CN103382501A - 阳性对照概念 - Google Patents

Abstract

提供了用于检测或定量至少两种不同靶核酸的方法、试剂盒和用途，其使用包含要检测或定量的不同靶核酸的阳性对照核酸混合物的单一阳性对照储备溶液来进行。

Description

阳性对照概念

本发明涉及利用扩增进行诊断核酸测试的对照概念。在通过扩增来检测或定量靶核酸的诊断测试中，一般使用不同对照。内部对照是如下的对照核酸，其添加至反应混合物，并且容许为每次单一扩增反应的质量作对照和/或定量反应中的靶核酸。此外，运行缺乏靶核酸的阴性对照以确保使用的试剂没被靶核酸污染。最后，还使用阳性对照来确保系统（仪器和试剂等）的正确运行。一般地，对于每次测定法，提供相应的阳性对照。例如，对于HIV测定法，提供包含HIV核酸的阳性对照。对于HBV测定法，提供包含HBV核酸的阳性对照。对于用于在单一管形瓶中同时定性及定量检测HIV、HBV和HCV的测定法，提供包含HIV、HBV和HCV的混合物的阳性对照。如此，阳性对照完全包含测定法设计针对的靶核酸。这需要为每种测定法分开制造阳性对照。此外，不得不向实施用于检测或定量靶核酸的方法的仪器系统提供每种测定法的分开的对照管形瓶。

发明概述

提供了一种在分开的管形瓶中检测或定量至少两种不同靶核酸的方法，包括：

a)扩增所述至少两种靶核酸，其中在不扩增第二靶核酸的情况中在第一管形瓶中扩增第一靶核酸，且在不扩增第一靶核酸的情况中在第二管形瓶中扩增第二靶核酸，

b)与步骤a)平行地，在第三管形瓶中扩增第一阳性对照核酸，其中所述第一阳性对照核酸是所述第一靶核酸的阳性对照，并在第四管形瓶中扩增第二阳性对照核酸，其中所述第二阳性对照核酸是所述第二靶核酸的阳性对照；其中所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸在扩增前从阳性对照管形瓶向所述第三管形瓶和所述第四管形瓶提供，所述阳性对照管形瓶包含单一阳性对照储备溶液，该单一阳性对照储备溶液包含所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸的混合物。

此外，提供了一种试剂盒，其包含如本文中所描述的架，其中所述架包含至少两个阳性对照管形瓶。所述至少两个阳性对照管形瓶在所述架的开口中保持。每一个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液。所述至少两种阳性对照核酸在分析仪中实施的扩增反应中作为外部阳性对照使用。试剂盒包含标签，其中所述标签指示要用试剂盒组分检测的单一靶核酸，其中所述靶核酸是架的阳性对照管形瓶中的阳性对照核酸之一。试剂盒进一步包含含有主混合物的主混合物管形瓶，所述主混合物包含用于扩增所述靶核酸和相应的阳性对照核酸的试剂。试剂盒不包含如下的主混合物，该主混合物包含用于扩增与至少一种如下的阳性对照核酸对应的靶核酸的试剂，该阳性对照核酸不对应于所述标签上标示的所述靶核酸，但是存在于所述阳性对照管形瓶的所述储备溶液中。

还提供了一种试剂盒，其包含架、标签，所述架具有至少两个阳性对照管形瓶，其中每一个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液；所述标签指示所述储备溶液中存在的阳性对照核酸所对应的所有靶核酸。所述标签还指示包含所述阳性对照核酸储备溶液的架供检测所述靶核酸之一，而不是单一管形瓶中的所述储备溶液中包含的阳性对照核酸所对应的其它靶核酸的方法中使用。

提供了混合物在分开的阳性对照反应中的用途，其中所述混合物至少包含第一阳性对照核酸和第二阳性对照核酸，其中在缺乏所述第二阳性对照核酸扩增的情况中扩增所述第一对照核酸，并在缺乏所述第一对照核酸扩增的情况中扩增所述第二阳性对照核酸。

