CN102296075B - 发作性运动诱发性运动障碍致病基因 - Google Patents

发作性运动诱发性运动障碍致病基因 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种发作性运动诱发性运动障碍致病基因-PRRT2及其相关的突变基因。本发明还涉及含有所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的编码蛋白。本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本是否存在所述基因的突变的试剂盒，该试剂盒方法能够精确地诊断遗传性PKD。

Description

发作性运动诱发性运动障碍致病基因
技术领域
本发明涉及的是一种人体变异的基因，具体地说是一种发作性运动诱发性运动障碍致病基因—PRRT2。本发明还涉及含有所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、所述发作性运动诱发性运动障碍相关基因的编码蛋白。
背景技术
发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia,PKD)又称为发作性运动诱发的舞蹈手足徐动症(paroxysmal kinesigenic choreoathetosis,PKC)。PKD最具特征的临床表现为静止状态下突然运动（突然运动指的是毫无准备的动作、平稳运动中突然增加负荷、改变方向等）诱发发作,另外突然的惊吓、过度换气、紧张、焦虑、疲劳、月经、失眠、气候异常等非特异性因素也可诱发。PKD可分为继发性和原发性，继发性PKD最常见于多发性硬化、脑血管病、代谢紊乱（如高血糖、低血糖、高钙血症）、脑外伤等;原发性分为散发和遗传，其中遗传性PKD呈常染色体显性遗传,可外显不完全。
PKD一般在儿童期或是青春期早期起病,发病年龄多在6～16岁,平均发病年龄±12岁。PKD以男性发病多见,男女患者之比为3～4:1。2004年，Bruno提出了PKD的诊断标准:发作由运动触发;发作持续时间短,不超过1分钟;发作时意识清楚,无疼痛感觉;神经系统检查正常,排除其他器质性疾病;抗癫痫药物治疗有效；无家族史者,多在1～20岁发病，若有家族史,发病年龄范围可放宽。
现阶段关于PKD的发病机制尚不清楚,主要有基底节病变、癫痫学说和离子通道障碍这三种学说,近几年学者们不断从神经影像学,分子生物学,脑电图等方面收集资料，寻找PKD的发病机制。几十年来，国内外许多研究人员都对PKD家系进行研究，希望克隆出其致病基因，但都未成功。本发明首次发现并克隆了PKD的致病基因PRRT2，对PKD的诊断和治疗、发病机制提供了分子及理论基础。
PRRT家族包括PRRT1、PRRT2、PRRT3、PRRT4，其中PRRT2(proline-richtransmembrane protein2)包含4个外显子，共3794bp，编码一个由340个氨基酸组成的跨膜蛋白/膜蛋白，UCSC上的序列编号为NM_145239。PRRT2主要在大脑表达，尤其是基底节区，其功能不详，编码的蛋白与SNAP25（synaptosomal-associated protein）是互做蛋白。SNAP25蛋白是一种突触相关膜蛋白，参与轴突发生、钙离子依赖性神经递质胞吐作用、神经递质（乙酰胆碱、GABA、谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、胰岛素）等的分泌和循环过程、突触发生的调节,且SNAP25的过表达可抑制钾离子通道蛋白的活性。
PKD治疗主要依靠卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、丙戊酸、托吡酯、拉莫三嗪等抗癫痫药物控制发作。进行早期诊断，将使患者有机会获得及时、有效、合理的治疗；也只有在实现对PKD患者早期诊断的基础上，相关药物的开发才真正能体现出意义。鉴于PKD的发病年龄较早，因此PKD可能的疾病相关基因突变位点的检测，将对潜在PKD患者的超早期诊断成为可能。
发明内容
本发明的目的之一在于提供与PKD相关的致病基因。
本发明再一目的是提供含有所述PKD致病基因PRRT2及其突变型的重组载体、含有上述重组载体的重组细胞、以及所述PKD相关基因的编码蛋白。
发明人通过候选基因筛查的方法在一个PKD显性遗传家系中发现PRRT2基因的一种新的突变——487位碱基C突变为T，使得PRRT2基因编码的氨基酸序列第163位赖氨酸突变为终止密码子（c.487C>T(p.Q163X)），具体序列如SEQ ID NO:2所示。通过对家系所有成员进行PRRT2基因突变检测，发现A家系中的其他患者均有c.487C>T(p.Q163X)突变，而家系中的正常人均未发现该突变，说明PRRT2基因突变在该家系中与疾病表型共分离。发明人又对另外四个PKD家系，进行PRRT2基因的突变检测，其中B、D、E三个家系中均发现PRRT2基因的另一种新的突变——649位C插入突变，使得PRRT2基因编码的氨基酸序列自217位开始框移突变,翻译7个氨基酸后终止，最终形成一段由223个氨基酸组成的肽链c.649_650InsC(p.P217fsX7)，具体序列如SEQ ID NO:3所示。在C家系中发现PRRT2基因上存在796位碱基C突变为T，使得PRRT2基因编码的氨基酸序列第266位精氨酸突变为色氨酸（c.796C>T(R266W)），具体序列如SEQ IDNO:4所示。通过对以上家系其他成员进行PRRT2以上基因突变位点检测，发现PRRT2基因突变在这三个家系中均与疾病表型共分离。随后的500名正常人的PRRT2基因突变检测中也未发现此突变，排除了单个核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism,SNP）的可能性，从而确定PRRT2基因是PKD的致病基因。
