CN110684834A - 一种检测由6个cd36突变基因所导致gpⅳ缺失的基因分型试剂盒 - Google Patents

一种检测由6个cd36突变基因所导致gpⅳ缺失的基因分型试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测由6个CD36突变基因导致GPⅣ缺失个体的基因分型试剂盒，所述的6个CD36突变基因的位点分别为：C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon‑10+2T>G(Change in splicing site)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)和1332ints TGAT(frameshift at AA 445)。本发明提供了一种简便快捷和高通量的实验检测方法，该试剂盒适合于由6个CD36突变基因所导致的GPⅣ缺失个体的分型检测和鉴定，抗‑GPⅣ血小板同种免疫疾病的辅助诊断检测。

Description

一种检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试 剂盒
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，特别是涉及一种由CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒。
背景技术
血小板糖蛋白Ⅳ(GPⅣ)，又名CD36、GP88、GPIIIb FAT或SCARB3，属于B类清道夫受体跨膜糖蛋白家族。该蛋白分子能被广泛糖基化，分子质量约为88000D。人类GPⅣ蛋白由472个氨基酸组成。GPⅣ蛋白在人体内广泛分布于多种细胞和组织中，包括血小板、单核/巨噬细胞、微血管内皮细胞、大脑小胶质细胞、星形胶质细胞、心肌和骨骼肌、脂肪细胞、树突状细胞、视网膜上皮细胞和乳腺及肾脏组织。其主要的功能包括作为凝血酶受体，胶原蛋白受体，长链脂肪酸受体等；还参与诱导细胞凋亡，去除血浆中的氧化低密度脂蛋白，增强异常形态红细胞的黏附等功能，在多种生理病理过程中发挥了重要的作用，大量的研究已证明：GPⅣ涉及止血、血栓、血小板同种免疫性疾病、高胆固醇血症、肥胖症、外周动脉粥样硬化、动脉高血压、心肌病、糖尿病、疟疾、早老年型痴呆(阿尔茨海默病)、癌症等疾病的形成。
部分个体在血小板或和单核细胞可出现GPⅣ缺失，按表现型GPⅣ缺失可分为2类：I型缺失，血小板和单核细胞上均不表达GPⅣ；II型缺失，GPⅣ仅在血小板不表达，但在单核细胞表达。编码GPⅣ的CD36基因变异，是导致人类GPⅣ抗原缺失的重要原因。编码GPⅣ的CD36基因位于第7号染色体的q11.2，有15个外显子，长度超过32000bp。GPⅣ蛋白编码区位于外显子3至外显子14，，由于人群多态性原因，不同人群中导致GPⅣ缺失的基因突变有所不同，如在日本人以268C>T、329-330delAC等突变多见(见文献Yanai H,Chiba H,FujiwaraH,et al.Phenotype-genotype correlation in GPⅣdeficiency types I andII.Thromb Haemost,2000,84(3):436-441.)。而本申请人在中国广西人群中发现了6个导致GPⅣ缺失的新突变基因，分别为C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon-10+2T>G(Change in splicing site)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)和1332intsTGAT(frameshift at AA 445)。在人群中开展由这6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的多态性的检测和筛查，将有助于全面检测人群中这6个GPⅣ突变基因所导致的GPⅣ缺失个体的分布特点和对个体生理及病理功能的影响，掌握人群中导致GPⅣ缺失的基因多态性情况，及遗传学特征。
为检查人群中所存在的GPIV缺失个体，目前文献报道中大多以血清学或基因测序的方式对GPⅣ缺失个体进行基因分型检测，也有部分报道以序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)、实时荧光定量PCR TaqMan探针技术，通过分析基因突变的存在以及与野生型的对比情况，来检测GPⅣ缺失个体的发生，所采用的检测技术繁琐而且是非特异性，不能达到对由特异性的突变基因所导致的GPIV缺失个体进行特异性的、高通量的筛查和鉴定的目的，更不能对本发明中所描述的发生在人群中的6个CD36突变基因所导致的GPⅣ缺失个体做针对性的、群体性的正确检测、分析和研究，因此，本发明旨在发明一种由特定的CD36突变基因所导致GPⅣ缺失个体的基因分型试剂盒，对所发现的6个CD36突变基因导致GPⅣ缺失个体做特异性、高通量地检测和鉴定。
发明内容
