CN103849623B - Abcb6基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的编码ABCB6的核酸、分离的多肽、筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法、筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统以及用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的试剂盒。其中，分离的编码ABCB6突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A。通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症。

Description

ABCB6基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及ABCB6基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及一种分离的编码ABCB6突变体的核酸、一种分离的多肽、一种筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法、一种筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统以及一种用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的试剂盒。

背景技术

遗传性泛发性色素异常症（Dyschromatosisuniversalishereditaria，DUH）是一种以全身泛发性色素沉着斑和色素减退斑相互夹杂存在为典型特征的遗传性皮肤病。多见于日本、中国、韩国等地区，也有报道在欧洲，非洲其他人种地区。1933年由日本学者UrabeK首次报道。患者多有家族史，遗传方式未定，多为常染色体显性遗传（Autosomaldominantinheritance，AD，也有报道为常染色体隐性遗传（Autosomerecessiveinheritance，AR），但出现于近亲婚配家系中。临床上DUH主要表现为全身泛发色素沉着和色素减退斑相互夹杂。色素沉着斑为淡褐色至深褐色不等，米粒至豌豆大小，圆形或不规则形状，散在、密集或成簇分布，境界清楚，并间以同等大小的色素减退甚至色素脱失斑，皮损可融合成网状。本病多幼年早发，也有报道成年才出现症状者。无明显自觉症状，局部无萎缩、炎症、苔藓化及毛细血管扩张，患者偶伴有其它先天性缺陷或异常，如耳聋，眼白化病，癫痫等。DUH除了伴发先天缺陷和异常外，皮损处一般无任何异常感觉，但皮损的美容问题成为很多患者求治的主要原因。但由于目前该疾病的病因不明，目前尚无有效治疗方法，有建议在皮损外露部分使用遮瑕霜以覆盖，减少患者心理不适。

因此，目前对于遗传性泛发性色素异常症的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了遗传性泛发性色素异常症的致病基因上的新突变。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码ABCB6突变体的核酸。根据本发明的实施例，该核酸与SEQIDNO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A。根据本发明的实施例，发明人确定了ABCB6基因突变体，这些新突变体与遗传性泛发性色素异常症的发病密切相关，从而通过检测这些新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽与SEQIDNO：2相比，具有选自下列的至少一种突变：p.Leu356Pro、p.Ser170Gly、p.Gly579Glu。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，具有选自c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A的至少一种突变是所述生物样品易感遗传性泛发性色素异常症的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法，可以有效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A的至少一种突变，判断所述生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测ABCB6基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述ABCB6基因突变体具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1：显示了根据本发明一个实施例的筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

A为根据本发明实施例的筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统的示意图，

B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2：显示了根据本发明一个实施例的DUH患者家系的家系图谱以及该家系中先证者V1的临床症状及病理检测图，其中，

a为根据本发明实施例的DUH患者家系的家系图谱，

b-g为根据本发明实施例的DUH患者家系的先证者V1的临床症状及病理检测图；

图3：显示了根据本发明一个实施的DUH患者家系中的患者及正常人，以及具有ABCB6基因突变的散发患者及家系外正常人的ABCB6基因突变位点的Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

ABCB6基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码ABCB6突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：1相比，该核酸具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A。在本文中所使用的表达方式“编码ABCB6突变体的核酸”，是指与编码ABCB6突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与ABCB6的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码ABCB6突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了ABCB6基因的新突变体，该突变体与遗传性泛发性色素异常症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感遗传性泛发性色素异常症。

这些编码ABCB6突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法，确定的遗传性泛发性色素异常症的致病基因上的新突变，并且在现有技术中并未见到ABCB6基因上的c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变与遗传性泛发性色素异常症相关的报道。

