CN109536597A - 一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法 - Google Patents

一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法，其特征在于：包括用于ApoE基因分型检测的混合液和含有重组DNA的质控品，所述用于ApoE基因分型检测的混合液包括用于ApoE基因分型检测的特异性引物对、特异性探针对、Taq HS DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反应缓冲液和反应增强剂。本发明联合采用荧光PCR‑MGB探针法和AMRS‑PCR法的基本原理，通过增加增强液，并同时优化配比，从而提高检测的灵敏度，则无需另外加入管家基因或者内参，与同类技术相比，操作更便捷，检测更迅速，准确率更高，特别适合血液基因组DNA样本的检测，适合推广应用和产业化。

Description

一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒 及其PCR方法
技术领域
本发明涉及的试剂盒属于体外检测技术领域，是一种适合血液基因组 DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒及其PCR方法。
背景技术
ApoE是载脂蛋白E(apolipoprotein E)的缩写，ApoE主要在肝脏和脑 中产生，其主要功能是参与脂类，特别是胆固醇，在血液循环系统和中枢神 经系统的运输，并且还是低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白和乳糜微粒受体的 配体，同时参与脂和脂蛋白代谢有关酶活性的调节，ApoE的表型是由位于一 个基因上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于 一个主要异构体产生三种纯合子(E2/E2，E3/E3，E4/E4)和三种杂合子 (E2/E3，E2/E4，E3/E4)共六种常见表型，自然人群中，E3基因频率分布 最高，在中国人群中，ApoE3/E3表型分布约占70％，ApoE基因的多态性与阿 尔海默氏症(AD)、冠心病等疾病密切相关，目前公认ApoE4基因是晚发型 AD发病的一个高风险因素，携带一个E4基因的人群(检测为E2/E4或E3/E4 分型)患AD的风险是未携带者的2-3倍,携带两个携带E4基因的人群(检 测为E4/E4分型)患AD的风险是未携带者的12-15倍。ApoE基因多态性还 与血脂异常，心脑血管疾病等有密切关系。ApoE基因分型是个体间血脂水平 差异的重要遗传因素，与血脂异常的发生密切相关。研究发现ApoE4等位基 因携带者具有较高的TC(总胆固醇)和LDL-C(低密度脂蛋白)水平，而ApoE2 等位基因携带者具有较低的TC和LDL-C水平。携带E4基因的冠心病患者心 肌梗死发生率更高，且E4等位基因与冠脉病变的严重程度具有相关性。
目前，检测ApoE基因多态性的方法有很多，包括普通的AMRS-PCR方法， 测序法，和荧光PCR法等，AMRS-PCR方法耗时较长，操作步骤繁琐，需要跑 琼脂糖电泳，涉及到环境污染的问题，而且检测的灵敏度较低。一代测序是 行业的金标准，但是由于测序需要先PCR扩增，再读取信号，不是封闭系统， 容易产生污染，荧光PCR法由于其操作步骤简便，耗时较短，准确性和灵敏 度高等优点，越来越受到广大研发人员的青睐，荧光PCR法比较常见的有HRM 法和探针法，但基于荧光PCR平台检测ApoE基因多态性的现有方法仍有一 些不足：
(1)ApoE基因涉及两个位点，多管检测操作步骤比较多且容易形成假 阳性，而单管多重PCR的检测方法，由于很多厂家的荧光PCR仪没有多个荧 光通道而检测的时候受到限制，结果分析也比较麻烦；
(2)ApoE基因的序列是典型的高GC含量的序列，用普通的荧光探针检 测灵敏度比较低，用血液基因组DNA提取试剂盒提取的DNA样本浓度大概在 10-100ng/μL左右，一些陈旧的血液提取率更低，且含有血红素等PCR抑制 剂，因此存在用了荧光PCR的方法，在特殊条件下提取的DNA的浓度过低且 含有杂质，仍然不能准确检测血液中提取的DNA样本的分型情况。
