CN101918563A - 抑制靶多核苷酸的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了增加细胞中靶序列特异抑制性RNA浓度的方法和组合物。在一实施方式中，方法和组合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸含有可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶害虫序列沉默元件；所述第二多核苷酸含有可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件，所述抑制增强元件包含靶害虫序列或其活性片段或变体。沉默元件和靶害虫序列或其活性变体或片段的联合表达，使得由沉默元件产生的抑制性RNA的扩增超过沉默元件单独表达可实现的扩增。因而，本发明的多种方法和组合物提供了将抑制性RNA递送至靶生物体的改良方法。
Description
发明领域
本发明通常涉及分子生物学和基因沉默的方法。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是在靶器官中选择性阻断基因功能的方法。已经很好地建立了将该方法用于体外细胞过程的遗传剖析。RNAi在昆虫整体生物体中的应用已大大限于经P元件介导的种系转化的果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(以及在其他昆虫中有限数量的基于dsRNA注入昆虫血腔的RNAi实验报道)。在本领域中需要在多种生物体中增强感兴趣序列的靶向抑制的方法。
在农业上虫害是严重的问题。它们毁坏了数百万英亩的主要作物例如玉米、大豆、豌豆和棉花。每年，这些害虫仅在美国就造成了超过千亿美元的作物损失。在正进行的季节性保卫战中，农场主必须应用亿万加仑的合成杀虫剂以抗击这些害虫。过去采用的其他方法是通过微生物或衍生自微生物的、于转基因植物中表达的基因来递送杀虫活性。例如，已知杆菌属的某些微生物物种具有针对广范围虫害的杀虫活性，所述害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、和其他。事实上，微生物杀虫剂，特别是从杆菌株获取的那些在农业中发挥重要作用以替代害虫的化学防治。农业科学家已通过基因工程化作物植株由杆菌产生杀昆虫蛋白来发展具有增强昆虫抗性的作物植株。例如，经基因工程化产生Cry毒素的玉米和棉花植株(参见例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.59(3)：417-425；Schnepf et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3)：775-806)现在被广泛用在美国农业中并为农民提供了传统昆虫防治方法的替代方案。然而，这种Bt杀昆虫蛋白仅保护植物免受相对窄范围的害虫。而且，这种模式的杀昆虫活性会提供可变水平的特异性，并在一些情况下会造成明显的环境后果。因而，迫切需要一种防治害虫的替代方法。
发明概述
提供了增强细胞中靶序列特异抑制性RNA浓度的方法和组合物。在一种实施方式中，方法和组合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸含有可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶害虫序列沉默元件；第二多核苷酸含有包含靶害虫序列或其活性片段或变体的、可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件。沉默元件和抑制增强元件的联合表达导致由沉默元件产生的抑制性RNA的扩增相对于沉默元件单独表达可实现的扩增增加。
还提供了防治害虫的方法。该方法包括饲喂害虫含有包含害虫靶序列沉默元件的第一多核苷酸和包含抑制增强元件的第二多核苷酸的植物细胞。
还提供了含有植物、植物细胞、植物部分、种子和包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的载体的组合物，所述第一多核苷酸含有可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶害虫序列的沉默元件；所述第二多核苷酸含有可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件，所述抑制增强元件包含靶害虫序列或其活性变体或片段。
附图简述
图1提供了抑制构建体的非限制性图示。
发明详述
下文将参照附图更充分地描述本发明，其中仅显示了部分而非全部的实施方式。事实上，本发明可具体化成多种不同形式且不应解释成限于本文所列的实施方式；相反，提供这些实施方式以便本公开满足可适用的法律要求。通篇地，同样的数字表示的是同样的元素。
受益于前述说明和相关附图中给出的教导的本发明所属领域技术人员会想到本文所述的本发明的多种修改和其他实施方式。因此，应该理解的是，本发明并不限于所公开的特定实施方式，修改和其他实施方式也包括在所附权利要求的范围中。尽管本文采用了特定术语，但是仅以一般性和描述性意义而非限制性目的使用它们。
I.概述
提供了增强细胞中靶序列特异抑制性RNA(RNAi)浓度的方法和组合物。在一种实施方式中，方法和组合物采用了第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸含有可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶害虫序列的沉默元件；第二多核苷酸含有包含靶害虫序列或其活性变体或片段的、可操作连接至在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强子。沉默元件和抑制增强元件的联合表达导致由沉默元件产生的抑制性RNA的扩增相对于沉默元件单独表达可实现的扩增增加。除增强扩增特定RNAi物质本身之外，该方法和组合物还允许产生不同种群的RNAi物质，其可增强阻断靶基因表达的效力。因此，当在植物细胞中联合表达抑制增强元件和沉默元件时，该方法和组合物可允许整个植物系统性产生RNAi；比仅由单独的沉默元件构建体观察到的产生更大量的RNAi；并且改善RNAi装载至植物韧皮部，因而提供通过RNAi方法更好地防治进食韧皮部的昆虫。因而，本发明的多种方法和组合物提供了将抑制性RNA递送至靶生物体的改善方法。
如本文所用的，“防治(controlling)害虫”或“防治(controlls)害虫”是指会造成限制害虫引起的损失的对害虫的任何影响。防治害虫包括但不限于杀死害虫、抑制害虫发展、改变害虫多产或生长，以致害虫对植物造成更小的损失，降低所产生的后代数量，产生较不健康的害虫，产生更易受捕食者攻击的害虫，或阻止害虫侵食植物。
“疾病抗性”是指植物免受由植物病原体相互作用引起的疾病症状。即，阻止病原体引起植物疾病和相关疾病症状，或可选地，最小化或减少病原体引起的疾病症状。
降低害虫中靶多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平会造成抑制、控制、和/或杀死侵入的病原体生物。降低害虫靶序列的表达水平会将由病原体侵袭造成的疾病症状降低至少约2％-至少约6％，至少约5％-至少约50％，至少约10％-至少约60％，至少约30％-至少约70％，至少约40％-至少约80％，或至少约50％-至少约90％或更多。因而，可利用本发明的方法保护植物免受疾病。
测量害虫防治的测定法是本领域公知的，如感染病原体之后定量植物中疾病抗性的方法。参见，例如美国专利第5,614,395号，将其通过引用并入本文。这些技术包括持续测量损伤的平均直径，病原体生物量和腐烂植物组织的整体百分比。参见，例如Thomma et al.(1998)Plant Biology 95：15107-15111，通过引用将其并入本文。也参见以下实施例。
在一种实施方式中，提供了保护植物免受植物害虫的组合物和方法。在特定实施方式中，该方法产生的RNAi不会降低植物序列或来自非靶向动物的其他序列的表达水平，所述动物包括但不限于害虫的捕食者(即瓢虫幼虫、花蝽、草蛉、寄生蜂、或食蚜蝇幼虫)或动物例如人、哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物等。
本发明的病原体(害虫)包括但不限于病毒或类病毒、细菌、昆虫、线虫、真菌等等。病毒包括任何植物病毒，例如烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等。真菌病原体包括但不限于禾生刺盘孢(Colletotrichum graminocola)、玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodia maydis)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)。主要作物的特定病原体包括：大豆：大豆疫病菌(Phytophthora megasperma fsp.Glycinea)，大豆碳腐病菌(Macrophomina phaseolina)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，Diaporthe phaseolorum var.sojae(黑点病(Phomopsis sojae))，大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)，白绢病菌(Sclerotium rolfsii)，大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)，大豆灰斑病菌(Cercospora sojina)，大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica)，束状刺盘孢(Colletotrichum dematium(炭疽病菌(Colletotichum truncatum))，多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)，大豆褐纹病菌(Septoria glycines)，大豆灰星病菌(Phyllosticta sojicola)，互隔交链孢菌(Alternaria alternata)，丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)，野油菜黄单胞菌菜豆致病型(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)，大豆白粉病菌(Microsphaera diffusa)，半裸镰刀病菌(Fusarium semitectum)，大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)，大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)，大豆小从壳菌(Glomerella glycines)，烟草环斑病毒(Tobacco Ring spot virus)，烟草条纹病毒(Tobacco Streak virus)，豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)，瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，终极腐霉菌(Pythium ultimum)，德巴利腐霉菌(Pythium debaryanum)，番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)，大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)，镰孢菌(Fusarium solani)；卡诺拉大 豆：白锈菌(Albugo candida)，白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)，油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)，油菜环斑病菌(Mycosphaerella brassicicola)，终极腐霉菌(Pythium ultimum)，寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)，粉红镰刀菌(Fusarium roseum)，互隔交链孢菌(Alternaria alternata)；苜蓿：密执安棒杆菌诡谲亚种(Clavibacter michiganese subsp.Insidiosum)，终极腐霉菌(Pythium ultimum)，畸雌腐霉菌(Pythium irregulare)，华丽腐霉菌(Pythium splendens)，德巴利腐霉菌(Pythium debaryanum)，瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，大豆疫病菌(Phytophthora megasperma)，三叶草霜霉菌(Peronospora trifoliorum)，茎点霉苜蓿变种(Phoma medicaginis var.medicaginis)，苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)，苜蓿褐斑病菌(Pseudopeziza medicaginis)，苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，苜蓿黄萎病菌(Verticilliam albo-atrum)，胡萝卜细菌性叶斑病菌(Xanthomonas campestris p.v.alfalfae)，豌豆根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)，枯叶格孢腔菌匐柄霉(Stemphylium herbarum)，苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)，三叶草刺盘孢菌(Colletotrichum trifolii)，苜蓿小光壳菌(Leptosphaerulina briosiana)，条纹单胞锈菌(Uromyces striatus)，三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)，草木犀壳多孢菌(Stagonospora meliloti)，叶枯病菌(Stemphylium botryosum)，苜蓿纤毛菌(Leptotrichila medicaginis)；小麦：丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens)，小麦杆黑粉病菌(Urocystis agropyri)，野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestris p.v.translucens)，丁香假单胞杆菌桑树致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)，互隔交链孢菌(Alternaria alternate)，多主枝孢霉(Cladosporium herbarum)，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，燕麦链孢菌(Fusarium avenaceum)，黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)，小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)，小麦茎枯病菌(Ascochyta tritici)，麦类条斑病菌(Cephalosporium gramineum)，禾谷炭疽病菌(Collotetrichum graminicola)，小麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)，小麦秆锈病菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)，小麦叶锈菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)，小麦条锈菌(Puccinia striiformis)，小麦褐斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis)，小麦颖枯病病菌(Septoria nodorum)，小麦壳针孢(Septoria tritici)，燕麦壳针孢(Septoria avenae)，小麦基腐病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)，瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，多雄腐霉菌(Pythium arrhenomanes)，终极腐霉菌(Pythium ultimum)，小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)，大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus)，雀麦花叶病毒(Brome Mosaic Virus)，土传小麦花叶病毒(Soil Borne Wheat Mosaic Virus)，小麦线条花叶病毒(Wheat Streak Mosaic Virus)，小麦纺锤线条病毒(Wheat Spindle Streak Virus)，美洲小麦条纹病毒(American Wheat Striate Virus)，黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)，小麦腥黑穗病菌(Tilletia tritici)，Tilletia laevis，小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)，小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，Pythium arrhenomannes，Pythium gramicola，瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，高平原病毒(High Plains Virus)，欧洲小麦条纹病毒(European wheat striate virus)；向日葵：霍尔斯单铀霉(Plasmopora halstedii)，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，紫菀黄化病菌(Aster Yellows)，向日葵壳针孢(Septoria helianthi)，向日葵褐纹病菌(Phomopsis helianthi)，向日葵黑斑病菌(Alternaria helianthi)，百日草链格孢菌(Alternaria zinniae)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，茎点霉黑茎病菌(Phoma macdonaldii)，大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)，白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)，米根霉(Rhizopus oryzae)，少根根霉(Rhizopus arrhizus)，葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)，向日葵柄锈菌(Puccinia helianthi)，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，胡萝卜软腐菌胡萝卜致病亚种(Erwinia carotovorum pv.carotovora)，顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)，隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)，白锈菌(Albugo tragopogonis)；玉米：禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)，玉米顶腐病菌(Fusarium moniliforme var.subglutinans)，斯氏欧文菌(Erwinia stewartii)，轮状镰孢(F.verticillioides)，玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae(禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum))，玉米穗腐病菌(Stenocarpella maydi (马伊德壳色单隔孢(Diplodia maydis))，畸雌腐霉菌(Pythium irregulare)，德巴利腐霉菌(Pythium debaryanum)，禾草腐霉(Pythium graminicola)，华丽腐霉菌(Pythium splendens)，终极腐霉菌(Pythium ultimum)，瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)，黄曲霉菌(Aspergillus flavus)，玉米小斑病菌O、T(Bipolaris maydis O，T(玉米小斑菌(Cochliobolus heterostrophus)，玉米圆斑病菌I，II和III(Helminthosporium carbonum I，II & III(玉米圆斑菌(Cochliobolus carbonum))，玉米大斑病菌I，II和III(Exserohilum turcicum I，II & III)，蠕孢菌(Helminthosporium pedicellatum)，玉米褐斑病(Physoderma maydis)，玉米黄叶枯病菌(Phyllosticta maydis)，玉蜀黍球梗孢菌(Kabatiella maydis)，高粱紫斑病菌(Cercospora sorghi)，玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)，玉米锈病菌(Puccinia sorghi)，玉米多堆柄锈菌(Puccinia polysora)，枯腐菌(Macrophomina phaseolina)，草酸青霉(Penicillium