附图简述

图1：样品制备的工作流。

图2：包含用于至少两种靶分析物检测及阳性对照检测的管形瓶的分析系统。

图3：包含用于至少三种靶分析物检测及阳性对照检测的管形瓶的分析系统。

图4：包含用于检测至少两种靶分析物、相应的阳性对照和阴性对照的管形瓶的分析系统。

图5显示了具有管形瓶的加热块。

图6显示了一种分析系统，其包含加载站、分离站、扩增站和具有阳性对照管形瓶的架。

图7显示了一种试剂盒，其具有含阳性对照管形瓶的架、标签和具有扩增试剂的容器。

发明详述

提供了一种在分开的管形瓶中检测或定量至少两种不同靶核酸的方法，包括：

a)扩增所述至少两种靶核酸，其中在不扩增第二靶核酸的情况中在第一管形瓶中扩增第一靶核酸，且在不扩增第一靶核酸的情况中在第二管形瓶中扩增第二靶核酸，

b)与步骤a)平行地，在第三管形瓶中扩增第一阳性对照核酸，其中所述第一阳性对照核酸是所述第一靶核酸的阳性对照，并在第四管形瓶中扩增第二阳性对照核酸，其中所述第二阳性对照核酸是所述第二靶核酸的阳性对照；其中所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸在扩增前从阳性对照管形瓶向所述第三管形瓶和所述第四管形瓶提供，所述阳性对照管形瓶包含单一阳性对照储备溶液，该单一阳性对照储备溶液包含所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸的混合物。

此方法的优点在于通过使用包含至少两种不同靶核酸的混合物的单一阳性对照储备溶液，仅需要阳性对照的一种单一阳性对照储备溶液来运行用于检测或定量不同靶核酸的测定法的个别阳性对照。这为制造提供了改善的效率和成本节约，因为可以为不同测试试剂盒制造较大批次的阳性对照。它还简化了用于检测或定量靶核酸的分析系统，因为可以使用包含阳性对照混合物的单一管形瓶来检测或定量不同靶核酸。

在上述方法中，通过仅将用于特异性扩增第一靶核酸的引物添加至第一管形瓶来实现扩增所述至少两种靶核酸，其中在不扩增所述第二靶核酸的情况中在第一管形瓶中扩增所述第一靶核酸，且在不扩增所述第一靶核酸的情况中在第二管形瓶中扩增所述第二靶核酸。用于扩增第二或任何其它靶核酸的引物没有添加至第一管形瓶，并且如此不存在于第一管形瓶。通过仅将用于特异性扩增第二靶核酸的引物添加至第二管形瓶来实现第二靶核酸的扩增。用于扩增与第二靶核酸不同的第一或任何其它靶核酸的引物没有添加至第二管形瓶，并且如此不存在于第二管形瓶。同样地，仅将用于扩增第一靶核酸的阳性对照的引物添加至第三管形瓶，并且仅将用于扩增第二靶核酸的阳性对照的引物添加至第四管形瓶。用于检测其它靶核酸的引物不存在于这些管形瓶。应当理解，同一原则适用于第三或第四靶核酸及它们相应的阳性对照反应。如此，若扩增第三靶核酸，则将其在存在第三靶核酸的特异性引物的情况中且在没有对第一或第二或任何其它不同靶核酸特异性的引物的情况中扩增。在一个具体的实施方案中，用于一种特定靶核酸的引物与用于相应阳性对照的引物相同。

平行扩增阳性对照。这意味着它们使用同一热概况扩增。在一个实施方案中，第一、第二、第三和第四管形瓶是一块多孔板的容器，并且放置多孔板的加热块对多孔板的所有容器应用相同热概况。使用阳性对照来确保诊断测定法中检测或定量靶核酸过程中的条件和扩增试剂的质量。

在一个具体的实施方案中，在又一个步骤中，检测或定量靶核酸和阳性对照核酸。

如本文中所使用的，术语“检测”指以评估样品中靶核酸的存在或缺乏为目的的定性测试。举例而言，可以通过测量与靶核酸有关的荧光染料来检测。

如本文中所使用的，术语“定量”指测定样品中存在的靶核酸的量或浓度。基于已知浓度的内部标准品的扩增实施定量。

如本文中所使用的，术语“扩增”一般指自靶核酸生成多个核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特定位点杂交以提供聚合酶延伸的起始位点。可以通过本领域中一般已知的任何方法来实施扩增，所述方法诸如但不限于：标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和等温扩增。其它扩增反应包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、缺口-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、和Qβ扩增，等等。

如本文中所使用的，术语“不同靶核酸”指测定的不同靶物。靶核酸是可以存在于生物学样品中，并且测定法所针对的核酸。核酸包括RNA或DNA、双链或单链核酸。在一个实施方案中，核酸可以是人的或动物的或病毒的或微生物的。如此，如本文中所使用的，术语“不同靶核酸”指测定的不同靶物。

若在分开的管形瓶中测试两种靶核酸，则意味着在一个管形瓶，而不是另一个管形瓶中测试一种靶核酸，且对于第二靶核酸，情况相反。

术语“管形瓶”指用于容纳液体溶液的接收器或管或容器或器皿。此类管形瓶包括发生反应的管形瓶。此类管形瓶还可以指如下的管形瓶，在该管形瓶中贮存反应中使用的溶液或混合物，之后转移至发生反应的不同管形瓶。在一些实施方案中，超过一个管形瓶是整体形成的。在一个实施方案中，发生反应的管形瓶是多孔板的容器。在另一个实施方案中，管形瓶是个别的管形瓶，其可以包含可穿透的帽，并且其在架中保持。