野生型ABCB6基因的cDNA的核苷酸序列如下所示：ATGGTGACTGTGGGCAACTACTGCGAGGCCGAAGGGCCCGTGGGTCCGGCCTGGATGCAGGATGGCCTGAGTCCCTGCTTCTTCTTCACGCTCGTGCCCTCGACGCGGATGGCTCTGGGGACTCTGGCCTTGGTGCTGGCTCTTCCCTGCAGACGCCGGGAGCGGCCCGCTGGTGCTGATTCGCTGTCTTGGGGGGCCGGCCCTCGCATCTCTCCCTACGTGCTGCAGCTGCTTCTGGCCACACTTCAGGCGGCGCTGCCCCTGGCCGGCCTGGCTGGCCGGGTGGGCACTGCCCGGGGGGCCCCACTGCCAAGCTATCTACTTCTGGCCTCCGTGCTGGAGAGTCTGGCCGGCGCCTGTGGCCTGTGGCTGCTTGTCGTGGAGCGGAGCCAGGCACGGCAGCGTCTGGCAATGGGCATCTGGATCAAGTTCAGGCACAGCCCTGGTCTCCTGCTCCTCTGGACTGTGGCGTTTGCAGCTGAGAACTTGGCCCTGGTGTCTTGGAACAGCCCACAGTGGTGGTGGGCAAGGGCAGACTTGGGCCAGCAGGTTCAGTTTAGCCTGTGGGTGCTGCGGTATGTGGTCTCTGGAGGGCTGTTTGTCCTGGGTCTCTGGGCCCCTGGACTTCGTCCCCAGTCCTATACATTGCAGGTTCATGAAGAGGACCAAGATGTGGAAAGGAGCCAGGTTCGGTCAGCAGCCCAACAGTCTACCTGGCGAGATTTTGGCAGGAAGCTCCGCCTCCTGAGTGGCTACCTGTGGCCTCGAGGGAGTCCAGCTCTGCAGCTGGTGGTGCTCATCTGCCTGGGGCTCATGGGTTTGGAACGGGCACTCAATGTGTTGGTGCCTATATTCTATAGGAACATTGTGAACTTGCTGACTGAGAAGGCACCTTGGAACTCTCTGGCCTGGACTGTTACCAGTTACGTCTTCCTCAAGTTCCTCCAGGGGGGTGGCACTGGCAGTACAGGCTTCGTGAGCAACCTGCGCACCTTCCTGTGGATCCGGGTGCAGCAGTTCACGTCTCGGCGGGTGGAGCTGCTCATCTTCTCCCACCTGCACGAGCTCTCACTGCGCTGGCACCTGGGGCGCCGCACAGGGGAGGTGCTGCGGATCGCGGATCGGGGCACATCCAGTGTCACAGGGCTGCTCAGCTACCTGGTGTTCAATGTCATCCCCACGCTGGCCGACATCATCATTGGCATCATCTACTTCAGCATGTTCTTCAACGCCTGGTTTGGCCTCATTGTGTTCCTGTGCATGAGTCTTTACCTCACCCTGACCATTGTGGTCACTGAGTGGAGAACCAAGTTTCGTCGTGCTATGAACACACAGGAGAACGCTACCCGGGCACGAGCAGTGGACTCTCTGCTAAACTTCGAGACGGTGAAGTATTACAACGCCGAGAGTTACGAAGTGGAACGCTATCGAGAGGCCATCATCAAATATCAGGGTTTGGAGTGGAAGTCGAGCGCTTCACTGGTTTTACTAAATCAGACCCAGAACCTGGTGATTGGGCTCGGGCTCCTCGCCGGCTCCCTGCTTTGCGCATACTTTGTCACTGAGCAGAAGCTACAGGTTGGGGACTATGTGCTCTTTGGCACCTACATTATCCAGCTGTACATGCCCCTCAATTGGTTTGGCACCTACTACAGGATGATCCAGACCAACTTCATTGACATGGAGAACATGTTTGACTTGCTGAAAGAGGAGACAGAAGTGAAGGACCTTCCTGGAGCAGGGCCCCTTCGCTTTCAGAAGGGCCGTATTGAGTTTGAGAACGTGCACTTCAGCTATGCCGATGGGCGGGAGACTCTGCAGGACGTGTCTTTCACTGTGATGCCTGGACAGACACTTGCCCTGGTGGGCCCATCTGGGGCAGGGAAGAGCACAATTTTGCGCCTGCTGTTTCGCTTCTACGACATCAGCTCTGGCTGCATCCGAATAGATGGGCAGGACATTTCACAGGTGACCCAGGCCTCTCTCCGGTCTCACATTGGAGTTGTGCCCCAAGACACTGTCCTCTTTAATGACACCATCGCCGACAATATCCGTTACGGCCGTGTCACAGCTGGGAATGATGAGGTGGAGGCTGCTGCTCAGGCTGCAGGCATCCATGATGCCATTATGGCTTTCCCTGAAGGGTACAGGACACAGGTGGGCGAGCGGGGACTGAAGCTGAGCGGCGGGGAGAAGCAGCGCGTCGCCATTGCCCGCACCATCCTCAAGGCTCCGGGCATCATTCTGCTGGATGAGGCAACGTCAGCGCTGGATACATCTAATGAGAGGGCCATCCAGGCTTCTCTGGCCAAAGTCTGTGCCAACCGCACCACCATCGTAGTGGCACACAGGCTCTCAACTGTGGTCAATGCTGACCAGATCCTCGTCATCAAGGATGGCTGCATCGTGGAGAGGGGACGACACGAGGCTCTGTTGTCCCGAGGTGGGGTGTATGCTGACATGTGGCAGCTGCAGCAGGGACAGGAAGAAACCTCTGAAGACACTAAGCCTCAGACCATGGAACGGTGA（SEQIDNO：1），

