CN102311948A - 乳液中的克隆预扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于克隆预扩增核酸的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供多种不同的核酸分子，(b)使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接，(c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员，(d)克隆扩增所述多种不同的核酸分子。具体而言，所述不同的核酸分子为mRNA分子。

Description

乳液中的克隆预扩增
发明的技术领域
本发明涉及核酸扩增领域。更具体而言，本发明提供利用区室化使得每个区室含有单个或至多几个靶核酸分子的用于扩增(即制备多拷贝的)靶核酸序列的方法、组合物和试剂盒。
发明背景
自发现遗传物质基因由核酸组成(McCarthy，M.，Nature 421(2003)406)以及遗传改变是疾病(Guttmacher，A.E.和Collins，F.S.，N.Engl.J.Med.347(2002)1512-1520)和进化(Ayala，F.J.，Proc.Natl.Acad.SciUSA 104，增刊1(2007)8567-8573)的分子基础以来，核酸便成为研究的主要靶分子。最有影响和最通用的研究基因组水平上的核酸的方法是微阵列(Brown，P.O.和Botstein，D.，Nat.Genet.21(1999)33-37)和第二代或第三代的高通量序列分析仪(Shendure，J.和Ji，H.，Nat.Biotechnol.26(2008)1135-1145)。这些技术通常需要微克量的核酸用于分析，这相当于几十万个哺乳动物细胞(Peano，C.等，Expert Rev.Mol.Diagn.6(2006)465-480；Tang，F.等，Nat.Methods 6(2009)377-382)。
然而，在许多重大情况下，几乎不可能得到这么大量的材料。例如，用于分离人组织的技术，例如活组织检查、细针抽吸、细胞灌洗术(cytolavage)和激光捕获显微切割，常常获得产量为毫微克范围的提取核酸(Kamme，F.等，Methods Mol.Med.99(2004)215-223)。其它实例来自发育研究、胚细胞、神经元、免疫细胞、癌细胞或干细胞研究的领域(Saitou，M.等，Nature 418(2002)293-300；Chambers，I.等，Nature 450(2007)1230-1234；Toyooka，Y.等，Development 135(2008)909-918；Kamme，F.等，J.Neurosci.23(2003)3607-3615；Stoecklein，N.H.等，Cancer Cell 13(2008)441-453；Diercks，A.等，PLoS One 4(2009)e6326)。实际上，在小鼠早期发育期间，当种系的建立者种群即原生殖细胞刚出现时，胚胎中只有大约30个原生殖细胞(Saitou，M.等，Nature 418(2002)293-300)。即使对于细胞数目似乎是无限的体外培养的干细胞，由于干细胞异质性所致也存在严重局限性。例如，小鼠胚胎干细胞这种也许是分析得最透彻的干细胞类型，含有在基因表达和生理功能两方面都有很大差异的多个亚群，这进而又加大了对亚群水平或甚至单细胞水平的基因组分析的需要(Chambers，I.等，Nature 450(2007)1230-1234；Toyooka，Y.等，Development 135(2008)909-918)。
因此，为了克服阵列和高通量测序技术的局限，并且允许甚至是单细胞的多重分析，需要开发扩增少量核酸而又不使样品信息量明显失真的方法。在这个方面上，在最近20多年中已开发出完整基因组以及完整转录组的核酸扩增的多个方案(Peano，C.等，Expert Rev.Mol.Diagn.6(2006)465-480；Lasken，R.S.和Egholm，M.，Trends Biotechnol.21(2003)531-535)。这些方法中的大多数以体外转录反应、等温扩增和PCR(聚合酶链式反应)为基础。
由Van Gelder和Eberwine开发的体外转录方法(Van Gelder，R.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1663-1667)能够进行RNA的线性扩增。原来的方法及其技术修订以双链cDNA合成接着RNA合成为基础。体外转录的出错率相对较低，不是由于RNA聚合酶的出错率(每合成10 000个碱基一个错配)，而是因为输入的双链DNA模板是完全扩增的模板的唯一来源，因此，在后面的反应中不会携带或扩增在新合成的RNA上产生的任何错误(Wang，E.，J.Transl.Med.3(2005)1-11)。然而，受限于RNA样品的体外转录是繁琐的，产生较不稳定的RNA扩增物，并且是耗时的。此外，该方法易产生因使用启动子修饰的寡(dT)引物而引入的3’偏倚，尤其是采用两轮扩增时，因为第二轮的RNA群会比较小，导致转录物5’端中丢失信息(Peano，C.等，Expert Rev.Mol.Diagn.6(2006)465-480；Wang，E.，J.Transl.Med.3(2005)1-11)。
大多数等温扩增方法以链置换扩增方法为基础，该方法依赖于具有强的链置换活性的DNA聚合酶，例如exo-Klenow、Bca、Bst或phi29DNA聚合酶(Dean，F.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)5261-5266；Walker，G.T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)392-396；Kurn，N.等，Clin.Chem.51(2005)1973-1981)。这些聚合酶的引发位点(priming site)通过产生切口的限制性内切酶或通过寡核苷酸随机引物启动。这种反应的独特性质允许在相同模板上于30℃进行重复的DNA合成，每个新拷贝置换之前制成的拷贝。因此不需要精密仪器，如循环变温器。此外，尤其phi29DNA聚合酶具有极强的通过困难序列(difficult sequence)复制的能力以及达10-100kb的大规模持续合成能力，出错率相对较低(每106-107个碱基1个错误)(Dean，F.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)5261-5266；Esteban，J.A.等，J.Biol.Chem.268(1993)2719-2726)。然而，前述等温扩增方法有缺点。例如Walker，G.T等人的链置换扩增方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)392-396)需要存在用于规定的限制性内切酶的位点，这就限制了它的实用性。即使它们产生无偏倚的产物且即使它们是准确的，甚至是最初序列的复制，但Dean或Kurn等人的随机引发的链置换扩增方法(Dean，F.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)5261-5266；Kurn，N.等，Clin.Chem.51(2005)1973-1981)受到质疑。