如本文中所使用的，术语“阳性对照核酸”指作为相应靶核酸的阳性对照的对照核酸，其在用与靶核酸相同的引物和探针扩增时生成可检测信号，该可检测信号指示反应混合物和扩增条件容许扩增及检测靶核酸(若存在的话)。作为一个非限制性例子，在方法涉及定量HIV时，阳性对照核酸包含HIV序列，并且是包装的，例如作为装甲的颗粒。装甲的颗粒是本领域中已知的，并且模拟HIV的被膜。如此，阳性对照核酸充当靶核酸的阳性对照。一般地，在分开的管形瓶中与靶核酸平行扩增阳性对照。

如本文中所使用的，术语“阳性对照管形瓶”指包含单一阳性对照储备溶液的管形瓶，所述单一阳性对照储备溶液包含至少第一和第二阳性对照核酸的混合物。术语“单一阳性对照储备溶液”意指第一和第二阳性对照核酸存在于共同的阳性对照储备溶液中，而非在两种不同的个别阳性对照储备溶液中。

如此，例如使用移液管通过移液从一个单一共同阳性对照储备溶液向第三管形瓶和第四管形瓶提供所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸。如此，仅需要一种阳性对照储备溶液来运行不同靶核酸的不同个别测定法，这简化了系统。

在一个具体的实施方案中，所述方法另外包括与a)和b)平行地在第五管形瓶中扩增阴性对照，其中所述阴性对照自阴性对照管形瓶中包含的第二单一阴性对照储备溶液提供。

如本文中所使用的，术语“阴性对照”指缺乏靶核酸的对照。阴性对照的目的是测试任何试剂或可以实施方法的分析仪的仪器部分是否被靶核酸污染。

在一个实施方案中，在自动化分析仪中实施所述方法。在自动化分析仪中实施所述方法时，所述方法具有如下的优点，即可以减少对分析仪提供的具有不同内容物的阳性对照管形瓶的数目。如此，分析仪中必须加载、加工并鉴定的管形瓶较少。

在本文中所描述的方法中通过将生物学样品的等分试样移液入管形瓶中来提供生物学样品。可以通过裂解自细胞或病毒颗粒释放靶核酸。然后，可以在扩增前富集靶核酸，例如通过固相分离，例如使用磁性颗粒，且在存在离液化合物的情况中。或者，可以使用与靶核酸或与多聚A特异性杂交，且与固相，例如聚合物材料或玻璃颗粒偶联的寡核苷酸通过靶物捕捉来分开靶核酸与其它材料。此类方法是本领域中公知的。在分开后，可以清洗固相以除去扩增反应的抑制剂，并且可以将结合的核酸洗脱，然后进行扩增。可以将阳性对照和阴性对照暴露于与要测试的核酸相同的裂解和富集步骤。

术语“生物学样品”指可以进行靶向核酸的诊断测定法，并且通常自生物学来源衍生的材料。在一些实施方案中，所述生物学样品自人衍生，并且是体液。在本发明的一个实施方案中，生物学样品是人血液、尿液、痰、汗液、拭样、可移液的粪、或脊髓液。生物学样品也可以是可以提取靶核酸的组织。

“靶核酸”是核苷酸的聚合化合物，如本领域熟练技术人员已知的。“靶核酸”在本文中用于指样品中应当分析，即应当测定样品中其存在、不存在和/或量的核酸。靶核酸可以是基因组序列，例如特定基因（DNA或RNA）的部分。在其它实施方案中，靶核酸可以是病毒的或微生物的。在一个具体的实施方案中，靶核酸可以是HIV、HCV和/或HBV。

如本文中所使用的，术语“等分试样”指用于测试的部分液体。通常，通过将一部分液体移液入管形瓶中来生成等分试样，然后进行进一步处理。在需要两份或更多份液体等分试样时，例如有可能吸出一定体积的所述液体，并将所述体积的各部分释放入两个或更多个孔中。或者，一次仅分配意图用于单一管形瓶的液体体积。

在一个具体的实施方案中，所述阳性对照管形瓶在架中提供，并且所述阴性对照管形瓶在与包含阳性对照管形瓶的架不同的第二架中提供。

通过加载入分析仪中对分析仪提供阳性对照管形瓶。如此，阳性对照管形瓶在它们加载入分析仪中时在架中保持。在分开的架中加载阳性对照管形瓶和阴性对照管形瓶具有如下的优点，即阴性对照可以以比阳性对照更高的频率运行。这导致处理保持阳性或阴性对照管形瓶的架的效率更高。如此，在一个实施方案中，在所述包含阳性对照管形瓶的架中，阴性对照管形瓶是缺乏的。在一个实施方案中，在所述包含阴性对照管形瓶的架中，阳性对照管形瓶是缺乏的。在保持至少一个阳性对照管形瓶的架中缺乏阴性对照管形瓶降低污染阴性对照管形瓶的风险。