其编码的的氨基酸序列如下所示：

MVTVGNYCEAEGPVGPAWMQDGLSPCFFFTLVPSTRMALGTLALVLALPCRRRERPAGADSLSWGAGPRISPYVLQLLLATLQAALPLAGLAGRVGTARGAPLPSYLLLASVLESLAGACGLWLLVVERSQARQRLAMGIWIKFRHSPGLLLLWTVAFAAENLALVSWNSPQWWWARADLGQQVQFSLWVLRYVVSGGLFVLGLWAPGLRPQSYTLQVHEEDQDVERSQVRSAAQQSTWRDFGRKLRLLSGYLWPRGSPALQLVVLICLGLMGLERALNVLVPIFYRNIVNLLTEKAPWNSLAWTVTSYVFLKFLQGGGTGSTGFVSNLRTFLWIRVQQFTSRRVELLIFSHLHELSLRWHLGRRTGEVLRIADRGTSSVTGLLSYLVFNVIPTLADIIIGIIYFSMFFNAWFGLIVFLCMSLYLTLTIVVTEWRTKFRRAMNTQENATRARAVDSLLNFETVKYYNAESYEVERYREAIIKYQGLEWKSSASLVLLNQTQNLVIGLGLLAGSLLCAYFVTEQKLQVGDYVLFGTYIIQLYMPLNWFGTYYRMIQTNFIDMENMFDLLKEETEVKDLPGAGPLRFQKGRIEFENVHFSYADGRETLQDVSFTVMPGQTLALVGPSGAGKSTILRLLFRFYDISSGCIRIDGQDISQVTQASLRSHIGVVPQDTVLFNDTIADNIRYGRVTAGNDEVEAAAQAAGIHDAIMAFPEGYRTQVGERGLKLSGGEKQRVAIARTILKAPGIILLDEATSALDTSNERAIQASLAKVCANRTTIVVAHRLSTVVNADQILVIKDGCIVERGRHEALLSRGGVYADMWQLQQGQEETSEDTKPQTMER（SEQIDNO：2），

发明人发现的ABCB6基因突变体与SEQIDNO：1相比，具有c.1067T>C（exon5）c.508A>G（exon1）c.1736G>A（exon12）的至少一种突变，即相对于野生型ABCB6基因，本发明的ABCB6基因突变体的cDNA中第1067位的T突变为C（位于exon5），第508位的A突变为G（位于exon1），第1736位的G突变为A（位于exon12），由此，其所编码的产物与野生型三磷酸腺苷结合盒转运子B亚族成员ABCB6（SEQIDNO：2）相比，具有p.Leu356Pro，p.Ser170Gly，p.Gly579Glu突变，即其356位氨基酸从Leu突变为Pro,其170位氨基酸从Ser突变为Gly，其579位氨基酸从Gly突变为Glu。

ABCB6基因（MIM:*605452），位于2号染色体，包含19个外显子，编码含842个氨基酸的三磷酸腺苷结合盒转运子（ABC）B亚族成员ABCB6，是一种对亚铁血红素生物合成很重要的线粒体输送器。而ABCB6蛋白是MDR/TAP亚族中的一个成员（ABC基因分成7个显著的基因家族：ABC1、MDR/TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20、White），广泛表达于多个组织中，尤其是心脏以及骨骼肌肉系统。目前，已有研究报道斑马鱼中与ABCB6同源的基因abcb6，在眼睛和中枢神经系统中表达；ABCB6基因上的leu811val突变曾在一个中国家系中被报道导致眼球缺损；而该基因上的Ala57Thr突变也曾在3个印度小眼畸形患者中被报道，该基因可能与小眼畸形有关。但是，尚未见该基因与遗传性泛发性色素异常症相关的报道。