由Mullis开发的PCR介导的指数扩增(Mullis K.等，Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.51Pt.1(1986)263-273)提供许多优势，例如表明原料的量可能大大减少的高扩增收率，以及可显著降低分析成本的快速容易的方案，因此使更复杂的实验设计成为可能。此外，双链PCR产物特别稳定。除常用的PCR扩增技术以外，在乳滴中进行PCR的方法也是本领域已知的(EP 1482036；Williams，R.等，Nat.Methods 3(2006)545-550)。
然而PCR技术受困于几个缺点。第一，PCR最有效地扩增几百个核苷酸的小区域，而当靶定较大区域时，扩增水平降低。这样，较短的片段趋于优先于较大的片段扩增。第二，通过PCR扩增基因组文库、cDNA文库和基因的其它复杂混合物，受到因DNA同源区之间重组产生的人为构造片段的损害。当引物在PCR的一个循环期间在一个模板上部分延伸，而在后面的循环中在另一模板上进一步延伸时，便出现这种情况下的重组。因此，产生了嵌合分子，其中的短分子于是优先扩增(Williams，R.等，Nat.Methods 3(2006)545-550；Meyerhans，A.等，Nucleic Acids Res.18(1990)1687-1691)。第三，扩增核酸序列品质方面的附加问题来源于使用水生栖热菌(Thermusaquaticus，Taq)DNA聚合酶，其特征在于相对较低的保真度。Taq聚合酶出错率(至多每合成50000个碱基一个错配)导致在大多数PCR扩增的DNA中掺入若干个错误碱基(Lundberg，K.S.等，Gene 108(1991)1-6)。这些错参通过随后的扩增循环而增殖。第四，另一个问题涉及扩增过程均衡性的丧失。在使用过量的输入模板量时，指数PCR反应达到饱和，因此有利于高丰度转录物优于低丰度转录物的扩增。此外，与富含AT的序列相反，DNA聚合酶在富含GC的序列的扩增中效率低下(Wang，E.，J.Transl.Med.3(2005)28)。在少至30个扩增循环后，不同的扩增效率可能导致在DNA群出现的DNA有数千倍的差异。
总之，核酸扩增现行方案中的普遍性质和缺点表明需要改进的核酸扩增方法。具体而言，当只可获得单个细胞或少量细胞的材料时，存在对无偏预扩增的需要。在这个背景下，本文所提供的本发明满足了这种需要，克服了若干缺点，并提供额外的益处。
发明简述
在第一个方面，本发明提供用于克隆预扩增(clonalpre-amplification)核酸的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供多种不同的核酸分子
b)使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接
c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员
d)克隆扩增所述多种不同的核酸分子
在一个主要的实施方案中，步骤d)期间的克隆扩增在油包水乳液内的水性液滴中进行。
优选所述不同的核酸分子是单链分子，优选RNA分子，更优选聚腺苷酸化RNA分子，最优选mRNA分子。
在RNA分子的情况下，本发明的方法可包括步骤b)内的下列步骤：
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，
所述衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列、长度为至少5个核苷酸的基本随机序列(essentially randomizedsequence)或基因家族特异性序列(gene family specificsequence)。
b2)在依赖于RNA的DNA聚合酶和dNTP混合物的存在下进行第一链cDNA合成以产生单链cDNA库
b3)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库连接。
此外在RNA分子的情况下，本发明的方法还可特别包括下列步骤：
b3i)在相同的dNTP存在下进行末端转移酶反应，以便产生同聚物突出端
b3ii)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3i)中产生的所述同聚物突出端互补。
优选所述多种不同的核酸分子为mRNA分子。还优选所述第一单链衔接分子的3’末端部分包含寡dT序列或完全随机序列，两者的长度为至少5个核苷酸。或者，所述3’末端部分包含基因或基因家族特异性序列。
在上述本发明方法和其改进方法后，可对乳液进行破乳以产生进行进一步分析实验的可能性。例如，可对克隆扩增的多种不同的核酸分子进行测序。或者，可使用参数特异性扩增引物(parameter specificamplification primer)对克隆扩增的多种不同的核酸分子进行定性或定量实时PCR反应实验。还可通过使用微阵列进行随后的基因表达分析。
为了分析仅从少量细胞得到的核酸，本发明的方法尤其有用。特别当所述多种不同的核酸分子得自少于100个细胞、少于10个细胞、甚至仅1个细胞时。
在另一方面，本发明涉及可用于进行上文公开的本发明方法的试剂盒。
这类试剂盒可包括
-第一单链衔接头核酸分子，其包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列或基本随机序列
-针对所述单链cDNA库的第二单链衔接分子，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分
-包含反转录酶活性的依赖于RNA的DNA聚合酶
附图简述
图1：乳液中整个核酸扩增的一般概念的示意图。
图2：整个转录组扩增的一般概念的示意图。
图3：整个转录组扩增方法实例的示意图
发明详述
本发明提供用于扩增(即制备多拷贝的)靶核酸序列的方法、组合物和试剂盒。
该技术具有广泛的实用性，因为核酸分析可用于检测和鉴定病原体、检测导致确定表型的基因改变、诊断遗传疾病或疾病易感性、评价在发育中、在疾病中和在响应特定刺激时的基因表达，并用于各种基因组分析计划。
本发明的主要概念是将核酸(NA)文库制备方案与按使单个或至多几个靶核酸分子区室化的方式扩增那些文库结合起来。区室化在油包水乳液的水性液滴中进行。因而模板核酸分子被隔离在乳液中极小的水性液滴中，并在隔离中通过PCR进行扩增。由于液滴的体积小，因此初始模板的浓度升高，这显著影响扩增的效率，允许甚至单个分子的扩增(Nakano，M.等，J.Biosci.Bioeng.99(2005)293-295)。示意图见图1。
