具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的同时检测心脑血管药物代谢能力基因的引物探针系统及检测试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明,均为市场购买得到。
实施例1、检测试剂盒的制备
本发明的检测试剂盒针对24个SNP位点rs5065、rs12041331、rs5186、rs730012、rs776746、rs2070744、rs12248560、rs4986893、rs4244285、rs1057910、rs1801253、rs2238032、rs2239050、rs2239128、rs2306283、rs4149056、rs671、rs1799752、rs16960228、rs4149601、rs429358、rs7412、rs1065852、rs9923231的多态性设计特异性扩增引物。基于多重扩增技术设计引物和芯片探针是本发明的关键之一,基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。
(一)本实施例的扩增引物序列如下:
所述检测试剂盒包括扩增反应液、检测反应液及阳性对照,所述扩增反应液包括如序列表SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:23所示的上游引物序列和如序列表SEQ ID NO:24~SEQ ID NO:46所示的下游引物序列,所述下游引物序列的5`端均采用CY5标记。定位探针序列如序列表SEQ ID NO:47所示。具体的序列表如下:
所述的24个SNP位点rs5065、rs12041331、rs5186、rs730012、rs776746、rs2070744、rs12248560、rs4986893、rs4244285、rs1057910、rs1801253、rs2238032、rs2239050、rs2239128、rs2306283、rs4149056、rs671、rs1799752、rs16960228、rs4149601、rs429358、rs7412、rs1065852、rs9923231的检测探针序列如序列表SEQ ID NO:48~SEQ IDNO:95所示;所述阳性探针序列如序列表SEQ ID NO:96~SEQ ID NO:119所示。所述定位参照序列如序列表SEQ ID NO:120所示。
更优选的,所述的检测探针多态性分辨位点采用LNA标记,“+”表示,可提高单碱基的分辨率。为进一步提高检测探针的分辨率探针中有碱基采用次黄嘌呤替代(I),替代后的探针对特异性更优,同时可以大大提高对捕获效率和减少探针的二级结构的形成。
更优选的,所述的检测探针和阳性探针的5’端采用C12氨基修饰和(dT)15修饰,有效减少了探针与PCR产物在特异性结合时的空间位阻效应。
(二)本实施例的芯片探针序列如下:
芯片的制备工艺如图1所示。如图2所示,图中从上至下1~24号检测区对应的检测位点对应如下:
(三)本实施例的检测试剂盒PCR反应液单人份配置体系如下:
PCR反应液各组分浓度分别为:24个SNP位点rs12041331、rs730012、rs4149056、rs2306283、rs7412、rs429358、rs671、rs9923231、rs12248560、rs4986893、rs4244285、rs5065、rs1799752、rs4149601、rs16960228、rs2239128、rs2239050、rs2238032、rs776746、rs5186、rs1057910、rs1065852、rs2070744、rs1801253前后引物(0.1uM),Multi BufferMix(1×),Multi酶系Mix 8.5ul,Solution II 0.25ul,其余用RNase Free-H2O补足;其中Multi Buffer Mix、Multi酶系Mix、Solution II为Multi Enzyme Mix组分,Multi EnzymeMix购自上海生工生物科技有限公司。
(四)本实施例的检测试剂盒芯片制备:
1.探针配制
将探针母液与点样缓冲液进行混合,探针点样终浓度10uM。
2.醛基片清洗
1)把醛基片取出依次放入芯片架中;
2)超声波清洗机装入纯化水达到水位线,再放入已装好芯片的芯片架,浸泡10分钟;
3)浸泡10分钟后,打开超声波清洗机超声清洗5分钟;
4)清洗结束后,取出芯片依次放入玻片离心机中进行离心干燥。
3.芯片点制
保证相对湿度为45%~65%,从2~8℃冰箱内取出384孔板,对384孔板加样,各个位点加样量60μl,将384孔板放入点样仪384孔板槽内。点样仪设置进行点样,点制矩阵示意图如图3所示。
4.芯片水合
温度:37℃;湿度:65%~75%;水合时间:12小时。
5.芯片后处理
将芯片盒内水合好的芯片取出,依次放入24格芯片架内。将芯片架放入0.25%SDS溶液中,5min后取出,再放入纯化水中,上下涮洗10次,以3500rpm离心30s甩干。芯片贴膜和包装。
实施例2、检测试剂盒检测
本发明中采用的仪器如下:扩增仪、杂交仪、GenePix 4100A微阵列基因芯片扫描仪。(1)试剂准备(试剂准备室)
提前将试剂取出,并将PCR反应液涡旋振荡15秒,低速离心待用。确定反应数N,N=待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按46μL/管分装至PCR反应管中。
(2)加样检测(样本制备间)
将EDTA抗凝全血、阳性对照和空白对照按4μL加样量加入到PCR反应管中,盖紧管盖,低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底,然后立即进行PCR扩增反应。
(3)PCR扩增(扩增间)
采用PCR仪进行扩增,反应体系为50μL,反应条件为:预变性95℃,10min;变性95℃,15s,退火60℃,20s,延伸72℃,30s,扩增35个循环;最终延伸72℃,7min;保存4℃∞。
(4)芯片杂交检测
1)将PCR产物及杂交液等比例混匀后在95℃条件下变性10min后,立即置于冰浴中5min;
2)取变性的扩增产物10μl,小心加入基因芯片反应区中,使其分布均匀;
3)将基因芯片平置于杂交盒中,42℃杂交1小时;
4)将基因芯片在SSC洗涤液中漂洗。取出基因芯片,甩去残留在基因芯片上的液体,室温晾干;
5)采用激光共聚焦基因芯片扫描仪对基因芯片进行扫描,并采用信号分析软件进行分析。
(5)结果判读
有效性判定:本检测试剂盒定位参照有信号,空白参照无信号;无模板对照的不通过,阳性对照品的检出结果为杂合型。
最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海普然生物科技有限公司
<120> 一种同时检测心脑血管药物代谢能力基因的引物探针系统及试剂盒
<160> 120
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcaggtggt cagtaatcaa gttca 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggattagagt tcctggtgga caaga 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccgtcatc tgtctaatgc aaaat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctaactcc tccacccacc ttatc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacctgcctt caatttttca ctgac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtccttga gtctgacatt agggt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgtggcgc attatctctt acatc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgtacttc agggcttggt caata 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcaataaag tcccgagggt tgttg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccggtgatg gtagaggttt aaaaa 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgggcggcgt ggccccgacg acatc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggatcaag aaaagccgca gataa 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gatgctatta tgcctataca gatgt 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttgttagat agtcaagatc acagt 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tattaattct taccttttcc cacta 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagtagacaa agggaaagtg atcat 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagcaggtcc cacactcaca gtttt 