BR112020016995A2

BR112020016995A2 - Moléculas curtas/pequenas de rna em forma de grampo

Info

Publication number: BR112020016995A2
Application number: BR112020016995-1A
Authority: BR
Inventors: Elane Fishilevich; Kenneth Narva; Xiaozeng Yang; Meghan L. Frey; Murugesan Rangasamy; Wendy LO; Premchand GANDRA; Peter Michael Waterhouse
Original assignee: Dow Agrosciences Llc; Queensland University Of Technology
Priority date: 2018-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2020-12-29
Also published as: EP3755801A1; CN112204141A; AU2019224179A1; CA3091625A1; EP3755801A4; MX2020008719A; US20210254058A1; WO2019161449A1; RU2020130915A

Abstract

moléculas curtas/pequenas de rna em forma de grampo. a presente invenção refere-se a composições e métodos de novas moléculas de rna de inibição (por exemplo, moléculas pequenas/curtas de rna em forma de grampo (shrna, do inglês "small/short hairpin rna")), a polinucleotídeos que codificam tais moléculas, ao uso de tais novas moléculas de rna de inibição para inibir um gene-alvo por supressão da expressão do rnam do gene-alvo e para aplicação tal como para o controle de pragas de insetos, e são descritas plantas transgênicas que produzem e são protegidas por essas novas moléculas de rna de inibição.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS CURTAS/PEQUENAS DE RNA EM FORMA DE GRAMPO".

[001] O presente pedido reivindica prioridade de US 62/773.355, depositado em 30 de novembro de 2018, e US 62/633.720, depositado em 22 de fevereiro de 2018, cujos conteúdos totais são incorporados por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE

[002] É incorporada na sua totalidade por referência uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legível por computador submetida simultaneamente com o presente documento e identificada da seguinte forma: um arquivo ASCII (Texto) de 90,2 KB nomeado "77716 Sequence_ST25" criado em 10 de novembro de 2017.

CAMPO DA TÉCNICA

[003] A presente invenção refere-se, em geral, ao campo de biologia molecular conforme aplicada às ciências agrícolas. Mais particularmente, determinadas modalidades dizem respeito a composições e métodos para o uso de uma molécula curta/pequena de RNA em forma de grampo (shRNA, do inglês "short/small hairpin RNA") para inibir um gene-alvo por supressão da expressão do RNAm do gene-alvo. Em algumas modalidades, a molécula de shRNA é usada para o controle de insetos. São divulgados também métodos de preparação e uso da molécula de shRNA no desenvolvimento das novas moléculas inseticidas em células vegetais transgênicas contendo as sequências polinucleotídicas divulgadas no presente documento.

ANTECEDENTES

[004] A expressão transgênica de moléculas de RNA de inibição/interferência (por exemplo, RNAi) pode ser empregada para regular a expressão de gene(s)-alvo pela inibição do RNA transcrito de um gene-alvo expresso dentro de uma célula viva de um organismo. RNAs pequenos (sRNAs, do inglês "small RNAs") são exemplos de moléculas de RNAi. Além disso, microRNAs (miRNAs) são um exemplo de tal molécula de sRNA. Estes miRNAs que não codificam proteínas guiam a clivagem de transcritos de RNAm-alvo regulando assim negativamente a expressão de genes (Ambros (2001) Cell 107 (7):823- 6; Bartel (2004) Cell 116 (2):281-97). RNAs curtos/pequenos em forma de grampo (shRNAs) são variantes projetadas de miRNA. As aplicações da expressão transgênica de shRNA em células de animais e plantas para inibir um gene-alvo por supressão da expressão do RNAm do gene-alvo foram previamente exemplificadas em aplicações terapêuticas em humanos. O uso de miRNA pode ser implantado para uso em sistemas de manejo de resistência de insetos em campos de cultivo. Por exemplo, o uso de shRNA na lagarta da raiz do milho ocidental mostra uma resposta robusta de interferência de RNA quando alimentado com essas moléculas.

[005] O controle de populações de insetos em campos de cultivo é economicamente necessário para as práticas agrícolas modernas. Por exemplo, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos estimou que as lagartas da raiz do milho (por exemplo, a lagarta da raiz do milho ocidental) causam perda de receita de US$ 1 bilhão a cada ano. A implantação de plantas transgênicas para o controle de insetos fornece uma alternativa aos inseticidas químicos. O uso de inseticidas químicos é uma estratégia imperfeita de controle de insetos. Altas populações de larvas de insetos, chuvas fortes e aplicação inadequada do(s) inseticida(s) podem resultar em controle inadequado de insetos. Além disso, o uso contínuo de inseticida(s) pode selecionar cepas de insetos resistentes a inseticidas, bem como levantar preocupações ambientais significativas devido à toxicidade para espécies não-alvo.

[006] Assim, continua a existir uma necessidade de novas moléculas estruturais de shRNA inovadoras com diferentes faixas de atividade inseticida contra pragas de insetos, por exemplo, moléculas de shRNA que são ativas contra uma variedade de insetos. Além disso, continua a existir uma necessidade de novas moléculas estruturais de shRNA com novos modos de ação que tenham atividade contra uma variedade de pragas de insetos que desenvolveram resistência aos pesticidas existentes.

BREVE SUMÁRIO

[007] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um polinucleotídeo de RNA pequeno em forma de grampo (shRNA) compreendendo as seguintes estruturas: uma sequência polinucleotídica compreendendo uma estrutura em forma de grampo com menos de 25 nucleotídeos; uma sequência polinucleotídica compreendendo uma estrutura de reconhecimento e sítio de clivagem de DICER; e uma sequência polinucleotídica compreendendo uma estrutura de haste de 16 a 25 pares de nucleotídeos, em que a estrutura de haste é de fita dupla. Em um aspecto, o shRNA compreende menos de 70 nucleotídeos de comprimento. Em outros aspectos, o shRNA compreende pelo menos duas voltas de alfa-hélice. Em aspectos adicionais, o shRNA não é reconhecido por DROSHA. Em alguns aspectos, o shRNA não é clivado por DROSHA. Em um aspecto, o shRNA não é reconhecido e/ou substancialmente clivado por uma proteína do tipo DICER de planta (por exemplo, DCL1, DCL2, DCL3 ou DCL4), facilitando assim que o shRNA se acumule na planta em uma forma intacta, tal como em uma forma de pré-miRNA, pronta para subsequente reconhecimento e clivagem por DICER em uma célula de inseto após a ingestão pelo inseto. Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo compreende nucleotídeos de fita dupla e nucleotídeos de fita simples.

Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo compreende uma série de mal pareamentos e/ou saliências.

Em outros aspectos, a estrutura de grampo compreende um polinucleotídeo obtido de um arcabouço de microRNA de inseto.

Em alguns aspectos, a estrutura de grampo compreende as SEQ ID Nos:7 a 401 ou qualquer fragmento das mesmas.

Em aspectos adicionais, a estrutura de haste não contém mal pareamentos e/ou saliências.

Em outros aspectos, a estrutura de haste compreende um polinucleotídeo que tem 70% a 100% de identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta.

Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em aspectos adicionais, a molécula de shRNA tem uma energia livre (∆G) inferior a -30 kcal/mol.

Em aspectos adicionais, o shRNA compreende menos de 80 nucleotídeos de comprimento.

Em outros aspectos, o shRNA compreende menos de 90 nucleotídeos de comprimento.

Em alguns aspectos, a molécula de shRNA compreende adicionalmente uma projeção polinucleotídica de pelo menos 2 nucleotídeos e não mais do que 4 nucleotídeos.

Em aspectos adicionais, o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita dupla.

Em outros aspectos, o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em aspectos adicionais, o segundo nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em aspectos adicionais, o terceiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em alguns aspectos, o quarto nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em aspectos adicionais, a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 5' da molécula de shRNA.

Em outros aspectos, a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 3' da molécula de shRNA. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende menos de 74 nucleotídeos de comprimento. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende menos de 84 nucleotídeos de comprimento. Em alguns aspectos, o shRNA compreende menos de 94 nucleotídeos de comprimento. Em outros aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[008] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um polinucleotídeo de RNA de fita dupla (dsRNA, do inglês "double stranded RNA") compreendendo menos de 70 pares de bases, em que o polinucleotídeo de dsRNA não é reconhecido e clivado por DROSHA. Em um aspecto, o polinucleotídeo de dsRNA compreendendo adicionalmente uma estrutura em forma de grampo. Em outros aspectos, a estrutura de grampo tem menos de 25 nucleotídeos de comprimento. Em alguns aspectos, a estrutura de grampo compreende nucleotídeos de fita dupla e de fita simples. Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo compreende uma série de mal pareamentos e/ou saliências. Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo compreende um polinucleotídeo obtido de um arcabouço de microRNA de inseto. Em outros aspectos, a estrutura de grampo compreende as SEQ ID Nos:7 a 401 ou qualquer fragmento das mesmas. Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo a molécula de shRNA tem uma energia livre (∆G) inferior a -30 kcal/mol. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo de dsRNA compreendendo adicionalmente uma estrutura de haste. Em outros aspectos, a estrutura de haste compreende tem 16 a 25 nucleotídeos de comprimento. Em aspectos adicionais, a estrutura de haste não contém mal pareamentos ou saliências. Em alguns aspectos, a estrutura de haste compreende um polinucleotídeo que tem 70% a 100% de identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta.

Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V- ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de dsRNA compreende adicionalmente uma estrutura de reconhecimento e sítio de clivagem de DICER.

Em outros aspectos, o polinucleotídeo de dsRNA compreende pelo menos duas voltas de alfa-hélice.

Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de dsRNA compreende adicionalmente uma projeção polinucleotídica de pelo menos 2 nucleotídeos e não mais do que 4 nucleotídeos.

Em aspectos adicionais, a projeção polinucleotídica é de fita dupla.

Em alguns aspectos, o segundo nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em outros aspectos, o quarto nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em alguns aspectos, a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 3' da molécula de shRNA.

Em um aspecto, o polinucleotídeo de dsRNA e a projeção polinucleotídica têm menos de 74 nucleotídeos de comprimento.

Em outro aspecto, o polinucleotídeo de dsRNA e a projeção polinucleotídica têm menos de 84 nucleotídeos de comprimento.

Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de dsRNA e a projeção polinucleotídica têm menos de 94 nucleotídeos de comprimento.

Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de dsRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto.

Em outro aspecto, o dsRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[009] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um polinucleotídeo de RNA pequeno em forma de grampo (shRNA) que compreende: uma primeira fita de RNA de 16 a 25 nucleotídeos; uma segunda fita de RNA com menos de 25 nucleotídeos, em que a segunda fita de RNA compreende polinucleotídeos de fita simples e de fita dupla; e uma terceira fita de RNA de 16 a 25 nucleotídeos, em que a terceira fita de RNA é substancialmente o complemento reverso da primeira fita de RNA. Em um aspecto, a primeira fita de RNA é transcrita a partir de um único polinucleotídeo. Em outro aspecto, a primeira fita de RNA está ligada à segunda fita de RNA e a segunda fita de RNA está ligada à terceira fita de RNA. Em outros aspectos, a terceira fita de RNA é substancialmente o complemento reverso da primeira fita de RNA, de modo que a primeira e a terceira fitas de RNA hibridizam quando transcritas em um ácido ribonucleico para formar o shRNA. Em aspectos adicionais, a sequência de reconhecimento e ligação de DICER está localizada entre a segunda fita de RNA e a primeira e a terceira fitas de RNA hibridizadas. Em alguns aspectos, a segunda fita de RNA compreende uma estrutura em forma de grampo. Em outro aspecto, a segunda fita de RNA tem menos de 25 nucleotídeos de comprimento. Em outros aspectos, a segunda fita de RNA compreende uma série de mal pareamentos e/ou saliências. Em alguns aspectos, a segunda fita de RNA compreende um polinucleotídeo obtido de um arcabouço de microRNA de inseto. Em outro aspecto, a segunda fita de RNA compreende as SEQ ID Nos:7 a 401 ou qualquer fragmento das mesmas. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de shRNA tem uma energia livre (∆G) inferior a -30 kcal/mol. Em aspectos adicionais, a primeira e a terceira fitas de RNA hibridizadas compreendem uma estrutura de haste. Em outros aspectos, a primeira e a terceira fitas de RNA hibridizadas não contêm mal pareamentos e/ou saliências.

Em alguns aspectos, a primeira fita de RNA tem 16 a 25 nucleotídeos de comprimento.

Em aspectos adicionais, a terceira fita de RNA tem 16 a 25 nucleotídeos de comprimento.

Em aspectos adicionais, a primeira fita de RNA compreende um polinucleotídeo que tem 70% a 100% de identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta.

Em outros aspectos, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em alguns aspectos, o shRNA compreende pelo menos duas voltas de alfa-hélice.

Em aspectos adicionais, o shRNA compreende adicionalmente uma projeção polinucleotídica de pelo menos 2 nucleotídeos e não mais do que 4 nucleotídeos.

Em outros aspectos, o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita dupla.

Em um aspecto adicional, o segundo nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em outro aspecto, o terceiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em um aspecto adicional, o quarto nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em alguns aspectos, a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 5' da molécula de shRNA.

Em outros aspectos, a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 3' da molécula de shRNA.

Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA e a projeção polinucleotídica têm menos de 74 nucleotídeos de comprimento.

Em outro aspecto, o polinucleotídeo de shRNA e a projeção polinucleotídica têm menos de 84 nucleotídeos de comprimento.

Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA e a projeção polinucleotídica têm menos de

94 nucleotídeos de comprimento. Em alguns aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0010] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um vetor compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o vetor compreende ainda um promotor heterólogo operacionalmente ligado ao polinucleotídeo de shRNA. Em outro aspecto, o vetor é um vetor de transformação de planta e em que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal. Em um aspecto adicional, o vetor compreende adicionalmente pelo menos uma região de borda de Agrobacterium. Em ainda outro aspecto, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano, um vírus e um bacteriófago. Em alguns aspectos, o shRNA inibe um gene- alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm- alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0011] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um cassete de expressão gênica compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência codificante heteróloga, em que as sequências codificantes heterólogas codificam o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o cassete de expressão gênica compreende uma ou mais características transgênicas adicionais. Em outro aspecto, a uma ou mais características transgênicas adicionais são selecionadas do grupo que consiste em uma sequência codificante heteróloga que confere resistência inseticida, tolerância a herbicidas, um ácido nucleico que confere eficiência no uso de nitrogênio, um ácido nucleico que confere eficiência no uso de água, um ácido nucleico que confere qualidade nutricional, um ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação ao DNA e um ácido nucleico que codifica um marcador de seleção. Em outros aspectos, a sequência codificante heteróloga está operacionalmente ligada a uma ou mais sequências regulatórias heterólogas que dirigem a expressão do shRNA. Em outros aspectos, o shRNA é oralmente ativo. Em um aspecto adicional, o shRNA tem atividade inseticida contra uma praga de inseto. Em outro aspecto, a praga de inseto é selecionada do grupo que consiste nas Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera e Trichoptera. Em alguns aspectos, o shRNA é colocado em contato com a praga de inseto mata ou inibe o crescimento e/ou alimentação da praga. Em outro aspecto, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em alguns aspectos, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0012] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma planta ou progênie da mesma, compreendendo o polinucleotídeo de shRNA. Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma planta ou progênie da mesma transformada de forma estável com o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, a planta é uma monocotiledônea. Em outro aspecto, a planta é uma dicotiledônea. Em outros aspectos, a planta é selecionada do grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, banana, cana de açúcar, Glycine max, algodão, Arabidopsis, tabaco, girassol e canola. Em alguns aspectos, a planta compreende adicionalmente uma ou mais características transgênicas adicionais. Em aspectos adicionais, a característica transgênica é codifica uma proteína de marcador de seleção, uma proteína de resistência inseticida, uma proteína de tolerância a herbicidas, uma proteína de eficiência no uso de nitrogênio, uma proteína de eficiência no uso de água, uma molécula pequena de RNA, uma proteína de qualidade nutricional ou uma proteína de ligação ao DNA. Em outros aspectos, a planta produz um produto de consumo. Em alguns aspectos, o produto de consumo é selecionado do grupo que consiste em concentrado de proteína, isolado de proteína, grão, farelo, farinha, óleo ou fibra. Em outro aspecto, o shRNA é complementar a um polinucleotídeo-alvo. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em aspectos adicionais, a praga de inseto ingere uma parte da planta que compreende o shRNA. Em aspectos adicionais, a praga de inseto entra em contato com uma parte da planta que compreende o shRNA. Em aspectos adicionais, a praga de inseto resulta em diminuição do crescimento e/ou sobrevivência, em relação ao desenvolvimento da mesma praga de inseto em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o shRNA. Em outro aspecto, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a proteção de uma planta de uma praga de inseto, compreendendo a expressão na planta ou célula da mesma do shRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 104 ou 105.

[0013] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a produção de uma célula vegetal, em que o método compreende as etapas de: a transformação de uma célula vegetal com um polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA; o isolamento da célula vegetal transformada compreendendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA; e a produção de uma célula vegetal transgênica compreendendo o polinucleotídeo que expressa o shRNA.

Em um aspecto, a transformação de uma célula vegetal é realizada com um método de transformação de planta.

Em outro aspecto, o método de transformação de planta é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação com carboneto de silício, um método de transformação de protoplastos e um método de transformação de lipossomos.

Em um aspecto adicional, a sequência polinucleotídica de interesse é constitutivamente expressa em uma célula vegetal.

Em outro aspecto, a sequência polinucleotídica de interesse é integrada de forma estável ao genoma da célula vegetal transgênica.

Em outros aspectos, o método para a produção de uma célula vegetal compreende adicionalmente as etapas de: regeneração da célula vegetal transgênica em uma planta transgênica; e obtenção da planta transgênica, em que a planta transgênica compreende o polinucleotídeo que expressa o shRNA.

Em um aspecto, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal transgênica monocotiledônea ou uma célula vegetal transgênica dicotiledônea.

Em outro aspecto, a célula vegetal transgênica dicotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de Glycine max, uma célula vegetal de canola e uma célula vegetal de algodão.

Em alguns aspectos, a célula vegetal transgênica monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vegetal de arroz e uma célula vegetal de trigo. Em outro aspecto, o método compreende a expressão na planta ou célula da mesma do polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA. Em alguns aspectos, o shRNA é complementar a um polinucleotídeo-alvo. Em outros aspectos, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em outros aspectos, a praga de inseto ingere uma parte da planta que compreende o polinucleotídeo de shRNA. Em aspectos adicionais, a praga de inseto entra em contato com uma parte da planta que compreende o polinucleotídeo de shRNA. Em alguns aspectos, a praga de inseto resulta em diminuição do crescimento e/ou sobrevivência, em relação ao desenvolvimento da mesma praga de inseto em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo de shRNA. Em outros aspectos, o polinucleotídeo de shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0014] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a proteção de uma planta de uma praga de inseto, compreendendo a expressão na planta ou célula da mesma do polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA.

[0015] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a expressão de uma sequência polinucleotídica de interesse em uma célula vegetal, em que o método compreende a introdução na célula vegetal de um cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA é introduzido na célula vegetal por um método de transformação de planta. Em outro aspecto, o método de transformação de planta é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação com carboneto de silício, um método de transformação de protoplastos e um método de transformação de lipossomos. Em aspectos adicionais, a sequência polinucleotídica de interesse é expressa constitutivamente em tecido de célula vegetal. Em outros aspectos, a sequência polinucleotídica de interesse é integrada de forma estável ao genoma da célula vegetal. Em alguns aspectos, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal monocotiledônea ou uma célula vegetal dicotiledônea. Em um aspecto adicional, a célula vegetal dicotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de Glycine max, uma célula vegetal de canola e uma célula vegetal de algodão. Em outro aspecto, a célula vegetal monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vegetal de arroz e uma célula vegetal de trigo.

[0016] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a proteção de uma planta de uma praga de inseto, compreendendo a expressão na planta ou célula da mesma do polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o shRNA é complementar a um polinucleotídeo-alvo. Em alguns aspectos, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa,

COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em outro aspecto, a praga de inseto ingere uma parte da planta que compreende o shRNA. Em um aspecto adicional, a praga de inseto entra em contato com uma parte da planta que compreende o shRNA. Em um aspecto adicional, a praga de inseto resulta em diminuição do crescimento e/ou sobrevivência, em relação ao desenvolvimento da mesma praga de inseto em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o shRNA. Em alguns aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0017] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um microrganismo recombinante, compreendendo um cassete de expressão gênica contendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o microrganismo é selecionado do grupo que consiste em uma bactéria, baculovírus, algas, levedura e fungos. Em outro aspecto, a bactéria é selecionada de Pseudomonas, Agrobacterium e Escherichia. Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a produção de um shRNA com atividade insecticida, compreendendo a cultura do microrganismo recombinante compreendendo o polinucleotídeo de shRNA sob condições nas quais o polinucleotídeo de shRNA é expresso. Em outro aspecto, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0018] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma célula transgênica compreendendo um cassete de expressão gênica contendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA.

Em um aspecto, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica.

Em outro aspecto, a célula vegetal transgênica compreende o cassete de expressão gênica contendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA.

Em um aspecto adicional, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea.

Em outro aspecto, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de arroz e uma planta de trigo.

Em um aspecto adicional, a planta dicotiledônea é selecionada do grupo que consiste em uma planta de soja, uma planta de Arabidopsis, uma planta de alfafa, uma planta de beterraba sacarina, uma planta de canola e uma planta de algodão.

Em um aspecto adicional, a semente da planta transgênica compreende o cassete de expressão gênica contendo o polinucleotídeo que expressa o polinucleotídeo de shRNA.

Em outro aspecto, o shRNA é complementar a um polinucleotídeo-alvo.

Em outros aspectos, o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em alguns aspectos, a praga de inseto ingere uma parte da planta que compreende o shRNA.

Em aspectos adicionais, a praga de inseto entra em contato com uma parte da planta que compreende o shRNA.

Em outros aspectos, a praga de inseto resulta em diminuição do crescimento e/ou sobrevivência, em relação ao desenvolvimento da mesma praga de inseto em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o shRNA.

Em aspectos adicionais, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em outros aspectos, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0019] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para o controle de uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida do polinucleotídeo de shRNA. Em outro aspecto, o método para o controle de uma população de praga de inseto compreende a exposição da praga de inseto a uma célula vegetal transgênica, planta transgênica ou parte da planta transgênica, em que a referida célula vegetal, planta ou parte da planta expressa uma quantidade eficaz como inseticida do shRNA. Em outro aspecto, a praga de inseto é das Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera ou Trichoptera. Em outros aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em alguns aspectos, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0020] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método de inibição do crescimento ou de exterminação de uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo de shRNA recombinante. Em um aspecto, o método de inibição do crescimento ou de exterminação de uma praga de inseto compreende adicionalmente a exposição da praga de inseto a uma célula vegetal transgênica, planta transgênica ou parte da planta transgênica, em que a referida célula vegetal, planta ou parte da planta expressa uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptídeo de shRNA recombinante. Em outro aspecto, a praga de inseto é das Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera ou Trichoptera. Em outro aspecto, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0021] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para o controle de uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida, compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida do polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o método compreende adicionalmente colocar a população em contato com uma quantidade eficaz como inseticida do shRNA, em que a proteína pesticida é selecionada do grupo que consiste em uma proteína CrylAc, uma proteína CrylAb, uma proteína Cry1A.105, uma proteína CrylAc, uma proteína Cry1 F, uma proteína Cry1 Fa2, uma proteína Cryl F, uma proteína Cry2Ab, uma proteína Cry3A, uma proteína mCry3A, uma proteína Cry3Bb1, uma proteína Cry34Ab1, uma proteína Cry35Ab1, uma proteína Vip3A, uma proteína Cry9c, uma proteína eCry3.1Ab, uma proteína CBI-Bt, uma proteína patatina, uma proteína de lectina vegetal, uma proteína fitoecdisteroide, uma proteína inseticida de Xenorhabdus, uma proteína inseticida de Photorhabdus, uma proteína inseticida de Bacillus laterosporous e uma proteína inseticida de Bacillus sphaericus. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a exposição da praga de inseto a uma célula vegetal transgênica, planta transgênica ou parte da planta transgênica, em que a referida célula vegetal, planta ou parte da planta expressa uma quantidade eficaz como inseticida do shRNA. Em outro aspecto, a praga de inseto é das Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera ou Trichoptera. Em um aspecto adicional, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID N os:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0022] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para a proteção de uma planta de uma praga de inseto, compreendendo a expressão na planta ou célula da mesma de uma quantidade eficaz como inseticida do polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o método compreende adicionalmente colocar a praga de inseto em contato com a uma célula vegetal transgênica, planta transgênica ou parte da planta transgênica, em que a referida célula vegetal, planta ou parte da planta expressa uma quantidade eficaz como inseticida do shRNA. Em outro aspecto, a praga de inseto é das Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera ou Trichoptera. Em alguns aspectos, a planta é plantada em um campo de cultura. Em aspectos adicionais, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0023] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método de redução da probabilidade de emergência de pragas de insetos que são resistentes a plantas transgênicas, compreendendo a expressão do polinucleotídeo de shRNA dentro de uma planta. Em um aspecto, o shRNA é expresso em combinação com uma proteína inseticida que tem um modo de ação diferente em comparação com o shRNA. Em outro aspecto, a praga de inseto é das Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera ou Trichoptera. Em um aspecto adicional, a planta é plantada em um campo de cultura. Em alguns aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0024] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um método para manejo de resistência de insetos, compreendendo a expressão do polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto, o shRNA é coexpresso com uma ou mais moléculas inseticidas que são tóxicas para pragas de insetos em uma planta transgênica. Em outro aspecto, o shRNA e as outras moléculas inseticidas exibem diferentes modos de ação de atividade inseticida contra as pragas de insetos. Em aspectos adicionais, a atividade inseticida é a mortalidade ou inibição do crescimento do inseto. Em outros aspectos, a praga de inseto é das Ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera ou Trichoptera. Em alguns aspectos, a outra molécula inseticida é uma proteína Cry. Em aspectos adicionais, a outra molécula inseticida é uma proteína VIP. Em aspectos adicionais, a outra molécula inseticida é uma molécula pequena de RNA. Em alguns aspectos, a planta transgênica é plantada em um campo de cultura. Em alguns aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em aspectos adicionais, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0025] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma composição compreendendo uma quantidade eficaz como inseticida do polinucleotídeo de shRNA.

Em um aspecto, o método compreende adicionalmente um veículo adequado para agricultura, um tensoativo, um organossilicone, um fitoprotetor, um fertilizante, um micronutriente, um atrativo para insetos e um regulador do crescimento de insetos.

Em alguns aspectos, o veículo é selecionado do grupo que consiste em um pó, uma poeira, péletes, grânulos, spray, emulsão, coloide e solução.

Em outros aspectos, a composição compreende adicionalmente um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas.

Em outro aspecto, a composição compreende adicionalmente um ou mais inseticidas são proteínas pesticidas.

Em aspectos adicionais, a uma ou mais proteínas pesticidas são selecionadas do grupo que consiste em uma proteína Cry1, uma proteína Cry2, uma proteína Cry3, uma proteína Cry4, uma proteína Cry5, uma proteína Cry6 , uma proteína Cry7, uma proteína Cry8, uma proteína Cry9, uma proteína Cry15, proteína Cry22, uma proteína Cry23, uma proteína Cry32, uma proteína Cry34, uma proteína Cry35, uma proteína Cry36, uma proteína Cry37, uma proteína Cry43, uma proteína Cry46, uma proteína Cry51, uma proteína Cry55, uma toxina binária Cry, uma proteína Cyt , uma toxina VIP, uma proteína SIP, uma lipase inseticida, uma quitinase inseticida, uma proteína do veneno de cobra, uma proteína patatina, uma proteína de lectina de planta, uma proteína fitoecdisteroide, uma proteína inseticida de Xenorhabdus, uma proteína inseticida de Photorhabdus, uma proteína inseticida de Bacillus laterosporous e uma proteína inseticida de Bacillus sphaericus.

Em outros aspectos, o um ou mais inseticidas são produtos químicos pesticidas.

Em aspectos adicionais, o um ou mais produtos químicos pesticidas são selecionados do grupo que consiste em piretrinas e piretroides sintéticos; derivados de oxadizina; cloronicotinilas; derivados de nitroguanidina; triazóis; organofosforados; pirróis; pirazóis;

fenilpirazóis; diacil-hidrazinas; produtos biológicos/de fermentação e carbamatos. Em outro aspecto, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em um aspecto adicional, o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0026] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (b) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (c) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421, em que a ingestão por uma praga de inseto de uma sequência de ribonucleotídeos de fita dupla compreendendo pelo menos uma fita que é complementar ao referido fragmento inibe o crescimento da referida praga; e um polinucleotídeo compreendendo um complemento da sequência de (a), (b) ou (c); em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor heterólogo. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico recombinante está compreendida em um vetor de transformação de planta. Em outra modalidade da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma sequência de ribonucleotídeos de fita dupla produzida a partir da expressão da molécula de ácido nucleico que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ

ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (b) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (c) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421, em que a ingestão da referida sequência de ribonucleotídeos por uma praga de inseto inibe o crescimento da referida praga. Em um aspecto, a ingestão da sequência de ribonucleotídeos pela praga inibe a expressão de uma sequência nucleotídica complementar a uma região de haste de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em outra modalidade da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma célula transformada com a molécula de ácido nucleico recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (b) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (c) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em um aspecto, a célula é uma célula procariótica, uma célula eucariótica, uma célula bacteriana ou uma célula vegetal.

[0027] Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a uma planta transformada com a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (b) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (c) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico recombinante é expressa em uma célula da planta como uma sequência de ribonucleotídeos de fita dupla e resulta em atividade inseticida contra a praga de inseto. Em outro aspecto, a ingestão da quantidade inibidora de praga de inseto da sequência de ribonucleotídeos de fita dupla mata ou inibe o crescimento e/ou alimentação da praga de inseto. Em modalidades da presente divulgação, a divulgação refere-se a um produto de consumo produzido a partir de uma planta, em que o referido produto de consumo compreende a molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (b) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421; (c) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

[0028] As características anteriores e outras se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir de várias modalidades, que prossegue com referência às Figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] Figura 1. Esse desenho representa os componentes estruturais da molécula de shRNA. A "Estrutura em forma de grampo" da molécula de shRNA é uma alça não pareada do polinucleotídeo de shRNA de fita simples que é criada quando o polinucleotídeo de shRNA se dobra e forma pares de bases com outra seção da mesma fita do polinucleotídeo de shRNA. A "Estrutura de haste" da molécula de shRNA é uma sequência polinucleotídica predominantemente de fita dupla do polinucleotídeo de shRNA de fita simples que é criada quando o polinucleotídeo de shRNA se dobra e forma pares de bases de fita dupla com outra seção da mesma fita do polinucleotídeo de shRNA. A "Sequência de reconhecimento de DICER" é outro componente estrutural da molécula de shRNA. A enzima DICER pode reconhecer, se ligar a e clivar as sequências de reconhecimento de DICER da molécula de shRNA. Uma estrutura final que pode ser adicionada e incluída na molécula de shRNA é fornecida nesse desenho e rotulada como uma "Estrutura de projeção adicional".

[0030] Figura 2. Representação em forma de desenho de miRNA nativo e RNA curto/pequeno em forma de grampo (shRNA). Figura 2A. miRNA nativo. A sequência de miRNA precursor (pré-miRNA) que é clivada pela proteína DROSHA é mostrada com o colchete. A DICER-1 de inseto cliva a alça de miRNA, liberando o miRNA maduro que está destacado para indicar a fita guia e a fita STAR. Figura 2B. shRNA. Esta molécula não é reconhecida ou clivada pela proteína DROSHA, pois tem menos de 70 pares de bases de comprimento. A enzima DICER-1 de inseto cliva a alça de shRNA, liberando o shRNA maduro que está destacado para indicar a fita guia e a fita STAR. A fita guia é projetada para corresponder a um polinucleotídeo-alvo selecionado, por exemplo, o RNAm de um gene-alvo endógeno.

[0031] Figura 3. Esse desenho fornece um esquema das sequências de pré-miRNA de miR-1 e bantam de Diabrotica, Tribolium e Drosophila que foram usadas para identificar arcabouços para a estrutura de grampo do projeto de shRNA. As sequências foram identificadas conforme descrito nos Exemplos. As fitas guia e STAR/passageira são destacadas. Essas fitas foram previstas com base na abundância de pequeno RNAseq em miRBase (mirbase.org/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores usando o prefixo "www"; veja também Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441). A estrutura de IRRNA.27482.8 é fornecida como SEQ ID Nº:1. A estrutura de IRRNA.25074.6 é fornecida como SEQ ID Nº:6. A estrutura de IRRNA.27480.2 é fornecida como SEQ ID Nº:2. A estrutura de IRRNA.28297.1 é fornecida como SEQ ID Nº:3. A estrutura de IRRNA.28298.1 é fornecida como SEQ ID Nº:4. A estrutura de IRRNA.28299.1 é fornecida como SEQ ID Nº:5. As sequências foram dobradas usando o programa de computador RNAStructure Versão 5.5 J.S. Reuter e D.H. Mathews (2010) BMC Bioinformatics, 11:129.

[0032] Figura 4. Esse desenho fornece um esquema das sequências de shRNA projetadas para incluir as estruturas de grampo que foram descritas na Figura 3. Essas sequências de shRNA contêm uma estrutura de haste que foi projetada para ter como alvo o gene COPIα endógeno da lagarta da raiz do milho ocidental (por exemplo, WCR, do inglês "Western Corn Rootworm"). Com relação à estrutura de haste; são destacadas a fita STAR e a fita antissenso do siRNA4 de COPIα. As sequências polinucleotídicas da estrutura de grampo não são destacadas. As sequências foram dobradas no programa de computador RNAStructure Versão 5.5 J.S. Reuter e D.H. Mathews (2010) BMC Bioinformatics, 11:129.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0033] As sequências de ácidos nucleicos mencionadas na listagem de sequências anexa são mostradas usando abreviações de letras padrão para bases nucleotídicas, conforme definido em 37 C.F.R. §

1.822. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos mencionadas definem moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) com os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos arranjados da maneira descrita. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos mencionadas também definem cada uma um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos compreendendo os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos arranjados da maneira descrita. Tendo em vista a redundância do código genético, será entendido que uma sequência nucleotídica incluindo uma sequência codificante também descreve o gênero de polinucleotídeos que codificam o mesmo polipeptídeo que um polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Será ainda entendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero de ORFs polinucleotídicos que codificam esse polipeptídeo.

[0034] Apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, porém a fita complementar é entendida como incluída por qualquer referência à fita exibida. Como o complemento e o complemento reverso de uma sequência primária de ácido nucleico são necessariamente divulgados pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de uma sequência de ácido nucleico estão incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, exceto onde explicitamente indicado em contrário (ou de outro modo é evidente a partir do contexto em que a sequência aparece). Além disso, como é entendido na técnica que a sequência nucleotídica de uma fita de RNA é determinada pela sequência do DNA a partir do qual foi transcrita (mas com a substituição de nucleobases de uracila (U) por timina (T)), uma sequência de RNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão Geral de Várias Modalidades

[0035] O RNA pequeno/curto em forma de grampo (shRNA) da presente divulgação fornece uma nova molécula estrutural de RNA pequeno (sRNA, do inglês "small RNA") para inibir um gene-alvo por supressão da expressão do RNAm do gene-alvo. O uso de RNA de inibição/interferência foi aplicado por meio do uso de shRNA in planta para conferir resistência contra espécies de insetos. Geralmente, este sistema resulta na introdução de uma molécula de shRNA em uma célula vegetal e no processamento subsequente da molécula de shRNA por proteínas endógenas do hospedeiro usando um mecanismo que no geral não coincide com o processamento de moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA, do inglês "double stranded RNA"). A absorção da molécula de shRNA por uma praga de inseto geralmente ocorre quando a praga de inseto entra em contato com a molécula de shRNA por meio da ingestão oral do material vegetal que contém a molécula de shRNA. Assim, a identificação de novas moléculas de shRNA pesticidas para o controle de espécies de insetos é benéfica para os sistemas modernos de produção de culturas.

[0036] Estudos anteriores indicaram que um comprimento mínimo de ~70 nucleotídeos de RNA de fita dupla é necessário para a resposta de RNAi oral em espécies de insetos, tais como a lagarta da raiz do milho ocidental (Bolognesi et al. (2012) PLoS One 7 (10):e47534). Assim, é provável que o processamento de moléculas pequenas de RNA, tais como microRNA, resulte em um efeito de RNAi ineficiente devido ao comprimento curto da molécula ou ao baixo nível de pareamento de bases no miRNA.

[0037] Os microRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes de proteína, geralmente com cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, que orientam a clivagem em trans de transcritos de RNA-

alvo, regulando negativamente a expressão de genes (Ambros (2001) Cell 107 (7):823-6; Bartel (2004) Cell 116 (2):281-97). Numerosos genes de miRNA foram identificados e são publicamente disponibilizados em um banco de dados ("miRBase" Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441). Os miRNAs foram relatados pela primeira vez em nematódeos e, desde então, foram identificados em outros invertebrados; veja, por exemplo, Lee e Ambros (2001) Science, 294:862-864; Lim et al. (2003) Genes Dev., 17:991-1008; Stark et al. (2007) Genome Res., 17:1865-1879. A transcrição de genes de miRNA pode estar sob o controle do próprio promotor de um gene de miRNA. No entanto, as vias de biogênese de microRNAs podem variar dependendo de suas origens genômicas, por exemplo, até um terço dos miRNAs de animais são considerados como sendo derivados de íntrons (mirtrons) (Okamura et al. (2008) Cell Cycle 7 (18):2840-2845; Westholm e Lai (2011) Biochimie 93 (11):1897-1904). Os genes de miRNA podem ser isolados ou aparecer em grupos no genoma; eles também podem estar localizados total ou parcialmente dentro de íntrons tanto dos codificantes de proteína como não codificantes de proteína, veja Kim (2005) Nature Rev. Mol Cell Biol., 6:376-385; (Westholm e Lai (2011) Biochimie 93 (11):1897-1904). O transcrito primário (pri-miRNA) pode ser bastante longo (vários quilobases) e pode ser monocistrônico ou policistrônico, contendo um ou mais miRNAs precursores (pré- miRNAs) (estruturas dobráveis contendo um arranjo haste-alça que é processado no miRNA maduro), bem como o cap 5′ usual e a cauda poliadenilada de um RNAm. Veja, por exemplo, a FIGURA 1 em Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385.

