CN111321218A - 迟发性耳聋GJB2基因pV37I突变的检测试剂盒 - Google Patents

迟发性耳聋GJB2基因pV37I突变的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种迟发性耳聋GJB2基因p.V37I突变的检测试剂盒，包括标准品，不同荧光报告基团标记标准序列与p.V37I突变序列的探针、扩增引物和定量扩增缓冲液。通过基因分型软件测定两种染料的荧光强度分布，判断待测样本GJB2基因p.V37I位点基因型。本发明的试剂盒能够准确检测GJB2基因p.V37I位点的基因型，灵敏度高，特异性好，成本低，检测迅速。应用本发明的试剂盒方法对GJB2基因p.V37I位点基因型的分型与Sanger测序结果完全一致，能够用于新生儿的GJB2基因p.V37I位点携带早期筛查及与GJB2基因p.V37I突变相关的迟发性耳聋易感性风险评估。

Description

迟发性耳聋GJB2基因pV37I突变的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种多聚核苷酸组合物，特别涉及一种由多条核苷酸组成的针对GJB2基因突变检测组合物及其试剂盒，用于新生儿突变携带的早期筛查及迟发性耳聋易感性风险评估。
背景技术
先天性耳聋是最常见的人类感官系统遗传疾病，发生率高达2～3‰(Fortnum etal.2001；Marazita et al.1993)。现阶段已有的普遍性新生儿听力筛查项目可以发现先天性新生儿期中重度听力损失患儿，但是对于新生儿期之后发生的迟发性耳聋，由于缺乏有效的风险评估手段而不能早期预警。我们通过前期大规模听力筛查研究发现，在中国人群中仅学龄前儿童迟发性耳聋的发病率就高达0.75‰(Jingrong Lu et al.2011)。因此，保守估计我国9岁以下儿童中迟发性耳聋的人数在70万人以上，然而这部分儿童因主观听力观察与实际听力不吻合，发现时间较晚，不能及时进行听力言语干预影响言语等能力正常发展，为儿童言语发育和家庭带来极大困扰的同时也给社会带来沉重的负担，因此针对儿童迟发性耳聋易感性风险评估的研究具有极其重大的科学意义和良好的社会效益。
在前期研究中，我们对与儿童迟发性耳聋相关的基因进行筛选，发现GJB2基因p.V37I排它性突变(p.V37I纯合突变或p.V37I+GJB2基因截短突变复合杂合)在儿童迟发性耳聋病例中的携带率高达19.56％，远远高于正常听力人群的携带率0.14％(p＝1.4×10-10，OR＝62.92)，说明GJB2基因p.V37I排它性突变与中国儿童迟发性耳聋具有高度相关性，是重要的遗传易感性突变(Li et al.2012)。同时期的其他研究结果也发现，GJB2基因p.V37I突变对缝隙连接蛋白第一跨膜域的正常构象形成极为关键，该突变会导致整个缝隙连接蛋白的功能受严重影响，此研究也从分子生物学角度证实了此突变类型对听觉发育有着重要的影响(Oscar et al.2012)。GJB2基因p.V37I排它性突变的病例在各阶段人群样本中不断富集，说明此突变类型极有可能是在新生儿期就导致尚不足以被现有听力筛查设备发现的亚临床听力损失，因此可顺利通过新生儿听力筛查而不被发现，但在生长发育过程中听力损失逐渐加重，并在学龄前达到临床可诊断的程度，导致患儿言语发育障碍(Li etal.2012)。
目前市场上针对GJB2基因p.V37I的单位点检测主要方法是Sanger测序法。Sanger测序法是检测位点突变的金标准，经扩增、纯化等步骤，通过毛细管电泳读取数据，因其操作繁琐，完成一次检测需要6～8小时，每个检测临床服务费用需要400元左右，并且需要昂贵的检测设备，不适于人群的大规模筛查。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种试剂盒，基于荧光定量PCR技术，对GJB2基因p.V37I突变位点实施快速筛查。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，用于迟发性耳聋易感性风险评估。
本发明的再一个目的在于提供一种试剂盒，用于新生儿GJB2基因p.V37I突变相关的迟发性耳聋的早期筛查。
本发明提供的试剂盒，基于荧光定量PCR技术，特异的对人基因组DNA样本进行GJB2基因p.V37I等位基因分型，实现对GJB2基因p.V37I突变位点的快速筛查。检测的结果可用于GJB2基因p.V37I突变相关的迟发性耳聋易感性风险评估和新生儿相关耳聋的早期筛查。
一种试剂盒，包括标准品及其探针，以及扩增引物。其中，
标准品包括野生型标准品、纯合突变标准品、杂合突变标准品和空白标准品；
野生型探针(W)，系Taqman MGB探针，其核酸序列如：SEQIDNo 3所示，或其互补序列，或序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；和
突变型探针(M)，系Taqman MGB探针，其核酸序列如：SEQIDNo 4所示，或其互补序列，或序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；以及
扩增正向引物(GJB2-F)，核酸序列如：SEQIDNo 5所示或其互补序列，或序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；和
扩增反向引物(GJB2-R)，核酸序列如：SEQIDNo6所示，或其互补序列，或序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
本发明的试剂盒，野生型标准品采用野生型重组质粒，其核酸序列如：SEQIDNo 1所示，或其互补序列，或序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
本发明的试剂盒，纯合突变标准品采用突变型重组质粒，其核酸序列如：SEQIDNo2所示，或其互补序列，或序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
本发明的试剂盒，杂合突变标准品为野生型重组质粒与突变型重组质粒按摩尔比1∶1混合而得。
本发明的试剂盒，空白标准品为水，如：但不限于经灭菌的去离子水。