本发明提供了一种如SEQ ID NO:2所示的人类PRRT2基因突变序列，其特征在于，所述PRRT2基因第487位碱基突变为T。正常人的PRRT2基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种如SEQ ID NO:3所示的人类PRRT2基因突变序列，其特征在于，所述PRRT2基因第649位C插入突变。正常人的PRRT2基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种如SEQ ID NO:4所示的人类PRRT2基因突变序列，其特征在于，所述PRRT2基因第796位碱基突变为T。正常人的PRRT2基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种PRRT2基因编码的氨基酸序列（SEQ ID NO.5）。
本发明进一步提供了如SEQ ID NO.2所示基因突变序列对应的氨基酸序列（SEQ IDNO.6），其特征是PRRT2基因编码的氨基酸序列第163位赖氨酸突变为终止密码子；如SEQ ID NO.3所示基因突变序列对应的氨基酸序列（SEQ ID NO.7），其特征是PRRT2基因编码的氨基酸序列自217位开始框移突变,翻译7个氨基酸后终止，最终形成一段由223个氨基酸组成的肽链；以及如SEQ ID NO.4所示基因突变序列对应的氨基酸序列（SEQID NO.8），其特征是PRRT2基因编码的氨基酸序列第266位精氨酸突变为色氨酸。
本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本是否存在所述基因的突变的试剂盒，包括：聚合酶链反应试剂，如dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液；聚合酶链反应扩增体系中所适应的引物对，序列如SEQ ID NO:9-12所示。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50%左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。
本发明还提供了一种根据上述试剂盒检测来源于人体的生物样本是否存在所述基因的突变的方法，其包括
步骤：
（1）从所述样本中提取和纯化基因材料；
（2）对所述基因材料进行聚合酶链扩增反应，获取产物；
（3）对所述产物进行核苷酸序列测定，以确定所述生物样本中是否含有PRRT2基因的突变。
优选地，所述生物样本为体液，所述体液包括但不限于：血液、血清、羊水、淋巴液等。
优选地，所述体液为血液。
优选地，在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为：SEQ ID NO:9—12；本领域技术人员还可以根据聚合酶链扩增反应的要求，设计更多种的引物，以扩增出包含本发明所述变异的核苷酸序列。
附图说明
图1为突变序列SEQ ID NO.2、3、4的示意图，其中图示从上至下依次为SEQ ID NO.2、3、4。
图2为A、B、C、D、E五个家系的家系图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围仅以权利要求书限定的范围为准。
实施例1：PRRT2基因c.487C>T(p.Q163X)突变的检测方法
（1）标本采集与处理。发明人对家系A中15名正常人（男8名、女7名）、7名PKD患者（男4名，女3名）进行详细的病史、家族史的调查及全面的体格检查和相关辅助检查。在签署知情同意书以后，每人取肘静脉血10ml（枸橼酸钠抗凝），4℃保存，两周内依照《分子克隆》第二版从血液中提取DNA的方法提取DNA。
（2）对样本DNA目标片段进行PCR体外扩增。根据PKD相关基因序列SED ID NO.13设计如下引物；
正向引物；5＇CTAgCAggggTACCAgACCA3＇(SED ID NO.9)
反向引物；5＇TCATTCgATCCTCCTCAACC3＇(SED ID NO.10)
反应体系和反应条件如下表1、2所示：
表1PCR反应体系（TaKaRa TaqTM Hot Start Version）
试剂名称 试剂量（ul）
ddH2O 6.55
10Xbuffer 1.0
2mM dNTP 0.8
引物 0.3
Taq酶 0.05
DNA模板 1.0
总体积 10
表2PCR反应程序
Figure GDA00002850334600051
实例2：突变分析
（1）对这15名正常人、7名PKD患者的PCR扩增产物进行DNA测序。
