JPH0728733B2 - 外来タンパク質又はポリペプチドが葉緑体に存在する植物細胞の調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に組み換えベクター等の手段及び植物葉緑
体への外来遺伝子産物の制御された導入の方法に関する
ものである。

以下の開示には、右肩の数字で示す文献の参照番号が含
まれるそれらはこの説明の終りにある、関連文献に関す
る著者参照目録である。他の文献は、また、出版の最初
の著者名や期日による一連のこの叙述に関するものであ
る。特許出願、特許、その他のもの同様、本説明を通し
て関連するすべての文献は参照によりここに含まれてい
る。

真核生物細胞、さらにより特定な植物細胞は細胞内で特
殊な機能を行ない、特定の膜系で区切られている個々の
細胞内区画、もしくは器官を含んでいる。より高度な植
物の光合成をする葉の細胞において最も顕著な器官は、
葉緑体であり、これは細胞内で半自律的に存在し、自分
自身の遺伝子系およびタンパク質合成工場をもつが、発
明および生合成活性において核−細胞質系と密接な協同
関係に依存している。

葉緑体の最も基本的な機能は光合成の光反応の遂行であ
る。しかし、葉緑体は植物細胞にとって重要なその他の
多くの生合成過程を行う。例えば、全ての細胞の脂肪酸
は葉緑体ストロマ中に存在する酵素によって、そこで容
易に利用できるアデノシン三リン酸、ニコチンアミド二
リン酸の還元型および炭水化物を使用して作られる。さ
らに、光により活性化された電子による還元力は葉緑体
中において亜硝酸のアンモニアへの還元を引きおこす。
即ちこのアンモニアは植物にアミノ酸やヌクレオチドの
合成に必要な窒素を供給する。

また葉緑素は農芸化学産業に特に関係のある過程に参画
している。

特に多くの除草剤が葉緑体中で遂行される機能を阻害す
ることが知られている。最近の研究でいくつかの除草剤
の特異的なターゲットが同定されている。例えばトリア
ジンから誘導される除草剤は光合成系IIの32キロダルト
ンのポリペプチド中の結合部位をプラストキノンで置換
することによって光合成を阻害する。この32キロダルト
ンのポリペプチドは葉緑体遺伝子中にコードされてお
り、器官工場により合成される。トリアジン除草剤に耐
性のある変異体植物が得られている。これらの植物はプ
ラストキノンがトリアジン除草剤によって置換できない
変異した32キロダルトンのプロティンを含んでいる。

いくつかの他の除草剤はアミノ酸合成における特異的段
階を阻害することが知られている。スルホニル尿素はア
セト酪酸合成酵素を阻害することが知られている。この
酵素はイソロイシンおよびバリンの合成に関係してい
る。グリホセートは芳香族系アミノ酸の合成に関係して
いる酵素である５−エノールピルビル−３−ホスホシキ
メート合成酵素の機能を阻害する。これらの全ての酵素
は核遺伝子にコードされているが、実際のアミノ酸合成
が起こっている葉緑体中へ転移している。

同様な機能をつかさどる酵素は原核生物にも存在する。
関係する酵素が除草剤に対してもはや感受性をもたない
ような細菌の変異体を得るのは容易であるはずである。
そのような戦術はグリホセートに耐性な修正されたaro
A遺伝子産物を伴うサルモネラ・ティフィムリウム（Sal
monella typhimurium）を単離するのにうまく利用でき
た。（コマル（Comal）等、科学（Science）221巻370頁
（1983年）） このように植物細胞に除草剤耐性を付与するのに葉緑体
や細菌遺伝子を使用するのは、それらの遺伝子産物が機
能する葉緑体へと効率よく移行する場合には有効であろ
う。

葉緑体は、アミノ酸合成のレベルを制御する複雑な機構
にも参画している。もっとも重要な制御機構の一つはい
わゆるレトロ制御である。この機構は、ある与えられた
経路の重要な酵素を、その経路の最終産物によって阻害
することを含んでいる。ある重要な酵素がもはやレトロ
制御を受けなくなるとその生体は対応する最終産物（例
えばアミノ酸）を過剰生産する。

対応する最終産物による阻害に非感受性の酵素をコード
している変異遺伝子の単離は細菌中でうまく実証でき
る。植物細胞における同様な変異体は得られにくく、た
った数例が報告されているに過ぎない。さらに、植物細
胞からの遺伝子の単離は細菌の遺伝子の単離に比べたい
へん繁雑な仕事となる。

前に述べたように、多くのアミノ酸合成は葉緑体内で起
こっている。

このように、形質転換過程により植物葉緑体に上述の酵
素の導入して、上述の最終産物による阻害に非感受性の
酵素をコードする細菌遺伝子で植物細胞を形質転換する
技術の発展は非常に興味深い。この過程の最終的結果は
アミノ酸の過剰生産となるだろう。葉緑体中への既知の
外来ポリペプチドもしくはタンパク質の導入に適した実
際の技術が使えるようになり次第、専門家達の手となる
であろう植物遺伝子工学のかなり発展のきざしとなる数
例がある（その他の例は後に述べる） 直接のDNAの取り込み、純粋なDNAの微量注入およびウイ
ルスやプラスミドベクターの使用のような植物へのDNA
の転移に対する多くの技術が提唱されている。特別の効
率を示すプラスミドベクターは双子葉植物中のクラウン
−キャル（crown gall）病の試薬である微生物アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa
ciens）の腫瘍誘発（Ti）プラスミドから誘導されたも
のである。これらのプラスミドはそれらのＴ−DNAから
腫瘍起因遺伝子を除くことによって修正することができ
る。するとそのように修正したプラスミドはもはや正常
な植物の成長や分化を妨害せず、そして、上述のプラス
ミドの適当な部位に特定の外来遺伝子の挿入に際し、植
物細胞中での上述の特定の遺伝子によりコードされたタ
ンパク質の発現を開始するのに使用することができる。
特に、その外来遺伝子は、生のTiプラスミド中のＴ−DN
Aを取り囲む二つの境界配列の間もしくはその境界配列
の近くに挿入することができる。例として、次の文献を
参照されたい。カプラン（A.CAPLAN）等、題名“植物細
胞への遺伝子物質の導入”サイエンス（Science）、198
3年11月18日、222巻,815−821頁；ヘレラーエストレラ
（L.HERRERA−ESTRELLA）等、題名“Tiプラスミド由来
のベクターを使用して植物遺伝子へ転移されたキメラ遺
伝子の発現”ネイチャー（Nature）303巻,5914号,209−
213頁、1983年５月19日； ヘレラ−エストレラ（L.HERRERA−ESTRELLA）等、題名
“Ti−プラスミドベクターを使用して、ニコチアナ・タ
バカム（Nicotiana tabacum）へ導入したキメラ遺伝子
の光誘導性葉緑体依存の発現”ネイチャー（Nature）、
310巻、5973号,115−120頁,1984年７月12日； ヨーロッパ特許出願番号0 116 718（米国出願番号570,6
46）又は、PCTの下に公開された国際出願WO 84/02913; これら全ての文献又は特許出願は参考資料中に納められ
ている。

この課題に科せられたかなりの仕事と、特に植物細胞中
でのタンパク質の生産や葉緑体への転移に関する必要と
される莫大な知識量にかかわらず、葉緑体への形質転換
の効率的で比較的容易な方法はこれらすべての技術をし
ても今だに与えられていない。実際に、葉緑体に直接的
形質転換のためのベクターは現在のところ手に入ってい
ない。さらに上述の葉緑体を含む植物細胞中正常にコー
ドされ、最終的に上述の葉緑体から自然に単離できるも
のを含む成熟タンパク質は、もしも外から供給されたと
してもその状態では葉緑体内に浸入することはできな
い。

多くの葉緑体タンパク質は核DNA中にコードされてお
り、多くの可溶性高分子量前駆体のように細胞質リボゾ
ーム上のタンパク質合成産物である。^2-9 これらの前
駆体は、色素体外被膜の１つ又は両方を通して転位し、
プロセシングされ、それらの最終的な器官画分もしくは
ホロエンザイム会合体へと組み立てられる。試験管内で
の単離した葉緑体を使った再構成実験により、核でコー
ドされかつ細胞質で合成される百以上の前駆体の、葉緑
体によるとり込みとプロセシングがエネルギー依存
¹⁷で、翻訳後の機構^6,10-17により起こるということが
説明された。

これらの核でコードされた葉緑体タンパク質で最も広範
に特性づけられているのは、リブロース−1,5−ビスホ
スフェート（RnBP）カルボキシラーゼの小サブユニット
である。このポリペプチドは、約５〜6,000ダルトンの
アミノ末端延長、すなわちトランジットペプチドを含む
20,000ダルトンの前駆体として、遊離細胞質リボゾーム
上で合成される。^6-7,9前駆体が葉緑体へ導入する間か
もしくはその直後、そのトランジットペプチドは可溶性
タンパク分解酵素によって二段階で分解され、15,000ダ
ルトンの成熟した小さなサブユニットポリペプチドを生
ずる。その後このポリペプチドは外来の大きなサブユニ
ットと会合して機能性のRnBPカルボキシラーゼホロエン
ザイムに組み立てられる。^11,12 同様のことが葉緑素a/b結合タンパク質でも観察され
た。これらのポリペプチドは細胞質リボゾーム上で可溶
性前駆体として合成され（アペル（Apel）とクロプステ
ク（Kloppstech）,1978年；シュミット（Schmidt）等、
1981年）、そして翻訳後に葉緑体に転位する。転位中又
は後にNH₂末端トランジットペプチドはタンパク分解的
に分解され（シュミット（Schmidt）等、1981年）成熟
ポリペプチドになる。成熟したＡ及びＢポリペプチドは
葉緑素ａ及びｂと会合してチラコイド膜へ統合される。
翻訳後転移する葉緑体タンパク質のトランジットペプチ
ドは葉緑体外被とトランジットペプチドとの相互作用に
とって重要であると提唱されている塩基性アミノ酸の優
位性（preponderance）によって特性づけられる。種々
の植物種からの小サブユニット前駆体のトランジットペ
プチドを比較するとそのアミノ酸配列に変化があるがプ
ロリンと苛電アミノ酸残基の位置はかなり強く保存され
ており、大豆（ベリー・ロウ（Berry−Lowe）等、1982
年）やえんどう豆（キャッシュモア（Cashmore）、1983
年）、あおうきくさ（スティーケマ（Stiekema）等、19
83年）及び小麦（ブロブリー（Broglie）等、1983年）
にみられるように、前駆体の切断部位のまわりの領域に
実質的な相同性がある。

これらの共通した性質は、試験管中及び生体中、１つの
植物種からの小サブユニット前駆体が他の葉緑体に導入
でき、かつ正しくプロセシングされうるし、又その逆も
可能なので機能的に重視である。

いかに葉緑体へ翻訳後にポリペプチドが転移し、及びど
の信号がこの過程に関与しているかについての分子的基
礎、とりわけ、取り込みとプロセシング機構へのトラン
ジットペプチドと成熟タンパク質の相対的寄与はまだ十
分に理解されておらず、トランジットペプチドが成熟タ
ンパク質の転位に必要であるということがすでに仮定さ
れているのみである。これは、成熟した小サブユニット
タンパク質が葉緑体へ転位しないという観察と一致して
いる。

この発明は、植物細胞の核DNAによってコードされてい
る葉緑体−タンパク質前駆体の葉緑体膜を通しての転位
機構の研究の結果として出願人によってなされたいくつ
かの発見に基づいている。RnBPについてさらに研究を重
ねた結果、転位機構そのものには細胞質因子は必要ない
ようである。

さらに、成熟タンパク質もしくは、サブユニットの葉緑
体膜を通しての転位や移動に必要な情報は前駆体サブユ
ニット内、特にそれと通常結合している単一のトラッジ
ットペプチド内に存在するようであると分った。またト
ランジットペプチドは転位を仲介するだけでなく対応す
るタンパク質と部位特異的なプロセシングに必要な情報
を含んでいると考えられる。

これらのトランジットペプチドの種々の性質は、組み換
えDNA、特に特定のタンパク質もしくはポリペプチド、
特に葉緑体中に導入され、プロセシングされるような外
来タンパク質をコードするDNAを含む組み換えベクタ
ー、及び葉緑体、例えばチラコイド膜、好ましくはスト
ローマにその外来ポリペプチド又はタンパク質を導入す
る方法に基づく。

実際、これらの組み換えベクターの重要な要素はトラン
ジットペプチドをコードするDNA配列からなる、ここで
添付した説明及び特許請求の範囲を通して用いられてい
るように、このトランジットペプチドという表現は、い
ずれかの葉緑体タンパク質前駆体に含まれるアミノ酸配
列を示し、特にRnBPの場合のように葉緑体中でタンパク
質の最終的成熟タンパク質のプロセシングが起こる場合
には、このアミノ酸配列は前駆体の導入に際し、葉緑体
への前駆体の導入の間又はその直後にタンパク質分解的
に除かれ対応する機能性成熟タンパク質又はサブユニッ
トを形成すると理解できる。そのような最終的プロセシ
ングは、例えば上述のサブユニットを他の内生のサブユ
ニットと組合わせて最終的な機能性タンパク質を作り上
げることを含む。

植物細胞に導入可能な本発明の組み換えDNAは、互いに
結合された第１の核酸と第２の核酸とを含むキメラ遺伝
子の存在により特性づけられる。上述の第１の核酸と第
２の核酸は由来が異なり、特に互いに外来のもので、第
１の核酸は上述の植物細胞の葉緑体中へ転移され、プロ
セシングされうる葉緑体タンパク質の少なくともＮ−末
端サブユニットを含む一つの前駆体に属するトランジッ
トペプチドをコードする天然の遺伝子配列と相同的な基
本的配列をもち、第２の核酸は上述の葉緑体タンパク質
又は葉緑体タンパク質サブユニットをコードする遺伝子
配列と異なる第２のコード配列を含み、上述の第２の核
酸は各々第１と第２の配列の転写の方向からみると第１
の核酸の下流に位置する。

葉緑体中にタンパク質を転移するための手段や方法を与
えるという課題を達成するための発明者の共同研究にお
いて、発明者たちはトランジットペプチドをコードする
配列を含む全てのDNA組み換え体を共通に使用する二つ
の主な方法を工夫した。これらの二つの方法の具体例に
ついては、後述するが、その結果有効であることが示さ
れた。