本发明旨在基于编码人类GPⅣ的CD36基因遗传学基础和新发现的导致GPⅣ缺失的CD36突变基因，创建一种检测由所发现的CD36突变基因导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，该试剂盒以序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法为基础，为由6个CD36突变基因：C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon-10+2T>G(Change in splicing site)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)和1332ints TGAT(frameshift at AA 445)导致的GPⅣ缺失个体的基因分型检测鉴定，提供了一种简便快捷的基因分型试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种检测由6个CD36突变基因导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测导致GPⅣ缺失的各突变位点的野生型序列特异性引物和突变型的特异性引物，以及公共引物；所述突变位点分别为：C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon-10+2T>G(Change in splicing site)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)、1332ints TGAT(frameshift at AA445)。
上述试剂盒的使用方法如下：
①通过一对PCR引物扩增人类C反应蛋白(CRP)DNA序列片段，作为每个PCR反应的内参照；
②每种由CD36突变基因导致的GPⅣ缺失的基因分型检测体系，均包含分别针对CD36突变基因导致GPⅣ缺失的基因突变位点的野生型序列特异性PCR引物和突变型序列特异性PCR引物，以及1条公共引物，对由6个CD36突变基因：C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon-10+2T>G(Change in splicing site)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)和1332ints TGAT(frameshift at AA 445)导致的GPⅣ缺失个体进行基因分型检测。
③检测每种CD36突变基因导致的GPIV缺失的基因分型检测体系，均由2个PCR反应分别对各自突变位点的野生型序列和突变型序列进行扩增，分别配制各突变位点基因分型PCR扩增的PCR反应体系，所有突变位点检测的PCR反应均可在同一PCR扩增条件下完成扩增，PCR扩增产物最后于2％琼脂糖凝胶中电泳，观察及分析检测结果。
本发明中采用的PCR针对每种CD36突变基因导致GPⅣ缺失的基因分型检测体系中所采用的引物信息如表1所示：
表1:6种CD36突变基因导致GPⅣ缺失的基因分型体系中PCR-SSP引物序列以及内参引物
Figure BDA0002214094550000031
Figure BDA0002214094550000041
对每种CD36突变基因型进行PCR，对各导致GPⅣ缺失的突变基因的单核苷酸多态性(SNP)位点，分别使用野生型引物a和公共引物c特异性扩增野生型目的片段，使用突变型引物b和公共引物c特异性扩增突变型目的片段；每个PCR反应均加入正向引物CRP I和反向引物CRP II PCR扩增内参照片段；根据不同突变型分为三个PCR反应体系，其组成及配置方法如下表2：
表2：PCR扩增反应体系组成为(终体积10μL/反应)
Figure BDA0002214094550000051
适合的镁离子浓度是获得良好PCR反应效果的基本条件之一，镁离子是Taq DNA聚合酶所必需的，对引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等均有影响。当镁离子浓度过低时，酶活力显著降低；镁离子浓度过高时，酶催化非特异性的扩增。因此，本发明对不同突变型的扩增体系的镁离子浓度进行了研究，发现当C275T和Exon-10(+2T>G)扩增体系的镁离子终浓度为2mM，T1229C和1332ints TGAT扩增体系的镁离子终浓度为3.5mM，G730A和C1123T扩增体系的镁离子终浓度为1.5mM时扩增效果最好。各突变SNP位点适用的PCR扩增反应体系如表3所示。
表3：各突变基因的SNP位点适用的PCR扩增反应体系
PCR扩增反应体系 适用突变型别
反应体系A([Mg<sup>2+</sup>]终＝2mM) C275T，Exon-10(+2T>G)
反应体系B([Mg<sup>2+</sup>]终＝3.5mM) T1229C，1332ints TGAT
反应体系C([Mg<sup>2+</sup>]终＝1.5mM) G730A，C1123T
PCR扩增通过PCR仪进行，所有的PCR反应均可在同一PCR扩增循环条件下完成扩增，其循环参数为：
95℃ 5min
以下条件扩增25个循环：
95℃ 30sec
68℃-0.4℃/循环 30sec
72℃ 30sec
以下条件扩增15个循环：
95℃ 30sec
54℃ 30sec
72℃ 30sec
最后以下条件延伸和保存：
72℃ 5min
12℃ ∞
PCR扩增产物最后于2％琼脂糖凝胶中进行电泳。
本发明的有益效果：本发明基于导致人类GPⅣ缺失的分子基础和序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术原理，创建了一种CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的GPⅣ缺失个体基因分型方法，其贡献在于，它可针对6个CD36突变基因：C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon-10+2T>G(Change in splicing site)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)、1332ints TGAT(frameshift at AA 445)所导致的GPⅣ缺失个体进行基因分型检测，为CD36突变基因导致的GPⅣ缺失个体的基因分型检测提供了一种简便快捷的基因分型检测方法，为GPⅣ缺失的基因分型检测鉴定，及为了解各人群中导致GPⅣ缺失的多态性情况提供了人群调查的实验基础。