在一个实施方案中，所述包含所述阳性对照管形瓶的架包含至少两个阳性对照管形瓶，其中所有所述至少两个阳性对照管形瓶包含阳性对照核酸的相同混合物。术语“相同的”指包含相同阳性对照核酸的阳性对照核酸混合物，尽管一个阳性对照管形瓶可以与同一架中的另一阳性对照管形瓶具有不同浓度的阳性对照核酸。此实施方案的阳性对照管形瓶无一包含同一架中其它阳性对照管形瓶中不包含的阳性对照核酸。这样，自动化系统的复杂性降低为一个架仅保持包含相同阳性对照核酸的阳性对照管形瓶。此外，这还降低包含阳性对照核酸的不同混合物的管形瓶间交叉污染的风险。

在一个实施方案中，检测或定量至少三种不同靶核酸，另外包括在步骤a)中，在不扩增所述第一或第二靶核酸的情况中在第六管形瓶中扩增第三靶核酸，并在步骤b)中，另外扩增第三阳性对照核酸，其中所述第三阳性对照核酸是所述第三靶核酸的阳性对照，其中在第七管形瓶中扩增所述第三阳性对照核酸，其中所述第一阳性对照核酸、所述第二阳性对照核酸和所述第三阳性对照核酸在扩增前从阳性对照管形瓶向所述第三管形瓶、第四管形瓶和第七管形瓶提供，所述阳性对照管形瓶包含单一阳性对照储备溶液，该单一阳性对照储备溶液包含所述第一阳性对照核酸、所述第二阳性对照核酸和所述第三阳性对照核酸的混合物。如此，通过此方法，可以使用一种对照混合物来实施检测或定量三种不同靶核酸的三种不同测定法的阳性对照反应，各自单独在分开的管形瓶中进行。

在一个具体的实施方案中，所述第一架中包含的所有阳性对照管形瓶包含1x10E5至1x10E8个拷贝/ml或1x10E2至5x10E3个拷贝/ml浓度的所述阳性对照核酸。浓度也可以以其它单位，诸如IU/ml提供。用于将拷贝/ml转化成每ml的IU的因子取决于具体的靶物，并且范围可以为1.0至16。如此，架包含较高浓度的阳性对照核酸或较低浓度的阳性对照核酸。这降低包含较高浓度的阳性对照核酸的管形瓶和包含较低浓度的阳性对照核酸的管形瓶间的任何交叉污染的风险，如本文中规定的。使用仅具有上文所描述的较高浓度的阳性对照核酸的管形瓶进行定量测定法。尽管反应混合物中存在有可能影响反应严格性的较多非扩增核酸的实情，可以使用阳性对照混合物。

在上文所描述的方法中，可以将实施的测试分拣成测定法的批次，其匹配一个架的管形瓶中阳性对照核酸混合物的组成。

本发明还涉及包含至少一个高浓度阳性对照管形瓶和/或至少一个低浓度阳性对照管形瓶的架，其中所述高浓度阳性对照管形瓶包含1x10E5至1x10E8个拷贝/ml浓度的至少两种不同阳性对照核酸的混合物，而所述低浓度阳性对照管形瓶包含1x10E2至5x10E3个拷贝/ml浓度的相同的两种不同阳性对照核酸的混合物。凭借此架，可以对自动化分析仪提供高阳性对照核酸和/或低阳性对照核酸的混合物以在不同管形瓶中实施至少两种不同参数的定量和/或定性测定法。在一个实施方案中，一个架包含相等数目的高阳性对照核酸和低阳性对照核酸。术语“高阳性对照核酸”指较高浓度的阳性对照核酸，如本文中所描述的，而“低阳性对照核酸”指较低浓度的阳性对照核酸，如本文中所描述的。

本发明进一步涉及适合于加载入自动化核酸分析仪中的架。所述架包含至少两个开口以接受至少两个管形瓶。在所述架的所述开口中保持至少两个管形瓶。每个所述管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液。所述至少两种阳性对照核酸在所述分析仪中实施的扩增反应中作为外部阳性对照使用。优点如本文中所描述的。

