CN102586241A

CN102586241A - 高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN102586241A
Application number: CN2012100511811A
Authority: CN
Inventors: 王刚; 樊向瑜; 王树; 詹红蕊; 孙鑫; 王桂凤; 王飞; 宋任涛; 许政暟
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-03-01
Filing date: 2012-03-01
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明涉及一种高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记及其应用。该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一种共显性分子标记6837D，所述的特异性引物的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：CCACGGAAGCCCGGGTCAGT；反向引物从5′端至3′端为：GCGTCCACCTCGATCGGGG。利用这个与o7基因完全连锁的分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中o7基因的存在与否以及杂合或纯合状态。同时，利用这个分子标记能区分突变体与539种国内主要育种亲本，能够在任何育种背景群体中准确检测到o7基因的存在，且错选率为0。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用o7基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

Description

高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记及其应用。

技术背景

玉米（Zea mays L.）是世界上也是我国主要的粮食和饲料作物，从1995年开始，我国玉米的总产量已经超过小麦，成为仅次于水稻的第二大粮食作物。据FAO统计，从1998年开始，玉米的总产量已超过小麦和水稻成为全球第一大粮食作物。作为食品、饲料和燃料的重要来源，玉米的全球需求和消耗正在急剧增加。预计到2017年，全球玉米和小麦的年产量需要再增加2亿吨才能满足全世界的需求。为应对世界粮食危机，保证我国的粮食安全，国务院提出了到2020年再增产粮食1000亿斤的战略目标，其中需要新增玉米400亿斤。随着我国以及世界上一些其它新兴国家饮食结构的调整，对动物产品的需求大幅度增加。作为“饲料之王”的玉米对畜牧业和养殖业的发展具有举足轻重的作用，这就对玉米的营养成份的改良提出了更高的要求。

玉米籽粒主要成份为淀粉、蛋白质和油脂，其中对营养成份起决定作用的是蛋白质。玉米籽粒的蛋白含量主要是由玉米的储藏蛋白控制的，玉米最主要的储藏蛋白是醇溶蛋白，约占蛋白总量的60％左右，它是一类在种子发育过程中特异表达的蛋白，主要起贮存自由氨基酸的作用。醇溶蛋白又可以进一步分为四类，分别是α、β、γ和δ醇溶蛋白。其中最大的一类是α醇溶蛋白，α醇溶蛋白基因家族根据所编码蛋白的分子大小，又分为22-kDa醇溶蛋白和19-kDa醇溶蛋白两个部分。α醇溶蛋白约占醇溶蛋白的80％以上，是决定种子蛋白含量重要因素。虽然醇溶蛋白富含脯氨酸和谷氨酸，但缺乏必需氨基酸尤其是色氨酸和赖氨酸，这些含量丰富的醇溶蛋白包含的氨基酸成分十分不均衡，造成以玉米为食物来源的人类和动物的营养缺乏。人类必需的8种氨基酸中，以赖氨酸影响最大，但在普通玉米中缺乏也最多。高赖氨酸玉米与普通玉米最本质的区别是胚乳中各种蛋白质组成及蛋白质氨基酸组成的差异。高赖氨酸玉米营养价值提高的原因是其醇溶蛋白含量由普通玉米的55.1％下降至22.9％；而谷蛋白、白蛋白、球蛋白含量提高，其中谷蛋白由普通玉米的31.8％上升至50.1％。由此表明，玉米种子中储藏蛋白的相对表达量显著地影响着玉米作为动物饲料的营养价值，因此对蛋白质含量以及成分的改变是改造玉米籽粒的关键途径。

玉米在品质性状的改造上有赖于一些籽粒的突变体。在玉米中有一类与蛋白品质相关的突变体，被称为高赖氨酸突变体。这类突变体一般具有不透明或粉质的籽粒，在玉米遗传上被称为Opaque或Floury突变体。这类突变体能够显著改善玉米籽粒中赖氨酸等必需氨基酸的含量，从而显著提高玉米在蛋白水平的营养品质。其中最为有名的是Opaque2突变体（O2），O2已经被广泛应用在高赖氨酸玉米的育种实践中。o7是另一种能显著提高玉米籽粒赖氨酸含量的重要突变，已有研究表明，在蛋白水平上， o7突变体与其相应的野生型相比，胚乳中总蛋白的含量较野生型相比降低了20.7％，醇溶蛋白和非醇溶蛋白分别降低了33.4％和15.1％；与醇溶蛋白的降低相对应，在氨基酸水平上，o7突变体与其相应的野生型相比，赖氨酸(lys)含量升高了38.2％。如能将O7突变体引入生产品种，则能进一步提高籽粒的赖氨酸(lys)含量，培育出高赖氨酸(lys)含量的优质蛋白玉米新品种。因此，O7突变体可以改善玉米籽粒的蛋白品质，对培育品质更高的玉米有很好的应用价值。

O7基因虽然已经被克隆，但是O7基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为O7由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。DNA分子标记辅助育种是一项新的育种技术，该技术是通过利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在早期进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。

DNA分子标记辅助育种技术的关键是：（1）获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本（纯合O7类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）的共显性标记；（2）获得的共显性分子标记与控制目标性状基因的连锁情况，连锁越紧密在其后代中错选的概率越低，如果该标记来源于控制目标性状基因，则利用该分子标记在其后代中错选的概率为零；（3）该标记可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。以往研究中并没有获得位于O7基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记，故无法对该基因所控制的目标性状进行DNA分子标记辅助选择，同时，以往也为获得能够区分突变体与国内所有主要育种亲本的分析标记。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对控制玉米籽粒高赖氨酸含量农艺性状的O7基因进行DNA分子标记辅助育种的基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记。