本发明的方法中，针对各导致GPⅣ缺失的CD36突变基因的多态性(SNP)位点，分别设计针对野生型位点的序列特异性引物和突变型位点的序列特异性引物，以及可完成该突变多态性位点分型的公共引物，每个导致GPⅣ缺失的CD36突变基因SNP位点的基因分型检测体系，由2个PCR反应完成，分别针对该突变基因SNP位点的野生型及突变型进行扩增；通过设计一对PCR引物扩增人类C反应蛋白(CRP)DNA序列片段，作为每个PCR反应的内参照；通过探索最佳退火温度及调节Mg2+离子浓度等条件，可对导致GPⅣ缺失的CD36突变基因SNP位点进行PCR特异性扩增和基因分型，并且使本发明中描述的所有导致GPⅣ缺失的突变基因SNP位点的PCR扩增均可在同一扩增循环条件下完成。该试剂盒适合于6个CD36突变基因导致GPⅣ缺失个体的基因分型检测和鉴定，抗-GPⅣ血小板同种免疫疾病的辅助诊断检测，以及CD36突变基因导致的GPⅣ缺失的群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究工作。
附图说明
图1是实施例1的6例样本C275T突变位点的基因分型扩增反应效果图(S1-1为C275T突变型杂合子，S1-2～S1-6为275C野生型纯合子。注：W为野生型泳道，M为突变型泳道)。
图2是实施例2的6例样本G730A突变位点的基因分型扩增反应效果图(S2-1为G730A突变型杂合子，S2-2～S2-6为730G野生型纯合子。注：W为野生型泳道，M为突变型泳道)。
图3是实施例3的8例样本Exon-10+2T>G突变位点的基因分型扩增反应效果图(S3-1～S3-3为Exon-10+2T>G突变型杂合子，S3-4～S3-8为Exon-10+2T野生型纯合子。注：W为野生型泳道，M为突变型泳道)。
图4是实施例4的6例样本C1123T突变位点的基因分型扩增反应效果图(S4-1为C1123T突变型杂合子，S4-2～S4-6为1123C野生型纯合子。注：W为野生型泳道，M为突变型泳道)。
图5是实施例5的7例样本T1229C突变位点的基因分型扩增反应效果图(S5-1～S5-3为T1229C突变型杂合子，S5-4～S5-7为1229T野生型纯合子。注：W为野生型泳道，M为突变型泳道)。
图6是实施例6的7例样本1332ints TGAT突变位点的基因分型扩增反应效果图(S6-1～S6-2为1332ints TGAT突变型杂合子，S6-4～S6-7为1332野生型纯合子。注：W为野生型泳道，M为突变型泳道)。
图7是G730A突变位点在不同镁离子终浓度的扩增电泳图(注：W为野生型泳道，M为突变型泳道；S2-1基因型为730G/A突变杂合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W和M泳道目的条带均为阳性，S2-2～S2-6基因型是730G/G纯合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W泳道目的条带均为阳性，M泳道目的条带阴性，[Mg2+]终＝1.5mM的PCR反应体系扩增结果更优且准确)。
图8是C1123T突变位点在不同镁离子终浓度的扩增电泳图(注：W为野生型泳道，M为突变型泳道；S4-1基因型为1123C/T突变杂合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W和M泳道目的条带均为阳性，S4-2～S4-6基因型是1123C/C纯合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W泳道目的条带均为阳性，M泳道目的条带阴性，[Mg2+]终＝1.5mM的PCR反应体系扩增结果更优且准确)。
图9是T1229C在不同镁离子终浓度的扩增电泳图(W为野生型泳道，M为突变型泳道；S5-1和S5-2基因型为1229T/C突变杂合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W和M泳道目的条带均为阳性，S5-4～S5-6基因型是1229T/T纯合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W泳道目的条带均为阳性，M泳道目的条带阴性，[Mg2+]终＝3.5mM的PCR反应体系扩增结果更为准确)。
图10是1332ints TGAT在不同镁离子终浓度的扩增电泳图(W为野生型泳道，M为突变型泳道；S6-1基因型为1332ints TGAT突变杂合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W和M泳道目的条带均为阳性，S6-4基因型是1332无TGAT插入纯合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W泳道目的条带均为阳性，M泳道目的条带阴性，[Mg2+]终＝3.5mM的PCR反应体系扩增结果准确)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明的PCR引物共20条，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。扩增酶采用TaKaRa公司生产的Taq DNA Polmerase进行。
实施例1
本实施例给出了通过本发明的CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，对由CD36突变基因【C275T(Thr92Met)】导致的GPⅣ缺失的个体进行基因分型检测。