本发明还涉及包含至少两个开口以接受至少两个阳性对照管形瓶的架。在所述架的所述开口中保持至少两个阳性对照管形瓶。每个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液。所述至少两种阳性对照核酸在所述分析仪中实施的扩增反应中作为外部阳性对照使用。在一个实施方案中，所述架包含架的开口中保持的至少两个阳性对照管形瓶，其中至少一个阳性对照管形瓶是高浓度阳性对照管形瓶，而一个阳性对照管形瓶是低浓度阳性对照管形瓶，其中所述高浓度阳性对照管形瓶包含1x10E5至1x10E8个拷贝/ml浓度的至少两种不同阳性对照核酸的混合物，而所述低浓度阳性对照管形瓶包含1x10E2至5x10E3个拷贝/ml浓度的相同的两种不同阳性对照核酸的混合物。优点如本文中所描述的。在一个实施方案中，所述架包含可以在阳性对照管形瓶在架的开口中接受后闭合的覆盖物。在又一个实施方案中，阳性对照管形瓶包含盖。在一个具体的实施方案中，对照管形瓶的盖包含易碎的封条诸如箔。

还公开了一种试剂盒，其包含如本文中所描述的架，其中所述架包含至少两个阳性对照管形瓶。在所述架中保持至少两个阳性对照管形瓶。每个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液。所述至少两种阳性对照核酸在所述分析仪中实施的扩增反应中作为外部阳性对照使用。试剂盒包含标签，其中所述标签指示要用试剂盒组分检测的单一靶核酸，其中所述靶核酸是架的阳性对照管形瓶中的阳性对照核酸之一。试剂盒进一步包含含有主混合物的主混合物管形瓶，所述主混合物包含用于扩增所述靶核酸和相应的阳性对照核酸的试剂。试剂盒不包含如下的主混合物，该主混合物包含用于扩增与至少一种如下的阳性对照核酸对应的靶核酸的试剂，所述阳性对照核酸不对应于所述标签上标示的所述靶核酸，但是存在于所述阳性对照管形瓶的所述储备溶液中。在一个实施方案中，试剂盒包含具有高浓度阳性对照核酸的阳性对照管形瓶和具有低浓度阳性对照核酸的阳性对照管形瓶，如本文中所描述的。在一个实施方案中，架包含至少两个开口以接受至少两个阳性对照管形瓶。

如本文中所使用的，术语“扩增试剂”指实现核酸扩增的化学或生物化学组分。此类试剂可以包括但不限于核酸聚合酶、缓冲液、单核苷酸诸如三磷酸核苷、寡核苷酸例如如寡核苷酸引物、盐及其相应的溶液、检测探针、染料，等等。

在一个具体的实施方案中，主混合物包含与要通过试剂扩增的靶核酸特异性杂交的寡核苷酸。

“寡核苷酸”可以包括“经修饰的寡核苷酸”（或“寡核苷酸类似物”）。它们是寡聚化合物的亚组。在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指自多个核苷酸（作为其单体单元）形成的组分。磷酸根基团通常称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常连接或主链是3’至5’磷酸二酯连接。可以合成可用于本发明的寡核苷酸和经修饰的寡核苷酸(见下文)，如主要在本领域中描述的及本领域技术人员已知的。用于制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域中已知的，并且包括例如合适序列的克隆和限制及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如由Narang S.A.等,Methods in Enzymology68(1979)90-98描述的磷酸三酯方法、由Brown E.L.等,Methods in Enzymology68(1979)109-151披露的磷酸二酯方法、在Beaucage等,Tetrahedron Letters22(1981)1859中披露的亚磷酰胺方法、在Garegg等,Chem.Scr.25(1985)280-282中披露的H-膦酸酯方法及在US4,458,066中披露的固体支持物方法。

在依照本发明的方法中，寡核苷酸可以是经化学修饰的，即引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。然后，探针或引物是经修饰的核苷酸。

在另一个实施方案中，试剂盒包含具有至少两个阳性对照管形瓶的架，其中每个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液；标签，其指示所述储备溶液中存在相应阳性对照核酸的所有靶核酸。所述标签还指示包含所述阳性对照核酸储备溶液的架供检测所述靶核酸之一，而不是单一管形瓶中的所述储备溶液中包含的阳性对照核酸所对应的其它靶核酸的方法中使用。在一个实施方案中，试剂盒包含具有高浓度阳性对照核酸的阳性对照管形瓶和具有低浓度阳性对照核酸的阳性对照管形瓶，如本文中所描述的。在一个实施方案中，所述架包含至少两个开口以接受至少两个阳性对照管形瓶。

术语“标签”指可以固定或附着于试剂盒和/或架和/或阳性对照管形瓶的任何类型的标签。标签可以包含以操作员可阅读的方式印刷信息的一个侧面，和包含胶水以附着于试剂盒、架和/或阳性对照管形瓶的第二侧面。