oxalicum)，稻黑孢(Nigrospora oryzae)，禾黑芽枝霉(Cladosporium herbarum)，新月弯孢菌(Curvularia lunata)，不等弯孢(Curvularia inaequalis)，苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)，玉米高氏细菌性萎蔫病菌(Clavibacter michiganense subsp.nebraskense)，绿色木霉(Trichoderma viride)，玉米矮花叶病毒A&B(Maize Dwarf Mosaic Virus A&B)，小麦线条花叶病毒(Wheat Streak Mosaic Virus)，玉米黄萎病毒(Maize Chlorotic Dwarf Virus)，高粱麦角菌(Claviceps sorghi)，玉米细菌性叶疫病菌(Pseudonomas avenae)，水稻基腐病菌(Erwinia chrysanthemi pv.zea)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，谷物矮小螺原体(Cornstunt spiroplasma)，大孢壳色单隔孢(Diplodia macrospore)，Sclerophthora macrospora，大孢指疫霉(Peronosclerospora sorghi)，菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)，玉蜀黍指霜霉(Peronosclerosporamaydis)，甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)，高梁丝黑穗菌(Sphacelotheca reiliana)，玉米壳锈菌(Physopella zeae)，玉蜀黍头孢霉(Cephalosporium maydis)，顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)，玉米黄萎斑点病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)，高平原病毒(High Plains Virus)，玉米花叶病毒(Maize Mosaic Virus)，玉米雷亚多非纳病毒(Maize Rayado Fino Virus)，玉米线条病毒(Maize Streak Virus)，玉米条纹病毒(Maize Stripe Virus)，玉米粗矮缩病毒(Maize Rough Dwarf Virus)；高粱：玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，炭疽刺盘孢(C.sublineolum)，高粱紫斑病菌(Cercospora sorghi)，高粱铜斑病菌(Gloeocercospora sorghi)，高梁粗斑壳二孢(Ascochyta sorghina)，丁香假单胞杆菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)，油菜黄单胞菌绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris p.v.holcicola)，高粱假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)，紫柄锈菌(Puccinia purpurea)，枯腐病菌(Macrophomina phaseolina)，Perconia circinata，串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)，互隔交链孢菌(Alternaria alternate)，高粱疤斑病病菌(Bipolaris sorghicola)，高粱长蠕孢(Helminthosporium sorghicola)，新月弯孢菌(Curvularia lunata)，高梁茎点霉(Phoma insidiosa)，玉米细菌性叶疫病菌(Pseudomonas avenae (玉米疫病菌(Pseudomonas alboprecipitans))，高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)，高梁生座枝孢(Ramulispora sorghicola)，Phyllachara sacchari，玉米丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum(高梁丝黑穗菌(Sphacelotheca reiliana))，高梁轴黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)，高粱坚黑穗病(Sporisorium sorghi)，甘蔗花叶病毒H(Sugarcane mosaic H)，玉米矮花叶病毒A&B(Maize Dwarf Mosaic Virus A&B)，高粱麦角菌(Claviceps sorghi)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，枝顶孢霉(Acremonium strictum)，黄化萎缩病菌(Sclerophthona macrospora)，高粱霜霉病菌(Peronosclerospora sorghi)，菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)，禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，多雄腐霉(Pythium arrhenomanes)，禾草腐霉(Pythium graminicola)等。
线虫包括寄生线虫类例如根癌、胞囊和损伤线虫，包括胞囊线虫属(Heterodera spp.)，根结线虫属(Meloidogyne spp.)和球形胞囊线虫(Globodera spp.)；特别地，胞囊线虫的成员包括但不限于，大豆胞囊线虫(Heterodera glycines(soybean cyst nematode))；甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii(beet cyst nematode))；谷物胞囊线虫(Heterodera avenae(cereal cyst nematode))；和马铃薯球形胞囊线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯球形胞囊线虫(Globodera pailida(potato cyst nematodes))。损伤线虫包括根腐线虫属(Pratylenchus spp.)。
昆虫虫害包括选自以下目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、鞘翅目和鳞翅目。主要作物的本发明虫害包括：玉 米：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)；小地老虎，黑地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；美洲棉铃虫，棉铃虫(Helicoverpa zea，corn earworm)；草地贪夜蛾，秋夜娥(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；西南玉米螟(Diatraea grandiosella，southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟，小型玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；小蔗螟，甘蔗螟(Diatraea saccharalis，surgarcane borer)；玉米幼芽根叶甲，西部玉米根叶甲(Diabrotica virgifera，western corn rootworm)；长角叶甲，北部玉米根叶甲(Diabrotica longicornis barberi，northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲，南部玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi，southern corn rootworm)；叩头虫，金针虫(Melanotus spp.，wireworms)；北部圆头独角仙，北部圆头犀金龟(蛴螬)(Cyclocephala borealis，northern masked chafer(white grub))；无斑圆头独角仙，南部圆头犀金龟(蛴螬)(Cyclocephala immaculata，southern masked chafer(white grub))；日本金龟子，日本丽金龟(Popillia japonica，Japanese beetle)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria，corn flea beetle)；谷喙甲，玉米谷象(Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米蚜，玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis，corn leaf aphid)；玉蜀黍根蚜，玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis，corn root aphid)；麦长蝽，长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；迁徙蚱蜢(Melanoplussanguinipes，migratory grasshopper)；灰种蝇，种蝇(Hylemya platura，seedcorn maggot)；美洲黍潜叶蝇，玉米斑点潜叶虫(Agromyza parvicornis，corn blot leafminer)；玉米蓟马，暗蓟马(Anaphothrips obscrurus，grass thrips)；火蚁(Solenopsis milesta，thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；高粱：玉米螟(Chilo partellus，sorghum borer)；草地贪夜蛾，秋夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；棉铃虫，玉米夜蛾(Helicoverpa zea，corn earworm)；南美玉米苗斑螟，小型玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；粗粒夜蛾(reltia subterranea，granulate cutworm)；蛴螬(Phyllophaga crinita，white grub)；金针虫(Eleodes，Conoderus，and Aeolus spp.，wireworms)；橙足负泥虫(Oulema melanopus，cereal leaf beetle)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria，corn flea beetle)；玉米象虫(Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis；corn leaf aphid)；甘蔗黄蚜(Sipha flava，yellow sugarcane aphid)；长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola，sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus，carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；小麦：粘虫(Pseudaletia unipunctata，army worm)；草地贪夜蛾，秋夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；南美玉米苗斑螟，小型玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；西部夜蛾(Agrotis orthogonia，western cutworm)；南美玉米苗斑螟，小型玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；橙足负泥虫(Oulema melanopus，cereal leaf beetle)；三叶草叶象，车轴草叶象(Hypera punctata，clover leaf weevil)；南部玉米线虫(Diabrotica undecimpunctata howardi，southern corn rootworm)；俄罗斯麦蚜(Russian wheat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum，greenbug)；麦长管蚜(Macrosiphum avenae，English grain aphid)；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；殊种蝗(Melanopplus differentialis，differential grasshopper)；迁徙蚱蜢(Melanoplus sanguinipes，migratory grasshopper)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor，Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana，wheat midge)；麦秆蝇(Meromyza americana，wheat stem maggot)；麦种蝇(Hylemya coarctata，wheat bulb fly)；烟草蓟马(Frankliniella fusca，tobacco thrips)；灰翅麦茎蜂(Cephus cinctus，wheat stem sawfly)；小麦卷叶螨(Aceria tulipae，wheat curl mite)；向日葵：向日葵顶芽卷叶蛾(Suleima helianthana，sunflower bud moth)；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum，sunflower moth)；向日葵金龟(zygogramma exclamationis，sunflower beetle)；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus，carrot beetle)；向日葵籽摇蚊(Neolasioptera murtfeldtiana，sunflower seed midge)；棉花：绿棉铃虫(Heliothis virescens，cotton budworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，cotton bollworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella，pink bollworm)；棉铃象甲(Anthonomus grandis，boll weevil)；棉蚜(Aphis gossypii，cotton aphid)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus，cotton fleahopper)；温室粉虱(Trialeurodes abutilonea，bandedwinged whitefly)；牧草盲蝽(Lygus lineolaris，tarnished plant bug)；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；殊种蝗(Melanoplus differentialis，differential grasshopper)；烟蓟马，葱蓟马(Thrips tabaci，onion thrips)；烟草蓟马(Franklinkiella fusca，tobacco thrips)；朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus，carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；水稻：甘蔗螟(Diatraea saccharalis，sugarcane borer)；草地贪夜蛾，秋夜娥(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，corn earworm)；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea，grape colaspis)；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus，rice water weevil)；米象(Sitophilus oryzae，rice weevil)；黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus，riceleafhopper)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；绿色恶臭臭虫(Acrosternum hilare，green stink bug)；大豆：豆卷叶螟(Pseudoplusia includens，soybean looper)；豆青虫(Anticarsia gemmatalis，velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm)；欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)；黑地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)；绿棉铃虫(Heliothis virescens，cotton budworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，cotton bollworm)；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis，Mexican bean beetle)；烟桃蚜(Myzus persicae，green peach aphid)；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae，potato leafhopper)；绿色恶臭臭虫(Acrosternum hilare，green stink bug)；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；殊种蝗(Melanoplus differentialis，differential grasshopper)；灰种蝇(Hylemya platura，seedcorn maggot)；豆蓟马(Sericothrips variabilis，soybean thrips)；烟蓟马，葱蓟马(Thrips tabaci，onion thrips)；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani，strawberry spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；大麦：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)；黑地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum，greenbug)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；绿色恶臭臭虫(Acrosternum hilare，green stink bug)；褐臭蝽(Euschistus servus，brown stink bug)；灰地种蝇(Delia platura，seedcorn maggot)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor，Hessian fly)；麦长腿蜘蛛(Petrobia latens，brown wheat mite)；油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae，cabbage aphid)；蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae，Flea beetle)；蓓带夜蛾(Mamestra configurata，Bertha armyworm)；小菜蛾(Plutella xylostella，Diamond-back moth)；根蛆(Delia ssp.，Root maggots)。
在一种实施方式中，害虫是来自半翅目。半翅目包括四个亚目：胸喙亚目(例如蚜虫、粉虱)、头喙亚目(例如蝉、叶蝉)、鞘喙亚目和异翅亚目(例如臭蝽)。因此，组合物和方法可用于保护植物免于半翅目的任何成员，包括大叶蝉科、角蝉科、蜡蝉科、介壳虫、蚜科、长蝽科、蝽科、和盲蝽科。
在其它实施方式中，害虫来自草盲蝽属。草盲蝽属包括盲蝽科的超过40种植食性昆虫。如本文所用的，“草盲蝽”或“草盲臭蝽”用于表示草盲蝽属的任何成员。因此，组合物和方法也用于保护植物免于任何草盲蝽，包括例如多疤盲蝽(Lygus adspersus)，贺兰山盲蝽(Lygus alashanensis)，北部盲蝽(Lygus borealis)，Lygus elisus，青绿草盲蝽(Lygus gemellatus)，豆荚盲蝽(Lygus Hesperus)，牧草盲蝽(Lygus lineolaris)或Lygus rugulipennis。在特定实施方式中，该方法防治豆荚盲蝽。