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgatgagttc cacgtatttc gggta 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgctggtcac tctcctcttt ctgtt 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caatcatgac tatgggtgga tgtgg 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccaggcgct cgcggatggc gctga 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caggtgtgtc cagaggagcc cattt 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cttctcttgc ttgacttccc agagg 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttcctgtca acacttctca catct 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gattagtgct tcctttgtag ggtcg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcttcttggt ggatgagctt acatt 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cttagtcgtt gtaggggttc catgc 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgtgtgtcac accctaatga actag 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gactagggaa actacagttc ccaga 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccacttattt atctaaggaa aacag 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agggtgaagc taaatgattg gaaac 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gccaagctct ggttgtaatt taaaa 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cacacgttca atctcttcct ggact 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagctcgcgg tggaaggcct tcacc 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgttaagaca cagatgaaca cttgg 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acatcaagga ggggtcaata gttaa 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggtcttacca tagagggaga gcatt 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccctttattt gcaccattat cttcc 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atgacccaga ttcctttaaa caacc 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttatgggtta cactcccagg acccc 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggtctagaga aatgggagaa aggat 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cactagagga accatgattc cctga 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aggtcacagg agagaagttt taact 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cttggacagc cgtgcccgcg tctcc 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caacctgctg catgtggact tccag 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tcacaagttc cagggattca tgcag 25
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
agtcgtaact tgttgaatg 19
<210> 48
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtcctccctg gctgttatct tcagtaaaag agaacaca 38
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcccttctgc tgtctcactt ccatcttact ctctgctt 38
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cttcactacc aaatgagcat tagctttcag aattgaag 38
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
caggggttgc caggaacagc ctggagacag ggaacaga 38
<210> 52
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gctcttttgt ctttcaatat ctcttgtttg gaccacat 38
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcaagctctt ccctggctgg ctgagcctca gccctagt 38
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ttgtgtcttc tgttctcaaa gtatgatgta agagataa 38
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgaaaacatc aggattgtaa gcactgaatc caggtaag 38
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
actatcattg attatttccc aggaataaca aattactt 38
<210> 57
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cacgaggtcc agagatacat tgactcccca ccagcctg 38
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gacttccgca aggccttcca gcgatctgct gcgcgcgca 39
<210> 59
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tggaccagaa aaggccactg tgggcttggg tgtcatgt 38
<210> 60
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atgtctggca aggggctaat tagcaacctc ttctgaat 38
<210> 61
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ctccagagtc cctgggagcc ctgcctctca ctgcatgt 38
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gtggataagg tcgatgttga atttttgaat tgatattag 39
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aggaatctgg gtcatacatg tggatgtgtt catgggtaa 39
<210> 64
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gggctgcagg catacactaa agtgctgtga gtgtgggac 39
<210> 65
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aattggcgaa accacataaa agtgtatcac gcctgtaat 39
<210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cagctgtggg ctggattctg tattcacaca taaaggaga 39
<210> 67