在一个具体的实施方案中，所述架缺乏包含阴性对照溶液的阴性对照管形瓶。在保持至少一个阳性对照管形瓶的架中缺乏阴性对照管形瓶降低污染阴性对照管形瓶的风险。

在本文中所描述的架的一个实施方案中，在所述架的任一个开口中没有保持包含缺乏核酸的溶液的阴性对照管形瓶。优点如本文中所描述的。

还公开了一种用于在分开的管形瓶中检测或定量至少两种不同靶核酸的分析系统。分析系统包含用于靶核酸检测、阳性对照和阴性对照检测的管形瓶。在一个实施方案中，管形瓶是整体形成的。用于扩增的管形瓶的一个具体的实施方案是多孔板的容器。本文中所描述的方法可以在分析系统上实施。在一个具体的实施方案中，分析系统包含含有阳性对照管形瓶的架，如本文中所描述的。在一个具体的实施方案中，分析系统进一步包含含有阴性对照管形瓶的架，如本文中所描述的。本文中描述了分析系统的组件的具体实施方案。架的具体实施方案也如本文中所描述的。

在一个具体的实施方案中，分析系统包含将所述架加载入分析系统中的加载站，和用于将所述架中保持的阳性对照管形瓶中的阳性对照核酸储备溶液的等分试样从所述阳性对照管形瓶转移至用于扩增靶核酸的管形瓶的移液站。在一个具体的实施方案中，分析系统进一步包含用于分离核酸的站。在又一个具体的实施方案中，分析系统包含用于扩增和/或检测靶核酸的站。

加载站指可以对其手动或自动加载包含阳性对照管形瓶的架，并且可以自其将该架转移至分析系统内的移液站的站。

移液站指包含移液装置的站。移液站可以自管形瓶，例如阳性对照管形瓶吸出液体，并且可以将该液体分配入不同管形瓶中。

用于分离核酸的站指可以分开要检测或定量核酸的生物学样品中包含的核酸与其它材料的站。所述用于分离核酸的站的非限制性例子是磁性分离站，其中核酸结合至固体支持物诸如磁珠，并且通过应用磁场与生物学样品中的其它材料分开。可以清洗结合的核酸以除去扩增抑制剂。可以将核酸在扩增前自固体支持物洗脱，或者在存在固体支持物的情况中扩增。

在一个实施方案中，用于扩增和/或检测核酸的站指扩增靶核酸的温育箱。温育箱可以是于一致的温度保持的温育箱（在使用等温扩增方法的情况中），或热循环仪。在一个实施方案中，用于扩增核酸的站还包括用于检测扩增的核酸的站。作为一个非限制性例子，此类站可以是具有内装式检测模块的等温温育箱或实时PCR热循环仪。在又一个实施方案中，分析系统包含检测扩增的靶核酸的分开的检测站。

在一个具体的实施方案中，分析系统还包含适合于测定靶核酸的存在或缺乏的计算机控制器。在一个具体的实施方案中，计算机控制器适合于基于靶核酸和内部标准品扩增期间或之后检出的荧光信号来定量靶核酸。此外，计算机控制器适合于基于所述靶核酸的阳性对照核酸的检测来确定用于扩增靶核酸的扩增条件和扩增试剂的质量。

在一个实施方案中，在本文中所描述的方法中使用架。也可以在自动化分析仪中使用架，如本文中所描述的。

本发明还涉及至少第一阳性对照核酸和第二阳性对照核酸的混合物在分开的阳性对照反应中的用途，其中在缺乏所述第二阳性对照核酸扩增的情况中扩增所述第一对照核酸，并在缺乏所述第一对照核酸扩增的情况中扩增所述第二阳性对照核酸。这样，针对各种靶物的分开的阳性对照反应可以基于单一阳性对照储备溶液。

在一个实施方案中，在本文中所描述的方法中使用混合物。在一个具体的实施方案中，混合物是高浓度混合物或低浓度混合物。上文描述了高和低浓度混合物的实施方案。在一个实施方案中，平行使用高浓度混合物和低浓度混合物。如此，可以对不同靶核酸的定量测定法和/或定性测定法平行使用一种单一混合物。

实施例

样品制备

此实施例描述了一种使用包含HIV、HBV和HCV的混合物的单一阳性对照储备溶液在不同管形瓶中分离及同时扩增第一、第二和第三靶核酸的方法。以用于单独定量HIV、HBV或HCV的相应测定法在三次个别运行中评估相同阳性对照储备溶液。

简言之，在描述的实施方案中，在相同条件下对包含HIV靶RNA、HCV靶RNA和HBV靶DNA的阳性对照储备溶液同时实施样品制备和实时PCR。分析下列阳性对照储备溶液和阴性对照储备溶液（HPC：高浓度阳性对照；LPC：低浓度阳性对照）：