[0038] A biogênese de um miRNA maduro a partir de seus precursores correspondentes difere significativamente entre animais e plantas. Em células vegetais, acredita-se que moléculas de microRNA precursor (pré-miRNA) são em geral processadas para o miRNA maduro inteiramente no núcleo. Em comparação, em células animais, os transcritos de pri-miRNA são processados no núcleo pela enzima específica de animal DROSHA (Lee et al. (2003) Nature 425 (6956):415- 419), seguido pela exportação do pré-miRNA para o citoplasma onde é posteriormente processado para o miRNA maduro por DICER em mamíferos e C. elegans (Bernstein et al. (2001) Nature 409 (6818):363- 366) ou DICER-1 em insetos (Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81; Tsutsumi et al. (2011) Nat Struct Mol Biol 18 (10):1153-1158), para uma ilustração veja a Figura 1 em (Axtell et al. (2011) Genome Biol 12 (4):221). Os miRNAs de animais têm muitas características diferentes de suas contrapartes de plantas. Os miRNAs de animais têm estruturas de miRNA precursor (pré-miRNA) mais curtas de cerca de 60 a 80 nucleotídeos, em comparação com as plantas com uma estrutura de miRNA precursor mais heterogênea, variando de 70 a centenas de nucleotídeos de comprimento, para uma revisão veja (Axtell, Westholm e Lai (2011) Genome Biol 12 (4):221). A região de haste do miRNA animal geralmente tem hibridização imperfeita. Além disso, os miRNAs precursores (pré-miRNAs) animais têm estrutura principalmente uniforme, três voltas helicoidais (aproximadamente 33 nucleotídeos) de uma sequência de RNA majoritariamente de fita dupla conectada por uma alça pequena e flanqueada por uma sequência principalmente de fita simples (Zeng e Cullen (2005) J Biol Chem 280 (30):27595-27603; Han et al. (2006) Cell 125 (5):887-901).

[0039] Normalmente, DROSHA, uma enzima RNase tipo III, cliva o pri-miRNA dentro do núcleo da célula, liberando assim a molécula de pré-miRNA. Estudos empíricos do comprimento e composição das regiões não estruturadas que flanqueiam o pré-miRNA indicam que comprimentos variáveis de extensões são necessários para reconhecimento e clivagem eficientes por DROSHA, dependendo do miRNA (~10 a 40 nt), enquanto a composição da sequência das extensões não era relativamente importante (Chen et al. (2004) Science 303 (5654):83-86; Zeng e Cullen (2005) J Biol Chem 280 (30):27595- 27603). As três voltas helicoidais de RNA de fita dupla seguidas por regiões não estruturadas são necessárias para a recondição de complexo DROSHA-DGCR8 que libera pré-miRNA de ~60 a 80 nucleotídeos de comprimento (Zeng e Cullen (2005) J Biol Chem 280 (30):27595-27603; Han et al. (2006) Cell 125 (5):887-901). DGCR8 também é conhecido como parceiro de DROSHA ou PASHA (Denli et al. (2004) Nature 432 (7014):231-235). A molécula de pré-miRNA liberada tem cerca de três voltas helicoidais de hélice de fita dupla de comprimento que é conectada por uma alça curta. Os pré-miRNAs de animais são então exportados para o citoplasma por Exportin-5 Yi et al. (2003) Genes Dev 17 (24):3011-3016), enquanto os pré-miRNAs de plantas são processados por DICER no núcleo (Papp et al. (2003) Plant Physiol 132 (3):1382-1390).

[0040] Em seguida, a molécula de pré-miRNA animal é exportada para o citoplasma, onde é processada por outra RNase tipo III, DICER. A molécula DICER cliva o pré-miRNA para liberar a sequência de alça e produzir uma molécula de miRNA maduro. A molécula de miRNA maduro resultante tem cerca de 21 a 23 pb de comprimento. Esta molécula é composta por uma fita guia e uma fita STAR/passageira. O miRNA maduro interage com uma proteína Argonaute, predominantemente Argonaute 1 (AGO1). A fita guia do miRNA é subsequentemente integrada no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC, do inglês "RNA-induced silencing complex"). A molécula estrutural de miRNA resultante e AGO-RISC, então, inibem um gene-alvo por supressão da expressão do RNAm do gene-alvo.

[0041] Uma das principais diferenças no processamento de miRNA vs. dsRNA entre insetos e outros animais é que os insetos têm duas DICERs. Os dsRNAs são processados em RNAs pequenos de interferência (siRNAs, do inglês "small interfering RNAs") pela ribonuclease tipo III de inseto, DICER-2. (Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81). Estudos em insetos coleópteros também demonstram que DICER-2 e AGO2 estão envolvidos nas vias de dsRNA de Tribolium castaneum (Tomoyasu et al. (2008) Genome Biol 9 (1):R10) e Diabrotica virgifera virgifera (Miyata et al. (2014) PLoS One 9 (7):e101661; Vélez et al. (2016) PLoS One 11 (6):e0157520). DICER-1 é específica para miRNA de inseto (Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81; Tsutsumi et al. (2011) Nat Struct Mol Biol 18 (10):1153-1158). O substrato de DICER-1 é um produto de DROSHA (pré-miRNA) que possui as seguintes características: A DICER-1 de inseto reconhece um duplex de RNA de aproximadamente 22 pares de bases; o duplex ou haste de RNA pode ter mal pareamento de bases, mas os mal pareamentos não são necessários para reconhecimento eficiente de DICER -1 (Tsutsumi et al. (2011) Nat Struct Mol Biol 18 (10):1153-1158)). A eficiência do processamento por DICER-1 diminui à medida que o comprimento do duplex de RNA aumenta para 25 pares de bases ou mais. A haste do pré-miRNA tem uma projeção 5’ de dois nucleotídeos que pode estar pareada ou "solta"; extremidades pareadas cegas ou soltas não são substratos eficazes de DICER-1 (Tsutsumi et al. (2011) Nat Struct Mol Biol 18 (10):1153-1158)).

[0042] Ao contrário dos miRNAs de insetos e outros animais, que são clivados de seus transcritos primários por duas enzimas de biogênese, primeiro no núcleo e depois no citoplasma, os miRNAs de plantas são processados por uma única enzima no núcleo. Os pré- miRNAs de plantas são gerados por uma de quatro proteínas do tipo DICER (DCL, do inglês "DICER-like"), sendo DCL1 a principal proteína de biogênese de miRNA. Ao contrário dos animais, a proteína DCL1 pode clivar tanto na base quanto na alça. O processamento geralmente inicia na base do pri-miRNA em forma de grampo, mas processamento

"alça primeiro" também pode ocorrer (Kurihara e Watanabe (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101 (34):12753-12758; Bologna et al. (2009) EMBO J 28 (23):3646-3656; Addo-Quaye et al. (2009) RNA 15 (12):2112- 2121). Antes do transporte do miRNA vegetal do núcleo, suas projeções 3′ são metiladas por uma proteína RNA metiltransferase, Hua- Enhancer1 (HEN1). O miRNA metilado é então transportado do núcleo para o citoplasma pela proteína Hasty (HST), um homólogo da Exportina

5. Para uma revisão da biogênese de miRNA em plantas e animais, veja (Kim (2005) Nat Rev Mol Cell Biol 6 (5):376-385) (Axtell, Westholm e Lai (2011) Genome Biol 12 (4):221). Revisões adicionais sobre a biogênese e função de miRNAs são encontradas, por exemplo, em Ha e Kim (2014) Nat Rev Mol Cell Biol 15 (8):509-524; Bartel (2004) Cell, 116:281-297; Murchison e Hannon (2004) Curr. Opin. Cell Biol., 16:223-229; e Dugas e Bartel (2004) Curr. Opin. Plant Biol., 7:512-520.

[0043] A proteína Arognaute-1 (AGO1) foi proposta como mediando uma repressão guiada por miRNA da tradução de RNAm ou como acelerando a degradação de RNAm (Valencia-Sanchez et al. (2006) Genes Dev 20 (5):515-524). Por outro lado, a atividade de clivagem da Arognaute-2 (AGO2) foi assumida como sendo guiada por siRNAs derivados de dsRNA. Em mamíferos, apenas AGO2 tem atividade de clivagem/"cortadora" de RNAm (Rivas et al. (2005) Nat Struct Mol Biol 12 (4):340-349; Liu et al. (2004) Science 305 (5689):1437-1441; Meister et al. (2004) Mol Cell 15 (2):185-197). Em Drosophila, tanto AGO1 quanto AGO2 têm atividade "cortadora", mas AGO1 é uma nuclease ineficiente (Förstemann et al. (2007) Cell 130 (2):287-297). Apesar dos miRNAs poderem interagir com AGO2, mal pareamentos centrais com o duplex de miRNA favorecem seu carregamento no complexo AGO1- RISC (Tomari et al. (2007) Cell 130 (2):299-308). A falta de mal pareamentos na haste de miRNAs promove seu encaminhamento para o complexo AGO1-RISC (Tomari et al. (2007) Cell 130 (2):299-308).

Assim, mal pareamentos na haste do miRNA e, por extensão, amiRNA, guiam o miRNA para AGO1, enquanto o pareamento/hibridização perfeito dentro de shRNA pode guiá-los para AGO2-RISC.

[0044] Os miRNAs de animais geralmente se anelam de forma imperfeita, com complementaridade tão pequena como de até sete nucleotídeos com suas extremidades 5', à região não traduzida (UTR, do inglês "untranslated region") 3' de seu RNAm-alvo (Brennecke et al. (2005) PLoS Biol 3 (3):e85). Por outro lado, a maioria dos miRNAs vegetais é caracterizada por ter complementaridade perfeita ou quase perfeita com sua sequência-alvo, que geralmente está na região codificante, com apenas alguns exemplos de miRNAs que têm sítios de ligação dentro das UTRs do RNAm-alvo; veja Rhoades et al. (2002) Cell, 110:513-520; Jones-Rhoades et al. (2006) Annu. Rev. Plant Biol., 57:19-

53. Essas diferenças significativas entre os miRNAs de plantas e animais fazem com que seja geralmente improvável que os miRNAs sejam processados e funcionem entre reinos.

[0045] Os miRNAs animais têm sido utilizados para a regulação transgênica em células animais; por exemplo, o precursor de miR-30 humano foi expresso como uma sequência de miRNA nativa ou como um miRNA modificado (miRNA artificial ou miRNA projetado, RNAs curtos em forma de grampo/RNA pequeno em forma de grampo (shRNA), RNA pequeno em forma de grampo orgânico (OshR), shRNAmir, shRNA-miR ou shmiR) em células cultivadas (Zeng et al. (2002) Mol. Cell, 9:1327-1333; Zeng et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:27595-27603; Chang et al. (2013) Cold Spring Harb Protoc 2013 (7):631-635; Zeng et al. (2013) Methods 63 (2):101-109). Arcabouços de miRNA adicionais baseados em miRNAs precursores e transcritos de miRNA primário foram otimizados para expressão transgênica eficiente de shRNA e moléculas relacionadas em sistemas de mamíferos (Chang et al. (2006) Nat Methods 3 (9):707-714; Yue et al.

(2010) Biochem Biophys Res Commun 394 (3):667-672; Fellmann et al. (2013) Cell Rep 5 (6):1704-1713; Lambeth e Smith (2013) Methods Mol Biol 942:205-232).

[0046] Um único miRNA maduro é precisamente processado a partir de um determinado precursor e, portanto, tais miRNAs "artificiais" (miRNA projetado, RNAs curtos/pequenos em forma de grampo (shRNA), shRNAmir, shRNA-miR, shmiRs, etc.) oferecem uma vantagem sobre o RNA de fita dupla (dsRNA) no sentido de que apenas uma sequência específica de miRNA é expressa, limitando potenciais efeitos fora do alvo. Embora os miRNAs animais normalmente interajam com sequências-alvo imperfeitas na UTR 3′, miRNAs artificiais com complementaridade perfeita com o alvo guiarão a clivagem do alvo (ver Zeng et al. (2003) RNA, 9:112-123 e Zeng et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:9779-9784).

[0047] Aproximadamente 150 miRNAs foram identificados nas espécies de Drosophila (Lai et al. (2003) Genome Biol 4 (7):R42; Ruby et al. (2007) Genome Res 17 (12):1850-1864; Stark et al. (2007) Genome Res 17 (12):1865-1879). Números que variam de 100s a 500s de miRNAs foram identificados em outros insetos, dependendo do nível de conservação examinado e da confiança das previsões (He et al. (2008) BMC Genomics 9:248; Luo et al. (2008) J Genet Genomics 35 (6):349-355; Chilana et al. (2013) Bioinformation 9 (2):79-83; Liang et al. (2013) PLoS One 8 (11):e78787; Lomate et al. (2014) Insect Biochem Mol Biol 54:129-137; Zhou et al. (2014) PLoS One 9 (7):e103041; Liu et al. (2014) Parasit Vectors 7:159; Kakumani et al. (2015) PLoS One 10 (2):e0116988). Os miRNAs de insetos conservados se enquadram em 65 famílias (Ylla et al. (2016) Sci Rep 6:37736). Um número ainda menor de miRNAs de inseto é conhecido por ser essencial para a sobrevivência do inseto. Esses miRNAs incluem let-7, bantam, miR-1, miR-14 e miR-279 em Drosophila melanogaster (Smibert e Lai (2008)

Cell Cycle 7 (16):2500-2508). Alternativamente, a superexpressão de miRNAs pode levar à letalidade ou fenótipos aberrantes em insetos (Schertel et al. (2012) Genetics 192 (4): 1543-52).

[0048] Os miRNAs artificiais de Drosophila melanogaster (amiRNAs), RNAs curtos/pequenos em forma de grampo (shRNA) ou shmiRs são precursores de miRNA onde a porção de miRNA maduro foi substituída por um siRNA que tem como alvo um gene de interesse. Os shRNAs têm alta eficácia quando expressos de forma transgênica em Drosophila (Haley et al., 2008; Ni et al., 2011). O processamento preferencial de shRNAs/shmiRs com DICER-1 foi validado usando dsRNA de DICER-1 e DICER-2 em cultura de células de Drosophila em combinação com Northern blots (Ni et al. (2011) Nat Methods 8 (5):405- 407). Assim, os shRNAs expressos de forma transgênica têm uma via de biogênese que é distinta do dsRNA. Além disso, os grampos shmiR de Drosophila podem interagir com AGO2 e AGO1 (Ni et al. (2011) Nat Methods 8 (5):405-407).

[0049] A presente divulgação é direcionada a composições e métodos para o controle de pragas de insetos por meio do uso de sequências polinucleotídicas de shRNA. São fornecidas no presente documento novas moléculas de shRNA que são compostas por uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste (Figura 1). Essas novas moléculas são estruturalmente distintas em comparação com as moléculas de miRNA conhecidas (Figura 2). Essas modificações estruturais da nova molécula de shRNA fornecem melhorias significativas em relação às moléculas de miRNA conhecidas. Por exemplo, a molécula de shRNA tem menos de 90 pares de bases, menos de 80 pares de bases ou menos de 70 pares de bases de comprimento e pode prescindir do processamento por proteínas endógenas do hospedeiro (por exemplo, DROSHA). Tal melhoria resulta na produção de uma molécula de shRNA madura com menos dependência do processamento por proteínas endógenas do hospedeiro, tais como DROSHA, de um organismo filogeneticamente não relacionado. A semelhança da estrutura do shRNA com a do pré- miRNA aumenta sua probabilidade de atuar como um substrato para DICER-1 de inseto. Além disso, as moléculas de shRNA descritas no presente documento carecem de mal pareamentos centrais em suas hastes, predispondo-as à associação com AGO2. Além disso, o uso de estrutura de miRNA de inseto provavelmente evitará o processamento de RNAi em uma planta, para a entrega de pré-miRNAs ou pri-miRNAs de inseto intactos para serem processados pela maquinaria de RNAi do inseto.

[0050] Polinucleotídeos exemplificativos que codificam as moléculas de shRNA inseticidas que conferem atividade inseticida contra as pragas de insetos são fornecidos. As moléculas biológicas da presente divulgação podem ser projetadas em cassetes de expressão gênica que são transformados em organismos vivos. Em particular, as sequências polinucleotídicas são úteis para a preparação de plantas, células vegetais, sementes de plantas, partes de plantas, composições e microrganismos que possuem atividade inseticida como conferida pelo polinucleotídeo de shRNA. Por exemplo, o polinucleotídeo de shRNA resulta em inibição significativa do crescimento e mortalidade de pragas de insetos. Além disso, o polinucleotídeo de shRNA pode ser usado para inibir um gene-alvo por supressão da expressão do RNAm do gene-alvo. Várias sequências polinucleotídicas-alvo (por exemplo, que correspondem ao RNAm do gene-alvo) podem ser incorporadas na região/estrutura de haste do polinucleotídeo de shRNA para uso na supressão da expressão de RNAm do gene-alvo dentro de outro organismo (por exemplo, a praga de inseto). O polinucleotídeo de shRNA pode ser usado para controlar, inibir o crescimento ou matar pragas de insetos. Da mesma forma, as composições resultantes que contêm a nova atividade inseticida podem ser usadas para controlar uma população de praga de inseto ou para reduzir a emergência de resistência de insetos em plantas transgênicas. Pela primeira vez, novas moléculas inseticidas que conferem atividade inseticida contra tais pragas de insetos são fornecidas no presente documento como uma molécula de shRNA. II. Termos e Abreviações

[0051] Em todo o pedido, diversos termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as seguintes definições são fornecidas.

[0052] Conforme usado no presente documento, os artigos, "um", "uma" e "o/a" incluem referências ao plural a menos que o contexto dite claramente e de modo não ambíguo de outro modo.

[0053] O termo "isolado", conforme usado no presente documento, significa ter sido removido de seu ambiente natural, ou removido de outros compostos presentes quando o composto é formado inicialmente. O termo "isolado" abrange materiais isolados de fontes naturais, assim como materiais (por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas) recuperados após a preparação por expressão recombinante em uma célula hospedeira, ou compostos quimicamente sintetizados, tais como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos.

[0054] O termo "purificado", conforme usado no presente documento, se refere ao isolamento de uma molécula ou composto em uma forma que é substancialmente livre de contaminantes normalmente associados à molécula ou composto em um ambiente nativo ou natural, ou substancialmente enriquecida em termos de concentração em relação a outros compostos presentes quando o composto é formado inicialmente, e significa que sua pureza aumentou como resultado de ser separado de outros componentes da composição original. O termo

"ácido nucleico purificado" é usado no presente documento para descrever uma sequência de ácido nucleico que foi separada, produzida separada de, ou purificada distante de outros compostos biológicos incluindo, mas sem limitação, polipeptídeos, lipídeos e carboidratos, enquanto se efetua uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser purificado de um cromossomo removendo-se os contaminantes proteicos e rompendo-se as ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo).

[0055] O termo "sintético", conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula polinucleotídica (isto é, um DNA ou RNA) que foi criada por meio de síntese química como um processo in vitro. Por exemplo, um DNA sintético pode ser criado durante uma reação em um tubo Eppendorf™, de modo que o DNA sintético seja enzimaticamente produzido a partir de uma fita nativa de DNA ou RNA. Outros métodos de laboratório podem ser usados para sintetizar uma sequência polinucleotídica. Os oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente em um sintetizador de oligo por meio de síntese em fase sólida com o uso de fosforamiditas. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser anelados um ao outro como um complexo, produzindo, assim, um polinucleotídeo "sintético". Outros métodos para sintetizar quimicamente um polinucleotídeo são conhecidos na técnica, e podem ser prontamente implementados para uso na presente divulgação.

[0056] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento, significa maior ou menor do que o valor ou faixa de valores declarados em 10 por cento, mas não é destinado a designar qualquer valor ou faixa de valores apenas dentro dessa definição mais ampla. Cada valor ou faixa de valores precedidos pelo termo "cerca de" também se destina a abranger a modalidade do valor absoluto ou faixa de valores declarados.

[0057] Para os fins da presente divulgação, um "gene" inclui uma região de DNA que codifica um produto gênico (veja abaixo), bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto gênico, independentemente de tais sequências reguladoras serem ou não adjacentes às sequências codificantes e/ou transcritas. Por conseguinte, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras da tradução, tais como sítios de ligação ao ribossomo e sítios de entrada interna ao ribossomo, potencializadores, silenciadores, isoladores, elementos de fronteira, origens de replicação, sítios de ligação à matriz, íntrons e regiões de controle de lócus.

[0058] Conforme usado no presente documento, os termos "nativo" ou "natural" definem uma condição encontrada na natureza. Uma "sequência de DNA nativa" é uma sequência de DNA presente na natureza que foi produzida por meios naturais ou técnicas tradicionais de melhoramento, mas não foi gerada por engenharia genética (por exemplo, com o uso de técnicas de biologia molecular/transformação).

[0059] Conforme usado no presente documento, um "transgene" é definido como uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto gênico, incluindo, por exemplo, mas sem limitação, um RNAm. Em uma modalidade o transgene/sequência codificante heteróloga é um ácido nucleico exógeno, em que o transgene/sequência codificante heteróloga foi introduzido em uma célula hospedeira por engenharia genética (ou a progênie da mesma) na qual o transgene/sequência codificante heteróloga não é normalmente encontrado. Em um exemplo, um transgene/sequência codificante heteróloga codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica uma característica agrícola desejável (por exemplo, um gene de resistência a herbicida). Em ainda outro exemplo, um transgene/sequência codificante heteróloga é uma sequência de ácido nucleico antissenso, em que a expressão da sequência de ácido nucleico antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico-alvo. Em uma modalidade, o transgene/sequência codificante heteróloga é um ácido nucleico endógeno, em que cópias genômicas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejáveis ou um ácido nucleico que esteja na orientação antissenso em relação à sequência de um ácido nucleico- alvo em um organismo hospedeiro.

[0060] Conforme usado no presente documento, "sequência codificante de DNA heteróloga" significa qualquer sequência codificante diferente daquela que codifica naturalmente a proteína de IRDIG37126 ou qualquer homólogo/variante da proteína de IRDIG37126 expressa. O termo "heterólogo" é usado no contexto da presente divulgação para qualquer combinação de sequências de ácidos nucleicos que não são normalmente encontradas intimamente associadas na natureza.

[0061] Um "produto gênico", conforme definido no presente documento, é qualquer produto produzido pelo gene. Por exemplo, o produto gênico pode ser o produto de transcrição direto de um gene (por exemplo, RNAm, RNAt, RNAr, RNA antissenso, RNA de interferência, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um RNAm. Os produtos gênicos também incluem RNAs que são modificados por processos tais como capeamento, poliadenilação, metilação e edição e proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ribosilação de ADP, miristilação e glicosilação. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão gênica. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte da via do DNA ao RNA à proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exemplo, por meio de controles que atuam na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, tais como RNAm, ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas proteicas específicas após as mesmas terem sido produzidas ou por combinações dos mesmos. A expressão gênica pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot ou ensaio(s) de atividade proteica in vitro, in situ ou in vivo.

[0062] Conforme usado no presente documento, o termo "expressão gênica" se refere ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (que inclui, por exemplo, DNA genômico) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, que inclui, frequentemente, a síntese de uma proteína. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão gênica. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte da via do DNA ao RNA à proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exemplo, por meio de controles que atuam na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, tais como RNAm, ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas proteicas específicas após as mesmas terem sido produzidas ou por combinações dos mesmos. A expressão gênica pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot ou ensaio(s) de atividade proteica in vitro, in situ ou in vivo.

[0063] Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" (ou "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo") pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, a qual pode incluir tanto fitas senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico", conforme usada no presente documento, é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". A molécula de ácido nucleico tem normalmente pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que especificado de outro modo. O termo pode se referir a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. O termo inclui formas de DNA de fita simples e dupla. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um de nucleotídeos de ocorrência natural e modificados, ou ambos, ligados entre si por ligações nucleotídicas de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.

[0064] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas química ou bioquimicamente, ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou derivadas, como será prontamente apreciado pelos especialistas na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotídicas (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamiditas, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções químicas pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, de fita dupla, parcialmente duplexadas, triplexadas, em formato de grampo, circulares e de cadeado.

[0065] A transcrição avança de maneira 5ʹ a 3ʹ ao longo de uma fita de DNA. Isso significa que o RNA é produzido pela adição sequencial de ribonucleotídeo-5ʹ-trifosfatos ao terminal 3' da cadeia em crescimento (com uma eliminação necessária do pirofosfato). Em uma molécula de ácido nucleico linear ou circular, elementos distintos (por exemplo, sequências nucleotídicas particulares) podem ser ditos como estando "a montante" ou "5ʹ" em relação a um outro elemento se forem ligados ou fossem ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5ʹ a partir desse elemento. De modo similar, elementos distintos podem estar "a jusante" ou "3ʹ" em relação a um outro elemento se forem ou fossem ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3ʹ a partir desse elemento.

[0066] Uma "posição" de base, conforme usada no presente documento, se refere à localização de um dado resíduo de nucleotídeo ou base em um ácido nucleico designado. O ácido nucleico designado pode ser definido por alinhamento (veja abaixo) com um ácido nucleico de referência.

[0067] Hibridização se refere à ligação de duas fitas polinucleotídicas por meio de ligações de hidrogênio. Os oligonucleotídeos e seus análogos se hibridizam por ligações de hidrogênio, que incluem as ligações de hidrogênio Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversas, entre bases complementares. Geralmente, as moléculas de ácido nucleico consistem em bases nitrogenadas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Essas bases nitrogenadas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é denominada "pareamento de bases". Mais especificamente, A fará ligação de hidrogênio com T ou U, e G se ligará a C. "Complementar" se refere ao pareamento de bases que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácido nucleico.

[0068] "Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade de modo que ligação estável e específica ocorra entre o oligonucleotídeo e o alvo de DNA ou RNA. O oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar à sua sequência-alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula de DNA ou RNA-alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA-alvo e existe um grau de complementaridade suficiente para evitar a ligação não específica do oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições em que a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é chamada de hibridização específica.

[0069] Condições de hibridização que resultam em graus específicos de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e comprimento das sequências de ácidos nucleicos da hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+) do tampão de hibridização contribuirão para a estringência da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a estringência. Os cálculos relativos às condições de hibridização exigidos para atingir graus específicos de estringência são discutidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, capítulos 9 e

11.

[0070] Conforme usado no presente documento, "condições estringentes" abrangem condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos do que 50% de mal pareamentos entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. "Condições estringentes" incluem adicionalmente níveis particulares de estringência. Desse modo, conforme usado no presente documento, condições de

"estringência moderada" são aquelas sob as quais moléculas com mais do que 50% de mal pareamentos da sequência não hibridizarão; condições de "alta estringência" são aquelas sob as quais sequências com mais do que 20% de mal pareamentos não hibridizarão; e condições de "estringência muito alta" são aquelas sob as quais sequências com mais do que 10% de mal pareamentos não hibridizarão.

[0071] Em modalidades particulares, condições estringentes podem incluir hibridização a 65°C, seguida de lavagens a 65°C com SSC 0,1x/0,1% de SDS por 40 minutos.

[0072] A seguir, são apresentadas condições de hibridização representativas e não limitantes: i. Estringência muito alta: Hibridização em tampão SSC 5x a 65°C por 16 horas; lavagem duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65°C por 20 minutos cada. ii. Alta estringência: Hibridização em tampão SSC 5x a 6x a 65 a 70°C durante 16 a 20 horas; lavagem duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão SSC 1x a 55 a 70°C por 30 minutos cada. iii. Estringência moderada: Hibridização em tampão SSC 6x à temperatura ambiente a 55°C durante 16 a 20 horas; lavagem pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x a 3x à temperatura ambiente a 55°C por 20 a 30 minutos cada.

[0073] Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência muito alta. Nessas e em outras modalidades, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de alta estringência. Nessas e em outras modalidades, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência moderada.

[0074] Conforme usado no presente documento, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados pela clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos ou pela polimerização de precursores de nucleotídeos individuais. Sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos com até várias centenas de pares de base de comprimento. Devido aos oligonucleotídeos poderem se ligar a uma sequência nucleotídica complementar, os mesmos podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA pequenas. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente chamado de "iniciador", o qual permite que uma DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.

[0075] Os termos "porcentagem de identidade de sequência" ou "porcentagem de identidade" ou "identidade" são usados de modo intercambiável para se referir a uma comparação de sequências com base em correspondências idênticas entre posições correspondentemente idênticas nas sequências sendo comparadas entre duas ou mais sequências de aminoácidos ou nucleotídeos. A porcentagem de identidade se refere à extensão em que duas sequências polinucleotídicas ou peptídicas alinhadas de modo otimizado são invariáveis ao longo de um quadro de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos. Experimentos de hibridização e algoritmos matemáticos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar a porcentagem de identidade. Muitos algoritmos matemáticos existem como programas de computador de alinhamento de sequências conhecidos na técnica que calculam a porcentagem de identidade. Esses programas podem ser classificados como programas de alinhamento global de sequências ou programas de alinhamento local de sequências.

[0076] Os programas de alinhamento global de sequências calculam a porcentagem de identidade de duas sequências por comparação de alinhamentos de ponta a ponta a fim de encontrar correspondências exatas, dividindo o número de correspondências exatas pelo comprimento das sequências mais curtas e então multiplicando por 100. Basicamente, a porcentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência polinucleotídica linear de uma molécula polinucleotídica de referência ("consulta") em comparação com uma molécula polinucleotídica de teste ("encontrada") quando as duas sequências são alinhadas de modo otimizado (com inserções, deleções ou lacunas nucleotídicas apropriadas).

[0077] Os programas de alinhamento local de sequências são similares em seu cálculo, mas apenas comparam fragmentos alinhados das sequências em vez de utilizar uma análise de ponta a ponta. Programas de alinhamento local de sequências, tais como o BLAST, podem ser usados para comparar regiões específicas de duas sequências. Uma comparação de BLAST de duas sequências resulta em um valor E, ou valor esperado, que representa o número de alinhamentos diferentes com escores equivalentes ou melhores do que o escore de alinhamento bruto, S, que se espera que ocorram em uma pesquisa de banco de dados ao acaso. Quanto menor o valor E, mais significativa é a correspondência. Devido ao tamanho do banco de dados ser um elemento em cálculos do valor E, os valores E obtidos por BLASTing em bancos de dados públicos, tais como GENBANK, geralmente têm aumentado ao longo do tempo para qualquer dada correspondência de consulta/entrada. Na definição de critérios para a confiança de previsão da função polipeptídica, uma correspondência "alta" de BLAST é considerada no presente documento como tendo um valor E para o acerto de BLAST superior menor do que 1E-30; um valor E médio de BLASTX é de 1E-30 a 1E-8 e um valor E baixo de BLASTX é maior do que 1E-8. A atribuição de função proteica na presente divulgação é determinada com o uso de combinações de valores E, porcentagem de identidade, cobertura de consulta e cobertura de acerto. A cobertura de consulta se refere à porcentagem da sequência de consulta que é representada no alinhamento de BLAST. A cobertura de acerto se refere à porcentagem da entrada de banco de dados que é representada no alinhamento de BLAST. Em uma modalidade da divulgação, a função de um polipeptídeo de consulta é inferida a partir da função de uma sequência proteica conservada em que ou (1) hit_p<1e-30 ou % de identidade >35% E query_coverage >50% E hit_coverage >50%, ou (2) hit_p<1e-8 E query_coverage >70% E hit_coverage >70%. As seguintes abreviações são produzidas durante uma análise de BLAST de uma sequência.

fornece a SEQ ID Nº para as sequências SEQ_NUM polinucleotídicas recombinantes listadas.

fornece um nome de sequência arbitrário retirado do CONTIG_ID nome do clone do qual a sequência de cDNA foi obtida.

fornece a SEQ ID Nº para a sequência polipeptídica PROTEIN_NUM recombinante fornece o número de ID do GenBank para o acerto de BLAST superior para a sequência. O acerto de BLAST NCBI_GI superior é indicado pelo Número de Identificador do National Center for Biotechnology Information GenBank.

se refere à descrição do acerto de BLAST superior do NCBI_GI_DESCRIPTION GenBank para a sequência.

fornece o valor esperado para a correspondência do E_VALUE BLAST superior.

MATCH_LENGTH fornece o comprimento da sequência que é alinhada na correspondência do BLAST superior se refere à porcentagem de nucleotídeos (ou resíduos) correspondidos identicamente que existem TOP_HIT_PCT_IDENT ao longo do comprimento daquela porção das sequências que está alinhada na correspondência do BLAST superior.

indica o esquema de classificação usado para CAT_TYPE classificar a sequência. GO_BP = Gene Consórcio de Ontologia - processo biológico; GO_CC = Consórcio de Ontologia Genética - componente celular; GO_MF = Consórcio de Ontologia Genética - função molecular; KEGG = hierarquia funcional KEGG (KEGG = Enciclopédia de Quioto de genes e genomas); EC = Classificação de Enzimas do banco de dados ENZYME, versão 25.0; POI = Vias de Interesse.

fornece a subcategoria do esquema de classificação CAT_DESC ao qual a sequência de consulta foi atribuída.

fornece a categoria de anotação FunCAT à qual a PRODUCT_CAT_DESC sequência de consulta foi atribuída.

fornece a descrição do acerto do BLAST que resultou PRODUCT_HIT_DESC em atribuição da sequência à categoria de função fornecida na coluna cat_desc.

fornece o valor E para o acerto do BLAST na coluna HIT_E hit_desc.

se refere à porcentagem de nucleotídeos (ou resíduos) correspondidos identicamente que existem ao longo do PCT_IDENT comprimento daquela porção das sequências que está alinhada na correspondência do BLAST fornecida em hit_desc.

mostra a faixa da sequência de consulta alinhada com QRY_RANGE o acerto.

mostra a faixa da sequência de acerto alinhada com HIT_RANGE a consulta.

fornece a porcentagem do comprimento da sequência QRY_CVRG de consulta que corresponde ao acerto (NCBI).

sequência na correspondência do BLAST (% de cobertura da consulta = (comprimento da correspondência/comprimento total da consulta) × 100).

fornece a porcentagem do comprimento da sequência de acerto que corresponde à sequência de consulta HIT_CVRG na correspondência gerada com o uso de BLAST (% de cobertura do acerto = (comprimento da correspondência/comprimento total do acerto) × 100).

[0078] Os métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos. Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso de um programa de alinhamento AlignX do pacote Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). O programa de alinhamento AlignX é um programa de alinhamento global de sequências para polinucleotídeos ou proteínas. Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa MegAlign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (MegAlign™ (©1993- 2016). DNASTAR. Madison, WI). O programa MegAlign é um programa de alinhamento global de sequências para polinucleotídeos ou proteínas. Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote Clustal de programas de alinhamento, incluindo, mas sem limitação, ClustalW e ClustalV (Higgins e Sharp (1988) Gene. 15 de dezembro;73(1):237-244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al. (1992) Comput. Appl.

Biosci. 8:189-191). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas GCG (Wisconsin Package Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento BLAST, por exemplo, mas sem limitação, BLASTP, BLASTN, BLASTX, etc. (Altschul et al. (1990) J.

Mol.

Biol. 215: 403-410). Outros exemplos de tais programas de alinhamento BLAST incluem Gapped-BLAST ou PSI-BLAST (Altschul et al., 1997). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento FASTA, incluindo, mas sem limitação, FASTA, TFASTX, TFASTY, SSEARCH, LALIGN, etc. (Pearson (1994) Comput.

Methods Genome Res. [Proc.

Int.

Symp], Data da reunião 1992 (Suhai e Sandor, Eds.), Plenum: Nova Iorque, NY, páginas 111-120). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento T-Coffee (Notredame, et. al. (2000) J.

Mol.

Biol. 302, 205-217). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento DIALIGN, incluindo, mas sem limitação, DIALIGN, CHAOS, DIALIGN-TX, DIALIGN-T, etc. (Al Ait, et al. (2013) "DIALIGN at GOBICS" Nuc.

Acids Research 41, W3-W7). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento

MUSCLE (Edgar (2004) Nucleic Acids Res. 32(5): 1792-1797). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento MAFFT (Katoh, et al. (2002) Nucleic Acids Research 30(14): 3059-3066). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa Genoogle (Albrecht, Felipe. arXiv150702987v1 [cs.DC] 10 de julho de 2015). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do conjunto de programas HMMER (Eddy. (1998) Bioinformatics, 14:755-763). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento PLAST, incluindo, mas sem limitação, TPLASTN, PLASTP, KLAST e PLASTX (Nguyen e Lavenier. (2009) BMC Bioinformatics, 10:329). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento USEARCH (Edgar (2010) Bioinformatics 26(19), 2460- 2461). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento SAM (Hughey e Krogh (janeiro de 1995) Technical Report UCSC0CRL-95-7, Universidade da Califórnia, Santa Cruz). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do IDF Searcher (O'Kane, K.C., "The Effect of Inverse Document Frequency Weights on Indexed Sequence Retrieval",

Online Journal of Bioinformtics, Volume 6 (2) 162-173, 2005). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Parasail. (Daily, Jeff. "Parasail: SIMD C library for global, semi-global, and local pairwise sequence alignments". BMC Bioinformatics. 17:18. 10 de fevereiro de 2016). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento ScalaBLAST (Oehmen C, Nieplocha J. "ScalaBLAST: A scalable implementation of BLAST for high-performance data-intensive bioinformatics analysis". IEEE Transactions on Parallel & Distributed Systems 17 (8): 740-749 agosto de 2006). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento SWIPE (Rognes, T. "Faster Smilth- Waterman database searches with inter-sequence SIMD parallelization". BMC Bioinformatics. 12:221 (2011)). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento ACANA (Weichun Huang, David M.

Umbach e Leping Li, "Accurate anchoring alignment of divergent sequences". Bioinformatics 22:29-34, 1 de janeiro de 2006). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento DOTLET (Junier, T. e Pagni, M. "DOTLET: diagonal plots in a web browser". Bioinformatics 16(2): 178-179 fevereiro de 2000). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento G-PAS (Frohmberg, W., et al. "G-PAS 2.0 – an improved version of protein alignment tool with an efficient backtracking routine on multiple GPUs". Bulletin of the Polish Academy of Sciences Technical Sciences, Vol. 60, 491 novembro de 2012). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento GapMis (Flouri, T. et. al., "Gap Mis: A tool for pairwise sequence alignment with a single gap". Recent Pat DNA Gene Seq. 7(2): 84-95 agosto de 2013). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento EMBOSS, incluindo, mas sem limitação: Matcher, Needle, Stretcher, Water, Wordmatch, etc. (Rice, P., Longden, I. e Bleasby, A. "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite". Trends in Genetics 16(6) 276-277 (2000)). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Ngila (Cartwright, R. "Ngila: global pairwise alignments with logarithmic and affine gap costs". Bioinformatics. 23(11): 1427-1428. 1 de junho de 2007). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento probA, também conhecido como propA (Mückstein, U., Hofacker, IL e Stadler, PF. "Stochastic pairwise alignments". Bioinformatics 18 Suppl. 2:S153-160. 2002). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento SEQALN (Hardy, P. e Waterman, M.