首先，取本发明中的275C野生型序列特异性引物GPⅣ-275a(反向引物)、275T突变型序列特异性引物GPⅣ-275b(反向引物)和公共正向引物GPⅣ-275c，对经DNA测序检测确认的1例C275T突变型样本(为C275T突变杂合子型)和5例275C野生型样本进行C275T突变位点的PCR扩增，每个PCR扩增反应体系均加入C反应蛋白的PCR扩增正向引物CRP I和反向引物CRP II，作为内参照，PCR扩增于ABI 9700型PCR仪进行，选择PCR扩增反应体系A，组成为：
Figure BDA0002214094550000091
Figure BDA0002214094550000101
(备注：在275C野生型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-275a；在275T突变型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-275b。)
PCR扩增循环参数为：
95℃ 5min
以下条件扩增25个循环：
95℃ 30sec
68℃-0.4℃/循环 30sec
72℃ 30sec
以下条件扩增15个循环：
95℃ 30sec
54℃ 30sec
72℃ 30sec
最后以下条件延伸和保存：
72℃ 5min
12℃ ∞
取8μl PCR产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳[琼脂糖凝胶含5％的绿如蓝荧光染料(北京天恩泽基因科技有限公司)]，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带，PCR产物条带清晰、特异，结果如图1所示，样本S1-1为C275T突变型杂合子，因此，在突变型泳道(M)扩增出目的条带，而S1-2～6为275C野生型纯合子，在突变型泳道(M)未扩增出目的条带。
实施例2
本实施例给出了通过本发明的CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，对由CD36突变基因【G730A(Asp244Asn)】导致的GPⅣ缺失的个体进行基因分型检测。
首先，取本发明中的730G野生型序列特异性引物GPⅣ-730a(正向引物)、730A突变型序列特异性引物GPⅣ-730b(正向引物)和公共反向引物GPⅣ-730c，对经DNA测序检测确认的1例G730A突变型样本(为G730A突变杂合子型)和5例730G野生型样本进行G730A突变位点的PCR扩增，每个PCR扩增反应体系均加入C反应蛋白的PCR扩增正向引物CRP I和反向引物CRP II，作为内参照，PCR扩增于ABI 9700型PCR仪进行，选择PCR扩增反应体系C，组成为：
Figure BDA0002214094550000111
Figure BDA0002214094550000121
(备注：在730G野生型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-730a；在730A突变型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-730b。)
PCR扩增循环参数与实施例1相同。
取8μl PCR产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳[琼脂糖凝胶含5％的绿如蓝荧光染料(北京天恩泽基因科技有限公司)]，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带，PCR产物条带清晰、特异，结果如图2所示，样本S2-1为G730A突变型杂合子，因此，在突变型泳道(M)扩增出目的条带，而S2-2～6为730G野生型纯合子，在突变型泳道(M)未扩增出目的条带。
实施例3
本实施例给出了通过本发明的CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，对由CD36突变基因【Exon-10+2T>G(Change in splicing site)】导致的GPⅣ缺失的个体进行基因分型检测。
首先，取本发明中Exon-10+2T野生型序列特异性引物GPⅣ-E10(+2)a(正向引物)、Exon-10+2G突变型序列特异性引物GPⅣ-E10(+2)b(正向引物)和公共反向引物GPⅣ-E10(+2)c，对经DNA测序检测确认的3例Exon-10+2T>G突变型样本(均为Exon-10+2T>G突变杂合子型)和5例Exon-10+2T野生型样本进行Exon-10+2T>G突变位点的PCR扩增，每个PCR扩增反应体系均加入C反应蛋白的PCR扩增正向引物CRP I和反向引物CRP II，作为内参照，PCR扩增于ABI 9700型PCR仪进行，选择PCR扩增反应体系A，组成为：
Figure BDA0002214094550000131
(备注：在Exon-10+2T野生型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-E10(+2)a；在Exon-10+2G突变型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-E10(+2)b。)
PCR扩增循环参数与实施例1相同。
取8μl PCR产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳[琼脂糖凝胶含5％的绿如蓝荧光染料(北京天恩泽基因科技有限公司)]，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带，PCR产物条带清晰、特异，结果如图3所示，样本S3-1～3为Exon-10+2T>G突变型杂合子，因此，在突变型泳道(M)扩增出目的条带，而S3-4～8为Exon-10+2T野生型纯合子，在突变型泳道(M)未扩增出目的条带。