本发明的试剂盒，在野生型探针上标记第一荧光基团，在突变型探针上标记第二荧光基团，且第一荧光基团和第二荧光基团不相同。第一荧光基团如：但不限于Hex、VIC、Cy5或FAM等，优先选择VIC。第二荧光基团如：但不限于Hex、FAM、Cy5或VIC等，优先选择FAM。
本发明的试剂盒，还包括定量PCR扩增试剂，如：但不限于Taq DNA酶、UDG酶、dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl2及其缓冲液。这些试剂单独或组合应用于本发明。
将本发明提供的试剂盒应用于GJB2基因p.V37I突变位点基因型的快速筛查，可用于对检测样本的迟发性耳聋易感性风险评估和新生儿耳聋的早期筛查。提取自检测样本的DNA应满足OD260/OD280＝1.7-1.9，浓度≥5ng/μl。
一种预测迟发性耳聋易感性风险评估的方法，包括：
获取自人的基因组DNA(来源，如：但不限于外周血、干血斑和口腔咽拭子等)并应用本发明的试剂盒进行检测，将检测所得的两种荧光强度结果数字化，判断待测样本GJB2基因p.V37I突变的等位基因型：扩增样本发出一种强烈荧光信号为野生型标准序列探针标记的荧光，该样本GJB2基因p.V37I等位基因型为G/G；扩增样本发出一种强烈荧光信号为突变型序列探针标记的荧光，该样本GJB2基因p.V37I等位基因型为A/A；扩增样本发出两种强烈荧光信号组合，该样本GJB2基因p.V37I等位基因型为G/A。当检测对象的基因型为A/A，则与受检对象迟发性耳聋易感可能性增加相关联。
本发明提供的检测试剂盒运用荧光定量PCR的方法对GJB2基因p.V37I位点进行检测，扩增后通过终点法基因分型可直接读取结果，检测快速，每个检测临床服务费不足Sanger测序检测临床服务费1/3，检测时间小于90分钟，可批量检测实现大规模筛查。后续随着核酸免提取技术的发展，与所述试剂盒的联合应用可实现基层医院GJB2基因p.V37I相关的迟发性耳聋易感风险普遍性筛查。
附图说明
图1为本发明标准品的基因分型分析结果图；
图2为本发明的标准品的荧光信号实验结果图；
图3为本发明的试剂盒用于81例样本检测，而得到的基因分型分析结果图；
图4为验证样本基因分型的Sanger测序结果图，其中A/A为纯合突变型序列，G/A为杂合突变型序列，G/G为野生型序列。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例所用的各项实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物(如表1所示)与序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；探针(如表1所示)合成由英潍捷基(上海)有限公司完成；一代测序工作由上海迈浦生物科技有限公司完成；pMDTMMD英潍捷载体克隆试剂盒购于宝日医生物技术(北京)有限公司。
表1
Figure BDA0002450824900000041
实施例1
本实施例合成GJB2基因p.V37I(c.109G＞A)野生型和纯合突变型DNA序列，合成的序列73bp，具体如下：
(1)野生型序列
5’-TCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGA-3’
(2)纯合突变型序列
5’-TCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCCTCATTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGA-3’
序列中标有下划线的碱基为基因突变位点。
使用pMDTM 18-T载体克隆试剂盒进行重组克隆，将上述合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，构建出野生型重组质粒(pMD18-T-GJB2 wt)和突变型重组质粒(pMD18-T-GJB2V37I)，所采用连接体系如下：
Figure BDA0002450824900000042
于16℃进行反应30分钟或者过夜连接反应。完成后，按如下方法进行质粒转化和鉴定：
取完成连接反应的产物10μl加入50μl的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。然后于42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2分钟，再于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，于37℃，120转/分轻摇培养90分钟。接着，将上述培养液短暂离心吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。接着，从平板上挑取单克隆菌落于500μl Amp抗性LB液体培养基的1.5ml离心管中，于37℃，220rpm振荡培养5～6小时后，取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇，再用引物GJB2-F(SEQ ID No.5)与GJB2-R(SEQ ID No.6)扩增上述稀释菌液。所得PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。
扩增所采用的体系如下：
Figure BDA0002450824900000051
扩增程序/反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃，30秒；58℃，30s；72℃，30秒，35个循环；72℃，10min。
采用Invitrogen的质粒抽提试剂盒提取重组质粒，使用NanoDrop OneC测定浓度和纯度，同时取10μl纯化质粒送至上海迈浦生物科技有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。由此制得野生型标准品(野生型重组质粒，pMD18-T-GJB2 wt)、纯合突变标准品(纯合突变型重组质粒，pMD18-T-GJB2 V37I)，以及按摩尔比1∶1混合的杂合突变标准品。
按如下方法可大量获取标准品质粒，并对所获取质粒进行定量：
