CN115976171A - 一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法，属于医学检测领域。本发明通过引入携带有两个酶识别位点的哑铃探针为模板，操作简单，无需退火程序。对miRNA155进行指数滚环扩增(T‑ERCA)，进一步的，T‑ERCA反应的扩增产物ssDNA被CRISPR/Cas12a识别，并激活其反式切割活性，切割外源单链信号探针，释放荧光信号。T‑ERCA和CRISPR/Cas12a的双重扩增效应确保了T‑ERCA/Cas12a检测体系具有较高灵敏度，检测范围从1fM到5nM，检测限为0.31fM。本发明提供的方法操作简单，不需要大型仪器，为CRISPR/Cas传感器平台在临床诊断检测提供新思路和理论基础。

Description

一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法，属于医学检测领域。

背景技术

miRNA是由大约20-25个核苷酸构成，且具有调控功能的小型非编码RNA，通过与靶标mRNA的3'UTR结合进行转录后抑制，参与调节细胞分化、凋亡、增殖和信号转导等生物学过程，发挥其生物学调控功能。已有研究证明了miRNA的异常表达与人类癌症的发生和发展密切相关，其中miRNA155的高表达与乳腺癌的发生有直接的关系，miRNA已被公认为癌症诊断和预后的有效生物标志物。因此，快速、准确地检测miRNAs在疾病诊断和病理分析中至关重要。通常miRNAs具有长度短、易降解、序列相似性和低丰度等固有特性，对其进行高稳定性、高灵敏度和高选择性的定量检测仍然是一个挑战。目前最常用的核酸检测方法是基于聚合酶链式反应(PCR)的信号放大技术，即在PCR体系中加入分子信标，通过分子信标与PCR产物的结合来释放荧光。然而，基于PCR的检测技术高度依赖于昂贵且精密的热循环设备，且需要专门的技术人员操作，限制了PCR技术在低资源配制区域的应用，难以实现现场实时检测和即时诊断。

近几年发展起来的恒温扩增技术是用于miRNA检测最常用于信号放大的方法，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对热循环设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。包括滚环扩增(RCA)、催化发夹装配技术(CHA)、杂交链式反应(HCR)、链置换扩增(SDA)和指数扩增。其中，SDA方法涉及较强的非特异性扩增，熵变化驱动的CHA和HCR扩增效率低，RCA和指数扩增的高扩增效率使其成为有效的miRNA检测扩增策略。CRISPR/Cas生物传感器是近几年出现的新型分子诊断技术，其本身就是一种信号放大系统，结合RCA恒温扩增，可构建出级联放大的超灵敏miRNA诊断平台，特别适合低丰度miRNA的检测。此外，CRISPR/Cas对核酸的识别具有序列依赖性，可精确区分单碱基突变靶标，具有高分辨率，确保复杂样本检测的高特异性。

但在现有技术中，在利用滚环扩增RCA反应时，需要利用挂锁探针与待检测目标物以及T4连接酶进行扩增程序，导致非特异性扩增和背景信号的产生，降低检测方法的灵敏度和准确性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明开发了一种新型等温扩增策略T-ERCA/Cas12a系统，用于miRNA155检测。图1展示了T-ERCA/Cas12a体系的检测过程，包括T-ERCA扩增反应和CRISPR/Cas12a识别两个部分。首先，在靶标(miRNA-155)存在的情况下，T-ERCA反应被触发，由于哑铃探针的扩增模板含有两个切刻内切酶Nt.BbvCI识别位点，在Phi29 DNA聚合酶的辅助下，可实现指数循环扩增，生成大量的ssDNA产物。随后，ssDNA产物可以被Cas12a/crRNA识别，激活Cas12a/crRNA的反式切割活性，并对外源荧光探针进行持续不断的剪切，产生荧光信号，进一步放大信号。因此，基于T-ERCA和CRISPR/Cas12a的双重扩增作用，可以实现对miRNA-155的高灵敏度检测。

本发明提供了一种组合物，所述组合物含有CRISPR/Cas12a蛋白、携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针、crRNA、荧光信号探针、DNA聚合酶、切刻内切酶。

在一种实施方式中，所述切刻内切酶识别并切割哑铃探针。

在一种实施方式中，所述切刻内切酶选自Nt.BbvCI和/或Nb.BtsI中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述哑铃探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述哑铃探针的5’端经磷酸基团修饰。