实施例4
本实施例给出了通过本发明的CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，对由CD36突变基因【C1123T(Pro375Ser)】导致的GPⅣ缺失的个体进行基因分型检测。
首先，取本发明中的1123C野生型序列特异性引物GPⅣ-1123a(反向引物)、1123T突变型序列特异性引物GPⅣ-1123b(反向引物)和公共正向引物GPⅣ-1123c，对经DNA测序检测确认的1例C1123T突变型样本(为C1123T突变杂合子型)和5例1123C野生型样本进行C1123T突变位点的PCR扩增，每个PCR扩增反应体系均加入C反应蛋白的PCR扩增正向引物CRP I和反向引物CRP II，作为内参照，PCR扩增于ABI 9700型PCR仪进行，选择PCR扩增反应体系C，组成为：
Figure BDA0002214094550000141
(备注：在1123C野生型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-1123a；在1123T突变型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-1123b。)
PCR扩增循环参数与实施例1相同。
取8μl PCR产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳[琼脂糖凝胶含5％的绿如蓝荧光染料(北京天恩泽基因科技有限公司)]，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带，PCR产物条带清晰、特异，结果如图4所示，样本S4-1为C1123T突变型杂合子，因此，在突变型泳道(M)扩增出目的条带，而S4-2～6为1123C野生型纯合子，在突变型泳道(M)未扩增出目的条带。
实施例5
本实施例给出了通过本发明的CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，对由CD36突变基因【T1229C(Ile410Thr)】导致的GPⅣ缺失的个体进行基因分型检测。
首先，取本发明中的1229T野生型序列特异性引物GPⅣ-1229a(反向引物)、1229C突变型序列特异性引物GPⅣ-1229b(反向引物)和公共正向引物GPⅣ-1229c，对经DNA测序检测确认的3例T1229C突变型样本(均为T1229C突变杂合子型)和4例1229T野生型样本进行T1229C突变位点的PCR扩增，每个PCR扩增反应体系均加入C反应蛋白的PCR扩增正向引物CRP I和反向引物CRP II，作为内参照，PCR扩增于ABI 9700型PCR仪进行，选择PCR扩增反应体系B，组成为：
Figure BDA0002214094550000151
Figure BDA0002214094550000161
(备注：在1229T野生型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-1229a；在1229C突变型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-1229b。)
PCR扩增循环参数与实施例1相同。
取8μl PCR产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳[琼脂糖凝胶含5％的绿如蓝荧光染料(北京天恩泽基因科技有限公司)]，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。PCR产物条带清晰、特异，结果如图5所示，样本S5-1～3为T1229C突变型杂合子，因此，在突变型泳道(M)扩增出目的条带，而S5-4～7为1229T野生型纯合子，在突变型泳道(M)未扩增出目的条带。
实施例6
本实施例给出了通过本发明的CD36突变基因导致人类GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，对由CD36突变基因【1332ints TGAT(frameshift at AA 445)】导致的GPⅣ缺失的个体进行基因分型检测。
首先，取本发明中的1332野生型序列特异性引物GPⅣ-1332a(正向引物)、1332ints TGAT突变型序列特异性引物GPⅣ-1332b(正向引物)和公共反向引物GPⅣ-1332c，对经DNA测序检测确认的2例1332ints TGAT突变型样本(均为1332ints TGAT突变杂合子型)和5例1332野生型样本进行1332突变位点的PCR扩增，每个PCR扩增反应体系均加入C反应蛋白的PCR扩增正向引物CRP I和反向引物CRP II，作为内参照，PCR扩增于ABI 9700型PCR仪进行，选择PCR扩增反应体系B，组成为：
(备注：在1332野生型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-1332a；在1332ints TGAT突变型PCR扩增反应体系，序列特异性引物选择GPⅣ-1332b。)
PCR扩增循环参数与实施例1相同。
取8μl PCR产物，于2％琼脂糖凝胶中电泳[琼脂糖凝胶含5％的绿如蓝荧光染料(北京天恩泽基因科技有限公司)]，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带，PCR产物条带清晰、特异，结果如图6所示，样本S6-1～2为1332ints TGAT突变型杂合子，因此，在突变型泳道(M)扩增出目的条带，而S6-3～7为1332野生型纯合子，在突变型泳道(M)未扩增出目的条带。