因此，研发出的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的 试剂盒可以有效解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测 的试剂盒及其PCR方法，联合采用荧光PCR-MGB探针法和AMRS-PCR法的基 本原理，通过增加增强液，并同时优化了配比，从而有效提高检测的灵敏度， 则不需要另外加入管家基因或者内参，与同类技术和产品相比，操作更便捷， 检测更迅速，准确率更高，特别适合血液基因组DNA样本的检测，适合推广 应用和产业化。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，包括两 组用于ApoE基因分型检测的混合液和三组含有重组DNA的质控品，两组所 述用于ApoE基因分型检测的混合液包括用于ApoE基因分型检测的特异性引 物对、特异性探针对、Taq HS DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反 应缓冲液和反应增强剂。
进一步地，所述用于ApoE基因分型检测特异性引物对包括分别检测 rs429358位点和rs7412位点的第一组引物和第二组引物，其中，
第一组引物：
检测rs429358位点的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ 1；
检测rs429358位点的引物对的下游引物的核苷酸序列为SEQ 2。
第二组引物：
检测rs7412位点的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ 3；
检测rs7412位点的引物对的下游引物的核苷酸序列为SEQ 4。
进一步地，所述用于ApoE基因分型检测特异性探针对设置为与所述第 一组引物和第二组引物配合使用的第一组探针和第二组探针，且该第一探针 和第二探针均为3’端带有荧光基团BHQ-MGB的探针，其中，
第一组探针:
检测rs429358位点的第一条探针的核苷酸序列为SEQ 5，5’端和3’ 端的荧光基团分别为VICTM和BHQ-MGB；
检测rs429358位点的第二条探针的核苷酸序列为SEQ 6，5’端和3’ 端的荧光基团分别为FAMTM和BHQ-MGB。
第二组探针：
检测rs7412位点的第一条探针的核苷酸序列为SEQ 7，5’端和3’端 的荧光基团分别为VICTM和BHQ-MGB；
检测rs7412位点的第二条探针的核苷酸序列为SEQ 8，5’端和3’端 的荧光基团分别为FAMTM和BHQ-MGB。
进一步地，所述Taq HS DNA聚合酶由下列物质混合而成： 20mmol/L的pH值为8.0三(羟甲基)氨基甲烷、100mmol/L的氯化钾、 0.1mmol/L的乙二胺四乙酸、1mmol/L二硫苏糖醇、0.5％的Tween 20、0.5％ 的乙基苯基聚乙二醇、50％的甘油。
进一步地，所述反应缓冲液由下列物质混合而成：100mmol/L的pH8.3 三(羟甲基)氨基甲烷、500mmol/L的氯化钾、15mmol/L氯化镁。
进一步地，所述反应增强液由下列物质混合而成：10mmol/L的亚精胺、 10mmol/L的岩藻糖、1mmol/L的N-乙酰基-D-葡萄胺、0.5％的肌醇。
进一步地，三组所述含有重组DNA的质控品包括第一阳性质控品、第二 阳性质控品、第三阳性质控品，所述第一阳性质控品、第二阳性质控品、第 三阳性质控品的浓度均为104copies/μL，其中所述第一阳性质控品选用 ApoE基因E2/E2分型的重组质粒，所述第二阳性质控品选用ApoE基因E4/E4 分型的重组质粒，所述第三阳性质控品选用ApoE基因E2/E4分型的重组质 粒。
进一步地，在每组20μL反应体系中，加入所述用于ApoE基因分型检 测的混合液的用量为18μL，所述含有重组DNA的质控品的用量为2μL， 其中所述用于ApoE基因分型检测的混合液中的各组分配比分别为 用于ApoE基因分型检测的特异性引物对的浓度为10μmol/L，用量为0.4μ L；
用于ApoE基因分型检测的特异性探针对的浓度为10μmol/L，用量为0.4μ L；
Taq HS DNA聚合酶的浓度为5U/μL，用量为1μL；
脱氧核糖核苷三磷酸混合液的浓度为4mmol/L，用量为1.6μL；
反应缓冲液的用量为2μL；
反应增强剂的用量为3μL。
进一步地，荧光PCR反应按四步扩增循环程序进行，且该荧光PCR反应 的条件为：第一步60℃，30s，收集荧光信号；第二步95℃，2min；第三步 95℃，15s和60℃，1min，循环40次，每次分别收集荧光信号；第四步60℃， 30s，收集荧光信号。