例Ｉはその第１の方法を説明しているが、これは、前駆
体の切断部位のまわりの高い相同性をもつ全領域を含
む、より大きい核遺伝子の部分が、タンパク質、特に葉
緑体に対する外来タンパク質のような、タンパク質の転
移とプロセシングに必要であるという可能性を示してい
る。これはこの発明の好ましい組み換えDNAの第１シリ
ーズを与え、これは特に上述のような第１の核酸が、上
述の葉緑体タンパク質のＮ端末細胞質サブユニットをコ
ードする核酸の少なくとも一部に対応する第３の配列
を、その第１の配列の下流に含むこと及び、上述の第３
の配列の一端が実質的に上述の第１の核酸の一端と直接
つながっていることによって特性づけられる。

むしろ、第３の配列は上述の葉緑体タンパク質の細胞質
サブユニットのＣ末端領域をコードするヌクレオチドを
越えて伸びてなく、さらにイントロン、特に対応する天
然の葉緑体タンパク質の前駆体サブユニットを最終的に
与えるペプチド領域をコードするエクソンと同様の遺伝
子にもともと属するイントロンを含むことが好ましい。

上述の第１の方法に従ったDNA組み換え体の好ましい具
体例としては、トランジットペプチドをコードする第１
の配列と、初めに同一の遺伝子に属し、かつピシウム・
サチバム（Pisium sativum）（キャッシュモア（Cashmo
re）、1983年）由来の小サブユニット遺伝子（rbc S）
の最初の22ケのアミノ酸をコードする第３の配列とを含
む。この第３の配列は、ついでネオマイシン・ホスホト
ランスフェラーゼIIをコードするnpt II遺伝子（トラン
スポゾンTn5由来のnPt（II）遺伝子）のような外来タン
パク質のコード領域と融合される。

例IIは解決すべき同一の課題に対する第２の方法をとる
際の、なし得る組み立てを説明している。この組み立て
では、npt IIコード配列をトランジットペプチドのコー
ド配列と直接融合し、その結果、潜在的な切断部位はト
ランジットペプチドの最終のアミノ酸に続くメチオニン
以外に成熟小サブユニットタンパク質由来のいかなるア
ミノ酸も含まない。より一般的には、また好ましくは、
第２の配列の最初のコドン（タンパク質、特に葉緑体へ
の転位を求められる外来タンパク質をコードする）が上
述のトランジットペプチドをコードしている上述の第１
のDNA配列の最終のコドンに直接隣りあっていることが
望ましい。このように上述の第２の配列が上述の第１の
配列によってコードされるトランジットペプチドとうま
く会合している葉緑体タンパク質とは異なるポリペプチ
ド又はタンパク質をコードするときには特に、上述のキ
メラ遺伝子中の上述の第１の配列の隣りのヌクレオチド
配列は正常な葉緑体タンパク質のＮ末端部分をコードす
るヌクレオチド配列と相同的な配列は一般に含まないで
あろう。また、第１の配列の最後のコドン及び第２の配
列の最初のコドンはいくつかのヌクレオチド三量体によ
り、好ましくはいかなるイントロンも終止コドンも含ま
ない形で分離しているかもしれない。例えば、対応する
天然の前駆体に関係するトランジットペプチドとうまく
会合している成熟タンパク質の最初のアミノ酸をコード
する“第３の配列”（特に上述のトランジットペプチド
をコードする第１の配列を含むエクソンによってコード
されているもの）は上述の第１と第２の配列の間に存在
しうる。この“第３の配列”は大豆、えんどう、あおつ
きくさ及び小麦由来の葉緑体タンパク質の細胞質前駆体
−サブユニットのＮ末端領域が共通にもつ高い相同性領
域を含むかもしれない。例えば、そのような“第３の配
列”（第１の方法から生じた組み立て中のそれ、又はこ
こで考えられた第２の方法”からのもの）は５量体ペプ
チド配列Ｍ−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｐをコードしている。これら
の文字は天然のアミド酸の標準的１文字略記法に対応し
ている。明らかに他のヌクレオチド配列の“第３の配
列”はコードされているアミノ酸配列が、後に形成さ
れ、葉緑体に転位させられるハイブリッドタンパク質の
生物学的性質に重大な修正を加えない程度に、上に定義
した第２の配列の上流及び／又は下流に企図してもよい
このタイプの最良の組み立てにおいては、第２の配列が
上で述べたように引き続く第１の配列に直接、もしく
は、融合を遂げるのが可能なように合成ヌクレオチドリ
ンカー、によってコードした短かいポリペプチド配列で
分離した形で位相を保存するように融合しているのが好
ましい。例IIで示しているように、そのような組み立て
は、例えば、葉緑体タンパク質又は前駆体により処理さ
れるいかなる特定のペプチド配列とハイブリダイズしな
い細菌のタンパク質又はタンパク質断片又は合成ポリペ
プチド等の、制御されたアミノ酸配列のタンパク質又は
タンパク質断片の葉緑体への転位をも保証することがで
きる。以前の定義によると“トランジットペプチド”
は、ここで示されてきた広い意味をもつことを理解しな
くてはならない。さらにトランジットペプチドは、以前
に述べた通り、トランジットペプチド又は、トランジッ
トペプチドを含むより小さなサブユニット前駆体がしば
しば植物特異的でないにもかかわらず、形質転換される
べく植物種に依存して選択されうる。１つの植物種から
のサブユニット前駆体はしばしばその他の葉緑体により
導入され直接プロセシングされる。

この発明におけるDNA組み換え体中に使用されるトラン
ジットペプチドをコードするDNA配列は大豆の細胞もし
くは小麦又はえんどうの細胞のRnBPの小サブユニットと
会合するトランジットペプチドをコードするもののいず
れかであることが好ましい。

トランジットペプチドをコードする好ましい“第１のヌ
クレオチド配列”は後に例の形で定義づけられている。
ヌクレオチド配列を示す行の上の文字は連続するヌクレ
オチド配列の三文字によりコードされる連続するアミノ
酸配列を示していることを理解しなくてはならない。上
述の行の下の文字は、ヌクレオチド配列中で、その文字
のすぐ上に示されたものと交換可能であるヌクレオチド
を示している。

もちろん他のトランジットペプチドをコードするDNA配
列は、又、この発明のキメラ遺伝子の組み立てに使用し
うる。たとえば、本出願の意味の範囲内で、“第１の配
列”は、通常はチラコロイド膜中に存在する光収穫葉緑
体a/bタンパク質複合体のトランジットペプチドをコー
ドする配列を含むことができる。それは次のような配列
をとる。

トランジットペプチドをコードするDNA配列は天然の核D
NA遺伝子領域もしくは対応するmRNAから誘導されるcDNA
であることが有利である。

同様なアミノ酸配列をコードする他のいかなるDNA配列
も置換可能であることは言うまでもない。例えば、同じ
対応するアミノ酸配列をコードしてはいるが、天然のDN
A配列中にみられる対応するコドンとは異なるコドンの
いくつかをもつ合成的に作られたDNA配列をつかうこと
も考えることができる。そのような点において“トラン
ジットペプチド”という表現は外来のポリペプチド又は
そのようなペプチドをコードする配列を伴うか又は隣り
合うDNA配列によりコードされるタンパク質の葉緑体へ
の転位を促進するためのその生じたペプチドの操作性を
その考慮している置換が修正しない限り、いかなるペプ
チドへも拡張されると理解すべきである。このように、
この発明のキメラ遺伝子は天然のトランジットペプチド
をコードする天然のDNA配列と相同的な実質的配列をも
ついかなる“第１の配列”をもっても構築することがで
きる。

上述の“第２の配列”によりコードされるタンパク質又
はポリペプチドに関しては、それは、既知の物質の葉緑
体内に導入もしくはプロセシングされるいかなるタンパ
ク地又はポリペプチドをも含みうることも理解すべきで
ある。それ故、それをコードしているDNA配列は通常、
選択されたトランジットペプチドと正常に結合している
ポリペプチド又はタンパク質をコードしているDNA配列
に関しては外来のものかもしくは異種なものである。他
の言葉で言えば、第１と第２のDNA配列は通常異なるも
のに由来するであろう。とくに第２の配列は、例えば細
菌由来の外来タンパク質又はポリペプチドをコードする
であろう。しかし、本発明はまた、先に考慮した特定の
植物以外の植物の葉緑体もしくは、数アミノ酸が異なる
だけの同様の植物の天然の葉緑体タンパク質（変異タン
パク質）に対応する葉緑体タンパク質と同類のタンパク
質にも拡張する。そのような突然変異を示す技術は、最
近のグタリッジ（S,Gutteridge）等の“ロドスピリウム
・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）”のリブロース
−1,5−ビホスフェート カルボキシラーゼの活性部位
内の部位特異的突然変異”という1984年の報告に示され
ている。

さらに、本発明に従った好ましいDNA組み換え体のキメ
ラ遺伝子は上述の融合配列の上流領域にプロモーターを
含み、上述のキメラ遺伝子が適当なベクター中に挿入し
た時上述の第1,及び第２配列が上述のプロモーターの制
御下転写されるという様式をとる。ここで企画されたプ
ロモーター領域はもちろん形質転換されようとしている
植物と同類のポリメラーゼによって認識されるものから
選択されねばならない。えんどう、小麦、大豆又はタバ
コの細胞中で有効なプロモーターが特に有利である。そ
のプロモーターは選択されたトランジットペプチドをコ
ードする配列と正常に会合しているのかもしれない。し
かし、また異なるものかもしれない。他のプロモーター
を使用した組み立ての例は後の例で説明されるであろ
う。例えば、適当なプロモーターはプラストシアニン・
フェレドキシン−NADP⁺オキシドレダクターゼ，その他
の遺伝子に属するものである。他の適当なプロモーター
はこの中に述べられている文献に示されている。

トランジットペプチドをコードする配列は選択されたプ
ロモーターの直接の制御下にあることが望ましい。これ
は、上述のプロモーター制御下で転写され発現される第
１のヌクレオチドトリプレットは好ましいことにトラン
ジットペプチドをコードする配列のものであることを意
味する。もちろんこれは例えば最初の例で示したように
決定的なものではない。

最後にこの発明はまだ組み換えベクター、特に植物細胞
中に導入および維持できて、上述のキメラ遺伝子を含
み、上述のプロモーター領域を含むプラスミドに関する
ものである。

このタイプの好ましいベクターは上述のTi−プラスミド
から誘導されるものである。特に、このタイプで好まし
いベクターは上述のキメラ遺伝子に加えて、上述の外来
遺伝子に関して、うまい位置にあって、Ｔ−DNA断片を
含むTiプラスミドのDNAと相同的な基本的配列をもつDNA
断片を含み、さらに上述の植物細胞への上述のＴ−DNA
断片と上述のキメラ遺伝子の転移を起こしうる基本的機
能をコードした配列を含むものである。特に、この発明
に従った好ましいベクターは、Ｔ−DNAの境界配列を含
み、また上述のキメラ遺伝子はその近くに位置する。さ
らにより好ましいこのタイプのベクターは二つの境界配
列を含み、キメラ遺伝子がそれらの２つの境界配列の間
に位置するものである。Tiプラスミド中のキメラ遺伝子
の挿入の一般的方法に関して、以上に例によって述べた
特許を参照されたい。うまいことにDNA組み換え体は
（キメラ遺伝子自身がそうであるか又はベクターがそれ
を含む）、翻訳される最初のコドン、ほとんどの場合AT
Gコドンの上流に対応するRAN転写の開始の為の適当な部
位を含んでいる。また、DNA組み換え体が発現されるべ
き外来遺伝子の下流に転写の禁止とポリアデニル化のシ
グナルを含むと有利である。

本発明はまた既知の植物細胞の葉緑体への既知のタンパ
ク質もしくはポリペプチド（又は上述のタンパク質もし
くはポリペプチドのフラグメント）の導入を遂行し制御
するための過程に関するものである。この導入を遂行す
るいかなる適切な過程も頼ることができる。この発明に
よるキメラ遺伝子により示されそして修正されたタイプ
の、タンパク質又はポリペプチドをコードする“第２の
コード配列”を含むベクターは非常に有効に利用でき
る。しかし、その他の過程は頼ることができない。例え
ば、この発明に従ってキメラ遺伝子は塩化カルシウム・
ポリエチレングリコール沈殿法もしくは植物細胞へのマ
イクロインジエクションにより、簡単に植物細胞に挿入
できる。

本発明の付加的特徴は葉緑体に既知の外来遺伝子産物の
挿入を最終的に引き起こすための植物細胞の形質転換可
能なベクターの構造上の要請を決定する条件の引き続く
一連の開示で示されていよう。

引き続く例の中で採用した方法はえんどうからのBuBPカ
ルボキシラーゼの前駆体のトランジットペプチドを含む
融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子と細菌のネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ（II）（NPT（II）
と略す）のコード配列を構築しなければならない。

NPN（II）タンパク質はNPT（II）タンパク質が植物に対
してカナマイシン耐性を与えるという理由で選ばれ（ヘ
レラエストレラ（HERRERA−ESTRELLA）等、1983年、フ
レーリー（FRALEY）等、1983年、ビバン（BEVAN）等、1
983年）、融合タンパク質は生物学的活性であり（レイ
ス（Reiss）等、1984年ｂ）そしてNPT（II）もしくはNP
T（II）融合タンパク質の非変性系ポリアクリルアミド
ゲル中での生の状態での検出のための酵素的検定法が最
近述べられてきている。⁴⁷この方法は特に融合タンパク
質の処理、未処理型を区別するのに有効である。

例 Ｉ 一般的概要 （キメラ遺伝子（tp−SS−npt II）を含むプラスミドpS
NIP及びpSNIFの調製） えんどうからrbcS遺伝子の１つに対応する遺伝的クロー
ンの単離、配列決定及びその利用が、ニューヨークのロ
ックフェラー大学、キャッシュモア博士（Dr.A. CASHMO
RE）によりなされた。

（pPSR6）。このクローンから、プロモーターシグナル
（キャッシュモア（CASHMORE）1983年、ヘレラーエスト
レラ（HERRERA−ESTRELLA）等、1984年）、rbcSトラン
ジットペプチドをコードする最初のエクソン、最初のイ
ントロン（83塩基対）につづく成熟小サブユニットタン
パク質の最初の２つのコドン及び成熟小サブユニットタ
ンパク質のアミノ末端をコードする第２番目のエクソン
（66塩基対）の一部をTn5由来のnpt IIのコード配列
（ベック（BECK）等、1982年）を含むプラスミドpKm 10
9/9（レイス（REISS）等、1984年ｂ）のBam HI部位と、
San 3A制限部位を介して融合した。

