CN115807122A - 一种菠萝种资源鉴定的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物分子标记技术领域，公开了一种用于菠萝种资源鉴定的SNP分子标记及应用。本发明通过对110份菠萝种质资源进行重测序，开发了44个能将菠萝种质完全区分开的SNP分子标记。本发明的SNP分子标记可用于菠萝种质资源鉴定及遗传多样性分析，具有适用的品种种类更多、成本低、效率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物分子标记技术领域，具体地涉及一种用于菠萝种资源鉴定的SNP分子标记及应用。
背景技术
菠萝(Ananas comosus(L.)Merr)是凤梨科凤梨属的热带亚热带果树。通过人工杂交创制新种质是菠萝新品种选育的有效手段。因此对已有种质资源进行分类、鉴定有助于杂种优势的利用，对菠萝育种具有重要意义。
菠萝种质资源传统的分类主要是基于表型性状来进行，主要分为卡因、皇后、西班牙和波多黎各四类。但表型鉴定易受环境条件的影响和人为主观因素的干扰，对研究结果造成一定的影响。而DNA分子标记技术是根据基因组中DNA片段差异来判断个体间遗传信息的差异，不受环境条件和人为主观因素的影响，在种质资源遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因定位与克隆以及分子标记辅助育种等方面具有重要作用。目前主要利用EST-SSR(Wo¨hrmann et al.,2011)、RAPD(王健胜等，2015)、AFLP(Kato et al.,2004)、SRAP(窦美安等，2010)和CAPS(Carlier et al.,2012)等标记进行菠萝种质资源遗传多样性的分析。这些分子标记能够有效的将种质资源进行分类，为分析种质资源的亲缘关系和杂交组配提供依据。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)广泛分布于植物基因组中，是最丰富的DNA变异形式(Lou et al.,2017；)，基于SNP开发的标记具有成本低、耗时短、准确性高和通量高等优点，在作物遗传图谱构建、基因定位、种质资源分析、分子标记辅助育种等方面广泛应用(Lu et al.,2020；孟君仁等，2021)。
菠萝种质资源表型鉴定周期长、田间工作量大、易受环境和人为主观因素的影响。现有的SSR，SRAP和AFLP等分子标记操作复杂、实验耗时长、通量低，不能有效解决菠萝种质资源的分类与鉴定。
发明内容
本发明通过对110份菠萝种质资源的基因组重测序，开发出能区分菠萝种质的44个SNP位点，作为分子标记可用于菠萝种质资源鉴定及遗传多样性分析。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
本发明提供了一种菠萝种质资源鉴定的SNP分子标记，包括以下SNP位点：
本发明还提供了一种扩增上述SNP分子标记的引物组，所述引物组的引物序列分别如SEQ ID NO.1-132所示。
本发明另外一个目的还在于上述分子标记或引物组在菠萝种质资源基因分型中的应用，对所述SNP分子标记的引物序列进行荧光标记后，进行PCR扩增，检测待测位点的荧光信号值进行基因分型。
作为一种实施方式，对所述菠萝SNP分子标记的两条特异性引物5’端分别标记不同的荧光序列。
本发明另外一个目的还在于上述分子标记或引物组在菠萝种质资源分类中的应用，包括：利用所述SNP分子标记的引物序列对菠萝种质进行基因分型，通过构建距离矩阵，构建进化树，和/或进行群体PCoA的分析。
优选的，根据进化树结果，若菠萝种质间SNP位点标记的相似度越高，分支离的越近，反之越远；根据PcoA结果，若菠萝种质间SNP标记相似度越高，种质靠的越近，反之越远。
优选的，利用R程序包poppr进行进化树的构建，利用联川生物平台进行PcoA分析。
本发明另外一个目的还在于上述分子标记或引物组在菠萝种质资源鉴定中的应用，包括：利用所述SNP分子标记的引物序列对菠萝种质进行基因分型，将待鉴定的种质基因型与目标种质基因型进行比较分析，当其相似度达到90％以上，表明待鉴定的种质真实来源于目标种质。
本发明还包括一种用于菠萝种质资源鉴定的试剂、试剂盒或芯片，其特征在于，所述试剂、试剂盒或芯片包括上述的引物序列。
优选的，所述试剂或试剂盒还包括分型试剂，和/或DNA提取试剂。本发明对所述分型试剂和DNA提取试剂的具体种类和来源没有特别限制，可以采用市售商品。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明通过对110份菠萝种质资源进行重测序，开发了44个能将现有菠萝种质完全区分开的SNP分子标记。上述SNP分子标记可用于菠萝种质资源鉴定及遗传多样性分析，具有适用的品种种类更多、成本低、效率高等优点。
附图说明
图1为179份菠萝种质的进化树图；
图2为179份菠萝种质的PcoA图；
图3为待鉴定种质与目标种质的进化树分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
菠萝SNP位点的筛选
1、菠萝基因组重测序
取110份菠萝种质资源叶片的幼嫩部位，采用CTAB法提取总DNA，利用琼脂糖电泳检测DNA的完整性，Nanodrop检测DNA的纯度以及Qubit对DNA浓度进行精确定量。将DNA样本送至联川生物进行基因组重测序。
2、SNP的检测
将获得的reads测序数据通过BWA软件(Li H et al.,2009)比对到菠萝参考基因组(http://plants.ensembl.org/Ananas_comosus/Info/Index)上，利用Picard标记重复序列，并用GATK软件对重复序列进行重新比对和碱基质量的校正，获得SNP位点。
3、Perfect SNP的筛选
筛选标准如下：①最小等位基因频率(MAF)>0.4；②缺失率<0.2；③杂合率<0.2；④在SNP位点左右各100bp的范围内无其他突变。通过过滤最终获得30953个perfect SNPs。
4、引物设计和合成
根据perfect SNPs的序列，利用NCBI-Primer3设计3条标记的特异引物。其中通用引物为标记位点的特异引物，命名为引物C，另外两条为SNP位点的特异引物，分别命名为引物X和引物Y。在X引物的5’添加FAM荧光通用引物的接头(其序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)，在Y引物的5’添加HEX荧光通用引物的接头(序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)。所用引物送于上海生工合成。