表1

将每份相应的样品(200ul)手动移液入深孔板中。对每个孔手动添加50ul内部定量标准品。对于HIV和HCV测定法，添加充当定量对照的RNA（6xE4装甲的颗粒/样品）。对于定量HBV测定法，添加充当定量标准品的DNA（1xE4λ颗粒/样品）。标准核酸的序列在所有情况中是相同的。适合于检测HIV、HCV和HBV的序列及关于标准品及用于检测标准品的序列披露于EP2426222。可以对于定性及对于定量测定都使用相同标准品。

遵循依照图1中描绘的方案的工作流来实施样品制备。实施总共三次单独运行；一次运行针对HIV测定法，一次运行针对HBV测定法，而一次运行针对HCV测定法。用相同的阳性对照储备溶液和相同的阴性对照储备溶液实施所有运行。

扩增和检测

在每次运行的最终样品制备步骤后，将含有分离的核酸的流体转移至用于实施扩增的多孔板的相应孔，并将分离的核酸与含有扩增试剂的相应主混合物R1和R2混合。

表2A

表2B

表2C

表2D

为了扩增和检测，用自动化平板密封器密封微孔板，并将平板转移至分析循环仪。

对所有测定法使用下列热循环概况：

表2E

热循环概况

预PCR程序包含于94°C的初始变性及于55°C、60°C和65°C的温育以逆转录RNA模板。于三个温度的温育组合有利的效果，即于较低的温度，略有错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也得到转录，而于较高的温度，抑制RNA二级结构的形成，如此导致更有效的转录。

将PCR循环分成两次测量，其中这两次测量都应用一步设置(组合退火和延伸)。于55°C的前5个循环通过预扩增略有错配的靶序列而容许升高的包容性(inclusivity)，而第二次测量的45个循环通过使用58°C的退火/延伸温度而提供升高的特异性。

对上文提及的所有测定法使用此概况，对所有测定法和样品实现扩增和检测。

下文表4显示了与定量标准品一起的HxV LPC和HxV HPC样品制备及扩增的结果。可以看出HxV LPC和HxV HPC在所有情况中得到成功扩增，并且使用定量标准品成功定量。

表4

图2至4显示了用于实施本方法的分析系统的例示性实施方案。图2显示了分析系统(9)。分析系统进一步包含测定靶物1(T1)的管形瓶(1)、测定靶物2(T2)的管形瓶(2)。此外，它包含测定与靶物1(T1)对应的阳性对照(p1)的管5形瓶3，和测定与靶物2(T2)对应的阳性对照(p2)的管形瓶4。从包含(p1)和(p2)的混合物的阳性对照管形瓶(p)将阳性对照(p1)和(p2)添加至管形瓶3和4。

图3显示了与图2的分析系统相似的分析系统(9)，只是测定三种靶物(T1)、(T2)和(T3)，其中在管形瓶(6)中测定第三靶物(T3)，并且三种阳性对照(p1)、(p2)、(p3)在(p)的混合物中，并分配给管形瓶(3)、(4)和(7)。

图4显示了测定至少两种靶物(T1)和(T2)的分析系统(9)。系统(9)包含架(10)和(11)。架(10)包含开口(12)及至少一个管形瓶(pH)和(pL)。管形瓶(pH)包含高浓度的阳性对照，如本文中公开的，而管形瓶(pL)包含低浓度的阳性对照，如本文中公开的。架(11)包含至少一个具有阴性对照的管形瓶(n)。从同一阳性对照储备管形瓶(pH)将阳性对照(p1)和(p2)添加至管形瓶(3)和(4)。当然，若低浓度的阳性对照是期望的，则它们也可以从阳性对照储备管形瓶(pL)添加。管形瓶(1)、(2)、(3)、(4)和(5)可以是整体形成的容器，诸如多孔板的部分，并且管形瓶(1)、(2)、(3)、(4)和(5)的内容物同时且平行处理并起反应。

图5显示了包含靶核酸(T1)、靶核酸(T2)、阳性对照(p1)、阳性对照(p2)和阴性对照(n)的管形瓶(1)、(2)、(3)、(4)和(7)在加热块(T)中进行同一热概况处理的实施方案。

图6显示了具有分析仪(29)的分析系统(9)。分析仪具有用于加载架(10)的加载站(22)。此外，分析仪包含具有分离站(21)和带移液装置(25)的移液站(28)的区域(28a)。此外，有转运装置(26)和管形瓶(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、…。然后，分析仪进一步包含具有扩增站(T)的扩增区(27)。系统(9)还包含计算机控制器(24)。

图7显示了试剂盒(30)，其具有包含阳性对照管形瓶(pH、pL)的架(11)、标签(31)和具有扩增试剂(M)的容器或管形瓶。

Claims (15)