得られたトランジット配列（56コドン）とnpt II遺伝子
からの第２のコドンと、７ケの人工的コドンを介して結
合した成熟したrbcS遺伝子からの22コドン（図1B）は同
様に活性であると分った。npt II遺伝子のコード領域の
大きさは1130塩基対である。融合接続部はDNA配列決定
法（マキサム（MAXAM）とギルバート（GILBERT）、1977
年）により検証した（データは示していない）。そのキ
メラタンパク質はプロセシング前には分子量38,023をも
ち、プロセシング後は分子量32,298をもつ。サウザーン
型（サウザーン（Southern）1975年）ハイブリダイゼー
ションデータ（図２）はキメラ遺伝子構築物を形質転換
植物組織が核DNA内に含み、インテグレーション中にDNA
の再配列は検出されない程度しか起こらないことを確か
めた。結果の図示は図３に与えられている。

この調製物のより詳細な開示は後に与えられるであろ
う。特に図1A,図1Bそして図３に関連している。

（植物の形質転換可能なベクターの生産） 植物の核遺伝子中へのキメラ遺伝子の導入のために、プ
ラスミドをpBR322で置換したＴ−DNAの一部をもつTiプ
ラスミドpTIC58の誘導体であるpGV3851とpGV3850のＴ−
DNA中へ挿入する。（ザンブリスキー（ZAMBRYSKI）等、
1983年、1984年）pGV3851のＴ−DNAはなお形質転換した
組織のテラトーマ様増殖をさせる（ジョース（JOOS）
等、1983年）ところの転写物4,Gaと6b（ウィルマイザー
（WILLMITZER）等、1983年）をコードする遺伝子を含
む。一方すべての腫瘍制御遺伝子をpGV 3850中で除去し
た結果このベクターで形質転換した植物細胞は識別可能
で正常な植物として成長する。（ザンブリスキー（ZAMB
RYSKI）等、1983年、テーブロック（DEBLOCK）等1984
年）。遺伝子調製物はプラスミドR64drd 11とJG28の助
けを貸りて大腸菌からアグロバクテリウム（Agrobacter
ium）への移動の後に相同的組み換えによりpGV3850とpG
V3851のTiプラスミド中へ導入した。（ヴァン・ホーテ
（VAN HAUTE）等、1983年）。スペクチノマイシンとス
トレプトマイシンを含むプレート上で、コインテグレー
トしたものが選択され、それらの構造をプローブとして
調製物の種々の部分を使用してサウザーンブロットハイ
ブリダイゼーション法（サウザーン（SOUTHERN）1975
年）により確証した。（データは示さない） （植物の形質転換） キメラ遺伝子を傷ついたプラントレットをイノキュレー
ションするか、アグロバクテリウム（Agrobacterium）
と細胞質を共に培養することによってニコチアナ・タバ
カム（Nicotiana tabacum）CV.ウスコンシン38又はSR1
に導入した。傷つけることにより得られた形質転換物質
はノパリン シンターゼ活性の存在下で共転移マーカー
をスクリーニングした。（オッテン（OTTEN）、1982
年）、形質転換体（pGV3851::pSNIP）は縁のテラトーマ
組織として250マイクログラム／ミリリットルの濃度の
カナマイシン下で増殖させ、機能性ミメラ遺伝子が存在
し、転写されることを示した。共培養実験でN.タバカム
（tabacum）SR1細胞質を（pGV3850::SNIF）含むアグロ
バクテリウム（Agrobacterium）とインキュベートし、1
00マイクログラム／ミリリットルのカナマイシンで二週
間後に選択した。NPT II活性でテストすると陽性の９ケ
の個々のコロニーから１つが選ばれ、十分に正常に見え
る植物へと一定の選択的抑制の下で再発生した。遺伝的
解析は古典的メンデル様式のNPT IIマーカーの遺伝を示
した。これらの結果はキメラ遺伝子からの転写はうまく
進行し、核からの転位や機能性タンパク質への翻訳もう
まくいっていることを示している。

（キメラ遺伝子の光誘導） 野生株および形質転換した組織（pGV3851::pSNIP）から
のPoly（Ａ）＋とpoly（Ａ）−RNAが単離され、そして
“ノーザン”ゲルハイブリダイゼーション法により解析
された。not II遺伝子（pKM109/9由来のBom HI−Sma I
フラグメント）のコード領域をプローブとして用いたと
き、複雑なハイブリダイゼーションパターンでは5,500
と8,000のヌクレオチド長の範囲のRNAを観察した。これ
らのRNAは光で成長するテラトーマのみで検出できた。1
2時間の昼夜リズムの後の４日間の斜光はシグナルの著
しい減少を示した。（図４）これらの非常に大きい転写
物はおそらく適当なポリアデニレーション及び転写終止
部位が翻訳終止シグナルの近くに導入されていない事実
に帰因する。同様なサイズ又は強度のシグナルは野生型
のウスコンシン−38−タバコやpGV3850ベクターのみで
形質転換した植物から得られた物質中には観察できなか
った。（図４）同種のrbc S遺伝子とルビスコの大きい
サブユニット（rbc L）をコードする葉緑体遺伝子の双
方をもつキメラ遺伝子の光依存の転写を比較するため
に、光成長と暗成長テラトマからのPoly（Ａ）＋および
poly（Ａ）−RANを各々のそれらの遺伝子に対する特異
的プローブにハイブリダイスした。この結果は図5Aに説
明してある。同様のrbc S転写物のシグナルは予想され
た位置に現れた。同様に1750ヌクレオチドの転写物はrb
c L特異的プローブが用いられた時、観察された（ズラ
ウスキー（ZURAWSKI）等1981年）。この結果は、葉緑体
中に存在するrbc L遺伝子のプロモーターが同種のrbc S
と新しく導入されたキメラ遺伝子の双方より光の刺激に
対し感受性が減少していることを示している。ドットブ
ロット実験はこれらの結果の定量化を含んでいる（図5
B）。以前に述べたようにameプローブが使用された。個
々のドットを切り出し、放射線量を測定した。rbc S又
はnpt II配列でさぐられた光成長および暗成長デラトマ
の若枝からのpoly（Ａ）−RNA間には25倍もの差があっ
た。一方、rbc L配列に特異的poly（Ａ）−RNAに対して
は５倍の差であった。これらの結果はノーザン実験は大
きなサブユニットをコードする葉緑体遺伝子の転写物は
小さなサブユニットに対する核遺伝子に比較して光の影
響に対して感受性が弱いことを示していることを支持し
ている。さらに、えんどうの導入されたキメラ遺伝子の
cbc Sプロモーターはタバコテラトマ組織中で測定され
る同種のプロモーターに比較して異なる光体制に対して
感受性があるようだ。

（融合タンパク質の特徴） トランジットペプチド、成熟した小サブユニットのアミ
ノ末端領域および植物中のNPT IIタンパク質の間で形成
された融合タンパク質を検出する為に植物の粗抽出物中
のホスホトランスフェラーゼII活性を検出する検定法を
開発した。この方法は発表された手順から採用した（レ
イス（REISS）等1984年ａ）。そしてこれはプロテイナ
ーゼＫの処理により、その方法を妨害する同種の自己リ
ン酸化タンパク質のほとんどを除外する。図６に示され
た結果はpGV3850とpSNIF調製物を含むタバコ植物の葉の
粗抽出物（レーン６）にもNPT II活性が検出されること
を説明している。この活性はTP−NPT II融合タンパク質
（35.5キロダルトン）と大腸菌の抽出物からの正常なNP
T IIタンパク質（29キロダルトン）間の移動度でゲル中
を移動する。（レーン１）レーン４中のNPT IIの相対的
移動度は、理論的分子量32,298の前駆体タンパク質（ss
−NPT II）のプロセシング後の型を示している結果と一
致している。三つのタンパク質の極性指標（カパルディ
（CAPALDI）とヴァンデルクール（VANDELKOOL）、1972
年）がNPT IIに対して41,ss−NPT IIに対し40、そしてT
P−NPT IIに対し41であるので、ポリアクリルアミドゲ
ル中のそれらの移動度による三つのタンパク質を比較す
るのは正統である。（図6B）。事実プロセシングをうけ
ていないTP−SS−NPT IIタンパク質は38,000の分子量を
もっており、それ故、おそらくTP−NPT IIマーカーより
もよりゆっくり移動するであろう。ss−NPT II融合タン
パク質は試験管中で単離後、正常のNPT II酵素の移動度
に近づく移動度をもつ活性なサブフラグメントを生じな
がら分解する。図6Aと７にみられるより低い分子量スポ
ットは非特異的分解によるものであることはこれと、他
のNPT IIタンパク質が細菌および植物抽出物中、試験管
内で実際に分解することを説明することにより示された
（データは示していない。）フロテアーゼ阻害剤の存在
下でのインキュベーションではこの分解は完全に妨害さ
れる。TP−SS−NPT IIキメラ遺伝子を欠いたタバコから
のコントロール抽出物では活性は検出されなかった（レ
ーン３）。粗抽出物中で観察されたSS−NPT II活性は単
離した葉緑体中にも検出された（レーン２）。葉緑体中
で検出された活性の相対量は明らかに粗抽出物のそれよ
り低くかった。これはたぶん葉緑体単離中に葉緑体から
活性がもれ出したためであろう。事実葉緑体単離操作
は、この特別な植物物質のために、葉緑体を実質的損傷
に導いた。葉緑体物質の90％以上は目に見えて損傷をう
けパーコールの密度勾配中でも密度に減少をきたしてい
る。さらに回収操作やNPT II検定の前の濃度がさらに小
さな損傷を起こし、もれ出しによりタンパク質の重大な
ロスに導く。これらの観察は、すべてのTP−SS−NPT II
タンパク質の前駆体がSS−NPT II型にプロセシングされ
るにもかかわらず、実際にはそれがすべて葉緑体のスト
ロマ中に生体中で転移する訳ではないという可能性と矛
盾しない。しかし、得られたデータはプロセシングされ
たSS−NPT IIタンパク質の少なくとも一部は葉緑体のス
トロマ画分にあることを明らかに説明している。事実、
葉緑体と会合している活性は、壊れた葉緑体はいかなる
NPT II活性も含まないことと、生の葉緑体中のNPT II活
性はトリプシン処理では除かれることはないという事を
説明することにより、ストローマ内に存在するというこ
とが示された。（データは示されていない）。さらに、
検出されたSS−NPT II活性は導入された光誘導キメラ遺
伝子から得られるという証拠はその活性が、pGV3850−p
SNIF調製物を含み12時間の明瞭体制の温室で成長したタ
バコ植物が96時間の完全な暗状態に移されたとき、著し
く減少したことを説明することにより得られた。（図
７、レーン2,3） DNA組み換え体の調製物が得られた条件や上に述べた結
果を確かめるのに用いた方法に関する詳細は以前の議論
から明白でない限りこの後に取り上げられるであろう。

＜試薬と方法＞ （菌株とプラスミド） 大腸菌DH1を試験管内形質転換に使用した。アグロバク
テリウム（Agrobacterium）C58CIRifをすべての細菌接
合における受容菌とした。接合につづく操作手順はヴァ
ンホーテ（Van Haute）等（1983年）及びザンブリスキ
ー（Zambryski）等（1984年）によって報告されてい
る。

（DNA技術） 制限酵素と他のDNA修飾酵素は製造元の推薦する方法に
従って使用した。その他の技術はマニアティス（Maniat
is）等によって述べられたものに従って使用した。

（ノパリン検定） 形質転換された仮皮そしてそれらの仮皮由来の再生した
若枝中のnos遺伝子の発現によるノパリンの存在もしく
は合成はオッテン（OTTEN）（1982年）の方法に従って
モニターした。

（植物の形質転換） 小さな成長植物はジャーの中の1/2Ｍ＋Ｓ培地中に保存
され、前述したように斬首のあとアグロバクテリウム
（Agrobacterium）株を植えつけた（ザンブリスキー（Z
AMBRYSKI）等1984年）。傷ついた仮皮を取り0.2mg/の
ベンズアミドプリンと0.6mg/のインドール酢酸及び0.
5mg/mlのセフォタキシム（ヘキスト（HOECHST））を含
む培地に置いた。約４週間後、カルスはホルモンのない
培地に移され、出現した若枝のノパリン産生をテストし
た。ノパリン合成が陽性の若枝を繁殖させ、100〜500μ
g/mlのカナマイシンに関してテストした。100μg/mlも
しくはそれ以上の濃度でも成長するテラトマの若枝を分
析に用いた。原形質はアグロバクテリウム（Agrobacter
ium）とともに、1985年、ヘイン（HAIN）等により述べ
られた修正を伴うマートン（MARTON）等の方法（1979
年）に従って一緒に培養した。

（DNAとRNAの解析） DNAは核の調製物からベドブルック（BEDBROOK）（1981
年）の方法に従って単離した。DNAを制限エンドヌクレ
アーゼで消化し（10〜30μg/レーン、３倍過剰の酵素で
一晩消化した。）、大きさに従ってアガロースゲルで分
離し、そしてニトロセルロースフィルターへと移した。
（トーマス（TOMAS）、1983年）。放射性プローブとの
ハイブリダイゼーションを50％ホルムアミド、４倍のSS
C,10倍のデンハルド（Denhardt）溶液,0.2％SDSおよび
0.1mg/mlの仔牛胸線DNAを含む溶液中で50℃、48時間の
条件で行った。（ボナート（BOHNERT）等、1982年）。
フィルターをハイブリダイゼーション温度で、各々50％
ホルムアミドと４倍のSSCで15分間づつ２回洗浄した。
さらに室温で50％ホルムアミドと３倍のSSCで洗い（１
−４時間）そして室温で２倍のSSCで洗った（１時
間）。ドットブロットハイブリダイゼーションが、試料
当り1000から0.1個の遺伝子のコピーと等価な範囲をカ
バーするDNA量でトーマス（THOMAS）の方法（1983年）
に従って行った。ハイブリダイゼーションは上述のよう
に行った。RNAはチャーグウィン（CHIRGWIN）等（1979
年）の方法に従がい単離し、そしてオリゴｄ（Ｔ）セル
ロース上を通すことによりpoly（Ａ）＋とpoly（Ａ）−
RNAに分離し（コラボラティブ研究所（Collaborative R
esearch）、タイプIII）、さらにアヴィヴ（AVIV）とレ
ダー（LEDER）（1972年）の操作に従った。RNAを5mMメ
チル水銀ハンドロキサイドを含む１％アガロースゲルで
大きさに従って分離した（ベイリー（BAILEY）とダビッ
トソン（DAVIDSO）（1976年）。³²Pでラベルしたニック
トランスレートしたプローブとのハイブリダイゼーショ
ンは述べたように行った（ボナート（BOHNERT）等1982
年）。レーン当り２×10⁶cpmと３×10⁶cpmの間で使用し
た。

（ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ活性検定） 検定は細菌及び動物細胞分解物に対して行った操作を植
物抽出物に対して対応した（レイス（REISS）等1984年
ａ）。形質転換した植物からの20から100mgの組織を0.1
ml緩衝液中で壊わした（10％グリセロール,5％２−メル
カプトエタノール,62.5mMトリス−塩酸pH6.8,50μg/ml
ブロモフエノールブルー及び0.1％SDS）。いくつかのプ
ロテアーゼ阻害剤は特異、非特異的プロテアーゼを阻害
する目的で使用した。アプロチニン（商品名トラシロー
ル（Trasylol）を最終濃度100μg/mlの水溶液で使用し
た。パラ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート（PHMB）
を1mM濃度で使用し、ｓ−アミノ−ｎ−カプロン酸と１
−10−フェナントロリンを最終濃度5mMになるように加
えた。プロテアーゼ阻害剤はグレイ（Gray）（1982年）
の方法に従って使用した。結晶性フエニルメチルスルホ
ニルフルオライドを100μg/mlの濃度になるように使用
直前に添加した。透明な均一物質（エッペントルフ（Ep
pendorf）遠心機で13000rpm5分）を10％非変性系ポリア
クリルアミドゲルに乗せた。（リムリ（Leammli）、197
0年、SDSなし）。電気泳動後、ゲル中の緩衝液を67mMト
リス−マレイン酸、42mM塩化マグネシウム、400mM塩化
アンモニウムpH7.1のものと交換し、そしてそのアクリ
ルアミドゲルをポリアクリルアミドゲルと同じ緩衝液中
にカナマイシン硫酸塩（1mg/ml）とγ³²P−ATP（５μCi
/μm pf比活性200〜3000Ci/mMol）を含むアガロースゲ
ルでカバーした。ゲルのサンドイッチをワットマンP81
口紙、ワットマン3MMロ紙とペーパータオルでおおっ
た。３時間後、P81口紙を水中に１％SDSと1mg/mlのプロ
テアーゼＫを含む溶液中30分間60℃でインキュベート
し、さらに80℃で10mMリン酸緩衝液（pH7.5）中で数回
洗浄し、乾燥しそして48時間にわたってコダック（Koda
k）×R5フイルムを感光させた。この方法の原理はカナ
マイシンのリン酸化活性の移動するゲル中の位置を明ら
かにするリン酸化DEAE口紙へのカナマイシンの結合であ
る。付加的なプロテアーゼ処理はリン酸化後P81口紙に
結合するがカナマイシンはリン酸化しない植物活性のシ
グナルを抑制する。

（葉緑体の単離） 葉緑体は形質転換した植物の１〜2gの葉から単離した。
構造的に生の葉緑体はパーコール（ファルマシア（Rhar
macia）勾配により集めた（オルティズ（Ortiz）等1980
年）。洗浄した葉緑体は遠心で濃縮し、分解しそして上
述した生状態のNPT II活性の説明に使った。葉緑体のト
リプシン処理はバートレット（BARTLETT）等（1982年）
に従って行った。

図に関する調製の詳細と具体的方法 １）キメラrbc S−wht II遺伝子pSNIPとpSNIFの調製
（図1A） Tn5（ベック（BECK）等、1982年）の修正したnpt II遺
伝子由来の全コード領域を含むpKM 109/9（レイス（REI
SS）等、1984年ｂ）からのBam HI−Sal Iフラグメント
をプロモーター領域とrbc S遺伝子の５′末端を含む950
塩基対DNAフラグメント（EcoR I−EcoR V）のとなりに
くるようにプラスミドpPSR6 △−RVに挿入したプラス
ミドＩ−22を使った。このプラスミド中、Hind III−Ba
m HIフラグメントをオリジナルなrbc Sクローン（pPSR
6）からの（Hind III−San 3Aフラグメントと置き換え
て融合遺伝子を含むプラスミドII−４を作った。II−４
のpBR由来の領域をpGV710からのEcoR I−Sal Iフラグメ
ントと交換して、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）中のTiプラスミドと共にこの最終的プラスミド（pSN
IP）（10.4キロ塩基対）が組み込まれたかどうかの選択
のマーカーとして使用する為のストレプトマイシン呼び
スペクチノマイシン耐性を導入した。プラスミドpSNIF
（12.3キロ塩基対）はpSNIPのSma I−Sal Iフラグメン
トを、Bam HI制限部位の隣りの遺伝子のポリアデニル化
部位をもつプラスミドpAGV40（ヘレラ−エラストラ（HE
RRERA−ESTRELLA）等1983年；デ．グレーブ（DE GREV
E）等1983年）のオクトピンシンターゼ遺伝子由来のPvu
−II−Xho Iフラグメントと置き換えて調製した。

２）rbc S−npt−IIキメラ遺伝子の構造（図1B） 黒い棒は第１番目のATGをもつトランジットペプチドを
表わしており、白い領域（エクソン１中の２つのコドン
とエクソン２中の22のコドン）は第１のイントロンによ
り分離されており、成熟rbc S配列を表している。斜線
部分はnpt II配列を表わしている。

３）サウザーン ハイブリダイゼーション実験形質転換
した（pGV3851::pSNIP）（a,cとｅ）タバコ及び形質転
換していない（ｂとｄ）タバコ由来の核DNAへの種々の
プローブのハイブリダイゼーション。サウザーンハイブ
リダイゼーション実験（サウザーン（Southern）1975
年）ではレーンａとｂは、遺伝子の小サブユニットクロ
ーン由来の661塩基対のEcoR V−AvaI IIDNAフラグメン
トをプローブとして使用したとき、小さなサブユニット
遺伝子群と似た種々の大きさのバンドに分裂する。（キ
ャッシュモア（Cashmore）、1983年）。10.4キロ塩基対
の付加的バンドはレーンａ中のキメラ遺伝子フラグメン
トを明らかにしている。レーンｃとｄとｅにおいてDNA
をPstlとEcoR Iで消化し、小サブユニット遺伝子のプロ
モーター領域（972塩基対のEcoR I/Hind IIIフラグメン
ト）（レーンｃとｄ）もしくはnpt II遺伝子のコード領
域（プラスミド pKM 109/9由来の1000塩基対のBam HI/
Sma Iフラグメント）をプローグとして使用した。レー
ンｃにおいては、非形質転換物から強いシグナルが検出
された（レーンｄ）。レーンｃにおける弱いシグナルは
同種のrbc S配列の相互ハイブリダイゼーションもしく
はDNAの不完全消化によるものであろう。レーンｅにお
いては、0.9キロ塩基対のバントがnpt II遺伝子の内部
のPstIフラグメントを明らかにし、弱いバンドは再び、
キメラのプロモーター領域とプローブのわずかな重なり
によるレーンｃにみられる1.5キロ塩基対のフラグメン
トを示している。

４）融合の機構及びフランキングベクター配列の図的説
明（図３） 大きさはキロ塩基対で示してある。キメラrbc S−npt I
Iのコード領域は棒で示してあり、５′−フランキング
配列は箱型の棒で示してある。EcoR IとPstIは制限エン
ドヌクレアーゼ部位を示している。SpRとApRはスペクチ
ノマイシン及びアンピリシンに対する抗生物質耐性のマ
ーカーを示している。数字はサウザーン実験で得られた
フラグメントの大きさを示している（図２）。遺伝子融
合とＴ−DNAの右側部分の間のDNAフラグメントはベクタ
ーpGV3851中に存在するpBR322の配列を表わしている。

５）rbc Sプロモーターの転写活性（図４） RNAは変性１％アガロースゲルで分離し、調製物の各部
分でさぐるニトロセルロースフイルターに移す。npt II
遺伝子のコード領域（pKM 109/9由来のBam HI−Sma Iフ
ラグメント）はプローブとして用いた。レーン1;光成長
テラトマ若枝由来のRNA。レーン2;12時間の明暗周期後
４日間の暗状態に保った植物からのRNA。レーン3;pGV38
50で形質転換した植物の葉由来のRNA。レーン4;野生型
ウィスコンシン38由来のRNA。後者の弱いシグナルは植
物染色体中の挿入位置近くか、もしくはＴ−DNA中で活
性なプロモーターからpBR322配列を通して転写されるmR
NAとハイブリダイズするロープ中の混入物質によるもの
であろう。左側の数字はヌクレオチドの大きさを示して
おり、右側のものはRNAマーカーのスペドベリ値に対応
している。

６）rbc 3とrbc Lプロモーターの光依存性の比較（図5
A） 12時間の明暗リズム（Ｌ）で成長したテラトマ若枝由来
のpoly（Ａ）＋RNAと暗状態（Ｄ）で４日間引きつづい
て保たれた物質をnpt II特異的プローブ（図４参照）と
rbc S特異的プローブ（図２参照）にハイブリダイズし
た。同種のrbc S転写物は850ヌクレオチドの位置に観察
された。poly（Ａ）−RNAはrbc L遺伝子由来の1750塩基
対フラグメントでさぐられた同様のテクニックで解析し
た。（ズラウスキー（ZURAWSKI）等、1981年）。左側の
数値はRNAマーカーのスベドベリ値を示し、右側のそのm
RNAの大きさを示している。

７）形質転換した（pGV3851::pSNIP）植物体からのRNA
に対するドットプブロットハイブリダイゼーション法
（図5B） Ｌは12時間の明暗サイクルで成長したものを示してお
り、Ｄは４日間暗状態に保って成長させたものを示す。
１つのドットが切り出され、放射活性を測定した。

８）pGV3850::pSNIF調製物を含むタバコ植物の葉緑体へ
のTP−SS−TPT II前駆体の導入の説明（図6A） 各レーンで得られた結果は以下に述べられている。

レーン1;大腸菌pGLT neol由来の抽出物はTP−NPT IIタ
ンパク質を発現（ヴァン・デン・ブルーク（VAN DEN BR
OECK）等、自然（Nature）、投稿中）、そしてTn5を含
む大腸菌pKM2はNPT II酵素をコードしている。レーン2:
葉緑体中のネオマイシンホスホトランスフエラーゼ活性
はキメラtp−ss−npt II遺伝子を含むタバコ植物の葉か
ら精製された。

レーン3;コントロールとしてのSR1タバコ植物からの粗
抽出物。

レーン4;キメラtp−ss−opt II遺伝子を含むタバコ植物
の葉由来の粗抽出物。P.K.バンドは細胞質の自己リン酸
化タンパク質により、C.P.Kは葉緑体の自己リン酸化タ
ンパク質によるものと考えられる。

９）図6Aで検出された個々のNPT II活性の相対移動度グ
ラフ表示（図6B） 上に述べたとおり、それらのタンパク質が互いに非常に
似た極性度をもつためにゲル上で分子量に従って分離す
ると仮定するのは合理的である。（カパルディ（CAPALD
I）とヴァンデルクール（VANDERKOOL）、1972年）。

10）SS NPT II融合タンパク質の光依存の発現（図７） レーン1;図6Aと同様 レーン2;植物を抽出前に96時間完全な暗状態に保ったこ
と以外は図6A、レーン４と同様。

レーン3;図CA、レーン４と同様、得られた結果は植物細
胞への遺伝子の転移と発現に対するアグロバクテリウム
（Agrobacterium）ベクターの使用は、特殊な細胞部
分、特に葉緑体に対して外来タンパク質を目標とすると
ころまで拡張された。（カプラン（CAPLAN）等により詳
細に述べられている； ザンブリスキー（ZAMBRYSKI）等1983年:1984年；ヘレラ
ーエストレラ（HERRERA−ESTRELLA）等1983年,1984
年）。さらに結果は次のようなことを説明している。

（ｉ） 遺伝子融合はDNAの再配列なしにタバコの核DNA
に集積される。

（ii） このキメラ遺伝子の転写（光誘導プロモーター
配列を含む）は光により調節される。

この導入された遺伝子の誘導される転写は同種の小サブ
ユニット遺伝子と同様の高率であり、そして、同じえん
どうの小サブユニットプロモーターを使った他のキメラ
遺伝子をもったタバコで以前の観察されたものよりはむ
しろ効率がよい。（ヘレラ・エストレラ（HERRERA−EST
RELLA）等、1984年）。おそらく、これらの組織中に導
入されたより高いレベルの定常状態のmRNAは改良したmR
NAの安定性によるものである。このトランジットペプチ
ドの小サブユニットネオマイシン・ホスホトランスフェ
ラーゼ・キメラ遺伝子（tp−ss−npt II）由来の転写物
中の１つのイントロンの存在と、ヘレラ−エストレラ
（HERRERA−ESTRELLA）等により述べられている調製物
中にいかなるイントロンも存在しないことで、このRNA
の安定性の増加を説明できるかもしれない。（ヘイマー
（Hamer）とレーダー（Leder）、1978年）。また我々の
観察はえんどうの小サブユニットのプロモーターは正常
なタバコ植物の葉の中で活性になりうることを示してい
る。これはえんどうの小サブユニットがタバコの組織培
養中やテラトーマ中で活性であるが、正常な植物体中で
は不活性であるという以前のいくつかの研究室での観察
と異なる。たぶん、この現象には位置の効果が関係して
いる。（pGV3851::pSNIP）中でのキメラtp−ss−npt II
遺伝子はポリアデニレーションもしくは転写終止シグナ
ルを含んでおらず、これはおそらく観察されるたいへん
大きな転写物を説明できるであろう。例IIでは、npt II
遺伝子の後の適当な位置に適したポリアデニレーション
もしくは転写終止シグナルを与えると自然環境化でのnp
t IIの転写物と実質的に同じ長さの転写物を作ることを
示している。

上で得られたデータは発現に際してトランジットペプチ
ドとプロセシング部位を横にもつ保存されたアミノ酸配
列をもつ融合タンパク質を生ずるキメラtp−ss−npt II
遺伝子が事実、葉緑体に転位し、プロセシングされて、
小サブユニットタンパク質のアミノ末端と活性なNPT II
タンパク質を含むストロマ中に存在する融合タンパク質
を生ずることを示している。このSS−NPT II融合タンパ
ク質は、ゲルNPT II検定において、TP−NPT II（35.5キ
ロダルトン）と本来のNPT II活性をもつもの（29キロダ
ルトン）との中間の電気泳動移動度を示して動く。この
移動度はSS−NPT II融合タンパク質の分子量（32,298）
とより一致を示している。得られた結果は、形質転換し
たタバコ植物体にカナマイシン耐性を与えるこの融合タ
ンパク質が葉緑体内に存在し、葉緑体が壊れたときは外
に流出することを示している。

しかし、後に例２で伸べられる調製で得られる結果は、
NPT IIタンパク質に直接融合し、プロセシング部位を側
にもつ保存されたアミノ酸配列の一部を失っているトラ
ンジットペプチドを含む前駆体タンパク質のNPT II成分
は等しく葉緑体外被を通して転位し適当なプロセシング
をうけていることを示している。後者の結果は、トラン
ジットペプチド配列だけで、葉緑体への前駆体タンパク
質の転移やプロセシングに十分であることを示してい
る。