在其它实施方式中，害虫来自鳞翅目。鳞翅目昆虫的毛虫和相关形式包括一重要组的尤其在生长的幼虫阶段期间的植食农业害虫。鳞翅目幼虫的饲喂方法通常包括咀嚼植物或植物部分。如本文所用，术语“鳞翅目”指鳞翅目的任何成员。在特定实施方式，本发明的组合物和方法防治鳞翅目幼虫(即毛虫)。因此，该组合物和方法还可以用于保护植物免于鳞翅目，包括例如菜粉蝶(Pieris rapae)，棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，桃透翅蛾(Synanthedon exitiosa)，Melittia cucurbitae，苹果蠹蛾(Cydia pomonella)，梨小食心虫(Grapholita molesta)，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，印度谷螟(Plodia interpunctella)，大蜡螟(Galleria mellonella)，烟草天蛾(Manduca sexta)，烟青虫(Manduca quinquemaculata)，舞毒蛾(Lymantria dispar)，棕尾毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)，黑地老虎(Agrotis ipsilon)或Spodoptera littoralis。在特定实施方式中，所述害虫是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
在其它实施方式中，害虫来自蚜科。此处所使用的术语“蚜科(Aphididae)”或“蚜虫(Aphid)”用于表示蚜虫科的任何成员。因此，组合物和方法也用于保护植物免于任何蚜虫，包括例如桃蚜(peach-potato aphid Myzus persicae)，豆蚜(the bean aphid Aphis fabae)，豌豆蚜(the pea aphid Acyrthosiphum pisun)，甘蓝蚜(the cabbage aphid Brevicoryne brassicae)，麦长管蚜(the grain aphid Sitobion avenae)，麦无网长管蚜(the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum)，俄罗斯麦蚜(麦双尾蚜)(the Russian wheat aphid Diuraphis noxia(Mordvilko))，麦长管蚜(the English grain aphid，Macrosiphum avenae)，麦二叉蚜(the greenbug aphid Schizaphisgraminum(Rondani))，胡萝卜埃二尾蚜(the carrot aphid Cavariella aegopodii)，马铃薯蚜(the potato aphid Macrosiphum euphorbiae)，豆蚜(the groundnut aphid Aphis craccivora)，棉蚜(the cotton aphid Aphis gossypii)，黑柑橘蚜(the black citrus aphid Toxoptera aurantii)，褐柑橘蚜(the brown citrus aphid Toxoptera ciidius)，柳蚜(the willow aphid Cavariella spp.)，玉米叶蚜(the corn leaf aphid Rhopalosiphum maidis)，禾谷缢管蚜(the aphid Rhopalosiphum padi)，柳叶蚜(the willow leaf aphids Chaitophorus spp.)，黑松蚜(the black pine aphids Cinara spp.)，美国梧桐蚜(the sycamore aphid Drepanosiphum platanoides)，云杉蚜(the spruce aphids Elatobium spp.)，绣线菊蚜(Aphis citricola)，芜菁蚜虫(Lipaphis pserudobrassicae(turnip aphid))，Nippolachnus piri，毛地黄蚜(the foxglove aphid Aulacorthum solani)，芦笋蚜(the asparagus aphid Brachycorynella asparagi)，棕色豚草蚜(the brown ambrosia aphid Uroleucon ambrosiae)，鼠李科蚜虫(the buckthorn aphid Aphis nasturtii)，玉米根部蚜虫(the corn root aphid Aphis maidiradicis)，the cresentmarked lily aphid Neomyzus circumflexes，金色蚜虫(the goldenglow aphid Dactynotus rudbeckiae)，忍冬蚜(the honeysuckle and parsnip aphid Hyadaphis foeniculi)，洋李梅蚜(the leafcurl plum aphid Brachycaudus helichrysi)，囊柄瘿绵蚜(the lettuce root aphid Pemphigus bursarius)，薄荷蚜(the mint aphid Ovatus crataegarius)，朝鲜蓟蚜(the artichoke aphid Capitophorus elaeagni)，洋葱蚜(the onion aphid Neotoxoptera formosana)，豌豆蚜(the pea aphid Macrosiphum pisi)，生锈梅蚜(the rusty plum aphid Hysteroneura setariae)，葱蚜(the shallot aphid Myzus ascalonicus)，茄根蚜(the solanum root aphid Smynthurodes betae)，甜菜根蚜(the sugarbeet root aphid Pemphigus betae)，百合西圆尾蚜(the tulip bulb aphid Dysaphis tulipae)，西方紫苑根蚜(the western aster root aphid Aphis armoraciae)，白紫苑根蚜(the white aster root aphid Prociphilus erigeronensis)。在特定实施方式中，该方法防治大豆蚜(the soybean aphid Aphis glycines)。
在一种实施方式中，害虫是植物汁液吸食昆虫。本文所使用的“植物汁液吸食昆虫”指的是，使用其可插入到植物中的尖利口部从植物维管系统中获取流体的植食性昆虫。在一种实施方式中，这些是直接以植物维管系统中的流体为食的昆虫。在插入位点，植物细胞还可以遭到破坏，不管其是否可以用作植物汁液吸食昆虫的食物来源。这些昆虫是植物害虫，因为其取食降低了其取食庄稼的生命力，并且它们能够传播病毒疾病。此外，这样的植物汁液吸食昆虫能够制造称为蜜露的富含糖的流体，其蓄积在植物的较低部位，这样的部位很快变得由被称为烟霉的特定黑色或褐色的真菌所覆盖，从而干扰光合作用。
包含在这样的植物汁液吸食昆虫中的是蚜虫(aphids)或同翅目蚜(Homopteran insects of the Aphididae)，并且本文所使用的植物汁液吸食昆虫包含但不限于，桃-马铃薯烟蚜(peach-potato aphid Myzus persicae)，豆蚜(the bean aphid Aphis fabae)，豌豆蚜(the pea aphid Acyrthosiphumpisun)，甘蓝蚜(the cabbage aphid Brevicoryne brassicae)，谷类蚜(the grain aphid Sitobion avenae)，蔷薇属谷类蚜(the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum)，俄罗斯麦蚜(麦双尾蚜)(the Russian wheat aphid Diuraphis noxia(Mordvilko))，麦长管蚜(the English grain aphid，Macrosiphum avenae)；麦二叉蚜(the greenbug aphid Schizaphis graminum(Rondani))，胡萝卜蚜(the carrot aphid Cavariella aegopodii)，马铃薯蚜(the potato aphid Macrosiphum euphorbiae)，落花生蚜(the groundnut aphid Aphiscraccivora)，棉蚜(the cotton aphid Aphis gossypii)，黑柑橘蚜(the black citrus aphid Toxoptera aurantii)，褐柑橘蚜(the brown citrus apid Toxoptera ciidius)，柳蚜(the willow aphid Cavariella spp.)，玉米叶蚜(the corn leaf aphid Rhopalosiphum maidis)，禾谷缢管蚜(the aphid Rhopalosiphum padi)，柳叶蚜(the willow leaf aphids Chaitophorus spp.)，黑松蚜(the black pine aphids Cinara spp.)，美国梧桐蚜(the Sycamore Aphid Drepanosiphum platanoides)，云杉蚜(the Spruce aphids Elatobium spp.)，绣线菊蚜(Aphis citricola)，小褐色飞虱(灰飞虱(Laodelphax striatellus)Lipaphis(small brown planthopper))，水稻褐色飞虱(Nilaparvata lugens(rice brown plant hopper))和白背水稻飞虱(Sogatella furcifera(white-backed rice planthopper))和叶蝉(Deltocephalidae)(或叶蝉(leafhoppers))例如Flexamia DeLong spp.，黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和黑尾夜蛾(Nephotettix virescens)，小叶绿蝉(Amrasca bigutulla)，和马铃薯小绿叶蝉(the potato leafhopper Empoasca filament)。除了网蝽科(Tingidae(或lace bugs))、木虱科(Psyllidae)昆虫和沫蝉科(spittle)臭虫之外，同样被包括在内的是蚧(又名介壳虫)，例如红圆蚧(Aonidiella aurantii(California red scale))，梨圆盾蚧(Comstockaspis perniciosa(San Jose scale))，桔盾蚧(Unaspis citri(citrus snow scale))，桃介壳虫(Pseudaulacaspis pentagona(white peach scale))，榄珠腊蚧(棕橄榄介壳虫)(Saissetia oleae(brown olive scale))，紫牡蛎蚧(紫介壳虫)(Lepidosaphes beckii(purple scale))，红腊蚧(Ceroplastes rubens(red wax scale))和吹绵介壳虫(Icerya purchasi(cottonycushion scale))。
还包含在植物汁液吸食昆虫中的是以植物维管系统为食的头喙部异翅目和半翅目昆虫，例如蝉科(例如蝉)、沫蝉科(沫蝉(spittlebugs)或沫蝉(froghoppers))、角蝉科(Membracoidea)(叶蝉(leafhoppers)和角蝉(treehoppers))以及蜡蝉科(飞虱科)(Fulgoroidea(planthoppers))，例如吮食棉籽的棉红蝽(异翅目红蝽科)，苹果酒窝盲蜷(the apple dimpling bug，Campylomma liebknechti)(半翅目盲蝽科)，和吸食棉花的昆虫害虫greenmirid，Creontiades dilutus，以及草盲蝽(半翅目盲蝽科，例如豆荚草盲蝽(Lygus hesperus))的汁液吸食昆虫。
II.靶序列
本文所用的“靶序列”包含害虫中期待降低表达水平的任何序列。在特定实施方式中，靶序列来自害虫。在进一步的实施方式中，降低害虫中靶序列水平防治害虫。例如，靶序列对于生长和发育可以是必需的。尽管靶序列可以在害虫中任何组织表达，在本发明的特定实施方式中，害虫中靶向抑制的序列在害虫的肠道组织的细胞、害虫的中肠的细胞，和肠道内腔或中肠衬层的细胞中表达。这样的靶序列可以涉及例如肠道细胞新陈代谢、生长或分化。
本发明靶序列的非限制性实例包括如在2008年1月17日提交的名称为“抑制源自草盲蝽的靶多核苷酸的组合物和方法”的美国临时专利申请US61/021,685，2008年1月17日提交的名称为“抑制源自鳞翅目的靶多核苷酸的组合物和方法”的美国临时专利申请US61/021,699，2008年10月28日提交的名称为“抑制源自蚜科的靶多核苷酸的组合物和方法”的美国临时专利申请US61/108,924中公开的多核苷酸。通过引用全文将以上每份申请并入本文。其他的可使用本发明的方法和组合物靶向的靶害虫序列进一步公开在例如WO 2005/049841，US 2005/0095199，WO01/37654和WO 2005/110068中，均通过引用全文将其并入本文。其他的靶序列示于SEQ ID NOS：1-58。
III.包含抑制增强元件的多核苷酸
在本发明的方法中，沉默元件和包含靶向序列或其活性片段或变体的抑制增强元件的联合表达导致与单独使用沉默元件表达可获得的相比，由沉默元件所产生的抑制性RNA的增强的扩增。本文所使用的“抑制增强元件”包括多核苷酸，所述多核苷酸包含待抑制的靶序列或其活性片段或变体。已认识的是，抑制增强元件无需和靶序列同一，而是，抑制增强元件可以包含靶序列的变体，只要抑制增强元件与靶序列具有足够的序列同一性(identity)，以致与单独使用沉默元件表达可获得的相比，由沉默元件产生的RNAi的水平提高。类似地，抑制增强元件可包含靶序列的片段，其中片段具有足够长度从而允许与单独使用沉默元件表达可获得的相比，由沉默元件产生的RNAi的水平提高。
可以使用进一步的同一靶序列的多抑制增强元件。例如，所使用的抑制增强元件可以包含源自靶序列的不同区域的靶序列片段(例如源自3’UTR，编码序列，内含子和/或5’UTR)。
IV.沉默元件
“沉默元件”指的是能够减少或消除靶多核苷酸或其编码多肽的水平或表达的多核苷酸。在特定实施方式中，沉默元件，当由昆虫摄食时特异性地减少或消除靶害虫序列的水平。所用沉默元件可以通过影响靶RNA转录本水平或可选地通过影响翻译并进而影响编码的多肽的水平而减少或降低靶序列的表达水平。本文他处公开了测验能够减少或降低感兴趣序列的水平的功能性沉默元件的方法。在本发明的方法中使用的单一多核苷酸可包含同样或不同靶多核苷酸的一个或多个沉默元件。本文所使用的“抑制性RNA”或“RNAi”指的是，能够以序列特异方式减少或消除靶多核苷酸或其所编码多肽的表达水平的RNA分子。
在特定实施方式中，靶序列不是植物内源基因。在其它实施方式中，当沉默元件防治害虫时，优选地，沉默元件对于正常的植物或植物部分没有影响。
如下文中进一步所述，沉默元件可以包含但不限于，双链RNA，miRNA，或发卡抑制元件。可应用于本发明的方法和组合物的沉默元件的非限制性实例包括，如在2008年1月17日提交的名称为“抑制源自草盲蝽的靶多核苷酸的组合物和方法”的美国临时申请US61/021,685、2008年1月17日提交的名称为“抑制源自鳞翅目的靶多核苷酸的组合物和方法”的美国临时申请US61/021,699、2008年10月28日提交的名称为“抑制源自蚜科的靶多核苷酸的组合物和方法”的美国临时申请US61/108,924中公开的多核苷酸。通过引用全文将以上每份申请并入本文。其他序列的可使用本发明的方法和组合物靶向的靶害虫序列进一步公开在例如WO 2005/049841，US 2005/0095199，WO 01/37654和WO2005/110068中，均通过引用全文将其并入本文。
“减少(reduces)”或“减少(reducing)”多核苷酸或由其编码多肽的表达水平的意思是，靶序列的多核苷酸或多肽水平在统计学上低于同样的靶序列在未暴露于沉默元件和抑制增强元件的适当对照中的多核苷酸水平或多肽水平。在本发明的特定实施方式中，根据本发明减少害虫中靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致，适当对照害虫中同样的靶序列的多核苷酸水平或由其编码的多肽水平的少于95％、少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％。本文他处讨论了测验RNA转录本水平、所编码多肽的水平、或多核苷酸或多肽活性的方法。
在特定实施方式中，沉默元件和抑制增强元件的联合表达与单独表达沉默元件时获得的水平相比，提高了植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部中抑制性RNA的浓度。本文所述“提高的抑制性RNA水平”包括联合表达的植物中所产生的RNAi水平与适当对照植物相比的任何统计学上显著的增加。例如，在植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平的增加可以包括，与适当对照相比，在植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1％、约1-5％、约5-10％、约10-20％、约20-30％、约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更多的增加。在其它实施方式中，在植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的增加可以包括，与适宜对照相比，在植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1倍、约1-5倍、约5-10倍、约10-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-60倍、约60-70倍、约70-80倍、约80-90倍、约90-100倍或更多的增加。本文他处讨论了测验RNAi水平增加的方法。
“双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包括至少一个能够形成dsRNA的转录本。从而，“dsRNA沉默元件”包括dsRNA、转录本或能够形成dsRNA的多核苷酸，或多于一个的转录本或能够形成dsRNA的多核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”指由单一自互补RNA分子形成的多核苷酸结构，或由至少两个不同RNA链的表达形成的多核苷酸结构。本发明的方法和组合物中采用的dsRNA)分子介导靶序列表达的降低，其例如通过以序列特异方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默。在特定实施方式中，dsRNA能够减少或降低害虫中靶多核苷酸或其编码多肽的水平或表达。
dsRNA能够通过影响靶RNA转录本水平、通过影响翻译从而影响编码多肽水平、或通过影响预转录水平的表达(例如通过染色质结构、甲基化模式等的调节，从而改变基因表达)而减少或消除靶序列的表达水平。参见，例如Verdel等人，(2004)Science 303：672-676；Pal-Bhadra等人，(2004)Science 303：669-672；Allshire(2002)Science 297：1818-1819；Volpe等人，(2002)Science 297：1833-1837；Jenuwein(2002)Science297：2215-2218；以及Hall等人，(2002)Science 297：2232-2237。本文他处公开了测验能够减少或消除感兴趣序列水平的功能性iRNA的方法。相应地，本文中所使用的术语“dsRNA”意在包括其他用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的术语，其包括例如小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、发卡RNA、短发卡RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其它。
在特定实施方式中，dsRNA的双链体或双链区域的至少一条链与靶多核苷酸共享足够的序列同一性或序列互补性，从而允许dsRNA减少靶序列的表达水平。如本文所用，与靶多核苷酸互补的链是“反义链”而与靶多核苷酸同源的链是“有义链”。
在一种实施方式中，dsRNA包括发卡RNA。发卡RNA包括能够折叠回其自身从而形成双链结构的RNA分子。可应用作为发卡元件的多重结构。在特定实施方式中，dsRNA抑制元件包含发卡元件，所述发卡元件按如下顺序包含：第一片段(segment)，第二片段和第三片段，其中第一和第三片段享有足够的互补性从而允许所转录RNA形成双链茎环结构。
发卡的“第二片段”包含“环”或“环状区域”。本文使用的这些术语是同义的，并应当被广义地理解，从而包含任何赋予足够柔性以允许多核苷酸互补区域(即形成发卡的茎的片段1和片段2)之间发生自我配对的核苷酸序列。例如，在一些实施方式中，环状区域可以基本上是单链的并作为发卡茎环的自互补区域之间的间隔子起作用。在一些实施方式中，环状区域可以包含随机或无义核苷酸序列，从而和靶多核苷酸没有序列同一性。在其他实施方式中，环状区域包含和靶多核苷酸具有同一性的有义或反义RNA序列或其片段。参见，例如，国际专利申请公开WO 02/00904，将其通过引用并入本文。在特定实施方式中，环状区域可以被优化为尽可能短同时仍然提供足够的分子内柔性从而允许形成碱基对的茎状区域。相应地，环状序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、15、10个核苷酸或更少。
发卡RNA分子的“第一”和“第三”片段包含发卡结构的碱基配对的茎。第一和第三片段互为反向重复并拥有足够的互补性从而允许碱基配对的茎状区域形成。在特定实施方式中，第一和第三片段是彼此充分互补的。可选地，第一和第三片段可以是彼此部分互补的，只要它们能够彼此杂交从而形成碱基配对的茎状区域。可以将第一和第三片段之间互补性的量计算为全片段的百分比。从而，发卡RNA的第一和第三片段通常拥有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，多至且包含100％互补性。