(1)将100μl含有本实施例上述重组质粒的大肠杆菌DH5α接种于30ml氨苄抗性的LB液体培养基中，于37℃，220rpm培养14小时～16小时；
(2)采用Invitrogen的质粒抽提试剂盒提取重组质粒；
(3)使用NanoDrop OneC超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度，A260/A280＝1.70-1.90。
实施例2
以制得的标准品，其包括野生型标准品、纯合突变标准品、杂合突变标准品和空白标准品作为模板按照实施例2的方法对标准品进行检测，进行特异性确认，以Roche
Figure BDA0002450824900000052
480Endpoint Genotyping对数据进行分析后，结果如图1和图2所示。由图可以见，采用本实施例的试剂盒能将各种基因分型明显区分，易于观察和计量。
实施例3
本实施例的标准品及其探针和扩增引物制成试剂盒，用于GJB2基因p.V37I突变位点基因型的快速筛查。试剂盒包括以下组分：
(1)标准品
标准品的各项内容如下表2所示：
表2
标准品 质粒
野生型标准品 野生型重组质粒
纯合突变标准品 突变型重组质粒
杂合突变标准品 野生型重组质粒与突变型重组质粒1∶1混合
空白标准品 灭菌去离子水
(2)PCR扩增试剂
引物：引物序列为SEQIDNo 3与SEQIDNo 4；
定量PCR扩增试剂：Taq DNA酶、UDG酶、dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl2及其缓冲液。
(3)检测探针；标记荧光基团VIC的探针，序列为SEQ ID No5，以及标记荧光基团FAM的探针，序列为SEQ ID No6。
(4)提取人源滤纸干血斑样本基因组DNA，用作GJB2基因PCR扩增的模板，提取试剂为天根生化科技(北京)有限公司生产的磁珠法干血斑基因组DNA提取试剂盒(DP344)。提取方法详见试剂盒操作说明书。以此试剂盒对81例样本(包括标准品4例)进行基因分型分析。
通过检测水解探针的报告基团荧光强度进行终点法基因分型，分析结果参见表3和图3。使用本实施例试剂盒检测时间为90分钟左右，即可完成对样本的基因分型，耗时短。针对每种基因型随机挑选1个样本在上海迈浦生物科技有限公司进行Sanger测序验证，结果如图4所示。图4中，A/A为样本编号9的测序结果，为p.V37I纯合突变型，A/G为样本编号6的测序结果，为p.V37I杂合突变型，G/G为样本编号3的测序结果，为野生型样本。可见，与本实施例试剂盒检测的结果完全一致，能够实现快速、特异性地对大量样本进行检测的目的。当检测对象的基因型为A/A，即GJB2基因p.V37I纯合突变，则说明与受检对象迟发性耳聋易感性增加相关联。大规模听力筛查与基因筛查研究发现，GJB2基因p.V37I纯合突变的人群携带率应为0.38％，此比例显著高于遗传性耳聋的总发生率(据推算约为0.1％)，表现为人群的不完全外显。该试剂盒将GJB2基因p.V37I纯合突变快速检测作为迟发性耳聋易感性风险评估标识，实现新生儿的早期筛查，提早迟发性耳聋的预警时间，提高耳聋的防治水平。因此，本实施例的试剂盒可应用于GJB2基因p.V37I易感性迟发性耳聋快速筛查及相关领域。
表3
样本编号 基因型 样本编号 基因型 样本编号 基因型
1(标准品) 野生型 28 野生型 55 野生型
2 野生型 29 野生型 56 野生型
3 野生型 30 野生型 57 野生型
4(标准品) 杂合突变型 31 野生型 58 野生型
5 杂合突变型 32 野生型 59 野生型
6 杂合突变型 33 野生型 60 野生型
7(标准品) 纯合突变型 34 野生型 61 野生型
8 纯合突变型 35 杂合突变型 62 野生型
9 纯合突变型 36 杂合突变型 63 野生型
10 野生型 37 杂合突变型 64 野生型
11 野生型 38 野生型 65 野生型
12 野生型 39 野生型 66 野生型
13 野生型 40 杂合突变型 67 野生型
14 野生型 41 野生型 68 野生型
15 野生型 42 野生型 69 野生型
16 野生型 43 野生型 70 野生型
17 野生型 44 野生型 71 杂合突变型
18 野生型 45 野生型 72 杂合突变型
19 野生型 46 野生型 73 杂合突变型
20 野生型 47 野生型 74 野生型
21 杂合突变型 48 野生型 75 野生型
22 杂合突变型 49 野生型 76 野生型
23 野生型 50 杂合突变型 77 野生型
24 杂合突变型 51 野生型 78 野生型
25 杂合突变型 52 野生型 79 野生型
26 野生型 53 野生型 80 野生型
27 野生型 54 杂合突变型 81(标准品) 空白
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> 迟发性耳聋GJB2基因pV37I突变的检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggctcac cgtcctcttc atttttcgca ttatgatcct cgttgtggct gcaaaggagg 60
tgtggggaga tga 73
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctggctcac cgtcctcttc atttttcgca ttatgatcct cattgtggct gcaaaggagg 60
tgtggggaga tga 73
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attatgatcc tcgttgtgg 19
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatcctcat tgtggc 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctggctcac cgtcctcttc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcatctcccc acacctcctt t 21