在一种实施方式中，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述荧光信号探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，荧光信号探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。

在一种实施方式中，所述荧光基团包括HEX、FAM、ROX、FITC、Cy3或Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、TRMRA、MGBNFQ或DABCYL。

在一种实施方式中，所述DNA聚合酶包括phi29聚合酶。

在一种实施方式中，所述的Cas12a蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中的一种。

本发明提供了一种检测miRNA155的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有上述组合物。

本发明提供了上述组合物或上述试剂盒在检测miRNA155中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

在一种实施方式中，所述试剂盒中含有dNTP。

在一种实施方式中，所述应用包括以下步骤：

(1)合成哑铃探针：利用DNA连接酶使携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针闭环化。

(2)T-ERCA反应：将步骤(1)合成的哑铃探针、DNA聚合酶、限制性内切酶以及dNTP混合进行扩增反应，获得扩增产物ssDNA。

(3)CRISPR/Cas12a识别和荧光信号采集：将步骤(2)中获得的ssDNA中加入核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的crRNA、Cas12a蛋白、荧光信号探针混合反应。

在一种实施方式中，步骤(1)中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。

在一种实施方式中，步骤(1)中，将哑铃探针溶液和T4 DNA连接酶缓冲液置于95℃下处理3min后，缓慢冷却至室温20min，加入T4 DNA连接酶，置于37℃孵育1h；加入，核酸外切酶孵育2h；最后80℃灭活20min。

在一种实施方式中，所述核苷酸外切酶包括ExoI和ExoIII。

在一种实施方式中，步骤(2)中，将20μL的0.4μM闭环哑铃探针、0.4U/μLphi29聚合酶、0.3U/μL限制性内切酶以及250mM dNTP进行扩增反应。

在一种实施方式中，步骤(2)中，所述扩增反应的条件为37℃下反应100min。

在一种实施方式中，步骤(3)中，将4μL扩增产物ssDNA、2μL 1μM crRNA、2μL 1μMCas12a、2μL荧光信号探针充分混合。

在一种实施方式中，步骤(3)中，所述混合反应的条件为在37℃反应20min后，加入ddH₂O，通过荧光分光光度计(PerkinElmer)采集荧光光谱和荧光信号强度，

在一种实施方式中，所述荧光分光光度计的激发波长为490nm，发射波长为560nm。

有益效果：

1)T-ERCA引入哑铃结构扩增模板，在闭环连接时，不需要外加挂锁探针，用于扩增DNA模板可以自配对，将连接端点拉在一起，进行T4连接酶闭环连接。减少扩增程序，也避免了由于引入挂锁探针而带来的非特异性扩增和背景信号的产生。此外，哑铃结构扩增模板闭环过程不需要靶标miRNA作为连接探针，与传统RCA相比，T-ERCA避免了长时间的连接过程造成miRNA降解所因为的检测不准确和灵敏度低的问题。

2)T-ERCA的哑铃结构扩增模板携带两个切刻内切酶位点，在滚环扩增产物会在切刻内切酶位点处被切断，产物又可以作为滚环扩增引物进行下一步扩增，实现指数信号放大。相比于传统RCA及其它恒温扩增，具有更高的扩增效率和检测灵敏度。

3)CRISPR/Cas12a本身是一种信号放大系统，与T-ERCA联用，可建立级联信号放大体系，进一步提高检测灵敏度。T-ERCA反应的扩增产物ssDNA被CRISPR/Cas12a识别，并激活其反式切割活性，切割外源单链信号探针，释放荧光信号。T-ERCA和CRISPR/Cas12a的双重扩增效应确保了T-ERCA/Cas12a检测体系具有较高灵敏度，检测范围从1fM到5nM，检测限为0.31fM。

4)CRISPR/Cas12a反式切割，使其兼具信号读出功能，无需外加信号读出体系，使T-ERCA/Cas12a系统简单化，缩短检测时间。

5)CRISPR/Cas系统结合等温扩增技术的实验执行温度良好匹配，T-ERCA容易集成，能实现单管非开盖检测，避免污染和减少检测程序，避免了热循环仪器的使用，适合作为临床POCT检测部署。

