CN102409086A - 一种玉米综合抗病性鉴定有效ssr标记的开发方法 - Google Patents
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Abstract
一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法,属于分子生物学领域,完成的步骤是对大量玉米种质进行三大病害抗病性调查;对供试材料进行SSR标记分析;综合抗病性鉴定有效SSR标记的筛选。本发明方法具有耗时短,成本低,得到的结果准确等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种农作物抗病性鉴定标记的开发方法。
背景技术
长期以来,玉米病害以其种类多、分布广、危害重等特点,已成为限制玉米产量的主要因素之一,常年损失为6-10%,大发生时达30%~40%,且严重降低了玉米品质。近年来,由于单交种的大面积推广种植,生态环境的改变、农业生产条件的改善和国际间材料交流的日益频繁,使得玉米病害的发生趋势呈两种:一度曾被控制的病害再度爆发流行,病害种类增加;一些次要病害上升为主要病害。其中,由真菌引起的病害,如玉米丝黑穗病、大小斑病、茎腐病、纹枯病、弯孢菌叶斑病、锈病等真菌性病害,在玉米病害中更是占有举足轻重的地位。
发掘玉米种质的抗病基因及其紧密连锁的分子标记,是抗病分子标记辅助育种的前提和必要过程。近10年来,随着分子生物学突飞猛进的发展,分子标记拓展出许多可以检测DNA多态性的新方法。在各种基于DNA变异的分子标记中,SSR技术以孟德尔方式遗传,为共显性标记,高多态性,杂合度高,分布广泛而均匀,灵敏度好,退火温度高,特异性强等优点,在玉米育种中得到了更为广泛的应用。SSR标记的发展应用,使玉米抗病育种进入分子育种水平,不仅可以定位多个目标性状,而且缩短育种年限,降低育种成本。可见,加强玉米抗病分子遗传学基础研究,把现代分子生物学技术与常规育种紧密结合,开展分子育种将对加速培育抗病虫品种,防止病虫危害,提高玉米产量等具有重要意义。
当前的玉米抗病性鉴定主要是通过大田种植,人工调查的方法获得抗病种质,该方法耗时长,病害种类鉴定单一,人为影响因素大,且需要一定数量的土地种植材料,成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法,从而克服现有玉米抗病性鉴定的不足。
玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法,包括如下步骤:
(1)对大量玉米种质进行三大病害抗病性调查;
(2)对供试材料进行SSR标记分析;
(3)综合抗病性鉴定有效SSR标记的筛选。
本发明方法具有耗时短,成本低,得到的结果准确等优点。
具体实施方式
(1)在试验基地种植我国常用玉米自交系,其多为育种中常用的杂交种亲本,包括常用杂种优势群和具代表性的自交系类群。采用单粒点播,两行区,行长5.0m,行距0.6m,每行15株,Mo17、黄早四分别是玉米丝黑穗病的抗感对照,齐319、掖478分别是玉米茎腐病的抗感对照。
采用人工接种方法,大斑病菌株于7月中旬(12叶期)采用喷雾法进行第一次接种,接种后覆盖塑料膜保湿36小时,以保证发病条件,10日后进行第二次接种。丝黑穗病病菌于在种植前进行病菌拌土接种。茎腐病菌株(禾谷镰刀菌)采用土壤埋入法接种,在玉米抽雄一周后进行茎腐菌根埋,并适当浇水,保证足够的土壤含水量和病菌量,以满足该病菌发病条件。
(2)玉米进入乳熟期开始进行调查,按照王晓鸣等人编著的《玉米病虫害手册》专业性鉴定标准对三大病害进行田间调查,根据症状划分单株病级数,根据单株病级数计算病株率和病情指数。抗性评价标准采用国家玉米品种抗病鉴定标准。
(3)收集整理前人围绕这三大病害开展的基因定位研究结果,收集SSR引物用于玉米三大病害抗性鉴定的有效标记筛选。
(4)基于扩增带型清晰、稳定、易读性强且等位基因数≤3的原则,筛选有效标记。
