GENES DE QUINASA POLIFOSFATO INOSITOL NOVEDOSOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO TECNICO La presente invención se refiere al campo de nutrición animal. Específicamente, la presente invención se refiere a la identificación y uso de genes que codifican enzimas involucradas en eJ metabolismo de fitato en plantas y el uso de estos genes y mutantes de los mismos para reducir los niveles de fitato y/o incrementar los niveles de fósforo no fitato en la comida o alimento. ANTECEDENTES DE' LA INVENCION La función del fósforo en la nutrición animal es bien reconocida, es un componente crítico del esqueleto, ácidos nucleicos, membranas celulares y algunas vitaminas. Aunque el fósforo es esencial para la salud de los animales,, no todo el fósforo en el alimento es biodisponible. Los fitatos son la forma- mayor de fósforo' en las semillas, por ejemplo el fitato representa aproximadamente 60-80% del fósforo total en el maíz y la soya. Cuando las dietas basadas en semillas son alimentadas a animales no rumiantes, el ácido fítico consumido forma sales con varios nutrientes minerales importantes, tales como potasio, calcio y hierro y también enlaza proteínas en el tracto intestinal. Estos complejos de fitato no pueden ser metabolizados por los animales monogástrieos y son excretados, actuando efectivamente como factores antinutricionales al reducir la biodisponibilidad del fósforo dietético y los minerales. El fósforo enlazado al fitato en las excresiones de animales también tiene un impacto ambiental negativo, contribuyendo a la contaminación del agua superficial y subterránea. Han existido dos procedimientos principales para reducir los impactos nutricionales y ambientales negativos del fitato en la semilla. El primero involucra las intervenciones de poscosecha, que incrementan el costo y el tiempo de procesamiento del alimento. Las tecnologías del procesamiento de poscosecha retiran el ácido fitico mediante la fermentación o mediante la adición de compuestos, tales como fitasas. El segundo es un procedimiento genético, que se ha correlacionado fuertemente con características agronómicas indeseables. Un procedimiento genético involucra desarrollar germen plasma de cultivo con reducciones heredables en el ácido fitico de la semilla. La variación cuantitativa heredable en el ácido fitico de la semilla se ha observado entre las lineas en varias especies de cultivos, pero también es altamente y positivamente correlacionada con características menos deseables. Mientras que se observó algo de variabilidad para el ácido fitico, no hubo cambio en el fósforo no fitato, solamente 2% de la variación observada en el ácido fitico fue heredable, mientras que 98% de la variación fue atribuida a factores ambientales. Otro procedimiento genético tradicional involucra seleccionar lineas de bajo contenido de fitato de una población mutagenizada para producir germen plasma separado de los rasgos correlacionados indeseables observados en la reproducción tradicional. La mayoría de líneas mutantes son una pérdida de la función, presumiblemente bloqueada en la ruta biosintética del ácido fítico, por lo tanto la baja acumulación de ácido fítico probablemente será un rasgo recesivo. En ciertos casos, este procedimiento ha revelado que la homocigosidad para el fitato sustancialmente reducido resultó letal. Un procedimiento genético más moderno es la tecnología transgénica, que se ha utilizado para incrementar los niveles de fitasa en plantas. Estos tejidos o semillas de plantas transgénicas se han utilizado como suplementos dietéticos, pero este procedimiento no se ha utilizado para reducir la acumulación de ácido típico en la semilla. La ruta biosintética que conduce al fitato es compleja y no entendida completamente. Sin que se desee que sea enlazada por alguna teoría en particular de la formación ' de fitato, se cree que la síntesis puede ser mediada por una serie de una o más ADP-fosfotransferasas, quinasas dependientes de ATP e isomerasas. Un número de intermediarios se han aislado incluyéndose, por ejemplo, monofosfatos tal como monofosfato D-mio-inositol, difosfatos (lP2s) tal como 3, -bifosfato D-mio-inositol, trifosfatos (IP3s) tal como 3, , 6-trifosfato D-mio-inositol, tetrafosfatos (IP4s) tal como 3, 4, 5, 6-tetraqu.isfosfatos D-mio-inositol y pentafosfatos (IP5s) tal como 1,3,4,5,6 pentaquisfosfato D-mio-inositol. La fosforilación del IP5 a IP6 se encuentra que es reversible. Varios ciclos infructuosos de defosforilación y refosforilación de las formas P5 y P6 se han reportado, asi como un ciclo que involucra glucosa-6-fosfato -> 3-monofosfato D-mio-inositol -> mio-inositol; el último paso que es completamente reversible, indicando que el control del flujo metabólico a través de esta ruta puede ser importante. Basado en lo anterior, existe la necesidad para mejorar el contenido nutricional de plantas, particularmente ma z y soya al incrementar fósforo no fitato y al reducir el fitato de la semilla. Esta invención difiere de los procedimientos anteriores en que proporciona herramientas y reactivos que permiten que la persona experta, mediante la aplicación, inter alia, de metodologías transgénicas influya en el flujo metabólico con respecto a la ruta del ácido fitico . BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Las quinasas polifosfato inositol son una clase de proteínas originalmente descubiertas en la levadura e identificadas como parte de una ruta de transducción de señal. Estas enzimas pueden usar varias especies de fosfato inositol como sustratos con trifosfato de adenosinas (ATP) en una reacción de fosforilación que produce los productos difosfato de adenosina (ADP) y fosfato inositol fosforilado (n+1) . Esta invención prevee usar estos ácidos nucleicos o polipéptidos, vaciantes de los mismos, para modular el flujo a través de la ruta biosintética del ácido fitico para mejorar la calidad nutricional del alimento, en particular maiz y soya, y para reducir el impacto ambiental de los desechos de animales al crear semilla con niveles de fósforo más altos disponibles o niveles menores de fitato. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
DEFINICIONES Las unidades, prefijos y símbolos pueden ser denotados en su forma aceptada SI. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos son escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a- 3'; las secuencias de aminoácidos son escritas de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los rangos numéricos citados dentro de la especificación son inclusivos de los números que definen el rango e incluyen cada número entero dentro del rango definido. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una letra comúnmente aceptados. A menos que se proporcione de otra manera, los términos de software eléctricos y electrónicos son utilizados en la presente como se definen en The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Tcrms (5a edición, 1993) . Los términos definidos enseguida son más completamente definidos por referencia a la especificación en conjunto. El término "aislado"' se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteina, que está: (1) sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el material como es encontrado en su medio ambiente que surge de manera natural o (2) si el material está en su medio ambiente natural, el material ha sido alterado por la intervención humana deliberada a una composición y/o colocado en un sitio en la célula diferente al sitio nativo al- material. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico" significa un polinucleótido e incluye polímeros de una sola o múltiples hebras de bases de desoxiribonucleótido o ribonucleótido. Los ácidos nucleicos también pueden incluir fragmentos y nucleótidos modificados. Por lo tanto, como se utiliza en la presente, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan intercambiablemente. Como se utiliza en la presente, "polinucleótido de quinasa polifosfato inositol" es un ácido nucleico de la presente invención y significa un ácido nucleico, o fragmento del mismo, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad de quinasa polifosfato inositol o un fragmento útil del mismo. Como se utiliza en la presente, "IP?K" significa quinasa polifosfato inositol con respecto a cualquier ácido nucleico o polipéptido de la presente invención o la actividad funcional asociada. Como se utiliza en la presente "polipéptido" significa proteínas, fragmentos de proteina, proteínas modificadas, por ejemplo, glicosiladas, fosforiladas u otras modificaciones), secuencias de aminoácidos y secuencias de aminoácidos sintéticas. El polipéptido puede ser modificado o no modificado. Por lo tanto, como se utiliza en la presente "polipéptido" y "proteina" se utilizan intercambiablemente. Como se utiliza en la presente, "polipéptido de quinasa polifosfato inositol" es un polipéptido de la presente invención que es capaz de fosforilar un sustrato de fosfato inositol apropiado y se refiere a una o más secuencias de aminoácidos, en forma modificada o no modificada. El término también es inclusivo de fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproteinas o proproteinas) o actividad de los mismos. Como se utiliza en la presente, "planta" incluye plantas y partes de plantas que incluyen, pero no están limitadas a, células de plantas y tejidos de plantas tales como hojas, tallos, raices, flores, polen y semillas. Como se utiliza en la presente, "promotor" incluye la referencia a una región de DNA corriente arriba del inicio de transcripción e involucrada en el reconocimiento y enlace de polimerasa de RNA y otras proteinas para iniciar la transcripción. Por "fragmento" se propone una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y por consiguiente la proteina codificada por la misma. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteina que retiene la actividad biológica del ácido nucleico nativo, los fragmentos funcionales. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que pueden ser útil como sondas de hibidrización no pueden codificar las proteinas del fragmento que retiene la actividad biológica. Asi, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos son generalmente más grandes que 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600 o 700 nucleótidos y hasta e incluyendo la secuencia de nucleótidos entera que codifica las proteinas de la invención. Generalmente, las sondas son menores que 1000 nucleótidos y frecuentemente menores que 500 nucleótidos. Los fragmentos de la invención incluyen secuencias antisentido utilizadas para disminuir la expresión de los polinucleótados inventivos. Tales fragmentos antisentido pueden variar en longitud que varia de mayor que 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 nucleótidos y hasta e incluyendo la secuencia de codificación entera. Por "equivalente funcional" como se aplica a un polinucleótido o una proteina, se propone un polinucleótido o una proteina de longitud suficiente para modular el nivel de la actividad de la proteina IPPK en una célula de planta. Un equivalente funcional de polinucleótido puede ser en la orientación de sentido o antisentido. Por "variantes" se proponen sustancialmente secuencias similares. Generalmente, las variantes de las secuencias de ácido nucleico de la invención tendrán por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos nativa, en donde el % de identidad de secuencia está basado en la secuencia entera y es determinada por el análisis de GAP 10 utilizando los parámetros de error. Generalmente, las variantes de la secuencia de polipéptido de la invención tendrán por lo menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia a la proteina nativa, en donde el % de identidad de secuencia está basado en la secuencia entera y es determinada por el análisis de GAP 10 utilizando los parámetros de error- GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970} para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. Como se utiliza en la presente, "transformación" incluye transformación estable y transformación transiente. Como se utiliza en la presente, "transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo huésped (esto incluye genomas tanto nucleares como de organelos) que dan por resultado la herencia genéticamente estable. Además de los métodos tradicionales, la transformación estable incluye la alteración de la expresión de gen por cualquier medio que incluye quimeraplastia o inserción de transposón. Como se utiliza en la presente, "transformación transiente" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico o proteina en el . núcleo (u organelo que contiene DNA) de un organismo huésped que da por resultado la expresión del gen sin la herencia de integración y estable. "Molécula de enlace a la . enzima IPPK" como se utiliza en la presente, se refiere a moléculas o iones que enlazan o interactúan específicamente con los polipéptidos o polinucleótidos de la enzima biosintética de fitato de la presente invención incluyéndose, por ejemplo, sustratos de enzima, cofactores, antagonistas, inhibidores, componentes de membrana celular y receptores clásicos. El enlace entre los polipéptidos de la invención y tales moléculas, incluyéndose las moléculas de enlace o interacción, puede ser exclusivo a los polipéptidos de la invención, o puede ser altamente especifico para los polipéptidos de la invención, o puede ser altamente especifico a un grupo de proteínas que incluye polipéptidos de la invención, o puede ser especifico a varios grupos de proteínas, por lo menos una de . las cuales incluye un polipéptido de la invención. Las moléculas de enlace también incluyen anticuerpos y reactivos derivados de anticuerpo que enlazan específicamente los polipéptidos de la invención. "Transgénica de alto fósforo" como se utiliza en la presente, significa una entidad que, como un resultado de la manipulación genética recombinante, produce semilla con una disminución heredable en el porcentaje de ácido fitico y/o en el porcentaje de fósforo no fitato. comparado con una planta correspondiente que no se ha transformado. "Acido fitico" como se utiliza en la presente, significa ácido mio-inositol tetrafosfórico, ácido mio-inositol pentafosfórico o acido mio-inositol hexafosfórico. Como una sal con cationes, ácido fitico es "fitato". "Fósforo no fitato", como se utiliza en la presente, significa fósforo con total de fósforo menos fitato .
"Animal no rumiante" significa un animal con un estómago simple dividido en las regiones de esófago, cardia, fundus y piloro .. Un animal no rumiante adicionalmente implica una especie de animal sin un rumen funcional. Un rumen es una sección del sistema digestivo donde el alimento/comida es empapado y sometido a la digestión por microorganismos antes de pasar a través del tracto digestivo. Este fenómeno no se presenta en un animal no rumiante. El término animal no rumiante incluye, pero no está limitado a humanos, puercos, aves de corral, gatos y perros. ACIDOS NUCLEICOS La familia del gen de quinasa polifosfato inositol codifica una clase de enzimas capaz de . utilizar varios fosfatos inositol diferentes como sustratos, en una reacción de fosforilación, utilizando trifosfato de adenosina (ATP) como el donador de fosfato, que da por resultado los productos de difosfato de adenos.ina (ADP) y un fosfato inositol fosforilado. Se espera que la modulación de la expresión y/o el nivel de los ácidos nucleicos de la presente invención modulen la ruta biosintética de fitato proporcionando métodos para incrementar el fósforo disponible, disminuir el fitato y/o disminuir la contaminación del fósforo enlazado al fitato en desechos de animales . Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden hacer utilizando (a) métodos recombinantes estándares, (b) técnicas sintéticas, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención se pueden clonar, amplificar o de otra manera construir de una monocotiledónea o dicotiledónea. Ejemplos típicos de monocotiledóneas son maiz, sorgo, cebada, trigo, mijo, arroz, o hierba de césped. Dicotiledóneas típicas incluyen soyas, cártamo, girasol, cánola, alfalfa, papa o mandioca. Los fragmentos funcionales incluidos en la invención se pueden obtener utilizando cebadores que hibridizan selectivamente bajo condiciones severas. Los cebadores son generalmente de por lo menos 12 bases en longitud y pueden ser tan largos como 200 bases, pero generalmente serán de 15 a 75, o más probablemente de 15 a 50 bases . Los fragmentos funcionales se pueden identificar utilizando una variedad de técnicas tal como el análisis de restricción, análisis de Southern, análisis de extensión de cebador y el análisis de secuencia de DNA. La presente invención incluye una pluralidad de polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos idéntica. La degeneración del código genético permite que se puedan utilizar tales "variaciones inactivas", por ejemplo, para hibridizar selectivamente y detectar variantes alélicas de polinucleótidos de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención incluye ácidos nucleicos que comprenden variantes alélicas. El término "alelo" como se utiliza en la presente se refiere á un ácido nucleico relacionado del mismo gen. Variantes de ácidos nucleicos incluidas en la invención pueden ser obtenidas, por ejemplo, mediante la mutagénesis dirigida al oligonucleótido, la mutagénesis de exploración enlazadora, mutagénesis utilizando la reacción de cadena de polimerasa, y similares. Ver, por ejemplo, las páginas 8.0.3-8.5.9 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, Eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . También, ver generalmente, PcPherson (ed.), DI ECTED MÜTAGENESIS: A Practical Approach, (IRL Press, 1991) . Asi, la presente invención también comprende moléculas de DNA que consisten de secuencias de nucleótidos que tienen similaridad de secuencia sustancial con las secuencias inventivas. Las variantes incluidas en la invención pueden contener sustituciones individuales, supresiones o adiciones al ácido nucleico o secuencia de polipéptido que alteran, adicionan o suprimen un aminoácido individual o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada. Una "variante conservativamente modificada" es una alteración que da por resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Cuando el ácido nucleico es preparado o alterado sintéticamente, la ventaja se puede tomar de las preferencias de codón conocidas del huésped propuesto . La presente invención también incluye "tergiversaciones" producidas por la tergiversación de secuencia de los polinucleótidos inventivos para obtener una característica deseada. La tergiversación de secuencia es descrita en la publicación de PCT No. 86/19256. Ver también, Z ang, J.H. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509 (1997). La presente invención también incluye el uso de las regiones 5' y/o 3' UTR para la modulación de la traducción de secuencias de codificación heteróloga. Las porciones de secuencia positiva incluyen las secuencias consensúales de iniciación de traducción (Ko2ak, Nucleíc Acids Res. 15:8125 (1987)) y la estructura de capa de 7-metilguanosina (Drummond y colaboradores, Nuclelc Acids - Res. 13:7375 (1985)). Elementos negativos incluyen las estructuras de circuitos de tallos 5' UTR intramoleculares estables (Muesing y colaboradores, CeIJ 48:691 (1987)) y las secuencias AUG o estructuras de lectura abierta cortas precedidas por un AUG apropiado en el 5' UTR ( osak, supra, Rao y colaboradores, Mol. Y Cell . Biol. 8:284 (1988)). Además, los segmentos de codificación de polipéptido de los polinucleótidos de la presente invención se pueden modificar para alterar el uso del codón. El uso del codón alterado puede ser empleado para alterar la eficiencia de traducción. El uso del codón en las regiones de codificación de los polinucleótidos de la presente invención se puede analizar estadísticamente utilizando paquetes de software comercialmente disponibles tal como "Codon Preference" disponible del University of Wisconsin Genetics Computer Group (ver Devereaux y colaboradores, Nucleic Acíds Res. 12:387-395 (1984)) o acVector 4.1 (Eastman Kidal Co., New Haven, Conn.). Por ejemplo, los ácidos nucleicos inventivos pueden ser optimizados para la expresión mejorada en las plantas de interés. Ver, por ejemplo, EPA0359472; W091/16432; Perlak y colaboradores (1991) Proc.Natl. Acad. 5ci. USA 88:3324-3328; y Murray y colaboradores (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. De esta manera, los polinucleótidos pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos de la planta. Ver, por ejemplo, Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, la descripción de la cual es incorporada en la presente por referencia. La presente invención proporciona subsecuencias que comprenden ácidos nucleicos aislados que contienen por lo menos 20 bases contiguas de las secuencias inventivas. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado incluye aquellos que comprenden por lo menos 20, 30, 40, 50, 50, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 u 800 nucleótidos contiguos de las secuencias inventivas. Las su secuencias del ácido nucleico aislado se pueden utilizar para modular o detectar la expresión de gen al introducir en las subsecuencias compuestos que enlazan, intercalan, segmentan y/o reticulan a los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender convenientemente un sitio de multiclonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa insertados en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, las secuencias traducibles se pueden insertar para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. Un polinucleótido de la -presente invención puede ser unido a un vector, adaptador, promotor, péptido de tránsito o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Secuencias adicionales se pueden adicionar a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido y extensivamente descrito en la técnica. Para una descripción de tales ácidos nucleicos ver, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) ; y, Amersham Life Sciences, Inc. Catalog '97 (Arlington Heights, IL) . Las composiciones de ácido nucleico aislado de esta invención, tales como RNA, cDNA, DNA genómico, o un híbrido de los mismos, se puede obtener de fuentes biológicas de plantas utilizando cualquier número de metodologías de clonación conocidas para aquellos expertos en la técnica. En algunas modalidades, las sondas de oligonucleótido que selectivamente hibridizan, bajo condiciones severas a los polinucleótidos de la présente invención son utilizadas para identificar la secuencia deseada de un cDNA o biblioteca de cDNA genómica. Los protocolos de aislamiento de RNA y mR A totales, ejemplares son descritos en Plant Molecular Bíology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997); y, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, Eds., Greene Publising and Wiley. Interscience, New York (1995). Los kits de aislamiento de RNA y mRNA totales son comercialmente disponibles de vendedores tales como Stratagene (La Jolla, CA) , Clonetech (Palo Alto, CA) , Pharmacia (Piscataway,NJ) , y 5' -3' (Paoli, PA) . Ver también, las patentes norteamericanas Nos. 5,614,391; y 5,459,253. Los protocolos de síntesis de cDNA típicos son bien conocidos para la persona experta y son descritos en tales referencias estándares como: PJant Molecular B ology: A Laboratory Manual, Clark, ED., Springer-Verlag, Berlín (1997); y, Current Protocols xn Molecular Bxology, Ausubel y colaboradores, Eds., Greene Publising and Wiley-interscience, New York (1995) . Los kits de síntesis de cDNA son disponibles de una variedad de vendedores comerciales tales como Stratagene o Farmacia. Un método ejemplar para construir una biblioteca de cDNA de longitud completa mayor que 95% pura es descrito por Carninci y colaboradores, Genomics, 37:327-336 (1996). Otros métodos para producir bibliotecas de longitud completas son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Edery y colaboradores, Mol. Cell Bxol. 15 (.6) : 3363-3371 (1995); y la Solicitud de PCT WO 96/34981. Frecuentemente es conveniente normalizar una biblioteca de cDNA para crear una biblioteca en la cual cada clon es más igualmente representado. Un número de procedimientos para normalizar bibliotecas de cDNA son conocidos en la técnica. La construcción de bibliotecas normalizadas es descrita en Ko, Nucí. Acids. Res. 18(19) .5705-5711 (1990); Patanjali y colaboradores, Proc.
Nati. Acad. U.S.A. 88:11943-1947 (1991); patentes norteamericanas Nos. 5,482,685 y 5,637,685; y Soares y colaboradores, Pxoc. Nati. Acad. Sci. USA 91:9228-9232 (1994) . Las bibliotecas de cDNA sustraídas son otro medio para incrementar la proporción de especies de cDNA menos abundantes. Ver, Foote y colaboradores, en Plant Molecular Biology; A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997); Kho y Zarbl, Technxque 3(2):58-63 (1991); Silve y St. John, Nucí. Acids Red. 16(22) :10937 (1988); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, EDS, Greene Publising and Wiley-Interscience, New York (1995); y, Swaroop y colaboradores, Nucí. Acids Res. 19(8) :1954(1991) . Los kits de sustracción de cDNA son comercialmente disponibles. Ver, por ejemplo, PCR-Select (Clontech) . Para construir bibliotecas genómicas, segmentos grandes de DNA genómicos son generados por fragmentación aleatoria. Ejemplos de técnicas biológicas moleculares apropiadas e instrucciones son encontradas en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Vols. 1-3 (1989), ethods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger y Kimmel, Eds., San Diego : Academic Press, Inc. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Auzubel y colaboradores, Eds., Greene Publising and Wiley- Interscience, New York- (1995); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlín (1997) . Los kits para la construcción de bibliotecas genómicas también son comercialmente "disponibles . El cDNA o biblioteca jenómica puede ser clasificada utilizando una sonda basada en la secuencia de un ácido nucleico de la presente invención tales como aquellas descritas en la presente. Las sondas se pueden utilizar para hibridizar con el DNA genómico las secuencias de cDNA para aislar polinucleótidos homólogos de las mismas o diferentes especies de plantas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que varios grados de severidad de hibridización se pueden emplear en el análisis; y ya sea que la hibridización o el medio de lavado puede ser severo. El grado de severidad puede ser controlado por la temperatura, intensidad iónica, pH y la presencia de un · solvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida. Típicamente, las condiciones de hibridización severas serán aquellas en la cual la concentración de sal es de menos de aproximadamente de ion Na 1.5 M, típicamente de manera aproximada concentración de ion Na 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden obtener con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridización con una solución reguladora de formamida al 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS_1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC=NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50°C. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen la hibridización en formamida al 40 al 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37 °C y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridización en formamida al 50%, NaCl 1 , SDS al 1% a 37 °C, y un lavado en SSC 0.1X a 60°C. Típicamente el tiempo de hibridización es de 4 a 16 horas. Una guia extensiva para la hibridización de ácidos nucleicos es encontrada en Tijssen,. Laboratory Techniques in Biochenistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Part. I, Chapter 2 "Overview de principies of hibridization and the strategy of nucleic acid prob assays", Elsevier, New York (1993); and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel y colaboradores, Eds. Greene Publising and Wiley-interscience, New York (1995) . Frecuentemente, las bibliotecas de cDNA serán normalizadas para incrementar la representación de cDNAs relativamente raros. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden amplificar de las muestras de ácido nucleico · utilizando técnicas de amplificación. Por ejemplo, la tecnología de reacción de cadena de polimerasa (PCR) se puede utilizar para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y polinucleótidos relacionados directamente de las bibliotecas de DNA o cDNA genómicas . La PCR y otros métodos de amplificación in vitro, también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas a ser expresadas, para hacer ácidos nucleicos para utilizarse como sondas para detectar la presencia del mRNA deseado en las muestras, para la secuenciación de ácido nucleico, o para otros propósitos. Ejemplos de técnicas útiles para los métodos de amplificación in vitro son encontrados en Berger, Sambrook, y Ausubel, asi como Mullis y . colaboradores, patente norteamericana No, 4,683,202 (1987); y, PCR Protocole A Guide to Methods and Applications, Innis y colaboradores, EDS . , Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los kits comercialmente disponibles para la amplificación de PCR genómicas son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech) . La proteina 32 del gen T4 (Boehninger Mannheim) se puede utilizar para mejorar el rendimiento de los productos de PCR largos. También se han descrito métodos de clasificación basados en PCR. Wilfinger y colaboradores describen un método basado en PCR en el cual el cDNA más largo es identificado en el primer paso, de modo que los clones incompletos pueden ser eliminados del estudio. Bio Techniques, 22 (3) : 81-486 (1997) . En un aspecto de la invención, los ácidos nucleicos pueden ser amplificados de una biblioteca de ácido nucleico de planta. La biblioteca de ácido nucleico puede ser una biblioteca de cDNA, una biblioteca genómica, o una biblioteca generalmente construida de transcripciones nucleares en cualquier etapa del procesamiento de intrón. Las bibliotecas se pueden hacer de una variedad de tejidos de plantas tales como espigas, plántulas, hojas, peciolos, . raices, polen o semillas. Buenos resultados se han obtenido utilizando tejidos tal como núcela de maíz 5 dias después de la maduración, embriones de maíz 20 dias después de la polinización, mazorcas inmaduras . primarias y secundarias acumuladas de maiz, hojas de maiz en la etapa V3-V4, plántulas de maiz germinadas en frió de 20 dias, raices de maiz V5, tejido de raiz de soya de 8 dias, cápsulas de eucalipto (posiblemente semilla fértil) , y corteza de tallo Guayule . Alternativamente, las secuencias de la invención se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes en otros organismos, particularmente otras plantas, más particularmente, otras monocotiledóneas . De esta manera, los métodos tales como PCR, hibridización, y similares, se pueden utilizar para identificar tales secuencias que tienen similaridad de secuencia sustancial a las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d_ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), e Innis y colaboradores (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York) . Las secuencias de codificación aisladas basadas en su identidad de secuencia a las secuencias de codificación inventivas enteras, expuestas en la presente o a fragmentos de las mismas, están comprendidas en la presente invención. Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden preparar mediante la síntesis química directa por métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang y colaboradores, Meth. Enzi ol .68 : 90-99 (1979); el método fosfodiester de Brown y colaboradores, Meth Enzymol. 68:109-151 (1979); el método de dxetilfosforamidita de Beaucage y colaboradores, Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981); el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra, Letts. 22 (20) :1859-1862 (1981), por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado, por ejemplo, como es descrito en Needham-VanDevanter y colaboradores, Nucleic Acids Res, 12:6159-6168 (1984); y, el método de soporte sólido de la patente norteamericana No. 4,458/066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de una sola hebra. Este se puede convertir en DNA de doble hebra mediante la hibridización con una secuencia complementaria o mediante la polimerización con una polimernsa de DNA utilizando la única hebra como un patrón. Un experto reconocerá que mientras la síntesis química del DNA es limitada a las secuencias de aproximadamente 100 bases, secuencias más largas se pueden obtener mediante la ligación de secuencias más cortas . Los ácidos nucleicos de la presente invención incluyen aquellos amplificados utilizando los siguientes pares cebadores: SEQ ID NOS: 26 y 27. CASETES DE EXPRESION En otra modalidad, se proporcionan casetes de expresión que comprenden ácidos nucleicos aislados de la presente invención. Un cásete de expresión típicamente comprenderá un polinucleótido de la presente invención operablemente enlazado a secuencias reguladoras de iniciación transcripcionales que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped propuesta, tales como tejidos de una planta transformada. La construcción de tales casetes de expresión que puede ser empleada en conjunción con la presente invención, es bien conocida para aquellos expertos en la técnica en vista de la presente descripción. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores; Molecular Cloñing: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, New York; (1989); Gelvin y colaboradores; Plant Molecular Biology Manual (1990); Plant Biotechnology: Commercial Prospecte and Problems, eds. Prakash y colaboradores; Osford & IBH Publising Co.; New Delhi, India; (1993); y Heslot y colaboradores; Molecular .Biology and Genetic Engineering of Yeasts; CRC Press, Inc., USA; (1992); cada una incorporadas en la presente en su totalidad por referencia . Por ejemplo, los vectores de expresión de planta puede incluir (1) un gen de planta clonado bajo el control transcripcional de la secuencia reguladora 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de planta también pueden contener, si es deseado una región reguladora promotora, (por ejemplo, una que confiere expresión inducible, constitutiva, .regulada ambientalmente o desarrolladamente o especifica/selectiva de la célula o tejido (un sitio de partida de iniciación de transcripción, un sitio de enlace de ribosoma, una señal de procesamiento de RNA, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadelinación. Se pueden emplear promotores constitutivos, preferidos del tejido inducibles. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el virus de mosaico de coliflor (CaMV) región de iniciación de transcripción 35S, el promotor 1' o 2' derivado de T-DNA de Agrobacteríum turnefaciens, el promotor de actina, el promotor de ubiquitina, el promotor de histona H2B (Nakayama y colaboradores, 1992) FEBS Lett 30:167-170), el promotor Smas, el promotor de de idrogenasa de alcohol cinamilico (patente norteamericana No. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor pEmu, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de plantas conocidas en la técnica. Ejemplos- de promotores inducibles son el promotor Adhl que es inducible por estrés por hipoxia o frió, el promotor Hsp70 que es inducible por estrés por calor, el promotor PPDK que es inducible por luz, el promotor In2 que es inducido por safener, el promotor ERE que es inducido por estrógeno y el promotor Pepcarboxilasa que es inducido por luz . Ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción preferencialmente en ciertos tejidos, tales como hojas, raices, frutos, polen, semillas o flores. Un promotor ejemplar es el promotor especifico de antera 5126 (patentes norteamericanas Nos. 5,689,049 y 5,689,051). Ejemplos de promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a promotor de gamma zeina 27 kD y promotor ceroso, (Boronat, A., y colaboradores, Plant Sci. 47:95-102 (1986); Reina, M. , y colaboradores, Nucleic Acids Res. 18(21): 6426 (1990); Kloesgen, R.B., y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 203:237-244 (1986)/ asi como los promotores globulina 1, oleosina y faseolina. Las descripciones de cada uno de estos son incorporados, en la presente por referencia en su ' totalidad. El promotor Nucí de cebada o maíz, el promotor Ciml de maíz o el promotor LTP2 de maíz se pueden utilizar para expresar preferencialmente en la núcela. Ver, por ejemplo WO 00/11177, la descripción de la cual es incorporada en la presente por referencia. Cualquiera de los promotores heterólogos o no heterólogos (es decir, endógenos) se pueden emplear para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. Estos promotores también se pueden utilizar, por ejemplo, en casetes de expresión para inducir la expresión de ácidos nucleicos antisentido para reducir, incrementar o alterar la concentración y/o composición de las proteínas de la presente invención en un tejido deseado. Si se desea la expresión de polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de polinucleótido . La región de poliadenilación puede ser derivada del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-DNA. La secuencia de extremo 3' a ser adicionada puede ser derivada de, por ejemplo, los genes de sintasa nopalina o sintasa octopina, o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariótico. Una secuencia de intrón puede ser adicionada a la región no traducida 5' o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula. Ver, por ejemplo Buch an y Berg, Mol. Cell Biol. 84395-4405 (1988); Callis y colaboradores, Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). El uso de intrones de maiz Adhl-S intrón 1,2, y 6, el intrón Bronze-1-son conocidos en la técnica. Ver generalmente, 2¾e Maize Handbook, Chapter 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1994) . El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente ¦ invención típicamente comprenderá un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en las células de plantas. Usualmente, el gen marcador seleccionable codifica la resistencia al antibiótico o al herbicida. Los genes adecuados incluyen a aquellos que codifican para la resistencia a los antibióticos, espectinomicina y estreptomicina {por ejemplo, el gen aada),el gen la fosfotransferasa estreptomicina (SPT) que codifica para la resistencia a la estreptomicina, el gen fosfotransferasa neomicina ( PTII) que codifica para la resistencia a la canamicina o geneticina, el gen fosfotransferasa higromicina (HPT) que codifica para la resistencia a la higromicina. Genes adecuados que codifican para la resistencia a herbicidas incluyen aquellos que actúan para inhibir la acción de la sintasa acetolactato (ALS) , en particular los herbicidas del tipo sulfonilurea, (por ejemplo, el gen sintasa acetolactato (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , aquellas que actúan para inhibir la acción de la sintasa glutamina, tal como, fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes de tal clase conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta y al gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorsulfuron. Vectores típicos útiles para la expresión de ' genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers y colaboradores, Meth. In Enzymol. 153:253-277 (1987). Vectores de A. tumefaciens ejemplares útiles en la presente son los plásmidos p YLX6 y pKYLX7 de Schardi y colaboradores, Gene 61:1-11 (1987) y Berger y colaboradores, Pxoc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8402-8406 (1989). Otro vector útil en la presente es el plásmido de pBI101.2 que es disponible de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . Una variedad de virus de planta que pueden ser empleados como vectores, son conocidos en la técnica e incluyen el virus de mosaico de coliflor (CaMV) gemivirus, virus de mosaico de bromo, y virus del mosaico del tabaco. Un polinucleotido de la presente invención se puede expresar en la orientación ya sea de sentido o antisentido, como sea deseado. En las células de plantas, 'se ha mostrado que el RNA antisentido inhibe la expresión del gen al prevenir la acumulación de RNA que codifica la enzima de interés, ver, por ejemplo, Sheehy y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8805-8809 (1988); y Hiatt y colaboradores, patente norteamericana No. 4,801,340. Otro método de supresión es la supresión de sentido. La introducción del ácido nucleico configurado en la orientación de sentido ha sido mostrada que es un medio efectivo mediante el cual bloquear la transcripción de los genes objetivo. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de los genes endógenos ver, Napoli y colaboradores, The Plant Cell 2:279-289 (1990) y la patente norteamericana No. 5,034,323. El trabajo reciente ha mostrado la supresión con el uso del RNA de doble hebra, tal trabajo es descrito en Tabara y colaboradores, Science 282:5388:430-431 (1998), WO 99/53050 Las moléculas de RNA catalíticas o ribozimas también pueden ser utilizadas para inhibir la expresión de los genes de plantas . La inclusión de las secuencias de ribozimas dentro de los RNA antisentido confiere la actividad de segmentación de RNA en estos, incrementando de esta manera la actividad de las construcciones . El diseño del uso de los ribozimas específico de RNA objetivo es descrito en Haseloff y colaboradores, Nature 334:585-591 (1988). Una variedad de agentes de reticulación, agentes de alquilación y especies de generación de radicales como grupos pendientes en polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para enlazar, etiquetar, detectar y/o segmentar ácidos nucleicos. Por ejemplo, Vlassov, V. V., y colaboradores, Nucleic Acids Res (1986) 14:4065-4076, describe el enlace covalente de un fragmento de DNA de una sola hebra con derivados de alquilación de nucleótidos complementarios a la secuencias subjetivo. Un reporte de trabajo similar del mismo grupo es aquel por Knorre, D.G., y colaboradores, Biochlmie (1985) 67:785-789. Iverson y Dervan también mostraron la segmentación específica de la secuencia del DNA de una sola hebra mediado por la incorporación de un nucleótido modificado que fue capaz de activar la segmentación. Meyer, R.B., y colaboradores, J. Jim. Chem. Soc. (1989) 111:8517-8519, efectúan la reticulación covalente a un nucleótido objetivo utilizando un agente de alquilación complementario a la secuencia de nucleótidos subjetivo de una sola hebra. Una reticulación fotoactivada a oligonucleótidos de una sola hebra mediada por psoralen fue descrita por Lee, B.L., y colaboradores, Biochemistry (1988) 27:3197-3203. El uso de la reticulación en sondas de formación de triple hélice también fue descrito por Home y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. (1990) 112:2435-2437. El uso de N4, N4-etanocitosina como un agente de alquilación para reticular a oligonucleótidos de una sola hebra también ha sido descrito por Webb y Matteucci, J. Am. Chem. Soc. (1986) 108:2764-2765; Nucleíc Acids Res (1986) 14:7661-7674; Feteritz y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 113:4000 (1991) . Varios compuestos que enlazan, detectan, etiquetan y/o segmentan ácidos nucleicos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,543,507 5,672,593; 5,484,908; 5,256, 648; y 5, 681, 941. AFILAMIENTO DE GENES O RASGOS En ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden apilar mediante cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con algunos otros polinucleótidos de la presente invención, tal como alguna combinación de IPPKs (SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22 y 24), o con otros genes implicados en las rutas metabólicas del ácido fitico tal como la fitasa; Lpal, Lpa2 (ver las patentes norteamericanas Nos. 5,689,054 y 6,111,168); sintasa 1- fosfato mio-inositol (MI1PS) , quinasas 1, 3, -trifosfato 5/6 inositol (ITPKs) y monofosfatasa mió inositol (IMP) (ver la Solicitud Provisional norteamericana número de Serie 60/325,308 presentada el 27 de septiembre de 2001, y WO 99/05298 y similares, las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Las combinaciones generadas también pueden incluir 'copias múltiples de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser apilados con algún otro gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos deseados incluyéndose pero no limitados a rasgos deseables para el alimento para animales tales como genes de alto contenido de aceites (por ejemplo, patente norteamericana No. 6,232,528); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. 5,990,389, . 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,409); cebada de alto contenido de lisina ( illiamson y colaboradores (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122); y proteínas de alto contenido de metionina (Pedersen. y colaboradores (1986) J. Blol. Chem, 261:6279; Kirihara y colaboradores (1988) Gene 71:359; y Musumura y colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digeribilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento ¦ modificadas) (Solicitud. Provisional norteamericana número de Serie 60,246,455, presentada el 11 de noviembre de 2000); y tiorredoxinas (Solicitud Provisional norteamericana número de Ser: e 60/250,705, presentada el 12 de diciembre de 2000)), la descripción de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser apilados con rasgos deseables para resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringíensis (patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5, 723, 756; .5, 593, 881; Geiser y colaboradores (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme y colaboradores (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de detoxificación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); avirulencia y genes de resistencia a la enfermedad (Jones y colaboradores (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores (1994) Cell 78;1089); mutantes de sintasa acetolactato (ALS) que conducen a la resistencia al herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de sintasa glutamina tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar); y resistencia al glifosato (gen EPSPS)); y rasgos deseables para el procesamiento o productos de proceso tales como de alto contenido de aceite (por ejemplo, patente norteamericana No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de desaturasa de ácido graso (patente norteamericana No, 5,952,544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPase) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SBE) y enzimas de desramificación de almidón (SDBE) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente norteamericana No, 5,602,321; beta-cetotiolasa, sintasa polihidroxibutirato, y reductasa acetoacetil-CoA (Schubert y colaboradores (1988) J. Bacteríol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de poli idroxialcanoatos (PHAs)), la descripción de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que proporcionan rasgos agronómicos tales como la esterilidad del macho, (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5,583,210), resistencia del peciolo, tiempo de florecimiento, o rasgos de tecnología de transformación tal como la regulación del ciclo celular o la dirección del gen (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), la descripción de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas se pueden crear mediante cualquier método que incluye, pero no limitado a la reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross, o transformación genética. Si los rasgos' son -apilados al transformar genéticamente las plantas, las secuencias de polinucleótido de interés se puede combinar en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más rasgos deseados puede ser utilizada como el objetivo paran introducir rasgos adicionales mediante la transformación subsecuente. Los rasgos se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si dos secuencias serán introducidas, las dos secuencias pueden ser contenidas en cásete de transformación separados (trans) o contenidas en el mismo c sete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias puede ser inducida por el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o cásete de sobreexpresión para generar la acumulación deseada de rasgos en la planta. PROTEINAS Las proteínas IPPK son una clase de proteínas en el · metabolismo de fosfato inositol que están todas involucradas en la fosforilación de sus sustratos de fosfato inositol apropiados, incluyéndose, pero no limitados a, IP2, IP3, IP4, e IP5, utilizando ATP- como el donador de fosfato. Las secuencias de la presente invención tienen omologia a un dominio de porción de enlace de fosfato inositol conservado, mostrado en SEQ ID NO:29. El análisis de las secuencias de polipéptido de la presente invención revela los dominios consensúales mostrados en SEQ ID NOS: 30-37. Se espera que la modulación de la expresión de esas proteínas de la presente invención proporcionará métodos para mejorar la calidad del alimento para animales al reducir el nivel de fitato y/o al incrementar el nivel de fósforo biodisponible . La reducción de los niveles de fitato también debe dar por resultado menos contaminación del medio ambiente por fósforo en los desechos de animales no rumiantes. Las proteínas de la presente invención incluyen proteínas que tienen las secuencias descritas así como proteínas codificadas por los polinucleótidos descritos. Además, las proteínas de la presente invención incluyen proteínas derivadas de la proteína nativa por supresión, adición o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de proteína nativa. Algunas variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido pueden ser preparadas mediante las mutaciones en las secuencia de DNA clonada que codifica la proteina nativa de interés. Métodos para la mutagénesis y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publising Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82 : 88- 92; Kunkel y colaboradores (1987) Methods Enzimol. 154:367-382; Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); patente norteamericana No, 4,873,192; y las referencias citadas en las mismas; incorporadas en la presente por referencia. La guia para las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteina de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff y colaboradores (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res.' Found., Washington, D.C.), incorporada e la presente por referencia. Las sustituciones conservativas, tal como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser preferidas. En la construcción de variantes de las proteínas de interés, las modificaciones a las secuencias de nucleótidos que codifican las variantes pueden generalmente ser hechas de tal manera que las variantes continúan conservando la actividad deseada.