本发明的发明人首次提出ABCB6基因在表皮基层表达，并可能在皮肤色素沉着过程中起着重要作用。并且，本发明首次提出ABCB6基因是遗传性泛发性色素异常症的致病相关基因，ABCB6基因的c.1067T>C（exon5），c.508A>G（exon1），c.1736G>A（exon12）突变导致DUH。根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：2相比，该多肽具有选自下列的至少一种突变：p.Leu356Pro、p.Ser170Gly、p.Gly579Glu突变。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码ABCB6突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感遗传性泛发性色素异常症。

筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法可以包括以下步骤：

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品ABCB6是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中ABCB6是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含ABCB6编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集ABCB6外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用ABCB6基因外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集ABCB6外显子，从而能够进一步提高筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，ABCB6基因外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些ABCB6基因外显子特异性引物具有如下表所示的核苷酸序列，即SEQIDNO：3-26所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对ABCB6外显子尤其是c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变所在的5、1、12号外显子序列的扩增。需要说明的是，这些SEQIDNO：3-26所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

	上游引物(5’→3’，SEQIDNO：)	下游引物(5’→3’，SEQIDNO：)
			ABCB6-3	ATTCCCTGTCATCATTCCTT（3）	CCTCTGCCCGCATTACCT（4）
ABCB6-1	CGCCCAGCGGCTACGTGA（5）	CCCCTCCCTTCTCCCTTT（6）
			ABCB6-2	CCAGTCCCCGGCCCTATTATAAGTAGT（7）	CTCCAGCCTGGTGACAGAGCAAGACT（8）
ABCB6-4	GGTTGATTTAGCCACCCA（9）	GAGACCCGCCCATCACAT（10）
			ABCB6-5	CCTCCCTGTGGAATCTGG（11）	CAACCTGTGGCAATCAAG（12）
ABCB6-6	GAGGCAGGATCTTGGATG（13）	ACCAGAGCTGCTAGTAGGC（14）
			ABCB6-7	GTGGTGTTTCTCGTGCTTG（15）	AATCCGGTTGCCTATCGT（16）
ABCB6-8	AGAATCGCTTGAACCTGG（17）	TGGCACCATACAAATCCTTA（18）
			ABCB6-9	TTATTACCACAGCCTCTTATCC（19）	ACTGCTCCTGCCACTCAA（20）
ABCB6-10	TTCTGCTGGATGAGGTGC（21）	GAGGCTTAGTGTCTTCAGAGGT（22）
			ABCB6-11	TGAGTGGCAGGAGCAGTT（23）	CCCAAGACCAGGATGAAAT（24）
ABCB6-12	GCTTCCTTGATTGCCACAG（25）	AAGCACGAGAAACACCACAC（26）

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司MultiplexingSamplePreparationGuide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-EndSamplePrepGuide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应ABCB6的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变，则指示生物样品易感遗传性泛发性色素异常症。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法，可以有效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQIDNO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统1000包括：核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集ABCB6外显子，进一步提高筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有ABCB6基因外显子特异性引物，以便利用ABCB6基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，ABCB6基因外显子特异性引物具有如SEQIDNO：3-26所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1的区别判断生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A的至少一种突变，判断生物样品是否易感遗传性泛发性色素异常症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQIDNO：1相比，具有c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A的至少一种突变，是生物样品易感遗传性泛发性色素异常症的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQIDNO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，例如根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的试剂盒包括：适于检测ABCB6基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，该ABCB6基因突变体具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测ABCB6基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测ABCB6编码基因的试剂，也可以是检测ABCB6突变体的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针。由此，可以高效地筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例1全外显子组测序确定致病基因及突变位点

1、样本收集：

发明人收集到一个5代的中国华中区DUH患者家系。其中，图2显示了上述DUH患者家系的家系图谱以及该家系中先证者V1的临床症状及病理检测图，其中，a为家系图谱，b-g为该家系的先证者V1的临床症状及病理检测图。如图2a所示，○表示正常女性；□表示正常男性；■表示男性患者；●表示女性患者；表示已故男性患者；表示已故女性患者；表示已故正常男性；表示已故正常女性；M/N表示患者；N表示正常人；以及V1表示先证者。该家系现有3代存活，共35个成员，其中患者13人（男性8人，女性5人）。