第一和第三片段长至少约1000、500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、15或10个核苷酸。在特定实施方式中，第一和/或第三片段的长度是约10-100个核苷酸，约10-约75个核苷酸，约10-约50个核苷酸，约10-约40个核苷酸，约10-约35个核苷酸，约10-约30个核苷酸，约10-约25个核苷酸，约10-约20个核苷酸。在其它实施方式中，第一和/或第三片段的长度包含至少10-20个核苷酸，20-35个核苷酸，30-45个核苷酸，40-50个核苷酸，50-100个核苷酸或100-300个核苷酸。参见例如国际专利申请公开WO 02/00904。在特定实施方式中，第一和/或第三片段包含与第一片段具有至少约85％互补性的至少20个核苷酸。在又一些实施方式中，形成发卡的茎状结构的第一和第三片段包含具有未配对核苷酸残基的3’或5’突出端。
在特定实施方式中，在第一、第二和/或第三片段中所用的序列包含设计为和感兴趣的靶多核苷酸具有足够序列同一性从而具有降低靶多核苷酸表达水平的能力的结构域。抑制性RNA转录本的特异性通常由沉默元件的这些结构域所赋予。因此，在本发明的一些实施方式中，沉默元件的第一、第二和/或第三片段包含结构域，所述结构域具有与靶多核苷酸享有足够序列同一性从而允许靶多核苷酸在适当细胞中表达时表达水平降低的至少10个、至少15个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少500个、至少1000个或者多于1000个核苷酸。在其它实施方式中，该结构域是约15-50个核苷酸、约20-35个核苷酸、约25-50个核苷酸、约20-75个核苷酸、约40-90个核苷酸、约15-100个核苷酸。
在特定实施方式中，第一、第二和/或第三片段的结构域具有和靶多核苷酸100％的序列同一性。在另外的实施方式中，与靶多肽同源的第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多肽的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三片段的结构域和靶多核苷酸的序列同一性仅仅是足够的以降低感兴趣靶多核苷酸的表达。参见，例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse及Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人，BMC Biotechnology 3：7；以及美国专利公开US20030175965，其中每一均通过引用被并入本文。Panstruga等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(通过引用并入本文)已经记载了对hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定法。
第一、第二和/或第三片段和靶多核苷酸之间所具有的互补性的量或第一片段和第三片段之间所具有的互补性的量(即发卡结构的茎)可以基于意欲控制基因表达的生物体而变化。某些生物体或细胞类型可能需要确切的配对或100％的同一性，而其他的一些生物体或细胞类型可以忍受一些错配。在某些细胞中，例如，在靶向序列中的单一核苷酸错配导致失去抑制基因表达的能力。在这些细胞中，本发明的抑制盒能够用于靶向抑制突变基因，例如转录本包含点突变的致癌基因，并且因此可以使用本发明的方法和组合物特异性靶向它们而不改变余下的野生型等位基因的表达。
靶多核苷酸的任何区域都可用以设计具有足够序列同一性从而允许发卡转录本的表达以降低靶多核苷酸水平的沉默元件的结构域。例如，可以将结构域设计成和靶多核苷酸的5’非翻译区、靶多核苷酸的3’非翻译区、靶多核苷酸的外显子区、靶多核苷酸的内含子区以及其任意组合具有序列同一性。在特定实施方式中，沉默元件的结构域和来自靶序列的核苷酸约1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、550-600、600-650、650-700、750-800、850-900、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000的至少约15个连续核苷酸具有足够的同源性。在一些实施方式中，为优化发卡中应用的siRNA序列，可以使用合成的寡脱氧核苷酸/RNAse H方法，以确定靶mRNA上处于对RNA沉默敏感的构象中的位点。参见例如，Vickers等人，(2003)J.Biol.Chem 278：7108-7118和Yang等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9442-9447，通过引用并入本文。这些研究显示，在RNase-H-敏感位点和促进有效的siRNA定向mRNA降解的位点之间存在明显的相关性。
也可以设计发卡沉默元件，以致有义序列或反义序列不对应靶多核苷酸。在该实施方式中，有义和反义序列位于包含与靶多核苷酸的全部或部分对应的核苷酸序列的环状序列的侧翼。因此，正是环状区域确定RNA干扰的特异性。参见例如WO02/00904，通过引用将其并入本文。
此外，可以通过使用发卡抑制元件来实现转录基因沉默(TGS)，其中发卡的反向重复与待沉默的靶多核苷酸的启动子区具有序列同一性。参见例如Aufsatz等人，(2002)PNAS 99(Supp1.4)：16499-16506和Mette等人，(2000)EMBO J 19(19)：5194-5201。
在其它实施方式中，dsRNA可以包含小RNA(sRNA)。sRNA可以包括微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)(Meister和Tuschl(2004)Nature431：343-349，以及Bonetta等人，(2004)Nature Methods 1：79-86)。miRNAs是包含约19个核糖核苷酸的调节剂，其在抑制靶多核苷酸表达方面有很高的效率。参见例如Javier等人，(2003)Nature 425：257-263，通过引用并入本文。对于miRNA干扰，可以将沉默元件设计为表达形成发卡结构的dsRNA分子，所述发卡结构包含和感兴趣的靶多核苷酸互补的19-核苷酸序列。可以合成制备miRNA，或将其转录为随后切割产生活性miRNA的更长的RNA。特定地，miRNA可以在有义方向包含和靶多核苷酸具有同源性的19个核苷酸的序列，以及与有义序列互补的19个核苷酸的相应反义序列。
当表达miRNA时，认为可转录多种形式的miRNA，包括例如初级转录本(称为“pri-miRNA”)，其通过多个解核(nucleolytic)步骤被加工成更短的前体miRNA(称为“pre-miRNA”)；pre-miRNA；或终(成熟)miRNA呈双链体，两条链是指miRNA(最终与靶碱基配对的链)和miRNA*。Pre-miRNA是从前体中去除miRNA/miRNA*双链体的dicer形式的底物，在所述的去除后，与siRNAs相似，双链体可以被带进RISC复合物。已经证实，miRNA可转基因表达并通过表达前体形式而非完整初级形式而有效(Parizotto et al.(2004)Genes & Development 18：2237-2242和Guo etal.(2005)Plant Cell 17：1376-1386)。
本发明的方法和组合物采用沉默元件，其转录时“形成”dsRNA分子。因此，正表达的异源多核苷酸本身不需要形成dsRNA，但可与细胞或者(在特定实施方式中)取食后的害虫肠中的其他序列相互作用以允许形成dsRNA。例如，通过将含有miRNA或siRNA靶序列的嵌合构建体表达成与待沉默的一个或多个基因的所有或部分相对应的序列，可生成可选择性沉默靶多核苷酸的嵌合多核苷酸。在这个实施方式中，当miRNA或siRNA的靶与细胞中存在的miRNA相互作用时“形成”dsRNA。然后所得的dsRNA可降低待沉默的一个或多个基因的表达水平。参见，例如2005年6月17日提交的美国临时申请第60/691,613号，名称为“基因沉默的方法和组合物”，通过引用将其并入本文。构建体可设计成具有内源miRNA的靶或可选地在构建体中可采用异源和/或合成miRNA的靶。如果采用异源和/或合成miRNA，它可在与嵌合多核苷酸相同的核苷酸构建体上或单独的构建体上被导入细胞。如本文别处所讨论的，可使用任何方法导入含有异源miRNA的构建体。
V.变体和片段
“片段”是指部分多核苷酸或部分的由此编码的氨基酸序列和因此的蛋白。多核苷酸片段可编码保留天然蛋白生物活性的蛋白片段。可选地，用作沉默元件或抑制增强元件的多核苷酸片段不需要编码保留生物活性的蛋白。因而，核苷酸序列片段的范围可以是至少约10、约15、约20个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸和多达本发明所采用的全长多核苷酸。本文在别处描述了测验所需沉默元件或抑制增强元件活性的方法。
“变体”表示基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包括在天然多核苷酸内的一个或多个内部位点删除和/或增加一个或多个核苷酸和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点取代一个或多个核苷酸。如本文所用的，“天然”多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括因为遗传密码简并性编码本发明所采用多肽之一的氨基酸序列的那些序列。变体多核苷酸也包括合成源的多核苷酸，例如通过使用定点突变生成的但仍保留所需活性的那些。通常地，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所测定的，本发明特定多核苷酸(即沉默元件)的变体与该特定多核苷酸具有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列同一性。
也可通过比较变体多核苷酸编码的多肽和参照多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比，来估算本发明特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体。可使用本文别处所述的序列比对程序和参数来计算任两个多肽之间的序列同一性百分比。通过比较它们编码的两个多肽共享的序列同一性百分比来估算本发明所采用的任意给定多核苷酸对时，两个编码多肽之间的序列同一性百分比为至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性。
“变体”蛋白表示通过在天然蛋白的一个或多个内部位点上删除或增加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白的一个或多个位点上取代一个或多个氨基酸而由天然蛋白衍生的蛋白。本发明包括的变体蛋白是有生物活性的，即它们仍拥有天然蛋白所需的生物活性，如本文别处所讨论的。这种变体可由例如基因多态性或人为操作所产生。如通过本文别处所述序列比对程序和参数所测定的，天然蛋白的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列具有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白可以只有1-15个氨基酸残基，只有1-10，例如6-10，只有5，只有4，3，2或甚至1个氨基酸残基的区别。
以下术语用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参照序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，和(d)“序列同一性百分比”。
(a)如本文所用的，“参照序列”是用作序列比较基础的确定序列。参照序列可以是完整的特定序列或子集；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整cDNA或基因序列。
(b)如本文所用的，“比较窗口”表示多核苷酸序列的邻近和特定片段，其中在比较窗口中的多核苷酸序列与用于两个多核苷酸最佳比对的参照序列(其不含有添加或删除)相比可含有添加或删除(即空位)。通常地，比较窗口在长度上是至少20个邻近核苷酸，和任选地可以是30，40，50，100或更长。本领域技术人员可理解的是，为避免由于在多核苷酸序列中包含空位而造成的与参照序列的高相似性，通常引入空位罚分，并将其从配对数中减去。
除非另有规定，本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP第10版采用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3的核苷酸序列％同一性和％相似性，和nwsgapdna.cmp评分阵列；使用GAP权重8和长度权重2的氨基酸序列％同一性和％相似性，和BLOSUM62评分阵列；或任何等效程序。“等效程序”是指任何序列比较程序，其可为讨论的任何两个序列生成与GAP第10版生成的相应比对相比，具有相同核苷酸或氨基酸残基配对和相同的序列同一性百分比的比对。
(c)如本文所用的，两个多核苷酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”是指，当在特定比较窗口内为最大对应而比对时，两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比用于指示蛋白时，认为不同一的残基位置的区别通常是保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代上有区别时，序列同一性百分比可向上调整以校正取代的保守特性。通过这种保守取代区别的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。通常这涉及将保守取代作为部分而非全部错配评分，由此增加序列同一性百分比。因而，例如在相同氨基酸被评为1分，非保守取代被评为0分时，保守取代被评为0到1之间。计算保守取代的评分，例如应用PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)程序。
(d)如本文所用的，“序列同一性百分比”表示通过比较在比较窗口内两个最佳比对序列所测定的值，其中与用于两个序列最佳比对的参照序列(不含有添加或删除)相比，在比较窗口中的部分多核苷酸序列可含有添加或删除(即空位)。百分比的计算可通过测定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量而产生配对位置数量，将配对位置数量除以比较窗口中位置总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
VI.DNA构建体
使用术语“多核苷酸”并非意在将本发明限制为含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认为，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明的多核苷酸也包括所有形式的序列，其包括但不限于单链形式，双链形式，卡发，茎环结构等。
本发明方法和组合物中采用的编码沉默元件和/或抑制增强元件的多核苷酸可提供在用于在感兴趣植物或生物体中表达的表达盒中。认为可使用多沉默元件和/或抑制增强元件。例如，可使用多相同沉默元件和/或多相同抑制增强元件；靶向靶序列不同区域的多沉默元件和/或靶向靶序列不同区域的多抑制增强元件；来自不同靶序列的多沉默元件和/或来自不同靶序列的多抑制增强元件。
认为每个沉默元件可包含在单个或单独的盒、DNA构建体或载体中。相似地，含有抑制增强元件的一个或多个多核苷酸可在单个或多构建体或载体中。同样地，发现两个元件(即沉默元件和抑制增强元件)可在单独的DNA构建体和/或载体中或可选地包含在相同构建体和/或载体中。如上所述，涉及提供沉默元件和/或抑制增强序列的任何手段。可用含有编码一个或多个沉默元件和/或抑制增强元件的DNA的单个盒转化宿主细胞、例如植物或植物细胞，或含有每一沉默元件和/或抑制增强元件的单独的盒可用于转化植物或植物细胞或宿主细胞。同样地，用一种组分转化的宿主细胞或植物随后可用另一组分进行转化。也可通过有性杂交集合一个或多个沉默元件和/或抑制增强元件。即，含有一种组分的第一植物与含有另一组分的第二植物杂交。杂交而来的后代植物会含有这两种组分。
表达盒可包括可操作连接至本发明多核苷酸的5’和3’调控序列。“可操作连接”表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，本发明多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的可操作连接是允许表达本发明多核苷酸的功能性连接。可操作连接元件可以是邻近的或不相邻的。当用于表示连接两个蛋白编码区时，可操作连接是指编码区在相同阅读框中。盒可以还含有至少一个待共转化至生物体的另外的多核苷酸。可选地，该另外的多核苷酸可提供在多表达盒中。表达盒可与用于插入多核苷酸使其处于调控区的转录调控下的多个限制性位点和/或重组位点一起提供。表达盒可另外地含有选择性标记基因。
表达盒在5’-3’转录方向上可包括在植物中有功能的转录和翻译起始区(即启动子)，含有沉默元件和/或抑制增强元件的多核苷酸，和转录和翻译终止区(即终止区)。本发明采用的调控区(即启动子，转录调控区，和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞或对彼此可以是天然的/类似物的。可选地，本发明采用的调控区和/或多核苷酸可以是与宿主细胞异源的或彼此异源的。如本文所用的，“异源的”是指源自外来物种、或虽然来自相同物种但通过有意的人为干预在组成和/或基因组位点上自其天然形式实质修饰的序列。例如，可操作连接至异源多核苷酸的启动子是来自不同于多核苷酸源自物种的物种，或虽然来自相同/类似物种，之一或两者自它们的原始形式和/或基因组位点实质修饰，或启动子不是用于可操作连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用的，嵌合基因含有可操作连接至与编码序列异源的转录起始区上的编码序列。
终止区与转录起始区可以是天然的，与编码沉默元件的可操作连接的多核苷酸可以是天然的，与植物宿主可以是天然的，或可衍生自对该启动子、含有沉默元件的多核苷酸、植物宿主、或其任意组合而言的另一来源(即外来或异源)。便利的终止区可从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau etal.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。
已知附加序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包含消除编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，和可能对基因表达不利的其他如此良好表征的序列。序列的G-C含量可调整至给定细胞宿主的平均水平，其计算参照宿主细胞中表达的已知基因。如果可能，修饰序列以避免预知的发卡二级mRNA结构。
在表达盒的制备中，可操作多种DNA片段，以便提供处于正确方向和适当时正确阅读框的DNA序列。为此，可采用适配子(adapter)或连接子来连接DNA片段，或包括其他操作以提供方便的限制性位点，去除多余的DNA，去除限制性位点等。为此，可包括体外诱变，引物修复，限制，退火，再取代，例如转换和颠换。
在本发明实践中可使用多个启动子。编码沉默元件的多核苷酸可与组成型、组织优选或用于植物表达的其他启动子联合。
这类组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和WO99/43838和美国专利第6,072,050号中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
也可采用可诱导启动子例如病原体诱导启动子。这种启动子包括来自致病相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在感染病原体之后被诱导；例如PR蛋白，SAR蛋白，β-1，3-葡聚糖酶，壳多糖酶等。参见例如Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes et al.(1992)Plant Cell4：645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。也参见WO99/43819，通过引用将其并入本文。
感兴趣的是在位于或邻近病原体感染部位局部表达的启动子。参见例如Marineau et al.(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。也参见Chen et al.(1996)Plant J.10：955-966；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner et al.(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利号5,750,386(线虫可诱导的)和本文引用的参考文献。特别感兴趣的是玉米PRms基因的可诱导启动子，可通过病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导其表达(参见例如Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。
此外，病原体通过创伤或昆虫损伤进入植物，因而创伤可诱导启动子可用于本发明的构建。这种创伤可诱导启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(systemin)(McGurl et al.(1992)Science225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J. 6(2)：141-150)；等等，通过引用将其并入本文。
化学调控启动子通过应用外源的化学调控剂可用于调节植物中的基因表达。根据目的，启动子可以是化学可诱导启动子，其中应用化学品诱导基因表达，或化学可抑制启动子，其中应用化学品抑制基因表达。化学可诱导启动子是本领域已知的，包括但不限于玉米In2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草安全剂激活的，玉米GST启动子，其是通过用作萌发前除草剂的疏水性亲电子化合物激活的，和烟草PR-1a启动子，其是通过水杨酸激活的。感兴趣的其他化学调控启动子包括类固醇应答启动子(参见例如在Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素可诱导启动子)和四环素可诱导和四环素可抑制启动子(参见例如Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)，通过引用将其并入本文。