例 II この例においては、NPT（II）のアミノ末端に直接結合
しているえんどう⁴⁴RuBPカルボキシラーゼの小サブユニ
ットへの前駆体のトランジットペプチドを含む融合タン
パク質をコードするキメラ遺伝子が調製されている。

換言すると、新しい“前駆体”ポリペプチドへの細菌酵
素の、生体内、及び試験管内条件下での葉緑体による翻
訳後の導入及びプロセシングされる能力が試される。

（プラスミド調製の一般的概要） TP−NPT（II）をコードするキメラ遺伝子を含む二つの
プラスミドが調製された（図8A）。第一のプラスミド、
pGGST neo 3、では、TP−NPT（II）に対するコード配列
は、植物細胞中でキメラ遺伝子の発現をうながすえんど
うのSS3.6プロモーターの制御下にある。^42,45この調製
物は形質転換したタバコの細胞中の生体内での融合タン
パク質の行方を研究するのに使用される。もう一つのプ
ラスミド、pGLT neo 1は、単離した葉緑体を用いた試験
管内での再構成実験に使う融合タンパク質の十分量を得
るために1 acUV5プロモーター⁴⁵制御下で大腸菌中TP−N
PT（II）の合成を支持するように調製した。両方のプラ
スミド中にコードされた融合タンパク質は、57個のアミ
ノ酸のトランジットペプチドとえんどうのss3.0遺伝子
⁴⁴によりコードされた成熟した小サブユニットポリペプ
チドの最初のメチオニン、７ケのアミノ酸のリンカ−フ
ラグメントおよび、最初のメチオニンを除くNPT⁴⁵（I
I）（263アミノ酸）から成る。ss3.6によりコードされ
る信頼性のある小サブユニットおよび融合タンパク質の
アミノ酸配列が図8Bに比較されている。小さなサブユニ
ットに対する前駆体のCys/Met切断部位がそのままTP−N
PT（II）融合タンパク質に保存されている。

生体中でのTP−NPT（II）融合タンパク質の運命を研究
するのに、まずtp−npt遺伝子産物を発現する形質転換
した植物細胞を得ることが必要である。

pGSSTneo 3のtp−npt（II）は、アグロバクテリウム（A
grobacterium）TiプラスミドpTIiC58⁴⁸の誘導体であるp
GV3851ベクターにより植物細胞の遺伝子へもたらされ
た。プラスミドpGV3851はオークシン産生に関するもの
を含むＴ−DNAにコードしたいくつかの転写物を除く
が、シトキニン合成に関する遺伝子は保存してある欠矢
を含んでいる。この修正はpGV3851を宿したアグロバク
テリウム（Agrobacterium）は枝を作る腫瘍の導入をも
たらすという結果となる。pGV3851においては、Ｔ−DNA
の欠失領域がpBR322と置換している。gGSSTneo 3をpBR3
22の相同性による組み換えにより、pGV3851のＴ−DNA中
に挿入した。⁴⁹カナマイシンを含むシャーレ上で得られ
たいくつかのアグロバクテリウムの相互結合体のＴ−DN
Aはサウザーンハイブリダイゼーション解析でpGSSTneo
3とpGV3851のＴ−DNAの間で適切なコインテグレーショ
ンを確証するのに試された。これらのpGV3851::pGSSTne
o 3の相互結合体の１つで得られた結果は図9Aに示され
ている。

滅菌したタバコ苗木の幹は第１節の下に針で傷つけ、こ
の菌株を植えつがれた。２〜３週間後、緑色の若枝をつ
くる腫瘍が現れた。無菌適な組織を、アンピリシン耐性
のアグロバクテリアが感受性を示す抗生物質であるセホ
タキシマムを500μg/mlを含むムラシゲ（Murashige）と
スコーグ（Scoog）（MS）培地でその形質転換組織を試
験管内培養することにより得た。組織の繁殖の間、MS培
地のショ糖濃度は３％から１％にすることで緑化を改良
した。緑の組織は200μg/mlのカナマイシンを含む培地
で生育することができ、これはtp−npt（II）遺伝子の
存在と機能の発現を示している。tp−npt（II）遺伝子
の存在は形質転換したカルス組織から得られた遺伝子
DNAをサウザーンハイブリダイゼーション解析法により
確認した。（図8B）。

一連のコインテグレーションと形質転換の実験（データ
は示していない）は、ノパリン・シンターゼ遺伝子
^35,43由来のプロモーターの制御下、非修正のNPT（II）
タンパク質をコードする第２のキメラ遺伝子nos−pnt
（II）を含むタバコの腫瘍を与えた。これは形質転換細
胞中でのNPT（II）自身の運命の研究を可能にした。

（植物細胞中でのtp−npt（II）遺伝子産物の運命） TP−NPT（II）融合タンパク質は植物細胞中での正常な
成分ではないので、形質転換した細胞中での融合タンパ
ク質の最終的な位置を決めることは興味深い。特に、ト
ランジットペプチドだけで、生体内で葉緑体によりTP−
NPT（II）融合タンパク質の取り込みとプロセシングを
指示しえるかどうかが知りたい。それゆえ、次の一連の
実験が、形質転換したタバコ細胞中でTP−NPT（II）融
合タンパク質および非修正のNPT（II）の運命をさぐる
ために遂行された。

与えられた抽出物中にNPT（II）又は活性NPT（II）融合
タンパク質があるかどうかは電気泳動後ホスホトランス
フェラーゼ活性のinsitnでの酵素検定法をつかって測定
した。（図10）。本来のNPT（II）とTP−NPT（II）融合
タンパク質の位置は上述のように調製したpBR322::Tn5
又はpGLTneo 1をもつ大腸菌の抽出物を検定することに
より測定した。⁴⁷示されているとおり（図10,レーン
３）、その遺伝子上にNPT（II）コード配列を含まない
植物細胞の抽出物の酵素検定法は、キナーゼ活性又はホ
スホトランスフェラーゼ活性の二つのバンドを示した
（植物キナーゼでは顕著）。これらのバンドは、酵素反
応中の基質としてカナマイシンを含まないときでも観察
されるということからNPT（II）活性を表わすものでは
ない。（データは示していない）同組織からの葉緑体調
製物ではより早く移動するバンドもみられる（図10,レ
ーン４）。pGLTneo 1によりコードされるTP−NPT（II）
融合タンパク質を含む細菌抽出物と植物抽出物とを混合
すると、NPT活性を示す新しい大きいバンドが出現する
（図10,レーン２）。このバンドはTn5によりコードされ
るNPT（II）よりゆっくり泳動し（図10,レーン１）、そ
してたぶんボナ・ファイド（bona fide）TP−NPT（I
I）に対応するものであろう。移動度の変化はトランジ
ットペプチドの付加による分子量と苛電の変化による。
レーン２（図10）では、また、より早い移動度を示す大
きなバンドがみられる。これはおそらく融合ポリペプチ
ドの分解産物もしくはTP−NPT（II）コード配列の内部A
TGから翻訳されたより小さなポリペプチドに対応するで
あろう。

nos−npt（II）キメラ遺伝子を含む形質転換組織から得
られた粗抽出物はNPT（II）活性を含んでいる（図10,レ
ーン５）。しかし、同組織から単離した生の葉緑体はそ
れらに関連したNPT（II）活性を検出できなかった（図1
0,レーン５）。この観察は、このキメラ遺伝子の産物は
葉緑体中への転位を媒介するのに必要な情報を欠いてい
ることを示している。またtp−npt（II）キメラ遺伝子
を含む組織から粗抽出物はかなりのNPT（II）活性を含
んでいる（図10、レーン７）。この組織から生の葉緑体
が単離された時、かなりのレベルのNPT（II）活性がそ
れらと関連しているのがみられる。（図10,レーン
８）。さらに粗抽出物と単離した葉緑体中にみられる１
つのネオマイシン−ホスホリル化タンパク質はTn5の信
頼できるタンパク質と同様の移動度で動くが、tp−npt
（II）キメラ遺伝子をもつ大腸菌からのNPT（II）融合
タンパク質とは異なっている（図11,レーン1,2,3参
照）。放射線活性による露光をより長くしても、このNP
T（II）融合タンパク質の存在は示されなかった。この
観察はNPT（II）活性は葉緑体中で濃縮され、TP−NPT
（II）融合タンパク質は融合部位付近で効率的に切断さ
れ、トランジットペプチドを失うことを示している。

成熟SSポリペプチドはストロマ中に存在する可溶性タン
パク質の一部なので、単離した葉緑体分画に会合したNP
T（II）活性が同じサブオーガネラ器官中に引込んでい
るかどうかを決めるのは興味深い。それ故、pGV3851::p
GSSTneo 3形質転換した組織からの葉緑体が低浸透圧緩
衝液にサスペンドすることにより分解し、ストロマと膜
画分に分画した。膜画分はさらに洗浄してストロマの混
入物を除いた。そして、これらの画分は非変性系ゲル電
気泳動にかけられ、その状態でNPT（II）活性が検定さ
れた。この解析の結果は（図11）明らかに、形質転換さ
れた組織から単離した葉緑体画分と会合している酵素活
性は全て、プラスチドの膜画分（図11,レーン４）より
もストロマ画分に存在することを示している。これらの
発見が、葉緑体による融合タンパク質の取り込みでプラ
スチド外被への非特異的な結合でなく、器官の分画中の
放出を表していることを確かめるために、単離した葉緑
体画分をプロテアーゼ処理にかけた。⁵⁹プロテアーゼ処
理した調製物及び処理しないものからの等量の葉緑体を
上述のように分画し、ストロマ画分をNPT（II）活性検
定した。非処理葉緑体中に存在するNPT（II）活性の大
部分が（図12,レーン３）、プロテアーゼ処理した葉緑
体中に、その葉緑体が壊されるまで（図12,レーン
２）、そのまま維持している（図に12,レーン４）。観
察される活性のわずかな減少は葉緑体内でのプロセシン
グされた融合タンパク質の隠遁の欠失というよりもむし
ろプラスミド分解物からのロスの結果であるらしい。

これらの結果は明らかにTP−NPT（II）融合タンパク質
が葉緑体を目指し、ストロマへ転位し、小さなサブユニ
ットポリペプチドのものと同様にプロセシングされるこ
とを示している。

（単離した葉緑体による融合タンパク質の試験管内での
取り込みとプロセシング） トランジットペプチドだけで、葉緑体への成熟小サブユ
ニットポリペプチド以外のタンパク質の翻訳後の取り込
みを指示するのに十分かどうかを決めるため、及び葉緑
体が認識でき、融合タンパク質のトランジットペプチド
をタンパク分解的に取り除くことができるかどうかをテ
ストするために、試験管内の一連の再構成実験を生の単
離した葉緑体で実行した。以前に試験管内のアプローチ
が葉緑体の翻訳過程の解析に有用であることが示され
た。^6,10-17ここで我々は大腸菌により生産された融合
タンパク質を使用する方法を適用した。TP−NPT（II）
融合タンパク質を含む細菌抽出物をpGLTneo 1をもつ大
腸菌の対数増殖期の溶液培養物を超音波処理することに
より調製した。透明にした細菌抽出物を含むTP−NPT（I
I）の画分をえんどうの葉から単離した葉緑体と１時間
インキュベートした。⁵³インキュベーション後、インキ
ュベーション混合物から葉緑体を再び単離し、上清にTP
−NPT（II）活性がなくなるまで等浸透圧緩衝液で数回
洗った。

この調製物をこれらの葉緑体のストロマもしくは膜画分
に会合したNPT（II）活性があるかどうかを測定するの
に用いた。図３のレーン１と２は各々、細菌抽出物中に
存在するNPT（II）とTP−NPT（II）の位置を示してい
る。レーン３（図13）は、TP−NPT（II）を含む大腸菌
抽出物とインキュベーションする前に、えんどうから単
離した葉緑体のストロマがTP−NPT（II）融合ポリペプ
チドもしくは信頼できるNPT−（II）と共に移動するい
かなるホスホトランスフェラーゼ又はキナーゼ活性も含
まないことを示している。しかし、前にタバコで観察さ
れたように、我々の検定条件は葉緑体と会合した同種の
キナーゼ活性（P,K）を明らかにした。TP−NPT（II）を
含む細菌の抽出物とこれらの葉緑体をインキュベートし
た後、単離した器官から得られたストロマ画分はかなり
のレベルNPT（II）活性を含んでいるが（図3,レーン
４）、一方、膜画分はそれを含んでいない（図３、レー
ン６）。このNPT（II）活性はプロセシングを示す本来
の細菌の酵素と同様に移動する。TP−NPT−（II）融合
タンパク質の存在下でインキュベートした葉緑体のスト
ロマ画分にみられるNPT（II）活性が、葉緑体の外被に
結合したタンパク質の取りこみの結果で、分画操作中の
放出の結果ではないことを確めるために、葉緑体をとり
込みインキュベーション混合物から再び単離し、洗浄
後、限定分解にかせられた。⁵⁹再精製につづいて、プロ
テアーゼ処理葉緑体を上述のように分画し、NPT（II）
活性をストロマ及び膜画分について測定した。ストロマ
のNPT（II）活性の大部分は、その回復した活性量が
（図13,レーン５）非処理の葉緑体でみられる（図13、
レーン４）ものと同様であることからプロテアーゼの消
化に対し保護されているようである。プロテアーゼで処
理した葉緑体の膜画分は全く活性がなかった（図13,レ
ーン７）。試験管内のTP−NPT（II）融合タンパク質の
取り込みに関する同様の結果が若い成長しているタバコ
の葉から単離した生の葉緑体を用いて得られている（デ
ータは示していない） これらの結果は、リブロース−1,5−TP−NPT（II）の小
サブユニットに対する前駆体のトランジットペプチドは
試験管内での検定条件下で葉緑体による成熟小サブユニ
ット以外のポリペプチドの取り込みを媒介できることを
示している。試験管内での葉緑体によるNPT（II）タン
パク質の取り込みはトランジットペプチドが存在しない
と起こらないということは我々の生体中でのnos−npt
（II）で形質転換したカルス組織から調節した葉緑体は
活性を含まないという観察と一致している。さらにこれ
らの観察は転位過程におけるトランジットペプチドの必
要性を確証している。以前の試験管内における前駆体ポ
リペプチドの合成に対する小麦胚芽抽出物の使用に頼っ
ていた取り込みの研究とは異なって、^6,11-17我々は、
融合タンパク質の調製に大腸菌の発現系を使用した。融
合タンパク質の転位がこの試験管内取り込み系で起こる
ために、これは、転位機構において付加的な細胞質因子
を要求しない証拠となる。しかし、ミクロソーム膜を使
った転移の研究とは対照的に、高塩濃度緩衝液で葉緑体
調製物を洗うことは実際的ではない。結果的に、我々は
葉緑体タンパク質の転位が我々の葉緑体調製物と強く結
合しているかもしれない付加的な細胞質因子を要求する
という可能性を全く除くことはできない。