(5)采用NTSYS软件对筛选出抗病鉴定有效标记数据进行主成分分析(PCO,Principle coordinate analysis),验证标记的有效性。
实例
一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法,包括如下步骤:
(1)2010年5月上旬,在吉林省农科院公主岭试验基地种植我国常用玉米自交系,共69份,其多为育种中常用的杂交种亲本,包括常用杂种优势群和具代表性的自交系类群。采用单粒点播,两行区,行长5.0m,行距0.6m,每行15株。
采用人工接种方法,大斑病菌株(未区分生理小种)由吉林省农科院植保所提供,于2010年5月自己繁殖,于7月中旬(12叶期)采用喷雾法进行第一次接种,接种后覆盖塑料膜保湿36小时,以保证发病条件,10日后进行第二次接种。丝黑穗病病菌于2009年收集,在种植前进行病菌拌土接种。茎腐病菌株(禾谷镰刀菌)由吉林省农科院植保所提供,并于2010年5月自己繁殖,接种方法采用土壤埋入法,在玉米抽雄一周后进行茎腐菌根埋,并适当浇水,保证足够的土壤含水量和病菌量,以满足该病菌发病条件。
(2)玉米进入乳熟期开始进行调查,按照王晓鸣等人编著的《玉米病虫害手册》专业性鉴定标准对三大病害进行田间调查,根据症状划分单株病级数,根据单株病级数计算病株率和病情指数。抗性评价标准采用国家玉米品种抗病鉴定标准(王晓鸣等,2002)。病级分级采用5级制:1级高抗(HR);3级抗(R);5级中抗(MR);7级感(S);9级高感(HS)。
病株率(Disease incidence)计算公式:
病株率=(病株/调查总株数)×100%;
病情指数(Disease Index)计算公式:
病情指数=(各级病株数×相应级数之和/调查株数×9)×100%。
(3)收集整理前人围绕这三大病害开展的基因定位研究结果,发现抗病位点主要集中在玉米第2、6、7、8、10条染色体上,选取其中引物用于玉米三大病害抗性鉴定的有效标记筛选。
(4)本研究利用所选取的引物,针对玉米大斑病、丝黑穗病和茎腐病三大病害,进行抗性鉴定有效标记的筛选。
前人研究结果表明,大斑病抗病基因Ht1、Ht2、Ht3、HtN属于单显性抗病基因,丝黑穗病主要受主效QTLqHSR1控制,茎腐病主要受Rfg1和Rpi1基因的控制。鉴于上述原因,本研究基于扩增带型清晰、稳定、易读性强且等位基因数≤3的原则,从引物中筛选出可作为检测玉米大斑病的有效标记umc2212、umc1316、umc1327,丝黑穗病有效标记SSR148152,茎腐病有效标记SSR58。
(5)采用NTSYS软件对筛选出的5个抗病鉴定有效标记数据进行主成分分析,结果表明,抗病自交系和感病自交系分化较明显,在PCO图上虽有部分重叠,没有形成两个相对独立的群,但大部分抗病自交系形成一个B群,部分感病自交系聚类成A群,部分兼有抗病表现和感病表现的自交系重叠在一起。
通过筛选获得的5对有效标记(umc2212、umc1316、umc1327、SSR148152、SSR58)进行聚类分析,结果显示可将这些自交系分为2大类群,第一个类群主要由综合表现抗病的自交系组成,第二个类群主要由综合表现感病的自交系组成。类群I由43份综合抗病自交系和8份综合感病自交系组成,其中43份综合抗病自交系中表现高抗性的有13份;类群II包括7份综合抗病和11份综合感病自交系,其中7份表现综合抗性的自交系为:齐319、H99、四287、武314、B73、综31、丹598。利用5对抗病SSR标记数据对69份自交系综合抗感情况进行验证,大体上可以将抗病和感病自交系区分。因此,筛选出的5对分子标记可作为抗病鉴定有效SSR标记,进而为已有抗病种质的筛选提供技术支撑。
Claims (1)
1.一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法,其特征是采用如下步骤完成:
(1)对大量玉米种质进行三大病害抗病性调查;
(2)对供试材料进行SSR标记分析;
(3)综合抗病性鉴定有效SSR标记的筛选。
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