组织优选启动子可用于在特定植物组织内靶向增强表达。组织优选启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen et al.(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco et al.(1993)PlantMol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad. Sci.USA90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要，这种启动子可被修饰用于弱表达。
叶片优选启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor et al.(1993)Plant J.3：509-18；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
根部优选启动子是已知的，并且可从许多可用文献中选择或从多种兼容物种中从头分离。参见例如Hire et al.(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根部特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(在法国菜豆的GRP1.8基因中的根部特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根瘤农杆菌甘露碱(mannopine)合酶(MAS)基因的根部特异性启动子)；和Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码细胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根部和根瘤中表达)。也参见Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述从固氮非豆类Parasponia andersonii和相关的非固氮非豆类Trema tomentosa的血红蛋白基因中分离的两个根部特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖苷酸酶报告基因连接，并将其导入非豆类烟草(Nicotiana tabacum)和豆类百脉根(Lotus corniculatus)，在两种情况中都保留了根部特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述对生根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中高度表达的rolC和rolD根部诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们总结了在这些启动子中增强子和组织优选DNA决定簇是解离的。Teeri et al.(1989)使用与lacZ融合的基因，以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别有活性，而TR’2基因在完整植物中是根部特异性的，并受叶片组织创伤刺激，是特别期望的可与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的特征的组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1’基因显示出相似特征。其他根部优选启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol. 29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691)。也参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。
在本发明的一种实施方式中，植物表达启动子是维管特异性启动子例如韧皮部特异性启动子。如本文所用的，“维管特异性”启动子是至少在维管细胞中表达的启动子，或优选在维管细胞中表达的启动子。维管特异性启动子的表达无需局限在维管细胞中，也可以在其他细胞类型或组织中表达。如本文所用，“韧皮部特异性启动子”是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达启动子，或优选在韧皮部细胞中表达的启动子。
韧皮部特异性启动子的表达无需局限在韧皮部细胞中，也可以在其他细胞类型或组织例如木质部组织中表达。在本发明的一种实施方式中，韧皮部特异性启动子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达启动子，其中与在韧皮部细胞中的表达相比，在非韧皮部细胞中的表达更受限(或不表达)。根据本发明的适当维管特异性或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自以下的启动子：SCSV3，SCSV4，SCSV5和SCSV7启动子(Schunmann et al.(2003)Plant Functional Biology 30：453-60；生根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolC基因启动子(Kiyokawa et al.(1994)Plant Physiology 104：801-02；Pandolfini et al.(2003)BioMedCentral(BMC)Biotechnology 3：7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Graham et al.(1997)Plant Mol.Biol.33：729-35；Guivarc′h et al.(1996)；Almon et al.(1997)Plant Physiol.115：1599-607；生根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolA基因启动子(Dehio et al.(1993)Plant Mol.Biol.23：1199-210)；根瘤农杆菌T-DNA基因5的启动子(Korber et al.(1991)EMBO J.10：3983-91)；水稻蔗糖合酶RSs1基因启动子(Shi et al.(1994)J.Exp.Bot.45：623-31)；CoYMV或鸭跖草黄化斑驳病毒(Commelina yellow mottle badnavirus)启动子(Medberry et al.(1992)Plant Cell4：185-92；Zhou et al.(1998)Chin.J.Biotechnol.14：9-16)；CFDV或椰子叶腐病毒启动子(Rohde et al.(1994)Plant Mol.Biol.27：623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol.79：1495-99)；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒启动子(Yin和Beachy(1995)Plant J.7：969-80；Yin et al.(1997)Plant J.12：1179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因(Edwards et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3459-63；Brears et al.(1991)Plant J.1：235-44)；马铃薯转化酶基因的inv CD111和inv CD141启动子(Hedley et al.(2000)J.Exp.Botany 51：817-21)；Kertbundit et al.(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88：5212-16)显示了从拟南芥分离的启动子在烟草中具有韧皮部特异性表达；VAHOX1启动子区(Tornero et al.(1996)Plant J.9：639-48)；豌豆细胞壁转化酶启动子(Zhang et al.(1996)Plant Physiol.112：1111-17)；与美国公开专利申请20030106097壳多糖酶相关的内源棉花蛋白的启动子，来自胡萝卜的酸转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenz et al.(1993)The Plant J.4：545-54)；硫酸盐转运蛋白基因Sultr1的启动子；3(Yoshimoto et al.(2003)Plant Physiol.131：1511-17)；蔗糖合酶基因启动子(Nolte和Koch(1993)Plant Physiol.101：899-905)；和烟草蔗糖转运蛋白基因启动子(Kuhn et al.(1997)Science 275-1298-1300)。
可能的启动子还包括野樱苷水解酶的黑樱桃启动子(PH DL1.4PRO)(美国专利第6,797,859号)，来自黄瓜和水稻的硫氧还蛋白H启动子(Fukuda A et al.(2005).Plant Cell Physiol.46(11)：1779-86)，水稻(RSs1)(Shi，T.Wang et al.(1994).J.Exp.Bot.45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang.，N-S.et al.(1990)PNAS 87：4144-4148)，来自南瓜的PP2启动子(Guo，H.et al.(2004)Transgenic Research 13：559-566)，At SUC2启动子(Truernit，E.et al.(1995)Planta 196(3)：564-70.，At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV.et al.(1996)Planr.Cell.Physiol.37(8)：1108-1115)，和水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasiet al.(1993)Plant J.4(1)：71-79)。
表达盒也可含有选择性标记基因用于选择转化细胞。可利用选择性标记基因选择转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些，以及赋予对除草剂化合物抗性的基因，所述除草剂化合物例如草胺磷，溴苯腈，咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸盐(2，4-D)。其他选择性标记包括表型标记例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter et al.(2004)Plant Cell16：215-28)，青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science117：943-54和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129：913-42)和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte et al.(2004)J.Cell Science117：943-54)。对于其他选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318；Yao et al.(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu et al.(1987)Cell 48：555-566；Brown et al.(1987)Cell 49：603-612；Figge et al.(1988)Cell 52：713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)博士论文，海德堡大学；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)博士论文，海德堡大学；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology(实验药理学手册)，Vol.78(Springer-Verlag，柏林)；Gill et al.(1988)Nature334：721-724。通过引用将这些公开文献并入本文。以上选择性标记基因的列表并非意在限制。本发明可使用任何选择性标记基因。
VII.多种含有沉默元件的组合物
在一实施例中，用DNA构建体或表达盒转化植物或宿主细胞，以表达至少一个沉默元件和/或表达抑制增强元件。认为组合物可含有细胞(例如植物细胞或细菌细胞)，其中编码沉默元件的多核苷酸和含有抑制增强元件的多核苷酸可稳定并入基因组并可操作连接至在细胞中有活性的启动子。
认为含有编码沉默元件和抑制增强元件的序列的多核苷酸可用于转化生物体，从而为宿主生物体提供产生这些组分，和随后将宿主生物体应用于靶害虫环境。这种宿主生物体包括杆状病毒，细菌等。用这种方式，经适宜载体将编码沉默元件的多核苷酸的组合导入微生物宿主，和将所述宿主应用于环境、或植物或动物。
将核酸插入细胞的术语“导入”表示“转染”或“转化”或“转导”并包括将核酸并入真核细胞或原核细胞，其中核酸可稳定并入细胞基因组(例如染色体，质粒，质体，或线粒体DNA)，转化成自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
可以选择已知占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”(叶面，叶圈，根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供编码沉默元件的序列和靶序列的稳定维持和表达，和期望地在保护该组分免受环境降解和灭活上的改良。
这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣是微生物例如细菌，例如假单胞菌(Pseudomonas)，欧文氏菌(Erwinia)，沙雷氏菌(Serratia)，克雷伯菌(Klebsiella)，黄单胞菌(Xanthomonas)，链霉素菌(Streptomyces)，根瘤菌(Rhizobium)，红色假单胞菌(Rhodopseudomonas)，Methylius，农杆菌(Agrobacterium)，醋杆菌(Acetobacter)，乳杆菌(Lactobacillus)，节杆菌(Arthrobacter)，固氮菌(Azotobacter)，明串珠菌(Leuconostoc)和产碱菌(Alcaligenes)，真菌特别是酵母例如酵母菌(Saccharomyces)，隐球菌(Cryptococcus)，克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)，掷孢酵母菌(Sporobolomyces)，红酵母(Rhodotorula)，和短梗霉菌(Aureobasidium)。特别感兴趣的是这种植物圈细菌物种，例如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，木醋杆菌(Acetobacter xylinum)，农杆菌(Agrobacteria)，球形红色假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)，平原黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)，真养产碱菌(Alealigenes entrophus)，木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter yinlandir)，和植物圈酵母物种例如深红酵母(Rhodotorula rubra)，粘红酵母(R.glutinis)，海滨红酵母(R.marina)，橙黄红酵母(R.aurantiaca)，白色隐球菌(Cryptococcus albidus)，流散隐球菌(C.diffluens)，罗伦隐球菌(C.laurentii)，玫瑰酵母菌(Saccharomyces rosei)，圆酵母(S.pretoriensis)，酿酒酵母(S.cerevisiae)，玫瑰掷孢酵母(Sporobolomyces rosues)，芳香掷孢酵母(S.odorus)，克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)，和茁芽短梗霉菌(Aureobasidium pollulans)。特别感兴趣的是着色微生物。
多种方式可用于在允许稳定维持和表达如下核苷酸序列的条件下，将含有沉默元件和/或抑制增强元件的多核苷酸导入微生物宿主中。例如，可构建表达盒，其包含与用于表达核苷酸构建体的转录和翻译调控信号可操作连接的感兴趣的核苷酸构建体，和与宿主生物体序列同源的核苷酸序列，由此会发生整合，和/或在宿主中有功能的复制体系，由此会发生整合或稳定维持。
转录和翻译调控信号包括但不限于启动子，转录起始启动位点，操作子(operator)，激动子(activator)，增强子，其他调控元件，核糖体结合位点，起始密码子，终止信号等。参见例如美国专利号5,039,523和4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook et al.(2000)；Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第3版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)；Davis et al.(1980)Advanced Bacterial Genetics(高级细菌遗传学)(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；和本文引用的参考文献。
适宜的宿主细胞包括原核生物和低等真核生物，例如真菌。示例性原核生物，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性，包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，志贺氏菌(Shigella)，沙门氏菌(Salmonella)，和变性杆菌(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)，例如根瘤菌(Rhizobium)；螺旋菌科(Spirillaceae)，例如发光细菌(photobacterium)，发酵单胞菌(Zymomonas)，沙雷氏菌(Serratia)，气单胞菌(Aeromonas)，弧菌(Vibrio)，脱硫弧菌(Desulfovibrio)，螺旋菌(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌(Pseudomonas)和醋杆菌(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。在真核生物之中是真菌，例如藻菌(Phycomycetes)和子囊菌(Ascomycetes)，其包括酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)和裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)；和担子酵母(Basidiomycetes yeast)，例如红酵母(Rhodotorula)，短梗霉菌(Aureobasidium)，掷孢酵母菌(Sporobolomyces)等。
为本发明目的，在选择宿主细胞中特别感兴趣的特征包括将编码序列轻松导入宿主，表达体系的可用性，表达效率，宿主稳定性和辅助遗传能力的存在。用作杀虫剂微胶囊的感兴趣特征包括保护性性质，例如厚细胞壁，染色和细胞内包装或包涵体的形成；叶片亲和力；缺乏哺乳动物毒性；吸引害虫摄取等等。其他考虑点包括容易形成和处理，经济，储存稳定性等等。
特别感兴趣的宿主生物体包括酵母，例如红色酵母菌属(Rhodotorulaspp.)，短梗霉菌属(Aureobasidium spp.)，酵母菌属(Saccharomyces spp.)，和掷孢酵母菌属(Sporobolomyces spp.)，叶面生物体例如假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，欧文氏菌属(Erwinia spp.)和黄杆菌属(Flavobacterium spp.)，和其他这种生物体，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等等。
本发明包括的编码沉默元件和/或抑制增强元件的序列可以被导入可在植物(附生菌)中繁殖的微生物中，以将这些组分递送至潜在的靶害虫。附生菌例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
沉默元件和/或抑制增强元件可在细菌宿主中发酵，并加工所得细菌，将其用作微生物喷雾，其按照与苏云金杆菌菌株被用作杀昆虫喷雾的相同的方法。任何适宜微生物可用于该目的。假单胞菌已被用来将苏云金杆菌内毒素表达为包囊蛋白，并加工所得的细胞，将其作为杀昆虫剂喷雾，Gaertner et al.(1993)，Advanced Engineered Pesticides(高级工程化杀虫剂)，ed.L.Kim(Marcel Decker，Inc.)。
可选地，通过将异源基因导入细胞宿主可产生本发明的组分。异源序列的表达直接或间接导致在细胞内产生沉默元件和靶序列。然后可以将这些组合物按照常规技术制剂，应用在宿有靶害虫的环境中，例如土壤，水和植物叶片。参见例如EPA0192319和本文引用的参考文献。
在本发明中，可将转化的微生物与可接受载体制剂成单独或组合的组合物，其可以是例如悬浮液，溶液，乳液，散粉，可分散颗粒，可润湿粉末和可乳化浓缩液，气溶胶，浸透颗粒，佐剂，可涂覆糊剂，也可包囊在例如聚合物物质中。