例IIにおける調製やここまでに議論されてきた結果を得
るための条件は、以上の開示から確かでないものに限
り、これからより詳細に明らかにされるであろう。

１）TP−NPT（II）融合タンパク質をコードするキメラ
遺伝子を含むプラスミドの調製の詳細な記述（図8A） えんどうの小サブユニットss3.6遺伝子を含むpBR327の
誘導体であるpPSR6からの１キロ塩基のEcoR 1−SphI制
限断片を１％アガロースゲルで精製した。プロモーター
領域とトランジットペプチドをコードするヌクレオチド
配列及び成熟小サブユニットポリペプチドの最初のメチ
オニンコドンを含むこのフラグメントをNPT（II）をコ
ードする領域の前の小さなEcoR I/Bam HI断片と置き換
えることによってEcoR IとBam HIで切断したpRM 109/9
に結合した。プラスミドpKM 109/9は、５′側の翻訳さ
れない領域を欠いたTn5のnpt（II）遺伝子と最初のメチ
オニンコドンを含むpBR322の誘導体である。⁴⁵SphIの制
限部位の３′側に突き出た末端をBam HI制限部位の５′
側の突き出た末端と融合するために、両方の突き出た末
端に相補的な一本鎖のオリゴヌクレオチド５′GATCCATG
3′を合成し、結合混合物に添加した。⁵⁵融合のあと、S
phI部位はなくなっているがBam HI部位は残っている。
生じたプラスミドpGSSTneo 1をSma Iで制限切断し、ocs
遺伝子⁵⁶からの転写終止及びポリアデニレーションシグ
ナルを含む700塩基対のPvu II断片を適当な３′転写終
止とプロセシングを保証する部位に結合した。中間体の
pGSSTneo 2プラスミドは２つの異なるクローニング段階
で使用した。

（Ａ） Tn903からのカナマイシン耐性遺伝子をコード
するpUC4K⁵⁷由来の1400塩基対のBam HI断片を単離し、p
GSSTneo 2の唯一のBgl II制限部位にクローンし、プラ
スミドpGSST−neo 3を作った。カナマイシン耐性はアグ
ロバクテリウム（Agrobacterium）中にTiプラスミドとp
GSSTneo 3とが共に取り込まれたものを選択する際のマ
ーカーとして用いた。

（Ｂ） lac UV5プロモーター領域を含むpKm 109/3⁴⁵か
らの200塩基対のEcoR I/Hind III断片をpGSSTneo 2の小
さなEcoR I/Hind III断片と交換した。これは大腸菌中
でのTP−NPT（II）融合タンパク質を発現させる。生じ
たプラスミドはpGLTneo 1と呼ぶ。略記法、Ap^R:アンピ
シリン耐性、Km^R:カナマイシン耐性、記号、−:pBR322
配列、 オクトピン合成酵素遺伝子の３′末端表示、 ロース−1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小
サブユニットをコードする遺伝子の表示、 ２）TP−NPT（II）融合タンパク質とリブロース−1,5−
ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットポ
リペプチドに対する前駆体との部分的アミノ酸配列の比
較（図8B） えんどうのss3.6遺伝子によりコードされているリブロ
ース−1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サ
ブユニットポリペプチドに対する前駆体（上の行）とTP
−NPT（II）融合タンパク質（下の行）の部分的アミノ
酸配列が表示してある。小サブユニット前駆体のプロセ
シング部位とTP−NPT（II）融合タンパク質の融合部位
付近の領域が示されている。矢は小サブユニット前駆体
に対して決定されたタンパク質分解的なプロセシング部
位を示している。本来のNPT（II）タンパク質由来のア
ミノ酸残基にはアンダーラインが引いてある。アミノ酸
残基には、成熟した小サブユニットタンパク質の最初の
メチオニン残基がアミノ酸番号１となるように配列の上
に番号が付せられている。

−57 Met…Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys Met Gln Val T
rp Pro Pro Ile Gly Lys Lys…… Met…Set Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys Met Asp Pro A
la Asn Leu Ala Trp Iso Glu…… ３）植物細胞の遺伝子へのtp−npt（II）遺伝子の組み
込み。

pGV3851のＴ−DNA境界間にpGSST−neo IIIを挿入するた
めにヘルパープラスミドR64drd IIとGj28をもつ大腸菌
株Gj23中にpGSSTneo IIIをまず導入する。先にあげた二
つのプラスミドは大腸菌からアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（pGV3851
をもつ）へpGSSTneo IIIが動くのに必要なTra及びMob機
能を与える。このように大腸菌とツメファシエンス（A.
tumefaciens）の間の結合後、pGSSTneo IIIとpGV3851間
にコインテグレートしたアグロバクテリウム（Agrobact
erium）結合体がカナマイシンを含むプレート上で選択
された。

いくつかのカナマイシン耐性アグロバクテリウム（Agro
bacterium）結合体のＴ−DNAをサウザーンハイブリダイ
ゼーション解析⁵⁰にかけられpGSSTneo IIIとpGV3851の
間で適正なコインテグレーションが起こっていることが
確かめられた。それらのpGV3851::pGSSTneo III結合体
の１つに対して得られた結果を図３に示してある。

またこのあと出てくる図10のより詳細な記述も参照され
たい。

４）アグロバクテリウム（Agrobacterium）と植物DNAと
のサウザーンハイブリタイゼーション解析（図９） 上述のオートラジオグラムは、コインテグレートしたpG
V3851::pGSSTneo III DNAと形質転換したタバコの細胞
由来の遺伝子DNA中のtp−npt（II）キメラ遺伝子の存在
と構造を確かめるサウザーン、ハイブリダイゼーション
解析の結果である。レーン1:pGV3851::pGSST−neo III
からの全アグロバクテリウムDNA。レーン2:pGV3851::pG
SST−neo IIIで形質転換したタバコの仮皮由来の植物遺
伝子DNA。両レースで二つのフラグメントが特異的プロ
ーブとハイブリダイズする。:Tn903のKm^R遺伝子とSSプ
ロモーターとトランジットヘプチド領域を含むpGSSTneo
IIIのEcoR I/Bam HI断片を示す2.6キロ塩基の第１の断
片、NPT（II）のコード領域とOCSの３′末端を含むpGSS
Tneo IIIのBam HI/Sal I断片を表わす1.85キロ塩基の第
２の断片。

全アグロバクテリウムDNA⁵⁸と形質転換をうけた仮皮組
織の植物遺伝子DNAが調製され、EcoR IとBam HIとSal I
で制限処理された。消化産物は１％アガロースゲルで分
画し、ニトロセルロース紙に移され、プロモーター及び
TP−NPT（II）融合タンパク質のコード領域に特異的な
³²P−ラベルしたプローブとハイプリダイズされた。
（そのプローブはpGSSTneo 1のEcoR I/Sal I断片の小さ
い方のものである、図8A参照）。

５）葉緑体カルス組織中のNPT（II）活性の位置づけ
（図10） オートラジオグラムは細菌抽出物と細胞画分中のNPT（I
I）活性の存在と移動、さにその状態での位置を10％非
変性系ポリアクリルアミドゲル上で示したものである。
⁴⁷レーン1:緑のpGV3851で形質転換したタバコ組織の粗
抽出物と混合したNPT（II）を含む大腸菌抽出物。レー
ン2:緑のpGV3851で形質転換したタバコ組織の粗抽出物
と混合したTP−NPT（II）を含む大腸菌抽出物。レーン
3:緑のpGV3851で形質転換したタバコ組織からの粗抽出
物。レーン4:緑のpGV3851で形質転換したタバコ組織か
らの生の葉緑体、レーン5:緑のpGV−3851::pLGV23neoで
形質転換したタバコ組織からの粗抽出物。レーン6:緑の
pGV3851::pLGV23neoで形質転換したタバコ組織からの生
の葉緑体。レーン7:緑のpGV3851::pGSSTneo IIIで形質
転換したタバコ組織からの抽出物。レーン8:緑の pGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したタバコ組織から
の生の葉緑体。（？）：おそらく植物キナーゼの活性に
よる形質転換していない植物組織中に存在する非特異的
バンド。

方 法：緑の仮皮3gをGR緩衝液（0.33Mソルビトール、5
0mMへペス−水酸化カリウム（pH7.5）、1mM塩化マグネ
シウム、1mM塩化マンガン、1mMEDTAナトリウム塩、2mME
DTAナトリウム塩、1mg/mlイソアコルベート、0.5mg/ml
BSA）中でワーリング・ブレンダー（Waring Blender）
により低速で数回の短かい破壊により均一化する。均一
化物はミラクロス（Miracloth）の２層を通してロ過
し、ロ液を０から4340gまで遠心し、できるだけ早く止
める。粗葉緑体レベルをGR緩衝液数mlに再びサスペンド
する。生の葉緑体をバーコール密度勾配沈降により粗葉
緑体ペレットから調製する。⁵³勾配で精製した生の葉緑
体をRGで洗い0.5％β−メルカプトエタノールを含む25m
Mトリス−塩酸（pH7.5）にさらす。

粗カルス抽出物は70μの抽出バッファ（１％β−メル
カプトエタノール、50mMトリスpH6.8、0.13mg/mlロイヘ
プチン）中70mlの組織をホモジネートし、その均一化物
を透明にする（18,800×g2分間）ことで調製した。大腸
菌の粗抽出物は10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化
マグネシウム、25mM塩化アンモニウム及び10mMDTTを含
むバッファ中で超音波処理し、⁶⁰さらに細胞破片を除く
遠心を行って調製した。NPT（II）活性の検定は先に述
べた状態での検出法を修正したものである。10倍濃度の
ローデイングバッファ（50％グリセリン、0.5％SDS、10
％β−メルカプトエタノール、0.005％ブロモフエノー
ルブルー）で試料を希釈し、10％（w/v）の非変性系ポ
リアクリルアミドゲルで分離した。電気泳動後、ゲルを
蒸留水で10分間２回洗い、２倍濃度の反応バッファ（10
0mMトリスpH7.5、50mM塩化マグネシウム、400mM塩化ア
ンモニウム、1mMDTT）中30分間平衡化させた。それから
ゲルをガラスプレート上に移し、反応バッファ中に30μ
g/mlのカナマイシン硫酸塩と200μCiγ³²−Ｐ−ATPを含
む１％アガロースゲルを重ねた。室温で30分後、ゲルの
サンドウィッチをワットマン（Whatman）P81ホスホセル
ロース紙と２枚のワットマン3MM紙でおおい、一重なり
のブロッティング紙を重石（1kg）で押しつけてサウザ
ーン型の移動でホスホリル化したカナマイシンがP81紙
に結合するようにした。３時間後、P81紙を500mlの熱い
水（80℃）で５分間洗い、３時間に数回、50mMのリン酸
ナトリウムバッファ（pH7.0）で洗う。P81紙を乾燥し、
NPT（II）活性をもつタンパク質がポリアクリルアミド
中を移動する位置にできる放射性ラベルしたカナマイシ
ンを見られるようにするために増感スクリーンを使って
一晩オートラジオグラフをとった。

６）pGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したタバコ組織
から単離した葉緑体のストロマ画分中のNPT（II）活性
の位置づけ（図11） 生の葉緑体のpGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したカ
ルス組織から単離し、ストロマと膜成分に分画した。各
々の画分に会合した NPT（II）活性が検定された。レーン1; NPT（II）を含む大腸菌抽出物、レーン2; TP−NPT（II）を含む大腸菌抽出物、 レーン3;緑のpGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したタ
バコ組織から単離した葉緑体のストロマ画分、レーン4:
レーン３における葉緑体の膜画分。レーン5:レーン４に
示された膜画分のもの。（？）：図10を参照。

生の葉緑体を図10に脚注に述べたような緑のタバコ組織
から単離した。ソルビトール−ヘペスバッファで２度洗
い遠心により回収した葉緑体を0.5％のβ−メルカプト
エタノールを含む25mMトリス−塩酸（pH7.5）にプラス
チドを再びサスペンドし、18,800×ｇで遠心することに
よってストロマと膜部分に分画した。膜画分は残留する
ストロマ混入物を除くため二度洗い、ペレット化した。
洗浄画分は残留するNPT（II）活性をルーチンに測定し
た。

７）プロテアーゼ処理に対するpGV3851::pGSSTneo III
で形質転換したタバコ細胞の葉緑体内に存在するNPT（I
I）活性の保護。

pGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したタバコのカルス
組織から単離した生の葉緑体をタンパクの限定分解に課
し、さらにストロマと膜成分に分画した。これらの画分
に会合しているNPT（II）活性のプロテアーゼ感受性が
検定された。レーン1:NPT（II）を含む大腸菌抽出物、
レーン2:緑のpGV3851::pGSST−neo IIIで形質転換した
タバコ組織から単離し、プロテアーゼ処理の前に溶かさ
れた生の葉緑体のストロマ画分。レーン3:緑のpGV385
1::pGSSTneo IIIで形質転換したタバコ組織から単離し
たプロテアーゼ処理していない生の葉緑体のストロマ画
分。レーン4:緑のpGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換し
たタバコ組織から単離したプロテアーゼ処理した葉緑体
のストロマ画分。（？）：図３参照。

生の葉緑体は図10の脚注に述べてあるように緑のタバコ
カルス組織から調製した。単離した葉緑体のプロテアー
ゼ処理は以前に述べたように行った。⁵³プロテアーゼの
処理、未処理のプラスチドは図５の脚注に述べられてい
るように分画した。

８）単離したえんどう葉緑体によるTP−NPT（II）融合
タンパク質の試験管内での取り込み（図13） 非変性系ポリアクリルアミドゲルによる分画につづく細
菌及び葉緑体の画分中の生状態でのNPT（II）活性の位
置づけを示すオートラジオグラムが示されている。レー
ン1;pBR322::Tn5（NPT（II）をもつ大腸菌の抽出物、レ
ーン2;pGLTneo 1（TP−NPT（II））をもつ大腸菌の抽出
物。レーン3;細菌抽出物とインキュベーションする前の
えんどう葉緑体のストロマ画分。レーン4;TP−NP5（I
I）融合タンパク質を含む細菌抽出物とインキュベート
したえんどう葉緑体のストロマ画分。レーン5;TP−NPT
（II）融合タンパク質を含む細菌抽出物とインキュベー
トしたプロテアーゼ処理後のえんどう葉緑体（レーン４
と同量）のストロマ画分。レーン6;レーン５と同様の葉
緑体の洗浄した膜画分。レーン7;レーン４と同様の葉緑
体の洗浄した膜画分。