此外，发明人对上述家系现有所有患者进行了全面仔细的体检，结果显示所有患者均具有典型的DUH临床特征，但是无并发性系统疾病，而且各患者均无皮肤癌症状及视觉缺陷症状。其中，图2b-g显示了上述DUH患者家系的先证者V1的临床症状及病理检测图。先证者V1，男，9岁。患者自2岁始，无明显诱因于头、面、躯干和四肢部出现淡褐色至深褐色的色素沉着斑，间有色素减退斑，无自觉症状，皮损逐渐加重。既往史：体健，无其它遗传疾病史，无暴露部位光敏史，无家族近亲婚配史。体检：系统检查未见异常。皮肤科情况：面、颈（见图2b）躯干和四肢(见图2d和图2e)，手足部(见图2c)可见褐色色素沉着斑和色素减退斑夹杂存在，散在分布，四肢末端皮损与全身皮损分布无异常。皮损呈米粒至豌豆大小的圆形或不规则形状，散在分布，境界清楚。组织病理检查显示：角化过度，棘层变薄，皮突消失，灶状基底细胞液化变性，基底层色素增多且有中断部分，真皮浅层较多黑素颗粒及嗜黑素细胞，血管周围少量淋巴细胞浸润。病理诊断为：遗传性泛发性色素异常症（见图2f和图2g）。

发明人收集获得上述DUH患者家系中尚在世的9个患者以及12个正常人的样本。

2、全外显子组测序确定致病基因及突变位点

发明人利用AgilentSureselect38MKit结合Solexa高通量测序技术对上述DUH患者家系中的病例IV13、V1以及正常个体IV6（编号可参见图2a）进行了外显子测序，具体步骤如下：

2.1样品制备

取IV13、V1以及正常个体IV6的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提抽提基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg，备用。

2.2文库构建及测序

利用超声波仪（CovarisS2,Massachusetts,USA）将各基因组DNA样本随机打断成200-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediatedPCR(LM-PCR)的线性扩增与SureSelectBiotinylatedRNALibrary(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序，测序平台为IlluminaHiseq2000，读取长度为90bp，样本的平均测序深度为59.2×。

2.3变异检测、注释及数据库比较

利用IlluminabasecallingSoftware1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner/SOAP2（可参见：LiR,LiY，KristiansenK,etal，SOAP:shortoligonucleotidealignmentprogram.Bioinformatics2008,24(5):713-714；LiR,YuC,LiY，eaal,SOAP2:animprovedultrafasttoolforshortreadalignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967，通过参照将其全文并入本文）比对到参考基因组Hg18(snp129)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：LiR,LiY，FangX,YangH,etal,SNPdetectionformassivelyparallelwhole-genomeresequencing.GenomeRes2009,19(6):1124-1132，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

在得到测序结果之后，对非同义突变、剪接受体/供体位点突变、编码区插入和缺失突变这三类最有可能与病理相关的突变进行研究。结果，发明人在3个测序样本中共发现43347个单核苷酸多态性（SNPs）和243处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi）、千人基因组数据库（www.1000genomes.org）、HapMap8数据库（http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov）等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。去掉同义突变，将剩下的非同义/剪接位点突变和微小插入缺失根据以下特征进行优先选择：（a）选择两个患者中共有的同基因同位点同突变型的突变，过滤掉正常人中存在的突变，还剩下4个SNP突变位点和5个Indel突变；（b）由于该疾病从系谱图上分析符合常染色体显性病遗传，故再过滤掉2个纯合Indel突变位点。由此，剩下4个SNP突变位点和3个Indel突变位点，其中，经SIFT，ployphen2，Condel和MutationTaster预测，这4个SNP突变位点均为有害的突变。

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，接下来，发明人又利用Sanger测序方法，对上述确定的4个SNP突变和3个Indel突变在该DUH患者家系内进行了验证，结果显示仅ABCB6基因5号外显子上的c.1067T>C突变在家系内共分离。由此，表明ABCB6基因为遗传性泛发性色素异常症的致病相关基因，c.1067T>C突变是遗传性泛发性色素异常症的致病突变。

实施例2Sanger法测序验证遗传性泛发性色素异常症的致病基因

分别对均来源于中国华中区的实施例1所述的DUH患者家系中的21人（5个男性患者、4个女性患者及12个家系内正常人，即图2a中由M/N及N标注的，M/N：患者，N：正常人，以及先证者V1）、6个散发患者以及200个家系外正常人的ABCB6基因进行检测，针对ABCB6基因的所有外显子序列设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得ABCB6有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证ABCB6与遗传性泛发性色素异常症之间的相关性。具体方法步骤如下：