以上公开的这种组合物可通过添加表面活性剂，惰性载体，防腐剂，润湿剂，饲喂刺激物，吸引剂，包囊剂，粘合剂，乳化剂，染料，UV保护剂，缓冲剂，流动剂或肥料，微量营养素供体，或影响植物生长的其他制剂而获得。一种或多种农业化学品包括但不限于除草剂，杀昆虫剂，杀真菌剂，杀细菌剂，杀线虫剂，杀软体动物剂，杀螨剂，植物生长调控剂，落叶剂和肥料可与载体，表面活性剂或制剂领域常规采用的佐剂或其他组分分组合，以促进产品处理和应用于特定靶害虫。适宜的载体和佐剂可以是固体或液体，并对应在制剂技术中常规采用的物质，例如天然或再生矿物质，溶剂，分散剂，润湿剂，增稠剂，粘合剂或肥料。本发明的活性成分(即至少一种沉默元件)通常以组合物形式应用，并可应用于待处理的作物区域，植物或种子。例如，组合物可在准备在粮仓或地窖等储存时或储存期间应用于谷物。组合物可与其它化合物同时应用或与其他化合物依次应用。应用活性成分或包含至少一种沉默元件的组合物的方法包括但不限于，叶敷、种子涂覆和土壤应用。应用的数量和应用速率取决于相应害虫的侵扰强度。
适宜表面活性剂包括但不限于，阴离子化合物例如金属羧酸盐；长链脂肪酸羧酸盐；N-酰基肌氨酸酯；脂肪醇乙氧基化物的磷酸单或双酯或这种酯的盐；脂肪醇硫酸盐例如十二烷基硫酸钠，十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基苯酚硫酸盐；木质素硫酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如丁基萘磺酸盐；磺酸盐萘甲醛缩合物的盐；磺酸盐苯酚甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐例如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺酸缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如磺酸钠或琥珀酸二辛酯。非离子剂包括脂肪酸酯，脂肪醇，脂肪酰胺或脂肪烷基或烯基取代苯酚与氧化乙烯的缩合产物，多元醇的脂肪酸酯，例如山梨糖醇脂肪酸酯，这种酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物，炔乙二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基化炔乙二醇。阳离子表面活性剂的实例包括例如脂肪族单、双或聚胺例如乙酸盐，环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通过羧酸与双或聚胺缩合制备的酰胺连接胺；或季铵盐。
惰性材料的实例包括但不限于，无机矿物质例如高岭土，硅酸盐，碳酸盐，硫酸盐，磷酸盐或植物材料例如软木，粉状玉米芯，花生壳，稻壳和胡桃壳。
含有沉默元件和抑制增强元件的组合物可以以适宜形式直接应用或作为原始组合物的浓缩物，其在应用前需要用适量水或其他稀释剂稀释。
组合物(包括转化的微生物)可在害虫开始出现时或在害虫出现之前作为保护措施，通过例如喷雾，雾化，撒粉，散播，涂覆或倾注，导入土壤里或土壤上，导入灌溉水中，通过种子处理或一般应用或撒粉应用于昆虫害虫的环境。例如，组合物和/或转化的微生物可与谷物混合，以在储存期间保护谷物。在植物生长早期良好防治害虫通常是很重要的，因为这个时间植物可以被最严重地损害。组合物可方便地包含另一杀昆虫剂，如果必要的话。在本发明的一种实施方式中，组合物可在种植的时候，以载体和杆状菌菌株或本发明转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式，直接应用于土壤。另一实施方式是含有农业化学品例如除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体和杆状菌菌株或本发明的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。
XII.植物，植物部分，和导入序列至植物的方法
在一种实施方式中，本发明的方法包括将多肽或多核苷酸导入植物。“导入”表示以序列能够进入植物细胞内部的方式，向植物呈递多核苷酸或多肽。本发明的方法不依靠将序列导入植物的特定方法，只要多核苷酸或多肽能够进入植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽导入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法，瞬时转化方法，和病毒介导方法。
“稳定转化”表示被导入植物的核苷酸构建体整合到植物基因组并能够通过其后代遗传。“瞬时转化”表示多核苷酸被导入植物且不整合到植物基因组中或多肽被导入植物中。
转化方案以及将多肽或多核苷酸序列导入植物的方案可依据转化的靶植物或植物细胞的类型即单子叶或双子叶而变化。将多肽和多核苷酸导入植物细胞的适宜方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，农杆菌介导转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)，直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道颗粒加速度(参见例如美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和5,932,782；Tomes et al.(1995)于Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养：基础方法)，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926)；和Lecl转化(WO00/28058)。也参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro CellDev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein etal.(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm etal.(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合)；De Wet et al.(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant CellReports 9：415-418和Kaeppler et al.(1992)Theor：.Appl.Genet.84：560-566(噬菌体颈须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell4：1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology14：745-750(经根瘤农杆菌的玉米)；通过引用将其全部并入本文。
在特定实施方式中，可以使用多种瞬时转化方法将沉默元件序列和/或抑制增强元件提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于，将蛋白或其变体和片段直接导入植物或将转录本导入植物。这种方法包括例如显微注射或颗粒轰击。参见例如Crosswayet al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784，通过引用将其全部并入本文。可选地，使用本领域已知技术可将多核苷酸瞬时导入植物。这种技术包括病毒载体体系和以防止随后的DNA释放的方式沉淀多核苷酸。因而，可以出现来自颗粒结合DNA的转录，但大幅降低了其释放并整合到基因组中的频率。这种方法包括使用包被聚乙二胺亚胺的颗粒(PEI；Sigma#P3143)。
在其他实施方式中，可通过植物与病毒或病毒核酸的接触，将沉默元件和/或抑制增强元件导入植物。通常地，这种方法包括将本发明核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子内。此外，认为本发明的启动子也包括通过病毒RNA聚合酶转录所使用的启动子。将多核苷酸导入植物并在其中表达编码蛋白、包括病毒DNA或RNA分子的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191，5,889,190，5,866,785，5,589,367，5,316,931，和Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；通过引用将它们并入本文。
在植物基因组的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一种实施方式中，通过位点特异性重组体系实现在所需基因组位置插入多核苷酸。参见例如WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855和WO99/25853，通过引用将它们全部并入本文。简而言之，本发明的多核苷酸可包含在侧翼连接两个非重组发生重组位点的转移盒中。将转移盒导入植物，所述植物使侧翼连接与转移盒位点对应的两个非重组发生重组位点的靶位点稳定地并入其基因组。提供适当重组酶，而转移盒整合至靶位点。感兴趣的多核苷酸由此整合至植物基因组的特定染色体位置中。
被转化的细胞按照常规方式可生长成植物。参见，例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后这些植物生长，用相同转化株或不同株授粉，并鉴别具有组成型表达所需表型特征的所得后代。可生长两代或更多世代以确保所需表型特征的表达稳定保持并遗传，然后收集种子以确保实现表达所需表型特征。在这种方式中，本发明提供了具有稳定并入其基因组的本发明多核苷酸、例如本发明的表达盒的转化种子(也称为“转基因种子”)。
如本文所用的，术语植物包括植物细胞，植物原生质体，可再生成植物的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物团块和植物或植物部分例如胚，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果核，穗，穗轴，壳，茎，根，根尖，花药等等中完整的植物细胞。谷粒表示由商业生长者为非生长或再生物种目的而生产的成熟种子。再生植物的后代，变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分含有被导入的多核苷酸。
本发明可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶和双子叶。感兴趣的植物物种实例包括但不限于，玉米(Zea mays)，芸薹属(例如B.napus，B.rapa，B.juncea)，特别是用作种子油来源的那些芸薹属物种，苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟(例如黑粟(Pennisetum glaucum)，黄米(Panicum miliaceum)，小米(Setaria italica)，指粟(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)，番薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananas comosus)，柑橘树(Citrus spp.)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(Musa spp.)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Olea europaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳洲坚果(Macadamia integrifolia)，杏(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(Saccharum spp.)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物，和针叶树类。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)，莴苣(例如Lactuca sativa)，青豆(Phaseolus vulgaris)，利马豆(Phaseolus limensis)，豌豆(Lathyrus spp.)，和甜瓜属成员例如黄瓜(C.sativus)，香瓜(C.cantalupensis)，和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)，八仙花(Macrophyllahydrangea)，木槿(Hibiscus rosasanensis)，玫瑰(Rosa spp.)，郁金香(Tulipaspp.)，水仙花(Narcissus spp.)，牵牛花(Petunia hybrida)，康乃馨(Dianthus caryophyllus)，猩猩木(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
本发明实践可采用的针叶树类包括例如松树例如火炬松(Pinus taeda)，沼泽松(Pinus elliotii)，美洲黄松(Pinus ponderosa)，黑松(Pinus contorta)，和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉例如银枞(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；和雪松例如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施方式，本发明的植物是作物植物(例如玉米，苜蓿，向日葵，芸薹属，大豆，棉花，红花，花生，高粱，小麦，粟，烟草等)。在其他实施方式中，玉米和大豆植物是最佳的，在其他实施方式中玉米植物是最佳的。
感兴趣的其他植物包括提供感兴趣种子的谷物植物，油料种子植物，和豆科植物。感兴趣种子包括谷物种子，例如玉米，小麦，大麦，水稻，高粱，黑麦等。油料种子植物包括棉花，大豆，红花，向日葵，芸薹属，玉米，苜蓿，棕榈，椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括谷柯，槐豆，胡芦巴，大豆，青刀豆，豇豆，绿豆，利马豆，蚕豆，扁豆，鹰嘴豆等。
在一种实施方式中，具有联合表达沉默元件和抑制增强元件或其片段的植物、植物细胞和植物部分具有相对于沉默元件单独表达可实现的，由沉默元件产生的增强水平的抑制性RNA。
在特定实施方式中，系统性产生RNAi发生在整个植物中。在其它实施方式中，当与仅表达沉默元件构建体的对照相比时，本发明的植物或植物部分具有改善的RNAi至韧皮部的装载，从而通过RNAi途径提供更好的对韧皮部饲喂昆虫的防治。在特定实施方式，本发明的植物、植物部分和植物细胞还可以具有特征，如允许产生多样性RNAi物种种群，其可增强阻断靶基因表达的效率。
XI.使用方法
提供了增加靶序列特异抑制性RNA浓度的方法。方法包括沉默元件和抑制增强元件在细胞中的联合表达。在特定实施方式中，方法包括将第一多核苷酸和第二多核苷酸导入植物细胞，第一多核苷酸含有害虫靶序列的抑制性RNA前体和第二多核苷酸含有抑制增强元件，其中沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了害虫靶序列特异抑制性RNA在植物细胞中的浓度。在其它实施方式中，沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了害虫靶序列特异抑制性RNA在含有植物细胞的植物韧皮部中的浓度。
还提供了防治害虫的方法，包括用植物细胞饲喂害虫，该植物细胞含有包含害虫靶序列的沉默元件的第一多核苷酸和包含抑制增强元件的第二多核苷酸。在特定实施方式中，沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了害虫靶序列特异抑制性RNA在植物细胞中的浓度。
通过多种方式用沉默元件饲喂害虫。例如，在一种实施方式中，将含有沉默元件和抑制增强元件的多核苷酸导入植物中。随着植物或其表达这些序列的部分饲喂害虫，RNAi被递送至害虫。当沉默元件和/或抑制增强元件通过这种方式被递送至植物时，认为两种多核苷酸或其一可组成型表达，或可选择地，通过采用本文别处讨论的多种可诱导或组织优选或发育调控启动子，以阶段特异性方式产生两者或其一。例如，沉默元件和抑制增强元件可在气生植物组织、例如叶、茎、花等中表达。在其他实施方式中，沉默元件和抑制增强元件是在根部表达。在这些实施方式中，半翅目例如葡萄木虱可以是靶向的。
在某些实施方式中，本发明的构建体可以叠加任何组合的感兴趣多核苷酸序列，以获得具有所需性状的植物。如本文所用的，性状是指源自特定序列或序列组的表型。例如，本发明多核苷酸可叠加编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸，例如其他苏云金杆菌毒性蛋白(在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser et al.(1986)Gene 48：109中描述的)、外源凝集素(VanDamme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825)，pentin(美国专利号5,981,722中描述的)等。生成的组合也可包括任一感兴趣多核苷酸的多个拷贝。本发明多核苷酸也可叠加任何其他基因或基因组合，以产生具有多种所需性状组合的植物，所述性状包括但不限于，动物饲喂所需的性状例如高油基因(例如美国专利号6,232,529)；平衡氨基酸(例如硫素(hordothionins)(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359；和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的消化性(例如修饰的储存蛋白(2001年11月7日提交的美国申请流水号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请流水号10/005,429))；通过引用将其公开内容并入本文。
本发明的多核苷酸也可叠加疾病或除草剂抗性所需的性状(例如烟曲霉毒素脱毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones etal.(1994)Science 266：789；Martin et al.(1993)Science 262：1432；Mindrinos et al.(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂例如草胺磷或草丁膦(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和加工或加工产品所需性状例如高油(例如美国专利号6,232,529)；修饰油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；修饰淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)，和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶，聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酸-CoA还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基脂肪酸酯(PHAs)表达)；通过引用将其公开内容并入本文。也可将本发明的多核苷酸与提供农业性状例如雄性不育(例如参见美国专利号5.583,210)、茎强度、开花时间或转化技术性状例如细胞周期调控或基因打靶(例如WO 99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821)的多核苷酸组合；通过引用将其公开内容并入本文。
通过任何方法可获得这些叠加组合，所述方法包括但不限于，通过任何常规或顶交(TopCross)方法的杂交育种植物，或基因转化。如果通过基因转化植物叠加序列，可在任何时候按任何顺序组合感兴趣多核苷酸序列。例如，含有一个或多个所需性状的转基因植物可作为靶以通过随后转化导入更多性状。性状可按共转化方案与转化盒的任何组合提供的感兴趣多核苷酸同时导入。例如，如果导入两个序列，这两个序列可包含在单独的转化盒(反式)或包含在相同转化盒(顺式)。序列的表达可由相同启动子或不同启动子驱动。在某些情况下，可能希望导入会抑制感兴趣多核苷酸表达的转化盒。这可与其他抑制盒或过表达盒的任何组合相组合，以在植物中生成性状的所需组合。还认为使用位点特异性重组体系可将多核苷酸序列叠加在所需基因组位置上。参见例如WO99/25821，WO99/25854，WO99/25840，WO99/25855和WO99/25853，通过引用将它们全部并入本文。
以解释而非限制的方式提供如下实施例。
实验
实施例1：靶序列，沉默元件和抑制增强元件
经RNAi阻断昆虫基因功能可产生针对靶昆虫的特异活性。通过转基因植物递送dsRNA可增强这种特异性。如上所述，提供了方法和组合物，其通过抑制增强元件和沉默元件的联合表达增加RNAi的水平，所述抑制增强元件含有靶序列或其片段或变体。图1提供了来自鳞翅目的全长靶序列的非限制性实例，其可用于设计用于联合表达的适宜抑制增强元件和/或沉默元件。表1提供了可用于本发明方法的引物和它们各自的靶序列的非限制实例。
在特定实施方式中，抑制增强元件含有希望被抑制的部分或完整序列。例如，SEQ ID NOS：1-58所示序列。这种抑制序列可置于适宜的调控元件的控制之下，并可以是用于递送沉默元件的相同或不同转化载体的部分，或作为用于共转化感受态植物或细胞、或二次转化此前用沉默元件转化的细胞或植物的第二载体。
表1(注意：表1所示的正义引物序列和反义引物序列可生成在3’端具有2个胸腺嘧啶残基。)
| 害虫序列 | 靶序列 | 引物1 | 引物2 | SEQ ID(靶序列：引物1：引物2) |
| ise1c.pk002.m13 | AACATGGTATCCGACTTCAGGAA | CAUGGUAUCCGACUUCAGG | CCUGAAGUCGGAUACCAUG | 59/60/61 |
| AAGGTCGCTGACGAGAACAAGGA | GGUCGCUGACGAGAACAAG | CUUGUUCUCGUCAGCGACC | 62/63/64 | |