实施例7不同CD36突变基因导致GPIV缺失的基因分型检测体系中，PCR反应中镁离子终浓度的对检测结果的影响。
1、不同镁离子终浓度对G730A扩增影响
G730A PCR反应中的[Mg2+]终＝2.0mM时，在确认该位点基因型为野生型730G/G纯合子的部分样本(S2-2～5)中730A突变基因的PCR反应扩增在目的条带位置出现非特异性扩增产物，造成假阳性结果，影响结果判断；而当[Mg2+]终＝1.5mM时，该非特异性条带明显减弱或消失，而不影响野生型目的条带的扩增，对携带有该突变基因的样本突变位点PCR扩增亦能取得良好检测效果，能获得正确结果判读，如图7所示。
2、不同镁离子终浓度对C1123T扩增影响
C1123T PCR反应中的[Mg2+]终＝2.0mM时，在确认该位点基因型为野生型1123C/C纯合子的部分样本(S4-2～6)中1123T突变基因的PCR反应扩增在目的条带位置出现较弱的非特异性扩增产物，且一些样本扩增效果不理想，影响结果判断；而当[Mg2+]终＝1.5mM时，该非特异性条带明显减弱或消失，而不影响野生型目的条带的扩增，对携带有该突变基因的样本突变位点PCR扩增亦能取得良好检测效果，能获得正确结果判读，如图8所示。
3、不同镁离子终浓度对T1229C扩增影响
T1229C PCR反应中的[Mg2+]终＝2.0mM时，T1229C突变杂合子样本DNA(S5-1、S5-2)和野生型样本DNA(S5-4～S5-6)，不管是突变位点还是野生型位点虽然均不能得到PCR反应扩增结果。当PCR反应中的[Mg2+]终＝3.5mM时，目的条带得到成功扩增，结果判读更为准确，如图9所示。
4、不同镁离子终浓度对1332ints TGAT扩增影响
S6-1基因型为1332ints TGAT突变杂合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W和M泳道目的条带均为阳性；S6-4基因型是1332无TGAT插入纯合子，使用本试剂盒做基因分型检测结果应为W泳道目的条带均为阳性和M泳道目的条带为阴性
1332ints TGAT PCR反应中的[Mg2+]终＝2.0mM时，1332ints TGAT突变杂合子样本DNA(S6-1)和野生型样本DNA(S6-4)，不管是突变位点还是野生型位点虽然均不能得到PCR反应扩增结果。当PCR反应中的[Mg2+]终＝3.5mM时，成功扩增出的目的条带，获得更好的检测效果，结果判读更为准确，如图10所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南宁中心血站（南宁输血医学研究所）
<120> 一种检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒
<130> 8.20
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggactcact cacctgtacg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggggactcac tcacctgtac a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgggttaaaa caggcacaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctattgggaa agtcactgcg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctattggga aagtcactgc a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccatcacat tgaacagacc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atcagcaaat gcaaagaagg t 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagcaaatgc aaagaaggg 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cactaaaatt ttctgccacc at 22
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagatcaata aggtgttttc ttacagg 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagatcaata aggtgttttc ttacaga 27
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgtcttcagg gagacctgtg t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttaagccaaa gaataggcac aa 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttaagccaaa gaataggcac ag 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccccgagaat ttattgaaag g 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aataaacctc cttggcctga tag 23