当应用于整个转录组RNA扩增时，所述主要概念的示意图见图2。最初，在由特异性3’端和通用5’端组成的锚定引物存在下，使用具有反转录酶活性的依赖于RNA的DNA聚合酶，将RNA转录组转化成cDNA文库。在使用末端转移酶活性进行聚(N)加尾后，可合成第二链cDNA，以产生具有通用末端序列的片段的cDNA文库。然后使用对通用末端有特异性的引物，使这些片段在乳液中扩增。
更详尽的实例见图3。最初，在由特异性3’端和通用5’端组成的寡(dT)-锚定引物的存在下，使用反转录酶将RNA转录组转化成cDNA文库。在使用外切核酸酶I和碱性磷酸酶处理除去未反应的寡(dT)-锚定引物和dNTP后，可以合成第二链cDNA。使用末端转移酶进行聚(A)加尾，产生在5’端和3’端两端具有通用末端序列的片段的cDNA文库。然后使用对通用末端有特异性的引物，使这些片段在乳液中扩增。
本发明的第一个方面可定义为用于克隆预扩增核酸的方法，所述方法包括下列4个步骤：
a)提供多种不同的核酸分子
b)使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接
c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员
d)克隆扩增所述多种不同的核酸分子
步骤a)
提供多种不同的核酸分子
基本上，本新方法适用于任何类型的核酸，例如双链DNA、单链DNA，特别是任何类型的(单链)RNA，例如核糖体RNA、t-RNA、snRNA、hnRNA等。具体而言，本新方法对聚腺苷酸化RNA分子(例如mRNA分子)的克隆预扩增是十分有利的。因此，换句话说，本发明提供以下新方法，其用于无偏预扩增来源于仅几个细胞的整个转录组，从而允许无偏基因表达分析。
提供多种不同核酸分子的步骤可包括本领域已知的任何方法，其提供纯的DNA或RNA或mRNA样品或cDNA样品等。该步骤还可包括任何已知的核酸断裂方法，例如酶消化、机械剪切、超声处理、雾化等。
步骤b)
使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接
在本发明的情况下，常常使用术语“引物结合位点”。在这种情况下，该术语应理解为与引物序列相同的序列，所述引物将用于使用各自引物通过聚合酶催化的引物延伸反应(例如聚合酶链式反应)而延伸的后续步骤。
如果将要克隆扩增的多种不同核酸分子为DNA，则使双链衔接头与每个DNA片段的末端连接。然后在步骤d)的克隆扩增期间，衔接头序列将用作通用引物结合位点。
可以平端形式提供双链DNA片段，这可通过本领域众所周知的方法获得。或者，双链片段可包含相同的单链3’或5’突出端，这可在相应的限制性内切酶消化基因组DNA时产生。
在一个优选的具体实施方案中，通过限制性内切核酸酶处理将基因组DNA断裂。这类限制性内切核酸酶可为例如MseI(T|TAA)，其产生范围为100-1500bp的片段(Klein，CA.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)4494-4499)。然后，使用碱性磷酸酶处理DNA片段防止其重新连接。使用T4-DNA-连接酶，使衔接头寡核苷酸与基因组DNA片段连接。衔接头寡核苷酸有两种类型。一种含有具有5’磷酸修饰的通用序列。另一种含有3’修饰以防止衔接头自我连接。这类修饰可为缺失3’OH基团或者3’NH基团或3’C7-氨基修饰物(aminomodifer)。任选衔接头可为嵌合5’-DNA-3’RNA-寡核苷酸；在这种情况下，RNA酶H处理会破坏这类衔接头，并排除对后续PCR扩增的任何干扰。
根据将要克隆扩增的核酸的类型，连接适当衔接头序列的步骤需要多种酶的处理步骤。
在mRNA分子的情况下，本发明的方法可包括步骤b)内的下列步骤：
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，所述衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列、长度为至少5个核苷酸的基本随机序列或者基因家族特异性序列。
b2)在依赖于RNA的DNA聚合酶和dNTP混合物的存在下，进行第一链cDNA合成以便产生单链cDNA库
b3)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库连接。
依赖于RNA的DNA聚合酶可以是任何包含反转录酶活性的聚合酶，例如Transcriptor(Roche Applied Science目录号：04 379 012 001)、AMV反转录酶、M-MuLV反转录酶或具有反转录酶活性的热稳定DNA聚合酶。
在一个优选的实施方案中，步骤b)包括下列步骤：
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，所述衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列或者基本随机序列或基因家族特异性序列。
b2)进行第一链cDNA合成以产生单链cDNA库
b3i)在相同的dNTP存在下进行末端转移酶反应以便产生同聚物突出端，
b3ii)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3i)中产生的所述同聚物突出端互补。
以以下方式设计b1)的所述第一单链衔接分子，所述方式使得它基本上提供两种功能。引入5’末端引物结合位点以便能够在该方法稍后的步骤d)期间扩增所有的cDNA分子。以以下方式设计3’末端部分，所述方式使得所述衔接分子能够结合并引起所有目标RNA分子反转录。例如，假使聚腺苷酸化mRNA分子的整个群以全长预扩增，则3’末端部分可包括长度为至少5个核苷酸或优选至少15个但至多50个核苷酸的互补寡dT序列。优选将这类引物设计成锚定引物。这类寡(dT)-锚定引物是在dT序列段后的3’端携带至少一个非T核苷酸(即A、C或G)的寡核苷酸的混合物。这就意味着迫使寡(dT)-锚定引物与聚(A)尾的(5’)起始位点结合。因此，聚(A)尾的实际长度对引发无影响。
或者，在其中不需要全长cDNA拷贝的一个实施方案中，如果预扩增RNA分子总群，则所述3’末端部分可包含长度为至少5个核苷酸的完全随机序列。在一些情况下，甚至可能需要预扩增仅特定基因或规定基因家族的转录物。因此，所述3’末端部分可包含与所述基因家族转录物共有序列的一部分互补的序列。