The Sequence Alignment Software Library at USC. 1997).

Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas de alinhamento SIM, incluindo, mas sem limitação, GAP, NAP, LAP, etc. (Huang, X e Miller, W. "A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm". Advances in Applied Mathematics, vol. 12 (1991) 337-357). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento UGENE (Okonechnikov, K., Golosova, O. e Fursov, M. "Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit". Bioinformatics. 2012 28:1166-1167). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento BAli-Phy (Suchard, MA e Redelings, BD. "BAli-Phy: simultaneous Bayesian inference of alignment and phylogeny". Bioinformatics. 22:2047-2048. 2006). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Base-By-Base (Brodie, R., et. al. "Base-By-Base: Single nucleotide-level analysis of whole viral genoma alignments", BMC Bioinformatics, 5, 96, 2004). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento DECIPHER (ES Wright (2015) "DECIPHER: harnessing local sequence context to improve protein multiple sequence alignment." BMC Bioinformatics, doi:10.1186/s12859-015-0749-z.). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento FSA (Bradley, RK, et. al. (2009)

"Fast Statistical Alignment". PLoS Computational Biology. 5:e1000392). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Geneious (Kearse, M., et. al. (2012). "Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data". Bioinformatics, 28(12), 1647-1649). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Kalign (Lassmann, T. e Sonnhammer, E. "Kalign – an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm". BMC Bioinformatics 2005 6:298). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento MAVID (Bray, N. e Pachter, L. "MAVID: Constrained Ancestral Alignment of Multiple Sequences". Genome Res. abril de 2004; 14(4): 693-699). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento MSA (Lipman, DJ, et.al. "A tool for multiple sequence alignment". Proc.

Nat'l Acad.

Sci.

USA. 1989; 86:4412-4415). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento MultAlin (Corpet, F., "Multiple sequence alignment with hierarchial clustering". Nucl.

Acids Res., 1988, 16(22), 10881-10890). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento LAGAN ou MLAGAN (Brudno, et. al. "LAGAN e Multi-LAGAN: efficient tools for large-scale multiple alignment of genomic DNA". Genome Research abril de 2003; 13(4): 721-731). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Opal (Wheeler, T.J., e Kececiouglu, J.D. "Multiple alignment by aligning alignments". Anais da 15.a conferência ISCB em Sistemas Inteligentes de Biologia Molecular.

Bioinformatics. 23, i559- i568, 2007). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do pacote de programas PicXAA, incluindo, mas sem limitação, PicXAA, PicXAA-R, PicXAA-Web, etc. (Mohammad, S., Sahraeian, E. e Yoon, B. "PicXAA: greedy probabilistic construction of maximum expected accuracy alignment of multiple sequences". Nucleic Acids Research. 38(15):4917-4928. 2010). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento PSAlign (SZE, S.-H., Lu, Y. e Yang, Q. (2006) "A polinomial time solvable formulation of multiple sequence alignment" Journal of Computational Biology, 13, 309-319). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento StatAlign (Novák, Á., et.al. (2008) "StatAlign: an extendable software package for joint Bayesian estimation of alignments and evolutionary trees". Bioinformatics, 24(20):2403-2404). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento Gap de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, Journal of Molecular Biology 48:443-453, 1970). Em uma modalidade, a presente divulgação se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos com o uso do programa de alinhamento BestFit de Smith e Waterman (Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Research 11:2205-2220, 1983). Esses programas produzem alinhamentos de sequências múltiplas biologicamente significativas de sequências divergentes. Os alinhamentos de melhor correspondência calculados para as sequências selecionadas são alinhados de modo que identidades, semelhanças e diferenças possam ser vistas.

[0079] O termo "similaridade" se refere a uma comparação entre sequências de aminoácidos e leva em consideração não só aminoácidos idênticos em posições correspondentes, mas também aminoácidos funcionalmente similares em posições correspondentes. Assim, a similaridade entre as sequências polipeptídicas indica similaridade funcional, além da similaridade da sequência.

[0080] O termo "homologia" é, algumas vezes, usado para se referir ao nível de similaridade entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos em termos da porcentagem de identidade posicional (isto é, similaridade ou identidade de sequência). Homologia também se refere ao conceito de relação evolucionária, em geral, evidenciada por propriedades funcionais similares dentre diferentes ácidos nucleicos ou proteínas que compartilham sequências similares.

[0081] Conforme usado no presente documento, o termo "variantes" significa sequências substancialmente similares. No caso de sequências nucleotídicas, variantes que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como, por exemplo, técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização, conforme descrito no presente documento.

[0082] No caso de sequências nucleotídicas, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo. Conforme usado no presente documento, uma sequência nucleotídica "nativa" compreende uma sequência nucleotídica de ocorrência natural. No caso de sequências nucleotídicas, variantes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como, por exemplo, técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização, conforme descrito abaixo. Sequências nucleotídicas variantes também incluem sequências nucleotídicas derivadas sinteticamente, tais como aquelas geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese sítio-dirigida. Geralmente, variantes de uma sequência nucleotídica particular da divulgação terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%>, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com essa sequência nucleotídica particular, conforme determinado por programas e parâmetros de alinhamento de sequências descritos em outro local no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma sequência nucleotídica da divulgação pode diferir dessa sequência em tão pouco quanto 1 a 15 resíduos de ácido nucleico, tão pouco quanto 1 a 10, tal como 6 a 10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2, ou até mesmo 1 resíduo de ácido nucleico.

[0083] Conforme usado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" se refere a uma primeira sequência de ácido nucleico que está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência codificante. Quando produzidas de forma recombinante, as sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas são geralmente contíguas e, quando necessário, de forma a unir duas regiões codificantes de proteína, na mesma fase de leitura. No entanto, os elementos não precisam ser contíguos para serem operacionalmente ligados.

[0084] Conforme usado no presente documento, o termo "oralmente ativo" refere-se a uma proteína que inibe a proliferação de pragas de insetos quando oralmente ingerida pela praga de inseto.

[0085] Conforme usado no presente documento, o termo "atividade inseticida" refere-se à atividade de um organismo ou uma substância (tal como, por exemplo, uma proteína) que pode ser medida por, mas sem limitação, mortalidade de insetos, perda de peso de insetos, repelência de insetos e outras alterações comportamentais e físicas de um inseto após alimentação e exposição durante um período de tempo apropriado. Deste modo, um organismo ou substância com atividade inseticida tem efeito adverso em pelo menos um parâmetro mensurável da condição dos insetos.

[0086] Conforme usado no presente documento, o termo "praga" refere-se a qualquer inseto que seja indesejável e prejudicial ou destrutivo para o crescimento e desenvolvimento de culturas agrícolas. O termo "praga de inseto" inclui, mas sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e similares. Pragas de insetos incluem insetos selecionados das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Hemiptera.

[0087] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação estável" ou "transformado de forma estável" destina-se a significar que a construção nucleotídica introduzida em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdada pela progênie da mesma. "Transformação transiente" destina-se a significar que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. Por "planta" entende-se plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e progênie dos mesmos. As células vegetais podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em suspensão, protoplastos, células foliares, células radiculares, células de floema e pólen).

[0088] Conforme usado no presente documento, o termo "regeneração" significa o processo de cultivo de uma planta a partir de uma célula vegetal (por exemplo, protoplasto vegetal ou explante).

[0089] Conforme usado no presente documento, o termo "cultivo" refere-se à propagação in vitro de células ou organismos ou em meios de vários tipos de modo que a manutenção ou crescimento celular dentro de um meio de cultura líquido seja controlado sob um conjunto de condições físicas. Entende-se que os descendentes de uma célula cultivada em cultura podem não ser completamente idênticos (isto é, morfologicamente, geneticamente ou fenotipicamente) à célula progenitora.

[0090] Conforme usado no presente documento, o termo "controle/controlar" (por exemplo, como em "controlar uma população de praga de inseto"), conforme usado no presente documento refere-se a monitorar, tratar, minimizar, exterminar ou prevenir pragas de insetos, tais como percevejos. Em casos específicos, as espécies de insetos são controladas para reduzir o número de insetos que causam redução do rendimento benéfico de plantas.

[0091] Conforme usado no presente documento, o termo "quantidade eficaz como inseticida" refere-se a uma quantidade de uma substância ou organismo que tem atividade inseticida quando presente no ambiente de uma praga de inseto. Para cada substância ou organismo, a quantidade eficaz como inseticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. De modo similar, uma "quantidade eficaz como pesticida" pode ser usada para se referir a uma quantidade eficaz como inseticida.

[0092] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína pesticida" ou "proteína inseticida" pretende se referir a um polipeptídeo que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação, membros das ordens Lepidoptera, Diptera, Hemiptera e Coleoptera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia com uma tal proteína. Proteínas pesticidas foram isoladas de organismos, incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. Proteínas pesticidas incluem, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp., tais como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de Pseudomonas protegens cepas CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368- 2386: n.º de Acesso no GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069), Pat. dos E.U.A. Nº 6.048.838 e Pat. dos E.U.A. Nº 6.379.946; e δ-endotoxinas incluindo, mas sem limitação, as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25,

Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51 e Cry55 de genes de δ-endotoxinas e os genes citolíticos Cyt1 e Cyt2 de B. thuringiensis.

Membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, mas sem limitação, Cry1Aa1 (Nº de acesso Nº de acesso M11250), Cry1Aa2 (Nº de acesso M10917), Cry1Aa3 (Nº de acesso D00348), Cry1Aa4 (Nº de acesso X13535), Cry1Aa5 (Nº de acesso D17518), Cry1Aa6 (Nº de acesso U43605), Cry1Aa7 (Nº de acesso AF081790), Cry1Aa8 (Nº de acesso I26149), Cry1Aa9 (Nº de acesso AB026261), Cry1Aa10 (Nº de acesso AF154676), Cry1Aa11 (Nº de acesso Y09663), Cry1Aa12 (Nº de acesso AF384211), Cry1Aa13 (Nº de acesso AF510713), Cry1Aa14 (Nº de acesso AY197341), Cry1Aa15 (Nº de acesso DQ062690), Cry1Ab1 (Nº de acesso M13898), Cry1Ab2 (Nº de acesso M12661), Cry1Ab3 (Nº de acesso M15271), Cry1Ab4 (Nº de acesso D00117), Cry1Ab5 (Nº de acesso X04698), Cry1Ab6 (Nº de acesso M37263), Cry1Ab7 (Nº de acesso X13233), Cry1Ab8 (Nº de acesso M16463), Cry1Ab9 (Nº de acesso X54939), Cry1Ab10 (Nº de acesso A29125), Cry1Ab11 (Nº de acesso I12419), Cry1Ab12 (Nº de acesso AF059670), Cry1Ab13 (Nº de acesso AF254640), Cry1Ab14 (Nº de acesso U94191), Cry1Ab15 (Nº de acesso AF358861), Cry1Ab16 (Nº de acesso AF375608), Cry1Ab17 (Nº de acesso AAT46415), Cry1Ab18 (Nº de acesso AAQ88259), Cry1Ab19 (Nº de acesso AY847289), Cry1Ab20 (Nº de acesso DQ241675), Cry1Ab21 (Nº de acesso EF683163), Cry1Ab22 (Nº de acesso ABW87320), tipo Cry1Ab (Nº de acesso AF327924), tipo Cry1Ab (Nº de acesso AF327925), tipo Cry1Ab (Nº de acesso AF327926), tipo Cry1Ab (Nº de acesso DQ781309), Cry1Ac1 (Nº de acesso M11068), Cry1Ac2 (Nº de acessoM35524), Cry1Ac3 (Nº de acesso X54159), Cry1Ac4 (Nº de acesso M73249), Cry1Ac5 (Nº de acesso M73248), Cry1Ac6 (Nº de acesso U43606), Cry1Ac7 (Nº de acesso U87793),

Cry1Ac8 (Nº de acesso U87397), Cry1Ac9 (Nº de acesso U89872), Cry1Ac10 (Nº de acesso AJ002514), Cry1Ac11 (Nº de acesso AJ130970), Cry1Ac12 (Nº de acesso I12418), Cry1Ac13 (Nº de acesso AF148644), Cry1Ac14 (Nº de acesso AF492767), Cry1Ac15 (Nº de acesso AY122057), Cry1Ac16 (Nº de acesso AY730621), Cry1Ac17 (Nº de acesso AY925090), Cry1Ac18 (Nº de acesso DQ023296), Cry1Ac19 (Nº de acesso DQ195217), Cry1Ac20 (Nº de acesso DQ285666), Cry1Ac21 (Nº de acesso DQ062689), Cry1Ac22 (Nº de acesso EU282379), Cry1Ac23 (Nº de acesso AM949588), Cry1Ac24 (Nº de acesso ABL01535), Cry1Ad1 (Nº de acesso M73250), Cry1Ad2 (Nº de acesso A27531), Cry1Ae1 (Nº de acesso M65252), Cry1Af1 (Nº de acesso U82003), Cry1Ag1 (Nº de acesso AF081248), Cry1Ah1 (Nº de acesso AF281866), Cry1Ah2 (Nº de acesso DQ269474), Cry1Ai1 (Nº de acesso AY174873), tipo Cry1A (Nº de acesso AF327927), Cry1Ba1 (Nº de acesso X06711), Cry1Ba2 (Nº de acesso X95704), Cry1Ba3 (Nº de acesso AF368257), Cry1Ba4 (Nº de acesso AF363025), Cry1Ba5 (Nº de acesso AB020894), Cry1Ba6 (Nº de acesso ABL60921), Cry1Bb1 (Nº de acesso L32020), Cry1Bc1 (Nº de acesso Z46442), Cry1Bd1 (Nº de acesso U70726), Cry1Bd2 (Nº de acesso AY138457), Cry1Be1 (Nº de acesso AF077326), Cry1Be2 (Nº de acesso AAQ52387), Cry1Bf1 (Nº de acesso AX189649), Cry1Bf2 (Nº de acesso AAQ52380), Cry1Bg1 (Nº de acesso AY176063), Cry1Ca1 (Nº de acesso X07518), Cry1Ca2 (Nº de acesso X13620), Cry1Ca3 (Nº de acesso M73251), Cry1Ca4 (Nº de acesso A27642), Cry1Ca5 (Nº de acesso X96682), Cry1Ca6 [1] (Nº de acesso AF215647), Cry1Ca7 (Nº de acesso AY015492), Cry1 Cab (Nº de acesso AF362020), Cry1Ca9 (Nº de acesso AY078160), Cry1Ca10 (Nº de acesso AF540014), Cry1Ca11 (Nº de acesso AY955268), Cry1Cb1 (Nº de acesso M97880), Cry1Cb2 (Nº de acesso AY007686), Cry1Cb3 (Nº de acesso EU679502), tipo Cry1 Cb (Nº de acesso AAX63901), Cry1Da1 (Nº de acesso X54160), Cry1Da2 (Nº de acesso

I76415), Cry1Db1 (Nº de acesso Z22511), Cry1Db2 (Nº de acesso AF358862), Cry1Dc1 (Nº de acesso EF059913), Cry1 Eat (Nº de acesso X53985), Cry1Ea2 (Nº de acesso X56144), Cry1Ea3 (Nº de acesso M73252), Cry1Ea4 (Nº de acesso U94323), Cry1Ea5 (Nº de acesso A15535), Cry1Ea6 (Nº de acesso AF202531), Cry1Ea7 (Nº de acesso AAW72936), Cry1Ea8 (Nº de acesso ABX11258), Cry1Eb1 (Nº de acesso M73253), Cry1Fa1 (Nº de acesso M63897), Cry1Fa2 (Nº de acesso M73254), Cry1Fb1 (Nº de acesso Z22512), Cry1Fb2 (Nº de acesso AB012288), Cry1Fb3 (Nº de acesso AF062350), Cry1Fb4 (Nº de acesso I73895), Cry1Fb5 (Nº de acesso AF336114), Cry1Fb6 (Nº de acesso EU679500), Cry1Fb7 (Nº de acesso EU679501), Cry1Ga1 (Nº de acesso Z22510), Cry1Ga2 (Nº de acesso Y09326), Cry1Gb1 (Nº de acesso U70725), Cry1Gb2 (Nº de acesso AF288683), Cry1Gc (Nº de acesso AAQ52381), Cry1Ha1 (Nº de acesso Z22513), Cry1Hb1 (Nº de acessoU35780), tipo Cry1H (Nº de acesso AF182196), Cry1Ia1 (Nº de acesso X62821), Cry1Ia2 (Nº de acesso M98544), Cry1Ia3 (Nº de acesso L36338), Cry1Ia4 (Nº de acesso L49391), Cry1Ia5 (Nº de acesso Y08920), Cry1Ia6 (Nº de acesso AF076953), Cry1Ia7 (Nº de acesso AF278797), Cry1Ia8 (Nº de acesso AF373207), Cry1Ia9 (Nº de acesso AF521013), Cry1Ia10 (Nº de acesso AY262167), Cry1Ia11 (Nº de acesso AJ315121), Cry1Ia12 (Nº de acesso AAV53390), Cry1Ia13 (Nº de acesso ABF83202), Cry1Ia14 (Nº de acesso EU887515), Cry1Ib1 (Nº de acesso U07642), Cry1Ib2 (Nº de acesso ABW88019), Cry1Ib3 (Nº de acesso EU677422), Cry1Ic1 (Nº de acesso AF056933), Cry1Ic2 (Nº de acesso AAE71691), Cry1Id1 (Nº de acesso AF047579), Cry1Ie1 (Nº de acesso AF211190), Cry1If1 (Nº de acesso AAQ52382), tipo Cry1I (Nº de acesso I90732), tipo Cry1I (Nº de acessoDQ781310), Cry1Ja1 (Nº de acesso L32019), Cry1Jb1 (Nº de acesso U31527), Cry1Jc1 (Nº de acesso I90730), Cry1Jc2 (Nº de acesso AAQ52372), Cry1Jd1 (Nº de acesso AX189651), Cry1 Kat (Nº de acesso U28801), Cry1La1 (Nº de acesso AAS60191), tipo Cry1 (Nº de acesso190729), Cry2Aa1 (Nº de acesso M31738), Cry2Aa2 (Nº de acesso M23723), Cry2Aa3 (Nº de acesso D86064), Cry2Aa4 (Nº de acesso AF047038), Cry2Aa5 (Nº de acesso AJ132464), Cry2Aa6 (Nº de acesso AJ132465), Cry2Aa7 (Nº de acesso AJ132463), Cry2Aa8 (Nº de acesso AF252262), Cry2Aa9 (Nº de acesso AF273218), Cry2Aa10 (Nº de acesso AF433645), Cry2Aa11 (Nº de acesso AAQ52384), Cry2Aa12 (Nº de acesso DQ977646), Cry2Aa13 (Nº de acesso ABL01536), Cry2Aa14 (Nº de acesso ACF04939), Cry2Ab1 (Nº de acesso M23724), Cry2Ab2 (Nº de acesso X55416), Cry2Ab3 (Nº de acesso AF164666), Cry2Ab4 (Nº de acesso AF336115), Cry2Ab5 (Nº de acesso AF441855), Cry2Ab6 (Nº de acesso AY297091), Cry2Ab7 (Nº de acesso DQ119823), Cry2Ab8 (Nº de acesso DQ361266), Cry2Ab9 (Nº de acesso DQ341378), Cry2Ab10 (Nº de acesso EF157306), Cry2Ab11 (Nº de acesso AM691748), Cry2Ab12 (Nº de acesso ABM21764), Cry2Ab13 (Nº de acesso EU909454), Cry2Ab14 (Nº de acesso EU909455), Cry2Ac1 (Nº de acesso X57252), Cry2Ac2 (Nº de acesso AY007687), Cry2Ac3 (Nº de acesso AAQ52385), Cry2Ac4 (Nº de acesso DQ361267), Cry2Ac5 (Nº de acesso DQ341379), Cry2Ac6 (Nº de acesso DQ359137), Cry2Ac7 (Nº de acesso AM292031), Cry2Ac8 (Nº de acesso AM421903), Cry2Ac9 (Nº de acesso AM421904), Cry2Ac10 (Nº de acesso BI 877475), Cry2Ac11 (Nº de acesso AM689531), Cry2Ac12 (Nº de acesso AM689532), Cry2Ad1 (Nº de acesso AF200816), Cry2Ad2 (Nº de acesso DQ358053), Cry2Ad3 (Nº de acesso AM268418), Cry2Ad4 (Nº de acesso AM490199), Cry2Ad5 (Nº de acessoAM765844), Cry2Ae1 (Nº de acesso AAQ52362), Cry2Af1 (Nº de acesso EF439818), Cry2Ag (Nº de acesso ACH91610), Cry2Ah (Nº de acesso EU939453), Cry3Aa1 (Nº de acesso M22472), Cry3Aa2 (Nº de acesso J02978), Cry3Aa3 (Nº de acesso Y00420), Cry3Aa4 (Nº de acesso M30503), Cry3Aa5 (Nº de acesso M37207), Cry3Aa6 (Nº de acesso U10985), Cry3Aa7 (Nº de acesso AJ237900), Cry3Aa8 (Nº de acesso AAS79487), Cry3Aa9 (Nº de acesso AAW05659), Cry3Aa10 (Nº de acesso AAU29411), Cry3Aa11 (Nº de acesso AY882576), Cry3Aa12 (Nº de acesso ABY49136), Cry3Ba1 (Nº de acesso X17123), Cry3Ba2 (Nº de acesso A07234), Cry3Bb1 (Nº de acesso M89794), Cry3Bb2 (Nº de acesso U31633), Cry3Bb3 (Nº de acesso I15475), Cry3Ca1 (Nº de acesso X59797), Cry4Aa1 (Nº de acesso Y00423), Cry4Aa2 (Nº de acesso D00248), Cry4Aa3 (Nº de acesso AL731825), tipo Cry4A (Nº de acesso DQ078744), Cry4Ba1 (Nº de acesso X07423), Cry4Ba2 (Nº de acesso X07082), Cry4Ba3 (Nº de acesso M20242), Cry4Ba4 (Nº de acesso D00247), Cry4Ba5 (Nº de acesso AL731825), tipo Cry4Ba (Nº de acesso ABC47686), Cry4Ca1 (Nº de acesso EU646202), Cry5Aa1 (Nº de acesso L07025), Cry5Ab1 (Nº de acesso L07026), Cry5Ac1 (Nº de acesso I34543), Cry5Ad1 (Nº de acesso EF219060), Cry5Ba1 (Nº de acesso U19725), Cry5Ba2 (Nº de acesso EU121522), Cry6Aa1 (Nº de acesso L07022), Cry6Aa2 (Nº de acesso AF499736), Cry6Aa3 (Nº de acesso DQ835612), Cry6Ba1 (Nº de acesso L07024), Cry7Aa1 (Nº de acesso M64478), Cry7Ab1 (Nº de acesso U04367), Cry7Ab2 (Nº de acesso U04368), Cry7Ab3 (Nº de acesso BI 1015188), Cry7Ab4 (Nº de acesso EU380678), Cry7Ab5 (Nº de acesso ABX79555), Cry7Ab6 (Nº de acesso FJ194973), Cry7Ba1 (Nº de acesso ABB70817), Cry7Ca1 (Nº de acesso EF486523), Cry8Aa1 (Nº de acesso U04364), Cry8Ab1 (Nº de acesso EU044830), Cry8Ba1 (Nº de acesso U04365), Cry8Bb1 (Nº de acesso AX543924), Cry8Bc1 (Nº de acesso AX543926), Cry8Ca1 (Nº de acesso U04366), Cry8Ca2 (Nº de acesso AAR98783), Cry8Ca3 (Nº de acesso EU625349), Cry8Da1 (Nº de acesso AB089299), Cry8Da2 (Nº de acesso BD133574), Cry8Da3 (Nº de acesso BD133575), Cry8 Db1 (Nº de acesso AB303980), Cry8Ea1 (Nº de acesso AY329081), Cry8Ea2 (Nº de acesso EU047597), Cry8Fa1 (Nº de acesso AY551093), Cry8Ga1 (Nº de acesso AY590188), Cry8Ga2

(Nº de acesso DQ318860), Cry8Ga3 (Nº de acesso FJ198072), Cry8Ha1 (Nº de acesso EF465532), Cry8Ia1 (Nº de acesso EU381044), Cry8Ja1 (Nº de acesso EU625348), Cry8 like (Nº de acesso ABS53003), Cry9Aa1 (Nº de acesso X58120), Cry9Aa2 (Nº de acesso X58534), Cry9Aa like (Nº de acesso AAQ52376), Cry9Ba1 (Nº de acesso X75019), Cry9Bb1 (Nº de acesso AY758316), Cry9Ca1 (Nº de acesso Z37527), Cry9Ca2 (Nº de acesso AAQ52375), Cry9Da1 (Nº de acesso D85560), Cry9Da2 (Nº de acesso AF042733), Cry9 Db1 (Nº de acesso AY971349), Cry9Ea1 (Nº de acesso AB011496), Cry9Ea2 (Nº de acesso AF358863), Cry9Ea3 (Nº de acesso EF157307), Cry9Ea4 (Nº de acesso EU760456), Cry9Ea5 (Nº de acesso EU789519), Cry9Ea6 (Nº de acesso EU887516), Cry9Eb1 (Nº de acesso AX189653), Cry9Ec1 (Nº de acesso AF093107), Cry9Ed1 (Nº de acesso AY973867), Cry9 like (Nº de acesso AF093107), Cry10Aa1 (Nº de acesso M12662), Cry10Aa2 (Nº de acesso E00614), Cry10Aa3 (Nº de acesso AL731825), Cry10A like (Nº de acesso DQ167578), Cry11Aa1 (Nº de acesso M31737), Cry11Aa2 (Nº de acesso M22860), Cry11Aa3 (Nº de acesso AL731825), tipo Cry11Aa (Nº de acesso DQ166531), Cry11Ba1 (Nº de acessoX86902), Cry11Bb1 (Nº de acesso AF017416), Cry12Aa1 (Nº de acesso L07027), Cry13Aa1 (Nº de acesso L07023), Cry14Aa1 (Nº de acesso U13955), Cry15Aa1 (Nº de acesso M76442), Cry16Aa1 (Nº de acesso X94146), Cry17Aa1 (Nº de acesso X99478), Cry18Aa1 (Nº de acesso X99049), Cry18Ba1 (Nº de acesso AF169250), Cry18Ca1 (Nº de acesso AF169251), Cry19Aa1 (Nº de acesso Y07603), Cry19Ba1 (Nº de acessoD88381), Cry20Aa1 (Nº de acesso U82518), Cry21Aa1 (Nº de acesso I32932), Cry21Aa2 (Nº de acesso I66477), Cry21Ba1 (Nº de acesso AB088406), Cry22Aa1 (Nº de acesso I34547), Cry22Aa2 (Nº de acesso AX472772), Cry22Aa3 (Nº de acesso EU715020), Cry22Ab1 (Nº de acesso AAK50456), Cry22Ab2 (Nº de acesso AX472764), Cry22Ba1 (Nº de acesso AX472770), Cry23Aa1 (Nº de acesso AAF76375),

Cry24Aa1 (Nº de acessoU88188), Cry24Ba1 (Nº de acesso BAD32657), Cry24Ca1 (Nº de acesso AM158318), Cry25Aa1 (Nº de acesso U88189), Cry26Aa1 (Nº de acesso AF122897), Cry27Aa1 (Nº de acesso AB023293), Cry28Aa1 (Nº de acesso AF132928), Cry28Aa2 (Nº de acesso AF285775), Cry29Aa1 (Nº de acesso AJ251977), Cry30Aa1 (Nº de acesso AJ251978), Cry30Ba1 (Nº de acesso BAD00052), Cry30Ca1 (Nº de acesso BAD67157), Cry30Da1 (Nº de acesso EF095955), Cry30 Db1 (Nº de acesso BAE80088), Cry30Ea1 (Nº de acesso EU503140), Cry30Fa1 (Nº de acesso EU751609), Cry30Ga1 (Nº de acesso EU882064), Cry31Aa1 (Nº de acesso AB031065), Cry31Aa2 (Nº de acesso AY081052), Cry31Aa3 (Nº de acesso AB250922), Cry31Aa4 (Nº de acesso AB274826), Cry31Aa5 (Nº de acesso AB274827), Cry31Ab1 (Nº de acesso AB250923), Cry31Ab2 (Nº de acesso AB274825), Cry31Ac1 (Nº de acesso AB276125), Cry32Aa1 (Nº de acesso AY008143), Cry32Ba1 (Nº de acesso BAB78601), Cry32Ca1 (Nº de acesso BAB78602), Cry32Da1 (Nº de acesso BAB78603), Cry33Aa1 (Nº de acesso AAL26871), Cry34Aa1 (Nº de acesso AAG50341), Cry34Aa2 (Nº de acesso AAK64560), Cry34Aa3 (Nº de acesso AY536899), Cry34Aa4 (Nº de acesso AY536897), Cry34Ab1 (Nº de acesso AAG41671), Cry34Ac1 (Nº de acesso AAG50118), Cry34Ac2 (Nº de acesso AAK64562), Cry34Ac3 (Nº de acesso AY536896), Cry34Ba1 (Nº de acesso AAK64565), Cry34Ba2 (Nº de acesso AY536900), Cry34Ba3 (Nº de acesso AY536898), Cry35Aa1 (Nº de acesso AAG50342), Cry35Aa2 (Nº de acesso AAK64561), Cry35Aa3 (Nº de acesso AY536895), Cry35Aa4 (Nº de acesso AY536892), Cry35Ab1 (Nº de acesso AAG41672), Cry35Ab2 (Nº de acesso AAK64563), Cry35Ab3 (Nº de acesso AY536891), Cry35Ac1 (Nº de acesso AAG50117), Cry35Ba1 (Nº de acesso AAK64566), Cry35Ba2 (Nº de acesso AY536894), Cry35Ba3 (Nº de acesso AY536893), Cry36Aa1 (Nº de acesso AAK64558), Cry37Aa1 (Nº de acesso

AAF76376), Cry38Aa1 (Nº de acesso AAK64559), Cry39Aa1 (Nº de acesso BAB72016), Cry40Aa1 (Nº de acesso BAB72018), Cry40Ba1 (Nº de acesso BAC77648), Cry40Ca1 (Nº de acesso EU381045), Cry40Da1 (Nº de acesso EU596478), Cry41Aa1 (Nº de acesso AB116649), Cry41Ab1 (Nº de acesso AB116651), Cry42Aa1 (Nº de acesso AB116652), Cry43Aa1 (Nº de acesso AB115422), Cry43Aa2 (Nº de acesso AB176668), Cry43Ba1 (Nº de acesso AB115422), tipo Cry43 (Nº de acesso AB115422), Cry44Aa (Nº de acesso BAD08532), Cry45Aa (Nº de acesso BAD22577), Cry46Aa (Nº de acesso BAC79010), Cry46Aa2 (Nº de acesso BAG68906), Cry46Ab (Nº de acesso BAD35170), Cry47Aa (Nº de acesso AY950229), Cry48Aa (Nº de acesso AJ841948), Cry48Aa2 (Nº de acesso AM237205), Cry48Aa3 (Nº de acesso AM237206), Cry48Ab (Nº de acesso AM237207), Cry48Ab2 (Nº de acesso AM237208), Cry49Aa (Nº de acesso AJ841948), Cry49Aa2 (Nº de acesso AM237201), Cry49Aa3 (Nº de acesso AM237203), Cry49Aa4 (Nº de acesso AM237204), Cry49Ab1 (Nº de acesso AM237202), Cry50Aa1 (Nº de acesso AB253419), Cry51Aa1 (Nº de acesso DQ836184), Cry52Aa1 (Nº de acesso EF613489), Cry53Aa1 (Nº de acesso EF633476), Cry54Aa1 (Nº de acesso EU339367), Cry55Aa1 (Nº de acesso EU121521), Cry55Aa2 (Nº de acesso AAE33526).

[0093] Exemplos de δ-endotoxinas também incluem, mas sem limitação, proteínas Cry1A das Patentes dos E.U.A. Nos 5.880.275 e

7.858.849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (variantes com deleção N- terminal da α-hélice 1 e/ou α-hélice 2 de proteínas Cry, tais como Cry1A) das Patentes dos E.U.A. Nos 8.304.604 e 8.304.605, Cry1B do pedido de patente dos E.U.A. Nº de série N.º 10/525.318; Cry1C da Patente dos E.U.A. Nº 6.033.874; Cry1F das Patentes dos E.U.A. Nos 5.188.960,

6.218.188; Quimeras Cry1A/F das Patentes dos E.U.A. Nos 7.070.982;

6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2, tal como a proteína Cry2Ab da Patente dos E.U.A. Nº 7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, mas sem limitação, uma proteína inseticida híbrida projetada (eHIP) criada pela fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. Número 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes dos E.U.A. Números 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943,

7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9, tal como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74: 7145-7151; uma Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das Patentes dos E.U.A. Nos 6.127.180, 6.624.145 e

6.340.593); uma proteína CryET33 e CryET34 das Patentes dos E.U.A. Nos 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; uma CryET33 e homólogos de CryET34 da Publicação de Patente dos E.U.A. Número 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das Patentes dos E.U.A. Nos 6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 de US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente dos E.U.A. Nº 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente dos E.U.A. Nº 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 de WO 2005/038032; AXMI-003 de WO 2005/021585; AXMI-008 de US 2004/0250311; AXMI-006 de US 2004/0216186; AXMI-007 de US 2004/0210965; AXMI-009 de US 2004/0210964; AXMI-014 de US 2004/0197917; AXMI-004 de US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 de WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080r12, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente dos

E.U.A.

Nº 8.084.416; AXMI-205 de US20110023184; AXMI-011, AXMI- 012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI- 041, AXMI-063 e AXMI-064 de US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas de US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230, e AXMI231 de WO11/103.247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI- 184 da Patente dos E.U.A.

Nº 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI- 030, AXMI-035, e AXMI-045 de US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI- 076 de US20090144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente dos E.U.A.

Nº 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de US 2010/0005543; Proteínas Cry, tais como Cry1A e Cry3A com sítios proteolíticos modificados da Patente dos E.U.A.

Nº 8.319.019; e uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A.

Número 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas por um especialista na técnica (veja Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um especialista na técnica (para uma revisão, veja van Frannkenhuyzen, (2009) J.

Invert.

Path. 101:1-16). O uso de proteínas Cry como características de plantas transgênicas é bem conhecido por um especialista na técnica e as plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Al, Cry1Al, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Al, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-T l receberam aprovação regulamentadora (veja Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283- 300 e o banco de dados de culturas GM de CERA (2010) Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um especialista na técnica também pode ser expressa em plantas como Vip3Ab e Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F e CryCa (US2012/0317681), Cry1DA e Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA e Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB e Cry1BE (US2012/0324606) e Cry1Fa e Cry2Aa, Cry1I ou Cry1E (US2012/0324605). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo as lipídeo acil hidrolases da Patente dos E.U.A.

Nº 7.491.869, e colesterol oxidases como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes dos E.U.A.

N os

5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020, e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por um especialista na técnica (veja lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC, do inglês "toxin complex"), obteníveis a partir de organismos, tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (veja as Patentes dos E.U.A. Nos 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida "independente" e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas independentes produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC "independente" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser aumentada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas independentes. As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxicidade das proteínas de Classe A. Exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (a Patente dos E.U.A. Nº

8.334.366).

[0094] Conforme usado no presente documento, o termo "inibir o crescimento" ou "inibição do crescimento" significa uma redução ou inibição no crescimento de um organismo de inseto, em algumas modalidades, em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%,

50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. A inibição de crescimento de inseto pode ser determinada mediante a medição do peso ou tamanho do inseto.

[0095] Conforme usado no presente documento, o termo "mortalidade" refere-se ao extermínio dos insetos.

[0096] Conforme usado no presente documento, o termo "resistente", "resistência" e "resistência de plantas hospedeiras" refere- se à capacidade de uma planta hospedeira para prevenir ou reduzir a infestação e danos de uma praga do grupo que compreende insetos, nematódeos, patógenos, fungos, vírus e doenças.

[0097] Conforme usado no presente documento, o termo "produto transgênico de resistência a insetos", pode significar um "pesticida", um "Bt" ou "polipeptídeo de Bt" em que o protetor de planta é uma proteína, ou uma variante da mesma, derivada de Bacillus thuringiensis, um "não- Bt" ou "polipeptídeo não-Bt", em que o protetor é uma proteína, ou uma variante da mesma, derivada de uma bactéria diferente de Bacillus thuringiensis ou uma planta, particularmente de uma samambaia ou outra planta primitiva, ou "RNA" em que o protetor de planta é uma molécula de RNA, particularmente um RNAi ou dsRNA. Os produtos inseticidas transgênicos podem ser expressos a partir de um evento transgênico que compreende um transgene que codifica um traço de resistência a inseto transgênica.

[0098] Conforme usado no presente documento, o termo "proteger/proteção" refere-se a evitar ou minimizar a quantidade de ataque da planta por uma praga do solo a um ponto em que não mais represente uma ameaça à vitalidade da planta, morte seletiva da planta, perda de qualidade e/ou rendimento reduzido.

[0099] Conforme usado no presente documento, o termo "campo de cultura" se refere a uma extensão de terra cultivada que um agricultor usa para cultivar uma espécie de cultura. Um campo de cultura varia em tamanho dependendo da espécie de cultura e do propósito. Em um exemplo, um campo de cultura pode incluir fileiras e pode ser plantado em vários comprimentos. Em um outro exemplo, um campo de cultura pode ser plantado espalhando-se a semente em todo o campo de cultura. Em um exemplo adicional, um campo de cultura pode ser plantado perfurando-se a semente em todo o campo de cultura.

[00100] Conforme usado no presente documento, o termo "modos de ação" significa os meios biológicos ou bioquímicos por meio dos quais uma estratégia ou composto de controle de pragas inibe a alimentação de pragas e/ou aumenta a mortalidade de pragas.

[00101] Conforme usado no presente documento, o termo "coexpressar/coexpressão" refere-se a dois ou mais produtos gênicos que são produzidos ao mesmo tempo no mesmo organismo hospedeiro.