Las proteínas aisladas de la presente invención incluyen un polipéptido que comprende por lo menos 25 aminoácidos contiguos codificados por cualquiera de los ácidos nucleicos de la presente invención, o polipéptidos que son variantes conservativamente modificadas de los mismos. Las proteínas de la presente invención no variantes de las mismas pueden comprender cualquier número de residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido de la presente invención, en donde ese número es seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 25 al número de residuos en un polipéptido de longitud completa de la presente invención. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoácidos contiguos es de por -lo menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 aminoácidos en longitud. La presente invención incluye polipéptidos catalíticamente activos (es decir, enzimas) . Los polipéptidos catalíticamente activos generalmente tendrán actividad específica de por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% que del polipéptido endógeno nativo (no sintético) . Además, la especificidad de sustrato (kCa Km) es opcionalmente de manera sustancial similar al polipéptido endógeno nativo (no sintético) . Típicamente, la m será de por lo menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% que del polipéptido endógeno nativo (no sintético) . Los métodos para analizar y cuantificar medidas de actividad enzimática y especificidad de sustratos (kcat/Km)/ son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Segel, Biochemical Calculations, 2a ed., John Wiley y Sons, New York (1976). La presente invención incluye modificaciones que se pueden hacer a una proteina inventiva. En particular, puede ser deseable disminuir la actividad del gen. Se pueden hacer otras modificaciones para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula objetivo en una' proteina de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina adicionada en el amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poly His) colocados en cualquier terminal para crear sitios de restricción convenientemente localizados o codones de terminación o secuencias de purificación. Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteina de la presente invención en células recombinantemente diseñadas tales como células de bacteria, levadura, insecto, mamífero o planta. Las células producen la proteina en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, localización, y/o tiempo) , debido a que se han alterado genéticamente a través · de la intervención humana para hacerlo de esta manera. Típicamente, una célula huésped intermedia puede ser utilizada en la práctica de esta invención para incrementar el número de copias del vector de clonación. Con un número de copias incrementado, el vector que contiene el gen de interés puede ser aislado en cantidades significantes para la introducción en las células de planta deseadas. Las células huésped que pueden ser utilizadas en la práctica de esta invención incluyen procariotes y eucariotes. Los procariotes incluyen huéspedes bacterianos tales como Eschericia coli, Salmonella typhimurium, y Serratia marcescens. Los huéspedes eucarióticos tales como levadura, células de insecto u hongos filamentosos también pueden ser utilizados en esta invención. Las secuencias de control procariótico comúnmente utilizados incluyen tales promotores comúnmente utilizados como los sistemas promotores de beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang y colaboradores, Nature 198:1056 (1977)), el sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddeí y colaboradores, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) y el promotor PL derivado de lambda y el sitio de enlace de ribosoma de N-gen (Shimatake y colaboradores, Nature 292:128 (1981)). La inclusión de marcadores de selección en los vectores de DMA. transfectados en E. coli también és útil. Ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican la resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. El vector es seleccionado para permitir la introducción en la célula huésped apropiada. Vectores bacterianos son tipicamente de origen de plásmido o fago. Los sistemas de expresión para expresar una proteina de la presente invención son disponibles utilizando Bacillus sp. Y Salmonella (Palva y colaboradores, Gene 22:229.235 (1983); Mosbach y colaboradores, Nature 302:543-545 (1983)). La síntesis de proteínas heterologas en levadura es bien conocida. Ver Sherman, F., y colaboradores., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) . Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharomices cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomices y Pichia pastoris son conocidos en la técnica y disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen) . Los vectores adecuados usualmente tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, incluyéndose quinasa 3^-fosfoglicerato u oxidasa de alcohol, y un origen de secuencias de terminación, replicación y similares, como sea deseado. El sistema de expresión baculovirus (BES) es un sistema de expresión ayudante-independiente eucariótico que se ha utilizado para expresar cientos de genes extraños (Lucko , V., Ch. 4 "Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors" in Recombinant DNA Technology and Applications, A. Prokopet y colaboradores, Eds. McGraw, Inc. (1991); Luckow, V.,, Ch. 10 "Insect Expression Technology" in Principies & Practice of Protein Engineering, J.L. Cleland and C.S. Craig, EDS. John Wiley & Sons, (1994) ) . Los baculorivus recombinantes son generados al insertar el gen particular o los genes de interés en el genoma de baculovirus utilizando protocolos establecidos con vectores y reactivos de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen, Life Technologies Incorporated) . Los vectores comerciales son fácilmente disponibles con varios promotores, tales como polihedrina y plO, secuencias de señal opcionales para la secreción de proteína, o residuos de actividad, tal como 6X histidina. Estos virus recombinantes son cultivados, mantenidos y propagados en líneas de células comercialmente disponibles derivadas de varias especies de insectos incluyéndose Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni. Las células de insecto pueden ser cultivadas utilizando protocolos bien establecidos en una variedad de diferentes medios, por ejemplo, con y sin suplementación de suero bovino. Las células cultivadas son infectadas con los virus recombinantes y es expresado el polipéptido del gen de interés. Las proteínas expresadas con el sistema de baculovirus se han caracterizado extensivamente y, en muchos casos, sus modificaciones postrasduccionales tales como fosforilación, acilación, etc., son idénticas a la proteína nativamente expresada. Una proteina de la presente invención, una vez expresada, puede ser aislada de las células al lisar las células y al aplicar técnicas de aislamiento de proteina estándares a los lisados. La inspección del proceso de purificación se puede realizar al utilizar técnicas de manchado de Western o radioinmunoensayo u otra técnica de inmunoensayo estándar. También están disponibles casetes de expresión los cuales dirigen la proteina expresada al ser secretada de la célula al medio. En estos casos, la proteina expresada puede ser purificada del medio de crecimiento de la célula utilizando técnicas de purificación de proteina estándares . Las proteínas de la presente invención también se pueden construir utilizando métodos sintéticos no celulares. Las síntesis en fase sólida de proteínas de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud se puede realizar al unir el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido por ¦ la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia. Las técnicas para la síntesis en fase sólida son descritas por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, pp. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods en Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield y colaboradores, J. Ara. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), y Stewart y colaboradores, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Las proteínas de longitud más grande pueden ser sintetizadas mediante la condensación de las terminales amino y carboxi de fragmentos más cortos. Métodos para formar el ácido de péptido por la activación de un extremo terminal de carboyi (por ejemplo, mediante el uso del reactivo de acoplamiento N, N' -diciclohexilcarbodiímida) ) son conocidos para aquellos expertos . Las proteínas de esta invención, recombinantes o sintéticas se- pueden purificar a la pureza sustancial mediante técnicas estándares bien conocidas en la técnica, incluyéndose la solubilización en detergente, precipitación selectiva con tales sustancias como sulfato de amonio, cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación y otros. Ver, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990) . Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser resaltados a las proteínas como es descrito en la presente. La purificación de E. coli se puede obtener siguiendo los procedimientos descritos en la patente norteamericana No. 4,511,503. La detección de la proteína expresada se obtiene mediante métodos conocidos en la técnica e incluyen, por e emplo, radioinmunoensayos, técnicas de manchado de Western o inmunoprecipitación. La presente invención además proporciona un método para modular (es decir, incrementar o disminuir) la concentración o composición de los polipéptidos de la presente invención en una planta o parte de la misma. La modulación se puede efectuar al incrementar o disminuir la concentración y/o la composición (es decir, la relación de los polipéptidos de la presente invención) en una planta. El método comprende transformar una célula de planta con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención, para obtener una célula de planta transformada, cultivar la célula de planta transformada bajo condiciones que permiten la expresión del polinucleótido en una célula de planta en una cantidad suficiente para modular la concentración y/o la composición en la célula de planta. En algunas modalidades, el contenido y/o composición de polipéptidos de la presente invención en una planta se puede modular al alterar, in vivo o in vitro, el promotor de un gen no aislado de la presente invención para sobre- o sub-regular la expresión de gen. En algunas modalidades, las regiones de codificación de genes nativos de la presente invención se pueden alterar via la sustitución, adición, inserción o supresión para disminuir la actividad de la enzima codificada. Ver, por ejemplo, Kmiec, patente norteamericana No. 5,565,350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868. Un método de sub-regulación de la proteina involucra utilizar secuencias de PEST que proporcionan un objetivo para la degradación de la proteina. En algunas modalidades, un ácido nucleico aislado