在步骤b2)期间，使用RNA指导的DNA聚合酶，将单链RNA反转录成单链DNA。在该方法中，聚合酶，例如AMV-反转录酶或、MMLV-反转录酶、HIV-反转录酶或C.therm.聚合酶在根据所采用的引物类型而确定的以下位点上合成新的DNA链：当寡(dT)-锚定寡核苷酸用作引物时在聚(A)-mRNA的3’端、当使用随机-六聚物-锚定引物时在沿着模板的非特定位置上、或在序列特异性锚定引物的引物结合位点上。此外，可以使用寡(dT)或寡(dA)锚定-寡核苷酸作为引物以便反转录单链RNA，所述单链RNA在其聚(A)或聚(U)尾的3’端通过用大肠杆菌(E.Coli)聚(A)聚合酶或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)聚(U)聚合酶处理而被修饰。
利用步骤b3i)的末端转移酶处理以将同聚A尾加到cDNA的3’端。然而，为了能够特异性地在所产生的第一链cDNA的3’端进行有效的同聚物加尾，进行下列两种酶处理特别有利：
(i)如果除去在步骤b1)期间加入的非杂交和非延伸的单链DNA衔接头核酸分子，已被证实是有利的。因此，在随后的末端转移酶反应中产生的反应副产物减少。因此本发明的具体实施方案包括除去在步骤b1)期间加入的非杂交单链DNA衔接头核酸分子的步骤。在一个实施方案中，这可在步骤b2)和b3i)之间通过DNA外切核酸酶I处理来实现。该酶是降解单链DNA的3’→5′外切核酸酶，其防止了末端转移酶反应期间所述分子的不需要延伸。或者，可通过色谱法纯化实现这类去除，例如通过玻璃纤维吸附介导的纯化。
此外，按照本发明的一个方面，如果在步骤b3)的末端转移酶反应之前降解dNTP以便确保在随后的末端转移酶反应中的同聚物加尾，这已被证实是有利的。在本发明的范围内，这可通过在步骤b2)和b3i)之间与碱性磷酸酶温育来实现。优选在用如上公开的DNA外切核酸酶I处理后进行这种温育。在所述碱性磷酸酶的常规热灭活后，可加入dATP或另一种特定的dNTP，以便能够在末端转移酶反应期间产生同聚延伸产物。
或者，可通过cDNA纯化除去非杂交和非延伸的单链DNA衔接头核酸分子以及多余的dNTP。可通过使cDNA吸附到二氧化硅珠粒或过滤柱上来实现这类纯化(Vogelstein，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)。或者，可采用特定的缓冲条件，例如Whitehead研究院开发的固相可逆固定化技术(Solid Phase ReversibleImmobilization technology)(De Angelis，M.M.，Wang，D.G.和Hawkins，T.L.等，Nucleic Acids Res.23(1995)4742-47439)，通过使cDNA在顺磁颗粒上固定化来实现cDNA纯化。
如上所述，利用末端转移酶处理将同聚核苷酸尾序加到cDNA的3’端。优选步骤b3i)中所述相同的dNTP是dATP，使得产生同聚的聚A尾。由于脊椎动物编码序列和5’非翻译RNA区趋于偏向G/C残基，使用聚(A)尾降低由第二寡dT-锚定引物引起不当截短的可能性。另外，由于A/T结合比G/C结合弱而使用聚(A)尾，因此在寡dT-锚定引物与内部位点结合并截短扩增产物之前，需要较长序列段的A残基。
第一链cDNA合成主要导致RNA/第一链cDNA杂合体的形成。经验表明，DNA外切核酸酶I反应、碱性磷酸酶反应和末端转移酶反应的性能不受第一链cDNA分子仍与其起始模板结合这个事实的影响。然而，在不除去起始模板RNA的情况下，已知第二链cDNA产生、特别是RT-PCR反应不大有效。因此，在一个具体的实施方案中，本发明方法包括在步骤b2)和b3i)之间通过RNA酶H处理除去RNA/DNA杂合体内的RNA来消化RNA的步骤，但是优选在所述与DNA外切核酸酶I和碱性磷酸酶温育之后。或者，可恰好在步骤b3i)的末端转移酶反应期间加入RNA酶H以消化RNA模板。
然后，将加尾的cDNA分子用于第二链cDNA合成。作为先决条件，使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3i)中产生的所述同聚物突出端互补。假如已在步骤b3i)期间加入同聚物A，则所述3’末端部分为寡dT引物，优选为包含至少一个随机的3’末端残基、最优选至少随机的3’末端和随机的3’近末端残基的寡dT锚定引物。
在一个实施方案中，所述第二单链衔接分子的5’末端部分与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同。因此，在步骤d)中只需要1种引物用于克隆扩增。
在另一个实施方案中，所述第二单链衔接分子的5’末端部分与所述第一单链衔接分子的5’末端部分不同。因此，步骤d)中的克隆扩增将导致产生定向扩增的文库，其特征在于所有cDNA分子在起始3’端具有第一特异性衔接头序列，而在5’端具有第二特异性衔接头序列。
此外，如果通过不同于末端转移酶介导的加尾和随后的引物杂交的方法引入第二衔接头序列，则它也属于本发明的范围内。
例如，也可通过将单链衔接分子与所述单链cDNA库连接来实现步骤b3)，即，使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库连接。所述单链衔接分子通常为包含与引物结合位点互补的序列的寡核苷酸，因为需要用于随后的扩增。所述引物可与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同。
或者，所述单链衔接分子为以下分子，其包含：
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-随机核苷酸残基的3’末端部分。
有利的是，该实施方案不需要任何中间酶的步骤，例如同聚物加尾或连接；然而，缺点在于，由于第二衔接分子序列的随机化所致，第一链cDNA只以不完整3’端的形式扩增。
步骤c)和d)
制备油包水乳液和克隆扩增所述多种不同的核酸分子
在步骤c)期间，将含有每侧连接有衔接头序列的核酸分子群的水性样品与合适的油组合物混合，以产生油包水乳液。乳液可按照本领域已知的任何合适的方法形成。可以采用任何不会破坏聚合酶活性的制备乳液的方法。各种方法是本领域众所周知的。
乳液为两种不混溶液相的非均相系统，其中一相作为显微大小或胶体大小的液滴分散于另一相中。乳液可从不混溶液体的任何合适的组合中产生。用于本发明的乳液含有作为以细分散的液滴形式存在的相(分散相、内相或不连续相)的水(含有生化组分)，和作为这些液滴悬浮于其中的基质(非分散相、连续相或外相)的疏水性不混溶液体(“油”)。这类乳液称为“油包水”(W/O)乳液。这就具有这样的优势，即含有生化组分的整个水相在不连续的液滴(内相)中区室化。作为疏水性油的外相，一般不含生化组分，并因此是惰性的。
可通过加入一种或多种表面活性剂(surface-active agent/surfactant)使乳液稳定。这些表面活性剂称为乳化剂，作用于水/油界面以防止(或至少延迟)相分离。许多油和许多乳化剂都可用于产生油包水乳液；最新的汇编列出了超过16,000种表面活性剂，其中许多用作乳化剂(Ash和Ash，1993)。合适的油包括轻质石蜡油和非离子型表面活性剂(Schick，1966)，例如脱水山梨醇单油酸酯(Span&#8482；80；ICI)和聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(Tween&#8482；80；ICI)。