[00102] Conforme usado no presente documento, o termo "degenerado" refere-se a um ácido nucleico iniciador ou de sonda em que determinadas posições não são definidas por um único nucleotídeo específico. Dessa forma, em tal posição degenerada, a sequência iniciadora ou de sonda pode ser qualquer uma dentre pelo menos dois nucleotídeos diferentes. Tais posições geralmente representam uma diferença em genótipos do ácido nucleico-alvo. Uma sequência degenerada também pode ser representada como uma mistura de múltiplas sequências individuais não-degeneradas que, para o propósito da presente divulgação, diferem em pelo menos duas posições.

[00103] Conforme usado no presente documento, o termo "fragmento enzimaticamente ativo", "fragmento" ou "porção biologicamente ativa" incluem fragmentos polipeptídicos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a um polipeptídeo e que exibem atividade inseticida. "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos polipeptídicos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos que exibe atividade inseticida. Uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 8, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas de recombinação e avaliadas em relação à atividade inseticida. Conforme usado no presente documento, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo. As modalidades abrangem outros fragmentos, entretanto, tais como qualquer fragmento na proteína maior que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos.

[00104] Conforme usado no presente documento, o termo "segmento peptídico" refere-se a uma molécula proteica que foi isolada livre de outras sequências proteicas e de resíduos de aminoácidos.

[00105] Conforme usado no presente documento, o termo "segmento de DNA" refere-se a uma molécula de DNA que foi isolada livre de DNA genômico total de uma espécie particular. Portanto, um segmento de DNA que codifica uma proteína ou peptídeo refere-se a um segmento de DNA que contém sequências codificantes de proteína, mas que é isolado de, ou purificado livre de, DNA genômico total da espécie a partir da qual o segmento de DNA é obtido, que no presente caso é o genoma do gênero de bactérias Gram-positivas, Bacillus, e em particular, a espécie conhecida como B. thuringiensis. Incluídos dentro do termo "segmento de DNA", estão segmentos de DNA e fragmentos menores de tais segmentos, e também vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, fago, vírus e similares.

[00106] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína inseticida formulada" refere-se a uma proteína inseticida purificada ou isolada que foi expressa ou colocada em uma composição sintética adequada para aplicações agrícolas, incluindo, mas sem limitação, plantas transgênicas, formulações líquidas pulverizáveis, formulações sólidas em pó ou formulações granulares.

[00107] Conforme usado no presente documento, o termo "expressão" refere-se à combinação de processos intracelulares, incluindo transcrição e tradução à qual uma molécula de DNA codificante, tal como um gene estrutural, passa para produzir um polipeptídeo.

[00108] Conforme usado no presente documento, o termo "célula transgênica" significa qualquer célula derivada ou regenerada a partir de uma célula transformada ou derivada de uma célula transgênica. Células transgênicas exemplificativas incluem calos vegetais derivados de uma célula vegetal transformada e células específicas, tais como células foliares, radiculares, de caule, por exemplo, somáticas, ou células reprodutivas (germinativas) obtidas a partir de uma planta transgênica.

[00109] Conforme usado no presente documento, o termo "planta transgênica" significa uma planta ou progênie da mesma derivada de uma célula ou protoplasto vegetal transformado, em que o DNA da planta contém uma molécula de DNA exógena introduzida não originalmente presente em uma planta não transgênica nativa da mesma cepa. Os termos "planta transgênica" e "planta transformada", às vezes, foram usados na técnica como termos sinônimos para definir uma planta cujo DNA contém uma molécula de DNA exógena. Entretanto, considera-se mais cientificamente correto referir-se a uma planta ou calo regenerado obtido a partir de uma célula ou protoplasto vegetal transformado como sendo uma planta transgênica, e esse uso será seguido no presente documento.

[00110] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor" se refere a uma região de DNA que geralmente está localizada a montante (em direção à região 5' de um gene) de um gene e é necessária para iniciar e dirigir a transcrição do gene. Um promotor pode permitir a ativação ou repressão apropriada de um gene que o mesmo controla. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Esses fatores podem se ligar a uma sequência de DNA promotora, que resulta no recrutamento de RNA polimerase, uma enzima que sintetiza RNA a partir da região codificante do gene. O promotor geralmente se refere a todos os elementos reguladores de gene localizados a montante do gene, incluindo promotores a montante, UTR 5', íntrons e sequências líder.

[00111] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor a montante" se refere a uma sequência polinucleotídica contígua que é suficiente para direcionar a iniciação da transcrição. Conforme usado no presente documento, um promotor a montante abrange o sítio de iniciação da transcrição com diversos motivos de sequência, que incluem TATA Box, sequência iniciadora, elementos de reconhecimento de TFIIB e outros motivos promotores (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). O promotor a montante fornece o local de ação para a RNA polimerase II, que é uma enzima com várias subunidades com fatores de transcrição gerais ou basais, tais como TFIIA, B, D, E, F e H. Esses fatores são reunidos em um complexo de pré-iniciação da transcrição que catalisa a síntese de RNA a partir do molde de DNA.

[00112] A ativação do promotor a montante é feita pela sequência adicional de elementos de sequência de DNA reguladores aos quais várias proteínas se ligam e subsequentemente interagem com o complexo de iniciação da transcrição para ativar a expressão gênica. Essas sequências de elementos reguladores de genes interagem com fatores específicos de ligação ao DNA. Esses motivos de sequência podem às vezes ser chamados de elementos cis. Tais elementos cis, aos quais fatores de transcrição específicos de tecido ou específicos de desenvolvimento se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor no nível transcricional. Esses elementos cis variam amplamente no tipo de controle que exercem sobre genes operacionalmente ligados. Alguns elementos atuam para aumentar a transcrição de genes operacionalmente ligados em resposta às respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade e feridas). Outros elementos cis podem responder a sinais de desenvolvimento (por exemplo, germinação, maturação de semente e floração) ou a informações espaciais (por exemplo, especificidade de tecido). Veja, por exemplo, Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-3223. Esses elementos cis estão localizados a uma distância variável do ponto de iniciação da transcrição, alguns elementos cis (chamados elementos proximais) estão adjacentes a uma região promotora central mínima enquanto outros elementos podem estar posicionados vários quilobases a montante ou a jusante do promotor (potencializadores).

[00113] Conforme usado no presente documento, os termos "região não traduzida 5'" ou "UTR 5'" são definidos como o segmento não traduzido no terminal 5' de pré-RNAm ou RNAm maduros. Por exemplo, em RNAm maduros, uma UTR 5' tipicamente abriga em sua extremidade 5' uma cap de 7-metilguanosina e está envolvida em vários processos, tais como splicing, poliadenilação, exportação de RNAm em direção ao citoplasma, identificação da extremidade 5' do RNAm pela maquinaria de tradução, e proteção dos RNAm contra degradação.

[00114] Conforme usado no presente documento, o termo "íntron" se refere a qualquer sequência de ácido nucleico compreendida em um gene (ou sequência polinucleotídica expressa de interesse) que seja transcrita, mas não traduzida. Os íntrons incluem a sequência de ácido nucleico não traduzida dentro de uma sequência expressa de DNA, bem como a sequência correspondente nas moléculas de RNA transcritas a partir da mesma. Uma construção descrita no presente documento também pode conter sequências que melhoram a tradução e/ou a estabilidade do RNAm, tais como íntrons. Um exemplo de um desses íntrons é o primeiro íntron do gene II da variante de histona H3 de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra sequência de íntron comumente conhecida. Os íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência promotora para melhorar a tradução e/ou a estabilidade do RNAm.

[00115] Conforme usado no presente documento, os termos "terminador da transcrição" ou "terminador" são definidos como o segmento transcrito no terminal 3' de pré-RNAm ou RNAm maduros. Por exemplo, extensões mais longas de DNA além do sítio de "sinal de poliadenilação" são transcritas como um pré-RNAm. Essa sequência de DNA normalmente contém sinal de terminação da transcrição para o processamento correto do pré-RNAm em RNAm maduro.

[00116] Conforme usado no presente documento, o termo "região não traduzida 3'" ou "UTR 3'" é definido como o segmento não traduzido em um terminal 3' dos pré-RNAm ou RNAm maduros. Por exemplo, em RNAm maduros, essa região abriga a cauda poli-(A) e é conhecida por ter muitos papéis na estabilidade de RNAm, iniciação da tradução e exportação de RNAm. Além disso, a UTR 3' é considerada como incluindo o sinal de poliadenilação e o terminador da transcrição.

[00117] Conforme usado no presente documento, o termo "sinal de poliadenilação" designa uma sequência de ácido nucleico presente em transcritos de RNAm que permite que transcritos, quando na presença de uma poli-(A) polimerase, sejam poliadenilados no sítio de poliadenilação, por exemplo, localizado 10 a 30 bases a jusante do sinal poli-(A). Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente divulgação. Uma sequência exemplificativa inclui AAUAAA e variantes da mesma, como descrito em Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468.

[00118] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" abrange todas as técnicas para que uma molécula de ácido nucleico possa ser introduzida em uma tal célula. Exemplos incluem, mas sem limitação: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmidiais; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al., (1978) Cell 15: 579-585); transferência mediada por Agrobacterium; captação direta de DNA; transformação mediada por WHISKERS™ e bombardeamento de microprojéteis. Essas técnicas podem ser usadas tanto para transformação estável quanto transformação transiente de uma célula vegetal. "Transformação estável" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro que resulta em herança geneticamente estável. Após transformação estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado de forma estável no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são chamados de organismos "transgênicos". "Transformação transiente" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo, ou organela que contém DNA, de um organismo hospedeiro, resultando em expressão gênica sem herança geneticamente estável.

[00119] Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em um exemplo, um transgene/sequência codificante heteróloga é uma sequência gênica (por exemplo, um gene de resistência a herbicidas), um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica uma característica agrícola desejável. Em ainda outro exemplo, o transgene/sequência codificante heteróloga é uma sequência de ácido nucleico antissenso, em que a expressão da sequência de ácido nucleico antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico-alvo. Um transgene/sequência codificante heteróloga pode conter sequências reguladoras operacionalmente ligadas ao transgene/sequência codificante heteróloga (por exemplo, um promotor). Em algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica de interesse é um transgene. No entanto, em outras modalidades, uma sequência polinucleotídica de interesse é uma sequência de ácido nucleico endógena, em que cópias genômicas adicionais da sequência de ácido nucleico endógena são desejadas ou uma sequência de ácido nucleico que está na orientação antissenso em relação à sequência de uma molécula de ácido nucleico-alvo no organismo hospedeiro.

[00120] Conforme usado no presente documento, o termo um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido nucleico que inclui um transgene/sequência codificante heteróloga de interesse, regeneração de uma população de plantas que resulta da inserção do transgene/sequência codificante heteróloga no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma localização de genoma particular. O termo "evento" se refere ao transformante original e progênie do transformante que incluem o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere a progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgene. Mesmo após o retrocruzamento repetido para um progenitor recorrente, o DNA do transgene/sequência codificante heteróloga inserido e o DNA genômico flanqueador (DNA genômico/transgene) do progenitor transformado estão presentes na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" também se refere a DNA do transformante original e progênie do mesmo que compreende o DNA inserido e sequência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que se esperava que fosse transferido para uma progênie que recebe DNA inserido, incluindo o transgene/sequência codificante heteróloga de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem progenitora que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante de autopolinização) e uma linhagem progenitora que não contém o DNA inserido.

[00121] Conforme usado no presente documento, os termos "reação em cadeia da polimerase" ou "PCR" definem um procedimento ou técnica na qual quantidades mínimas de ácido nucleico, RNA e/ou DNA são amplificadas, conforme descrito na Patente dos E.U.A. Nº 4.683.195 emitida em 28 de julho de 1987. Geralmente, as informações de sequência das extremidades da região de interesse, ou além, precisam estar disponíveis, de modo que iniciadores oligonucleotídicos possam ser projetados; esses iniciadores serão idênticos ou similares em termos de sequência às fitas opostas do molde a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. PCR pode ser usada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas de DNA genômico total, e cDNA transcrito a partir de RNA celular total, sequências de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Veja, em geral, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

[00122] Conforme usado no presente documento, o termo "iniciador" se refere a um oligonucleotídeo com capacidade para atuar como um ponto de iniciação de síntese ao longo de uma fita complementar quando condições são adequadas para a síntese de um produto de extensão de iniciador. As condições de síntese incluem a presença de quatro desoxirribonucleotídeo trifosfatos diferentes e pelo menos um agente de indução da polimerização, tal como uma transcriptase reversa ou DNA polimerase. Essas estão presentes em um tampão adequado, que pode incluir constituintes que são cofatores ou que afetam condições tais como pH e similares em várias temperaturas adequadas. Um iniciador é, tipicamente, uma sequência de fita simples, de modo que a eficiência da amplificação seja ideal, mas sequências de fita dupla podem ser usadas.

[00123] Conforme usado no presente documento, o termo "sonda" se refere a um oligonucleotídeo que hibridiza com uma sequência-alvo. No procedimento de ensaio TaqMan® ou de estilo TaqMan®, a sonda hibridiza com uma porção do alvo situada entre o sítio de anelamento dos dois iniciadores. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos. Uma sonda pode incluir adicionalmente um marcador detectável, por exemplo, um fluoróforo (Texas-Red®, isotiocianato de fluoresceína, etc.). O marcador detectável pode ser covalentemente ligado diretamente ao oligonucleotídeo de sonda, por exemplo, localizado na extremidade 5' da sonda ou na extremidade 3' da sonda. Uma sonda incluindo um fluoróforo pode também incluir ainda um supressor, por exemplo, Black Hole Quencher™, Iowa Black™, etc.

[00124] Como usado no presente documento, os termos "endonucleases de restrição" e "enzimas de restrição" se referem a enzimas bacterianas, cada uma das quais corta DNA de fita dupla em ou próximo a uma sequência nucleotídica específica. As enzimas de restrição tipo 2 reconhecem e clivam o DNA no mesmo sítio e incluem, mas sem limitação, XbaI, BamHI, HindIII, EcoRI, XhoI, SalI, KpnI, AvaI, PstI e SmaI.

[00125] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" é usado indistintamente com os termos "construção", "vetor de clonagem" e "vetor de expressão" e significa o veículo pelo qual uma sequência de

DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzida em uma célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. Um "vetor não viral" se destina a significar qualquer vetor que não compreende um vírus ou retrovírus. Em algumas modalidades, um "vetor" é uma sequência de DNA que compreende pelo menos uma origem de replicação de DNA e pelo menos um gene marcador de seleção. Exemplos incluem, mas sem limitação, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso e/ou genes marcadores de seleção e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor.

[00126] O termo "plasmídeo" define uma fita circular de ácido nucleico capaz de replicação autossômica em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. O termo inclui ácido nucleico que pode ser DNA ou RNA e pode ser de fita simples ou dupla. O plasmídeo da definição também pode incluir as sequências que correspondem a uma origem bacteriana de replicação.

[00127] Conforme usado no presente documento, o termo "gene marcador de seleção", como usado no presente documento, define um gene ou outro cassete de expressão que codifica uma proteína que facilita a identificação de células nas quais o gene marcador de seleção é inserido. Por exemplo, um "gene marcador de seleção" abrange genes-repórter, assim como genes usados na transformação de plantas para, por exemplo, proteger células vegetais de um agente de seleção ou fornecer resistência/tolerância a um agente de seleção. Em uma modalidade, apenas as células ou plantas que recebem um marcador de seleção funcional são capazes de se dividir ou crescer sob condições que têm um agente de seleção. A expressão "positivo para marcador" se refere a plantas que foram transformadas para incluir um gene marcador de seleção.

[00128] Conforme usado no presente documento, o termo "marcador detectável" se refere a um marcador com capacidade de detecção, tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelante de metal ou enzima. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas sem limitação, os seguintes: marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeo), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes e biotinila, epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, marcadores de epitopo). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser ligado por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico.

[00129] Conforme usado no presente documento, os termos "cassete", "cassete de expressão" e "cassete de expressão gênica" se referem a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou polinucleotídeo em sítios de restrição específicos ou por recombinação homóloga. Como usado no presente documento, o segmento de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, e o cassete e sítios de restrição são projetados para garantir a inserção do cassete na fase de leitura adequada para transcrição e tradução. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e que tem elementos além do polinucleotídeo que facilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica também pode incluir elementos que permitem a expressão intensificada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Esses elementos podem incluir, porém sem limitação: um promotor, um promotor mínimo, um potencializador, um elemento de resposta, uma sequência terminadora, uma sequência de poliadenilação e similares.

[00130] Como usado no presente documento, um "ligante" ou "espaçador" é uma ligação, molécula ou grupo de moléculas que liga duas entidades separadas uma à outra. Os ligantes e espaçadores podem proporcionar um espaçamento ideal das duas entidades ou adicionalmente fornecer uma ligação lábil que permita que as duas entidades sejam separadas uma da outra. As ligações lábeis incluem grupos fotocliváveis, porções químicas lábeis a ácidos, porções químicas lábeis a bases e grupos cliváveis por enzimas. Os termos "poliligante" ou "sítio de clonagem múltipla", como usados no presente documento, definem um agrupamento de três ou mais sítios de enzimas de restrição Tipo 2 localizados dentro de 10 nucleotídeos um do outro em uma sequência de ácido nucleico. Em outros casos, o termo "poliligante", conforme usado no presente documento, se refere a um trecho de nucleotídeos que são alvejados para unir duas sequências por meio de qualquer método de clonagem contínuo conhecido (isto é, Gibson Assembly®, NEBuilder HiFiDNA Assembly®, Golden Gate Assembly, BioBrick® Assembly, etc.). Construções compreendendo um poliligante são usadas para a inserção e/ou excisão de sequências de ácidos nucleicos, tais como a região codificante de um gene.

[00131] Conforme usado no presente documento, o termo "controle" se refere a uma amostra usada em um procedimento analítico para propósitos de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou

"negativo". Por exemplo, quando o propósito de um procedimento analítico é detectar um polipeptídeo ou transcrito diferencialmente expresso em células ou tecido, é geralmente preferencial incluir um controle positivo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que exibe a expressão desejada, e um controle negativo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que não tem a expressão desejada.

[00132] Conforme usado no presente documento, o termo "planta" inclui uma planta completa e qualquer descendente, célula, tecido, ou parte de uma planta. Uma classe de planta que pode ser usada na presente divulgação é geralmente tão abrangente quanto a classe de plantas inferiores e superiores passíveis de mutagênese, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Desse modo, "planta" inclui plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. O termo "partes da planta" inclui qualquer parte (ou quaisquer partes) de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente não madura); um corte de planta; uma célula vegetal; uma cultura de célula vegetal; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutos, brotos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido vegetal ou órgão vegetal pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células vegetais que seja organizado em uma unidade estrutural ou funcional. Uma cultura de célula ou tecido vegetal pode ser capaz de regenerar uma planta com as características fisiológicas e morfológicas da planta da qual a célula ou tecido foi obtido e de regenerar uma planta que tem substancialmente o mesmo genótipo da planta. Por outro lado, algumas células vegetais não são capazes de serem regeneradas para produzir plantas. As células regeneráveis em uma cultura de célula ou tecido vegetal podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas das raízes, cabelo, flores,

sementes, sabugos, espigas, cascas ou pedúnculos.

[00133] As partes das plantas incluem partes passíveis de serem colhidas e partes úteis para a propagação de plantas descendentes. As partes das plantas úteis para propagação incluem, por exemplo, e sem limitação: semente; fruta; um corte; uma muda; um tubérculo e um porta- enxerto. Uma parte passível de ser colhida de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; haste; fruta; semente e raiz.

[00134] Uma célula vegetal é a unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreende um protoplasto e uma parede celular. Uma célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula cultivada) e pode fazer parte de uma unidade organizada superior (por exemplo, um tecido vegetal, órgão vegetal e planta). Assim, uma célula vegetal pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gametas ou uma célula ou coleção de células que podem se regenerar em uma planta completa. Dessa maneira, uma semente que compreende múltiplas células vegetais e tem capacidade para se regenerar em uma planta completa é considerada uma "célula vegetal" em modalidades no presente documento.

[00135] Como usado no presente documento, o termo "RNA pequeno" se refere a várias classes de ácido ribonucleico não codificante de proteína (ncRNA). O termo RNA pequeno descreve as cadeias curtas de ncRNA produzidas em células bacterianas, animais, plantas e fungos. Essas cadeias curtas de ncRNA podem ser produzidas naturalmente dentro da célula ou podem ser produzidas pela introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de RNA pequeno não codificam diretamente uma proteína e diferem em função de outro RNA, pelo fato de que sequências de RNA pequeno são somente transcritas e não traduzidas.

As sequências de RNA pequeno estão envolvidas em outras funções celulares, incluindo expressão e modificação de genes. Moléculas de RNA pequeno são geralmente constituídas por cerca de 20 a 30 nucleotídeos. As sequências de RNA pequeno podem ser derivadas de precursores mais longos. Os precursores formam estruturas que se dobram de volta uma na outra em regiões autocomplementares; os mesmos são então processados pela nuclease DICER em animais ou DCL1 em plantas.

[00136] Muitos tipos de RNA pequeno existem naturalmente ou são produzidos artificialmente, incluindo microRNAs (miRNAs), RNAs de interferência curtos (siRNAs), RNA antissenso, RNA curto/pequeno em forma de grampo (shRNA) e RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs). Certos tipos de RNA pequeno, tais como microRNA e siRNA, são importantes no silenciamento de genes e na interferência de RNA (RNAi). O silenciamento de genes é um processo de regulação genética no qual um gene que seria normalmente expresso é "desligado" por um elemento intracelular, nesse caso, o RNA pequeno. A proteína que seria normalmente formada por essas informações genéticas não é formada devido à interferência, e as informações codificadas no gene são bloqueadas da expressão.

[00137] Conforme usado no presente documento, o termo "RNA pequeno" abrange moléculas de RNA descritas na literatura como "RNA minúsculo" (Storz, (2002) Science 296:1260-1263; Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489); "RNA pequeno" procariótico (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); "RNA não codificante (ncRNA)" eucariótico; "micro-RNA (miRNA)"; "RNA não mensageiro pequeno (snmRNA)"; "RNA funcional (fRNA)"; "RNA de transferência (tRNA)"; "RNA catalítico" [por exemplo, ribozimas, incluindo ribozimas de auto-acilação (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489)]; "RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs)", "tmRNA"

(também conhecido como "10S RNA", Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29; e Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885); moléculas de RNAi incluindo, sem limitação, "RNA pequeno de interferência (siRNA)", "siRNA preparado por endoribonuclease (e- siRNA)", "RNA curto/pequeno em forma de grampo (shRNA)" e "RNA pequeno temporariamente regulado (stRNA)", "siRNA cortado (d- siRNA)" e aptâmeros, oligonucleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que compreendem pelo menos uma base uracila.

[00138] Conforme usado no presente documento, o termo sequência de reconhecimento de DICER é qualquer trecho de polinucleotídeos que são reconhecidos e ligados pela enzima DICER para clivagem subsequente. A molécula de fita dupla gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de shRNA pode ser separada em dois shRNAs de fita simples; a "fita STAR/passageira" e a "fita guia". A fita STAR/passageira pode ser degradada e a fita guia pode ser incorporada ao complexo RISC. A inibição pós-transcricional ocorre por hibridização específica da fita guia com um polinucleotídeo especificamente complementar de uma molécula de RNAm e subsequente clivagem pela enzima Argonaute (por exemplo, um componente catalítico do complexo RISC).

[00139] Conforme usado no presente documento, o termo sequência de reconhecimento de DROSHA é qualquer trecho de polinucleotídeos que são reconhecidos e ligados pela enzima DROSHA para clivagem subsequente.

[00140] A menos que especificamente explicado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles de habilidade comum na técnica à qual a presente divulgação pertence. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser constatadas em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of

Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). III. Novas moléculas pequenas de RNA em forma de grampo (shRNA)

[00141] São fornecidos métodos e composições que divulgam o polinucleotídeo de shRNA. Em uma modalidade, o polinucleotídeo de shRNA pode ser um polinucleotídeo de DNA ou RNA. Em um aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA tem menos de 70 nucleotídeos de comprimento. Em um exemplo deste aspecto, o shRNA pode ter menos de 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, ou 15 polinucleotídeos de comprimento. Em outro aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA tem menos de 80 nucleotídeos de comprimento. Em um exemplo deste aspecto, o shRNA pode ter menos de 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, ou 15 polinucleotídeos de comprimento. Em um aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA tem menos de 90 nucleotídeos de comprimento. Em um exemplo deste aspecto, o shRNA pode ter menos de 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, ou 15 polinucleotídeos de comprimento. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA é inicialmente uma sequência polinucleotídica de fita simples (por exemplo, sequência de ácido ribonucleico) que pode dobrar-se sobre si mesma e se auto-hibridizar sob condições apropriadas. Em um aspecto,

o shRNA compreende uma primeira fita de RNA, uma segunda fita de RNA e uma terceira fita de RNA. Por conseguinte, a primeira fita de RNA compreende de 16 a 25 nucleotídeos. A segunda fita de RNA compreende menos de 25 nucleotídeos. Além disso, a terceira fita de RNA compreende de 16 a 25 nucleotídeos. Em alguns aspectos, a terceira fita de RNA é o complemento reverso da primeira fita de RNA. Em outros aspectos, a primeira e a terceira fitas de RNA podem auto- hibridizar quando o polinucleotídeo de shRNA se dobra sobre si mesmo. Em tal aspecto, o polinucleotídeo de shRNA pode formar uma estrutura do tipo haste-alça que é composta por uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste. Por conseguinte, aspectos da divulgação incluem uma molécula de shRNA que é composta por uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste. Outros aspectos incluem uma molécula de shRNA que consiste em uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste. Em outros aspectos, a molécula de shRNA tem uma energia livre (∆G°37) inferior a -30 kcal/mol. Em aspectos adicionais, a molécula de shRNA compreende SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3, SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5, SEQ ID Nº:6, SEQ ID Nº:405, SEQ ID Nº:406, SEQ ID Nº:407, SEQ ID Nº:408, SEQ ID Nº:411, SEQ ID Nº:413, SEQ ID Nº:415, SEQ ID Nº:417, SEQ ID Nº:419, ou SEQ ID Nº:421 . Em alguns aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em outros aspectos, o shRNA inibe um gene-alvo de um organismo vivo por supressão da expressão do RNAm-alvo de um organismo vivo.

[00142] Em modalidades adicionais da presente divulgação, o polinucleotídeo de shRNA não compreende uma sequência de reconhecimento de DROSHA. Em outros aspectos, o polinucleotídeo de shRNA não é clivado pela enzima DROSHA. O pri-miRNA é transcrito no núcleo e processado por um complexo da ribonuclease DROSHA e DGCR8 (por exemplo, PASHA) para produzir uma molécula de pré-

miRNA com ~70 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a molécula de pré-miRNA tem ~80 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades adicionais, a molécula de pré-miRNA tem ~90 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto desta modalidade, uma enzima DROSHA é uma enzima da família RNase III que não tem função na clivagem da molécula de shRNA. Em outros aspectos, a enzima DROSHA é uma enzima da família RNase III que não reconhece ou se liga à molécula de shRNA. Comparativamente, a enzima DROSHA reconhece, se liga a e cliva moléculas de miRNA dentro do núcleo de uma célula. Enzimas DROSHA exemplificativas incluem membros da Classe de enzimas: 3.1.26.3 (isto é, EC:3.1.26.3).

[00143] Em outras modalidades da presente divulgação, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma sequência de reconhecimento de DICER. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA é clivado pela enzima DICER. Tipicamente, o pré-miRNA é processado em um pri-miRNA por meio da clivagem da característica de alça (por exemplo, estrutura de grampo) da estrutura de haste-alça por DICER em colaboração com outros cofatores (por exemplo, TRBP e PACT). A clivagem resultante produz um duplex de miRNA imperfeito de ~22 nucleotídeos com projeções de 2 nucleotídeos na extremidade 3' da molécula. Em um aspecto desta modalidade, uma enzima DICER é uma enzima da família RNase III que cliva a molécula de shRNA para produzir fragmentos curtos de RNA de fita dupla chamados de RNA pequeno de interferência (siRNA) e miRNA maduro. Em outros aspectos, a enzima DICER processa uma molécula de shRNA em fragmentos com comprimentos de aproximadamente 19 a 25 nucleotídeos. Como tal, os aspectos desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por DICER em uma molécula de shRNA de 19 nucleotídeos. Outros aspectos desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por

DICER em uma molécula de shRNA de 20 nucleotídeos.

Aspectos adicionais desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por DICER em uma molécula de shRNA de 21 nucleotídeos.

Aspectos desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por DICER em uma molécula de shRNA de 22 nucleotídeos.

Aspectos adicionais desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por DICER em uma molécula de shRNA de 23 nucleotídeos.

Outros aspectos desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por DICER em uma molécula de shRNA de 24 nucleotídeos.

Aspectos adicionais desta modalidade incluem o processamento de uma molécula de shRNA por DICER em uma molécula de shRNA de 25 nucleotídeos.

Em outros aspectos, a enzima DICER reconhece e cliva uma molécula de shRNA, ativando assim o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Assim, os aspectos desta modalidade incluem uma molécula de shRNA processada por DICER que ativa RISC.

Em aspectos adicionais, a enzima DICER da presente divulgação abrange qualquer enzima DICER ortóloga de um organismo vivo.

Na maioria dos exemplos, a enzima DICER contém tanto uma helicase como um domínio PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille). Exemplos adicionais de enzimas DICER incluem membros da Classe de enzimas: 3.1.26.- (isto é, EC:3.1.26.-). Em outros aspectos, a enzima DICER inclui uma enzima DICER obtida de um inseto (por exemplo, DICER-1). Assim, a enzima DICER de inseto pode reconhecer um shRNA e processar o shRNA processando a molécula de shRNA em shRNA maduro, que é uma molécula de siRNA.

Subsequentemente, essas moléculas de shRNA maduras são carregadas em RISC (por exemplo, AGO2-RISC) e resultam na inibição de um gene-alvo por meio da clivagem do RNAm- alvo.

Em aspectos adicionais, a enzima DICER inclui uma enzima DICER ou fragmento da mesma obtido de uma planta (por exemplo,

DCL-1, DCL-2, DCL-3 ou DCL-4). Assim, a enzima DICER de planta ou fragmento da mesma pode reconhecer um shRNA e processar o shRNA por clivagem da molécula de shRNA em fragmentos de 19 a 25 pb. Subsequentemente, esses shRNA clivados podem ser carregados em RISC e resultar na inibição de um gene-alvo pela supressão da expressão do RNAm do gene-alvo.

[00144] Em outras modalidades da presente divulgação, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo. Em um aspecto, a estrutura de grampo pode ter menos de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 polinucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, a estrutura de grampo pode ser qualquer sequência polinucleotídica com menos de 25 polinucleotídeos de comprimento. Em um aspecto adicional, a estrutura de grampo pode ser qualquer sequência polinucleotídica com menos de 24 polinucleotídeos de comprimento. Em um aspecto adicional, a estrutura de grampo pode ser uma sequência polinucleotídica obtida a partir de um arcabouço de microRNA de inseto. Em aspectos adicionais, a estrutura de haste pode compreender os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 23 a 36 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 23 a 38 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 24 a 36 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 25 a 37 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 24 a 37 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 25 a 34 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:419 ou os pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:421. Em outros aspectos,

a estrutura de grampo pode compreender qualquer polinucleotídeo de SEQ ID Nº:7, SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:9, SEQ ID Nº:10, SEQ ID Nº:11, SEQ ID Nº:12, SEQ ID Nº:13, SEQ ID Nº:14, SEQ ID Nº:15, SEQ ID Nº:16, SEQ ID Nº:17, SEQ ID Nº:18, SEQ ID Nº:19, SEQ ID Nº:20, SEQ ID Nº:21, SEQ ID Nº:22, SEQ ID Nº:23, SEQ ID Nº:24, SEQ ID Nº:25, SEQ ID Nº:26, SEQ ID Nº:27, SEQ ID Nº:28, SEQ ID Nº:29, SEQ ID Nº:30, SEQ ID Nº:31, SEQ ID Nº:32, SEQ ID Nº:33, SEQ ID Nº:34, SEQ ID Nº:35, SEQ ID Nº:36, SEQ ID Nº:37, SEQ ID Nº:38, SEQ ID Nº:39, SEQ ID Nº:40, SEQ ID Nº:41, SEQ ID Nº:42, SEQ ID Nº:43, SEQ ID Nº:44, SEQ ID Nº:45, SEQ ID Nº:46, SEQ ID Nº:47, SEQ ID Nº:48, SEQ ID Nº:49, SEQ ID Nº:50, SEQ ID Nº:51, SEQ ID Nº:52, SEQ ID Nº:53, SEQ ID Nº:54, SEQ ID Nº:55, SEQ ID Nº:56, SEQ ID Nº:57, SEQ ID Nº:58, SEQ ID Nº:59, SEQ ID Nº:60, SEQ ID Nº:61, SEQ ID Nº:62, SEQ ID Nº:63, SEQ ID Nº:64, SEQ ID Nº:65, SEQ ID Nº:66, SEQ ID Nº:67, SEQ ID Nº:68, SEQ ID Nº:69, SEQ ID Nº:70, SEQ ID Nº:71, SEQ ID Nº:72, SEQ ID Nº:73, SEQ ID Nº:74, SEQ ID Nº:75, SEQ ID Nº:76, SEQ ID Nº:77, SEQ ID Nº:78, SEQ ID Nº:79, SEQ ID Nº:80, SEQ ID Nº:81, SEQ ID Nº:82, SEQ ID Nº:83, SEQ ID Nº:84, SEQ ID Nº:85, SEQ ID Nº:86, SEQ ID Nº:87, SEQ ID Nº:88, SEQ ID Nº:89, SEQ ID Nº:90, SEQ ID Nº:91, SEQ ID Nº:92, SEQ ID Nº:93, SEQ ID Nº:94, SEQ ID Nº:95, SEQ ID Nº:96, SEQ ID Nº:97, SEQ ID Nº:98, SEQ ID Nº:99, SEQ ID Nº:100, SEQ ID Nº:101, SEQ ID Nº:102, SEQ ID Nº:103, SEQ ID Nº:104, SEQ ID Nº:105, SEQ ID Nº:106, SEQ ID Nº:107, SEQ ID Nº:108, SEQ ID Nº:109, SEQ ID Nº:110, SEQ ID Nº:111, SEQ ID Nº:112, SEQ ID Nº:113, SEQ ID Nº:114, SEQ ID Nº:115, SEQ ID Nº:116, SEQ ID Nº:117, SEQ ID Nº:118, SEQ ID Nº:119, SEQ ID Nº:120, SEQ ID Nº:121, SEQ ID Nº:122, SEQ ID Nº:123, SEQ ID Nº:124, SEQ ID Nº:125, SEQ ID Nº:126, SEQ ID Nº:127, SEQ ID Nº:128, SEQ ID Nº:129, SEQ ID Nº:130, SEQ ID Nº:131, SEQ ID Nº:132, SEQ ID Nº:133, SEQ ID Nº:134, SEQ ID Nº:135, SEQ ID Nº:136, SEQ ID Nº:137, SEQ ID Nº:138, SEQ ID

Nº:139, SEQ ID Nº:140, SEQ ID Nº:141, SEQ ID Nº:142, SEQ ID Nº:143, SEQ ID Nº:144, SEQ ID Nº:145, SEQ ID Nº:146, SEQ ID Nº:147, SEQ ID Nº:148, SEQ ID Nº:149, SEQ ID Nº:150 SEQ ID Nº:151, SEQ ID Nº:152, SEQ ID Nº:153, SEQ ID Nº:154, SEQ ID Nº:155, SEQ ID Nº:156, SEQ ID Nº:157, SEQ ID Nº:158, SEQ ID Nº:159, SEQ ID Nº:160, SEQ ID Nº: 161, SEQ ID Nº:162, SEQ ID Nº:163, SEQ ID Nº:164, SEQ ID Nº:165, SEQ ID Nº:166, SEQ ID Nº:167, SEQ ID Nº:168, SEQ ID Nº:169, SEQ ID Nº:170, SEQ ID Nº:171, SEQ ID Nº:172, SEQ ID Nº:173, SEQ ID Nº:174, SEQ ID Nº:175, SEQ ID Nº:176, SEQ ID Nº:177, SEQ ID Nº:178, SEQ ID Nº:179, SEQ ID Nº:180, SEQ ID Nº:181, SEQ ID Nº:182, SEQ ID Nº:183, SEQ ID Nº:184, SEQ ID Nº:185, SEQ ID Nº:186, SEQ ID Nº:187, SEQ ID Nº:188, SEQ ID Nº:189, SEQ ID Nº:190, SEQ ID Nº:191, SEQ ID Nº:192, SEQ ID Nº:193 SEQ ID Nº:194, SEQ ID Nº:195, SEQ ID Nº:196, SEQ ID Nº:197, SEQ ID Nº:198, SEQ ID Nº:199, SEQ ID Nº:200, SEQ ID Nº:201, SEQ ID Nº:202, SEQ ID Nº:203, SEQ ID Nº:204, SEQ ID Nº:205, SEQ ID Nº:206, SEQ ID Nº:207, SEQ ID Nº:208, SEQ ID Nº:209, SEQ ID Nº:210, SEQ ID Nº:211, SEQ ID Nº:212, SEQ ID Nº:213, SEQ ID Nº:214, SEQ ID Nº:215, SEQ ID Nº:216, SEQ ID Nº:217, SEQ ID Nº:218, SEQ ID Nº:219, SEQ ID Nº:220, SEQ ID Nº:221, SEQ ID Nº:222, SEQ ID Nº:223, SEQ ID Nº:224, SEQ ID Nº:225, SEQ ID Nº:226, SEQ ID Nº:227, SEQ ID Nº:228, SEQ ID Nº:229, SEQ ID Nº:230, SEQ ID Nº:231, SEQ ID Nº:232, SEQ ID Nº:233, SEQ ID Nº:234, SEQ ID Nº:235, SEQ ID Nº:236, SEQ ID Nº:237, SEQ ID Nº:238, SEQ ID Nº:239, SEQ ID Nº:240, SEQ ID Nº:241, SEQ ID Nº:242, SEQ ID Nº:243, SEQ ID Nº:244, SEQ ID Nº:245, SEQ ID Nº:246, SEQ ID Nº:247, SEQ ID Nº:248, SEQ ID Nº:249, SEQ ID Nº:250 SEQ ID Nº:251, SEQ ID Nº:252, SEQ ID Nº:253, SEQ ID Nº:254, SEQ ID Nº:255, SEQ ID Nº:256, SEQ ID Nº:257, SEQ ID Nº:258, SEQ ID Nº:259, SEQ ID Nº:260, SEQ ID Nº:261, SEQ ID Nº:262, SEQ ID Nº:263, SEQ ID Nº:264, SEQ ID Nº:265, SEQ ID Nº:266, SEQ ID Nº:267, SEQ ID Nº:268, SEQ ID

Nº:269, SEQ ID Nº:270, SEQ ID Nº:271, SEQ ID Nº:272, SEQ ID Nº:273, SEQ ID Nº:274, SEQ ID Nº:275, SEQ ID Nº:276, SEQ ID Nº:277, SEQ ID Nº:278, SEQ ID Nº:279, SEQ ID Nº:280, SEQ ID Nº:281, SEQ ID Nº:282, SEQ ID Nº:283, SEQ ID Nº:284, SEQ ID Nº:285, SEQ ID Nº:286, SEQ ID Nº:287, SEQ ID Nº:288, SEQ ID Nº:289, SEQ ID Nº:290, SEQ ID Nº:291, SEQ ID Nº:292, SEQ ID Nº:293 SEQ ID Nº:294, SEQ ID Nº:295, SEQ ID Nº:296, SEQ ID Nº:297, SEQ ID Nº:298, SEQ ID Nº:299, SEQ ID Nº:300, SEQ ID Nº:301, SEQ ID Nº:302, SEQ ID Nº:303, SEQ ID Nº:304, SEQ ID Nº:305, SEQ ID Nº:306, SEQ ID Nº:307, SEQ ID Nº:308, SEQ ID Nº:309, SEQ ID Nº:310, SEQ ID Nº:311, SEQ ID Nº:312, SEQ ID Nº:313, SEQ ID Nº:314, SEQ ID Nº:315, SEQ ID Nº:316, SEQ ID Nº:317, SEQ ID Nº:318, SEQ ID Nº:319, SEQ ID Nº:320, SEQ ID Nº:321, SEQ ID Nº:322, SEQ ID Nº:323, SEQ ID Nº:324, SEQ ID Nº:325, SEQ ID Nº:326, SEQ ID Nº:327, SEQ ID Nº:328, SEQ ID Nº:329, SEQ ID Nº:330, SEQ ID Nº:331, SEQ ID Nº:332, SEQ ID Nº:333, SEQ ID Nº:334, SEQ ID Nº:335, SEQ ID Nº:336, SEQ ID Nº:337, SEQ ID Nº:338, SEQ ID Nº:339, SEQ ID Nº:340, SEQ ID Nº:341, SEQ ID Nº:342, SEQ ID Nº:343, SEQ ID Nº:344, SEQ ID Nº:345, SEQ ID Nº:346, SEQ ID Nº:347, SEQ ID Nº:348, SEQ ID Nº:349, SEQ ID Nº:350 SEQ ID Nº:351, SEQ ID Nº:352, SEQ ID Nº:353, SEQ ID Nº:354, SEQ ID Nº:355, SEQ ID Nº:356, SEQ ID Nº:357, SEQ ID Nº:358, SEQ ID Nº:359, SEQ ID Nº:360, SEQ ID Nº:361, SEQ ID Nº:362, SEQ ID Nº:363, SEQ ID Nº:364, SEQ ID Nº:365, SEQ ID Nº:366, SEQ ID Nº:367, SEQ ID Nº:368, SEQ ID Nº:369, SEQ ID Nº:370, SEQ ID Nº:371, SEQ ID Nº:372, SEQ ID Nº:373, SEQ ID Nº:374, SEQ ID Nº:375, SEQ ID Nº:376, SEQ ID Nº:377, SEQ ID Nº:378, SEQ ID Nº:379, SEQ ID Nº:380, SEQ ID Nº:381, SEQ ID Nº:382, SEQ ID Nº:383, SEQ ID Nº:384, SEQ ID Nº:385, SEQ ID Nº:386, SEQ ID Nº:387, SEQ ID Nº:388, SEQ ID Nº:389, SEQ ID Nº:390, SEQ ID Nº:391, SEQ ID Nº:392, SEQ ID Nº:393 SEQ ID Nº:394, SEQ ID Nº:395, SEQ ID Nº:396, SEQ ID Nº:397, SEQ ID Nº:398, SEQ ID

Nº:399, SEQ ID Nº:400, ou SEQ ID Nº:401. Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo pode compreender um fragmento de qualquer uma das SEQ ID Nos:7 a 401. Em um exemplo deste aspecto, o comprimento do fragmento de qualquer uma das SEQ ID Nos:7 a 401 pode ser menor que 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 polinucleotídeos de comprimento. As sequências polinucleotídicas da presente divulgação podem ser usadas para isolar estruturas de arcabouço de microRNA em forma de grampo correspondentes de outros organismos, particularmente outras espécies de insetos. Dessa maneira, métodos tais como PCR, hibridização, análise de bioinformática e similares podem ser usados para identificar essas sequências com base em sua identidade de sequência com as sequências apresentadas no presente documento.