（2）测序结果分析
应用SEQUENCE ANALYSIS软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组序列进行比较，对测序结果进行对比分析。
测序分析显示：
1）7名PKD患者的PCR扩增产物上的376位碱基C突变为T（SED ID NO.13）。
2）15名正常人PRRT2基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变(SED IDNO.14)。
实例3PRRT2基因c.649_650InsC(p.P217fsX7)突变的检测方法
家系B内有6名正常人（男4名，女2名）、5名PKD患者（男3名，女2名）。
基本方法和步骤参见实施例1，在具体方法中针对该突变位点及邻近序列进行PCR扩增，使用的PCR引物序列为：
正向引物；5＇gCTggTgATggggAAgAg  3＇(SED ID NO.11)
反向引物；5＇CTCCAgAggCTCTATTgCAg  3＇(SED ID NO.12)
实例4突变分析
对这6名正常人、5名PKD患者的PCR扩增产物进行DNA测序。
测序结果分析
应用SEQUENCE ANALYSIS软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组序列进行比较，对测序结果进行对比分析。
测序分析显示：
1）5名PKD患者的PCR扩增产物上有306位碱基C插入突变（SED ID NO.15）。
2）6名正常人PRRT2基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变(SED IDNO.16)。
实施例5PRRT2基因c.796C>T(R266W)突变的检测方法
家系C内有1名正常人（男）、2名PKD患者（男1名，女1名）。
基本方法和步骤参见实施例1，在具体方法中针对该突变位点及邻近序列进行PCR扩增，使用的PCR引物序列为：
正向引物；5＇gCTggTgATggggAAgAg  3＇(SED ID NO.11)
反向引物；5＇CTCCAgAggCTCTATTgCAg  3＇(SED ID NO.12)
实例6突变分析
对这1名正常人、2名PKD患者的PCR扩增产物进行DNA测序。
测序结果分析
应用SEQUENCE ANALYSIS软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组序列进行比较，对测序结果进行对比分析。
测序分析显示：
1）2名PKD患者的PCR扩增产物上有452位碱基C突变为T（SED ID NO.17）。
2）1名正常人PRRT2基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变(SED IDNO.16)。
此外，本发明人还进一步对这三个家系外的500个正常人的PRRT2基因进行了突变筛查，未发现上述的三种突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性，确定上述的三种突变是这些常染色体显性遗传PKD家系的致病基因突变。
虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对本领域技术人员来说，可用根据本发明进行各种改变，而不脱离本发明的目的和精神，所有这些修改都包括在所附权利要求的范围内。
Figure IDA0000093681320000011
Figure IDA0000093681320000021
Figure IDA0000093681320000031
Figure IDA0000093681320000041
Figure IDA0000093681320000051
Figure IDA0000093681320000071
Figure IDA0000093681320000081
Figure IDA0000093681320000091
Figure IDA0000093681320000101
Figure IDA0000093681320000111
Figure IDA0000093681320000121
Figure IDA0000093681320000131
Figure IDA0000093681320000141
Figure IDA0000093681320000151

Claims (5)

1.一种分离的发作性运动诱发性运动障碍相关基因突变型，其序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种分离的蛋白，具有SEQ ID NO.6 表示的氨基酸序列，其特征为由SEQ ID NO.2所示序列编码。
3.一种重组载体，含有SEQ ID NO.2所示序列。
4.一种含有权利要求3所述重组载体的宿主细胞。
5.一种用于检测权利要求1所述基因突变型的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中引物对选自SEQ ID NO. 9—10所示的序列。
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