1.一种在分开的管形瓶中检测或定量至少两种不同靶核酸的方法，包括：

a)扩增所述至少两种靶核酸，其中在不扩增第二靶核酸的情况中在第一管形瓶中扩增第一靶核酸，且在不扩增第一靶核酸的情况中在第二管形瓶中扩增第二靶核酸，

b)与步骤a)平行地，在第三管形瓶中扩增第一阳性对照核酸，其中所述第一阳性对照核酸是所述第一靶核酸的阳性对照，并在第四管形瓶中扩增第二阳性对照核酸，其中所述第二阳性对照核酸是所述第二靶核酸的阳性对照；其中所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸在扩增前从阳性对照管形瓶向所述第三管形瓶和所述第四管形瓶提供，所述阳性对照管形瓶包含单一阳性对照储备溶液，该单一阳性对照储备溶液包含所述第一阳性对照核酸和所述第二阳性对照核酸的混合物。

2.权利要求1的方法，另外包括与a)和b)平行地在第五管形瓶中扩增阴性对照，其中所述阴性对照从阴性对照管形瓶中包含的第二单一阴性对照储备溶液提供。

3.权利要求1或2的方法，其中在自动化分析仪中实施所述方法。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述阳性对照管形瓶在架中提供，且其中所述阴性对照管形瓶在与包含所述阳性对照管形瓶的架不同的第二架中提供。

5.权利要求4的方法，其中在所述包含所述阳性对照管形瓶的架中，阴性对照管形瓶是缺乏的。

6.权利要求4或5的方法，其中在所述包含所述阴性对照管形瓶的架中，阳性对照管形瓶是缺乏的。

7.权利要求4至6中任一项的方法，其中所述包含所述阳性对照管形瓶的架包含至少两个阳性对照管形瓶，其中所有所述至少两个阳性对照管形瓶都包含阳性对照核酸的相同混合物。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中检测或定量至少三种不同靶核酸，另外包括在步骤a)中，在不扩增所述第一或第二靶核酸的情况中在第六管形瓶中扩增第三靶核酸，并在步骤b)中，另外扩增第三阳性对照核酸，其中所述第三阳性对照核酸是所述第三靶核酸的阳性对照，其中在第七管形瓶中扩增所述第三阳性对照核酸，其中所述第一阳性对照核酸、所述第二阳性对照核酸和所述第三阳性对照核酸在扩增前从阳性对照管形瓶向所述第三管形瓶、所述第四管形瓶和所述第七管形瓶提供，所述阳性对照管形瓶包含单一阳性对照储备溶液，该单一阳性对照储备溶液包含所述第一阳性对照核酸、所述第二阳性对照核酸和所述第三阳性对照核酸的混合物。

9.权利要求5至8中任一项的方法，其中所述第一架中包含的所有阳性对照管形瓶都包含浓度1x10E5至1x10E8个拷贝/ml或1x10E2至5x10E3个拷贝/ml的所述阳性对照核酸。

10.一种试剂盒，其包含架、标签、和主混合物管形瓶，所述架包含至少两个阳性对照管形瓶，其中每一个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液；所述标签指示要用试剂盒组分检测的单一靶核酸，其中所述靶核酸对应于所述储备溶液中的所述阳性对照核酸之一，所述主混合物管形瓶包含主混合物，该主混合物包含用于扩增所述靶核酸和相应的阳性对照核酸的试剂，且其中所述试剂盒不包含如下的主混合物，该主混合物包含用于扩增与至少一种如下的阳性对照核酸对应的靶核酸的试剂，该阳性对照核酸不对应于所述标签上标示的所述靶核酸，但是存在于所述阳性对照管形瓶的所述储备溶液中。

11.一种试剂盒，其包含架、标签，所述架包含至少两个阳性对照管形瓶，其中每一个所述阳性对照管形瓶包含至少两种阳性对照核酸的混合物的储备溶液；所述标签指示所述储备溶液中存在的阳性对照核酸所对应的所有靶核酸，其中所述标签还指示包含所述阳性对照核酸储备溶液的架供检测所述靶核酸之一，而不是单一管形瓶中的所述储备溶液中包含的阳性对照核酸所对应的其它靶核酸的方法中使用。

12.权利要求10的试剂盒，其中所述架包含至少两个开口，用于接收所述至少两个阳性对照管形瓶。

13.至少第一阳性对照核酸和第二阳性对照核酸的混合物在分开的阳性对照反应中的用途，其中在缺乏所述第二阳性对照核酸扩增的情况中扩增所述第一对照核酸，并在缺乏所述第一对照核酸扩增的情况中扩增所述第二阳性对照核酸。

14.权利要求12的用途，其中所述混合物是高浓度混合物或低浓度混合物。

15.权利要求12的用途，其中平行使用高浓度混合物和低浓度混合物。

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