[00145] Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA compreendendo a estrutura de grampo pode dobrar-se sobre si mesmo e auto-hibridizar. Em tal aspecto, o polinucleotídeo de shRNA pode formar uma estrutura do tipo haste-alça que é composta por uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste. Em tal aspecto, a estrutura de grampo pode ser composta por nucleotídeos de fita simples que não auto-hibridizam. Em outro aspecto, a estrutura de grampo pode ser composta por uma combinação de nucleotídeos de fita simples que não auto-hibridizam e nucleotídeos de fita dupla que auto-hibridizam. Em tal exemplo, os nucleotídeos de fita dupla que auto-hibridizam constituem a menor parte da estrutura de grampo, em que a estrutura de grampo é observada como a característica de alça dentro da estrutura do tipo haste-alça. Em um aspecto, a estrutura de grampo compreende fragmentos de fita dupla com um comprimento de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos. Em outros aspectos, podem existir múltiplos fragmentos/polinucleotídeos de fita dupla dentro da estrutura de grampo. Assim, o resultado de nucleotídeos de fita dupla que auto-

hibridizam dentro de uma estrutura de haste pode ser observado como uma série de saliências e/ou mal pareamentos dentro da estrutura de haste. Em um aspecto, as saliências/mal pareamentos são nucleotídeos de fita simples e não ligados que resultaram da formação de sequências de fita dupla diretamente a montante e a jusante das saliências/mal pareamentos não estruturados da sequência polinucleotídica. Em aspectos adicionais, a estrutura de grampo tem uma energia livre (∆G) inferior a -20 kcal/mol. São como fornecidos no presente documento métodos e composições que divulgam a estrutura de grampo do polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação.

[00146] Em outras modalidades da presente divulgação, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de haste. Em um aspecto, a estrutura de haste pode ter 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 ou 16 polinucleotídeos de comprimento. Em um aspecto adicional, a estrutura de haste pode ter 25 a 16 polinucleotídeos de comprimento. Em outro aspecto, a estrutura de haste pode ter 23 a 16 polinucleotídeos de comprimento. Em outros aspectos, a estrutura da haste do shRNA contém sequências polinucleotídicas-alvo que inibem especificamente o RNA transcrito a partir de um gene expresso em um organismo vivo. Por exemplo, o polinucleotídeo-alvo da molécula de shRNA inibe um gene-alvo por supressão da expressão do RNAm do gene-alvo. Em um aspecto adicional, a estrutura de haste do polinucleotídeo de shRNA pode ser qualquer sequência polinucleotídica que tenha de 70% a 100% de identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ter pelo menos 70% de identidade de sequência, 71% de identidade de sequência, 72% de identidade de sequência, 73% de identidade de sequência, 74% de identidade de sequência, 75% de identidade de sequência, 76% de identidade de sequência, 77% de identidade de sequência, 78% de identidade de sequência, 79% de identidade de sequência, 80% de identidade de sequência, 81% de identidade de sequência, 82% de identidade de sequência, 83% de identidade de sequência, 84% de identidade de sequência, 85% de identidade de sequência, 86% de identidade de sequência, 87% de identidade de sequência, 88% de identidade de sequência, 89% de identidade de sequência, 90% de identidade de sequência, 91% de identidade de sequência, 92% de identidade de sequência, 93% de identidade de sequência, 94% de identidade de sequência, 95% de identidade de sequência, 96% de identidade de sequência, 97% de identidade de sequência, 98% de identidade de sequência, 99% de identidade de sequência, 99,5% de identidade de sequência, 99,9% de identidade de sequência ou 100% de identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo de uma praga de inseto.

Em exemplos deste aspecto, o polinucleotídeo-alvo pode ser um gene essencial da praga de inseto.

Assim, a sequência polinucleotídica-alvo é obtida a partir de uma praga de planta e é incorporada como uma estrutura de haste com 16 a 23 polinucleotídeos de comprimento dentro da molécula de shRNA.

Similarmente, a sequência polinucleotídica-alvo é obtida a partir de uma praga de planta e é incorporada como uma estrutura de haste com 16 a 25 polinucleotídeos de comprimento dentro da molécula de shRNA.

Em outros aspectos, a estrutura de haste pode ser um polinucleotídeo-alvo que é selecionado do grupo que consiste em um gene de Caf1-180, gene de RPA70, gene de V-ATPase H, gene de Rho1, gene de V- ATPase C, gene de Reptina, gene de PPI-87B, gene de RPS6, gene de COPI gama, gene de COPI alfa, gene de COPI beta, gene de COPI delta, gene de Brahma, gene de ROP, gene de Hunchback, gene de RNA polimerase II 140, gene de Sec23, gene de Dre4, gene de Gho, gene de thread, gene de ncm, gene de RNA polimerase II-215, gene de RNA polimerase I 1, gene de RNA polimerase II 33, gene de Kruppel, gene de Spt5, gene de Spt6, gene de Snap25 e gene de Prp8. Em exemplos adicionais deste aspecto, as sequências polinucleotídicas- alvo da estrutura de haste são selecionadas de homólogos de genes- alvo que foram identificados no banco de dados de sequências de transcriptoma como descrito nos seguintes pedidos de patentes: Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20120174258; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20130091601; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20120198586; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº US20120174260; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20120174259; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20140298536; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20130091600; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20130097730; Pedido de Patente Nº WO2016060911; Pedido de Patente Nº WO2016060912; Pedido de Patente Nº WO2016060913; Pedido de Patente Nº WO2016060914; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160208251; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160222408; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20150176025; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160222407; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160208252; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20150176009; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20150322455; Pedido de patente dos E.U.A.

Nº 20150322456; Pedido de patente dos E.U.A.

Nº 20160186203; Pedido de patente Nº WO2016191357; Pedido de patente dos E.U.A.

Nº 20160194658; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160264992; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160264991; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160355841; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160208253; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160369296; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 20160348130; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 2016196241; Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 2017011764 e Pedido de Patente dos E.U.A.

Nº 2017011771, cujas divulgações são incorporadas no presente documento por referência na sua totalidade.

Em aspectos adicionais, a estrutura de haste pode compreender os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID

Nº:6, os pares de bases 37 a 58 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 36 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 39 a 70 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:421 ou os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:421. Em outros aspectos, a estrutura de haste pode compreender um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases de SEQ ID Nº:404, SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420. Em outros aspectos, a estrutura de haste pode compreender um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases da sequência complementar reversa de SEQ ID Nº:404, SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420. Em outros aspectos, a estrutura de haste pode compreender um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases da sequência complementar de SEQ ID Nº:404,

SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420.

[00147] Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA pode dobrar-se sobre si mesmo e auto-hibridizar. Em tal aspecto, o polinucleotídeo de shRNA pode formar uma estrutura do tipo haste-alça que é composta por uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste. Em tal aspecto, a estrutura de haste pode ser composta por nucleotídeos pareados ou de fita dupla que auto-hibridizam. Em outro aspecto, a estrutura de haste da molécula de shRNA não contém uma sequência polinucleotídica de fita simples dentro da estrutura de haste. Assim, a estrutura de haste da molécula de shRNA é livre de quaisquer mal pareamentos e/ou saliências de pares de bases dentro da estrutura de haste. Em aspectos adicionais, a estrutura de haste tem uma energia livre (∆G°37) inferior a -30 kcal/mol. São como fornecidos no presente documento métodos e composições que divulgam a estrutura de haste do polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação.

[00148] Outro aspecto da presente divulgação compreende uma variante funcional que difere em um ou mais nucleotídeos daqueles do polinucleotídeo que codifica os polinucleotídeos-alvo da estrutura de haste dentro do polinucleotídeo de shRNA, como fornecido no presente documento. Tal variante é produzida como o resultado de uma ou mais modificações (por exemplo, deleção, substituição ou adição) das sequências nucleotídicas compreendendo as sequências que codificam os polinucleotídeos-alvo da estrutura de haste. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo-alvo da estrutura de haste é alterado para produzir uma sequência polinucleotídica-alvo variante. Em um aspecto desta modalidade, os polinucleotídeos-alvo variantes da estrutura de haste têm pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12,

22, 23, 24 ou 25 pares de bases de SEQ ID Nº:404, SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420. Em um aspecto desta modalidade, os polinucleotídeos-alvo variantes da estrutura de haste têm pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 37 a 58 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 36 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 39 a 70 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:421 ou os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:421.

[00149] O grau de complementaridade entre o primeiro segmento da região de haste de pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos e um segmento de comprimento equivalente no polinucleotídeo-alvo é prontamente selecionado por um especialista na técnica. Será apreciado pelos especialistas na técnica que o pareamento de bases entre nucleotídeos localizados em direção à extremidade 5′ do shRNA maduro e o polinucleotídeo-alvo é comparativamente importante na capacidade de um shRNA de silenciar a expressão do polinucleotídeo-alvo. Além disso, espera-se que alta complementaridade entre a extremidade 5' do shRNA e o polinucleotídeo-alvo possa permitir um grau relativamente maior de mal pareamentos entre nucleotídeos mais próximos à extremidade 3′ do shRNA e o polinucleotídeo-alvo (e vice versa). Assim, em uma modalidade preferencial, a sequência nucleotídica do primeiro segmento da região de haste de pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos é selecionada de modo que o miRNA maduro processado a partir da haste-alça seja perfeitamente complementar ao polinucleotídeo-alvo no segmento de nucleotídeos mais 5′ do shRNA. Em outra modalidade preferencial, a sequência nucleotídica do primeiro segmento da região de haste de pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos é selecionada de modo que o shRNA processado a partir da haste-alça seja perfeitamente complementar ao polinucleotídeo-alvo nas posições nucleotídicas 2, 3, 4, 5, 6 e 7 (a partir da extremidade 5') do shRNA. Em outra modalidade preferencial, a sequência nucleotídica dos pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos do primeiro segmento da região de haste é projetada de modo que o shRNA processado a partir da estrutura de haste-alça tenha poucos ou não tenha pares de bases de oscilação G:U.

[00150] As sequências polinucleotídicas da presente divulgação, independentemente do comprimento da sequência codificante propriamente dita, podem ser combinadas com outras sequências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzimas de restrição adicionais, múltiplos sítios de clonagem, outras regiões codificantes, e similares, de modo que seu comprimento total possa variar consideravelmente. Portanto, é contemplado que uma sequência polinucleotídica de quase qualquer comprimento pode ser empregue, com o comprimento total sendo, de preferência, limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante pretendido. Por exemplo, fragmentos de sequências polinucleotídicas podem ser preparados que incluem um trecho contíguo curto de polinucleotídeos que codificam a totalidade ou uma porção dos polinucleotídeos de shRNA da presente divulgação.

[00151] As sequências polinucleotídicas da presente divulgação abrangem moléculas de shRNA equivalentes biologicamente funcionais. Alterações projetadas manualmente podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagênese sítio-dirigida, por exemplo, para introduzir aprimoramentos na toxicidade do polinucleotídeo de shRNA ou para testar polinucleotídeos de shRNA variantes de modo a melhorar a atividade inseticida do polinucleotídeo de shRNA contra uma praga de inseto.

[00152] Sequências nucleotídicas variantes também abrangem sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, tal como rearranjo de DNA. Com um tal procedimento, as sequências polinucleotídicas que codificam a estrutura de haste do shRNA dos seguintes polinucleotídeos-alvo; gene de Caf1-180, gene de RPA70, gene de V-ATPase H, gene de Rho1, gene de V-ATPase C, gene de Reptina, gene de PPI-87B, gene de RPS6, gene de COPI gama, gene de COPI alfa, gene de COPI beta, gene de COPI delta, gene de Brahma, gene de ROP, gene de Hunchback, gene de RNA polimerase II 140, gene de Sec23, gene de Dre4, gene de Gho, gene de thread, gene de ncm, gene de RNA polimerase II-215, gene de RNA polimerase I 1, gene de RNA polimerase II 33, gene de Kruppel, gene de Spt5, gene de Spt6, gene de Snap25 e gene de Prp8 podem ser manipuladas para criar um novo polinucleotídeo-alvo que codifica a estrutura de haste do polinucleotídeo de shRNA. Deste modo, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos com sequências relacionadas compreendendo regiões de sequências que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de forma homóloga in vitro ou in vivo. Estratégias para tal rearranjo de DNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA i: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 570:389- 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 75:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 527:288-291 e as Patentes dos E.U.A. Nos 5.605.793 e 5.837.458.

[00153] Em outras modalidades da presente divulgação, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma combinação de uma estrutura de grampo e uma estrutura de haste.

[00154] Em um aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo uma sequência polinucleotídica com menos de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 pares de bases de comprimento em combinação com uma estrutura de haste compreendendo os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 37 a 58 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 36 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 39 a 70 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:421 ou os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:421. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo uma sequência polinucleotídica obtida a partir de um arcabouço de microRNA de inseto em combinação com uma estrutura de haste compreendendo os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 37 a 58 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 36 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID

Nº:408, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 39 a 70 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:421 ou os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:421. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:1, dos pares de bases 23 a 36 de SEQ ID Nº:6, dos pares de bases 23 a 38 de SEQ ID Nº:2, dos pares de bases 24 a 36 de SEQ ID Nº:3, dos pares de bases 25 a 37 de SEQ ID Nº:4, dos pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, dos pares de bases 24 a 37 de SEQ ID Nº:5, dos pares de bases 25 a 34 de SEQ ID Nº:5, dos pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, dos pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, dos pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:407, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:408, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:411, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:413, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:415, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:417, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:419 ou dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:421 em combinação com uma estrutura de haste compreendendo os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 37 a 58 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID

Nº:5, os pares de bases 36 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 39 a 70 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:421 ou os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:421. Em um exemplo deste aspecto, o shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo um fragmento de 5 a 24 polinucleotídeos de comprimento de qualquer uma das SEQ ID Nos:7 a 401 em combinação com uma estrutura de haste compreendendo os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:1, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 37 a 58 de SEQ ID Nº:6, os pares de bases 1 a 22 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:2, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:3, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 24 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 36 a 60 de SEQ ID Nº:5, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:407, os pares de bases 1 a 23 de

SEQ ID Nº:408, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:408, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:411, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 39 a 70 de SEQ ID Nº:413, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:415, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:417, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:419, os pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:421 ou os pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:421.

[00155] Em um aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo uma sequência polinucleotídica com menos de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 pares de bases de comprimento em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um polinucleotídeo-alvo que é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo uma sequência polinucleotídica obtida de um arcabouço de microRNA de inseto em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um polinucleotídeo-alvo que é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V- ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:1, dos pares de bases 23 a 36 de SEQ ID Nº:6, dos pares de bases 23 a 38 de SEQ ID Nº:2, dos pares de bases 24 a 36 de SEQ ID Nº:3, dos pares de bases 25 a 37 de SEQ ID Nº:4, dos pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, dos pares de bases 24 a 37 de SEQ ID Nº:5, dos pares de bases 25 a 34 de SEQ ID Nº:5, dos pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, dos pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, dos pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:407, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:408, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:411, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:413, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:415, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:417, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:419 ou dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:421 em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um polinucleotídeo-alvo que é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8. Em um exemplo deste aspecto, o shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo um fragmento com 5 a 24 polinucleotídeos de comprimento de qualquer uma das SEQ ID Nos:7 a 401 em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um polinucleotídeo-alvo que é selecionado do grupo que consiste em Caf1- 180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8.

[00156] Em um aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo uma sequência polinucleotídica com menos de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 pares de bases de comprimento em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases de SEQ ID Nº:404, SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420. Em um aspecto adicional, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo uma sequência polinucleotídica obtida de um arcabouço de microRNA de inseto em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases de SEQ ID Nº:404, SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma estrutura de grampo dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:1, dos pares de bases 23 a 36 de SEQ ID Nº:6, dos pares de bases 23 a 38 de SEQ ID Nº:2, dos pares de bases 24 a 36 de SEQ ID Nº:3, dos pares de bases 25 a 37 de SEQ ID Nº:4, dos pares de bases 38 a 60 de SEQ ID Nº:4, dos pares de bases 24 a 37 de SEQ ID Nº:5, dos pares de bases 25 a 34 de SEQ ID Nº:5, dos pares de bases 1 a 23 de SEQ ID Nº:405, dos pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:405, dos pares de bases 39 a 60 de SEQ ID Nº:406, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:407, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:408, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:411, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:413, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:415, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:417, dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:419 ou dos pares de bases 24 a 38 de SEQ ID Nº:421 em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases de SEQ ID Nº:404, SEQ ID

Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420. Em um exemplo deste aspecto, o shRNA compreende uma estrutura de grampo compreendendo um fragmento com 5 a 24 polinucleotídeos de comprimento de qualquer uma das SEQ ID Nos:7 a 401 em combinação com uma estrutura de haste compreendendo um fragmento de 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases de SEQ ID Nº:404, SEQ ID Nº:409, SEQ ID Nº:410, SEQ ID Nº:412, SEQ ID Nº:414, SEQ ID Nº:416, SEQ ID Nº:418 ou SEQ ID Nº:420.

[00157] Em outras modalidades da presente divulgação, o polinucleotídeo de shRNA compreende uma projeção polinucleotídica de 2 a 4 nucleotídeos. Por exemplo, a projeção polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica com 2 pares de bases de comprimento. Em outro exemplo, a projeção polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica com 3 pares de bases de comprimento. Em um exemplo adicional, a projeção polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica com 4 pares de bases de comprimento. Em um aspecto, a combinação do polinucleotídeo de shRNA e da projeção polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica com menos de 74 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto adicional, a combinação do polinucleotídeo de shRNA e da projeção polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica com menos de 84 nucleotídeos de comprimento. Em outro aspecto, a combinação do polinucleotídeo de shRNA e da projeção polinucleotídica compreende uma sequência polinucleotídica com menos de 94 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita dupla. Em outro aspecto, o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples. Em um aspecto adicional, o segundo nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples. Em um aspecto adicional, o terceiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em outro aspecto, o quarto nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

Em um aspecto, a projeção de 1 par de bases é composta de uma das seguintes sequências nucleotídicas 5'-A-3', 5'-G-3', 5'-C-3' ou 5'-T-3'. Em alguns aspectos, a projeção de 2 pares de bases é composta de uma das seguintes sequências polinucleotídicas 5'-AA-3', 5'-AC-3', 5'-AG-3', 5'- AT-3', 5'-CA-3', 5'-CC-3', 5'-CG-3', 5'-CT-3', 5'-GA-3', 5'-GC-3', 5'-GG-3', 5'-GT-3', 5'-TA-3', 5'-TC-3', 5'-TG-3' ou 5'-TT-3'. Em outros aspectos, a projeção de 3 pares de bases é composta de uma das seguintes sequências polinucleotídicas 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAG-3', 5'-AAT-3', 5'-ACA-3', 5'-ACC-3', 5'-ACG-3', 5'-ACT-3', 5'-AGA-3', 5'-AGC-3', 5'- AGG-3', 5'-AGT-3', 5'-ATA-3', 5'-ATC-3', 5'-ATG-3', 5'-ATT-3', 5'-CAA-3', 5'-CAC-3', 5'-CAG-3', 5'-CAT-3', 5'-CCA-3', 5'-CCC-3', 5'-CCG-3', 5'- CCT-3', 5'-CGA-3', 5'-CGC-3', 5'-CGG-3', 5'-CGT-3', 5'-CTA-3', 5'-CTC- 3', 5'-CTG-3', 5'-CTT-3', 5'-GAA-3', 5'-GAC-3', 5'-GAG-3', 5'-GAT-3', 5'- GCA-3', 5'-GCC-3', 5'-GCG-3', 5'-GCT-3', 5'-GGA-3', 5'-GGC-3', 5'- GGG-3', 5'-GGT-3', 5'-GTA-3', 5'-GTC-3', 5'-GTG-3', 5'-GTT-3', 5'-TAA- 3', 5'-TAC-3', 5'-TAG-3', 5'-TAT-3', 5'-TCA-3', 5'-TCC-3', 5'-TCG-3', 5'- TCT-3', 5'-TGA-3', 5'-TGC-3', 5'-TGG-3', 5'-TGT-3', 5'-TTA-3', 5'-TTC-3', 5'-TTG-3', ou 5'-TTT-3'. Em outros aspectos, a projeção de 4 pares de bases é composta de uma das seguintes sequências polinucleotídicas 5'-AAAA-3', 5'-AACA-3', 5'-AAGA-3', 5'-AATA-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACCA- 3', 5'-ACGA-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGAA-3', 5'-AGCA-3', 5'-AGGA-3', 5'- AGTA-3', 5'-ATAA-3', 5'-ATCA-3', 5'-ATGA-3', 5'-ATTA-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CAGA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAA-3', 5'-CCCA-3', 5'-CCGA- 3', 5'-CCTA-3', 5'-CGAA-3', 5'-CGCA-3', 5'-CGGA-3', 5'-CGTA-3', 5'- CTAA-3', 5'-CTCA-3', 5'-CTGA-3', 5'-CTTA-3', 5'-GAAA-3', 5'-GACA-3',

5'-GAGA-3', 5'-GATA-3', 5'-GCAA-3', 5'-GCCA-3', 5'-GCGA-3', 5'- GCTA-3', 5'-GGAA-3', 5'-GGCA-3', 5'-GGGA-3', 5'-GGTA-3', 5'-GTAA- 3', 5'-GTCA-3', 5'-GTGA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TAAA-3', 5'-TACA-3', 5'- TAGA-3', 5'-TATA-3', 5'-TCAA-3', 5'-TCCA-3', 5'-TCGA-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAA-3', 5'-TGCA-3', 5'-TGGA-3', 5'-TGTA-3', 5'-TTAA-3', 5'-TTC-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-AAAG-3', 5'-AACG-3', 5'-AAGG-3', 5'-AATG- 3', 5'-ACAG-3', 5'-ACCG-3', 5'-ACGG-3', 5'-ACTG-3', 5'-AGAG-3', 5'- AGCG-3', 5'-AGGG-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-ATCG-3', 5'-ATGG- 3', 5'-ATTG-3', 5'-CAAG-3', 5'-CACG-3', 5'-CAGG-3', 5'-CATG-3', 5'- CCAG-3', 5'-CCCG-3', 5'-CCGG-3', 5'-CCTG-3', 5'-CGAG-3', 5'-CGCG- 3', 5'-CGGG-3', 5'-CGTG-3', 5'-CTAG-3', 5'-CTCG-3', 5'-CTGG-3', 5'- CTTG-3', 5'-GAAG-3', 5'-GACG-3', 5'-GAGG-3', 5'-GATG-3', 5'-GCAG- 3', 5'-GCCG-3', 5'-GCGG-3', 5'-GCTG-3', 5'-GGAG-3', 5'-GGCG-3', 5'- GGGG-3', 5'-GGTG-3', 5'-GTAG-3', 5'-GTCG-3', 5'-GTGG-3', 5'-GTTG- 3', 5'-TAAG-3', 5'-TACG-3', 5'-TAGG-3', 5'-TATG-3', 5'-TCAG-3', 5'- TCCG-3', 5'-TCGG-3', 5'-TCTG-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGCG-3', 5'-TGGG- 3', 5'-TGTG-3', 5'-TTAG-3', 5'-TTCG-3', 5'-TTGG-3', 5'-TTTG-3', 5'- AAAC-3', 5'-AACC-3', 5'-AAGC-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAC-3', 5'-ACCC-3', 5'-ACGC-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGAC-3', 5'-AGCC-3', 5'-AGGC-3', 5'- AGTC-3', 5'-ATAC-3', 5'-ATCC-3', 5'-ATGC-3', 5'-ATTC-3', 5'-CAAC-3', 5'-CACC-3', 5'-CAGC-3', 5'-CATC-3', 5'-CCAC-3', 5'-CCCC-3', 5'- CCGC-3', 5'-CCTC-3', 5'-CGAC-3', 5'-CGCC-3', 5'-CGGC-3', 5'-CGTC- 3', 5'-CTAC-3', 5'-CTCC-3', 5'-CTGC-3', 5'-CTTC-3', 5'-GAAC-3', 5'- GACC-3', 5'-GAGC-3', 5'-GATC-3', 5'-GCAC-3', 5'-GCCC-3', 5'-GCGC- 3', 5'-GCTC-3', 5'-GGAC-3', 5'-GGCC-3', 5'-GGGC-3', 5'-GGTC-3', 5'- GTAC-3', 5'-GTCC-3', 5'-GTGC-3', 5'-GTTC-3', 5'-TAAC-3', 5'-TACC-3', 5'-TAGC-3', 5'-TATC-3', 5'-TCAC-3', 5'-TCCC-3', 5'-TCGC-3', 5'-TCTC- 3', 5'-TGAC-3', 5'-TGCC-3', 5'-TGGC-3', 5'-TGTC-3', 5'-TTAC-3', 5'- TTCC-3', 5'-TTGC-3', 5'-TTTC-3', 5'-AAAT-3', 5'-AACT-3', 5'-AAGT-3', 5'-AATT-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACCT-3', 5'-ACGT-3', 5'-ACTT-3', 5'-AGAT-

3', 5'-AGCT-3', 5'-AGGT-3', 5'-AGTT-3', 5'-ATAT-3', 5'-ATCT-3', 5'- ATGT-3', 5'-ATTT-3', 5'-CAAT-3', 5'-CACT-3', 5'-CAGT-3', 5'-CATT-3', 5'-CCAT-3', 5'-CCCT-3', 5'-CCGT-3', 5'-CCTT-3', 5'-CGAT-3', 5'-CGCT- 3', 5'-CGGT-3', 5'-CGTT-3', 5'-CTAT-3', 5'-CTCT-3', 5'-CTGT-3', 5'- CTTT-3', 5'-GAAT-3', 5'-GACT-3', 5'-GAGT-3', 5'-GATT-3', 5'-GCAT-3', 5'-GCCT-3', 5'-GCGT-3', 5'-GCTT-3', 5'-GGAT-3', 5'-GGCT-3', 5'- GGGT-3', 5'-GGTT-3', 5'-GTAT-3', 5'-GTCT-3', 5'-GTGT-3', 5'-GTTT-3', 5'-TAAT-3', 5'-TACT-3', 5'-TAGT-3', 5'-TATT-3', 5'-TCAT-3', 5'-TCCT-3', 5'-TCGT-3', 5'-TCTT-3', 5'-TGAT-3', 5'-TGCT-3', 5'-TGGT-3', 5'-TGTT- 3', 5'-TTAT-3', 5'-TTCT-3', 5'-TTGT-3', ou 5'-TTTT-3'.

[00158] Outro aspecto da presente divulgação inclui um vetor de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA como divulgado no presente documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, um vírus ou um fragmento polinucleotídico excisado para uso em transformação direta ou direcionamento gênico tal como um DNA doador.

[00159] Vetores recombinantes contendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA podem ser adicionalmente modificados para conter elementos reguladores, tais como promotores, UTRs 5', íntrons, UTRs 3' e terminadores. Em algumas modalidades, as sequências que constituem esses elementos reguladores podem ser operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA é fornecido como um cassete de expressão gênica. Na preparação do cassete de expressão gênica, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, na fase de leitura adequada. Para este fim, podem ser utilizados adaptadores ou ligantes para juntar os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para esse propósito, podem estar envolvidos mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, novas substituições, por exemplo, transições e transversões.

[00160] Em alguns aspectos desta modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA é posicionado sob o controle de um promotor. Em tais modalidades, é contemplado que certas vantagens serão obtidas pelo posicionamento do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo. Conforme usado no presente documento, um promotor recombinante ou heterólogo destina-se a se referir a um promotor que normalmente não está associado a um segmento de DNA que codifica um shRNA em seu ambiente natural. Tais promotores podem incluir promotores normalmente associados a outros genes e/ou promotores isolados de qualquer célula bacteriana, viral, eucariótica ou vegetal. Naturalmente, será importante empregar um promotor que dirija de maneira eficaz a expressão do segmento de DNA no tipo de célula, organismo, ou até mesmo o organismo, selecionado para expressão. O uso de combinações de promotor e tipo de célula para a expressão de shRNA é geralmente conhecido pelos especialistas na técnica de biologia molecular, por exemplo, veja Sambrook et al., 1989. Os promotores empregues podem ser constitutivos, induzíveis ou preferenciais para tecidos, e podem ser usados sob as condições adequadas para dirigir a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido no cassete de expressão gênica, como é vantajoso na produção de moléculas de shRNA recombinantes dentro de plantas transgênicas ou na expressão heteróloga de moléculas de shRNA recombinantes dentro de um microrganismo.

[00161] Vários promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros para expressão no organismo hospedeiro. Os promotores constitutivos adequados para utilização em uma célula hospedeira vegetal incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados em WO 1999/43838 e na Patente dos E.U.A. Nº 6.072.050; o promotor central de 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Gene. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patentee dos E.U.A. Nº 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, os discutidos nas Patentes dos E.U.A. Nos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785;

5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.

[00162] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o polinucleotídeo de shRNA a partir de um promotor induzível. De interesse particular para regulação da expressão das sequências nucleotídicas das modalidades em plantas são promotores induzíveis por ferimento. Tais promotores induzíveis por ferimento podem responder a danos causados pela alimentação de insetos e incluem o gene do inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 e wun2, Patente dos E.U.A. Nº 5.428.148; win1 e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS

Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141- 150) e similares, incorporados no presente documento por referência.

[00163] Adicionalmente, podem ser empregues promotores induzíveis por patógenos nos métodos e construções nucleotídicas das modalidades. Tais promotores induzíveis por patógenos incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidos após infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Veja, por exemplo, Redolfi et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Veja também, WO 1999/43819, incorporado no presente documento por referência.

[00164] De interesse são os promotores que são expressos localmente em ou próximo ao local da infecção pelo patógeno. Veja, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Veja também Chen et al. (1996) Plant J. 10:955- 966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; Patente dos E.U.A. Nº 5.750.386 (induzível por nematódeo); e as referências citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzível para o gene PRms de milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (veja, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

[00165] Promotores regulados quimicamente podem ser usados para modular a expressão de uma molécula de shRNA em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível,

em que a aplicação da substância química induz a expressão gênica ou um promotor quimicamente reprimível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão gênica. Promotores quimicamente induzíveis são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, o promotor ln 2-2 de milho, que é ativado por fitoprotetores de herbicidas benzenossulfonamidas, o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse regulados quimicamente incluem promotores responsivos a esteroides (veja, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 e McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotores induzíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina (veja, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 e Patentes dos E.U.A. Nos 5.814.618 e

5.789.156), incorporados no presente documento por referência.

[00166] Promotores preferenciais para tecidos podem ser usados para direcionar expressão aprimorada de shRNA dentro de um tecido vegetal particular. Promotores preferenciais para tecidos incluem aqueles discutidos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525- 535; Canevascini et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário,

para expressão fraca.

[00167] Promotores preferenciais para folha são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2):255- 265; Kwon et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-367; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-518; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

[00168] Promotores preferenciais para raiz ou específicos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados dentre os vários disponíveis na literatura ou isolados de novo a partir de várias espécies compatíveis. Veja, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene de glutamina sintetase específico de raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de vagem); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone de cDNA de comprimento completo que codifica a glutamina sintetase (GS) citosólica, a qual é expressa em raízes e nódulos radiculares de soja). Veja também Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, em que dois promotores específicos de raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia andersonii e da não leguminosa de não fixação de nitrogênio Trema tomentosa relacionada são descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter de 6- glucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus corniculatus, e em ambos os casos a atividade de promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes roIC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (veja, Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Eles concluíram que o potencializador e os determinantes de DNA preferenciais para tecidos estão dissociados nesses promotores. Teen, et al., (1989) usaram fusão gênica para lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium que codifica a octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é específico de raiz na planta intacta e é estimulado por ferimento em tecido foliar, uma combinação de características particularmente desejável para uso com um gene inseticida ou larvicida (veja, EMBO J. 8(2):343-350). O gene TR1' fundido com nptII (neomicina fosfotransferase II) apresentou características similares. Promotores preferenciais para raiz adicionais incluem o promotor de gene VfENOD- GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) e o promotor de rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Veja também as Patentes dos E.U.A. Nos 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363;

5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179.

[00169] Os promotores "preferenciais para semente" incluem tanto os promotores "específicos de semente" (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento de sementes, tais como promotores de proteínas de armazenamento de sementes), assim como promotores de "germinação de sementes" (aqueles promotores ativos durante a germinação de sementes). Veja Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, incorporado no presente documento por referência. Tais promotores preferenciais para semente incluem, mas sem limitação, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de milho); e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase) (veja a Patente dos E.U.A. Nº 6.225.529, incorporada no presente documento por referência). Gama-zeína e Glb-1 são promotores específicos de endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku, K. D. e Goldberg, R. B. Plant Cell 1:1079-1093, 1989), β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Veja também, WO 2000/12733, em que promotores preferenciais para semente dos genes end1 e end2 são divulgados; incorporados no presente documento por referência. Em dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, o promotor de revestimento de semente de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de sementes precoces de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes dos E.U.A. Nos 7.294.760 e 7.847.153). Um promotor que tem expressão "preferencial" em um tecido específico é expresso nesse tecido até um grau maior do que em pelo menos um outro tecido vegetal. Alguns promotores preferenciais para tecidos mostram expressão quase exclusivamente no tecido específico.

[00170] Quando se deseja expressão em nível baixo, serão usados promotores fracos. Geralmente, o termo "promotor fraco", conforme usado no presente documento, se refere a um promotor que dirige a expressão de uma sequência codificante em um nível baixo. Por expressão em nível baixo, são pretendidos níveis de cerca de 1/1000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de 1/500.000 transcritos. Alternativamente, é reconhecido que o termo "promotores fracos" também abrange promotores que dirigem a expressão em apenas algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor dirige a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.

[00171] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 (WO 1999/43838 e a Patente dos E.U.A. Nº 6.072.050), o promotor central de 35S de CaMV e similares.

Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, os divulgados nas Patentes dos E.U.A. Nos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121;

5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611, incorporadas no presente documento por referência.

[00172] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.

[00173] Em algumas modalidades, a região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com o elemento regulador do promotor, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de interesse, à planta hospedeira ou qualquer combinação dos mesmos). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al., (1990) Plant Cell 2:1261- 1272; Munroe et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[00174] Em outras modalidades, o cassete de expressão gênica recombinante está operacionalmente ligado a uma borda de T-DNA de Agrobacterium. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende ainda uma primeira e uma segunda bordas de T-DNA, em que a primeira borda de T-DNA está operacionalmente ligada a uma extremidade de uma construção gênica, e a segunda borda de T-DNA está operacionalmente ligada à outra extremidade de uma construção gênica. A primeira e a segunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser selecionadas independentemente de sequências de bordas de T-DNA originárias de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza nopalina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza ocotopina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza manopina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza succinamopina ou qualquer combinação das mesmas.

Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada do grupo que consiste em uma cepa que sintetiza nopalina, uma cepa que sintetiza manopina, uma cepa que sintetiza succinamopina ou uma cepa que sintetiza octopina, em que a referida cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene/sequência codificante heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA.

Em outra modalidade, a primeira e a segunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser selecionadas independentemente de sequências de bordas de T-DNA originárias de cepas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza nopalina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza ocotopina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza manopina, uma borda de T-DNA de Agrobacterium que sintetiza succinamopina ou qualquer combinação das mesmas.

Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada do grupo que consiste em uma cepa que sintetiza nopalina, uma cepa que sintetiza manopina, uma cepa que sintetiza succinamopina ou uma cepa que sintetiza octopina, em que a referida cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene/sequência codificante heteróloga operacionalmente ligado a uma sequência do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada do grupo que consiste em uma cepa que sintetiza nopalina, uma cepa que sintetiza manopina, uma cepa que sintetiza succinamopina ou uma cepa que sintetiza octopina, em que a referida cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene/sequência codificante heteróloga operacionalmente ligado a uma sequência do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA.

[00175] Os transgenes de interesse podem ser empilhados com o polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação. Transgenes de interesse exemplificativos que são adequados para uso nas presentes construções divulgadas incluem, mas sem limitação, sequências codificantes que conferem (1) resistência a pragas ou doença, (2) tolerância a herbicidas, (3) características agronômicas de valor adicionado, tais como aprimoramento de rendimento, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso de água e qualidade nutricional, (4) ligação de uma proteína ao DNA de uma maneira sítio-específica, (5) expressão de RNA pequeno e (6) marcadores de seleção. De acordo com uma modalidade, o transgene/sequência codificante heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA é adicionalmente empilhado com pelo menos um outro transgene/sequência codificante heteróloga que codifica um marcador de seleção ou um produto gênico que confere resistência inseticida, tolerância a herbicidas, expressão de RNA pequeno, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso da água ou qualidade nutricional.

1. Resistência a Insetos

[00176] Vários genes de resistência a insetos podem ser adicionalmente empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de resistência a insetos. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor selecionado para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Sequências codificantes de resistência a insetos exemplificativas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências codificantes de resistência a insetos que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente divulgação, são fornecidas as seguintes características. Sequências codificantes que fornecem resistência exemplificativa a insetos Lepidópteros incluem: cry1A; cry1A.105; cry1Ab; cry1Ab (truncada); cry1Ab-Ac (proteína de fusão); cry1Ac (comercializada como Widestrike®); cry1C; cry1F (comercializada como Widestrike®); cry1Fa2; cry2Ab2; cry2Ae; cry9C; mocry1F; pinII (proteína inibidora de protease); vip3A(a) e vip3Aa20. Sequências codificantes que fornecem resistência exemplificativa a insetos Coleópteros incluem: cry34Ab1 (comercializada como Herculex®); cry35Ab1 (comercializada como Herculex®); cry3A; cry3Bb1; dvsnf7 e mcry3A. Sequências codificantes que fornecem resistência exemplificativa a múltiplos insetos incluem ecry31.Ab. A lista acima de genes de resistência a insetos não pretende ser limitante. Quaisquer genes de resistência a insetos são abrangidos pela presente divulgação.

2. Tolerância a Herbicidas

[00177] Vários genes de tolerância a herbicidas podem ser adicionalmente empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de tolerância a herbicidas.

As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor selecionado para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Sequências codificantes de tolerância a herbicidas exemplificativas são conhecidas na técnica.

Como modalidades de sequências codificantes de tolerância a herbicidas que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente divulgação, são fornecidas as seguintes características.

O herbicida glifosato contém um modo de ação que inibe a enzima EPSPS (5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase). Esta enzima está envolvida na biossíntese de aminoácidos aromáticos que são essenciais para o crescimento e desenvolvimento de plantas.

São conhecidos na técnica vários mecanismos enzimáticos que podem ser usados para inibir esta enzima.

Os genes que codificam tais enzimas podem ser operacionalmente ligados aos elementos reguladores de genes da presente divulgação.

Em uma modalidade, genes marcadores de seleção incluem, mas sem limitação, os genes que codificam os genes de resistência ao glifosato, incluindo: genes de EPSPS mutantes, tais como os genes 2mEPSPS, genes cp4 EPSPS, genes mEPSPS, genes dgt-28; genes aroA; e genes de degradação do glifosato, tais como os genes da glifosato acetil transferase (gat) e genes da glifosato oxidase (gox). Essas características são atualmente comercializadas como Gly-TolTM, Optimum® GAT®, Agrisure® GT e Roundup Ready®. Os genes de resistência para compostos de glufosinato e/ou bialafos incluem os genes dsm-2, bar e pat.

As características de bar e pat são atualmente comercializadas como LibertyLink®. Também são incluídos os genes de tolerância que fornecem resistência a 2,4-D, tais como os genes aad-1 (deve ser observado que os genes aad-1 têm atividade adicional em herbicidas ariloxifenoxipropionato) e os genes aad-12

(deve ser observado que os genes aad- 12 têm atividade adicional em auxinas sintéticas de piridiloxiacetato). Essas características são comercializadas como tecnologia de proteção de cultura Enlist®. Genes de resistência a inibidores de ALS (sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidinas, pirimidiniltiobenzoatos e sulfonilamino-carbonil- triazolinonas) são conhecidos na técnica.

Esses genes de resistência mais comumente resultam de mutações pontuais na sequência gênica que codifica ALS.

Outros genes de resistência a inibidores de ALS incluem os genes hra, os genes csr1-2, genes Sr-HrA e genes surB.

Algumas das características são comercializadas sob o nome comercial Clearfield®. Herbicidas que inibem HPPD incluem as pirazolonas tais como pirazoxifen, benzofenap e topramezona; tricetonas, tais como mesotriona, sulcotriona, tembotriona, benzobiciclona; e dicetonitrilas, tais como isoxaflutole.

Estes herbicidas de HPPD exemplificativos podem ser tolerados por características conhecidas.

Exemplos de inibidores de HPPD incluem os genes hppdPF_W336 (para resistência a isoxaflutole) e os genes avhppd-03 (para resistência a meostriona). Um exemplo de características tolerantes ao herbicida oxinil inclui o gene bxn, que demonstrou conferir resistência ao herbicida/antibiótico bromoxinil.

Os genes de resistência a dicamba incluem o gene da dicamba mono-oxigenase (dmo), como divulgado na Publicação Internacional PCT Nº WO 2008/105890. Genes de resistência a herbicidas do tipo inibidor de PPO ou PROTOX (por exemplo, acifluorfen, butafenacil, flupropazil, pentoxazona, carfentrazona, fluazolato, piraflufem, aclonifen, azafenidina, flumioxazina, flumiclorac, bifenox, oxifluorfem, lactofem, fomesafem, fluoroglicofeno e sulfentrazona) são conhecidos na técnica.

Genes exemplificativos que conferem resistência a PPO incluem a superexpressão de uma enzima PPO de Arabidopsis thaliana de tipo selvagem (Lermontova I e Grimm B, (2000) "Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen". Plant Physiol 122:75–83.), o gene PPO de B. subtilis (Li, X. e Nicholl D. 2005. "Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops". Pest Manag. Sci. 61:277-285 e Choi KW, Han O, Lee HJ, Yun YC, Moon YH, Kim MK, Kuk YI, Han SU e Guh JO, (1998) "Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide, oxyfluorfen, via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants". Biosci Biotechnol Biochem 62:558–560). Genes de resistência para ácidos piridinoxi ou fenoxipropriônicos e ciclo-hexonas incluem os genes que codificam o inibidor da ACCase (por exemplo, Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3). Genes exemplificativos que conferem resistência a ciclo-hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico incluem haloxifope, diclofope, fenoxaprope, fluazifope e quizalofope. Por fim, é fornecida tolerância aos herbicidas que podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina ou benzonitrila, pelos genes psbA (tolerância a triazina), genes 1s+ (tolerância a triazina) e genes nitrilase (tolerância a benzonitrila). A lista acima de genes de tolerância a herbicidas não pretende ser limitante. Quaisquer genes de tolerância a herbicidas são abrangidos pela presente divulgação.

3. Características Agronômicas

[00178] Vários genes de características agronômicas podem ser adicionalmente empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de característica agronômica. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor selecionado para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Sequências codificantes de características agronômicas exemplificativas são conhecidas na técnica.

Como modalidades de sequências codificantes de características agronômicas que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente divulgação, são fornecidas as seguintes características.

O amolecimento tardio do fruto, como fornecido pelos genes pg, inibe a produção da enzima poligalacturonase responsável pela quebra das moléculas de pectina na parede celular e, portanto, provoca o amolecimento tardio do fruto.

Além disso, o amadurecimento/senescência tardio do fruto dos genes acc atua para suprimir a expressão normal do gene acc sintase nativo, resultando em produção reduzida de etileno e amadurecimento tardio do fruto.

Por outro lado, os genes accd metabolizam o precursor do hormônio de amadurecimento de fruto etileno, resultando em atraso no amadurecimento do fruto.

Alternativamente, os genes sam-k provocam atraso no amadurecimento por redução da S-adenosilmetionina (SAM), um substrato para a produção de etileno.

Os fenótipos de tolerância a estresse de seca, como fornecidos pelos genes cspB, mantêm funções celulares normais sob condições de estresse hídrico por preservação da estabilidade e transcrição de RNA.

Outro exemplo inclui os genes EcBetA que catalisam a produção do composto osmoprotetor glicina betaína, conferindo tolerância a estresse hídrico.

Além disso, os genes RmBetA catalisam a produção do composto osmoprotetor glicina betaína, conferindo tolerância a estresse hídrico.

A fotossíntese e o aumento de rendimento são fornecidos com o gene bbx32 que expressa uma proteína que interage com um ou mais fatores de transcrição endógenos para regular os processos fisiológicos diurnos/noturnos da planta.

A produção de etanol pode ser aumentada por expressão dos genes amy797E que codificam uma enzima alfa-amilase termoestável que aumenta produção de bioetanol por aumento da termoestabilidade de amilase usada na degradação de amido.

Por fim, composições de aminoácidos modificadas podem resultar da expressão dos genes cordapA que codificam uma enzima di-hidrodipicolinato sintase que aumenta a produção do aminoácido lisina. A lista acima de sequências codificantes de características agronômicas não pretende ser limitante. Qualquer sequência codificante de característica agronômica é abrangida pela presente divulgação.

4. Proteínas de Ligação ao DNA

[00179] Vários transgenes/genes de sequências codificantes heterólogas/sequências codificantes heterólogas de ligação ao DNA podem ser adicionalmente empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de ligação ao DNA. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor selecionado para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Sequências codificantes de proteína de ligação ao DNA exemplificativas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências codificantes de proteína de ligação ao DNA que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente divulgação, os seguintes tipos de proteínas de ligação ao DNA podem incluir: Dedos de Zinco, TALENS, CRISPRS e meganucleases. A lista acima de sequências codificantes de proteína de ligação ao DNA não pretende ser limitante. Qualquer sequência codificante de proteína de ligação ao DNA é abrangida pela presente divulgação.

5. RNA Pequeno

[00180] Várias sequências de RNA pequeno podem ser adicionalmente empilhadas com o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo uma sequência de RNA pequeno.

As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor selecionado para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Características de RNA pequeno exemplificativas são conhecidas na técnica.

Como modalidades de sequências codificantes de RNA pequeno que podem ser operacionalmente ligadas aos elementos reguladores da presente divulgação, são fornecidas as seguintes características.

Por exemplo, o atraso no amadurecimento/senescência do RNA pequeno anti-efe atrasa o amadurecimento por supressão da produção de etileno por meio do silenciamento do gene ACO que codifica uma enzima de formação de etileno.

A produção de lignina alterada do RNA pequeno ccomt reduz o conteúdo de guanacil (G) lignina por inibição da S- adenosil-L-metionina: trans-cafeoil CoA 3-O-metiltransferase endógena (gene CCOMT). Ademais, a tolerância a machucados de mancha preta em Solanum verrucosum pode ser reduzida pelo RNA pequeno Ppo5 que aciona a degradação de transcritos de Ppo5 para bloquear o desenvolvimento de machucados de mancha preta.

Também é incluído o RNA pequeno dvsnf7 que inibe a lagarta da raiz do milho ocidental com dsRNA que contém um fragmento de 240 pb do gene Snf7 da lagarta da raiz do milho ocidental.

Amido/carboidratos modificados podem resultar de RNA pequeno, tal como o RNA pequeno pPhL (degrada transcritos PhL para limitar a formação de açúcares redutores através da degradação do amido) e o RNA pequeno pR1 (degrada transcritos R1 para limitar a formação de açúcares redutores através da degradação do amido). Benefícios adicionais tais como acrilamida reduzida que resultam do RNA pequeno asn1 que desencadeia a degradação de Asn1 para prejudicar a formação de asparagina e reduzir poliacrilamida.

Por fim, o fenótipo de não escurecimento do RNA pequeno de pgas ppo suppression resulta na supressão de PPO para produzir maçãs com um fenótipo de não escurecimento. A lista acima de RNAs pequenos não pretende ser limitante. Quaisquer sequências codificantes de RNA pequeno são abrangidas pela presente divulgação.

6. Marcadores de Seleção

[00181] Vários marcadores de seleção também descritos como genes repórteres podem ser ainda empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser operacionalmente ligado a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene repórter. As sequências operacionalmente ligadas podem, então, ser incorporadas em um vetor selecionado para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Vários métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores de seleção em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e PCR (reação em cadeia da polimerase), Southern blotting, blotting de RNA, métodos imunológicos para a detecção de uma proteína expressa do vetor. Porém, geralmente os genes repórteres são observados através da observação visual de proteínas que, quando expressas, produzem um produto colorido. Genes repórteres exemplificativos são conhecidos na técnica e codificam a β- glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarela fluorescente (YFP, Phi-YFP), proteína vermelha fluorescente (DsRFP, RFP, etc), β- galactosidase e similares (veja Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo conteúdo é incorporado em sua totalidade no presente documento por referência).

[00182] Genes marcadores de seleção são usados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores de seleção incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO), resistência a espectinomicina/estreptinomicina (AAD) e higromicina fosfotransferase (HPT ou HGR), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Os genes de resistência a herbicidas geralmente codificam uma proteína-alvo modificada, insensível ao herbicida ou uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes que possa agir. Por exemplo, resistência ao glifosato foi obtida com o uso de genes que codificam enzimas-alvo mutantes, 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Genes e mutantes de EPSPS são bem conhecidos e descritos adicionalmente abaixo. Resistência ao glufosinato de amônio, bromoxinil e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida com o uso de genes bacterianos que codificam PAT ou DSM-2, uma nitrilase, uma AAD-1 ou AAD-12, cada uma das quais é um exemplo de proteínas que desintoxicam seus respectivos herbicidas.

[00183] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e os genes de resistência/tolerância de aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) para esses herbicidas são bem conhecidos. Genes de resistência ao glifosato incluem os genes mutantes de 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPs) e dgt-28 (por meio da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes de glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Genes de resistência para outros compostos fosfono incluem os genes bar e pat de espécies de Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes, e ácidos piridinoxi ou fenoxipropriônicos e ciclo-hexonas (genes que codificam o inibidor da ACCase). Genes exemplificativos que conferem resistência a ciclo- hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo haloxifope,

diclofope, fenoxiprope, fluazifope, quizalofope) incluem genes de acetil coenzima A carboxilase (ACCase); Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene da nitrilase). Além disso, esses marcadores de seleção podem incluir marcadores de seleção positiva, tais como a enzima fosfomanose isomerase (PMI).

[00184] Em uma modalidade, os genes marcadores de seleção incluem, mas sem limitação, genes que codificam: 2,4-D; neomicina fosfotransferase II; cianamida-hidratase; aspartato quinase; di- hidrodipicolinato sintase; triptofano descarboxilase; di-hidrodipicolinato sintase e aspartato-quinase dessensibilizada; gene bar; triptofano descarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); di-hidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina acetiltransferase; ácido 2,2-dicloropropiônico des- halogenase; aceto-hidroxiácido sintase; 5-enolpiruvil-chiquimato-fosfato sintase (aroA); haloarilnitrilase; acetil-coenzima A carboxilase; di- hidropteroato sintase (sul I) e polipeptídeo do fotossistema II de 32 kD (psbA). Uma modalidade também inclui genes marcadores de seleção que codificam resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinil; glifosato e fosfinotricina. A lista acima de genes marcadores de seleção não pretende ser limitante. Qualquer gene repórter ou marcador de seleção é abrangido pela presente divulgação.

[00185] Em algumas modalidades, as sequências codificantes são sintetizadas para expressão ideal em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência codificante de um gene foi modificada por otimização de códon para intensificar a expressão em plantas. Um transgene de resistência inseticida, um transgene de tolerância a herbicidas, um transgene de eficiência no uso de nitrogênio, um transgene de eficiência no uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA ou um transgene de marcador de seleção/sequência codificante heteróloga pode ser otimizado para expressão em uma espécie de planta específica ou, de modo alternativo, pode ser modificado para expressão ideal em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os códons preferenciais das plantas podem ser determinados a partir dos códons de maior frequência nas proteínas expressas na maior quantidade nas espécies de plantas particulares de interesse. Em uma modalidade, uma sequência codificante, gene, sequência codificante heteróloga ou transgene/sequência codificante heteróloga é projetado para ser expresso em plantas em um nível mais alto, resultando em maior eficiência de transformação. Métodos para otimização de genes de plantas são bem conhecidos. As orientações relativas à otimização e produção de sequências de DNA sintéticas podem ser encontradas, por exemplo, em WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, na Patente dos E.U.A. Nº 6166302 e na Patente dos E.U.A. Nº 5380831, incorporados no presente documento por referência. Transformação

[00186] Métodos adequados para a transformação de plantas incluem qualquer método pelo qual DNA possa ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: eletroporação (veja, por exemplo, a Patente dos E.U.A. 5.384.253); bombardeamento de microprojéteis (veja, por exemplo, as Patentes dos E.U.A. 5.015.580, 5.550.318,

5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (veja, por exemplo, as Patentes dos E.U.A.

5.635.055, 5.824.877, 5.591.616; 5.981.840 e 6.384.301); e transformação de protoplastos (veja, por exemplo, a Patente dos E.U.A.

5.508.184).

[00187] Uma construção de DNA pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula vegetal com o uso de técnicas como agitação com fibras de carboneto de silício (veja, por exemplo, as Patentes dos E.U.A. 5.302.523 e 5.464.765), ou as construções de DNA podem ser introduzidas diretamente no tecido vegetal com o uso de métodos biolísticos, tais como bombardeamento de partículas de DNA (veja, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, a construção de DNA pode ser introduzida na célula vegetal por meio de transformação com nanopartículas (veja, por exemplo, a Publicação de Patente dos E.U.A. Nº 20090104700, que é incorporada na sua totalidade no presente documento por referência).

[00188] Além disso, a transferência de genes pode ser realizada com o uso de bactérias não-Agrobacterium ou vírus tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X da batata, vírus do mosaico da couve-flor e vírus do mosaico da veia da mandioca e/ou vírus do mosaico do tabaco, veja, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11 (1):1-4.

[00189] Através da aplicação de técnicas de transformação, células de praticamente qualquer espécie de planta podem ser transformadas de forma estável, e essas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto da transformação do algodão são descritas nas Patentes dos E.U.A. Nos 5.846.797,

5.159.135, 5.004.863 e 6.624.344; técnicas para a transformação de plantas de Brassica em particular são descritas, por exemplo, na Patente dos E.U.A. Nº 5.750.871; técnicas para a transformação de soja são descritas, por exemplo, na Patente dos E.U.A. Nº 6.384.301; e técnicas para a transformação de Zea mays são descritas, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. Nos 7.060.876 e 5.591.616 e na Publicação Internacional PCT WO 95/06722.

[00190] Após efetuar a entrega de um ácido nucleico exógeno a uma célula receptora, uma célula transformada é geralmente identificada para cultura adicional e regeneração de plantas. A fim de melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se desejar empregar um gene marcador de seleção com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de células transformadas pode ser analisada expondo-se as células a um ou mais agentes seletivos, ou as células podem ser triadas quanto à característica do gene marcador desejado.

[00191] As células que sobrevivem à exposição a um agente de seleção, ou células que foram classificadas como positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. Em uma modalidade, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado pode ser modificado incluindo substâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que haja tecido suficiente disponível para iniciar os esforços de regeneração das plantas ou após repetidas rodadas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos duas semanas), e então transferido para meios propícios à formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que tenha ocorrido formação de brotos suficiente. Uma vez que que os brotos são formados, os mesmos são transferidos para meios propícios à formação de raízes. Uma vez que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento adicional e maturidade. Confirmação Molecular

[00192] Uma célula vegetal, calo, tecido ou planta transformados podem ser identificados e isolados por seleção ou triagem do material vegetal manipulado quanto a características codificadas pelos genes marcadores presentes no DNA transformante. Por exemplo, a seleção pode ser realizada cultivando-se o material vegetal manipulado em meios contendo uma quantidade inibitória do antibiótico ou herbicida ao qual a construção gênica transformante confere resistência. Além disso, plantas e células vegetais transformadas também podem ser identificadas por triagem das atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes de β-glucuronidase, luciferase ou proteína verde fluorescente) que podem estar presentes nas construções de ácido nucleico recombinante. Tais metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Os métodos de confirmação molecular que podem ser usados para identificar plantas transgênicas são conhecidos pelos especialistas na técnica. Vários métodos exemplificativos são descritos abaixo.

[00193] Os sinalizadores moleculares foram descritos para uso na detecção de sequência. Em resumo, é projetada uma sonda oligonucleotídica FRET que se sobrepõe à junção genômica flanqueadora e DNA de inserto. A estrutura exclusiva da sonda FRET resulta na mesma conter uma estrutura secundária que mantém as porções químicas fluorescentes e de supressão em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após amplificação por PCR bem sucedida, a hibridização da(s) sonda(s) FRET com a sequência-alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das porções químicas fluorescente e de supressão. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica flanqueadora/inserto de transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas. Tal ensaio de sinalizador molecular para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente divulgação.

[00194] O ensaio de sonda de hidrólise, ou então conhecido como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Em resumo, uma sonda oligonucleotídica FRET é projetada com um oligo dentro do transgene/sequência codificante heteróloga e um na sequência genômica flanqueadora para detecção específica de evento. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da porção química fluorescente para longe da porção química de supressão na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência flanqueadora/inserto de transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas. Tal ensaio de sonda de hidrólise para detecção como uma reação de amplificação é uma modalidade da presente divulgação.

[00195] Os ensaios KASPar® são um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Em resumo, a amostra de DNA genômico compreendendo o polinucleotídeo de cassete de expressão gênica integrado é submetida a triagem usando um ensaio com base em reação em cadeia da polimerase (PCR) conhecido como sistema de ensaio KASPar®. O ensaio KASPar® usado na prática da presente divulgação pode utilizar uma mistura de ensaio de PCR KASPar® que contém múltiplos iniciadores. Os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciador direto e pelo menos um iniciador reverso. O iniciador direto contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinucleotídeo de DNA e o iniciador reverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Além disso, os iniciadores usados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos um iniciador direto e pelo menos um iniciador reverso. Por exemplo, a mistura de ensaio de PCR KASPar® pode usar dois iniciadores diretos que correspondem a dois alelos diferentes e um iniciador reverso. Um dos iniciadores diretos contém uma sequência que corresponde à região específica da sequência genômica endógena. O segundo iniciador direto contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinucleotídeo de DNA. O iniciador reverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Tal ensaio KASPar® para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da presente divulgação.

[00196] Em algumas modalidades, o sinal fluorescente ou corante fluorescente é selecionado do grupo que consiste em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante fluorescente Cy 3, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX.

[00197] Em outras modalidades, a reação de amplificação é executada com o uso de segundos corantes de DNA fluorescentes adequados que são capazes de marcar o DNA celular em uma faixa de concentração detectável por citometria de fluxo e possuem um espectro de emissão fluorescente que é detectável por um termociclador em tempo real. Deve ser reconhecido pelas pessoas de habilidade comum na técnica que outros corantes de ácido nucleico são conhecidos e estão sendo identificados continuamente. Qualquer corante de ácido nucleico adequado com espectros de excitação e emissão apropriados pode ser empregue, tal como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® e TOTO®. Em uma modalidade, um segundo corante de DNA fluorescente é SYTO13® usado a menos de 10 µM, menos de 4 µM ou menos de 2,7 µM.

[00198] Em modalidades adicionais, o sequenciamento de próxima geração (NGS, do inglês "Next Generation Sequencing") pode ser usado para detecção. Conforme descrito por Brautigma et al., 2010, a análise da sequência de DNA pode ser usada para determinar a sequência nucleotídica do fragmento isolado e amplificado. Os fragmentos amplificados podem ser isolados e subclonados em um vetor e sequenciados com o uso do método do terminador de cadeia (também denominado como sequenciamento de Sanger) ou sequenciamento do terminador com corante. Além disso, o amplicon pode ser sequenciado com o sequenciamento de próxima geração. As tecnologias NGS não exigem a etapa de subclonagem e múltiplas leituras de sequenciamento podem ser concluídas em uma única reação. Três plataformas de NGS estão comercialmente disponíveis, o Genome Sequencer FLX™ disponível junto à 454 Life Sciences ⁄ Roche, o Illumina Genome Analyser™ disponível junto à Solexa e SOLiD™ da Applied Biosystems (acrônimo para: "Sequencing by Oligo Ligation and Detection"). Além disso, há dois métodos de sequenciamento de molécula única que estão sendo atualmente desenvolvidos. Esses incluem o verdadeiro sequenciamento de molécula única (tSMS, do inglês "true Single Molecule Sequencing") da Helicos Bioscience™ e o Single Molecule Real Time™ (SMRT) da Pacific Biosciences.

[00199] O Genome Sequencher FLX™, comercializado pela 454 Life Sciences/Roche, é um NGS de leitura longa, que usa PCR de emulsão e pirosequenciamento para gerar leituras de sequenciamento. Podem ser usados fragmentos de DNA de 300 a 800 pb ou bibliotecas contendo fragmentos de 3 a 20 kb. As reações podem produzir mais de um milhão de leituras de cerca de 250 a 400 bases por corrida, para um rendimento total de 250 a 400 megabases. Essa tecnologia produz as leituras mais longas, mas a saída total de sequência por corrida é baixa em comparação com outras tecnologias de NGS.

[00200] O Illumina Genome Analyzer™, comercializado pela Solexa™, é um NGS de leitura curta que utiliza a abordagem de sequenciamento por síntese com nucleotídeos terminadores reversíveis marcados com corante fluorescente e tem como base PCR de ponte de fase sólida. Pode ser usada a construção de bibliotecas de sequenciamento de extremidade pareada contendo fragmentos de DNA de até 10 kb. As reações produzem mais de 100 milhões de leituras curtas, com 35 a 76 bases de comprimento. Esses dados podem produzir de 3 a 6 gigabases por corrida.

[00201] O sistema de sequenciamento por ligação de detecção de oligo (SOLiD, do inglês "Sequencing by Oligo Ligation and Detection") comercializado pela Applied Biosystems™ é uma tecnologia de leitura curta. Essa tecnologia NGS usa DNA de fita dupla fragmentada com até 10 kb de comprimento. O sistema utiliza o sequenciamento por ligação de iniciadores oligonucleotídicos marcados com corante e PCR de emulsão para gerar um bilhão de leituras curtas que resultam em uma saída total de sequência de até 30 gigabases por corrida.

[00202] O tSMS da Helicos Bioscience™ e o SMRT da Pacific Biosciences™ aplicam uma abordagem diferente que utiliza moléculas de DNA únicas para as reações de sequência. O sistema tSMS Helicos™ produz até 800 milhões de leituras curtas que resultam em 21 gigabases por corrida. Essas reações são completadas com o uso de nucleotídeos de terminador virtual marcados com corante fluorescente que é descrito como uma abordagem de "sequenciamento por síntese".

[00203] O sistema de sequenciamento de próxima geração SMRT comercializado pela Pacific Biosciences™ usa um sequenciamento por síntese em tempo real. Essa tecnologia pode produzir leituras de até

1.000 pb de comprimento como resultado de não ser limitada por terminadores reversíveis. Um rendimento de leitura bruta que é equivalente à cobertura de uma vez de um genoma humano diploide pode ser produzido por dia com o uso dessa tecnologia.

[00204] Em outra modalidade, a detecção pode ser concluída com o uso de ensaios de blotting, incluindo Western blot, Northern blot e Southern blot. Tais ensaios de blotting são técnicas comumente usadas em pesquisa biológica para a identificação e quantificação de amostras biológicas. Esses ensaios incluem primeiro a separação dos componentes da amostra em géis por eletroforese, seguida pela transferência dos componentes eletroforeticamente separados dos géis para membranas de transferência produzidas de materiais tais como nitrocelulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou náilon. Os analitos também podem ser aplicados diretamente como pontos nesses suportes ou direcionados para regiões específicas nos suportes aplicando-se vácuo, ação capilar ou pressão, sem separação prévia. As membranas de transferência são então comumente submetidas a um tratamento pós-transferência para aumentar a capacidade dos analitos serem distinguidos entre si e detectados, visualmente ou por leitores automatizados.

[00205] Em uma modalidade adicional, a detecção pode ser concluída com o uso de um ensaio ELISA, que utiliza um imunoensaio enzimático em fase sólida para detectar a presença de uma substância, usualmente um antígeno, em uma amostra líquida ou em uma amostra úmida. Os antígenos da amostra são fixados a uma superfície de uma placa. Em seguida, um anticorpo específico adicional é aplicado sobre a superfície para que o mesmo possa se ligar ao antígeno. Esse anticorpo é ligado a uma enzima e, na etapa final, é adicionada uma substância que contém o substrato da enzima. A reação subsequente produz um sinal detectável, geralmente uma mudança de cor no substrato. Plantas Transgênicas

[00206] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, semente vegetal ou célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA de uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, semente vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA de uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende o polinucleotídeo de shRNA.

Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal consiste no polinucleotídeo de shRNA.

Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal, semente vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA compreendendo adicionalmente pelo menos um outro transgene ou sequência codificante heteróloga.

Tais exemplos do transgene ou sequência codificante heteróloga podem incluir um transgene de resistência inseticida, um transgene de tolerância a herbicidas, um transgene de eficiência no uso de nitrogênio, um transgene de eficiência no uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador de seleção ou combinações dos mesmos.

Em alguns casos, mais de um transgene/sequência codificante heteróloga pode ser incorporado no genoma da célula vegetal hospedeira transformada. Tal é o caso quando mais de um segmento de DNA que codifica shRNA ou proteína é incorporado no genoma de tal planta. Em determinadas situações, pode ser desejável ter uma, duas, três, quatro ou até mais proteínas inseticidas ou outras proteínas ou ácidos nucleicos inseticidas (por exemplo, shRNA ou miRNA ou dsRNA) incorporados e expressos de forma estável na planta transgênica transformada.

[00207] Em outra modalidade, a planta, tecido vegetal, semente vegetal ou célula vegetal compreendendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea, semente, célula ou tecido derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade a planta é selecionada do grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade a planta é Zea mays. Em outra modalidade a planta é soja (por exemplo, Glycine max).

[00208] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal de acordo com os métodos divulgados no presente documento pode ser uma planta dicotiledônea. A planta dicotiledônea, tecido vegetal ou célula vegetal pode ser, mas sem limitação, alfafa, colza, canola, mostarda indiana, mostarda da Etiópia, soja, girassol, algodão, feijões, brócolis, repolho, couve-flor, aipo, pepino, berinjela, alface; melão, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, espinafre, beterraba, girassol, tabaco, tomate e melancia.

[00209] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal de acordo com os métodos divulgados no presente documento pode ser uma planta monocotiledônea. A planta, tecido vegetal ou célula vegetal monocotiledônea pode ser, mas sem limitação, várias gramíneas, trigo, milho, arroz, cevada, aveia e espécies do gênero brachypodium.

[00210] De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA é incorporado no genoma da planta, tecido vegetal, semente vegetal ou célula vegetal. Um especialista na técnica reconhecerá que, após a sequência exógena ser incorporada de forma estável em plantas transgênicas e confirmada como operável, a mesma pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma das diversas técnicas de melhoramento padrão pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas. Por exemplo, duas plantas transgênicas diferentes podem ser cruzadas para produzir descendentes que contêm dois transgene/sequências codificantes de shRNA heterólogas de segregação independente. A autopolinização de progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os transgenes/sequências codificantes heterólogas que codificam um shRNA de interesse. O retrocruzamento com uma planta progenitora e o cruzamento exogâmico com uma planta não transgênica são também contemplados. O resultado do retrocruzamento produz uma planta de progênie transgênica que é homozigota para transgenes/sequências codificantes heterólogas. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida por cruzamento sexual (autopolinização) de uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene adicionado, germinação de algumas das sementes produzidas e análise das plantas resultantes produzidas quanto a atividade inseticida aumentada resultando em inibição do crescimento e mortalidade de insetos em relação a uma planta de controle (nativa, não transgênica) ou transgênica de segregação independente.

[00211] A presente divulgação também abrange sementes das plantas transgênicas descritas acima, em que a semente tem o transgene/sequência codificante heteróloga do polinucleotídeo de shRNA, conforme fornecido na presente divulgação. A presente divulgação abrange ainda a progênie, clones, culturas de calos, linhagens celulares ou células das plantas transgênicas descritas acima, em que a referida progênie, clone, culturas de calos, linhagem celular ou célula tem o transgene/sequência codificante heteróloga ou construção gênica contendo o polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação.

[00212] A presente divulgação também abrange a regeneração, desenvolvimento e produção de plantas a partir de transformantes ou de vários explantes transformados. Tal metodologia é bem conhecida na técnica. Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas, cultivo dessas células individualizadas através dos estágios normais de desenvolvimento embrionário através do estágio de plântula enraizada. Embriões e sementes transgênicos também podem ser regenerados de forma similar. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são subsequentemente plantados em um meio de crescimento vegetal apropriado, tal como solo.

[00213] O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o transgene/sequência codificante heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA pode ser alcançado por métodos bem conhecidos na técnica. Nesse procedimento, os transformantes são cultivados na presença de um agente de seleção e em um meio que induz a regeneração de brotos na planta sendo transformada conforme descrito. Esse procedimento tipicamente produz brotos dentro de dois a quatro meses e esses brotos são então transferidos para um meio indutor de raiz apropriado contendo o agente de seleção e um antibiótico para prevenir o crescimento bacteriano. Os brotos enraizados na presença do agente de seleção para formar plântulas são, então, transplantados no solo ou outros meios para permitir a produção de raízes. Esses procedimentos variam dependendo da planta específica empregue, sendo tais variações bem conhecidas na técnica.

[00214] Em alguns casos, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas, conforme discutido anteriormente. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas a partir de sementes de linhagens agronomicamente importantes, tais como linhagens endogâmicas de elite. Por outro lado, pólen a partir de plantas dessas linhagens agronomicamente importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente divulgação contendo o transgene/sequência codificante heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA é produzida usando métodos bem conhecidos por um especialista na técnica.

[00215] Uma planta transgênica da presente divulgação contém um transgene/sequência codificante heteróloga integrada de forma estável que codifica o polinucleotídeo que codifica a molécula de shRNA. Em uma modalidade, a planta transgênica é um segregante independente e pode transmitir esse gene e sua atividade à sua progênie. Em modalidades adicionais, a planta transgênica é homozigota para esse gene, e transmite esse gene a todos os seus descendentes através de cruzamento sexual. As sementes de uma planta transgênica podem ser cultivadas no campo de cultura ou em estufa, e as plantas transgênicas sexualmente maduras resultantes são autopolinizadas para gerar plantas de linhagem pura. A progênie dessas plantas se torna linhagens puras que são avaliadas quanto a, a título de exemplo, atividade inseticida aumentada contra pragas de insetos resultando em inibição do crescimento e mortalidade de insetos, por exemplo, no campo de cultura, sob uma gama de condições ambientais. Tal metodologia encontrará utilidade específica na criação de plantas transgênicas de interesse comercial.

[00216] A presente divulgação também abrange o cultivo de plantas transgênicas descritas acima, em que a planta transgênica tem o transgene/sequência codificante heteróloga do polinucleotídeo que codifica a molécula de shRNA, conforme fornecido na presente divulgação. Consequentemente, tais plantas transgênicas podem ser manipuladas para, inter alia, ter uma ou mais características ou eventos transgênicos desejados contendo os elementos reguladores de genes da presente divulgação, ao serem transformadas com moléculas de ácido nucleico de acordo com a divulgação, e podem ser colhidas ou cultivadas por qualquer método conhecido pelos especialistas na técnica. Método de Expressão de um Transgene

[00217] Em uma modalidade, um método de expressão da sequência polinucleotídica de interesse dentro de uma planta compreende o cultivo de uma planta contendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA operacionalmente ligado a pelo menos um elemento regulador ou uma sequência poliligante. Em uma modalidade, o gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA consiste em uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos uma sequência polinucleotídica de interesse em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal contendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade adicional, um método de expressão de um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA contido dentro de uma planta resulta na proteção da planta contra uma praga de inseto.

[00218] Em uma modalidade, um método de expressão da sequência polinucleotídica de interesse dentro de uma planta compreende o cultivo de uma planta contendo um cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA operacionalmente ligado a pelo menos um elemento regulador ou uma sequência poliligante. Em uma modalidade, o cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA compreende uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, o cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA consiste em uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos uma sequência polinucleotídica de interesse em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal contendo um cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade adicional, o método de expressão de um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA a partir de um cassete de expressão gênica contido em uma planta resulta na proteção da planta contra uma praga de inseto, inibindo o crescimento ou matando a praga de inseto.