5、核心引物的筛选
以23份菠萝种质资源为实验材料，进行引物的筛选，SNP分型试剂PARMS购买自武汉景泰生物。PCR扩增反应体系如下：
表2PCR反应体系
| 成分 | 体积 |
| 2×PARMS | 3ul |
| 引物X | 0.1ul |
| 引物Y | 0.15ul |
| 引物C | 0.15ul |
| DNA模板 | 1ul |
| 双蒸水 | 1.5ul |
PCR反应在ABI QuantStudio6 QS6仪器上进行，并在仪器上进行基因分型分型，反应程序如表3所示。
表3PCR热循环程序
| 步骤 | 温度 | 时长 |
| 1 | 94℃ | 15min |
| 2 | 94℃ | 20s |
| 3 | 65℃(每个循环降低0.7℃) | 1min |
| 4 | 回到第2步，10个循环 | |
| 5 | 94℃ | 20s |
| 6 | 57℃ | 1min |
| 7 | 回到第6步，35个循环 | |
| 8 | 37℃ | 1min |
根据引物3'端最后一个碱基的差异及荧光信号值，区分并扩增特定等位基因的DNA片段，检测待测位点的荧光信号值，从而进行基因分型。筛选出可以将23份种质进行分型的引物，共获得60组可用的SNP引物。根据最小等位基因频率值筛选前44组SNP引物作为核心引物，如表4所示。
表4菠萝SNP位点及引物
实施例2
SNP分子标记在菠萝遗传多样性分析中的应用
利用实施例1中44组SNP引物对现有已知现有的179份菠萝种质资源进行基因分型，根据SNP标记的二态性特点，将分型数据转化为二元编码数据，将与参考基因组一致的记为(1,0)，突变体记为(0,1)，杂合基因型记为(1,1)缺失碱基位点记为(999,999)。根据基因分型的结果，计算出各个标记的等位基因频率，利用Power Marker计算引物的最小等位基因频率(MAF)、遗传多样性(Gene Diversity)、杂合率(Heterozygosity)和多态性信息含量(PIC)。结果如表5所示。
表5 44组SNP引物对179份菠萝种质的遗传多样性分析
实施例3
SNP分子标记在菠萝种质资源分类中的应用
提取实施例2中179份菠萝种质的基因组DNA，利用实施例1中的44组SNP引物，分析179份菠萝种质资源的遗传多样性，根据分型数据，统计每个样品两两之间的SNP的相似程度，构建一个距离矩阵，利用利用R程序包poppr(Kamvar ZN,Tabima JF,GrünwaldNJ.2014.Poppr:an R package for genetic analysis ofpopulations with clonal,partially clonal,and/or sexual reproduction.PeerJ 2:e281 https://doi.org/10.7717/peerj.281)进行进化树的构建，利用联川生物平台进行PcoA分析。进化树结果表明，种质间SNP标记的相似度越高，分支离的越近，反之越远(图1)；PcoA结果表明，种质间SNP标记相似度越高，种质靠的越近，反之越远(图2)。
实施例4
SNP分子标记在菠萝品种鉴定中的应用
随机选取6份(w9-w12,w14-w15)已知的种质和8份(w1-w8)未知的种质构建虚拟混合群体，提取叶片总DNA。利用核心SNP分子标记对人工构建的虚拟混合群体和目标种质(p1-p4,p6-p7)进行基因分析比较分析。聚类分析结果显示，p2、p3、w10和w11，p4和w12，p6和w14的相似系数均为100，其相似度大于90％，表明待鉴定的种质真实来源于目标种质(图3)。
上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种菠萝种质资源鉴定的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括以下SNP位点：
2.一种扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组的引物序列分别如SEQ ID NO.1-132所示。
3.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物组在菠萝种质资源基因分型中的应用，其特征在于，对所述SNP分子标记的引物序列进行荧光标记后，进行PCR扩增，检测待测位点的荧光信号值进行基因分型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对所述菠萝SNP分子标记的两条特异性引物5’端分别标记不同的荧光序列。
5.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物组在菠萝种质资源分类中的应用，其特征在于，包括：利用所述SNP分子标记的引物序列对菠萝种质进行基因分型，通过构建距离矩阵，构建进化树，和/或进行群体PCoA的分析。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，根据进化树结果，若菠萝种质间SNP位点标记的相似度越高，分支离的越近，反之越远；根据PcoA结果，若菠萝种质间SNP标记相似度越高，种质靠的越近，反之越远。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用R程序包poppr进行进化树的构建，利用联川生物平台进行PcoA分析。
8.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物组在菠萝种质资源鉴定中的应用，其特征在于，包括：利用所述SNP分子标记的引物序列对菠萝种质进行基因分型，将待鉴定的种质基因型与目标种质基因型进行比较分析，当其相似度达到90％以上，表明待鉴定的种质真实来源于目标种质。
9.一种菠萝种质资源鉴定的试剂、试剂盒或芯片，其特征在于，所述试剂、试剂盒或芯片包括权利要求2所述的引物序列。
10.根据权利要求9所述的菠萝种质资源鉴定的试剂、试剂盒或芯片，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括分型试剂，和/或DNA提取试剂。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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