进一步地，所述荧光PCR反应按照不同仪器的说明选择Genotyping分 型程序，反应结束后，根据荧光值曲线并结合试剂盒说明书附图作出分析， 或导出实验结果，根据样本名称、检测的位点和“Call”值并结合试剂盒说 明书判断标准作出分析或者直接用荧光曲线对照说明书判断标准进行分析。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1、本发明在用于ApoE基因分型检测的混合液里加入了一种特制的反应 增强液，该反应增强液含四种添加剂，适合血液基因组DNA样本的PCR实验， 其中的亚精胺和岩藻糖的组合可以有效减轻血液中如血红素等PCR抑制剂对 PCR扩增的干扰，N-乙酰基-D-葡萄胺和肌醇的加入可以保护这种抗干扰能力 不受PCR实验时高温的影响，从而有效提高血液基因组DNA样本ApoE基因 分型的检测的灵敏度，从而使该试剂盒具有检测快速并准确的优点；
2、本发明提供的试剂盒在设计的时候，根据目前主流的荧光定量PCR 仪(RocheLightCycler 480、ABI 7500和ABI ViiATM7)的软件运行情况和 结果分析，选择了三个阳性质控品，而第三阳性质控品的加入，可以更好的 把杂合分型和纯合分型区分开，极大的提高了仪器识别和读取分型的准确 性，另外，本发明提供的试剂盒只使用了两种荧光通道(FAMTM和VICTM)， 适用于市面上常见的荧光定量PCR仪；
3、本发明对荧光PCR反应后的结果判定也较为简便，无需解读大量的 数据和图形，可直接根据荧光值曲线结合试剂盒说明书附图进行分析，也可 以导出实验结果，根据样本名称、检测的位点和“Call”值，结合试剂盒说 明书附表，综合两管的SNP分型判读ApoE基因分型。
附图说明
图1是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的纯合分型探针优选前后效 果比较图；
图2是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的杂合分型探针优选前后的 效果比较图；
图3是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的探针优选前后效果比较的 散点图；
图4是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的加入反应增强液前后效果 比较图；
图5是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的加入反应增强液后的标准 曲线图；
图6是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的加入第三阳性质控品前后 效果对比图；
图7是本发明检测ApoE基因分型的试剂盒的荧光曲线判定标准示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一 步的描述。
试剂盒的检测样本为血液基因组DNA，检测原理是联合采用荧光PCR-MGB 探针法和AMRS-PCR法的特异性扩增血液基因组DNA目的基因片段，继之根 据扩增曲线，能快速并精准在待检样本中提取血液基因组DNA，具有极高的 灵敏度和准确性。
检测所需的主要设备有荧光定量PCR仪(Roche LightCycler 480、ABI 7500和ABIViiATM7)等。
一、本试剂盒包括如下部分：
两组用于ApoE基因分型检测的混合液和三组含有重组DNA的质控品， 两组所述用于ApoE基因分型检测的混合液包括用于ApoE基因分型检测的特 异性引物对、特异性探针对、Taq HS DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸混 合液、反应缓冲液和反应增强剂。
1、用于ApoE基因分型检测特异性引物对包括分别检测rs429358位点和 rs7412位点的第一组引物和第二组引物，其中，
第一组引物：
检测rs429358位点的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ 1；
检测rs429358位点的引物对的下游引物的核苷酸序列为SEQ 2。
第二组引物：
检测rs7412位点的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ 3；
检测rs7412位点的引物对的下游引物的核苷酸序列为SEQ 4。