阴离子表面活性剂的使用也可为有益的。合适的表面活性剂包括胆酸钠和牛磺胆酸钠。特别优选的为脱氧胆酸钠，优选浓度为0.5％w/v以下。在一些情况下，加入这类表面活性剂可提高遗传组分的表达和/或基因产物的活性。将一些阴离子表面活性剂加入未乳化的反应混合物中完全破坏翻译。然而，在乳化期间，表面活性剂从水相转移到界面，活性得以恢复。向待乳化的混合物中加入阴离子表面活性剂确保反应只在区室化后进行。
乳液的产生一般需要应用机械能以迫使各相混在一起。存在实现此目的的许多方法，其利用多种机械装置，包括搅拌器(例如磁力搅拌棒、螺旋桨搅拌器和汽轮搅拌机、桨式装置和搅拌器)、匀浆器(包括转子定子式匀浆器、高压阀匀浆器和喷射匀浆器)、胶体磨、超声装置和“膜乳化”装置。
在本发明的情况下，优选的方法包括辅助方法、逆流方法、错流方法、转鼓方法和膜法。此外，可通过改变流速和组件的速度调整微胶囊的大小。例如，在逐滴加入中，可以改变液滴大小和递送的总时间。
在一个实施方案中，将扩增溶液混合物滴加到生物相容性油(例如轻质矿物油，Sigma)的旋转中的混合物中，并使之乳化。所使用的油可补充一种或多种生物相容性乳液稳定剂。这些乳液稳定剂可包括Atlox 4912、Span 80、Agrimer AL22(US 7,575,865；EP 1735458)和其它认可和市售的合适稳定剂。优选所形成的液滴的大小范围为5微米-500微米，更优选介于约50-300微米之间，最优选100-150微米。
按照Williams等(Williams，R.等，Nat.Methods 3(2006)545-550)，可通过在50ml离心管中于25℃将下列组分充分混匀，来制备用于emPCR的油-表面活性剂混合物：
Span 20            4.5％最终浓度
Tween 80           0.4％最终浓度
Triton X-100       0.05％最终浓度
矿物油(Sigma)      加至50ml
随后，在1.5分钟内将水相滴加入油-表面活性剂混合物中，再继续搅拌5分钟。通过这种方法，可以产生每毫升乳液含有约108-109个能进行PCR的区室的油包水乳液。
定制的cDNA分子统计性地分布在油包水乳液的过量的水性液滴中。因而加尾的cDNA分子被隔离在乳液的极小水性液滴中，以使用与在加尾cDNA的3’端和5’端引入的引物结合位点互补的引物，通过PCR扩增单个或至多几个加尾cDNA分子。如上文所公开，在cDNA加尾期间在cDNA的3’端加入引物结合位点，而在cDNA合成期间在cDNA的5’端插入引物结合位点。这允许在随后的步骤c)期间克隆扩增大多数的最初产生的单链cDNA分子。
更准确地讲，以以下方式选择条件，所述方式使得大多数水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员。可以假定，许多加尾单链cDNA分子的分布遵循典型泊松型分布。因此本领域的技术人员能够鉴定满足下列两个要求的情况：
第一，液滴的数目需要足够大，使得超过50％、优选超过80％的液滴含有至多一个加尾cDNA分子。这是随后步骤d)期间进行克隆扩增的先决条件。由于克隆扩增的原理，即每个起始单一cDNA分子单独扩增，因此可能获得无偏的扩增cDNA群，从而解决了作为本发明基础的问题。换句话说，作为步骤d)的结果，存在于扩增的cDNA群中的cDNA序列每个种类的出现频率将相当于在最初提供的多种不同核酸分子中存在的cDNA序列的每个类型的出现频率。
第二，需要将不含加尾cDNA模板的水性液滴的数目保持得足够低，以便限制步骤c)和d)中对乳液和扩增试剂的需要，从而使方法尽可能有效。
实施步骤d)以便克隆扩增水性液滴内的加尾DNA。通常，通过已知在油包水乳液中的水性液滴内同样具有功能的PCR，来实现这类扩增(Margulies，M.等，Nature Publ Group 437(2005)376-80；Nakano，M.等，J.Biotechnol 102(2003)117-124)。本领域亦称“emPCR”，这类扩增方法可采用标准热循环方案进行。
用于步骤d)的乳液PCR的引物是与由上文公开的第一和第二单链衔接分子引入的引物结合位点互补的寡核苷酸。如果第二衔接分子含有的引物结合位点不同于第一衔接分子的引物结合位点，则只需要一种引物用于扩增。如果两个衔接头的引物结合位点不同，则需要两种不同的引物对。在后一情况下，产生定向扩增的cDNA。
按照本发明应用的确保双链cDNA保持在扩增指数期的PCR循环数目可最优化，并且主要取决于例如样品DNA的起始浓度。
然后，进行破乳。破乳可通过合适的过滤方法进行。优选破乳可通过用异丙醇或洗涤剂处理所述乳液以便从乳液中回收扩增的cDNA文库来实现。异丙醇处理结合高速离心可供通过定量沉淀从乳液中回收核酸。使用含有离液序列高的缓冲剂的十二烷基硫酸钠和TritonX100的洗涤剂处理进行破乳，并可供通过吸附到二氧化硅珠粒或过滤柱上来回收核酸。
按照Williams等的方法(Williams，R.等，Nat.Methods 3(2006)545-550)，可通过在13000g下于25℃离心5分钟来破乳。除掉上(油)相。用有机溶剂(例如水饱和的乙醚)进行若干次提取可进一步从乳液中除去余留的油，并引起破乳。
读出方法(READ OUT METHOD)
为了分析仅从少量细胞得到的核酸，本发明的方法尤其有用。特别是当所述多种不同的核酸分子来源于少于100个细胞、少于10个细胞、甚至仅1个细胞时。所得到的样品包含扩增核酸，其特征在于与原样品出现的核酸相比，原来存在于样品中的核酸分子的全部类型以相同的相对量出现，因为本发明的方法提供用于无偏扩增的解决办法。这为进行具有高精度的进一步定量分析实验提供了可能性。具体而言，本发明提供用于高精度基因表达分析的解决办法，当RNA、特别是mRNA用作起始材料时。
在第一个实施方案中，可使用参数特异性扩增引物，对克隆扩增的多种不同的核酸分子进行定性或定量实时PCR反应实验。在实时PCR内，样品分析在同一仪器中的同一管中与扩增同时发生。在每个PCR循环中监测PCR产物的形成。通常在循环变温器中测量，该循环变温器具有在扩增反应期间测量荧光信号的其它装置。DNA染料或荧光探测物可在扩增前加入PCR混合物中，并可用于分析扩增期间的PCR产物。这种联合方法减少了样品处理，节约了时间，极大降低了用于后续反应的产物污染的风险，因为不需要从其密封的容器中取出样品用于进一步分析。
在一个具体的实施方案中，由于双链扩增产物的量通常超过待分析样品中最初存在的核酸的量，因此可以使用双链DNA特异性染料，该染料只有当它们与双链DNA结合时，在用适当波长激发时才显示荧光升高。优选仅可使用例如不影响PCR反应效率的染料，如SybrGreenI I。