样本来源信息表

1、DNA提取

分别采集中上述DUH患者家系中的9名患者和12名家系内正常人、6个散发患者以及200个家系外正常人的外周静脉血，然后利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量所提取DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/微升，总量不少于30μg，由此，获得227种DNA样品，备用。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库GRCh36/hg18，设计得到具有SEQIDNO：3-26所示的核苷酸序列的ABCB6基因外显子特异性引物，具体见下表。

ABCB6基因外显子特异性引物

	上游引物(5’→3’，SEQIDNO：)	下游引物(5’→3’，SEQIDNO：)10 -->
			ABCB6-3	ATTCCCTGTCATCATTCCTT（3）	CCTCTGCCCGCATTACCT（4）
ABCB6-1	CGCCCAGCGGCTACGTGA（5）	CCCCTCCCTTCTCCCTTT（6）
			ABCB6-2	CCAGTCCCCGGCCCTATTATAAGTAGT（7）	CTCCAGCCTGGTGACAGAGCAAGACT（8）
ABCB6-4	GGTTGATTTAGCCACCCA（9）	GAGACCCGCCCATCACAT（10）
			ABCB6-5	CCTCCCTGTGGAATCTGG（11）	CAACCTGTGGCAATCAAG（12）
ABCB6-6	GAGGCAGGATCTTGGATG（13）	ACCAGAGCTGCTAGTAGGC（14）
			ABCB6-7	GTGGTGTTTCTCGTGCTTG（15）	AATCCGGTTGCCTATCGT（16）
ABCB6-8	AGAATCGCTTGAACCTGG（17）	TGGCACCATACAAATCCTTA（18）

ABCB6-9	TTATTACCACAGCCTCTTATCC（19）	ACTGCTCCTGCCACTCAA（20）
			ABCB6-10	TTCTGCTGGATGAGGTGC（21）	GAGGCTTAGTGTCTTCAGAGGT（22）
ABCB6-11	TGAGTGGCAGGAGCAGTT（23）	CCCAAGACCAGGATGAAAT（24）
			ABCB6-12	GCTTCCTTGATTGCCACAG（25）	AAGCACGAGAAACACCACAC（26）

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应：

2.1、ABCB6-1~11

针对ABCB6-1~11外显子，按以下配比分别配制各基因组DNA样本的各PCR反应体系（不同的突变位点采用相同的反应体系）：

反应体系：50μL

然后，将配制获得的ABCB6-1~ABCB6-11的各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应（不同的突变位点采用相同的反应条件）：

反应条件：

2.2、ABCB6-12

针对ABCB6-12外显子，按以下配比分别配制各基因组DNA样本的各PCR反应体系（不同的突变位点采用相同的反应体系）：

然后，将配制获得的ABCB6-12的各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应（不同的突变位点采用相同的反应条件）：

反应条件：

由此，获得上述DUH患者家系中的9例患者和12名家系内正常人、6个散发患者以及200个家系外正常人的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的获自该DUH患者家系中的9例患者和12名家系内正常人、6个散发患者以及200个家系外正常人的PCR扩增产物直接进行DNA测序（ABIPrism3130XL）。

接着，基于测序结果，对上述各样本进行ABCB6基因编码序列比对。根据序列测定及比对结果，来验证ABCB6与DUH之间的相关性。

结果，发明人发现，该DUH患者家系的家系内患者及其家系内正常人的ABCB6基因c.1067T>C出现共分离现象，家系内患者均携带c.1067T>C突变；2个散发患者中分别存在ABCB6基因c.508A>G（exon1），c.1736G>A（exon12）突变；200个家系外正常人的ABCB6基因均未发现c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变。即，DUH患者家系内患者、其中2个散发患者分别携带c.1067T>C（exon5），c.508A>G（exon1），c.1736G>A（exon12）突变，而家系内外的正常人均为野生型。

由此，发明人在患者家族成员中对ABCB6基因5号外显子的序列进行突变排查发现DUH患者家系的9个患者均具有c.1067T>C突变；此外，发明人还发现2个散发患者分别具有为1号外显子c.508A>G突变和12号外显子c.1736G>A突变；而200个家系外正常人中均未发现上述突变。由此，证明ABCB6基因的c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变是遗传性泛发性色素异常症的致病突变。