本发明的目的之二在于提供该分子标记的用途。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记，其特征在于该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一种共显性分子标记6837D，所述的特异性引物的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：CCACGGAAGCCCGGGTCAGT；

反向引物从5′端至3′端为：GCGTCCACCTCGATCGGGG。

一种上述的高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。

本发明利用高赖氨酸玉米（O7/O7）与其他具优良性状的玉米杂交获得F1代，F1代自交后筛选具有目的性状的高赖氨酸玉米F2，F2代多次自交，最终获得稳定的纯合体。

本发明提供1个位于O7基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记，以及利用这个共显性DNA分子标记对O7基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中o7基因的存在与否以及杂合或纯合状态。利用这个分子标记能区分突变体与国内539种主要育种亲本，能够在任何育种背景群体中准确检测到o7基因的存在。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用o7基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

附图说明

图1 o7/o7和野生型籽粒中醇溶蛋白、非醇溶蛋白和总蛋白的含量变化图；

图2 o7/o7和野生型籽粒中总的赖氨酸含量变化图；

图3为玉米籽粒纯合突变体外形图（o7/o7）；

图4是玉米籽粒野生型（+/+）

图5是用于进行O7基因克隆的BC群体构建路线；

图6标记6837D在BC群体中的分离情况，其中1、2和4为o7/o7纯合体； 3、5、6和7为O7/+杂合体；H2O为负对照,o7/o7为纯和突变体，+/+为纯和野生型；

图7是本发明中分子标记在玉米十号染色体长臂上的示意位置，其中CEN10代表第十号染色体着丝粒，TEL代表端粒；

图8是标记6837D在539种国内不同育种自交系间的多态情况；-为H2O是负对照、+为+/+是野生型对照，CK为o7/o7是突变体对照。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编， Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：利用o7突变体（o7/o7）培育高赖氨酸玉米

由于o7突变体与其相应的野生型相比，胚乳中总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量分别降低了20.7％、33.4％和15.1％，参见图1，赖氨酸(lys)含量升高了38.2％，参见图2，因此利用该基因与其他优良品种的杂交可以培育出高赖氨酸玉米。把o7突变纯合体（o7/o7）与其他具有优良生产性状的玉米杂交，然后F1代自交，在F2代中分离出高赖氨酸玉米籽粒的隐性纯合体。该隐性纯合体经多代自交，轮回选择，逐代选择籽粒发育好，赖氨酸含量高的种子，最终获得稳定的隐性纯合体，高赖氨酸自交系或群体，即获得高赖氨酸商品玉米。

实施例二：共显性分子标记的获得及与O7基因连锁关系的确定

图3和图4为玉米籽粒野生型（+/+）与玉米籽粒纯合突变体（O7/O7）外形图。通过纯合突变体（O7/O7）与纯合野生型（+/+）杂交获得F1（O7/+），然后以F1为母本，纯合突变体为父本进行回交构建回交（BC）群体，参见图5。 BC群体中出现了基因型分离，包含O7/+与O7/O7两种基因型，参见图6，具有O7/+基因型的与+/+基因型的籽粒均为非Opaque的野生型类型籽粒，具有O7/O7基因型的籽粒为Opaque的突变体类型。

本发明通过经典的遗传定位获知O7基因定位在玉米第10号染色体的长臂上(Bin10.07)。通过在O7位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的回交群体（BC），提取纯合突变体、野生型以及BC群体各单株的基因组DNA，利用图位克隆的方法克隆了该基因，获得了该基因的DNA序列。经过序列分析表明，该基因在基因组上与野生型相比缺失了12个碱基。转基因功能互补表明，该基因即为O7基因。本研究依据突变基因o7与野生型基因O7的差别序列设计特异性引物，通过扩增特异性引物，共显性分子标记6837D。所述的特异性引物为：

正向引物从5′端至3′端为：CCACGGAAGCCCGGGTCAGT；

反向引物从5′端至3′端为：GCGTCCACCTCGATCGGGG；

所得到共显性分子标记6837D能够区分育种过程中杂交亲本（纯合o7类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）的。

由于该标记位于O7基因上，故该分子标记与该基因完全连锁，参见图7。使用这个分子标记进行辅助选择准确度很高，在任何背景下，标记6837D与O7基因的交换率为0，使用这个标记确定O7基因的错选率为0。

实施例三：分子标记在不同亲本间的多态性鉴定

提取o7/o7突变体纯和，野生型纯和和B73、Mo17、W22、W64A、BSSS53等539种育种中广泛使用的自交系的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记6837D对o7与B73、Mo17、W22、W64A、BSSS53等539中育种亲本DNA进行PCR扩增和凝胶电泳分析表明，6837D在o7与B73、Mo17、W22、W64A、BSSS53等539中育种亲本都具有多态性，参见图8。此结果证明，分子标记6837D能够在任何育种背景群体中准确检测到o7基因的存在，可用于与这些育种材料培育高赖氨酸玉米时o7基因的辅助选择且错选率为0。

序列表

<110> 上海大学

<120> 高赖氨酸玉米基因Opaque7的分子标记及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCACG GAAGC CCGGG TCAGT 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GCGTC CACCT CGATC GGGG 19

Claims

1.一种高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记，其特征在于该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一种共显性分子标记6837D，所述的特异性引物的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：CCACGGAAGCCCGGGTCAGT；

反向引物从5′端至3′端为：GCGTCCACCTCGATCGGGG。

2.一种根据权利要求1所述的高赖氨酸玉米Opaque7基因的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。