| AAGTGTCCTGGGCTTGAGTTCCA | GUGUCCUGGGCUUGAGUUC | GAACUCAAGCCCAGGACAC | 65/66/67 | |
| ise1c.pk003.f7 | AAGAAGAAGCTCCTCCACGTGTT | GAAGAAGCUCCUCCACGUG | CACGUGGAGGAGCUUCUUC | 68/69/70 |
| AAGGTCGCTGACGAGAAC | GGUCGCUGACGAG | CUUGUUCUCGUCA | 71/72/73 | |
| 害虫序列 | 靶序列 | 引物1 | 引物2 | SEQ ID(靶序列：引物1：引物2) |
| AAGGA | AACAAG | GCGACC | ||
| AATGTCCTGGGGCTGAGTTTCAA | UGUCCUGGGGCUGAGUUUC | GAAACUCAGCCCCAGGACA | 74/75/76 | |
| ise1c.pk005.a15 | AAGAATAAGCTCCTCCACGTGTT | GAAUAAGCUCCUCCACGUG | CACGUGGAGGAGCUUAUUCtt | 77/78/79 |
| AATTTGTCGAGGAGACCCTATTG | U UUGUCGAGGAGACCCUAU | AUAGGGUCUCCUCGACAAA | 80/81/82 | |
| AAGTTCGCGTTCACTCTTGAAGA | GUUCGCGUUCACUCUUGAA | UUCAAGAGUGAACGCGAAC | 83/84/85 | |
| ise1c.pk006.d24 | AACTGCCCCTTAACCTCATCTAT | CUGCCCCUUAACCUCAUCU | AGAUGAGGUUAAGGGGCAG | 86/87/88 |
| AATCACGCTGAAACCACTGTATA | UCACGCUGAAACCACUGUA | UACAGUGGUUUCAGCGUGA | 89/90/91 | |
| ise2c.pk009.i4 | AAAATATGGCGCGCCTATTGTTT | AAUAUGGCGCGCCUAUUGUtt | ACAAUAGGCGCGCCAUAUU | 92/93/94 |
| AACGTTCTCGGTCTTTCACTGCT | CGUUCUCGGUCUUUCACUGtt | CAGUGAAAGACCGAGAACG | 95/96/97 | |
| AAGTCATCGTTCCAAGTCTACCT | GUCAUCGUUCCAAGUCUAC | GUAGACUUGGAACGAUGAC | 98/99/100 | |
| ise2c.pk001.d19 | AACCCCTTGAATGTTAAGGTCGG | CCCCUUGAAUGUUAAGGUC | GACCUUAACAUUCAAGGGG | 101/102/103 |
| AAGTACACCATGTTGCAAGTATG | GUACACCAUGUUGCAAGUA | UACUUGCAACAUGGUGUAC | 104/105/106 | |
| AACGTGTCCATGATGGCTGACTC | CGUGUCCAUGAUGGCUGAC | GUCAGCCAUCAUGGACACG | 107/108/109 |
| ise2c.pk001.e14 | AAACCTACAAAATGGCCGAAAAC | ACCUACAAAAUGGCCGAAA | UUUCGGCCAUUUUGUAGGU | 110/111/112 |
| AATCTACGGACCCTTCTTTGGAG | UCUACGGACCCUUCUUUGG | CCAAAGAAGGGUCCGUAGA | 113/114/115 | |
| ise2c.pk001.f20 | AACTCTGACGTCATCATCTACGT | CUCUGACGUCAUCAUCUAC | GUAGAUGAUGACGUCAGAG | 116/117/118 |
| AAGTGCTTGGGTAACCCCGACAG | GUGCUUGGGUAACCCCGAC | GUCGGGGUUACCCAAGCAC | 119/120/121 | |
| AACTGGCTCATCTCCTACAGCAA | CUGGCUCAUCUCCUACAGC | GCUGUAGGAGAUGAGCCAG | 122/123/124 | |
| ise2c.pk010.h3 | AAACAGTGCGTCGTAATATATTC | ACAGUGCGUCGUAAUAUAU | AUAUAUUACGACGCACUGU | 125/126/127 |
| AAGGCACATGGTCCTTCACTGAT | GGCACAUGGUCCUUCACUG | CAGUGAAGGACCAUGUGCC | 128/129/130 | |
| AACACCATGACCCTCGTGTACAA | CACCAUGACCCUCGUGUAC | GUACACGAGGGUCAUGGUG | 131/132/133 | |
| ise2c.pk007.k24 | AACGAGGCCGGATCTCTTAAGCA | CGAGGCCGGAUCUCUUAAG | CUUAAGAGAUCCGGCCUCG | 134/135/136 |
| AACTTCACACATAACTAGACAAA | CUUCACACAUAACUAGACA | UGUCUAGUUAUGUGUGAAG | 137/138/139 |
| AATGCGTGGCGATTTCAAACTTA | UUAGAAAUUAUAAGCCCAG | CUGGGCUUAUAAUUUCUAA | 140/141/142 | |
| ise2c.pk011.a10 | AAAAAACACAGACCACGTTCACA | AAAACACAGACCACGUUCA | UGAACGUGGUCUGUGUUUU | 143/144/145 |
| AATCGATGGTGGTGTTATTCGCT | UCGAUGGUGGUGUUAUUCG | CGAAUAACACCACCAUCGA | 146/147/148 | |
| ise2c.pk011.h12 | AAAGAAAATGCTACGCGTTACGA | AGAAAAUGCUACGCGUUAC | GUAACGCGUAGCAUUUUCU | 149/150/151 |
| AACCCTTGGACACTACTGGAAGA | CCCUUGGACACUACUGGAA | UUCCAGUAGUGUCCAAGGG | 152/153/154 | |
| AAGGATCCTATGTGTACCAGGTT | GGAUCCUAUGUGUACCAGG | CCUGGUACACAUAGGAUCC | 155/156/157 | |
| ise2c.pk001.d22 | AAACTCGGCACACAACACAATGG | ACUCGGCACACAACACAAU | AUUGUGUUGUGUGCCGAGU | 158/159/160 |
| AATACGAAGATATCTGCCC | UACGAAGAUAUCU | AAGGGCAGAUAUC | 161/162/163 | |
| 害虫序列 | 靶序列 | 引物1 | 引物2 | SEQID(靶序列：引物1：引物2) |
| TTCC | GCCCUU | UUCGUA |
| AATCAACAGCTCTTACATAAATG | UCAACAGCUCUUACAUAAA | UUUAUGUAAGAGCUGUUGA | 164/165/166 | |
| ise2c.pk001.d9 | AAAGAAGATCAGAAGATTGGCCG | AGAAGAUCAGAAGAUUGGC | GCCAAUCUUCUGAUCUUCU | 167/168/169 |
| AAAAGCCGTCTGCTATCCAACAA | AAGCCGUCUGCUAUCCAAC | GUUGGAUAGCAGACGGCUU | 170/171/172 | |
| AATGCTAAATGCCATGCTTGCAT | UGCUAAAUGCCAUGCUUGC | GCAAGCAUGGCAUUUAGCA | 173/174/175 | |
| ise2c.pk001.i23 | AAGATCAGAAGATTGGCCGGAAG | GAUCAGAAGAUUGGCCGGA | UCCGGCCAAUCUUCUGAUC | 176/177/178 |
| AATTCTTCAGCAAATCGATACCA | UUCUUCAGCAAAUCGAUAC | GUAUCGAUUUGCUGAAGAA | 179/180/181 | |
| AAATGCTGTCAAGAGGATTTAAA | AUGCUGUCAAGAGGAUUUA | UAAAUCCUCUUGACAGCAU | 182/183/184 | |
| ise2c.pk001.124 | AAGCTCGAGACTTGCTCTTGATG | GCUCGAGACUUGCUCUUGA | UCAAGAGCAAGUCUCGAGC | 185/186/187 |
| AACTGTTAGCTCAAGGTCTGCTA | CUGUUAGCUCAAGGUCUGC | GCAGACCUUGAGCUAACAG | 188/189/190 | |
| AAGACTTTCTATCAGAATTTGCG | GACUUUCUAUCAGAAUUUG | CAAAUUCUGAUAGAAAGUC | 191/192/193 |
| ise2c.pk005.b9 | AAACTTAATCATGGACGACGACA | ACUUAAUCAUGGACGACGA | UCGUCGUCCAUGAUUAAGU | 194/195/196 |
| AAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGAG | AGAAGAAGAAGAAGAAGGG | CCCUUCUUCUUCUUCUUCU | 197/198/199 | |
| AAGATCAAGAGAATGTCGAGGAT | GAUCAAGAGAAUGUCGAGG | CCUCGACAUUCUCUUGAUC | 200/201/202 | |
| ise2c.pk002.m10 | AAAATCGTCGGTTTTAGCGACGT | AAUCGUCGGUUUUAGCGAC | GUCGCUAAAACCGACGAUU | 203/204/205 |
| AACTGTCAATAGGCAGTATGCGT | CUGUCAAUAGGCAGUAUGC | GCAUACUGCCUAUUGACAG | 206/207/208 | |
| AACCTGTACCAACAGACCACTGG | CCUGUACCAACAGACCACU | AGUGGUCUGUUGGUACAGG | 209/210/211 | |
| ise2c.pk001.c14 | AACCAAAAATGGGCAAGGAAAAG | CCAAAAAUGGGCAAGGAAA | UUUCCUUGCCCAUUUUUGG | 212/213/214 |
| AACGTGGTATCACCATCGATATT | CGUGGUAUCACCAUCGAUA | UAUCGAUGGUGAUACCACG | 215/216/217 | |
| AACAAAATGGACTCCACTGAGCC | CAAAAUGGACUCCACUGAG | CUCAGUGGAGUCCAUUUUG | 218/219/220 | |
| ise2c.pk001.d16 | AATCCGTGACTAACCAAAAATGG | UCCGUGACUAACCAAAAAU | AUUUUUGGUUAGUCACGGA | 221/222/223 |
| AACATTGTCGTCATTGGACACGT | CAUUGUCGUCAUUGGACAC | GUGUCCAAUGACGACAAUG | 224/225/226 | |
| ise2c.pk005.h3 | AATTTGTGAGACTGGTGGCCGAA | UUUGUGAGACUGGUGGCCG | CGGCCACCAGUCUCACAAA | 227/228/229 |
| AATCTGATTGTATTCGCCCCCTC | UCUGAUUGUAUUCGCCCCC | GGGGGCGAAUACAAUCAGA | 230/231/232 | |
| AACACTCTAGTTCTGCCTATTCT | CACUCUAGUUCUGCCUAUU | AAUAGGCAGAACUAGAGUG | 233/234/235 | |
| ise2c.pk001.d21 | AACACACATCACAATGGCGGATA | CACACAUCACAAUGGCGGA | UCCGCCAUUGUGAUGUGUG | 236/237/238 |
| AAGGATGGCATCATCGGCAAGAA | GGAUGGCAUCAUCGGCAAG | CUUGCCGAUGAUGCCAUCC | 239/240/241 | |
| AAAGGCTTCATCGACACCGCGAA | AGGCUUCAUCGACACCGCG | CGCGGUGUCGAUGAAGCCU | 242/243/244 | |
| ise2c.pk001.j9 | AAACTCCAATTATAACCTACTAG | ACUCCAAUUAUAACCUACU | AGUAGGUUAUAAUUGGAGU | 245/246/247 |
| AAGTACAAGGATCTGATCGGCAA | GUACAAGGAUCUGAUCGGC | GCCGAUCAGAUCCUUGUAC | 248/249/250 | |
| AAGACTTTCTTCATGTGGCCCAT | GACUUUCUUCAUGUGGCCC | GGGCCACAUGAAGAAAGUC | 251/252/253 |
| 害虫序列 | 靶序列 | 引物1 | 引物2 | SEQ ID(靶序列：引物1：引物2) |
| ise2c.pk002.f12 | AAACAAAGTATCGCCTACACCGC | ACAAAGUAUCGCCUACACC | GGUGUAGGCGAUACUUUGU | 254/255/256 |
| AATAGCGTCGATCTTCAACGACT | UAGCGUCGAUCUUCAACGA | UCGUUGAAGAUCGACGCUA | 257/258/259 | |
| ise2c.pk001.b14 | AACTCATAGAGCTTGATGTGTGG | CUCAUAGAGCUUGAUGUGU | ACACAUCAAGCUCUAUGAG | 260/261/262 |
| AAGATGTGGATGACGTCACTGGT | GAUGUGGAUGACGUCACUG | CAGUGACGUCAUCCACAUC | 263/264/265 | |
| AACCTTCCTGATTCTCTTCTGTG | CCUUCCUGAUUCUCUUCUG | CAGAAGAGAAUCAGGAAGG | 266/267/268 | |
| ise2c.pk003.f2 | AACAGTGCTTGTGATAAGTGAAC | CAGUGCUUGUGAUAAGUGA | UCACUUAUCACAAGCACUG | 269/270/271 |
| AAGTTAATGGTGACTGCCCTCGA | GUUAAUGGUGACUGCCCUC | GAGGGCAGUCACCAUUAAC | 272/273/274 | |
| AATAAAGCGATGACCCCATAGGA | UAAAGCGAUGACCCCAUAG | CUAUGGGGUCAUCGCUUUA | 275/276/277 |
| ise2c.pk005.120 | AAACGGTACTGCAGCAAAAAGAC | ACGGUACUGCAGCAAAAAG | CUUUUUGCUGCAGUACCGU | 278/279/280 |
| AAGCTGCATACTTCTTGGCTCTC | GCUGCAUACUUCUUGGCUC | GAGCCAAGAAGUAUGCAGC | 281/282/283 | |
| AAATGTTTACAGAGACGCGATGA | AUGUUUACAGAGACGCGAU | AUCGCGUCUCUGUAAACAU | 284/285/286 | |
| ise2c.pk001.d1 | AACGTCGATCTTACCGAGTTCCA | CGUCGAUCUUACCGAGUUC | GAACUCGGUAAGAUCGACG | 287/288/289 |
| ise2c.pk001.k6 | AATTCAAAATGCGTGAGTGCATC | UUCAAAAUGCGUGAGUGCA | UGCACUCACGCAUUUUGAA | 290/291/292 |
| AAATCGTAGACCTAGTCCTCGAC | AUCGUAGACCUAGUCCUCG | CGAGGACUAGGUCUACGAU | 293/294/295 | |
| ise2c.pk001.12 | AAACTCAATTCAAAATGCGTGAG | ACUCAAUUCAAAAUGCGUG | CACGCAUUUUGAAUUGAGU | 296/297/298 |
| AACTTATCACTGGTAAGGAAGAT | CUUAUCACUGGUAAGGAAG | CUUCCUUACCAGUGAUAAG | 299/300/301 | |
| ise2c.pk002.b4 | AAGAGTTACGAACCGTCACCATA | GAGUUACGAACCGUCACCA | UGGUGACGGUUCGUAACUC | 302/303/304 |
| AAACTTAGTCCGGATAATGAACC | ACUUAGUCCGGAUAAUGAA | UUCAUUAUCCGGACUAAGU | 305/306/307 |
| AAGGCGATGTACGAGAACCTGTT | GGCGAUGUACGAGAACCUG | CAGGUUCUCGUACAUCGCC | 308/309/310 | |
| ise2c.pk001.j16 | AACGACAAGATGCTGAAGGAGAC | CGACAAGAUGCUGAAGGAG | CUCCUUCAGCAUCUUGUCG | 311/312/313 |
| ise2c.pk006.h23 | AAGATAAAGGTCGCGTGTGGACC | GAUAAAGGUCGCGUGUGGA | UCCACACGCGACCUUUAUC | 314/315/316 |
| AATGTCAAGACTGATCCAAACAC | UGUCAAGACUGAUCCAAAC | GUUUGGAUCAGUCUUGACA | 317/318/319 | |
| AACATTCGAGTCTGAACAGGTGG | CAUUCGAGUCUGAACAGGU | ACCUGUUCAGACUCGAAUG | 320/321/322 |
表2公开的数据是如下得到的：
微滴饲喂测验：
对第一龄幼虫饲喂在含有蓝色食品色素的20％蔗糖溶液中的21bpdsRNA引物对(50微摩尔)。该引物在任一端具有2bp的突出端。引物序列是基于来自秋夜娥内部cDNA文库的基因。靶基因的选择是基于对文献的浏览，文献指出，在其他物种中，它们是可扰乱的靶，或基于预测该基因对昆虫的发育或生理至关重要。两小时之后，大部分幼虫消耗了溶液。然而，仅将具有蓝色胃道的幼虫转移至干净的人工饮食中(没有dsDNA并入饮食)。经计算，昆虫消耗了大约200nl的流体。48小时之后，检查与饲喂蔗糖的昆虫和饲喂阴性对照Ambion引物的昆虫阴性对照相比生长迟缓的昆虫。
注射测验：
向初生或第二龄秋夜娥注射浓度为2μg/μl的多种RNA引物对。使用30×放大倍数的解剖显微镜，在显微操作器和微量移液器的辅助下进行注射。每只昆虫注射大约200nL，并注射到昆虫的血腔而非胃道中。注射Ambion阴性对照引物对的显示出接近100％的存活率。仅有的一例死亡很可能是由于机械性损伤。这些注射测验显示了基于该浓度下的所测试秋夜娥序列的大部分引物对的强烈的杀昆虫活性。然后注射浓度范围为2μg/μl-0.125μg/μl的2个引物。在最高级观察到死亡，而在更低级，观察到生长迟缓。估计EC50浓度为大约0.6μg/μl。
基于饮食的局部饲喂测验：
用浓度为0.67μg/μl的引物对进行测验。在100μl饮食中应用5μl样品，4次观察/样品。实验重复4次。在72小时，评分昆虫的生长迟缓和死亡率。在这些测验中，某些引物对证实了不一致的活性，而一些引物对证实了一致的活性。不一致很可能是至少部分地出于计分者(我)对生长迟缓的不一致定义。我们希望通过采用扫描分析仪以今后计分平板并对4次观察中的生长迟缓和必要一致性设定严格标准，来解决这个问题。同时，已经为生长迟缓制定更为严格的标准，这应该会帮助消除可能在一次实验重复中得分而在另一次中不得分的边际检出(marginal calls)。
所有引物对均在0.67、0.33和0.16μg/μl进行剂量反应。观察通常剂量反应数据，并基于EC50数据辨别引物对。许多引物对证实了在最高级的活性。在数个其他情况中，引物对在两个最高级具有活性，但未证实在最低级的活性。在一个情况中，引物对在两个最高级具有明显死亡甚至在0.16μg/μl级生长迟缓。这些数据总结在下表中。注意：表2所示的正义引物序列和反义引物序列可生成在3’端具有2个胸腺嘧啶残基。
实施例2.玉米转化
用含有本发明沉默元件的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚，该沉默元件可操作连接至玉米Ubi 1-5UTR-Ubi 1内含子和可选择标记基因PAT(Wohlleben et al.(1988)Gene 70：25-37)，其赋予除草剂双丙磷抗性。在特定实施方式中，构建体具有2个反向的相同2-300bp靶基因片段，它们之间具有“内含子”片段以便形成发卡环。这个构建体可与dMMB启动子连接。该质粒还含有包含靶害虫序列或其片段或变体的抑制增强元件。可选地，在单独的质粒中提供了可选择标记基因。如下进行转化。培养基配方如下。
靶组织的制备
剥去穗，表面用30％次氯酸钠漂白剂加0.5％微去垢剂灭菌20分钟，并用灭菌水清洗两次。切离未成熟胚，并胚轴侧朝下放置(胚子叶侧朝上)，每板25个胚，在560Y培养基上4小时，然后排列在2.5cm的靶区域内准备用于轰击。
制备了含有感兴趣沉默元件的质粒载体，该沉默元件可操作连接至玉米Ubi1-5UTR-Ubi1内含子。使用以下的CaCl2沉淀程序，将质粒DNA加含有PAT选择性标记的质粒DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨沉淀上：100μl制备的水中钨颗粒；10μl(1μg)Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaCl2；和10μl 0.1M精脒。