其中，图3显示了本实施例中DUH患者家系中的患者及正常人，以及具有ABCB6基因突变的散发患者及家系外正常人的ABCB6基因突变位点的Sanger测序验证峰图。如图3所示，DUH患者家系中患者的ABCB6基因具有c.1067T>C（exon5）突变，而该家系中的正常人不具有该突变；散发病例1的ABCB6基因具有c.508A>G（exon1）突变，散发病例2的ABCB6基因具有c.1736G>A（exon12）突变，而家系外正常人在相应位点上均不存在该突变。

需要说明的是，已知，ABCB6（MIM:*605452）基因位于2号染色体，包含19个外显子，其编码的含842个氨基酸的三磷酸腺苷结合盒转运子（ABC）B亚族成员ABCB6，位于线粒体膜外部，被认为是哺乳类线粒体卟啉运输器。然而，近来的研究表明ABCB6在多种细胞类型中糖基化并且存在于包含内质网、高尔基氏体以及质膜的分泌途径中。而本发明发明人发现，ABCB6位于黑化的人的黑色素体膜和B16细胞树突中。这一发现和Kissetal之前的发现相吻合，Kissetal证明了ABCB6显现在红色成熟过程的最后一步时网织红细胞释放出来的外来体中。由此，发明人推测ABCB6作为运输者可能在生黑色素细胞中起到重要作用，可能运输关键分子用于黑色素合成或参与黑色素体成熟，也可能参与黑色素体排序，或者对于从生黑色素细胞运输黑色素体到角质细胞起关键作用。已有研究发现，皮肤色素沉着现象与许多生理因素相联系，黑素小体发生取决于包含络氨酸酶、络氨酸酶相关的蛋白质1、异构酶、ATP7A和BLOC-1的酶和运输器，在成熟过程中，黑色素体从细胞和周围区域转移到质膜。本发明的发明人发现，ABCB6基因与皮肤色素沉着显著相关，该基因中三个突变c.1067T>C、c.508A>G、c1736G>A可能导致了黑色素合成缺陷，从而导致突变体ABCB6蛋白质无法留在黑色素体上。由此，表明ABCB6蛋白可能为黑色素体膜上的限速因子之一，其可能传输关键分子用于合成黑色素，或者在从生黑色素细胞中的黑色素体到角质细胞的传输中起关键作用，而DUH的致病基因可能影响了皮肤黑色素调节缺失中的功能和结果。

综上，发明人进一步证明了ABCB6基因为遗传性泛发性色素异常症的致病相关基因，且该基因的c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A突变为遗传性泛发性色素异常症的治病突变。

实施例3Sanger法测序验证遗传性泛发性色素异常症的致病突变

分别对实施例2所得到的ABCB6基因的c.508A>G和c.1736G>A的致病突变进行验证，即利用前述的ABCB6基因的1和12号外显子特异性引物（即SEQIDNO：5-6以及SEQIDNO：25-26所示的核苷酸序列），分别按照实施例2中的相应方法，对实施例2中获得的来源于中国华中区的2个散发患者以及200个家系外正常人的基因组DNA样本进行ABCB6基因突变位点的Sanger法测序验证。结果证明，2个散发患者分别确实具有1号外显子c.508A>G突变和12号外显子c.1736G>A突变；而在与患者来自同一区域的200个正常人中均未发现上述突变。

由此，发明人进一步证明了ABCB6基因的c.508A>G和c.1736G>A突变是遗传性泛发性色素异常症的致病突变。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种分离的编码ABCB6突变体的核酸，其特征在于，相对于野生型ABCB6基因，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A。

2.根据权利要求1所述的分离的编码ABCB6突变体的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA。

3.一种分离的多肽，其特征在于，所述分离的多肽为ABCB6突变体，相对于野生型ABCB6具有选自下列的至少一种突变：p.Leu356Pro、p.Ser170Gly、p.Gly579Glu。

4.根据权利要求3所述的分离的多肽，其特征在于，所述多肽是由权利要求1或2所述的核酸编码的。

5.一种用于筛选易感遗传性泛发性色素异常症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

特异检测ABCB6基因突变体的试剂，其中相对于野生型ABCB6基因，所述ABCB6基因突变体具有选自下列的至少一种突变：c.1067T>C、c.508A>G、c.1736G>A。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针。