6)与传统的聚合酶链反应相比，T-ERCA具有反应条件温和、扩增效率高的特点。

7)T-ERCA扩增和CRISPR/Cas12a识别具有序列依赖性，T-ERCA/Cas12a检测体系增强了miRNA155检测的特异性，可将miRNA155与其家族同源miRNA准确区分开来。

8)鉴于CRISPR/Cas12a的可编程性，T-ERCA/Cas12a可被改造成为检测其他miRNA的通用平台，为CRISPR/Cas传感器平台在临床诊断检测提供新思路和理论基础。

附图说明

图1 T-ERCA/Cas12a系统检测示意图。(A)哑铃探针(DP)的合成过程；(B)T-ERCA与CRISPR/Cas12结合(T-ERCA/Cas12a)用于检测miRNA-155示意图。

图2 T-ERCA/Cas12a系统的可行性验证。(A)crRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析图；(B)基于T-ERCA/Cas12a体系对不同样靶标的荧光响应光谱；(C)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哑铃探针(DP)和T-ERCA/Cas12a体系。

图3检测条件优化。(A)哑铃探针(DP)浓度的优化；(B)扩增时间的优化；(C)CRISPR/Cas12a切割时间的优化，柱状图A中，左为对照组，右为实验组。

图4 T-ERCA/Cas12a系统的检测性能。(A)T-ERCA/Cas12a对不同浓度miRNA-155(1fM到5nM)测定的荧光光谱；(B)根据荧光变化的miRNA-155浓度的校准曲线，荧光变化与浓度对数之间的线性关系；(C)1fM至50pM线性范围内的相应对数校准曲线；(D)0pM至5nM线性范围内的相应对数校准曲线。

图5为T-ERCA/Cas12a传感系统的特异性、可重复性和稳定性。(A,B)不同干扰物质的荧光光谱图，以及对应的荧光强度；(C)重复性；(D)稳定性。

图6为T-ERCA/Cas12a检测对从MCF-7细胞和LO2细胞中提取的总RNA的荧光响应。(A,B)两种细胞系的总RNA的荧光响应。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

下述实施例中涉及到的试剂：

HiScribe T7高效RNA合成试剂盒，核酸外切酶I(Exo I)、核酸外切酶III(ExoIII)、T4 DNA连接酶、phi29聚合酶、NEBuffer 2.0和切刻内切酶Nt.BbvCI购自New EnglandBioLabs(中国北京)。RNase-free H2O、miRcute miRNA分离纯化试剂盒和RNAprep试剂盒购自天根(中国北京)。Cas12a(Cpf1)购自广州美格生物科技。TE缓冲液、DEPC处理水、dNTP混合液和PAGE相关试剂(Acryl/Bis 30％溶液(29:1)、核酸染料、TBE缓冲液、DNA加载缓冲液、上样缓冲液和DNA标记)购自Sangon Biotechnology(中国上海)。所有DNA序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，并用HPLC纯化。

下述实施例中涉及的相关探针和寡核苷酸序列如表1所示。

表1本发明所用到的探针和寡核苷酸序列

“p”表示磷酸基团修饰。

实施例1一种高灵敏、低背景检测miRNA155的检测方法

具体为以下步骤：

(1)crRNA合成和纯化：将1μLT7启动子(100μM)、1μL crRNA模板(100μM)和16μLRNase-free H₂O充分混合，并在95℃下线性退火至室温，并保持20min。然后，添加10μLNTP和2μLT7 RNA聚合酶，然后将混合物在37℃下孵育12小时，以转录大量crRNA。之后，加入2μLDNase I，并在37℃下反应2小时以消化DNA模板。最后，使用miRcute miRNA分离纯化试剂盒纯化crRNA，并用NanoDrop 2000C(Thermo Fisher)定量，然后于-20℃条件下保存以便后续使用。

(2)合成哑铃探针：首先将线性模板哑铃探针溶液(TP，40μM，SEQ ID NO.2)和T4DNA连接酶缓冲液，置于PCR仪中，95℃下处理3min后，缓慢冷却至室温20分钟。然后加入2μLT4 DNA连接酶(400U/μL)，置于烘箱中37℃孵育1h；加入2μL ExoI(20U/μL)和2μLExoIII(20U/μL)，孵育2h；置于PCR仪中，80℃灭活20min，形成闭环哑铃探针(DP)。