[00219] Em uma modalidade, um método de expressão da sequência polinucleotídica de interesse dentro de um microrganismo compreende o crescimento de um microrganismo contendo um cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA operacionalmente ligado a pelo menos um elemento regulador ou uma sequência poliligante. Em uma modalidade, o cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA compreende uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, o cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA consiste em uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou

421. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos uma sequência polinucleotídica de interesse em uma planta compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal contendo um cassete de expressão gênica compreendendo um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade adicional, o método de expressão de um gene que codifica o polinucleotídeo shRNA a partir de um cassete de expressão gênica contido dentro de um microrganismo resulta na produção de um shRNA com atividade inseticida.

[00220] Em algumas modalidades, o gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA é expresso na planta, célula vegetal, parte da planta ou semente vegetal de uma forma constitutiva. Em um aspecto de uma tal modalidade, a expressão constitutiva dirige a transcrição em todos ou quase todos os tecidos o tempo todo. Assim, a expressão constitutiva está mais ou menos em um nível de estado estacionário ao longo do desenvolvimento. Em outras modalidades, o gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA é expresso na planta, célula vegetal, parte da planta ou semente vegetal de um modo preferencial para tecidos. Em um aspecto de uma tal modalidade, a expressão preferencial para tecidos é expressa apenas em determinados tipos de tecidos ou em determinados momentos durante o desenvolvimento. Em uma Célula Microbiana

[00221] Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA. Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA de uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende um cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA de uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404,

405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende o polinucleotídeo de shRNA. Em modalidades adicionais, a célula microbiana pode ser uma célula de bactérias, baculovírus, algas, levedura ou fungos. Exemplos não limitantes de células bacterianas incluem Pseudomonas, Bacillus (incluindo B. megaterium, B. subtilis e B. thuringiensis), Agrobacterium, Escherichia, ou outras espécies de Enterobacteraceae.

[00222] A presente divulgação também abrange células hospedeiras microbianas que expressam um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA, na fração solúvel, corpos ou cristais de inclusão, sobrenadante da cultura, células rompidas, extratos celulares, lisados, homogenatos e similares. As células hospedeiras bacterianas podem estar sob a forma aquosa, ou alternativamente, sob as formas seca, semi-úmida ou similares, tais como pasta de células, péletes de células ou, alternativamente, secas a frio, em pó, liofilizadas, evaporadas ou, de outro modo, preparadas de modo similar sob a forma seca. Tais meios para a preparação do polinucleotídeo de shRNA são bem conhecidos pelos especialistas na técnica de isolamento e purificação de shRNA microbiano. Em determinadas modalidades, as moléculas de shRNA podem ser purificadas, concentradas, misturadas com outros reagentes ou processadas em uma forma final desejada. Em algumas modalidades, a composição compreenderá de cerca de 1% a cerca de 90% em peso do lisado celular, e em outras modalidades de cerca de 5% a cerca de 50% em peso.

[00223] A presente divulgação também abrange composições de shRNA que são preparadas por um processo que compreende as etapas de cultivo de uma célula microbiana. As células microbianas são manipuladas para expressar um polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA sob condições eficazes para produzir tal shRNA e, em seguida, obter o shRNA da célula. A obtenção de tal shRNA pode incluir adicionalmente purificação, concentração, processamento ou mistura do shRNA com um ou mais reagentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de shRNA é obtido em uma quantidade de entre cerca de 1% a cerca de 90% em peso e, em outras modalidades, de cerca de 5% a cerca de 50% em peso. Composição

[00224] Em uma modalidade, a presente divulgação inclui uma composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA. Em uma modalidade, uma composição compreende o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA de uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, uma composição compreende um cassete de expressão gênica compreendendo o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de shRNA de uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma sequência que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421. Em uma modalidade, uma composição compreende o polinucleotídeo de shRNA.

[00225] Em determinadas modalidades, a presente divulgação se refere a um método de preparação de uma composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA. Tal método geralmente envolve as etapas de cultivo de uma célula microbiana que expressa o polinucleotídeo de shRNA sob condições eficazes para produzir o shRNA e, em seguida, a obtenção o shRNA assim produzido. Células hospedeiras procarióticas incluindo células Gram-negativas, tais como E. coli, Pseudomonas fluorescens e Enterobacteraceae relacionadas, ou células Gram- positivas, tais como Bacillus spp. (incluindo B. megaterium, B. subtilis e B. thuringiensis) e similares são todas contempladas como úteis na preparação do polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação.

[00226] Alternativamente, as composições podem ser preparadas por sistemas de expressão bacteriana nativa ou recombinante in vitro e isoladas para aplicação subsequente em campo de cultura. Tal shRNA pode estar em lisados celulares brutos, suspensões, coloides, etc., ou alternativamente pode ser purificado, refinado, tamponado e/ou adicionalmente processado, antes da formulação em uma formulação biocida ativa. De modo similar, em determinadas circunstâncias, pode ser desejável isolar cristais e/ou esporos de culturas bacterianas que expressam o polinucleotídeo de shRNA e aplicar soluções, suspensões ou preparações coloidais de tais cristais e/ou esporos como a composição bioinseticida ativa.

[00227] A composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA descrito no presente documento pode ser preparada por formulação da célula bacteriana, suspensão de cristais e/ou esporos ou componente de shRNA isolado com o veículo agricolamente aceitável desejado. A composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA pode ser formulada antes da administração em meios apropriados, tais como liofilizada, seca a frio, dessecada ou em um veículo, meio ou diluente aquoso adequado, tal como salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó molhável ou em combinação com qualquer outro material de veículo adequado para aplicação agrícola. Veículos agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo "veículo agricolamente aceitável"

abrange todos os adjuvantes, por exemplo, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, promotores de pegajosidade, aglutinantes, etc. que são normalmente usados na tecnologia da formulação de inseticidas; esses são bem conhecidos pelos especialistas na técnica da formulação de inseticidas. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou trituração da composição inseticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencionais. De modo similar, a formulação pode ser misturada com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e similares) ou materiais botânicos (sabugos de milho em pó, cascas de arroz, cascas de nozes e similares). As formulações podem incluir adjuvantes de espalhamento-adesividade, agentes estabilizantes, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. As formulações líquidas podem ser de base aquosa ou não aquosa e empregues como espumas, suspensões, concentrados emulsionáveis, ou similares. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificantes, dispersantes ou polímeros.

[00228] Em algumas modalidades, a composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA pode ser aplicada na forma de composições e pode ser aplicada ao campo de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de gramíneas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de veículos de liberação prolongada ou biodegradáveis que permitem a dosagem a longo prazo de uma área visada após uma única aplicação da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas,

nematocidas, moluscicidas ou misturas de várias dessas preparações, se desejado, junto com veículos agricolamente aceitáveis adicionais, tensoativos ou adjuvantes promotores de aplicação normalmente empregues na técnica de formulação. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalmente empregues na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, promotores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em "iscas" comestíveis ou fabricadas em "armadilhas" para pragas para permitir alimentação ou ingestão da formulação pesticida por uma praga-alvo.

[00229] Métodos de aplicação da composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA incluem aplicação em folhas, revestimento da sementes e aplicação no solo. Outras técnicas de aplicação, por exemplo, empoeiramento, aspersão, imersão, injeção no solo, revestimento de sementes, revestimento de mudas, pulverização, aeração, nebulização, atomização e similares, também são viáveis e podem ser necessárias em determinadas circunstâncias, tais como, por exemplo, insetos que causam infestação de raízes ou caules, ou para aplicação em vegetação delicada ou plantas ornamentais. Esses procedimentos de aplicação também são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. As composições da presente divulgação são aplicadas ao ambiente do inseto-alvo, tipicamente à folhagem e à rizosfera (o solo que circunda as raízes das plantas) da planta ou cultura a ser protegida, por métodos convencionais, por exemplo, por aspersão.

[00230] Em modalidades adicionais da presente divulgação, as composições compreendendo o polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação encontrarão utilidade particular como inseticidas para aplicação tópica ou sistêmica a culturas, gramíneas, frutas e vegetais e plantas ornamentais. Em uma modalidade, a composição compreende uma suspensão fluida em óleo de células bacterianas que expressa um novo polinucleotídeo de shRNA como divulgado no presente documento. Por exemplo, a célula hospedeira bacteriana expressa os novos segmentos de ácidos nucleicos divulgados no presente documento e produz um polinucleotídeo de shRNA.

[00231] Em outra modalidade, a composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA é fornecida como um grânulo dispersível em água. Este grânulo compreende células bacterianas que expressam um novo polinucleotídeo de shRNA como divulgado no presente documento. Células bacterianas exemplificativas incluem células de B. thurigiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli ou Pseudomonas spp. que foram transformadas com um segmento de DNA divulgado no presente documento e expressando o shRNA também são contempladas como úteis.

[00232] Em uma modalidade adicional, a composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA é fornecida como um pó, poeira, pélete ou concentrado coloidal. Esta forma de composição compreende células bacterianas que expressam um novo polinucleotídeo de shRNA como divulgado no presente documento. Tais formas secas das composições inseticidas podem ser formuladas para se dissolver imediatamente após umedecimento ou, alternativamente, se dissolver com liberação controlada, liberação prolongada ou de outra maneira dependente do tempo. Células bacterianas exemplificativas incluem células de B. thurigiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli ou Pseudomonas spp. que foram transformadas com um segmento de DNA divulgado no presente documento e expressando o polinucleotídeo de shRNA também são contempladas como úteis.

[00233] Em ainda outra modalidade, a composição compreendendo o polinucleotídeo de shRNA é fornecida como uma suspensão aquosa de células bacterianas, tais como aquelas descritas acima, que expressam o polinucleotídeo de shRNA. Tais suspensões aquosas podem ser fornecidas como uma solução de estoque concentrada que é diluída antes da aplicação, ou alternativamente, como uma solução diluída pronta a ser aplicada.

[00234] A composição da presente divulgação pode ser empregue no método da divulgação individualmente ou em combinação com outros compostos, incluindo e sem limitação, outros pesticidas. Esses métodos também podem ser usados em conjunto com outros tratamentos, tais como tensoativos, detergentes, polímeros ou formulações de liberação prolongada. As composições inseticidas da presente divulgação podem ser formuladas para uso sistêmico ou tópico.

[00235] Em outras modalidades da presente divulgação, as plantas também podem ser tratadas com o polinucleotídeo de shRNA com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. Composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas de frutas/vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halossulfurom Gowan, Paraquate, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halossulfurom, Indaziflam; Inseticidas de frutas/vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, FluaCripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Espinoteram, Triflumuron, Espirotetramate, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Espinotoram,

Tiodicarb, Flonicamida, Metiocarb, Emamectina-benzoato, Indoxacarb, Fostiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Fenbutatina-óxido, Hexitiazox, Metomil, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; Fungicidas de frutas/vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim metílico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobina, Fenexamida, Fumarato de oxpoconazol, Ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas de cereais: Isoproturon, Bromoxinil, Ioxinil, Fenóxidos, Clorossulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfuron, Triassulfuron, Flucarbazona, Iodossulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafeno, Mesossulfuron, Beflubutamida, Pinoxadeno, Amidossulfuron, Tifensulfuron-metil, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfossulfuron, Pirassulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxassulfona; Fungicidas de cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Cresoxim metílico, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas de cereais: Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifos, Metamidofos, Oxidemeton metílico, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas de milho: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S- )Metolaclor, Mesotriona, Nicossulfuron, Primissulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxassulfona; Inseticidas de milho: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-

Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirimifos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarb, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de milho: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazossulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofano, Flufenacet, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissulfano; Inseticidas de arroz: Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarb, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Cloropiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de arroz: Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobaque sódico, Trifloxissulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de algodão: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation,

Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida, Indoxacarb, Lambda-Cialotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gama-Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endossulfano; Fungicidas de algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etílico, Cloransulam Metílico, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas de soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflussulfuron, Tepraloxidim, Quizalofope; Inseticidas de beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, β- Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop,

Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de canola: Organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

[00236] Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, 2,4-D, Tifensulfuron-metil, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutole, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Piritiobaque sódico, Flumioxazin, Clorimuron-etil, Metribuzin, Quizalofop, S-metolaclor, Hexazinona ou combinações dos mesmos.

[00237] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarbe, Espinosad, Sulfoxaflor, Oxamil ou combinações dos mesmos.

[00238] Independentemente do método de aplicação ou do teor da composição, a quantidade do(s) componente(s) ativo(s) é aplicada em uma quantidade eficaz como inseticida, que irá variar dependendo de fatores tais como, por exemplo, os insetos específicos a serem controlados, a planta ou cultura específica a ser tratada, as condições ambientais, e o método, taxa e quantidade de aplicação da composição ativa como inseticida. De modo que o polinucleotídeo de shRNA iniba um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente. De modo similar, a intensidade e a duração da aplicação inseticida serão definidas considerando condições específicas da(s) praga(s), cultura(s) específica(s) a serem tratadas e condições ambientais específicas. A razão proporcional de ingrediente ativo para veículo naturalmente dependerá da natureza química, solubilidade e estabilidade da composição, bem como a formulação específica contemplada.

[00239] A concentração de composição que é usada para aplicação ambiental, sistêmica ou no solo variará amplamente, dependendo da natureza da formulação específica, meios de aplicação, condições ambientais e grau de atividade biocida. Tipicamente, a composição estará presente na formulação aplicada a uma concentração de pelo menos cerca de 1% em peso e pode ser até e incluindo cerca de 99% em peso. As formulações secas das composições podem ser de cerca de 1% a cerca de 99% ou mais em peso da composição, enquanto as formulações líquidas geralmente podem compreender de cerca de 1% a cerca de 99% ou mais do ingrediente ativo em peso. Em outros casos, a composição pode ser administrada a uma planta específica ou área- alvo em uma ou mais aplicações, conforme necessário, com uma taxa de aplicação de campo de cultura típica por hectare na faixa da ordem de cerca de 50 g a cerca de 500 g de ingrediente ativo, ou de cerca de 500 g a cerca de 1000 g, ou de cerca de 1000 g a cerca de 5000 g ou mais de ingrediente ativo. Produto de Consumo

[00240] Em uma modalidade, a presente divulgação inclui um produto de consumo. Em determinados aspectos, o produto de consumo é produzido dentro da planta transgênica da presente divulgação. Produtos de consumo exemplificativos incluem concentrado de proteína, isolado de proteína, grãos, sêmola, farinha, óleo ou fibra. Em outros exemplos, tais produtos de consumo podem incluir sementes inteiras ou processadas, ração animal contendo plantas transgênicas da presente divulgação ou subprodutos de planta transgênica, óleo, sêmola, farinha, amido, flocos, farelo, biomassa e restolho, e produtos combustíveis e subprodutos combustíveis, quando fabricados a partir de plantas ou partes de plantas transgênicas.

[00241] Além disso, os produtos de consumo podem ser vendidos a consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis. Produtos de consumo não viáveis incluem, mas sem limitação, sementes não viáveis; sementes processadas, partes de sementes e partes de plantas; sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimento, óleo, sêmola, farinha, flocos, farelo, biomassas e produtos combustíveis. Produtos de consumo viáveis incluem, mas sem limitação, sementes, plantas e células vegetais. As plantas compreendendo os polinucleotídeos e moléculas de shRNA da presente divulgação podem ser, portanto, usadas para fabricar qualquer produto de consumo tipicamente adquirido a partir de tal planta de cultura transgênica. Atividade Inseticida

[00242] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o polinucleotídeo de shRNA que confere atividade inseticida. Também são fornecidas as sequências polinucleotídicas que codificam o polinucleotídeo de shRNA. O polinucleotídeo de shRNA resultante da transcrição dessas sequências polinucleotídicas permite o controle ou morte de pragas de insetos que ingerem o polinucleotídeo de shRNA. Em um aspecto desta modalidade, o polinucleotídeo de shRNA é oralmente ativo no fornecimento de atividade inseticida. Em aspectos adicionais, o polinucleotídeo de shRNA pode ser usado para fornecer atividade inseticida contra pragas de insetos, em pragas agronômicas, de florestas, estufas, plantas ornamentais para viveiros, alimentos e fibras, saúde pública e animal, estrutura doméstica e comercial, domésticas e de produtos armazenados economicamente importantes. Em outros aspectos, o polinucleotídeo de shRNA fornece atividade inseticida tóxica contra uma ou mais pragas de insetos. Exemplos de tais pragas de insetos incluem, mas sem limitação, membros das ordens Lepidoptera, Diptera, Hemiptera e Coleoptera ou do filo Nematoda. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é fornecida contra pragas de Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros ou Coleópteros. Em aspectos adicionais desta modalidade, as pragas de Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em número pelos métodos da divulgação.

[00243] Em outras modalidades da presente divulgação, são fornecidos métodos para a produção do polinucleotídeo de shRNA e para uso do polinucleotídeo de shRNA para controlar, inibir o crescimento ou matar uma praga de Lepidópteros, Coleópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Dípteros. Em algumas modalidades, as plantas transgênicas da presente divulgação são manipuladas para expressar um ou mais polinucleotídeos que codificam o polinucleotídeo de shRNA como divulgado no presente documento. Em várias modalidades, as plantas transgênicas compreendem adicionalmente um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de Coleópteros, Lepidópteros, Hemípteros, Dípteros e/ou Nematódeos.

[00244] Polinucleotídeos de shRNA exemplificativos encontram uso no controle, inibição do crescimento ou morte de populações de pragas de Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros ou Coleópteros e para a produção de composições com atividade inseticida contra tais insetos. Incluídos como pragas de insetos de interesse estão adultos e ninfas.

[00245] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Lepidoptera incluem, mas sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagartas da maçã-do- algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith

(lagarta-do-cartucho do milho); S. exigua Hübner (lagarta-militar da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, lagarta-rosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta- rosca preta); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterranea Fabricius (lagarta-rosca); Alabama argillacea Hübner (Curuquerê-do-algodoeiro); Trichoplusia ni Hübner (falsa-medideira da couve); Pseudoplusia includens Walker (falsa-medideira da soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta da maçã); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta capulho pontilhada); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algodão); Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca de citrinos); brocas, traça-das- paredes, lagartas de teia, lagartas cone e esqueletizadores da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (broca de milho europeia); Amyelois transitella Walker (lagarta de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de teia de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta de teia de gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Hübner (dobrador de folha de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (lagarta de melão); D. nitidalis Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca de cana-de-açúcar);

Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutella Hübner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de teia de grama); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo); Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de teia de beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa de teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctella Hübner (traça indiana da farinha); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubigalis Guenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rösslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham (mariposa bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomonella Linnaeus (traça da maçã); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegada); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de onívoro); Lobesia botrana Denis e Schiffermüller (traça europeia dos cachos da videira); Spilonota ocellana Denis e Schiffermüller (traça vermelha dos gomos); Endopiza viteana Clemens (mariposa de bagas de uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (cochilis); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta enroladeira da maçã); Grapholita molesta Busck (traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp..

[00246] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidoptera incluem, mas sem limitação, Alsophila pometaria Harris

(locusta do outono); Anarsia lineatella Zeller (broca do ponteiro do pessegueiro); Anisota senatoria J.

E.

Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (traça de tussar de carvalho chinesa); Bombyx mori Linnaeus (mariposa-de-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (lagarta mineradora das folhas); Collas eurytheme Boisduval (lagarta de alfafa); Datana integerrima Grote e Robinson (lagarta de nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (Mariposa-de-seda siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta de olmo); Erannis tiliaria Harris (mede-palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa de cauda marrom); Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletizador de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta); Hyphantria cunea Drury (larva de teia de outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (traça do tomateiro); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do leste); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa-cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão de cinco manchas, mandarová de tomate); M. sexta Haworth (mandarová de tomate, mandarová de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (locusta de primavera); Papilio cresphontes Cramer (larva de borboleta rabo de andorinha gigante); Phryganidia californica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (lagarta mineira das folhas de citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (lagarta mineira das folhas manchada); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta rosada); Pontia protodice Boisduval e Leconte (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta enroladora de omnívoros); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta de corcova vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa de grão de Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processadora de pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (mariposa desfiadora de roupa); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira das folhas do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa de arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.

[00247] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, mas sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (gorgulho do algodão); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho aquático americano); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho dos cereais); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sphenophorus maidis Chittenden (gorgulho do milho)); besouros-pulga, besouros do pepino, larvas da raiz, besouros da folha, besouros da batata e moscas minadoras na família Chrysomelidae (incluindo, mas sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (escaravelho da batateira); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (verme da raiz do milho do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (verme da raiz do milho do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga crucífero); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo,

mas sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); escaravelhos e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas sem limitação: Popillia japonica Newman (escaravelho japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte, escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, larva branca); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.

[00248] Espécies agronomicamente importantes da ordem Diptera são de interesse, incluindo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira das folhas do milho); moscas (incluindo, mas sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); vermes (incluindo, mas sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outras Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas dos estábulos)); moscas da face, moscas de corno, moscas predadoras, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de moscas, moscas dos cavalos Tabanus spp.; moscas-varejeiras Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; larvas do gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outras Brachycera, mosquitos

Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarídeos e outras Nematocera.

[00249] Espécies agronomicamente importantes de interesse das ordens Hemiptera e Homoptera, tais como, mas sem limitação, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da família Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, pfiloxera da família Phylloxeridae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, cochonilhas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos das gramíneas, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Coreidae e percevejos vermelhos e manchadores de algodão da família Pyrrhocoridae.

[00250] Outros membros agronomicamente importantes da ordem Homoptera incluem adicionalmente, mas sem limitação: Acyrthisiphon pisum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão- frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho); A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo de Spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo do pessegueiro, afídeo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo da alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afídeo-da-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afídeo amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afídeo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afídeo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos citrinos); Adelges spp. (adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argentifolii Bellows e Perring (mosca-branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca-branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropictus Stål (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stål (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Planococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilídeos da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilídeos do caqui).

[00251] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemiptera incluem, mas sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (percevejo da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (percevejo das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (percevejo rendado de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (percevejo do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de percevejos de semente); Leptoglossus corculus Say (percevejo-pés-de-folha de semente de pinheiro); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (percevejo manchado); L. Hesperus Knight (percevejo ocidental); L. pratensis Linnaeus (percevejo comum de prado); L. rugulipennis Poppius (percevejo manchado europeu); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (percevejo grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[00252] Além disso, modalidades podem ser eficazes contra Hemiptera, como Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (percevejo do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca sugadora); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga com marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (percevejo de espinheiro-da-virgínia); Labopidicola allii Knight (percevejo da cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (percevejo rápido); Poecilocapsus lineatus Fabricius (percevejo de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (percevejo das gramíneas falso); Nysius raphanus Howard (percevejo das gramíneas falso); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[00253] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Acari (ácaros), tais como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrom do trigo); ácaros-aranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-aranha de duas manchas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov e Nikolski (ácaro-aranha do morango); ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferrugem e do broto da família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira da família Epidermoptidae, ácaros do folículo da família Demodicidae, ácaros dos grãos da família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do veado); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano de paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cachorro americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela) e ácaros da sarna e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[00254] Pragas de insetos da ordem Thysanura são de interesse, tais como Lepisma saccharina Linnaeus (traça-dos-livros); Thermobia domestica Packard (tesourinha).

[00255] Outras pragas de artrópodes abrangidas incluem: aranhas na ordem Araneae, tais como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom); e a Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra); e centopeias na ordem Scutigeromorpha tais como

Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).

[00256] Nematódeos incluem nematódeos parasitários, tais como nematódeos das galhas radiculares, formadores de cistos, e formadores de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos formadores de cistos, incluindo, mas sem limitação, Heterodera glycines (nematódeo formador de cistos da soja); Heterodera schachtii (nematódeo formador de cistos da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo formador de cistos de cereais) e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeos formadores de cistos da batata). Os nematódeos formadores de lesões incluem Pratylenchus spp.

[00257] Métodos para medir a atividade inseticida são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2.480-2.485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290- 293 e a Patente dos E.U.A. Nº 5.743.477, todos os quais estão incorporados no presente documento por referência em sua totalidade. Geralmente, o shRNA é misturado e usado em ensaios de alimentação. Veja, por exemplo, Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a capacidade da planta para sobreviver e/ou causar a morte das pragas. Para cada substância ou organismo, a quantidade eficaz como inseticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico.

[00258] Métodos para inibição do crescimento ou morte de uma praga de inseto e controle de uma população de inseto. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para inibição do crescimento ou morte de uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polinucleotídeo de shRNA recombinante. Em algumas modalidades,

são fornecidos métodos para inibição do crescimento ou morte de uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma molécula de shRNA pesticida recombinante das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma variante da mesma.

[00259] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para o controle de uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polinucleotídeo de shRNA recombinante. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para o controle de uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma molécula de shRNA pesticida recombinante das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma variante da mesma.

[00260] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para o controle de uma população de praga de inseto resistente a um shRNA pesticida, compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polinucleotídeo de shRNA recombinante. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para o controle de uma população de praga de inseto resistente a um shRNA pesticida, compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polinucleotídeo de shRNA pesticida recombinante das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma variante da mesma.

[00261] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para a proteção de uma planta contra uma praga de inseto compreendendo expressar na planta ou célula da mesma o polinucleotídeo de shRNA recombinante. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para a proteção de uma planta contra uma praga de inseto compreendendo expressar na planta ou célula da mesma uma molécula de shRNA pesticida recombinante das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou variantes da mesma.

[00262] Estratégias de manejo de resistência de insetos (MRI)

[00263] Uma maneira para aumentar a eficácia de características transgênicas de resistência a insetos contra pragas de insetos-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é o uso ou fornecimento de refúgios (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, proteínas ou shRNA não inseticidas). A United States Environmental Protection Agency (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge—

2006.htm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma única proteína Bt ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu site da web: (ncga.com/insect-resistance- management-fact-sheet-bt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Devido a perdas devido a pragas de insetos dentro da área de refúgio, refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.

[00264] Outra maneira para aumentar a eficácia das características transgênicas de resistência a insetos contra pragas de insetos-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas consiste em ter um repositório de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de insetos e que manifestam seus efeitos através de diferentes modos de ação.

[00265] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inseticida é expresso em níveis eficazes, poderia ser outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência de insetos a plantas transgênicas. Isso baseia-se no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos de ação separados é muito mais improvável do que contra apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de "piramidação" ou "empilhamento" para o manejo de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:777-1786). O empilhamento ou piramidação de duas moléculas inseticidas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir o uso de um refúgio menor. A U.S. Environmental Protection Agency exige significativamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em comparação aos produtos de característica única (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de manejo de resistência de insetos de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos de cultura e misturas de sementes em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.

[00266] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de shRNA da presente divulgação é útil como uma estratégia de manejo de resistência de insetos em combinação (isto é, piramidado) com outras moléculas inseticidas que incluem, mas sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., moléculas de RNA pequeno e similares. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00267] São fornecidos métodos para o controle de infestação (ou infestações) de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros ou Coleópteros em uma planta transgênica que promovem manejo de resistência de insetos, compreendendo expressar na planta pelo menos duas moléculas inseticidas diferentes com diferentes modos de ação. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00268] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promoção de manejo de resistência de insetos, em que pelo menos uma das moléculas inseticidas compreende um polinucleotídeo de shRNA com atividade inseticida contra insetos das ordens Lepidoptera, Diptera, Heteroptera, Nematoda, Hemiptera e/ou Coleoptera. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00269] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promoção de manejo de resistência de insetos pelo menos uma das moléculas inseticidas compreende uma molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou variantes da mesma, com atividade inseticida contra insetos das ordens Lepidoptera, Diptera, Heteroptera, Nematoda, Hemiptera e/ou Coleoptera. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00270] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e de promoção de manejo de resistência de insetos compreendem a expressão na planta transgênica de um polinucleotídeo de shRNA e uma proteína Cry com atividade inseticida contra insetos das ordens Lepidoptera, Diptera, Heteroptera, Nematoda, Hemiptera e/ou Coleoptera com diferentes modos de ação. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00271] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros,

Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promoção de manejo de resistência de insetos compreendem, na planta transgênica, uma molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou variantes da mesma e uma proteína Cry com atividade inseticida contra insetos das ordens Lepidoptera, Diptera, Heteroptera, Nematoda, Hemiptera e/ou Coleoptera com diferentes modos de ação. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00272] Também são fornecidos métodos de redução da probabilidade de emergência de resistência de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros a plantas transgênicas que expressam, nas plantas, moléculas inseticidas para o controle das espécies de insetos compreendendo a expressão de um polinucleotídeo de shRNA com atividade inseticida contra as espécies de insetos em combinação com uma segunda molécula inseticida contra as espécies de insetos com diferentes modos de ação. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00273] Também são fornecidos métodos de redução da probabilidade de emergência de resistência de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros a plantas transgênicas que expressam, nas plantas, moléculas inseticidas para o controle das espécies de insetos compreendendo a expressão de uma molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou variantes da mesma com atividade inseticida contra as espécies de insetos em combinação com uma segunda molécula inseticida contra as espécies de insetos com diferentes modos de ação. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00274] Também são fornecidos no presente documento meios para o manejo eficaz de resistência de insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros de plantas transgênicas compreendendo a coexpressão nas plantas de duas ou mais moléculas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Hemípteros, sendo que cada uma exibe um diferente modo de efetuar sua atividade de inibição do crescimento ou morte, em que as duas ou mais moléculas inseticidas compreendem um polinucleotídeo de shRNA e uma proteína Cry. Também são fornecidos meios para o manejo de resistência de insetos de plantas transgênicas compreendendo a coexpressão nas plantas de duas ou mais moléculas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nematódeos, Hemípteros e/ou Coleópteros, sendo que cada uma exibe um diferente modo de efetuar sua inibição do crescimento ou atividade, em que as duas ou mais moléculas inseticidas compreendem uma molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou variantes da mesma e uma proteína Cry. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00275] Além disso, são fornecidos métodos para a obtenção de aprovação regulatória para o plantio ou comercialização de plantas que expressam moléculas inseticidas contra insetos das ordens Lepidoptera, Diptera, Heteroptera, Nematoda, Hemiptera e/ou Coleoptera, compreendendo a etapa de referência a, envio de ou dependência de dados de ligação de ensaios de insetos que mostram que o polinucleotídeo de shRNA não compete com os sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, são fornecidos métodos para a obtenção de aprovação regulatória para o plantio ou comercialização de plantas que expressam moléculas inseticidas contra insetos nas ordens Lepidoptera, Diptera, Heteroptera, Nematoda, Hemiptera e/ou Coleoptera, compreendendo a etapa de referência a,

envio de ou dependência de dados de ligação de ensaios de insetos que mostram que a molécula de shRNA das SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421 ou uma variante da mesma não compete com sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00276] O uso de proteínas Cry como características de plantas transgênicas é bem conhecido por um especialista na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (veja Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 e o banco de dados de culturas GM de CERA (2010) Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma molécula inseticida bem conhecida por um especialista na técnica também pode ser expressa em plantas, tais como Vip3Ab e Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F e CryCa (US2012/0317681), Cry1DA e Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA e Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB e Cry1BE (US2012/0324606) e Cry1Fa e Cry2Aa, Cry1I ou Cry1E (US2012/0324605). As moléculas inseticidas também incluem lipases inseticidas, incluindo as lipídeo acil hidrolases da Patente dos E.U.A. Nº

7.491.869, e colesterol oxidases, tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As moléculas inseticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes dos E.U.A. Nos 5.877.012, 6.107.279,

6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020, e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por um especialista na técnica (veja lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). As moléculas inseticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC, do inglês "toxin complex"), obteníveis a partir de organismos, tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (veja as Patentes dos E.U.A. Nos 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida "independente" e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas independentes produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC "independente" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser aumentada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas independentes. As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxicidade das proteínas de Classe A. Exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As moléculas inseticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente dos E.U.A. Nº

8.334.366). Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00277] Em uma modalidade adicional, um método de expressão de um gene que codifica o polinucleotídeo de shRNA contido dentro de uma planta resulta na proteção da planta contra uma praga de inseto por meio da supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto. Em tal modalidade, o rendimento da planta é significativamente aumentado.

[00278] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar determinadas características e/ou modalidades particulares. Os exemplos não devem ser interpretados como limitando a divulgação às características ou modalidades particulares exemplificadas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: As moléculas de shRNA contêm novas características estruturais

[00279] Uma nova molécula curta/pequena em forma de grampo (shRNA) foi projetada e desenvolvida para inibir o RNA transcrito a partir de um gene expresso dentro de uma célula viva de um organismo. Em algumas modalidades, a molécula de shRNA é uma molécula polinucleotídica de fita simples com menos de 70 nucleotídeos (isto é, < 70 nt) de comprimento. Em outras modalidades, a molécula de shRNA é uma molécula polinucleotídica de fita simples com menos de 80 nucleotídeos (isto é, < 80 nt) de comprimento. Em modalidades adicionais, a molécula de shRNA é uma molécula polinucleotídica de fita simples com menos de 90 nucleotídeos (isto é, < 90 nt) de comprimento. A molécula de shRNA de fita simples forma uma estrutura secundária conhecida como uma estrutura de haste-alça (por exemplo, estrutura de grampo-alça). A estrutura de haste-alça do shRNA resulta do pareamento de bases nucleotídicas intramoleculares de modo que a molécula de shRNA de fita simples se dobra e forma pares de bases com outra seção da mesma fita de polinucleotídeo de shRNA.

[00280] A molécula de shRNA contém uma combinação de características estruturais que estão sendo descritas pela primeira vez na presente divulgação. A combinação das características estruturais que compõem a molécula de shRNA resulta na inibição do RNA dentro de uma célula viva. As características estruturais do shRNA são representadas graficamente na Figura 1. A primeira característica estrutural da molécula de shRNA é uma estrutura de grampo. A segunda característica estrutural da molécula de shRNA é uma sequência polinucleotídica que pode ser reconhecida, ligada e clivada pela enzima DICER. Embora a molécula de shRNA contenha pelo menos um sítio de reconhecimento de DICER, deve-se observar que a molécula de shRNA pode não conter um sítio de reconhecimento de DROSHA. Assim, a molécula de shRNA pode não conter uma sequência polinucleotídica que seja reconhecida, ligada e clivada pela enzima DROSHA. A terceira característica estrutural da molécula de shRNA é uma estrutura de haste de fita dupla. A estrutura da molécula de shRNA haste-alça resultante compreende duas voltas de alfa-hélice completas. Cada uma dessas características estruturais é descrita em mais detalhes abaixo. EXEMPLO 2: As moléculas de shRNA contêm uma estrutura de grampo

[00281] A estrutura de grampo do shRNA é um trecho de nucleotídeos predominantemente não pareados ou de fita simples do polinucleotídeo de shRNA que foi criado quando o polinucleotídeo de shRNA se dobra e forma pares de bases com outra seção da mesma fita do polinucleotídeo de shRNA. Embora a estrutura de grampo permaneça predominantemente não pareada ou de fita simples, pode haver alguma formação de ligação de fita dupla entre os nucleotídeos do shRNA dentro da estrutura de grampo. Não é improvável que fragmentos de fita dupla com um comprimento de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos sejam observados dentro da estrutura de grampo da molécula de shRNA. Além disso, pode haver vários fragmentos de fita dupla observados dentro da estrutura de grampo da molécula de shRNA. Em alguns aspectos, a estrutura de grampo da molécula de shRNA continha sequências polinucleotídicas não estruturadas. Estas sequências polinucleotídicas não estruturadas dentro da estrutura de alça eram saliências/mal pareamentos de fita simples de um único ou múltiplos nucleotídeo(s) que não se ligaram aos polinucleotídeos da fita oposta da sequência de alça. As saliências/mal pareamentos de fita simples se apresentaram como nucleotídeos de fita simples e não ligados que resultaram da formação de sequências de fita dupla diretamente a montante e a jusante da sequência polinucleotídica não estruturada. Em outros aspectos, a estrutura de grampo da molécula de shRNA era uma estrutura de fita simples não pareada. A estrutura de grampo do shRNA foi projetada para ter menos de ou igual a 25 nucleotídeos de comprimento (isto é, ≤ 25 pb). Em outras palavras, a estrutura de grampo do shRNA foi projetada para ter um comprimento de até ou igual a 25 nucleotídeos de comprimento (isto é, ≤ 25 pb).

