CN105907876B - 用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组及其应用。该特异性引物组中扩增该opaque10基因左侧DNA片段的一对特异性引物SSR401的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：TCACGCCACTTCCCTCATC；反向引物从5′端至3′端为：GCACCACCAGCGGTCAAT；扩增该opaque10基因右侧DNA片段的一对特异性引物SSR456的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：TAGACGTAAGTTGTTTAAGG；反向引物从5′端至3′端为：GTCGCTTGACCTGATTAC。利用这两对特异性引物组能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中opaque10基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用opaque10基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

Description

用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组及其应用。

技术背景

玉米（zea mays）是世界上也是我国主要的粮食作物和饲料作物，学名为zea maysL ,英文名maize或corn. 中文名称较多，旧称玉蜀黍，苞谷等，现通称玉米。玉米是一年生草本植物，起源于墨西哥或中美洲地区。1492年哥伦布在古巴发现玉米，随后被带回西班牙，逐渐传至世界各地，并成为优势作物。作为食品、饲料和燃料的重要来源，玉米是我国今后一个时期消费需求增长最快的农作物, 主要来自两个方面：一是畜牧业快速发展，增加了对玉米的需求。国际经验表明，进入工业化和城镇化中期以后，人们的膳食结构会发生明显变化，肉蛋奶消费显著增加。美国1965—2000年间玉米饲料消费量年均增长1.6%，日本为4.1%。我国也进入这个阶段，玉米饲料消费增加加快。2010年全国肉类、禽蛋、牛奶、水产品产量分别比2003年增长23%、18.5%、105%、31.8%。同期，饲料用粮消耗玉米，由1800亿斤增加到2400亿斤，增长33%。畜牧业养殖方式的转变也增加了饲料用粮，随着畜禽规模化养殖快速发展，由过去一家一户以青饲料、米糠麦麸、剩菜剩饭喂猪，转变为使用工厂化饲料，对玉米的需求明显增加。二是深加工快速发展，增加了对玉米的需求。2000年以前，我国玉米深加工年消费不足200亿斤，占玉米消费比重不到10%。近年来玉米深加工业产能迅速扩展，未来在目前1800亿斤的基础上有可能进一步扩大。为应对世界粮食危机，保证国家粮食安全，我国提出了构建粮食核心区及到2020年再增产粮食1000亿斤的战略目标，其中需要新增玉米400亿斤(全国新增1000亿斤粮食生产能力规划2009-2020年, 2009, 国务院)。因此，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。

为了提高玉米品质和营养价值，从上个世纪开始，越来越多的国内外科研人员就开始利用生物学的方法对玉米的品质进行改造。优质蛋白玉米（Quality Protein MaizeQPM）便在这样的情况下产生了。其基本原理是：以玉米中一些籽粒的突变体为材料，借助于遗传学的研究手法对其进行改造，提高其营养价值。在玉米中，有一类与蛋白品质相关的突变体，被称为Opaque或Floury突变体。在表型上，这类突变体胚乳细胞内的主要储藏细胞器淀粉粒和蛋白体包装不紧密，造成籽粒胚乳结构疏松，比较容易粉碎，所以与野生型的透明籽粒相比容易消化，适口性好，更适合用于优质饲料的加工。生化方面，这类突变体能够显著提高玉米籽粒中赖氨酸等必需氨基酸的含量，进而提高玉米的营养价值。其中最为有名的是Opaque2（o2）突变体, 世界上许多国家利用opaque 2基因( o2) 改进玉米蛋白的研究和育种工作, 并取得了显著成绩。o 2基因是Mertz 等于1964 年首次发现的能够降低醇溶蛋白在胚乳蛋白中的比例、显著提高玉米籽粒胚乳蛋白中赖氨酸含量的隐性突变基因。o2突变基因通过抑制玉米醇溶蛋白合成和提高谷蛋白等富含赖氨酸蛋白质水平, 从而增加玉米胚乳中赖氨酸的量。

Opaque10（简称O10）也是一个类似的高营养粉质胚乳突变体。对o10突变体的遗传学分析表明：o10是单基因控制的隐性突变，能够引起玉米籽粒的不透明（Opaque）性状（参见图1）。对o10突变体的生化分析显示与野生型籽粒相比，o10突变体籽粒中主要生化成分如淀粉，油脂，醇溶蛋白，非醇溶蛋白的含量都没有明显的变化，但是一些重要的氨基酸的成分有显著的上升，如赖氨酸上升了10.70%，甘氨酸上升了10.23%，天冬氨酸上升了6.32%，精氨酸上升了9.05% (参见图2)。其中赖氨酸是人类一种必须氨基酸。该基因的优点在于在不改变产量的情况下，能显著提高玉米的品质。o10基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为o10由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。DNA分子标记辅助育种是一项新的育种技术，该技术是通过利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在早期进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。

DNA分子标记辅助育种技术的关键是：（1）获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本（纯合o10类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）的共显性引物组；（2）获得的共显性分子标记（即引物组）与控制目标性状基因的连锁情况，连锁越紧密在其后代中错选的概率越低，如果该标记来源于控制目标性状基因，则利用该分子标记在其后代中错选的概率为零；（3）该标记可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。以往研究中并没有获得位于o10基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记（即引物组），故无法对该基因所控制的目标性状进行DNA分子标记辅助选择，同时，以往也为获得能够区分突变体与国内所有主要育种亲本的分析标记。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对控制玉米籽粒高赖氨酸含量农艺性状的o10基因进行DNA分子标记辅助育种的基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测玉米o10基因的特异性引物组。