(3)T-ERCA反应：将20μL含有步骤(2)中的闭环哑铃探针(DP,0.4μM)、不同浓度miRNA155、phi29聚合酶(0.4U/μL)、Nt.BbvCI(0.3U/μL)、1×phi29聚合酶缓冲液和dNTP(250mM)混合溶液置于烘箱中，在37℃下反应100min，获得扩增产物(ssDNA)。

(4)CRISPR/Cas12a识别和荧光信号采集：使用涡旋仪将4μL步骤(3)中的扩增产物、2μLNEBuffer 2.0、2μL步骤(1)中的crRNA(1μM)、2μL Cas12a(1μM)、2μLFQ-reporter信号探针和9μLRNase-freeH₂O充分混合。混合液置于烘箱中，37℃反应20min后，FQ-reporter信号探针被CRISPR/Cas12a剪切，产生黄色的荧光信号，加入80μL ddH₂O，通过荧光分光光度计(PerkinElmer)采集荧光光谱和荧光信号强度，其中激发波长为490nm，发射波长为560nm。

实施例2T-ERCA/Cas12a体系检测miRNA-155的可行性验证

具体为以下步骤：

按照实施例1中的方法进行miRNA-155的检测，并使用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶对实施例1各步骤中的反应产物进行电泳分析。将反应产物与DNA加载缓冲液以5:1的体积比混合，转入凝胶孔中。将凝胶置于在TBE缓冲液(1×)中，以100V的电压持续100min。最后，将电泳凝胶放入核酸染料中反应12min，并通过JENAUVsolo Imager收集图像。

如图2A所示，经过DNase I消解后的crRNA，仍出现明显的单一电泳条带，说明crRNA成功合成。如图2C所示，泳道1上的条带具有较低电泳迁移率，属于线性模板探针(TP)本身杂交的产物条带，在T4 DNA连接酶存在的情况下，泳道2中可观察到一条具有较高电泳迁移率的条带，这是归因于环状结构的闭环哑铃探针(DP)的形成，以上结果表明闭环哑铃探针(DP)合成成功。无靶标miRNA-155的情况下，经T-ERCA反应后，泳道3上只有DP条带，然而，miRNA-155存在情况下，泳道4中显示不同电泳迁移率的条带，分别对应于扩增产物单链、哑铃探针、扩增产物单链和哑铃探针互补而成的杂交链，这表明miRNA-155会触发T-ERCA反应以产生大量扩增的ssDNA。

如图2B所示，与对照组相比，在miRNA-155存在的情况下，T-ERCA反应被miRNA-155靶标所触发，产生大量的ssDNA，从而激活CRISPR/Cas12a切割荧光信号探针，产生大量荧光。然而，当不存在靶标miRNA-155时，不会生成ssDNA，也就不会激活Cas12a/crRNA的反式切割活性，因此表现出可忽略的荧光响应。基于以上结果，该方案可用于miRNA-155的灵敏检测。

实施例3检测方法实验参数的优化

具体为以下步骤：

(1)T-ERCA反应步骤中DP浓度的优化

与实施例1步骤(3)的区别仅在于DP浓度，设置DP浓度为0.1μM、0.4μM和1μM进行T-ERCA反应，检测不同DP浓度的实验组的荧光值，同时设置不含有靶标miRNA-155的对照组以检测背景荧光值。如图3A所示，当DP模板浓度为0.4μM时，其荧光响应最强。随着DP浓度增加引起非特异性扩增，导致较强的背景信号，因此使用0.4μM的DP作为最佳反应条件。

(2)T-ERCA反应步骤中反应时间的优化

与实施例1步骤(3)的区别仅在于反应时间，设置反应时间为40、60、80、100、120和140min进行T-ERCA反应，检测不同反应时间的实验组的荧光值，同时设置不含有靶标miRNA-155的对照组以检测背景荧光值。如图3B所示，随着反应时间的延长，荧光净响应值逐渐增加，并在100min时达到峰值，随后下降，可见延长反应时间将导致高背景信号。

荧光净响应值(ΔF)＝实验组的荧光值-对照组的荧光值

(3)CRISPR/Cas12a识别和荧光信号采集反应步骤中反应时间的优化

与实施例1步骤(4)的区别仅在于剪切的反应时间，设置剪切的反应时间为5、10、15、20、25和30min进行T-ERCA反应，检测不同剪切的反应时间的实验组的荧光值，同时设置不含有靶标miRNA-155的对照组以检测背景荧光值。