2、用于ApoE基因分型检测特异性探针对设置为与所述第一组引物和第二组 引物配合使用的第一组探针和第二组探针，且该第一探针和第二探针均为3’ 端带有荧光基团BHQ-MGB的探针，这样的探针比普通探针的特异性更强，特 别适合ApoE基因这种高GC含量的序列，其中，
第一组探针:
检测rs429358位点的第一条探针的核苷酸序列为SEQ 5，5’端和3’ 端的荧光基团分别为VICTM和BHQ-MGB；
检测rs429358位点的第二条探针的核苷酸序列为SEQ 6，5’端和3’ 端的荧光基团分别为FAMTM和BHQ-MGB。
第二组探针：
检测rs7412位点的第一条探针的核苷酸序列为SEQ 7，5’端和3’端 的荧光基团分别为VICTM和BHQ-MGB；
检测rs7412位点的第二条探针的核苷酸序列为SEQ 8，5’端和3’端 的荧光基团分别为FAMTM和BHQ-MGB。
3、Taq HS DNA聚合酶由下列物质混合而成：
20mmol/L的pH值为8.0三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、100mmol/L 的氯化钾(KCl)、0.1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、1mmol/L二硫苏糖 醇(DTT)、0.5％的Tween 20、0.5％的乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、 50％的甘油(Glycerol)。
4、反应缓冲液由下列物质混合而成：
100mmol/L的pH8.3三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)的、500mmol/L 的氯化钾(KCl)、15mmol/L氯化镁(MgCl2)。
5、反应增强液由下列物质混合而成：
10mmol/L的亚精胺、10mmol/L的岩藻糖、1mmol/L的N-乙酰基-D- 葡萄胺、0.5％的肌醇。
该反应增强液含四种添加剂，特别适合血液基因组DNA样本的PCR实验， 其中的亚精胺和岩藻糖的组合可以有效减轻血液中如血红素等PCR抑制剂对 PCR扩增的干扰，N-乙酰基-D-葡萄胺和肌醇的加入可以保护这种抗干扰能力 不受PCR实验时高温的影响。
6、三组所述含有重组DNA的质控品包括第一阳性质控品、第二阳性质控品、 第三阳性质控品，所述第一阳性质控品、第二阳性质控品、第三阳性质控品 的浓度均为104copies/μL，其中所述第一阳性质控品选用ApoE基因E2/E2 分型的重组质粒，所述第二阳性质控品选用ApoE基因E4/E4分型的重组质 粒，所述第三阳性质控品选用ApoE基因E2/E4分型的重组质粒。
参见附图6，仅加入第一阳性质控品和第二阳性质控品，有部分分型无 法识别出来，然后通过加入第三阳性质控品，可以将原有不能识别的分型进 行区分，从而相比较得出，极大的提高了仪器识别和读取分型的准确性。 二、试剂盒反应体系
在每组20μL反应体系中，加入所述用于ApoE基因分型检测的混合液 的用量为18μL，所述含有重组DNA的质控品的用量为2μL，其中所述用于 ApoE基因分型检测的混合液中的各组分配比分别为用于ApoE基因分型检测 的特异性引物对的浓度为10μmol/L，用量为0.4μL；用于ApoE基因分型 检测的特异性探针对的浓度为10μmol/L，用量为0.4μL；Taq HSDNA聚合 酶的浓度为5U/μL，用量为1μL；脱氧核糖核苷三磷酸混合液的浓度为 4mmol/L，用量为1.6μL；反应缓冲液的用量为2μL；反应增强剂的用量为 3μL。
三、试剂盒的具体检测步骤如下：
1、检测反应液配制
(1)将试剂盒内所有组分室温融化，混匀并短暂离心处理。
(2)每个样本的检测都需要两个PCR反应管，例如A管和B管，A管加入 PCR反应液A，B管加入PCR反应液B，每个PCR管的反应体系的配制见表1。 每次检测都需要分别设置阳性质控品1、2、3对照和阴性质控品对照，每种 阳性质控品设置两个重复。PCR布局设置方法见表2。
注：阳性质控品设置两个重复可以使仪器的Genotyping分型程序判断 分型更加准确，若只采用荧光曲线判断基因分型，可只加阳性质控品3和阴 性质控品，不设置重复。
表1 PCR反应体系表
名称 用量
PCR反应液A或B 18μL
样本DNA或质控品 2μL
反应体系 20μL
表2 PCR布局设置方法
(3)依次加好样后，盖上PCR反应管盖并进行离心处理，使所加试剂聚集 到管底，放入仪器样品槽。
2、PCR扩增及荧光检测