方 法：生の葉緑体のバコールの密度勾配沈降法によっ
てえんどう（ピサムサチバム（Pisum Sativum））から
単離した。⁵³生の葉緑体は洗浄され、ソルビトール・ヘ
ペスバッファ（50mMヘペス−水酸化カリウム、pH7.5、
0.33Mソルビトール）中にサスペンドした。そして０℃
で保存した。試験管内で、単離した葉緑体への取り込み
は、インキュベーション混合物が細菌の抽出物の使用に
対して修正された以外は基本的に以前に述べられたよう
に行なわれた。⁵³取り込み反応（最終体積300μ）
は、0.33Mソルビトール50mMヘペス−水酸化カリウム（p
H7.5）、1mM塩化マンガン、1mMEDTAナトリウム塩を含む
バッファ中生の葉緑体（200〜300μｇ葉緑素相当）と50
μの細菌抽出物（図10の脚注に述べられているよう
に）を含んで行なわれた。明光中おだやかに攪拌しなが
ら20〜22℃で１時間インキュベーションして、葉緑体は
ソルビトール−ヘペスバッファで希釈し、生の葉緑体を
4343×ｇの遠心で回収した。ソルビトール−ヘペスバッ
ファで２回洗われ遠心で回収した葉緑体は直ちに分画す
るか（図11の脚注参照）、もしくは以前に述べたよう⁵³
にプロテアーゼ処理に付した。試料溶液はNPT（II）に
対し直ちに検定されるか、もしくは−80℃で保存した後
に検定に付した。生体内及び試験管内の研究からのこの
例中に示された結果はTP−NPT（II）融合タンパク質のN
PT（II）成分は葉緑体外被を通して転位し、最終的にス
トロマ中に位置することを示している。この過程へのト
ランジットヘプチドの必要性は、トランジットペプチド
がNPT（II）と融合していない時には、葉緑体によるNPT
（II）の取り込みの検出に失敗することにより示されて
いる。しかし、TP−NPT（II）融合タンパク質は、小サ
ブユニット前駆体に対して、特にトランジットペプチド
のすぐあとのプロセシング部位の近くにアミノ酸配列に
おける類似性をもたない。このことは転位に必要なすべ
ての配列情報はトランジットペプチドの内に存在するこ
とを暗示している。植物の正常な生理的成長条件下、小
サブユニット前駆体は直ちに葉緑体にとり込まりプロセ
シングを受け、そしてプロセシングを受けていない前駆
体の大きく自由なプールを観察することはできない。
^1,10pGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したタバコ細胞
の中で、粗細胞抽出物もしくは単離した葉緑体画分中に
みられるすべてのNPT（II）活性は本来のNPT（II）と同
様の電気泳動移動度を示して使用したゲル系⁴⁷中を移動
することがここで示されている。TP−NPT（II）融合タ
ンパク質のプロセシングは小サブユニット前駆体のプロ
セシングをになう同様の可溶性の葉緑体と会合したプロ
テアーゼにより、おそらく行なわれる。それゆえTP−NP
T（II）融合タンパク質のプロセシングは小サブユニッ
ト前駆体中で用いられるのと同じCys/Met部位（図8B）
で起きるように思われる。このように、トランジットペ
プチドは転位のみならず、部位特異的プロセシングをも
媒介すると仮定することができるよう。さらに、転位プ
ロセシングの双方の段階が我々の検定の検定限界内で、
すべての観察されるNPT−（II）活性はTP−NPT（II）融
合タンパク質のプロセシングされた型に対応しているこ
とから、pGV3851::pGSSTneo IIIで形質転換したタバコ
細胞中でむしろ効率よく起こっている。

ここで示された結果は外来の遺伝子を植物中に導入する
ためにアグロアクテリウムに媒介される細胞の形質転換
を利用する適応性を再度示している。

例 III TP−NPT（II）融合タンパク質をコードするキメラ遺伝
子をコードし、そこではコード配列が外来のプロモータ
ーの制御下にあるようなプラスミドの調製。

調製はpGSSTneo 3から出発する。それからこのプラスミ
ドはEcoR IとHind IIIで消化される。長い断片のぶらぶ
らする末端はクレノー（Klenow）フラグメントで満たさ
れ、得られたDNAは報告されているプラスチドpLGV2382
から生ずるSan III A断片（270塩基対）に結合する。

このSan III A断片はノパリン・シンターゼのプロモー
ターを含んでいる。（ヘレラ、エラストレラ（HERRERA
−ESTRELLA）等、1983年、エンボ・ジャーナル（E mbo.
J.）２巻、987〜995頁）。また後者の断片をDNAポリメ
ラーゼのクレノーフラグメントで処理した。そのように
修正したSan III AフラグメントとpGSSTneo IIIからの
週したフラグメントはT4リガーゼで結合し、プラスミド
pLSSTneo 1を得る。正しい方向を向いたプロモーター領
域を含むプラスミドはSac IIとBam H1の制限酵素で制限
処理解析により同定した。最も大きいSac II−Bam H1断
片を含むと分ったプラスミド（pLSSTneo 1）はまた正し
い向きのプロモーター領域とTP−NPT II断片を含む上述
のプロモーター制御に従うものである。

このように正常な葉の特異的光誘導プロモーターのかわ
りに本質的プロモーターをもつ他のプラスミドを示され
ている。結果的に得られたプラスミドではプロモーター
の下流に位置するタンパク質が暗闇でもそして他の植物
体中でも発現できる。このような方法で、興味ある代謝
物、例えば脂肪酸又はアミノ酸の生産のレベルをコント
ロールできる。

また本発明は定常的に正常に働く（昼も夜も）プロモー
ターの制御下である遺伝子を発現させることができると
いうことは適切なことである。そのようなやり方で、例
えば、種子中で働くプロモーターの制御下、決ったアミ
ノ酸を定常的に生産させることができる。

このようにこの発明は葉緑体の機能を含む需要な農業的
応用への道を切り開いた。さらに植物細胞葉緑体中での
制御された構造のタンパク質の導入を可能にした。これ
らのタンパク質は天然の遺伝子によりコードされている
そして正常に植物細胞葉緑体へ転送されるタンパク質又
はタンパク質サブユニットとの融合のように導入するこ
とができる。これらのタンパク質は形質転換される植物
細胞にとって外来のタンパク質であるか又は制御された
突然変異によって異なるが同種のタンパク質に類似する
ものである。特にこの発明は葉緑体遺伝子によってコー
ドされた酵素の活性を改良するため等の、決ったタンパ
ク質を含む望みの遺伝子の場所に修正をほどこす可能性
を与えている。また本発明は、葉緑体タンパク質の生産
を制御した方法で調節するような、天然の遺伝子中に含
まれる同種のプロモーターと他のプロモーターを置きか
える可能性を与えている。

さらに本発明は葉緑体がコードしているタンパク質と相
互作用する転送された種々の領分のタンパク質のはたす
役割りを理解するための価値ある道具を提供している。
また、既知のキメラ遺伝子が、葉緑体によって正常にコ
ードされているタンパク質の移動をこの器官へもどるこ
とを指示できるかどうかの研究を可能にした。基本的な
研究や農業への応用にとって重要な葉緑体にコードされ
る遺伝子のモデル系で例えばホロエンザイムの触媒部位
を含むRuB Pカルボキシラーゼの大きいサブユニット
や、ある除草剤に耐性を与える32Kのタンパク質等のよ
うなものがすでに入手できる。また生体中と試験管内か
ら得られた結果同志の類似性は、大腸菌中での核でコー
ドされる器官ポリペプチドの一部と酵素的レポーターと
からなる融合タンパク質の生産は単離した器官によるタ
ンパク質の導入に関するシグナルや過程の迅速な分析の
有力な技術となることを暗示している。

さらにこの発明はアミノ酸の過剰生産や植物の産生能の
改良にとって基本的な植物のキメラ工学の実現の手段を
与え、そしてそれ故、この応用の前文ですでに述べてい
る必要性に直面している。

また葉緑体中で特異的に目標とするポリペプチドに対す
るトランジットペプチドの使用は、天然の植物細胞中に
含まれる正常な調節システムを与えられた経路の重要な
酵素がもはやになわなくなるようなやり方でその酵素を
コードしている配列を含む遺伝子工学による遺伝子の可
能性を与えている。

また本発明は前文に述べられた他の問題、例えば除草剤
耐性植物の生産等の問題を解く手段を与えている。現
在、実際にこの発明はトランジットペプチドをコードす
る第１の配列と興味あるタンパク質をコードする“第２
の配列”との融合する方法を与え、そのように作られた
キメラ遺伝子が興味ある植物の細胞の遺伝子DNA中に挿
入した後に葉緑体中へ興味あるタンパク質の転位を可能
にすることができる。

本発明は多くの他の応用への道を開いた。いくつかの付
加的例が以下に説明されている。そしてそこでは酵素の
リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（RuB PCas
e）が活躍している。

ａ）カルボキシラーゼ−オキシダーゼ比の改善、この酵
素は２種の酵素反応を触媒する。

１）リブロース・ビホスフェート１分子とCO₂1分子を縮
合してホスホグリセル酸２分子を生ずる（カルボキシラ
ーゼ反応）。

２）リブロース・ビホスフェート１分子と酵素１分子を
反応させてホスホグリコレートを作る（オキシダーゼ反
応）。

後者はカルボキシル化を伴う競争反応である。従って有
機物へのCO₂の転換効率には限度がある。

本発明は現在、決ったタンパク質の制御された修正に十
分な効果が与えられるような部位指向の突然変異の技術
を与えている。例えばカルボキシラーゼとオキシダーゼ
の比をより好ましいものにするようなRuB PCaseの修正
は現在企画することができる。もう一つのアプローチは
他の植物又はより好ましい比をもつシアノバクテリアの
ような他の生物からRuB PCaseをコードする遺伝子を単
に取って、プロモーターと興味ある植物内で効果的なト
ランジットペプチドを含む核酸フラグメントと融合し、
そして上述の植物内へ得られたキメラ遺伝子を導入する
ことである。

ｂ）植物の生産性の改良 栄養物の不足や光収穫の低効率又はCO₂同化の低効率等
の植物の生産性を制限するいくつかの因子がある。栄養
の不足は肥料を使って解決することができるので、主な
植物生産性に対する制限因子はCO₂同化である。葉によ
るCO₂の取り込みは主に２つの因子に依存している。

１）植物細胞に沿ったCO₂の物理的拡散 ２）CO₂の有機化合物への転換効率。

高等植物によるCO₂同化に対する異なった経路が存在す
るにもかかわらず、それらはRuB PCase酵素の効果とい
う同じ制限段階を分ちもっている。ここで再び本発明は
この問題の少なくとも一部は解決できる手段を与えてい
る。例えば、各々、プロモーター領域とその植物中で有
効なトランジットペプチドをコードする配列と他方、他
の植物由来のより効率的なRuB PCaseをコードする配列
とを含み、互いに融合した配列をキメラ遺伝子を植物細
胞に導入するようなことである。

プラスミド、中間クローニングベクター及び本発明の過
程により調製された微生物の培養物はドイツ、ゲッチン
ゲンのドイツ微生物コレクションに預けられている培養
物により例示される。これらの培養物は以下のように確
認された。

（１）大腸菌 HB101（pSRP6） （２）大腸菌 HB101（pKM 109/9） （３）大腸菌 HB101（pGSST3） これらの培養物は12月27日に預けられた。

これらの培養物は12月27日に預けられた。

これらの培養物は受理番号3172（１） 3171（２） 31
70（３）が割り当てられた。

この応用で議論したその他の培養物についても12月27日
以前例えば1984年12月20日に預けられている。プラスミ
ドは以下のテーブルの左手の部分に認められる微生物中
に保持された。

これらの培養物は次のような受理番号が割り当てられ
た。

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３ グレイ（Gray）,J.C.とケックウィック（Kekuuic
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４ キャシュモア（Cashmore）,A.J.Biol.Chem.251,284
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５ アペル（Apel）,K.とクロップステック（Kloppstec
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６ ハイフィールド（Highfield）,P.E.とエリス（Elli
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７ ドバースタイン（Dobberstein）,B.,ブロベル（Blo
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８ シュミット（Schmit）,G.W.,バートレット（Bartle
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９ キャッシュモア（Cashmore）,A.R.,ブロードハース
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10 チュー（Chua）,N.H.とシュミット（Schmidt）,J.C
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11 チュー（Chua）,N.Hとシュミット（Schmidt）,G.
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12 エリス（Ellis）,R.J.スミス（Smith）,S.M.とバラ
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13 シュミット（Schmit）,G.W.,バートレット（Bartle
tt）,S.G.,グロスマン（Grossman）,A.R.,キャッシュモ
ア（Cashmore）,A.R.,とチュー（Chua）,N.H.,植物中に
おけるゲノム生物体と発現（リーバー,C.J.編）337−35
1（プレナム出版、ニューヨーク、1980）。

14 グロスマン（Grossman）、A.R.,バートレット（Bar
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（Mullet）,J.E.とチュー（Chua）,N.H.J.Biol.Chem.25
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15 グロスマン,A.R.,バートレット,S.G.,シュミット,
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16 チュー（Chua）,N.H.,とシュミット（Schmit）,G.
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17 グロスマン（Grossman）,A.R.,バートレット（Bart
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18 ロンビンソン（Robinson）,C.とエリス（Ellis）,
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19 シュミット（Schmit）,G.W.,らJ.Cell3.Biol.83,61
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20 ブログリー（Broglie）,R.,コルチー（Coruzzi）,
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21 チムコ（Timko）,M.P.とキャッシュモア（Cashmor
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22 コルチ（Coruzzi）,G.,プログリ（Broglie）,R.,ラ
ンバ（Lamppa）,G.,とチュー（Chua）,N.H.植物ゲノム
の構造と機能（Structure and function of Plant g
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I,L.編）47−59（プレナム出版、ニューヨーク,198
4）。

23 ブログライ（Broglie）,R.,らScience 224,838−84
3（1984）。

24 バートレット（Bartlett）,S.B.,グロスマン（Gros
sman）,A.R.,とチュー（Chua）,N.H.光合成（アコヨノ
グル（Akoyonogluo）,G.編）、43,（パラダン、ニュー
ヨーク,1980）。

25 シラベー（Silhavy）,T.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 74,5411−5415。

26 ウルム（Wolfe）,P.B.とウィックナー（Wickner）,
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27 ゲシング（Gething）,M.J.とサンブロック（Sambro
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28 サバチニ（Sabatini）,D.D.クライビッヒ（Kreibic
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k）,M.J.Cell Biol.92,1−22（1982）。