本发明的目的之二在于提供该特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本中的应用。

本发明的目的之三在于提供该特异性引物组在检测和区分野生型自交系w22、B73、BSSS53、昌7-2、W64A和郑58类型以及他们杂交子代类型中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该opaque10基因左侧DNA片段的一对特异性引物SSR401的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：TCACGCCACTTCCCTCATC；

反向引物从5′端至3′端为：GCACCACCAGCGGTCAAT；

扩增该opaque10基因右侧DNA片段的一对特异性引物SSR456的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：TAGACGTAAGTTGTTTAAGG；

反向引物从5′端至3′端为：GTCGCTTGACCTGATTAC。

一种根据权利要求1所述的用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组在在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。

一种根据权利要求1所述的用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组在检测和区分野生型自交系W22、B73、BSSS53、昌7-2、W64A和郑58类型以及他们杂交子代类型中的应用。

本发明提供的2个位于o10基因染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性DNA特异性引物组，以及利用这两个共显性DNA特异性引物组对o10基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这两个特异性引物组能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中o10基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用o10基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

附图说明

图1 是o10纯合突变体（o10/o10）和野生型籽粒(o10/＋或＋/＋)在灯箱上以及横切图；

图2 是o10纯合突变体籽粒与野生型相比氨基酸含量的变化图；

图3是用于O10基因克隆的F2群体构建路线；

图4是标记SSR401在W22背景F2群体中的分离情况，o10/o10为纯合突变体；o10/＋是杂合体；＋/＋为纯合野生型；

图5是标记SSR456在W22背景F2群体中的分离情况，o10/o10为纯合突变体；o10/＋是杂合体；＋/＋为纯合野生型；

图6是本发明中分子标记在玉米一号染色体长臂上的示意位置，其中CEN1代表一号染色体着丝粒，TEL代表端粒；

图7是标记SSR401在不同自交系间的多态情况；

图8是标记SSR456在不同自交系间的多态情况。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual, Melody S. Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：两个共显性分子标记的获得

本发明通过经典的遗传定位获知o10基因定位在玉米第1号染色体的长臂上。通过在o10位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的F2群体（参见图3），提取纯合突变体、野生型以及F2群体各单株的基因组DNA。通过筛选已有的SSR分子标记，获取有多态性的SSR类型分子标记（umc2074与umc1290），将o10基因定位于分子标记umc2074与umc1290之间。然而这两个标记和o10的连锁性并不十分紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此根据umc2074与umc1290之间已知的B73基因组序列（http://www.genome.arizona.edu/fpc/maize），设计引物。通过测序以及序列比对，获得纯合突变体与纯合野生型亲本间的序列差异，并通过所测序列开发标记，获得能够区分育种过程中杂交亲本（纯合o10类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）的共显性分子标记SSR401与SSR456。

扩增DNA片断SSR401的特异性引物及碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：TCACGCCACTTCCCTCATC；

反向引物从5′端至3′端为：GCACCACCAGCGGTCAAT；

扩增DNA片断SSR456的特异性引物及碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为： TAGACGTAAGTTGTTTAAGG；

反向引物从5′端至3′端为： GTCGCTTGACCTGATTAC。

实施例二：分子标记SSR401与SSR456与o10连锁关系的确定

分别抽提o10/o10与W22背景杂交后获得的F2群体中的籽粒的DNA用于分子标记SSR401与SSR456与o10连锁关系的分析，野生型表型的基因型包括(+/+ 和o10/+)，o10纯合突变体的基因型为o10/o10。以这些样本来分析分子标记SSR401与SSR456与o10基因的遗传连锁关系（参见图4和5）。分析结果表明，这两个标记与o10基因连锁，大群体分析表明，在W22背景的分离群体中，标记SSR401的交换率为1.0×10^-3，标记SSR456的交换率为1.2×10^-2。分子标记SSR401与SSR456与o10基因在染色体上的物理位置关系参见图6。

实施例三：分子标记在不同亲本间的多态性鉴定

提取o10和6种育种中广泛使用的自交系W22、W64A、B73、郑58、昌7-2和BSSS53的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记SSR401可以区别O10与 W22、W64A、B73、昌7-2和BSSS53SSR456自交系，分子标记SSR456可以区别O10与其余所有自交系（图7和图8）。此结果证明，分子标记SSR401和分子标记SSR456能够在W22、W64A、B73、昌7-2和BSSS53背景群体中准确检测到o10基因的存在，辅助选择时的错选率为1.2×10^-5，可以满足选择要求。

<110> 上海大学

<120> 用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> 单链DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TCACG CCACT TCCCT CATC 19

<210> 2

<211> 18

<212> 单链DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GCACC ACCAG CGGTC AAT 18

<210> 3

<211> 20

<212> 单链DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TAGAC GTAAG TTGTT TAAGG 20

<210> 4

<211> 18

<212> 单链DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GTCGC TTGAC CTGAT TAC 18

Claims (2)

1.一种用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该opaque10基因左侧DNA片段的一对特异性引物SSR401的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：TCACGCCACTTCCCTCATC；

反向引物从5′端至3′端为：GCACCACCAGCGGTCAAT；

扩增该opaque10基因右侧DNA片段的一对特异性引物SSR456的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：TAGACGTAAGTTGTTTAAGG；

反向引物从5′端至3′端为：GTCGCTTGACCTGATTAC。

2.一种根据权利要求1所述的用于检测玉米opaque10基因的特异性引物组在检测和区分野生型自交系W22、B73、BSSS53、昌7-2、W64A和郑58类型以及它 们杂交子代类型中的应用。