如图3C所示，CRISPR/Cas12a剪切20min后，荧光净响应值达到峰值。延长CRISPR/Cas12a剪切时间，没有观察到荧光净响应值增加，反而降低了，这是因为背景信号的增强所引起的。

实施例4T-ERCA/Cas12a体系的检测性能

(1)标准曲线和检测限

为了评估T-ERCA/Cas12a体系的检测性能，在实施例3优化的实验条件下对一系列浓度的miRNA-155进行量化分析。如图4A所示，荧光信号的强度随着miRNA-155浓度的增加(1fM～5nM)而逐渐增加。图4B显示了荧光净响应值随miRNA-155浓度变化的校准曲线，荧光净响应值(ΔF)与miRNA-155浓度对数呈线性相关。当miRNA-155为1fM到50pM时(图4C)，拟合方程为ΔF1＝33.73*logC+29.26(R²＝0.996)；当miRNA-155为50pM到5nM时(图4D)，拟合方程为ΔF2＝301.99*logC-1211.98(R²＝0.994)。检测限(LOD)为0.31fM。

(2)特异性

选择miRNA-21，let-7a和随机RNA作为干扰物质，以评估T-ERCA/Cas12a体系的对miRNA-155检测的特异性，添加浓度为1nM。设置空白对照。T-ERCA/Cas12a测定不同干扰物质引起的荧光光谱变化，只有靶标miRNA-155引起显著的荧光信号，荧光信号强度显著增强(图5A和图5B)，其他物质引起的荧光强度变化可忽略不计，表明T-ERCA/Cas12a对靶miRNA-155具有优异的选择性。

(3)重复性

为了进一步研究该方法的传感特性，进一步验证了其重复性和稳定性。将靶标miRNA-15浓度设定为1nM，分别在五个实验组进行3次连续测试来探索该方法的重复性。如图5C所示，相对标准偏差为为1.01％，说明T-ERCA/Cas12a体系的重复性好。

实施例5T-ERCA/Cas12a在实际样本中的应用

选择人乳腺癌细胞(MCF-7)作为阳性细胞，人正常肝细胞(LO2)作为阴性对照，从这两种细胞中提取总RNA。在相同浓度(500ng/μL)下，取2μL总RNA作为作为测试样本，并使用T-ERCA/Cas12a进行检测。结果如图6所示，两种细胞系引起的荧光信号明显不同，MCF-7细胞引起的荧光强度明显高于LO2细胞(图6A)。MCF-7细胞与LO2细胞之间存在显着差异(P^***<0.001)(图6B)。这些结果表明，MCF-7细胞中miRNA-155的水平远高于正常的LO2细胞，这是由于miRNA-155在乳腺癌中的高表达所致。所有这些结果表明，所提出的T-ERCA/Cas12a传感体系在重大疾病标志物miRNA检测中具有潜在的应用价值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有CRISPR/Cas12a蛋白、携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针、crRNA、荧光信号探针、DNA聚合酶、切刻内切酶。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述切刻内切酶识别并切割哑铃探针，所述切刻内切酶包括Nt.BbvCI和/或Nb.BtsI。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述哑铃探针的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述荧光信号探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，荧光信号探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述DNA聚合酶包括phi29聚合酶，所述的Cas12a蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中的一种。

6.一种检测miRNA155的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有权利要求1～5任一所述的组合物。

7.权利要求1～5任一所述组合物或权利要求6所述所述试剂盒在检测miRNA155中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

(1)合成哑铃探针：利用DNA连接酶使携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针闭环化；

(2)T-ERCA反应：将步骤(1)合成的哑铃探针、DNA聚合酶、限制性内切酶以及dNTP混合进行扩增反应，获得扩增产物ssDNA；

(3)CRISPR/Cas12a识别和荧光信号采集：将步骤(2)中获得的ssDNA中加入核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的crRNA、Cas12a蛋白、荧光信号探针混合反应。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增反应的条件为37℃下反应100min。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述混合反应的条件为在37℃反应20min后，加入ddH₂O，通过荧光分光光度计采集荧光光谱和荧光信号强度。

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