(por ejemplo, un vector) que comprende una secuencia promotora es transfectada a una célula de planta. Subsecuentemente, una célula de planta que comprende el promotor operablemente enlazado a un polinucleótido de la presente invención es seleccionada por medios conocidos para aquellos expertos en la técnica tales como, pero no limitados a, manchado de Southern, secuenciación de DNA, o análisis de PCR utilizando cebadores especificos al promotor y al gen y detectando amplicones producidos de los mismos . Una planta o parte de planta alterada o modificada por las modalidades anteriores es cultivada bajo condiciones de formación de planta durante un tiempo suficiente para modular la concentración y/o composición de los polipéptidos de la presente invención en la planta. Las condiciones de formación de planta son bien conocidos en la técnica. En general, el contenido del polipéptido es incrementado o disminuido por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a una planta de control nativa, parte de planta o célula que carece del cásete de expresión mencionado anteriormente. La modulación en la presente invención puede surgir durante y/o subsecuente al cultivo de la planta a la etapa- deseada de desarrollo. La modulación de la expresión de ácido nucleico temporalmente y/o en particular tejidos puede ser controlado al emplear el promotor apropiado operablemente enlazado a un polinucleótido de la presente invención en, por ejemplo, la orientación de sentido o antisentido como es discutido en mayor detalle, supra. La inducción de la supresión d un polinucleótido de la presente invención también puede ser controlada mediante la administración exógena de una cantidad efectiva de compuesto inductor. Los promotores inducibles y compuestos inductores que activan la expresión de estos promotores son bien conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los polipéptidos de la presente invención son modulados en monocotiledóneas o dicotiledóneas, por ejemplo, maiz, soya, girasol, cártamo, sorgo, cánola, trigo, alfalfa, arroz, cebada y mijo. Los medios para detectar las proteínas de la presente invención no son aspectos críticos de la presente invención. Las proteínas pueden ser detectadas y/o cuantificadas utilizando cualquiera de un número de ensayos de enlace inmunológico-reconocidos (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; y 4,837,168). Para una revisión de los inmunoensayos generales ver también Methods in Cell Biology, Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Ed., Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, Eds. (1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención se pueden realizar en cualquiera de varias configuraciones, por ejemplo aquellos revisados en Enzyme Imunoassay, Maggio, Ed., CRC Press, _ Boca Ratón, Florida (1980); Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1985) ; Harlow and Lañe, supra; Immunoassay: A Practical Guide, Chan, Ed., Academic Press, Orlando, FL (1987); Principies and Practice of Immunoassays, Price and Newmañ Eds., Stockton Press, NY (1991); and Non-isotopic Immunoassays, Ngo, Ed., Plenum Press, NY (1988). Métodos típicos incluyen el análisis de manchado de Western (inmunomanchado) , métodos bioquímicos analíticos tal como la electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de capa delgada (TLC), cromatografía de hiperdifusión, y similares, y varios métodos inmunológicos tal como las reacciones de precipitina en fluido o en gel, i munodifusión, (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIAs), ensayos inmunosorbentes enlazados a la enzima (ELISAs), ensayos inmunofluorescentes, y similares. Las etiquetas no radioactivas frecuentemente son unidas por medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) es covalentemente enlazada a la molécula. El ligando luego enlaza a una molécula antiligando (por ejemplo, est eptavidina) que es ya sea inherentemente detectable o covalentemente enlazada a un sistema de —señal, tal - como — una enzima detectable, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente. Un número de ligandos y antiligandos puede ser utilizado. Cuando un ligando tiene un antiligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina, y cortisol, éste se puede utilizar en conjunción con los antiligandos que surgen de manera natural etiquetados. Alternativamente, cualquier compuesto hapténico o antigénico puede ser utilizado en combinación con un anticuerpo. Las moléculas también pueden ser conjugadas directamente a compuestos de generación de señal, por ejemplo, mediante la conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como etiquetas principalmente serán hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidoreductasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, etc. Los compuestos quimiluminicentes incluyen luciferina, y 2, 3-dihidroftalazinedionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de varios sistemas de producción de señal o etiquetación que pueden ser utilizados, ver, la patente norteamericana No. 4,391,904, la cual es incorporada en la presente por referencia. Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de componentes etiquetados. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación -se- pueden utilizar _ para detectar la presencia de los anticuerpos objetivo. En este caso, las particulas recubiertas con antigeno son aglutinadas por. muestras que comprenden los anticuerpos obj tivo. En este formato, ninguno de los componentes necesita ser etiquetado y la presencia del anticuerpo objetivo es detectada por simple inspección visual . Las proteínas de la presente invención se pueden utilizar para identificar compuestos que enlazan a (por ejemplo, sustratos), y/o incrementan o disminuyen (es decir, modulan) la actividad enzimática de polipéptidos catalíticamente activos de la presente invención. El método comprende poner en contacto un polipéptido de la presente invención con un compuesto cuya habilidad para enlazar a, o modular, la actividad de la enzima va a ser determinada. El polipéptido empleado tendrá por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la actividad específica del polipéptido de longitud completa, nativo de la presente invención (por ejemplo, enzima) . Los métodos para medir la cinética de la enzima son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Segel, Biochemical Calculations, 2a ed., John Wiley and Sons, New York (1976) . Los anticuerpos pueden ser resaltados a una prote na de la presente invención, incluyéndose variantes individuales, alélicas, de cepa o especies, o variantes de los mismos,- ambas en sus formas que surgen de manera natural., (longitud completa) en formas recombinantes . Adicionalmente, los anticuerpos son resaltados a estas proteínas en cualquiera de sus configuraciones nativas o en configuraciones no nativas . Los anticuerpos anti-idiotipicos también pueden ser generados. Muchos métodos para elaborar anticuerpos son conocidos para las personas expertas . En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de técnicas para la preparación de tales anticuerpos monoclonales son encontradas en, ¦ por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 4a ed., Stites y colaboradores, Eds., Lange Medical Publications. Los Altos, CA, y las referencias citadas en las mismas; Harlo y La e, Supra^oding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2* Ed., Academic Press, New York, NY (1986); y Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Otras técnicas adecuadas involucran la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fago o similares (ver, por ejemplo, Huse y colaboradores, Science 246:1275-1281 (1989); y Ward y colaboradores, Nature 341:544-546(1989); y Vaughan y colaboradores, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad pueden ser obtenidos de ratones transgénicos que, comprenden fragmentos,.del sitio Ig de cadena pesada y ligera humana sin nuevo arreglo (es decir, mini sitio de ratones transgénicos) . Fishwild y colaboradores, Nature Biotech. 14:845-851 (1996) . También, se pueden producir inmunoglubulinas recombinantes . Ver, Cabilly, patente norteamericana No. 4,816,567; y Queen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033 (1989) . Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar para la cromatografía de afinidad en aislar proteínas de la presente invención, para clasificar bibliotecas de expresión para · productos de expresión particulares tal como la proteína normal o anormal o para resaltar anticuerpos antiidiotípicos que son útiles para detectar o diagnosticar varias condiciones patológicas relacionadas con la presencia de los antígenos respectivos. Frecuentemente, las proteínas y anticuerpos de la presente invención se pueden etiquetar al unir, ya sea covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación son conocidas y son reportadas extensivamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las etiquetas adecuadas incluyen radionucleótidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones
- -quimilum-iniscentes,^ partículas—magnéticas y_si.milares . . _ TR-USTSFOFMACION DE CELULAS El método de transformación no es crítico para la presente invención; varios métodos de transformación son actualmente disponibles . A medida que métodos más recientes son disponibles para transformar cultivos u otras células huésped, ellos pueden ser aplicados directamente. Por consiguiente, se ha desarrollado una amplia variedad de métodos para insertar una secuencia de DNA en el genoma de una célula huésped para obtener la transcripción y/o traducción de la secuencia para efectuar los cambios fenotípicos en el organismo. Así, cualquier método que proporcione la transformación y/o transfección eficiente puede ser empleado. Una secuencia de DNA que codifica para el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un cDNA o una secuencia genómica que codifica una proteína de longitud completa, puede ser utilizada para construir un cásete de expresión que puede ser introducido en la planta deseada. Los . ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden introducir en plantas de acuerdo con técnicas conocidas en el arte. Generalmente, se preparan casetes de expresión como es descrito anteriormente y adecuados para la transformación de células de planta. Las técnicas para la transformación de una amplia variedad de especies de-plantas superiores son bien conocidas y descritas en la literatura técnica científica y de patentes. Ver, por ejemplo, Weising y colaboradores, Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Por ejemplo, la construcción de DNA se puede introducir directamente en el DNA genómico de la célula de planta utilizando técnicas tales como electroporación, poración de PEG, bombardeo de partículas, suministro de fibra de silicio o microinyección de protoplastos de célula de planta o callo embriogénico. Ver, por ejemplo, Tomes y colaboradores, Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microproyectile Bombardment. Pp 197-213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Eds. 0:L: Gamborg and G.C. Phillips, Springer-Verlag Berlín Heidelberg New York, 1995. Alternativamente, las construcciones de DNA se pueden combinar con regiones flanqueantes de T-DNA adecuadas de intrones y se pueden introducir en un vector huésped de Agrobacterium turnefaciens convencional. Las funciones de' virulencia del huésped Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y el marcador adyacente en el DNA de la célula de planta, cuando la célula es infectada por las bacterias. Ver, la patente norteamericana No. 5,591,616. La introducción de construcciones de DNA utilizando la precipitación de polietilenglicol es descrita en Paszkowski y colaboradores, Ebo. 3:2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación son descritas en Fromm y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82:5824 (1985). Las técnicas de transformación balística son descritas en Klein y colaboradores, Nature 327:70-73 (1987). Las técnicas de transformación mediadas con Agrobacterium tumefaciens son bien descritas en la literatura científica. Ver, por ejemplo Horsch y colaboradores, Science 233:496-498 (1984), y Fraley y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 80:4803 (1983). Por ejemplo, la transformación por Agrobacterium del maíz es descrita en la patente norteamericana 5,981,840. La transformación por Agrobacterium de la soya es descrita en la patente norteamericana No. 5,563,055. Otros métodos de transformación incluyen (1) la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes (ver, por ejemplo, Lichtenstein y Fuller en: Genetic Engíneering, Vol. 6,P.W.J. Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, CP. y Draper, J. en: DNA Cloning, Vol. II, D.M. Glover, Ed., Osford, IRI Press, 1985), solicitud PCT/US87/02512 (WO 88/02405 publicada el 7 de Abril de 1988) describe el uso de la cepa A4 de A. rhizogenes y su plásmido Ri junto con los vectores pARC8 o pARC16 de A. tumefaciens (2) captación de DNA mediada por liposoma (ver, por ejemplo, Freeman y colaboradores, Plant Cell Physiol. 