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于包括：
探针，其包括：
野生型探针，如SEQ ID No 3所示，或其互补序列，和
突变型探针，如SEQ ID No 4所示，或其互补序列；以及
扩增引物，其包括：
正向引物，如SEQ ID No 5所示，或其互补序列，和
反向引物，如SEQ ID No 6所示，或其互补序列；
所述的野生型探针上标记第一荧光基团，所述的突变型探针上标记第二荧光基团，且所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团不相同。
2.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于所述的野生型探针还包括SEQ ID No 3所示序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列，所述的突变型探针还包括SEQ ID No 4所示序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
3.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于所述的正向引物包括SEQ ID No5所示序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列，所述的反向引物包括SEQ ID No 6所示序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
4.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于还包括标准品，所述的标准品包括：
野生型标准品，其为具有如SEQ ID No1所示序列，或其互补序列；和
纯合突变标准品，其为具有如SEQ ID No 2所示序列，或其互补序列。
5.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于所述的野生型标准品还包括SEQ IDNo1所示序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列，所述的纯合突变标准品还包括SEQ ID No 2所示序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
6.根据权利要求书4或5所述的试剂盒，其特征在于所述的标准品还包括杂合突变标准品，由野生型重组组质粒与突变型重组质粒按摩尔比1∶1混合而得。
7.根据权利要求书4或5所述的试剂盒，其特征在于所述的标准品还包括空白标准品。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括Taq DNA酶、UDG酶、dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl2及其缓冲液之一种或几种。
9.根据权利要求1所述的试剂盒在GJB2基因p.V37I突变的基因分型筛查中的应用。
10.一种预测与GJB2基因p.V37I突变相关的迟发性耳聋易感性风险评估的方法，包括：
在获取自人的基因组DNA，应用权利要求1～9之一所述的试剂盒进行检测，将检测所得的两种荧光强度数字化，判断待测样本GJB2基因p.V37I突变的等位基因型：①扩增样本发出一种强烈荧光信号为野生型标准序列探针标记的荧光，该样本GJB2基因p.V37I等位基因型为G/G；②扩增样本发出一种强烈荧光信号为突变型序列探针标记的荧光，该样本GJB2基因p.V37I等位基因型为A/A；③扩增样本发出两种强烈荧光信号组合，该样本GJB2基因p.V37I等位基因型为G/A；当检测对象的基因型为A/A，则与受检对象迟发性耳聋易感可能性增加相关联。
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Assignor: SHANGHAI NINTH PEOPLE'S HOSPITAL SHANGHAI JIAOTONG University SCHOOL OF MEDICINE

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Denomination of invention: Detection kit for gv37i mutation of GJB2 gene in late-onset deafness

License type: Exclusive License

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