向钨颗粒悬浮液中依次加入每种试剂，而维持在多管涡旋器上。对最终混合液做短暂的超声处理，并在恒定涡旋下温育10分钟。在沉淀期后，将试管短暂离心，移除液体，并用500ml 100％乙醇清洗，离心30秒。再次移除液体，并在最终的钨颗粒沉淀中加入105μl100％乙醇。对于颗粒枪轰击，对钨/DNA颗粒做短暂的超声处理，并将10μl点样于在每个巨载体(macrocarrier)的中心，使其在轰击之前干燥约2分钟。
样品平板在颗粒枪中水平#4下轰击。用从每管制备的颗粒/DNA中取出的共十等份，对所有样品进行650PSI下的单次射击。
轰击之后，将胚在560Y培养基中保持2天，然后转移至含有3mg/升双丙氨磷的560R选择培养基中，并每两周进行继代培养。选择大约10周之后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基中，以启动植物再生。体细胞胚成熟(2-4周)之后，将发育良好的体细胞胚转移至培养基中进行萌发并转移至有光培养室中。大约7-10天之后，将发育中的小苗转移至试管中的272V无激素培养基中7-10天，直至小苗良好建成。然后将植株转移至含有盆栽土的浅箱插孔中(等于2.5″盆栽)，在生长箱中生长1周，之后在温室中再生长1-2周，然后转移至典型的600盆栽(1.6加仑)并生长至成熟。监测植物并为适当标记评分。
例如，可以进行FAW饲喂测验。在这种测验中，使用1cm木塞钻孔器或叶片冲压器，从转基因植物切离叶片圆盘。每株植物制备6个叶片圆盘。将叶片置于在500μl 0.8％琼脂之上的24孔微孔板中。用2个初生秋夜娥(或任何感兴趣的害虫)侵染每个叶片圆盘，然后用聚酯膜密封该板。为每个孔留个小通气孔，然后将板储存在28℃生长箱中。96小时时，对测验的死亡率、生长迟缓和叶片消耗评分。
轰击培养基(560Y)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)，1.0ml/l埃里克松维生素混合物(1000X SIGMA-1511)，0.5mg/l硫胺素HCl，120.0g/l蔗糖，1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调整pH至5.8之后，以D-I H2O恢复体积)；2.0g/l结冷胶(Gelrite)(以D-I H2O恢复体积之后加入)；和8.5mg/l硝酸银(灭菌培养基并冷却至室温之后加入)。选择培养基(560R)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)，1.0ml/l埃里克松维生素混合物(1000X SIGMA-1511)，0.5mg/l硫胺素HCl，30.0g/l蔗糖和2.0m/l2，4-D(用KOH调整pH至5.8之后，以D-I H2O恢复体积)；3.0g/l结冷胶(以D-I H2O恢复体积之后加入)；和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(都在灭菌培养基并冷却至室温之后加入)。
植物再生培养基(288J)含有4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)，5.0ml/lMS维生素原溶液(0.100g烟酸，0.02g/l硫胺素HCL，0.10g/l吡哆醇HCL和0.40g/l甘氨酸(用精致D-I H2O恢复体积)(Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)，100mg/l肌醇，0.5mg/l玉米素，60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM抗坏血酸(调整pH至5.6之后，用精致D-I H2O恢复体积)；3.0g/l结冷胶(以D-I H2O恢复体积之后加入)；和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(灭菌培养基并冷却至60℃之后加入)。无激素培养基(272V)含有4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)，5.0ml/l MS维生素原溶液(0.100g/l烟酸，0.02g/l硫胺素HCL，0.10g/l吡哆醇HCL和0.40g/l甘氨酸，用精致D-I H2O恢复体积)，0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(调整pH至5.6之后，用精致D-I H2O恢复体积)；和6g/l细菌用琼脂(用精致D-I H2O恢复体积之后加入)，灭菌并冷却至60℃。
实施例3.农杆菌介导的玉米转化
用本发明的沉默元件和抑制增强元件(例如，实施例2所述的那些)进行农杆菌介导的玉米转化，采用Zhao的方法(美国专利第5,981,840号和PCT专利公开文本WO98/32326；通过引用将它们的内容并入本文)。简而言之，从玉米中分离未成熟的胚，并将胚与农杆菌悬浮液接触，其中细菌能够将含有沉默元件和抑制增强元件的多核苷酸转移至至少一个未成熟胚的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚浸没在农杆菌悬浮液中以启动接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，在固体培养基上培养未成熟胚。共培养期之后，涉及任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，在已知抑制农杆菌生长的至少一种抗生素的存在下孵育胚，而不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。将未成熟胚培养在含抗生素但不含选择剂的固体培养基中，以消除农杆菌和进行被感染细胞的静息阶段。接下来，将接种胚培养在含有选择剂的培养基中，并回收生长转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。将未成熟胚培养在含选择剂的固体培养基中，以使转化细胞选择性生长。然后将愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，并将在选择性培养基中生长的愈伤组织培养在固体培养基上以再生成植物。
实施例4：大豆胚转化
培养条件
将大豆胚生成悬浮培养物(cv.Jack)维持在35ml液体培养基SB196(参见以下配方)中，并在旋转振荡器上150rpm振荡，26℃，且用冷白色荧光按16∶8小时昼/夜的光周期以60-85μE/m2/s光强度照射。通过将约35mg组织接种至35ml新鲜液体SB196中，每7天至两周对培养物进行继代培养(优选的继代培养间隔是每7天)。
用以下实施例所述的质粒和DNA片段通过颗粒枪轰击方法(Klein et al.(1987)Nature，327：70)，转化大豆胚生成悬浮培养物。
大豆胚生成悬浮培养启动
每月启动两次大豆培养，每次启动间隔5-7天。
从种植45-55天后的可用大豆植物上采摘带未成熟种子的豆荚，将其去壳并置于灭菌品红盒中。通过将大豆种子在含1滴乳色皂液的5％次氯酸钠溶液(95ml高压灭菌蒸馏水加5ml次氯酸钠和1滴皂液)中振荡15分钟进行灭菌。充分混合。使用21升瓶的灭菌蒸馏水洗涤种子，将小于4mm的那些置于单个显微载玻片。切除种子的小末端，从种皮中挤出子叶。将子叶转移至含有SB1培养基的平板中(每板25-30个子叶)。用纤维带包裹平板并储存8周。此后切下次生胚，并将其在SB196液体培养基中放置7天。
制备轰击用DNA
轰击使用含有沉默元件和抑制元件(例如实施例2所述的那些)和选择性标记基因的完整质粒或DNA质粒片段。使用PromegaTM方案和应用指南，第二版(106页)所述方法，常规制备和纯化轰击用质粒DNA。通过凝胶分离双消化质粒，获得携带感兴趣沉默元件的质粒片段。在每种情况中，在适宜感兴趣质粒的0.5ml特定酶混合物中消化100μg质粒DNA。通过1％SeaPlaque GTG琼脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)的凝胶电泳分离所得的DNA片段，并从琼脂糖凝胶上切下含有感兴趣沉默元件的DNA片段。使用琼脂酶(GELase)消化酶按照生产商的方案从琼脂糖纯化DNA。
将50μl等份的含有3mg金颗粒(3mg金)的灭菌蒸馏水加入5μl的1μg/μl DNA溶液(如上制备的完整质粒或DNA片段)，50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M精脒。将混合物在水平3的涡旋振荡器上振荡3分钟并在台式微量离心机旋转10秒。用400μl100％乙醇清洗之后，通过在40μl100％乙醇中超声处理而悬浮沉淀。将5μl DNA悬浮液分散在弹道PDS1000/HE仪器盘的每一飞盘上。每5μl等份含有每次轰击(即每盘)大约0.375mg金。
组织制备和DNA轰击
将大约150-200mg的7天龄胚悬浮培养物置于空的、无菌60×15mm培养皿并用塑料网覆盖皿。轰击组织，每平板1或2枪，膜破坏压力设定为1100PSI，箱体抽空至27-28英寸汞柱的真空。离保留/阻挡屏(retaining/stopping screen)大约3.5英寸放置组织。
转化胚的选择
采用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶HPT基因用作选择性标记时)或氯磺隆(chlorsulfuron)(当乙酰乳酸合酶ALS基因用作选择性基因标记时)选择转化胚。
潮霉素(HPT)选择
轰击之后，将组织置于新鲜SB196培养基中，并如上所述进行培养。轰击之后六天，将SB196更换成含30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196。每周更新选择性培养基。选择之后4-6周，可以观察到从未转化、坏死胚生成簇中生长出的绿色转化组织。取出分离的绿色组织，并接种到多孔板中，以生成新的、克隆繁殖的、转化胚生成悬浮培养物。
氯磺隆(ALA)选择
轰击之后，用新鲜SB196培养基将组织分配在2个烧瓶中，并如上所述进行培养。轰击之后6-7天，将SB196更换成含100ng/L氯磺隆选择剂的新鲜SB196。每周更新选择性培养基。选择之后4-6周，可以观察到从未转化、坏死胚生成簇中生长出绿色转化组织。取出分离的绿色组织，并接种到含SB196的多孔板中，以生成新的、克隆繁殖的、转化胚生成悬浮培养物。
大豆体细胞胚再生成植株
为了从胚生成悬浮培养物获得整株植物，组织必须再生。
胚成熟
按16∶8小时光周期，90-120μE/m2s的光强度，在冷白色荧光(Phillips冷白色Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40Agro)灯泡(40瓦)下，将胚在SB196中26℃下培养4-6周。此后，将胚簇取出至固体琼脂培养基SB1661-2周。然后将簇在培养基SB103上继代培养3周。在此期间，可从簇中取出单个胚，并筛选适当标记或当害虫摄取植物时植物防治害虫的能力。
胚干燥和萌发
通过将成熟的单个胚置于空的、小皮式培养皿盘(35×10mm)中大约4-7天，将其干燥。用纤维带密封平板(形成小的湿度箱)。将干燥的胚植入SB71-4培养基，将其在其中保留至在以上所述相同培养条件下萌发。从萌发培养基中取出萌发的小苗，并用水充分清洗，然后植入24室包装盘的Redi-Earth中，用透明塑料圆顶覆盖。2周之后，移除圆顶将并植物再锻炼一周。如果小苗看起来壮实，将它们转植在10”盆栽的Redi-Earth中，每盆多至3棵小苗。10-16周之后，收获成熟的种子，压碎并分析蛋白。
培养基配方
SB 196-FN低盐液体增殖培养基(每升)-
MS FeEDTA-100×原液1 10ml
MS硫酸盐-100×原液2 10ml
FN低盐卤化物-100×原液3 10ml
FN低盐P，B，Mo-100×原液4 10ml
B5维生素(1ml/L) 1.0ml
2，4-D(10mg/L终浓度) 1.0ml
KNO3 2.83gm
(NH4)2SO4 0.463gm
天冬酰胺 1.0gm
蔗糖(1％) 10gm
pH 5.8
FN低盐原溶液
原液# 1000ml 500ml
1MS Fe EDTA 100×原液
Na2EDTA* 3.724g 1.862g
FeSO4-7H2O 2.784g 1.392g
*首先添加，在暗瓶中溶解同时搅拌
2MS硫酸盐100×原液
MgSO4-7H2O 37.0g 18.5g
MnSO4-H2O 1.69g 0.845g
ZnSO4-7H2O 0.86g 0.43g
CuSO4-5H2O 0.0025g 0.00125g
3FN低盐卤化物100×原液
CaCl2-2H2O 30.0g 15.0g
KI 0.083g 0.0715g
CoCl2-6H2O 0.0025g 0.00125g
4FN低盐P，B，Mo 100×原液
KH2PO4 18.5g 9.25g
H3BO3 0.62g 0.31g
Na2MoO4-2H2O 0.025g 0.0125g
SB1固体培养基(每升)含有：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml B5维生素1000×原液；31.5g蔗糖；2ml 2，4-D(20mg/L终浓度)；pH 5.7；和8g TC琼脂。
SB 166固体培养基(每升)含有：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml B5维生素1000×原液；60g麦芽糖；750mg MgCl2六水合物；5g活化木炭；pH 5.7；和2g结冷胶。
SB 103固体培养基(每升)含有：1pkg.MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml B5维生素1000×原液；60g麦芽糖；750mg MgCl2六水合物；pH 5.7；和2g结冷胶。
SB 71-4固体培养基(每升)含有：1瓶Gamborg’s B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat#21153-036)；pH 5.7；和5g TC琼脂。
2，4-D原液是从Phytotech cat#D 295预制获得的-浓度是1mg/ml。
在-20℃等份储存的B5维生素原液(每100ml)含有：10g肌醇；100mg烟酸；100mg吡哆醇HCl；和1g硫胺素。如果溶液不能足够快地溶解，可应用热搅拌盘低水平加热。氯磺隆原液含有在1mg/ml的0.01N氢氧化铵。
本文所用的冠词“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或多于一个(即至少一个)的冠词的语法客体。通过举例的方式，“一个元件”表示一个或多个元件。
说明书提及的所有公开文本和专利申请指示了本发明所属领域技术人员的水平。所有公开文本和专利申请通过引用并入本文，以致如同每篇公开文本或专利申请具体且单独地被指出通过引用并入本文。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过解释和实施例的方式，较详细地描述了上述发明，但是显而易见的是，可在所附权利要求范围之内进行某些变化和修改。
Claims (40)
1.植物细胞，其含有：
(a)第一异源多核苷酸，其含有可操作连接至在所述植物细胞中有活性的启动子的靶害虫序列沉默元件；和
(b)第二异源多核苷酸，其含有可操作连接至在所述植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件，所述抑制增强元件包含所述靶害虫序列或其片段或变体。
2.如权利要求1所述的植物细胞，其中所述沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了该害虫靶序列特异抑制性RNA在所述植物细胞中的浓度。
3.如权利要求1或2所述的植物细胞，其中所述第一和第二多核苷酸稳定并入所述细胞的基因组中。
4.如权利要求1、2或3所述的植物细胞，其中所述害虫是昆虫害虫。
5.如权利要求4所述的植物细胞，其中所述昆虫害虫选自：
(a)草盲蝽属的成员；
(b)蚜虫；
(c)蚜科的成员；和
(d)鳞翅目的成员。
6.如权利要求5所述的植物细胞，其中所述的鳞翅目的成员包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的植物细胞，其中所述沉默元件编码发卡RNA。
8.如权利要求7所述的植物细胞，其中所述沉默元件按以下顺序含有第一片段，第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段含有与所述靶害虫序列具有至少90％序列互补性的至少约18个核苷酸；
(b)所述第二序列含有足够长的环，以允许所述沉默元件转录成发卡RNA；和
(c)所述第三片段含有与所述第一片段具有至少85％互补性的至少约18个核苷酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
10.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述双子叶植物是大豆、芸薹属、向日葵、棉花或苜蓿。
11.如权利要求1-8中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
12.如权利要求11所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
13.植物或植物部分，其含有权利要求1-12中任一项所述的细胞。
14.如权利要求13所述的植物或植物部分，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的联合表达增加了所述害虫靶序列特异抑制性RNA在所述植物或植物部分的韧皮部中的浓度。
15.来自权利要求13或14中任一项所述植物的转基因种子。
16.增加靶害虫序列特异抑制性RNA浓度的方法，其包括将第一多核苷酸和第二多核苷酸导入植物细胞，所述第一多核苷酸含有所述害虫靶序列的沉默元件和所述第二多核苷酸含有抑制增强元件，所述抑制增强元件包含所述靶害虫序列或其变体或片段，
其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的联合表达增加了所述植物细胞中害虫靶序列特异抑制性RNA在所述植物细胞中的浓度。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸稳定并入所述植物细胞的基因组。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述沉默元件和所述抑制增强元件的联合表达增加了所述害虫靶序列特异抑制性RNA在含有所述植物细胞的植物的韧皮部中的浓度。
19.如权利要求16、17或18所述的方法，其中所述害虫是昆虫害虫。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述害虫选自：
(a)草盲蝽属的成员；
(b)蚜虫；
(c)蚜科的成员；和
(d)鳞翅目的成员。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的鳞翅目的成员包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述沉默元件编码发卡RNA。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述含有沉默元件的多核苷酸按以下顺序含有第一片段，第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段含有与所述靶多核苷酸具有至少90％序列互补性的至少约18个核苷酸；
(b)所述第二片段含有足够长的环，以允许所述沉默元件转录成发卡RNA；和
(c)所述第三片段含有与所述第一片段具有至少85％序列互补性的至少约18个核苷酸。
24.如权利要求16-23中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆、芸薹属、向日葵、棉花或苜蓿。
26.如权利要求16-23中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
28.防治害虫的方法，其包括用含有第一多核苷酸和第二多核苷酸的植物细胞饲喂所述害虫，所述第一多核苷酸含有害虫靶序列的沉默元件和所述第二多核苷酸含有抑制增强元件，所述抑制增强元件包含所述靶害虫序列或其片段或变体，其中所述害虫靶序列或由其编码的多肽的表达水平被降低。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的联合表达增加了所述害虫靶序列特异抑制性RNA在所述植物细胞中的浓度。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述沉默元件和所述第二多核苷酸的联合表达增加了所述害虫靶序列特异抑制性RNA在含有所述植物细胞的植物的韧皮部中的浓度。
31.如权利要求28、29或30所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸稳定并入所述植物细胞的基因组中。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述害虫是昆虫害虫。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述害虫选自：
(a)草盲蝽属的成员；
(b)蚜虫；
(c)蚜科的成员；和
(d)鳞翅目的成员。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的鳞翅目的成员包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
35.如权利要求28-34中任一项所述的方法，其中所述沉默元件含有发卡RNA。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述含有沉默元件的多核苷酸按以下顺序含有第一片段，第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段含有与所述靶多核苷酸具有至少90％序列互补性的至少约18个核苷酸；
(b)所述第二片段含有足够长的环，以允许所述沉默元件转录成发卡RNA；和
(c)所述第三片段含有与所述第一片段具有至少85％序列互补性的至少约18个核苷酸。
37.如权利要求28-36中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆、芸薹属、向日葵、棉花或苜蓿。
39.如权利要求28-36中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
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