(1)根据不同仪器类型，选择相应Genotyping分型检测程序，具体按照仪 器操作说明进行程序编辑。
(2)仪器检测荧光选择见表3，A管对应SNP位点112，B管对应SNP位点 158。参比荧光选择“None”。
表3 检测荧光选择表
(3)反应体系设置为20μL，PCR扩增程序设定如下：
第一步：60℃30s，收集荧光(Roche LightCycler 480仪器不需要该步)；
第二步：95℃2min；
第三步：95℃15s，60℃1min，40个循环，收集荧光；
第四步：60℃30s，收集荧光；
保存文件后，运行程序。
四、试剂盒检测的结果判定方法如下：
1、阳性判断值或者参考区间
(1)反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，三种适用机型基线和阈值设定的 推荐值参见表4，实际使用中可在推荐值上下进行调整，保证阈值设定在扩 增曲线的指数扩增期内。
(2)检测结果除阴性对照管外，其他所有反应均应出现两条荧光曲线，且至 少一条荧光曲线Ct值≤Cutoff值，才可进行ApoE基因分型分析。若Ct 值均>Cutoff值，则检测结果无效，需要重新取样进行检测。三种适用机 型的Cutoff值参见表4。
(3)阴性对照管扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期；否则检测 结果无效。
(4)检测结果无效的样本建议重新取样。
表4 基线和阈值设定
2、检验结果的解释
若检测结果有效，按照以下条件进行结果判断：
(1)通过Genotyping分型程序结果的“Call”值判断ApoE基因分型：程序 运行结束后，根据样本名称、检测的位点和“Call”值，对照表5，综合A 管和B管的“Call”值判读ApoE基因分型，也可导出实验结果(xls或pdf 格式)进行分析。其中E2/E2、E4/E4、E3/E3分型为纯合分型，E2/E3、E3/E4、 E2/E4为杂合分型。
表5 ApoE基因分型判定表
注：红、蓝和绿三种颜色标记是ABI公司ViiATM7和7500型仪器“Call” 值和散点图里区分两个纯合分型和杂合分型的方式。Roche LightCycler 480 检测结果标记的颜色与这两台仪器不同。
(2)通过荧光曲线判断ApoE基因分型：若通过检测结果中的“Call”值 不能直接判读分型，可以通过荧光曲线判定A管和B管的SNP分型(判定标 准请参阅附图7和表6所示)，ABI ViiATM7和7500的检测结果根据表6的 标记对照表7直接读出ApoE基因分型，RocheLightCycler 480的检测结果 对照表5判读ApoE基因分型。
注：以上示意图均来自于ABI 7500型荧光定量PCR仪检测结果，不同 型号仪器的荧光曲线略有差异。ABI公司的ViiATM7和7500型仪器“VIC”标 记的探针的荧光曲线为绿色，“FAM”标记的探针的荧光曲线为蓝色。Roche LightCycler 480仪器的荧光曲线为其他颜色。
表6 荧光曲线判定标准
表7 ApoE基因分型和标记对照表(ABI ViiATM7和7500)
基因分型 A管 B管 基因分型 A管 B管
E2/E2 绿 绿 E2/E4 杂 杂
E2/E3 绿 杂 E3/E4 杂 蓝
E3/E3 绿 蓝 E4/E4 蓝 蓝
3、若根据以上步骤仍无法确定基因分型，建议该样本重新进行检测。
参见附图1、图2和图3，本发明采用荧光PCR探针法，所有探针均选 择3’端带有荧光基团BHQ-MGB的探针，由于MGB本身可以提高探针与模板 的结合稳定性，进而提高SNP的辨别力，并且MGB探针还都包括一个不发荧 光的猝灭基团(NFQ)，降低了背景荧光，提高信噪比，从而提高检测灵敏性， 但并不是所有3’端带有荧光基团BHQ-MGB的探针都适用ApoE基因分型的检 测，本发明提供的探针序列已经进行了多次优化，最终确定了检测rs429358位点和rs7412位点的各两条探针，优化后的探针对纯合分型和杂合分型的 区分程度更明显，散点图上检测点更集中，检测特异性更好，更方便直观的 分析结果。
本发明首次在用于ApoE基因分型检测的混合液里加入了一种特制的反 应增强液，该反应增强液含四种添加剂，适合血液基因组DNA样本的PCR实 验，其中的亚精胺和岩藻糖的组合可以有效减轻血液中如血红素等PCR抑制 剂对PCR扩增的干扰，N-乙酰基-D-葡萄胺和肌醇的加入可以保护这种抗干 扰能力不受PCR实验时高温的影响，同时这种增强液特别适合对血液基因组 DNA样本ApoE基因分型的检测，20μL反应体系中血液基因组DNA的最低检 测限为0.5ng/μL，并且不会影响阳性质控品作为模板时的PCR扩增。