在另一个具体的实施方案中，可以使用仅在结合其靶核酸时才发出荧光的荧光标记的杂交探针。例如，将单链杂交探针用两个组分标记。根据荧光共振能量转移原理，当第一组分被适当波长的光激发时，所吸收的能量转移至第二组分，即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤期间，杂交探针与靶DNA结合，在随后的延伸期，通过Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性而降解。因此，激发的荧光组分和猝灭剂在空间上彼此分隔开，因此可以测量第一组分的荧光发射。TaqMan水解探针测定法有关详情披露于US 5,210,015、US5,538,848和US 5,487,972。TaqMan杂交探针和试剂混合物披露于US 5,804,375。
或者，分子信标杂交探针用第一组分和用猝灭剂标记，标记优选位于探针的两端。由于探针的二级结构的原因，在溶液中，两个组分在空间上接近。在与靶核酸杂交后，两个组分彼此分隔开来，使得在用适当波长的光激发后，可以测量第一组分的荧光发射(US5,118,801)。
又或者，通过FRET杂交探针，实时监测所述实时PCR。FRET杂交探针试验形式可用于全部类型的均相杂交测定法，包括实时PCR(US 6,174,670)。其特征在于同时使用与扩增的靶核酸同一链的相邻位点互补的两种单链杂交探针。两种探针都用不同的荧光组分标记。根据荧光共振能量转移原理，当用适当波长的光激发时，第一组分将所吸收的能量转移至第二组分，使得在两种杂交探针与待检测的靶分子的相邻位置结合时，可以测量第二组分的荧光发射。或者为监测FRET受体组分的荧光的增加，还可监测FRET供体组分的荧光减少作为杂交事件的定量测量。
在第二个实施方案中，可对克隆扩增的多种不同的核酸分子进行测序。可以进行任何类型的测序(例如Sanger测序)或任何高通量测序方法。例如，测序可在454基因组序列分析仪FLX系统(454 GenomeSequencer FLX System)(Roche Applied Science)上进行。该系统能够进行每轮一百万个以上的高质量读取和400个碱基的读取长度，因此理想地适于任意大小的整个基因组和转录组的从头测序、复杂样品的宏基因组学表征(metagenomic characterization)、重测序研究等等。应用一系列的标准分子生物学技术，将短衔接头(A和B)-对3’端和5’端都具有特异性-加到将要测序的每个片段上。将衔接头用于纯化、扩增和测序步骤。具有A和B衔接头的单链片段构成用于随后的工作流程步骤的样品文库。使单链DNA文库在特别设计的DNA俘获珠粒上固定化。每粒珠粒携带唯一的单链DNA文库片段。将珠粒结合的文库与扩增试剂在油包水混合物中乳化，产生微型反应器，其只含有一个珠粒和一个独特的样品-文库片段。每个独特的样品文库片段在其自身的微型反应器内扩增。整个片段集合体的扩增并行进行；对于每个片段，这就导致每珠粒有数百万的拷贝数。随后，乳液PCR设置被破坏，同时扩增片段保持与其特定的珠粒结合。于是片段对加载到PicoTiterPlate装置中用于测序已准备好。PicoTiterPlate孔的直径允许每孔仅一珠粒。加入测序酶后，基因组序列分析仪FLX仪的射流子系统使各个核苷酸以固定顺序沿着各含有一珠粒的几十万个孔流过。随后，进行焦磷酸测序(Pyrosequncing)反应，与模板链互补的一个(或多个)核苷酸的加入产生化学发光信号，用基因组序列分析仪FLX的CCD照相机记录。
对于基因表达分析，以大规模并行的方式对扩增cDNA分子的整个群进行测序使得可以比较不同mRNA种类的相对丰度。在这种情况下，本发明包括以下步骤
a)提供多种不同的mRNA分子
b)通过以下步骤使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接，
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，所述衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列，
b2)进行第一链cDNA合成以产生单链cDNA库
b3i)在相同的dNTP存在下进行末端转移酶反应以便产生同聚物突出端，dNTP优选为dATP，
b3ii)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3)中产生的所述同聚物突出端互补。
c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员
d)克隆扩增所述多种不同的核酸分子。
e)对所述克隆扩增的多种不同的核酸进行测序。
如果代表引物结合位点的5’末端部分实际上不同于所述第一单链衔接分子的5’末端部分，则该方法可与454基因组序列分析仪系统的文库组合。因此本发明还涉及包括以下步骤的方法
a)提供多种不同的mRNA分子
b)通过以下步骤使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接，
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，所述衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列，
b2)进行第一链cDNA合成以产生单链cDNA库
b3i)在相同的dNTP存在下进行末端转移酶反应以便产生同聚物突出端，dNTP优选为dATP，
b3ii)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3)中产生的所述同聚物突出端互补，
其中所述衔接分子的5’末端与珠粒连接
c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员
d)克隆扩增油包水乳液内的所述多种不同的核酸分子，和
e)对所述乳液进行破乳，和
f)对所述克隆扩增的多种不同核酸分子进行测序。
最后，为了监测基因表达，对统计各个cDNA序列的测序事件的丰度进行彼此对比。
在第三个实施方案中，可将克隆扩增的多种不同的核酸分子杂交至DNA微阵列。
为了检测DNA微阵列上的杂交，所述克隆扩增的多种不同的核酸分子，需要用随后在相应仪器(例如扫描器)上可检出的荧光化合物标记。本领域用于标记核酸样品的一个优选的构思是随机引物标记(random prime labeling)。对于这个构思，首先将长为5-12个核苷酸单体的随机引物群与样品DNA杂交。然后，加入缺乏3’5’外切核酸酶活性的Klenow片段DNA聚合酶，以便通过掺入dNTP来延伸所述引物。通过使用标记的引物，或通过至少一种类型的标记的脱氧核苷三磷酸来引入标记。标记优选为荧光标记，最优选为菁染料，例如Cy3、Cy3.5、Cy5或Cy5.5。
因此，本发明还包括以下步骤的方法：a)提供多种不同的mRNA分子
b)通过以下步骤使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接，