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gagacgtctc gcatttgagc aagtctcggt aagactttg 39
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gcgatgccga tgacctgcag aagtggcagt gtaccaggcc 40
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
aagcggctcc tccgcgatgc cgatgacaga agtgcctggc 40
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
caacgctggg ctgcacgcta ctcaccaccc tgccactgc 39
<210> 71
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
aatgctagga ttataggcgt gagccaacct ggccaatgg 39
<210> 72
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gtcctccctg gctgttatct tcggtaaaag agaacaca 38
<210> 73
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tcccttctgc tgtctcactt ccgtcttact ctctgctt 38
<210> 74
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
cttcactacc aaatgagcct tagctttcag aattgaag 38
<210> 75
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
caggggttgc caggaacagc ctggagaccg ggaacaga 38
<210> 76
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gctcttttgt ctttcagtat ctcttgtttg gaccacat 38
<210> 77
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tcaagctctt ccctggccgg ctgagcctca gccctagt 38
<210> 78
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ttgtgtcttc tgttctcaaa gcatgatgta agagataa 38
<210> 79
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tgaaaacatc aggattgtaa gcactggatc caggtaag 38
<210> 80
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
actatcattg attatttccc gggaataaca aattactt 38
<210> 81
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cacgaggtcc agagatacct tgactcccca ccagcctg 38
<210> 82
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gacttccgca aggccttcca gggatctgct gcgcgcgca 39
<210> 83
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tggaccagaa aaggccactg tgggcttggg ggtcatgt 38
<210> 84
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
atgtctggca aggggctaat tagcaacgtc ttctgaat 38
<210> 85
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ctccagagtc cctgggagcc ccgcctctca ctgcatgt 38
<210> 86
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gtggataagg tcgatgttga atttttgaat cgatattag 39
<210> 87
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
aggaatctgg gtcatacatg tggatgcgtt catgggtaa 39
<210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gggctgcagg catacactga agtgctgtga gtgtgggac 39
<210> 89
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
aattggcgaa accacataaa agtgtatagg cagcaggtc 39
<210> 90
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cagctgtggg ctggattctg tattcacacg taaaggaga 39
<210> 91
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gagacgtctc gcatttgagc aggtctcggt aagactttg 39
<210> 92
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gcgatgccga tgacctgcag aagcggcagt gtaccaggcc 40
<210> 93
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagcggctcc tccgcgatgc cgatgacaga agcgcctggc 40
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
caacgctggg ctgcacgcta cccaccaccc tgccactgc 39
<210> 95
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgctagga ttataggcgt gagccaaccc ggccaatgg 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagcctcttg cagtctgtcc cta 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacttcccag agaagctgga agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tgtggactga accgactttt cta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaagggctt ccgcagagga gggt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacgaatgct ctactgtcat ttct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaactgtagt ttccctagtc cccc 24
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagaagacc tcagctcaaa tccc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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accacttaca gtcttttttt ctgg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatggaaagt gatattttgg agaa 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgcaagaca ggagccacat gcc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcttccctg gaagaccctg tg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgtgccttg cctgcctgtt ccct 24
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatcactga attaaacatt ttgc 24
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacactctct tatctacata ggtt 24
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ggctacaaga tgtcggggag tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
cattcaacag ttacgact 18