参见附图4，加入反应增强液优化后检测时CT值提前了，从而有效提高 血液基因组DNA样本ApoE基因分型的检测的灵敏度，从而使该试剂盒具有 检测快速并准确的优点。
参见附图5，加入反应增强液优化后,样本DNA浓度从102copies/μ L-107copies/μL做标准曲线，均能有良好的扩增，扩增效率达到99％，目 前用血液基因组DNA提取试剂盒提取的DNA样本浓度大概在10-100ng/μL， 换算成拷贝数在102copies/μL-105copies/μL，也就是说本试剂盒优化后完 全适合对血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测。
参见附图6，本发明提供的试剂盒在设计的时候，根据目前主流的荧光 定量PCR仪(Roche LightCycler 480、ABI 7500和ABI ViiATM7)的软件运 行情况和结果分析，选择了三个阳性质控品，而第三阳性质控品的加入，可 以更好的把杂合分型和纯合分型区分开，极大的提高了仪器识别和读取分型 的准确性，另外，本发明提供的试剂盒只使用了两种荧光通道(FAMTM和VICTM)， 适用于市面上常见的荧光定量PCR仪。
本发明对荧光PCR反应后的结果判定也非常简便，不需要解读大量的数 据和图形，可以直接根据荧光值曲线结合试剂盒说明书附图进行分析，也可 以导出实验结果(xls或pdf格式)，根据样本名称，检测的位点和“Call” 值，结合试剂盒说明书附表，综合两管的SNP分型判读ApoE基因分型。
本发明的特点：
本发明在用于ApoE基因分型检测的混合液里加入了一种特制的反应增 强液，该反应增强液含四种添加剂，适合血液基因组DNA样本的PCR实验， 其中的亚精胺和岩藻糖的组合可以有效减轻血液中如血红素等PCR抑制剂对 PCR扩增的干扰，N-乙酰基-D-葡萄胺和肌醇的加入可以保护这种抗干扰能力 不受PCR实验时高温的影响，从而有效提高血液基因组DNA样本ApoE基因 分型的检测的灵敏度，从而使该试剂盒具有检测快速并准确的优点；本发明 提供的试剂盒在设计的时候，根据目前主流的荧光定量PCR仪(Roche LightCycler480、ABI 7500和ABI ViiATM7)的软件运行情况和结果分析， 选择了三个阳性质控品，而第三阳性质控品的加入，可以更好的把杂合分型 和纯合分型区分开，极大的提高了仪器识别和读取分型的准确性，另外，本 发明提供的试剂盒只使用了两种荧光通道(FAMTM和VICTM)，适用于市面上 常见的荧光定量PCR仪；本发明对荧光PCR反应后的结果判定也较为简便，无需解读大量的数据和图形，可直接根据荧光值曲线结合试剂盒说明书附图 进行分析，也可以导出实验结果，根据样本名称、检测的位点和“Call”值， 结合试剂盒说明书附表，综合两管的SNP分型判读ApoE基因分型。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳 实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均 等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：包括两组用于ApoE基因分型检测的混合液和三组含有重组DNA的质控品，两组所述用于ApoE基因分型检测的混合液包括用于ApoE基因分型检测的特异性引物对、特异性探针对、Taq HS DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸混合液、反应缓冲液和反应增强剂。
2.根据权利要求1所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：所述用于ApoE基因分型检测特异性引物对包括分别检测rs429358位点和rs7412位点的第一组引物和第二组引物，其中，
第一组引物：
检测rs429358位点的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ 1；
检测rs429358位点的引物对的下游引物的核苷酸序列为SEQ 2。
第二组引物：
检测rs7412位点的引物对的上游引物的核苷酸序列为SEQ 3；
检测rs7412位点的引物对的下游引物的核苷酸序列为SEQ 4。