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cctccttggc ctgattgat 19
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tggcctaata tgtaacttct ctttga 26
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccagcctctc tcatgctttt ggccagacag 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gggtcgagga cagttccgtg tagaagtgga 30

Claims (9)

1.一种检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失个体的基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测由6个CD36突变基因所导致的GPⅣ缺失的各个基因位点的野生型序列特异性引物和突变型序列的特异性引物，以及公共引物；所述的CD36突变基因的突变位点分别为：C275T(Thr92Met)、730G>A(Asp244Asn)、Exon-10+2T>G(Change in splicingsite)、1123C>T(Pro375Ser)、1229T>C(Ile410Thr)和1332ints TGAT(frameshift at AA445)。
2.如权利要求1所述的检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，所述C275T突变位点的野生型(275C)序列特异性引物如SEQ ID NO.1所示，C275T突变位点的突变型(275T)序列的特异性引物如SEQ ID NO.2所示，公共引物如SEQ ID NO.3所示；
所述突变位点G730A的野生型(730G)序列特异性引物如SEQ ID NO.4所示，突变型(730A)序列的特异性引物如SEQ ID NO.5所示，公共引物如SEQ ID NO.6所示；
所述突变位点Exon-10+2T>G的野生型(Exon-10+2T)序列特异性引物如SEQ ID NO.7所示，突变型(Exon-10+2G)序列的特异性引物如SEQ ID NO.8所示，公共引物如SEQ ID NO.9所示；
所述突变位点C1123T的野生型(1123C)序列特异性引物如SEQ ID NO.10所示，突变型(1123T)序列的特异性引物如SEQ ID NO.11所示，公共引物如SEQ ID NO.12所示；
所述突变位点T1229C的野生型(1229T)序列特异性引物如SEQ ID NO.13所示，突变型(1229C)的序列特异性引物如SEQ ID NO.14所示，公共引物序如SEQ ID NO.15所示；
所述突变位点1332ints TGAT的野生型(1332位点无TGAT碱基插入)序列特异性引物如SEQ ID NO.16所示，突变型(1332ints TGAT)序列的特异性引物如SEQ ID NO.17所示，公共引物如SEQ ID NO.18所示。
3.如权利要求2所述的检测由6个CD36突变基因所导致的GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，还包括CRP内参，所述内参正向引物序列如SEQ ID NO.19所示，所述内参反向引物序列如SEQ ID NO.20所示。
4.如权利要求1或2所述的检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，还包括MgCl2试剂，其在PCR反应体系中的终浓度为1.5～3.5mM。
5.如权利要求4所述的检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，在检测C275T和Exon-10(+2T>G)突变位点的各野生型和突变型的PCR扩增反应体系中镁离子终浓度为2mM，PCR扩增反应体系终体系为10μL。
6.如权利要求4所述的检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，在检测T1229C和1332ints TGAT突变位点的各野生型和突变型的PCR扩增反应体系中镁离子终浓度为3.5mM，PCR扩增反应体系终体系为10μL。
7.如权利要求4所述的检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，在检测G730A和C1123T突变位点的野生型和突变型的PCR扩增反应体系中镁离子终浓度为1.5mM，PCR扩增反应体系终体系为10μL。
8.如权利要求1或2所述的检测由6个CD36突变基因所导致GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，还包括2.5mM的dNTPs试剂，10×Buffer、DNA聚合酶、10mg/ml的甲酚红、50％的甘油。
9.如权利要求1所述的检测导致由6个CD36突变基因所GPⅣ缺失的基因分型试剂盒，其特征在于，检测权利要求1所述的突变位点进行PCR扩增的反应程序为：
95℃ 5min
以下条件扩增25个循环：
95℃ 30sec
68℃-0.4℃/循环 30sec
72℃ 30sec
以下条件扩增15个循环：
95℃ 30sec
54℃ 30sec
72℃ 30sec
最后以下条件延伸和保存：
72℃ 5min
12℃ ∞。
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