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，所述衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列，
b2)进行第一链cDNA合成以产生单链cDNA库
b3i)在相同的dNTP存在下进行末端转移酶反应以便产生同聚物突出端，dNTP优选为dATP，
bii)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3)中产生的所述同聚物突出端互补
c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员
d)克隆扩增所述多种不同的核酸分子
e)标记所述扩增的多种核酸分子，优选通过随机引物标记，和
f)使所述标记的扩增的多种核酸分子杂交至DNA微阵列。
本领域技术人员应了解如何设计用于监测基因表达的阵列上需要的探针。或者，这类基因表达阵列是市售的(例如Roche AppliedScience目录号：05 543 789 001)。于是，对DNA微阵列发出的荧光图式的分析表明各个RNA的相对表达水平。
本发明的试剂盒
在另一方面，本发明涉及可用于进行上文公开的本发明方法的试剂盒。
这类试剂盒可包括
-第一单链衔接头核酸分子，其包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列或者基本随机序列或基因家族特异性序列
-针对所述单链cDNA库的第二单链衔接分子，
所述第二单链衔接分子包含
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分
-包含反转录酶活性的依赖于RNA的DNA聚合酶。
依赖于RNA的DNA聚合酶可以为反转录酶，例如Transcriptor(Roche Applied Science目录号：03 531 317 001)、AMV反转录酶(RocheApplied Science目录号：11 495 062 001)、M-MULV反转录酶(RocheApplied Science目录号：11 062 603 001)或生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的DNA聚合酶的Klenow片段(Roche Applied Science目录号：12016346001)。
优选这类试剂盒中包含的所述第一单链衔接分子的3’末端部分包含长度为至少5个核苷酸或更优选至少15个但不超过50个核苷酸的寡dT序列。
此外，试剂盒可还包含一种或若干种代表性的下列化合物、试剂和酶：
-末端转移酶(Roche Applied Science目录号：03 333 566 001)
-RNA酶H(Roche Applied Science目录号：10 786 349 001)
-碱性磷酸酶(Roche Applied Science目录号：11 097 075 001)
-DNA外切核酸酶(New England Biolabs目录号：MO 293L)
-可用于形成用于乳液PCR的油包水乳液的油
-能够进行emPCR的热稳定DNA聚合酶
-一种或多种脱氧核苷三磷酸
-扩增引物或扩增引物对，其是与由上文公开的第一和第二单链衔接分子引入的引物结合位点互补的寡核苷酸。
如果第二衔接分子含有的引物结合位点不同于第一衔接分子的引物结合位点，则只需要一种引物用于扩增。如果两种衔接子的引物结合位点不同，则需要两种不同的引物对。
实施例
实施例1
未扩增cDNA文库和预扩增文库之间的基因表达一致性的比较
使用HeLa细胞作为总RNA的来源来进行该比较。具体而言，使用以下文库对未扩增cDNA文库之间的表达进行比较
-作为校准样品的使用Roche Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Science，#04379012001)的未扩增cDNA文库，
-按照生产商的方案，使用NuGen公司(Roche Applied Science，#05190894001)、Rubicon/Sigma公司(#WTA1)和Clontech/Takara公司(#634925)的先存在的预扩增试剂盒的预扩增文库，和
-在油包水乳液设置中使用Clontech/Takara(#634925)预扩增试剂盒的克隆预扩增文库。
伴随下列改进，在Clontech/Takara SMARTer cDNA合成试剂盒(#634925)的基础上进行在乳液中的这种预扩增：使用SMARTerMMLV反转录酶和含有通用锚定序列(3’SMART CDS引物IIA)的修饰寡(dT)引物，对总RNA进行反转录。当SMARTScribe RT到达mRNA的5’端时，酶的末端转移酶活性将几个额外的核苷酸加到cDNA的3’端。具有非模板核苷酸序列段的SMARTer寡核苷酸IIA碱基对产生延伸的模板。SMARTScribe RT然后转换模板，并继续复制至寡核苷酸的末端31。所得单链cDNA此时含有两个通用锚定序列，一个位于其5’端，另一个位于其3’端。这些cDNA然后分布在油包水乳液的过量水性液滴中，该油包水乳液含有PCR反应混合物(聚合酶、盐、缓冲液、dNTP、引物)和补充了一种或多种生物相容性乳液稳定剂的矿物油，稳定剂包括Atlox 4912、Span 80、Agrimer AL22和其它认可和市售的合适稳定剂(另见专利29，30)。通过PCR的扩增以对通用锚定序列有特异性的引物为基础。在确保双链cDNA保持在扩增指数期的最佳次数的PCR循环后，对乳液进行破乳，从乳液中回收扩增的cDNA文库用于通过定量PCR进行另外的比较基因表达分析。
然后，按照比较阈值循环方法(Livak，K.J.和Schmittgen，T.D.，Methods 25(2001)402-408；Schmittgen，T.D.和Livak，K.J.，Nat.Protoc.3(2008)1101-1108)，在LightCycler 480仪器(Roche Applied Science#05 015278 001)上应用Real Time Ready Human Reference Gene Panel(Roche Applied Science，#05 339 545 001)，使用克隆扩增的cDNA文库进行相对基因表达分析。
简单地说，使用HeLa细胞作为总RNA的来源，测定相对基因表达。将使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche AppliedScience，#04379012001)从5ng总RNA合成的cDNA，用作校准物。在该校准物的基础上，使用NuGen预扩增试剂盒、Rubicon/Sigma WTA预扩增试剂盒、Clontech/Takara SMARTer预扩增试剂盒和改进的乳化SMARTer预扩增试剂盒的各5ng RNA，对基因表达进行比较。
qPCR表达分析的结果概括于下表：
表1：与未预扩增的cDNA相比，使用预扩增方法监测相对基因表达的差异。