3.根据权利要求2所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：所述用于ApoE基因分型检测特异性探针对设置为与所述第一组引物和第二组引物配合使用的第一组探针和第二组探针，且该第一探针和第二探针均为3’端带有荧光基团BHQ-MGB的探针，其中，
第一组探针:
检测rs429358位点的第一条探针的核苷酸序列为SEQ 5，5’端和3’端的荧光基团分别为VICTM和BHQ-MGB；
检测rs429358位点的第二条探针的核苷酸序列为SEQ 6，5’端和3’端的荧光基团分别为FAMTM和BHQ-MGB。
第二组探针：
检测rs7412位点的第一条探针的核苷酸序列为SEQ 7，5’端和3’端的荧光基团分别为VICTM和BHQ-MGB；
检测rs7412位点的第二条探针的核苷酸序列为SEQ 8，5’端和3’端的荧光基团分别为FAMTM和BHQ-MGB。
4.根据权利要求1所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：所述Taq HS DNA聚合酶由下列物质混合而成：
20mmol/L的pH值为8.0三(羟甲基)氨基甲烷、100mmol/L的氯化钾、0.1mmol/L的乙二胺四乙酸、1mmol/L二硫苏糖醇、0.5％的Tween 20、0.5％的乙基苯基聚乙二醇、50％的甘油。
5.根据权利要求1所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液由下列物质混合而成：100mmol/L的pH8.3三(羟甲基)氨基甲烷、500mmol/L的氯化钾、15mmol/L氯化镁。
6.根据权利要求1所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：所述反应增强液由下列物质混合而成：10mmol/L的亚精胺、10mmol/L的岩藻糖、1mmol/L的N-乙酰基-D-葡萄胺、0.5％的肌醇。
7.根据权利要求1所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：三组所述含有重组DNA的质控品包括第一阳性质控品、第二阳性质控品、第三阳性质控品，所述第一阳性质控品、第二阳性质控品、第三阳性质控品的浓度均为104copies/μL，其中所述第一阳性质控品选用ApoE基因E2/E2分型的重组质粒，所述第二阳性质控品选用ApoE基因E4/E4分型的重组质粒，所述第三阳性质控品选用ApoE基因E2/E4分型的重组质粒。
8.根据权利要求1所述的一种适合血液基因组DNA样本的ApoE基因分型检测的试剂盒，其特征在于：在每组20μL反应体系中，加入所述用于ApoE基因分型检测的混合液的用量为18μL，所述含有重组DNA的质控品的用量为2μL，
其中所述用于ApoE基因分型检测的混合液中的各组分配比分别为
用于ApoE基因分型检测的特异性引物对的浓度为10μmol/L，用量为0.4μL；
用于ApoE基因分型检测的特异性探针对的浓度为10μmol/L，用量为0.4μL；
Taq HS DNA聚合酶的浓度为5U/μL，用量为1μL；
脱氧核糖核苷三磷酸混合液的浓度为4mmol/L，用量为1.6μL；
反应缓冲液的用量为2μL；
反应增强剂的用量为3μL。
9.一种权利要求1-8任一所述试剂盒的PCR方法，其特征在于：荧光PCR反应按四步扩增循环程序进行，且该荧光PCR反应的条件为：第一步60℃，30s，收集荧光信号；第二步95℃，2min；第三步95℃，15s和60℃，1min，循环40次，每次分别收集荧光信号；第四步60℃，30s，收集荧光信号。
10.根据权利要求9所述的PCR方法，其特征在于：所述荧光PCR反应按照不同仪器的说明选择Genotyping分型程序，反应结束后，根据荧光值曲线并结合试剂盒说明书附图作出分析，或导出实验结果，根据样本名称、检测的位点和“Call”值并结合试剂盒说明书判断标准作出分析或者直接用荧光曲线对照说明书判断标准进行分析。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110257510A (zh) * 2019-08-06 2019-09-20 江苏贝格尔生物医药有限公司 一种检测apoe基因多态性的引物和探针及试剂盒
CN112662746A (zh) * 2019-10-15 2021-04-16 杭州百迈生物股份有限公司 一种基因分型检测用的质控品及其制备方法

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