29 エムル（Emr）,S.D.とシルベイ（Silvahy）,T.J.Ce
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30 ベンソン（Benson）,S.A.とシルベイ（Silvahy）,
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31 ガレンテ（Guarente）,L.とプタシン（Ptashne）,
M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,2460−2464（1981）。

32 ハル（Hall）,M.N.,ヒアホード（Hereford）,L.と
ヒルスコウッツ（herskowitz）,I.セル（Cell）36,1057
−1065（1984）。

33 リグナッパ（Lignappa）,V.R.,カイデス（Chaide
z）,J.,ヨスト（Yost）,C.S.とヘドペス（Hedpeth）,J.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,456−460（1984）。

34 ドウグラス（Douglas）,M.G.,ゲラー（Geller）,B.
L.とエムル（Emr）,S.S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81P
3983−3987（1984）。

35 ヘレラ−エストレラ（Herrera−Estrella）。L.,デ
ピッカー（Depicker）,A.,ファンモンタギュ（Van Mont
agu）,M.とシエル（Schell））,J.,Nature（ロンドン）
303,209−213（1983）。

36 フラレイ（Fraley）,R.T.らProc.Natl.Acad.Sci.US
A 80.4803−4087−（1983）。

37 ホルシュ（Horsh）,R.B.らScience223,496−498（1
984）。

38 ビバン（Bevan）,M.W.,フラベル（Flavell）,R.B.
とチルトン（Chilton）,M.D.,Nature（ロンドン）304,1
84−187（1983）。

39 ムライ（Murai）,N.らScience222,476−482（198
3）。

40 ヘレラーエストレラ（Herrera−Estrella）,L.らEM
BO J.2,987−995（1983）。

41 カプラン（Caplan）,A.らScience 222,815−821（1
983）。

42 ヘレラ−エストレラ（Herrera−Estrella）,L.らNa
ture（ロンドン）310,115−120（1984）。

43 デ ブロック,M.らEMBO J.3.1681−1689（198
4）。

44 キャッシュモア（Cashmore）,A.R.植物の遺伝子工
学−農業的展望（コスゲ（Kosuge）,T.,メレディス（Me
rredith）,C.P.とホランダー（Hollaender）,A.編）。

45 ライス（Rejss）,B.Ph.D.論文、ハイデルベルグ（1
982）。

46 ベック（Beck）,E.,ラドウィック（ludwig）,G.,オ
イエルスワルド（Auerswaid）,E.A.,ライス（Reiss）,
B.とシャラー（Schaller）,H.Gene 19,327−336（198
2）。

47 ライス（Reiss）,B.,スプランゲル（Sprengel）,
R.,ウィル（Will）,H.とシャラー（Schaller）,H.Gene
30,217−223（1984）。

48 ザンブリスキ（Zambryski）,P.,ヘレラ−エストレ
ラ（Herrera−Estrella,L.,デブロック（De Block）,
M.,ファンモンタギュ（Van Montagu）,M.とシエル（Sch
ell）.J.「遺伝子工学−原理と方法」（巻６）（セット
ロニー（Setlow）,J.とホランダー（Hollaender）,A
編）253−278（プレナム出版、ニューヨーク,1984）。

49 ファン ホイテ（Van Haute）,E.ら、EMBO J.2,41
1−418（1983）。

50 サザン（Southern）,E.M.,J.Mol.Biol.98,503−518
（1975）。

51 シュレーダー（Schroder）,G.,ワッフェンシュミッ
ト（Waffenschmidt）,S.,ウェルダー（Weilder）,E.W.
とシュレーダー（Schroder）,J.Eur.J.Biochim.138,387
−391（1984）。

52 ムラシゲ（Murashige）,T.とスクーグ（Skoog）,
F.,Physion.Plantarum 15,473−497（1962）。

53 バートレット（Bartlett）,S.G.,グロスマン（Gros
sman）,A.R.,とチュー（Chue）,N.H.葉緑体分子生物学
における方法（エーデルマン（Edelman）,M.編）1081−
1091（アムステルダム，エルセビアバイオメディカル出
版、1982）。

54 ワルター（Walter）,P.とプロベル（Blobel）,G.Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 77,7112−7116−（1980）。

55 ラス（Lathe）,R.,バーランド（Balland）,A.,コー
リ（Kohli）,V.とレコック（Lecocq）,J.P.Gene 20,18
7−195（1982）。

56 デグレブ（De Greve）,H.らJ.Mol.Appl.Genet.1,4
99−512（1982）。

57 ビエイラ（Vieira）,J.とメシング（Messing）,J.G
ene19,259−268（1982）。

58 ダエス（Dhease）,P.らEMBO J.2,419−426（198
3）。

59 デラボルタ（Dellaporta）,S.L.,ウッド（Wood）,
J.とヒックス（Hicks）,J.B.Plant Mol.Biol.Reporter
1,19−21（1983）。

60 ハス（Hass）,M.J.とダウデング（Dowding）,J.E.M
eth.Enzymol.43,611−628（1975）。

【図面の簡単な説明】

図1A 本発明の最初の望ましい具体案に従ったキメラ遺
伝子を含む植物細胞の形質転換に適したベクターを含む
望ましいDNA組み換え体の調製の連続するステップを図
式的に示している。 図1B 上述のDNA組み換え体に含まれる、本発明に従っ
たキメラ遺伝子の特徴的部分の構造を示している。 図２ 植物細胞の遺伝子中の上述のキメラ遺伝子の組み
込みの検出に関する、本発明に従ったDNA組み換え体を
用いたサウザーンハイブリダイゼーション実験で得られ
た結果を示している。 図３は上述のキメラ遺伝子により修正された、図1A中の
ベクターの植物−ベクター配列と遺伝子融合の機構の図
的表現である。 図４は、本発明のキメラ遺伝子中に含まれるプロモータ
ーの転写活性の検出に関して行なわれたRNAハイブリダ
イゼーション実験で得られた結果を示している。 図5Aと5Bは本発明のDNA組み換え体により形質転換され
た植物体中の光依存プロモーターの制御下での転写実験
の比較結果を示している。 図6Aは植物細胞の葉緑体への上述のキメラ遺伝子により
コードされる産物の転送を説明を意図する実験で得られ
た結果の代表的なものである。 図6Bは図6Aに検出された異なった活性をもつ遺伝子産物
の相対的移動度のグラフ表示である。 図７は検定で得られた結果を説明している（キメラ遺伝
子によりコードされる融合タンパク質の光依存の発現を
示している） 図8Aは研究の目的に応じた他のDNA組み換え体同様、本
発明の第２の望ましい具体案に従う望ましいDNA組み換
え体の調製の連続するステップを図式的に示している。 図8Bは、特に、葉緑体への転送可能な細菌由来のモデル
タンパク質として使用した細菌のネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼII（NPT（II））のアミノ酸末端をコ
ードする遺伝子の選択されたトランジットペプチドをコ
ードするDNA配列の結合部分を、図8Aに図式的に示され
たキメラ遺伝子の一部によりコードされたアミノ酸配列
を示している。 図９は本発明に従った他の例のキメラ遺伝子の図式的表
示である。 図10〜13は前に明らかにされた一連のゲル−分離検定で
観察されたオートラジオグラムである。 第14図は、融合タンパク質を外来のプロモーターが制御
するようにキメラ遺伝子を含む望ましい組み換え体の調
製の連続ステップを図式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (72)発明者 グイド バン デン ブレツク ベルギー国 9000 ジヤン タムペルホフ 37 (72)発明者 マルク バン モンタギユー ベルギー国 1050 ブリユツセル ド ス タツサルトストラート 120 (72)発明者 ペートル シユライア ドイツ連邦共和国 5000 ケルン １ ダ ツセルストラーセ 16 (72)発明者 ジエフ シエル ドイツ連邦共和国 5000 ケルン フオー ゲルザンク エゲルシユプフアツト（番地 なし) (72)発明者 ハンス ジエイ ボナート アメリカ合衆国 アリゾナ州 85711 タ クソン ノース ウイルモツト ロード 830 (72)発明者 アンソニー アール キヤツシユモア アメリカ合衆国 ニユーヨーク州 11377 ウツドサイド サーテイナインス ドラ イブ 52―40 (72)発明者 マイケル ピー テイムコ アメリカ合衆国 ニユーヨーク州 10021 ニユーヨーク イースト シツクステイ サード ストリート 500 (72)発明者 アルバート ピー コーシユ アメリカ合衆国 ニユーヨーク州 10021 ニユーヨーク イースト セブンテイセ ブンス ストリート 517 アパートメン ト１ イー

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】外来タンパク質又はポリペプチドが葉緑体
   中に存在する植物細胞を調製する方法であって、前記植
   物細胞の細胞質中において、前記外来タンパク質又はポ
   リペプチドのキメラ前駆体を発現させる工程を含み、前
   記前駆体は、前記植物細胞のゲノム中のキメラDNA配列
   によってコードされ、前記キメラDNA配列は、 （ｉ）植物種の葉緑体タンパク質又はポリペプチドの細
   胞質前駆体のトランジットペプチドをコードする第１の
   核酸配列、及び （ii）前記外来タンパク質又はポリペプチドをコードす
   る第２の核酸配列であって、前記第１の配列とヘテロロ
   ゴスであり、かつ該第１の核酸配列の下流にあって、同
   一の転写単位にある、第２の核酸配列、 を含み、もって前記外来タンパク質又はポリペプチドか
   ら前記トランジットペプチドが除去されて、該外来タン
   パク質又はポリペプチドが前記植物細胞の細胞質から前
   記葉緑体に移動することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】前記外来タンパク質又はポリペプチドが、
   前記植物細胞の葉緑体に存在する時、該植物に除草剤耐
   性を提供する特許請求の範囲１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記キメラDNA配列が、第３の核酸配列を
   含み、前記第３の核酸配列が、前記植物種の前記葉緑体
   タンパク質又はポリペプチドのＮ−末端領域をコード
   し、かつ前記第１の核酸配列の下流にあり、更に前記第
   ３の核酸配列の５′末端が、前記第１の核酸配列の３′
   末端に実質的に隣接する、特許請求の範囲１又は２に記
   載の方法。
4. 【請求項４】前記第３の核酸配列が、前記植物種の葉緑
   体タンパク質又はポリペプチドの細胞質サブユニットの
   少なくとも一部をコードする、特許請求の範囲３に記載
   の方法。
5. 【請求項５】前記第３の核酸配列が、前記植物種の前記
   葉緑体タンパク質又はポリペプチドの前記細胞質サブユ
   ニットより大きくはコードしない、特許請求の範囲４に
   記載の方法。
6. 【請求項６】前記第１の核酸配列及び第３の核酸配列が
   エクソンを含む、特許請求の範囲３〜５の何れかに記載
   の方法。
7. 【請求項７】前記第３の核酸配列が、イントロンを含
   む、特許請求の範囲６に記載の方法。
8. 【請求項８】前記第３の核酸配列が、大豆、えんどう、
   あおうきくさ及び小麦に共通する葉緑体タンパク質又は
   ポリペプチドの細胞質サブユニットのＮ−末端部分をコ
   ードする核酸配列に相同性を有する核酸配列から本質的
   になる、特許請求の範囲３〜７の何れかに記載の方法。
9. 【請求項９】前記第３の核酸配列が、ペンタペプチド:M
   −Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｐをコードする、特許請求の範囲８に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】前記第１の核酸配列の３′末端が、前記
    第２の核酸配列の５′末端と実質的に隣接する、特許請
    求の範囲１又は２に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配
    列との間に、ヌクレオチドリンカーが存在する、特許請
    求の範囲10に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記第２の核酸配列が、葉緑体タンパク
    質又はポリペプチドのＮ−末端領域をコードしない、特
    許請求の範囲10又は11に記載の方法。
13. 【請求項１３】前記キメラDNA配列が、前記第１の核酸
    配列と前記第２の核酸配列との間にイントロンを有さな
    い、特許請求の範囲12に記載の方法。
14. 【請求項１４】前記第２の核酸配列の第１のコドンが、
    メチオニンをコードするとともに、前記第１の核酸配列
    の最後のコドンに隣接する、特許請求の範囲10〜13の何
    れかに記載の方法。
15. 【請求項１５】前記キメラDNA配列が、前記第１の核酸
    配列及び第２の核酸配列の両者を転写制御下に置くよう
    に、前記第１の核酸配列の上流にプロモーターを含み、
    かつ前記プロモーターが、前記細胞のポリメラーゼによ
    って認識できる核酸配列を含む、特許請求の範囲１〜14
    の何れかに記載の方法。
16. 【請求項１６】前記プロモーターと、前記第１の核酸配
    列とがヘテロロゴスである、特許請求の範囲15に記載の
    方法。
17. 【請求項１７】前記プロモーターが、プラストシアニン
    遺伝子、フェレドキシン−NADP⁺遺伝子、オキシドレダ
    クターゼ遺伝子、又はノパリンシンターゼ遺伝子に由来
    し、前記第１の核酸配列と正常に結合している、特許請
    求の範囲15に記載の方法。
18. 【請求項１８】前記第１の核酸配列が、リブロース−1,
    5−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニッ
    トの細胞質前駆体のトランジットペプチドをコードす
    る、特許請求の範囲１〜17の何れかに記載の方法。
19. 【請求項１９】前記第２の核酸配列が、細菌又は植物タ
    ンパク質又はポリペプチドをコードする、特許請求の範
    囲１〜17の何れかに記載の方法。
20. 【請求項２０】前記第２の核酸配列が、葉緑体タンパク
    質又はポリペプチド若しくは変異した葉緑体タンパク質
    又はポリペプチドをコードする、特許請求の範囲19に記
    載の方法。
21. 【請求項２１】（１） ゲノム中にキメラDNA配列と、 （２） トランジットペプチドのない外来タンパク質又
    はポリペプチドを含有する葉緑体と を含む植物細胞であって、 前記キメラDNA配列が、 （ｉ）植物種の葉緑体タンパク質又はポリペプチドの細
    胞質前駆体のトランジットペプチドをコードする第１の
    核酸配列、及び （ii）前記外来タンパク質又はポリペプチドをコードす
    る第２の核酸配列であって、前記第１の配列とヘテロロ
    ゴスであり、かつ該第１の核酸配列の下流にあって、同
    一の転写単位にある第２の核酸配列、 を含むことを特徴とする植物細胞。
22. 【請求項２２】植物の種子又は植物細胞培養体を構成す
    る、特許請求の範囲21に記載の植物細胞。
23. 【請求項２３】前記ゲノムが、核ゲノムである、特許請
    求の範囲21に記載の植物細胞。