Figure BSA00000538287300261
Figure BSA00000538287300271
*星号表示缺失的数据点
根据该表可知，靶基因与校准物的相对基因表达表明，使用Clontech预扩增试剂盒结合油包水乳液(见表1右栏)，导致与在分析校准样品(仅cDNA合成试剂盒)时对基因表达所获得的值的偏差最小。因此，本发明的方法，即在油包水乳液中进行的克隆预扩增产生优于本领域可获得的方法的结果。
实施例2：
未扩增cDNA文库和用额外的末端转移酶处理制备的预扩增文库之间的基因表达一致性的比较
使用HeLa细胞作为总RNA的来源进行该比较。具体而言，使用以下文库对未扩增cDNA文库之间的表达进行比较
-作为校准样品的使用Roche Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Science，#04379012001)的未扩增cDNA文库，和
-以改进的5′/3′RACE试剂盒(5′/3′RACE Kit)(Roche AppliedScience，#03353621001)为基础结合用于预扩增的油包水乳液设置的克隆预扩增文库。
改进如下：使用AMV型Transcriptor反转录酶和含有通用锚定序列的修饰的寡(dT)引物，对总RNA进行反转录。在第一链cDNA合成后，通过玻璃纤维吸附介导的cDNA纯化(Roche Applied Science，#11732668001)除去未反应引物。
随后，使用末端转移酶处理将同聚A尾加到cDNA的3’端。然后使用DNA-聚合酶和第二寡dT-锚定引物，将加尾cDNA分子用于第二链cDNA合成。
另外，加尾cDNA分子统计性地分布在油包水乳液的过量水性液滴中，油包水乳液含有PCR反应混合物(聚合酶、盐、缓冲液、dNTP、引物)和补充了一种或多种生物相容性乳液稳定剂的矿物油，稳定剂包括Atlox 4912、Span 80、Agrimer AL22和其它认可和市售的合适稳定剂(另见专利(US 7,575,865；EP 1 735 458)。从而加尾的cDNA分子分隔在乳液的极小水性液滴中，使得各个或至多几个加尾cDNA分子通过使用对锚定引物有特异性的引物进行PCR而扩增。在确保双链cDNA可保持在扩增指数期的最佳次数的PCR循环后，对乳液进行破乳，然后从乳液中回收扩增的cDNA文库。
然后如实施例1所公开，使用克隆扩增的cDNA文库用于相对基因表达分析。qPCR表达分析的结果概括于下表：
表2：与未预扩增的cDNA相比，使用预扩增方法监测的相对基因表达的差异。
Figure BSA00000538287300291
*星号表示缺失的数据点
从该表可知，靶基因与校准物的相对基因表达表明，19个基因中有18个可通过上述油包水乳液型方案成功地预扩增。对于中等到低表达的靶基因与校准样品的一致性高(绝对Cp≥25)，但却常常过高估计了样品中更高丰度基因的表达水平。这就表明，本发明的方法，即在油包水乳液中进行的克隆预扩增，对于在样品中具有的起始RNA浓度低的靶转录物的分析或对于得自其中存在极少量总RNA的样品的RNA预扩增(例如从细针活组织检查得到的少数细胞的分析或单细胞水平的分析)，都提供较好的结果。

Claims (15)

1.一种包括以下步骤方法：
a)提供多种不同的核酸分子，
b)使衔接头序列与所述核酸分子的3’端和5’端连接，
c)制备油包水乳液，其特征在于大部分水滴包含一个或不包含所述多种不同的核酸分子的成员，
d)克隆扩增所述多种不同的核酸分子。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述不同的核酸分子是单链分子，优选RNA分子，更优选聚腺苷酸化RNA分子，最优选mRNA分子。
3.权利要求2的方法，所述方法包括下列步骤：
b1)使第一单链衔接头核酸分子与所述多种不同的核酸分子杂交，
所述衔接分子包含：
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列、长度为至少5个核苷酸的基本随机序列或基因家族特异性序列，
b2)在依赖于RNA的DNA聚合酶和dNTP混合物的存在下进行第一链cDNA合成以便产生单链cDNA库，
b3)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库连接。
4.权利要求3的方法，其中步骤b3)包括：
b3i)在一种特定的dNTP存在下进行末端转移酶反应以便产生同聚物突出端，
b3ii)使第二单链衔接分子与所述单链cDNA库杂交，
所述第二单链衔接分子还包含：
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，
-同聚核苷酸残基的3’末端部分，其与步骤b3i)中产生的所述同聚物突出端互补。
5.权利要求4的方法，其特征在于
-所述多种不同的核酸分子是mRNA分子，
-所述第一单链衔接分子的3’末端部分包含长度为至少5个核苷酸的寡dT序列，和
-步骤b4)中所述特定的dNTP是dATP。
6.权利要求5的方法，所述方法还包括在步骤b2)和b3i)之间或在步骤b3i)期间，通过与RNA酶H温育来消化所述mRNA分子的步骤。
7.权利要求5-6的方法，所述方法还包括在步骤b2)和b3i)之间，通过与碱性磷酸酶温育来降解所述dNTP混合物的步骤。
8.权利要求5-7的方法，所述方法还包括在步骤b2)和步骤b3i)之间，通过与3’-5’外切核酸酶温育来降解所述第一单链衔接头核酸的步骤，所述3’-5’外切核酸酶优选为DNA外切核酸酶I。
9.权利要求1-8的方法，所述方法还包括以下步骤：
e)对所述乳液进行破乳，
f)对所述克隆扩增的多种不同的核酸分子进行测序。
10.权利要求1-8的方法，所述方法还包括以下步骤：
e)对所述乳液进行破乳，
f)进行实时PCR反应。
11.权利要求1-8的方法，所述方法还包括以下步骤：
e)对所述乳液进行破乳，
f)进行DNA微阵列分析。
12.权利要求1-11的方法，其中所述多种不同的核酸分子来源于少于100个细胞，优选少于10个细胞，最优选1个细胞。
13.一种试剂盒，其包含：
-第一单链衔接头核酸分子，其包含：
-代表引物结合位点的5’末端部分，和
-3’末端部分，其为长度为至少5个核苷酸的寡dT序列、长度为至少5个核苷酸的基本随机序列或基因特异性序列，
-针对所述单链cDNA库的第二单链衔接分子，
所述第二单链衔接分子包含：
-代表引物结合位点的5’末端部分，其与所述第一单链衔接分子的5’末端部分相同或不同，和
-同聚核苷酸残基的3’末端部分。
14.权利要求13的试剂盒，其还至少包含末端转移酶和任选包含反转录酶和/或热稳定DNA聚合酶。
15.权利要求13-14的试剂盒，其进一步的特征在于：
-所述第一单链衔接分子的3’末端部分包含长度为至少5个核苷酸的寡dT序列。
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