[00282] Em alguns aspectos, a sequência polinucleotídica que constitui uma porção da alça do shRNA é um arcabouço de shRNA. Em um aspecto, o arcabouço de shRNA é identificado e obtido a partir de uma sequência polinucleotídica de inseto. Em modalidades deste aspecto, o arcabouço de shRNA é identificado e obtido a partir de uma sequência polinucleotídica de miRNA de inseto. Por exemplo, os arcabouços de shRNA de Diabrotica virgifera virgifera LeConte (isto é, WCR) foram identificados e isolados pela triagem dos transcritos primários de WCR com sequências de genes ortólogos de miRNAs de insetos conservados. Os transcritos primários desses miRNAs foram identificados usando uma combinação de sequenciamento de RNA pequeno, sequências do transcriptoma e genoma de WCR e homologia de sequência com outras espécies de insetos no mesmo subfilo (por exemplo, SEQ ID Nos:7 a 12). Os dados de sequenciamento de RNA pequeno obtidos de WCR foram mapeados com o transcriptoma e contigs do genoma de WCR para extrair transcritos primários. Um sistema interno personalizado foi usado para identificar estruturas de haste-alça que eram sequências de pré-miRNA prováveis. Os miRNAs conservados em WCR foram identificados por alinhamentos de sequência com miRNAs de outras espécies de insetos. As sequências das outras espécies de insetos foram obtidas da miRBase (Kozomara A, Griffiths-Jones S. "miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data." NAR 2014 42:D68-D73; disponível em mirbase.org/, que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Os precursores de miRNA de Drosophila melanogaster, Tribolium castaneum e outros artrópodes foram obtidos de mirbase.org/ (que pode ser acessado na rede mundial de computadores usando o prefixo "www"). A Figura 3 fornece uma representação gráfica das sequências de miRNA para os miRNAs miR- 1 e bantam que foram obtidos usando este método divulgado (SEQ ID Nos:7 a 12). Os arcabouços de shRNA foram identificados a partir das sequências dobradas. As porções de alça de arcabouços obtidos a partir de WCR (SEQ ID Nos:13 a 401), Drosophila e Tribolium foram então incorporadas na estrutura de grampo dos polinucleotídeos de shRNA. EXEMPLO 3: As moléculas de shRNA contêm uma estrutura de haste

[00283] A estrutura de haste do shRNA é uma sequência polinucleotídica de fita dupla do polinucleotídeo de shRNA de fita simples que é criada quando o polinucleotídeo de shRNA se dobra e forma pares de bases de fita dupla com outra seção da mesma fita do polinucleotídeo de shRNA. A estrutura de haste permanece principalmente pareada ou de fita dupla, sem formação de sequência polinucleotídica de fita simples entre os nucleotídeos do shRNA dentro da estrutura da haste devido à não ligação dos nucleotídeos. Em alguns aspectos, a estrutura de haste da molécula de shRNA pode conter sequências polinucleotídicas não estruturadas. Em outros aspectos, a estrutura de haste da molécula de shRNA pode se apresentar inteiramente como uma estrutura pareada de fita dupla. Em aspectos adicionais, a estrutura da haste do shRNA foi projetada para ter mais de 16 nucleotídeos de comprimento (isto é, > 16 pb). Em outros aspectos, a estrutura de haste do shRNA foi projetada para ter menos de ou igual a 25 nucleotídeos de comprimento (isto é, ≤ 25 pb). Em outras palavras, a estrutura de haste do shRNA foi projetada para ter um comprimento de até ou igual a 25 nucleotídeos de comprimento (isto é, ≤ 25 pb). A estrutura da haste do shRNA contém sequências polinucleotídicas-alvo que inibem especificamente o RNA transcrito a partir de um gene expresso em um organismo vivo. EXEMPLO 4: Identificação de genes-alvo candidatos

[00284] As sequências polinucleotídicas-alvo que foram incorporadas na estrutura de haste dos polinucleotídeos de shRNA foram selecionadas a partir de regiões transcritas de dsRNA que foram previamente exemplificadas em formas alternativas de moléculas de RNAi (por exemplo, dsRNA). Estas sequências-alvo foram testadas para determinar se a nova estrutura de shRNA poderia funcionar para inibir o RNA transcrito a partir de um gene expresso dentro da célula de um organismo vivo. Por exemplo, uma lista não limitativa de sequências polinucleotídicas-alvo inclui: Caf1-180 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20120174258); RPA70 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20130091601); V-ATPase H (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20120198586); Rho1 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº US20120174260); V-ATPase C (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20120174259); Reptina (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20140298536); PPI-87B (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20130091600); RPS6 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20130097730); COPI gama (Pedido de Patente N.º WO2016060911); COPI alfa (Pedido de Patente N.º WO2016060912); COPI beta (Pedido de Patente N.º

WO2016060913); COPI delta (Pedido de Patente N.º WO2016060914); Brahma (Pedidos de Patente dos E.U.A. Nos 20160208251 e 20160222408); ROP (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150176025); Hunchback (Pedidos de Patente dos E.U.A. Nos 20160222407 e 20160208252); RNA polimerase II 140 ( Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150176009); Sec23 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150322455); Dre4 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150322456); Gho (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160186203); thread (Pedido de Patente N.º WO2016191357); ncm (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160194658); RNA polimerase II-215 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160264992); RNA polimerase I 1 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160264991); RNA polimerase II 33 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160355841); Kruppel (Pedidos de Patente dos E.U.A. Nos 20160208253 e 20160369296); Spt5 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160348130); Spt6 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 2016196241); Snap25 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 2017011764) e Prp8 (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 2017011771).

[00285] As sequências-alvo exemplificativas foram usadas para identificar sequências-alvo para os polinucleotídeos de shRNA por análise da sequência-alvo expressa presente em diferentes estágios de desenvolvimento do inseto. Por exemplo, uma sequência-alvo específica seria obtida de insetos WCR em diferentes estágios de desenvolvimento por combinação da análise do transcriptoma para identificar as sequências gênicas-alvo candidatas. Os genes candidatos para o direcionamento de shRNA foram aqueles considerados essenciais para a sobrevivência e o crescimento de WCR. Homólogos de genes-alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequência do transcriptoma, conforme descrito nos seguintes pedidos de patente (Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20120174258; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20130091601; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº

20120198586; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº US20120174260; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20120174259; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20140298536; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20130091600; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20130097730; Pedido de Patente Nº WO2016060911; Pedido de Patente N.º WO2016060912; Pedido de Patente Nº WO2016060913; Pedido de Patente N.º WO2016060914; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160208251; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160222408; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150176025; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160222407; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160208252; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150176009; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150322455; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20150322456; Pedido de patente dos E.U.A. Nº 20160186203; Pedido de patente N.º WO2016191357; Pedido de patente dos E.U.A. Nº 20160194658; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160264992; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160264991; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160355841; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160208253; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160369296; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 20160348130; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 2016196241; Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 2017011764 e, Pedido de Patente dos E.U.A. Nº 2017011771), cujas divulgações são incorporadas no presente documento por referência na sua totalidade.

[00286] Em um exemplo, RNA total foi isolado de cerca de 0,9 gm de larvas WCR inteiras de primeiro ínstar; (4 a 5 dias pós-eclosão; mantidas a 16 °C) e purificado usando o seguinte método baseado em fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH). As larvas foram homogeneizadas à temperatura ambiente em homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT ® até a obtenção de uma suspensão homogênea. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, o homogenato foi processado de acordo com o protocolo do fabricante. O pélete de RNA lavado com etanol foi deixado secar ao ar por 3 a 5 minutos e, em seguida, foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 gm de larvas rendeu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260/A280 de 1,9. O RNA extraído foi armazenado a -80 °C até processamento posterior. A qualidade do RNA foi determinada por corrida de uma alíquota em um gel de agarose a 1% com TAE 1X.

[00287] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA larval total por um provedor de serviços comercial (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), usando priming aleatório. A biblioteca de cDNA larval normalizada foi sequenciada em escala de 1/2 placa pela química da série GS FLX 454 Titanium™ na EUROFINS MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento médio de leitura de 348 pb. Cerca de 350.000 leituras foram montadas em mais de 50.000 contigs. Ambos, as leituras não montadas e os contigs, foram convertidos em bancos de dados BLASTable usando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível no NCBI).

[00288] RNA total e bibliotecas de cDNA normalizadas foram preparados de forma similar a partir de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupada para o rastreio do gene-alvo foi construída combinando membros da biblioteca de cDNA que representam as várias fases de desenvolvimento.

[00289] Os genes candidatos para o direcionamento de shRNA foram aqueles considerados essenciais para a sobrevivência e o crescimento de WCR. Homólogos de genes-alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequência do transcriptoma conforme descrito abaixo. As pesquisas de TBLASTN usando sequências codificantes de proteínas candidatas foram executadas contra bancos de dados BLASTable contendo as leituras de sequência de WCR não montadas ou os contigs montados. Acertos significativos com uma sequência de WCR (definidos como melhor que e-20 para homologias de contig e melhor que e-10 para homologias de leituras de sequências não montadas) foram confirmados usando BLASTX contra o banco de dados não redundante do NCBI. Os resultados desta pesquisa de BLASTX confirmaram que as sequências de genes candidatos homólogos de WCR identificadas na pesquisa de TBLASTN compreendiam de fato genes de WCR, ou eram os melhores acertos para as sequências de genes candidatos não WCR presentes nas sequências de WCR. Em alguns casos, ficou claro que alguns dos contigs de WCR ou leituras de sequência não montadas selecionadas por homologia com um gene candidato não WCR se sobrepuseram, e que a montagem dos contigs falhou em unir essas sobreposições. Nesses casos, Sequencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION , Ann Arbor, MI) foi usado para montar as sequências em contigs mais longos. EXEMPLO 5: Síntese in vitro de shRNAs

[00290] A síntese de RNA para aplicações como bioensaios de dieta de insetos e aplicação tópica em plantas pode ser alcançada por transcrição in vitro de RNA a partir de sequências promotoras curtas específicas usando RNA polimerases dependentes de DNA de bacteriófago, tais como T7, T3 ou Sp6. O método convencional para geração in vitro de RNA de fita simples e de fita dupla envolve a transcrição a partir de moldes de DNA de fita dupla ou parcialmente de fita dupla (Stump e Hall (1993) Nucleic Acids Research 21 (23):5480- 5484). Anteriormente, acreditava-se que pelo menos 18 pb de sequência de DNA de fita dupla dentro de um promotor de bacteriófago eram necessários para a síntese eficiente de RNA (Stump e Hall (1993) Nucleic Acids Research 21 (23):5480-5484). A geração desses moldes de DNA de fita dupla requer uma reação de PCR ou, pelo menos, o anelamento de oligonucleotídeos.

[00291] A abordagem a seguir usa moldes de DNA de fita simples para a transcrição eficiente de produtos de RNA de fita simples de até 180 pb de comprimento. As vantagens desta abordagem incluem a eliminação de PCR ou uma etapa de hibridização, o que economiza tempo com rendimento comparativo similar ou melhor. Além disso, o uso de moldes de DNA de oligonucleotídeos sintetizados comercialmente (até 200 pb) permite a produção de grampos que são proibitivos para a síntese de genes e podem ser problemáticos durante a amplificação por PCR (isto é, priming incorreto das sequências que se dobram).

[00292] Um DNA de fita simples de 200 pb exemplificativo inclui um promotor mínimo de T7 de 21 nucleotídeos: (SEQ ID Nº:402 TTAATACGACTCACTATAGGG), o molde de oligonucleotídeo de DNA de fita simples é um reverso e complemento da sequência de produto desejada. O promotor T7 inicia a transcrição a partir do último C do promotor/sítio de ligação da RNA polimerase do molde, incorporando um único G no transcrito e produzindo o produto de RNA de 180 pb. Em algumas aplicações, os oligonucleotídeos direto (F) e reverso (R) foram usados como iniciadores para amplificar um molde de DNA de fita dupla por PCR.

[00293] O primer T7 (SEQ ID Nº:402) foi incorporado nos moldes de shRNA para permitir a síntese in vitro do shRNA. Os shRNAs foram sintetizados usando o kit MEGAscript RNAi® com a RNA polimerase T7 (Life Technologies, AM1626) usando sequências de oligonucleotídeos de DNA para os genes-alvo COPIα em WCR. As concentrações de moléculas de shRNA foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) usando configurações de RNA. As moléculas de shRNA sintetizadas foram então diluídas em tampão TE 0,1X para aplicações de bioensaio.

[00294] Um dsRNA de controle negativo, do gene yfp, foi sintetizado com MEGAscript RNAi T7 kit™ usando o produto amplificado por PCR como molde. O molde de YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA compreendendo a região codificante para a proteína amarela fluorescente (YFPv2; SEQ ID Nº:403) (Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-850). Os iniciadores projetados para amplificar o dsRNA continham o iniciador de T7 (SEQ ID Nº:402) nas suas extremidades 5'. EXEMPLO 6: Bioensaio de larvas de insetos baseado em dieta

[00295] As amostras foram testadas quanto à atividade de insetos em bioensaios conduzidos com larvas de insetos neonatos em dieta de inseto artificial. Os bioensaios de WCR foram conduzidos em placas de cultura de células de 48 poços Costar 3548 (Cole-Parmer|, Vernon Hills, IL). Cada poço continha aproximadamente 750 μl de uma dieta artificial projetada para o crescimento de insetos coleópteros. As amostras de shRNA foram aplicadas a 500 ng/cm2 na área de superfície de 0,95 cm2 em cada poço (uma alíquota de 40 µl de amostra de shRNA a 11,88 ng/μl foi distribuída por pipeta na superfície da dieta de cada poço). As bandejas foram lacradas com filme adesivo de selagem de microplacas Breathe-Easy® (Diversified Biotech). Alternativamente, os bioensaios de WCR foram conduzidos em bandejas de bioensaio de plástico de 128 poços (C-D International, Pitman, NJ). Cada poço continha aproximadamente 1,5 ml de uma dieta artificial projetada para o crescimento de insetos coleópteros. As amostras de dsRNA foram aplicadas a 500 ng/cm2 na área de superfície de 1,5 cm2 em cada poço (uma alíquota de 60 µl de amostra de dsRNA a 12,5 ng/μl foi distribuída por folhas (C-D International, Pitman, NJ), pipeta na superfície da dieta de cada poço). As bandejas foram então seladas com plástico adesivo ventilado Pull N' Peel Tab.

[00296] Além das amostras experimentais, as amostras incluíram; dsRNA de YFPv2, TE 0,1X (Tris HCl (0,1 mM) mais tampão de EDTA

(0,01 mM), pH 7,2.), e água como controles negativos ou amostras de "verificação de fundo". Poucas horas após a eclosão, larvas individuais foram coletadas com um pincel umedecido e depositadas na dieta tratada (duas a três larvas por poço). As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28°C, ~40% de umidade relativa) por 9 dias, após os quais o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados. A porcentagem média de mortalidade e a inibição de crescimento média foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (IC) foi calculada da seguinte forma: IC = [1 – (PTIT/NTIT)/(PTIVF/NTIVF)], onde PTIT é o Peso Total de Insetos vivos no Tratamento; NTIT é o Número Total de Insetos no Tratamento; PTIVF é o Peso Total de Insetos vivos na Verificação de Fundo (controle de tampão); e NTIVF é o Número Total de Insetos na Verificação de Fundo (controle de tampão).

[00297] Comparações de médias foram realizadas para todos os pares usando o método Tukey-Kramer HSD em JMP®Pro 11.1.1 (SAS, Cary, NC). Em alguns casos, os valores de CL50 e IC50 foram calculados. A CL50 (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% dos insetos de teste são mortos. A IC50 (Inibição do Crescimento) é definida como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio visto nas amostras de Verificação de Fundo. EXEMPLO 7: Sequências de shRNA resultam na mortalidade e inibição do crescimento de insetos

[00298] A entrega de novas moléculas de shRNA aos insetos por bioensaio resultou na mortalidade e inibição do crescimento dos insetos. Foi observado que a entrega oral da molécula de shRNA causou inibição do crescimento de WCR no bioensaio. Os dados gerados a partir dos experimentos de bioensaio mostraram que shRNAs com menos de 70 nucleotídeos (isto é, < 70 pb) podem causar tanto mortalidade como inibição do crescimento em WCR. Esses resultados contrastaram com o precedente estabelecido de que sequências de dsRNA com mais de 70 nucleotídeos (isto é, > 70 pb) eram necessárias para atividade oral em WCR. Pela primeira vez, esses experimentos de bioensaio indicaram que moléculas de shRNA com menos de 70 nucleotídeos são eficazes em espécies de insetos.

[00299] As seguintes moléculas de shRNA continham uma projeção 3' de dois nucleotídeos. A SEQ ID Nº:1 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 24 a 38 eram a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia ao siRNA4 dentro da região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404). A SEQ ID Nº:6 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 22 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 23 a 36 eram a alça de miR-1 de Tribolium; as posições nucleotídicas 37 a 58 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia ao siRNA4 dentro da região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404).

[00300] São fornecidas na Figura 4 as novas moléculas de shRNA que foram sintetizadas para inibir os genes-alvo COPIα em WCR. As moléculas de shRNA continham estruturas de grampo compreendendo arcabouços de shRNA obtidos a partir do miR-1 de WCR. Os dados fornecidos na Tabela 1 mostram que as moléculas de shRNA causaram tanto mortalidade significativa como inibição do crescimento em WCR. As moléculas de shRNA contendo o gene-alvo de COPIα inibiram o RNAm de COPIα em WCR, causando assim uma inibição estatisticamente significativa do crescimento (conforme indicado pelo relatório de letras de conexão, conforme mostrado na Tabela 1).

[00301] Tabela 1. Eficácia oral de shRNAs baseados em miR-1 em larvas de WCR. Os resultados de bioensaio do tratamento da superfície da dieta com 500 ng/cm2 de shRNA ou controle negativo (dsRNA de YFPv2; SEQ ID Nº:403) nove dias após exposição. As abreviaturas são as seguintes; N: número de réplicas (cada réplica representa oito poços em uma bandeja de criação de 128 poços, 17 insetos/réplica); EPM: erro padrão da média; IC: inibição do crescimento; relatório de letras de conexão do método Tukey-Kramer HSD (CLR, do inglês "connecting letter report"): os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes. SEQ ID % de mortalidade ± Nº ID do projeto Nome da amostra N EPM IC ± EPM 6 miR-1 de Tribolium IRRNA.25074,6 siRNA4 de COPIα_v3 6 51,02 ± 6,29 (A) 0,87 ± 0,03 (A) de WCR +0 +0 1 miR-1 de WCR IRRNA.27482,8 siRNA4 de COPIα_v3 6 36,79 ± 6,42 (AB) 0,78 ± 0,02 (A) de WCR +0 +0 --- Controle Tampão TE 0,1X 2 23,53 ± 11,77 (AB) 0,13 ± 0,12 (B) --- Controle ÁGUA 2 20,59 ± 20,59 (AB) -0,02 ± 0,25 (B) 403 Controle dsRNA de YFPv2 2 2,94 ± 2,94 (B) -0,13 ± 0,11 (B)

[00302] Em experimentos adicionais, um conjunto de seis moléculas de shRNA diferentes que continham diferentes arcabouços de shRNA foi testado em bioensaios. As moléculas de shRNA continham estruturas de grampo compreendendo arcabouços de shRNA obtidos a partir dos miRNAs miR-1 e bantam de WCR, Tribolium e Drosophila. A SEQ ID Nº:2 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 22 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 23 a 38 eram a alça de miR-1 de Drosophila; as posições nucleotídicas 39 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia ao siRNA4 dentro da região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404). A SEQ ID Nº:3 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 24 a 36 eram a alça de bantam de Diabrotica; as posições nucleotídicas 37 a 59 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia ao siRNA4 dentro da região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404). A SEQ ID Nº:4 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 24 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 25 a 37 eram a alça de bantam de Tribolium; as posições nucleotídicas 38 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia ao siRNA4 dentro da região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404). A SEQ ID Nº:5 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 ou 1 a 24 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 24 a 37 ou 25 ou 34 eram a alça de bantam de Drosophila; as posições nucleotídicas 36 a 60 ou 38 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia à região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404).

[00303] Os dados de bioensaio, conforme mostrados na Tabela 2, indicaram que as moléculas de shRNA produziram inibição estatisticamente significativa do crescimento e níveis variáveis de mortalidade para cinco dos seis shRNAs testados. Estes resultados suportam ainda que as novas moléculas de shRNA inibem o RNA-alvo e resultam na inibição do crescimento de insetos.

[00304] Tabela 2. Eficácia oral de shRNAs baseados em miR-1 e bantam em larvas de WCR. Os resultados de bioensaio [% de mortalidade e inibição do crescimento (IC)] do tratamento da superfície da dieta com 500 ng/cm2 de shRNA, dsRNA ou controle negativo (dsRNA de YFPv2) nove dias após exposição. As abreviaturas são as seguintes; N: número de réplicas (cada réplica representa oito poços em uma bandeja de criação de 128 poços, 17 insetos/réplica); EPM: erro padrão da média; e IC: inibição do crescimento. Relatório de letras de conexão do método Tukey-Kramer HSD: os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes. SEQ ID ID do projeto Nome da amostra N % de mortalidade IC média ± Nº EPM ± EPM 1 IRRNA.27482,8 miR-1 de WCR siRNA4 de 6 10,73 ± 2,83 (BC) 0,64±0,03 (B) COPIα_v3 de WCR +0 +0 2 IRRNA.27480,2 miR-1 de Dm siRNA4 de 6 5,88 ± 2,15 (C) 0,25±0,05 (C) COPIα_v3 de WCR +0 +0 3 IRRNA.28297,1 bantam de WCR siRNA4 de 6 19,61 ± 4,47 (ABC) 0,71±0,03 (AB) COPIα_v3 de WCR +0 +0 4 IRRNA.28298,1 bantam de Tribolium siRNA4 6 16,85 ± 4,91 (ABC) 0,62±0,06 (B) de COPIα_v3 de WCR +0 +0 5 IRRNA.28299,1 bantam de Drosophila siRNA4 6 35,9 ± 4,34 (A) 0,82±0,02 (AB) de COPIα_v3 de WCR +0 +0 6 IRRNA.25074,6 miR-1 de Tribolium siRNA4 de 6 27,45 ± 7,7 (AB) 0,79±0,04 (AB) COPIα_v3 de WCR +0 +0 -- Controle Tampão TE 0,1 X 4 4,41 ± 1,47 (C) 0,05±0,05 (CD) -- Controle ÁGUA 3 5,88 ± 3,39 (BC) -0,02±0,01 (D) 403 Controle dsRNA de YFPv2 5 3,53 ± 1,44 (C) -0,02±0,04 (D) EXEMPLO 8: Sequências-alvo de shRNA adicionais resultam na inibição do crescimento em WCR

[00305] Para demonstrar a eficácia de vários alvos de shRNA, uma sequência-alvo adicional dentro de COPIα, bem como três sequências- alvo de COPIβ foram testadas resultando em shRNA das SEQ ID Nos:405 a 408. As sequências guia incluíram siRNA1 da região v3 de

COPIα (dentro da SEQ ID Nº:404), siRNA1 da região v1 de COPIβ (dentro da SEQ ID Nº:409) e siRNA1 da região v2 de COPIβ e siRNA2 (dentro da SEQ ID Nº:410). A SEQ ID Nº:405 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 eram a fita senso da região de haste de COPIα que pode não ser idêntica à sequência de COPIα; as posições nucleotídicas 24 a 38 eram a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIα que correspondia ao siRNA1 dentro da região v3 de COPIα (SEQ ID Nº:404). A SEQ ID Nº:406 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 eram a fita senso da região de haste de COPIβ que pode não ser idêntica à sequência de COPIβ; as posições nucleotídicas 24 a 38 eram a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIβ que correspondia ao siRNA1 dentro da região v1 de COPIβ (SEQ ID Nº:409). A SEQ ID Nº:407 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 eram a fita senso da região de haste de COPIβ que pode não ser idêntica à sequência de COPIβ; as posições nucleotídicas 24 a 38 eram a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIβ que correspondia ao siRNA1 dentro da região v2 de COPIβ (SEQ ID Nº:410). A SEQ ID Nº:408 continha os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 eram a fita senso da região de haste de COPIβ que pode não ser idêntica à sequência de COPIβ; as posições nucleotídicas 24 a 38 eram a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 eram a fita antissenso da região de haste de COPIβ que correspondia ao siRNA2 dentro da região v2 de COPIβ (SEQ ID Nº:410).

[00306] Além disso, a SEQ ID Nº:411 pode ser designada para conter os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 são a fita senso da região de haste de v-ATPase C que pode não ser idêntica à sequência de v-ATPase C; as posições nucleotídicas 24 a 38 são a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 são a fita antissenso da região de haste de v- ATPase C que corresponde ao siRNA1 dentro de v-ATPase C (SEQ ID Nº:412). A SEQ ID Nº:413 pode ser designada para conter os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 são a fita senso da região de haste de COPIγ que pode não ser idêntica à sequência de COPIγ; as posições nucleotídicas 24 a 38 são a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 70 são a fita antissenso da região de haste de COPIγ que corresponde ao siRNA1 dentro da região v4 de COPIγ (SEQ ID Nº:414). A SEQ ID Nº:415 pode ser designada para conter os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 são a fita senso da região de haste de COPIδ que pode não ser idêntica à sequência de COPIδ; as posições nucleotídicas 24 a 38 são a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 são a fita antissenso da região de haste de COPIδ que corresponde ao siRNA2 dentro da região v1 de COPIδ (SEQ ID Nº:416). A SEQ ID Nº:417 pode ser designada para conter os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 são a fita senso da região de haste de Rab5 que pode não ser idêntica à sequência de Rab5; as posições nucleotídicas 24 a 38 são a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 são a fita antissenso da região de haste de Rab5 que corresponde à seq4 dentro da região 1_v1 de Rab5 (SEQ ID Nº:418). A SEQ ID Nº:419 pode ser designada para conter os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 são a fita senso da região de haste de wupA que pode não ser idêntica à sequência de wupA; as posições nucleotídicas 24 a 38 são a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 são a fita antissenso da região de haste de wupA que corresponde à seq2 dentro da região 4 de wupA (SEQ ID Nº:420). A SEQ ID Nº:421 pode ser designada para conter os seguintes fragmentos de uma molécula de shRNA: as posições nucleotídicas 1 a 23 são a fita senso da região de haste de wupA que pode não ser idêntica à sequência de wupA; as posições nucleotídicas 24 a 38 são a alça de miR-1 de Diabrotica; as posições nucleotídicas 39 a 60 são a fita antissenso da região de haste de wupA que corresponde à seq3 dentro da região 4 de wupA (SEQ ID Nº:420). shRNAs adicionais são projetados para terem como alvo sequências no EXEMPLO 4 e outros genes essenciais de espécies de artrópodes.

[00307] Das sequências adicionais testadas, a SEQ ID Nº:406 (IRRNA.29794.3) mostrou tanto mortalidade significativa de larvas de WCR como inibição do crescimento (Tabela 3).

[00308] Tabela 3. Eficácia oral de shRNAs direcionados a COPIα e COPIβ em larvas de WCR. Os resultados de bioensaio [% de mortalidade e inibição do crescimento (IC)] do tratamento da superfície da dieta com 500 ng/cm2 de shRNA, dsRNA ou controle negativo (dsRNA de YFPv2) nove dias após exposição. As abreviaturas são as seguintes; N: número de réplicas (cada réplica representa oito poços em um formato de 48 poços, 16 insetos/réplica); EPM: erro padrão da média; e IC: inibição do crescimento. Relatório de letras de conexão do método Tukey-Kramer HSD: os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes.

SEQ ID ID do projeto Nome da amostra N % de mortalidade IC média ± EPM Nº ± EPM 405 IRRNA.28112,3 miR-1 de Dvv siRNA1 de COPIα_v3 de Dvv +0 +0 6 33,7 ± 8,4 (AB ) 0,41 ± 0,19 (AB) 1 IRRNA.27482,8 miR-1 de Dvv siRNA4 de COPIα_v3 de Dvv +0 +0 6 11,6 ± 3,2 (B ) 0,14 ± 0,16 (AB) 406 IRRNA.29794,3 miR-1 de Dvv siRNA1 de COPIβ_v1 de Dvv +0 +0 6 48,5 ± 5,2 (A ) 0,69 ± 0,08 (A) 407 IRRNA.29796,3 miR-1 de Dvv siRNA1 de COPIβ_v2 de Dvv +0 +0 6 12,1 ± 4,2 (B ) 0,012 ± 0,19 (B) 408 IRRNA.29797,3 miR-1 de Dvv siRNA2 de COPIβ_v2 de Dvv +0 +0 5 24,1 ± 3,1 (AB) 0,12 ± 0,22 (AB) --- --- Tampão TE 6 22,8 ± 10,4 (AB) 0,17 ± 0,10 (AB) --- --- Água 6 17,5 ± 5,3 (B) -0,11 ± 0,07 (B ) 403 --- dsRNA de YFPv2 6 15,3 ± 4,0 (B) -0,19 ± 0,14 (B) EXEMPLO 9: Plantas transgênicas contendo moléculas de shRNA

[00309] Construção de vetores de transformação de plantas. Cassetes de expressão gênica contendo as moléculas de shRNA (por exemplo, as SEQ ID Nºs: 1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 e 421) são montados em vetores plasmidiais usando métodos de clonagem molecular padrão. Os shRNAs compreendem uma estrutura de haste separada por uma estrutura de grampo. Em alguns casos, o shRNA é flanqueado por uma projeção 5' e/ou uma projeção 3'. Um promotor é clonado diretamente a montante da molécula de shRNA (por exemplo, promotor da ubiquitina 1 do milho, vírus do mosaico da couve- flor 35S; promotor do badnavírus baciliforme da cana-de-açúcar; promotores dos genes da actina do arroz; promotores do gene da ubiquitina; promotores pEMU; promotor MAS; promotor da histona H3 do milho; promotor ALS; promotor do gene da faseolina; promotor CAB; promotor RUBISCO; promotor LAT52; promotor Zm13; e/ou promotor

APG são exemplos não limitativos de promotores conhecidos na técnica que podem ser selecionados para dirigir a expressão da molécula de shRNA) é usado para dirigir a produção da molécula de shRNA de RNAm primário. Em seguida, uma região 3′ não traduzida (por exemplo, uma UTR 3′ de ZmPER5; UTR 3' de AtUbi10; UTR 3' de AtEf1; ou UTR 3' de StPinIIsão exemplos não limitativos de UTRs 3' conhecidas na técnica que podem ser selecionadas para terminar a expressão da molécula de shRNA) é usada para terminar a transcrição da molécula de shRNA. A conclusão dos cassetes de expressão gênica é realizada usando métodos de clonagem molecular padrão e pode incluir cassetes de expressão gênica adicionais ligados em trans ou em cis a outros cassetes de expressão gênica que expressam outras características agronomicamente importantes e/ou marcadores de seleção.

[00310] Transformação de plantas. Além disso, são fornecidos exemplos não limitativos de protocolos de transformação de plantas para a transformação dos cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA. À luz da presente divulgação, culturas adicionais podem ser transformadas de acordo com modalidades da presente divulgação com o uso de técnicas que são conhecidas na técnica. É possível a transformação de plantas de espécies de plantas monocotiledôneas. Para a transformação mediada por Agrobacterium de centeio, veja, por exemplo, Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye", Transgenic Res. outubro de 2003; 12(5):587-596. Para a transformação mediada por Agrobacterium de sorgo, veja, por exemplo, Zhao et al., "Agrobacterium-mediated sorghum transformation", Plant Mol Biol. dezembro de 2000; 44(6):789-798. Para a transformação mediada por Agrobacterium de cevada, veja, por exemplo, Tingay et al., "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation," The Plant

Journal, (1997) 11: 1369–1376. Para a transformação mediada por Agrobacterium de trigo, veja, por exemplo, Cheng et al., "Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiol., novembro de 1997;115(3):971-980. Para a transformação de tabaco mediada por Agrobacterium, veja, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. Nº US 2013/0157369 Al. Para a transformação mediada por Agrobacterium de arroz, veja, por exemplo, Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol. setembro de 1997;35(1- 2):205-218. É possível a transformação de plantas de espécies de plantas dicotiledôneas. Para a transformação mediada por Agrobacterium de Arabidopsis, veja, por exemplo, Clough, SJ, e Bent, AF (1998). "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium‐mediated transformation of Arabidopsis thaliana." The plant journal, 16(6), 735-

743. Para a transformação mediada por Agrobacterium de algodão, veja, por exemplo, Tohidfar, M., Mohammadi, M. e Ghareyazie, B. (2005). "Agrobacterium-mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum) using a heterologous bean chitinase gene." Plant cell, tissue and organ culture, 83(1), 83-96. Para a transformação de soja mediada por Agrobacterium, veja, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. Nº US 2014/0173780 Al. Para a transformação mediada por Agrobacterium de tabaco, veja, por exemplo, An, G. (1985). "High efficiency transformation of cultured tobacco cells." Plant Physiology, 79(2), 568-570.

[00311] O milho pode ser transformado com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 8 do pedido de patente WO 2007/053482.

[00312] A soja pode ser transformada com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 11 ou Exemplo n.º 13 do pedido de patente WO 2007/053482.

[00313] O algodão pode ser transformado com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 14 da Patente dos E.U.A. Nº 7.838.733 ou no Exemplo n.º 12 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00314] A canola pode ser transformada com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 26 da Patente dos E.U.A. Nº

7.838.733 ou no Exemplo n.º 22 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00315] O trigo pode ser transformado com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 23 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

[00316] O arroz pode ser transformado com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 19 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

[00317] A Arabidopsis pode ser transformada com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 7 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

[00318] O tabaco pode ser transformado com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, utilizando as mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo n.º 10 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

[00319] Os nomes em latim para essas e outras plantas são dados abaixo. Deve ficar claro que outras técnicas de transformação (não

Agrobacterium) podem ser usadas para transformar cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, por exemplo, nessas e em outras plantas. Exemplos incluem, mas sem limitação; Milho (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), Cevada (Hordeum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Beterraba sacarina e de mesa (Beta spp.), Cana de açúcar (Saccharum officinarum), Tomate (Lycopersicon esculentum e outras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras spp., e Cyphomandra betacea), Batata (Solanum tuberosum), Batata-doce (Ipomoea batatas), Centeio (Secale spp.), Pimentas (Capsicum annuum, chinense e frutescens), Alface (Lactuca sativa, perennis e pulchella), Repolho (Brassica spp.), Aipo (Apium graveolens), Berinjela (Solanum melongena), Amendoim (Arachis hypogea), Sorgo (Sorghum spp.), Alfafa (Medicago sativa), Cenoura (Daucus carota), Feijão (Phaseolus spp. e outros gêneros), Aveias (Avena sativa e strigosa), Ervilhas (Pisum, Vigna e Tetragonolobus spp.), Girassol (Helianthus annuus), Abóbora (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa), Tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Gramado (Lolium, Agrostis, Poa, Cynodon, e outros gêneros), Trevo (Trifolium), Ervilhaca (Vicia). A transformação de tais plantas, com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA, por exemplo, é contemplada em modalidades da presente divulgação.

[00320] O uso de cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA pode ser implantado em muitas espécies de madeira decídua e perene. Tais aplicações também estão dentro do escopo das modalidades da presente divulgação. Essas espécies incluem, mas sem limitação; amieiro (Alnus spp.), freixo (Fraxinus spp.), espécies de álamo e choupo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Betula spp.), cerejeira (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira (Carya spp.), ácer (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.) e pinheiro (Pinus spp.).

[00321] O uso de cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA pode ser implantado em espécies ornamentais e frutíferas. Tais aplicações também estão dentro do escopo das modalidades da presente divulgação. Exemplos incluem, mas sem limitação; rosa (Rosa spp.), sarça ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp.), maçã silvestre ou maçã (Malus spp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp.) e malmequeres (Tagetes spp.).

[00322] Análises moleculares. A análise molecular de tecidos vegetais transformados é realizada em amostras obtidas de materiais vegetais transformados com cassetes de expressão gênica contendo a molécula de shRNA para confirmar a presença e o número de cópias de uma molécula de shRNA integrada de forma estável e para quantificar a quantidade expressa de shRNA sendo produzido na célula vegetal. Vários ensaios são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para análise molecular da molécula de shRNA dentro de material vegetal.

[00323] Bioensaios de insetos. A bioatividade de material vegetal transgênico que expressa as moléculas de shRNA da presente divulgação é demonstrada por métodos de bioensaio conhecidos. Veja, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. A conclusão desses ensaios permite demonstrar a eficácia da molécula de shRNA, por exemplo, ao dar como alimento vários tecidos vegetais ou pedaços de tecidos derivados de uma planta que produz um shRNA inseticida para atingir insetos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, extratos são preparados a partir de vários tecidos vegetais derivados de uma planta que produz o shRNA inseticida, e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados em cima de dietas artificiais para bioensaios. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados a bioensaios conduzidos de forma similar que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem uma molécula de shRNA, ou a outras amostras de controle. O crescimento e a sobrevivência de insetos-alvo no material da planta transgênica que expressa as moléculas de shRNA são determinados e comparados aos do grupo de controle.

[00324] Embora vários aspectos e modalidades exemplificativos tenham sido discutidos acima, os especialistas na técnica reconhecerão certas modificações, permutações, adições e subcombinações dos mesmos. Portanto, pretende-se que as reivindicações anexas a seguir e reivindicações apresentadas depois sejam interpretadas no sentido de incluir todas as modificações, permutações, adições e subcombinações que estejam dentro de seu verdadeiro espírito e escopo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo de RNA pequeno em forma de grampo (shRNA) caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes estruturas: a) uma sequência polinucleotídica compreendendo uma estrutura em forma de grampo com menos de ou igual a 25 nucleotídeos; b) uma sequência polinucleotídica compreendendo uma estrutura de reconhecimento e sítio de clivagem de DICER; e c) uma sequência polinucleotídica compreendendo uma estrutura de haste de 16 a 25 pares de nucleotídeos, em que a estrutura de haste é de fita dupla.

2. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende menos de 70 nucleotídeos de comprimento.

3. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende pelo menos 2 voltas de alfa-hélice.

4. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o shRNA não é reconhecido por DROSHA.

5. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o shRNA não é clivado por DROSHA.

6. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura de grampo compreende nucleotídeos de fita dupla e nucleotídeos de fita simples.

7. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a estrutura de grampo compreende uma série de mal pareamentos e/ou saliências.

8. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura de grampo compreende um polinucleotídeo obtido de um arcabouço de microRNA de inseto.

9. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a estrutura de grampo compreende as SEQ ID Nos:7 a 401 ou qualquer fragmento das mesmas.

10. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura de haste não contém mal pareamentos e/ou saliências.

11. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura de haste compreende um polinucleotídeo que tem 70% a 100% de identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta.

12. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo-alvo de uma praga de planta é selecionado do grupo que consiste em Caf1-180, RPA70, V-ATPase H, Rho1, V-ATPase C, Reptina, PPI-87B, RPS6, COPI gama, COPI alfa, COPI beta, COPI delta, Brahma, ROP, Hunchback, RNA polimerase II 140, Sec23, Dre4, Gho, thread, ncm, RNA polimerase II-215, RNA polimerase I 1, RNA polimerase II 33, Kruppel, Spt5, Spt6, Snap25 e Prp8.

13. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de shRNA tem energia livre (∆G°37) inferior a -30 kcal/mol.

14. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende menos de 80 nucleotídeos de comprimento.

15. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende menos de 90 nucleotídeos de comprimento.

16. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de shRNA compreende adicionalmente uma projeção polinucleotídica de pelo menos 2 nucleotídeos e não mais do que 4 nucleotídeos.

17. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita dupla.

18. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

19. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o segundo nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

20. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o terceiro nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

21. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o quarto nucleotídeo da projeção polinucleotídica é de fita simples.

22. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 5' da molécula de shRNA.

23. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a projeção polinucleotídica encontra-se na extremidade 3' da molécula de shRNA.

24. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende menos de 74 nucleotídeos de comprimento.

25. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende menos de 84 nucleotídeos de comprimento.

26. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende menos de 94 nucleotídeos de comprimento.

27. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o shRNA inibe um gene-alvo de uma praga de inseto por supressão da expressão do RNAm-alvo de uma praga de inseto.

28. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o shRNA compreende as SEQ ID Nos:1 a 6, 405 a 408, 411, 413, 415, 417, 419 ou 421.

29. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a estrutura de reconhecimento e sítio de clivagem de DICER não é reconhecida e/ou substancialmente clivada por uma proteína do tipo DICER de planta.

30. Polinucleotídeo de shRNA, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a proteína do tipo DICER é selecionada do grupo que compreende DCL-1, DCL-2, DCL-3 e DCL-4.