25:1353 (1984)), y (3) el método de formación de vórtice (ver, por ejemplo, Kindle, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:1228 (1990)). DNA también puede ser introducido en plantas mediante la transferencia de DNA directa en polen como es descrito por Zhou y colaboradores, Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol. , 107:367 (1987); Luo y colaboradores, Plant Mol. Biol. Repórter, 6:165 (1988). La expresión de polipéptido que codifica polinucleótidos puede ser obtenida mediante la inyección del DNA en los órganos reproductores de una planta como es descrito por Pena y colaboradores, iVature, 325:274 (1987). DNA también puede ser inyectado directamente en las células de embriones inmaduros y la rehidratación de embriones desecados como es descrito por Neuhaus y colaboradores, Theor. Appl. Genet. 75:30 (1987); y Benbrook y colaboradores, in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass, pp. 27-54 (1986). Las células huésped de animales y eucarióticas inferiores (por ejemplo, levadura) son competentes o se hacen competentes para la transformación por diversos medios. Existen varios métodos bien conocidos para introducir DNA en células de animales. Estos incluyen: la precipitación de fosfato de calcio, fusión de las células recibidoras con protoplastos bacterianos que contiene el DNA, tratamiento de las células recibidoras con liposomas que contiene el DNA, DEAE dextrano, electropcración, biolistica, y microinyección del DNA directamente en las células. Las células tran-sfectadas son cultivadas por medios bien conocidos en el arte. Kuchler, R.J., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977) . REGENERACION DE PLANTA TRANSGENICA Las células de plantas transformadas que son derivadas mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden ser . cultivadas para regenerar una planta entera que posee el genotipo transformado. Tales técnicas de regeneración frecuentemente dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, que depende típicamente de un marcador de biocida y/o herbicida que se ha introducido conjuntamente con un polinucleótido de la presente "invención. Para la transformación y regeneración del maíz ver, Gordon-Kamm y colaboradores, The Plant Cell 2:603-618 (1990) . Las células de plantas transformadas con un vector de expresión de planta pueden ser regeneradas, por ejemplo, de células individuales, tejido de callo o discos de hojas de acuerdo con las técnicas de cultivo de tejido de planta estándares. Es bien conocido en la técnica que varias células, tejidos y órganos de casi cualquier planta, pueden ser cultivadas subsecuentemente para regenerar una planta entera. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados es descrita en Evans y colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company, New York, pp. 124-176 (1983); y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Ratón, pp. 21-73 (1985) . La regeneración de plantas que contiene el gen extraño introducido por Agrobacterium, puede ser obtenida como es descrito por Horsch y colaboradores, Science, 227:1229-1231 (1985) y Fraley y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803 (1983). Este procedimiento típicamente produce retoños dentro de dos a cuatro semanas y estos retoños transformantes luego son transferidos a un medio inductor de raíz apropiado, que contiene el agente selectivo y un antibiótico para prevenir el crecimiento bacteriano. Plantas transgénicas de la presente invención pueden ser fértiles o estériles. La regeneración también se puede obtener del callo de planta, explantas, órganos, o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee y colaboradores, Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987). La regeneración de plantas de ya sea protoplastos de planta individuales o varias explantas es bien conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Methods fox Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Para el cultivo de célula de maiz y regeneración ver generalmente, The Maize Handbook, Freeling y albot, Eds., Springer, New York (1994); Corn and Corn improvement, 3rd edition, Sprague y Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988) . Un experto reconocerá que después que el cásete de expresión es establemente incorporado en las plantas transgénicas y confirmado que es operable, éste puede ser introducido en otras plantas mediante la cruza sexual. Cualquiera de un número de técnicas de reproducción estándares pueden ser utilizadas, dependiendo de la especie a ser cruzada. En cultivos vegetativamente propagados, plantas transgénicas maduras pueden ser propagadas por la toma de cortes, vía la producción de semilla apomictica, o mediante técnicas de cultivo de tejido para producir múltiples plantas idénticas. La selección de plantas transgénicas deseables se hace y nuevas variedades son obtenidas y propagadas vegetativamente para el uso comercial. En cultivos propagados de semilla, plantas transgénicas maduras pueden ser autocruzadas para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semilla que contiene el ácido nucleico heterólogo recientemente introducido. Estas semillas pueden ser cultivadas para producir plantas que producirían el fenotipo seleccionado. Partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, frutos y similares son incluidas en la invención, siempre y que estas partes comprendan células que comprenden el ácido nucleico aislado de la presente invención. Progenie y variantes, y mutantes de las plantas regeneradas también son incluidos dentro del alcance de la invención, siempre y que estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico introducidas . Plantas transgénicas que expresan un marcador seleccionable pueden ser clasificadas para la transmisión del ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, por las técnicas estándares de inmunomanchado y de detección de DNA. Lineas transgénicas también son típicamente evaluadas en los niveles de expresión del ácido . nucleico heterólogo. La expresión en el nivel de R A puede ser determinada inicialmente para identificar y cuantificar las plantas de expresión positiva. Técnicas estándares para el análisis de RNA pueden ser empleadas e incluir ensayos de amplificación de PCR utilizando cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar solamente los patrones de RNA heterólogos y ensayos de hibridización en solución utilizando sondas especificas de ácido nucleico heterólogo. Las plantas de RNA positivas luego se pueden analizar para la expresión de proteina mediante el análisis de inmunomanchado de Western utilizando los anticuerpos específicamente reactivos de la presente invención. Además, la hibridización in situ y la inmunocitoquimica de acuerdo con los protocolos estándares, se puede hacer utilizando sondas de polinucleótido especifico de ácido nucleico heterologo y anticuerpos,' respectivamente, para localizar sitios de expresión dentro del tejido transgénico. Generalmente, un número de líneas transgénicas son usualmente clasificadas para el ácido nucleico incorporado para identificar y seleccionar plantas con los perfiles de expresión más apropiados . Plantas transgénicas de la presente invención pueden ser homocígotas para el ácido nucleico heterólogo adicionado; es decir, una planta transgénica que contiene dos secuencias de ácido nucleico adicionadas, un gen en el mismo sitio en cada cromosoma de un par de cromosomas . Una planta transgénica homocígota se puede obtener al acoplar sexualmente (igual) una planta transgénica homocígota que contiene un solo ácido nucleico heterólogo adicionado, al germinar algo de la semilla producida y al analizar las plantas resultantes producidas para la expresión alterada de un polinucleótido de la presente invención con relación a una planta de control (es decir, nativa, no transgénica) . La cruza de una planta de origen y la cruza diferente con una planta no transgénica también son contempladas. Alternativamente, la propagación de plantas transgénicas heterocigotas se podria realizar a través de la apomixis. La presente invención proporciona un método para hacer el genotipo de una planta que comprende un polinucleótido de~ la—presente - invención.. Hacer el genotipo proporciona un medio para distinguir homólogos de un par de cromosomas y se puede utilizar para diferenciar segregantes en una población de plantas. Métodos marcadores moleculares se pueden utilizar para estudios filogenéticos, caracterización de relaciones genéticas entre variedades de cultivo, identificación de cruzas o híbridos somáticos, localización de segmentos cromosómicos que afectan los rasgos monogénicos, clonación basada en mapa, y el estudio de la herencia cuantitativa. Ver, por ejemplo, Plant Molecular Blology: A Laboratory Manual, Chapter 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997) . .Para métodos marcadores moleculares, ver generalmente, The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1996 (Chapter 2) en: Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paterson) by Academic Press/R.G. Landis Company, Austin, Texas, pp. 7-21. El método particular para hacer el genotipo en la presente invención puede emplear cualquier número de técnicas analíticas marcadoras moleculares tales como, pero no limitadas a, polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLPs) . Los RFLPs son el producto de diferencias alélicas entre los fragmentos · de restricción de DNA ocasionados por la variabilidad de la secuencia de nucleótidos. Asi, la presente invención además proporciona un medio para seguir la segregación de un gen o ácido nucleico de la presente invención asi como secuencias cromosómicas genéticamente enlazadas a estos genes o ácidos nucleicos utilizando tales técnicas como el análisis de RFLP. Plantas que pueden ser utilizadas en el método de la invención incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Plantas preferidas incluyen maíz, trigo, arroz, cebada, avena, sorgo, mijo, centeno, soya, girasol, cártamo, alfalfa, cánola, algodón, o hierba de césped- Semillas derivadas de plantas regeneradas de células de plantas transformadas, partes de plantas o tejidos de plantas o progenie derivada de las plantas transformadas regeneradas, se pueden utilizar directamente como alimento o comida, o puede presentarse el procesamiento adicional. • Todas las publicaciones citadas en esta solicitud son incorporadas en la presente por referencia, al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específica e individualmente indicada que es incorporada por referencia. La presente invención será descrita adicionalmente por referencia en los siguientes ejemplos detallados. Sin embargo, se entiende, que existen muchas extensiones, variaciones y modificaciones del tema básico de la presente invención más allá de aquel mostrado en los ejemplos y la descripción, que están dentro del espíritu y alcance de la presente invención. Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención llegarán a ser evidentes para aquellos expertos a partir de la siguiente descripción. Sin embargo, se debe entender, que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, mientras . que indican ciertas modalidades de la invención, se dan a manera de ilustración solamente. Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita llegarán a ser fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la lectura de la siguiente descripción y de la lectura de las otras partes de la presente descripción. EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción de la Biblioteca de cDNA A. Aislamiento de RNA Total RNA total se aisló de tejidos de maíz con TRlzol
Reagent (Life Techonology Inc. Gaithersburg, MD) utilizando una modificación del procedimiento de isotiocianato de guanidina/ácido-fenol descrito por Chomczynski y Sacchi (Anal. Biochem. 162, 156(1987)). En resumen, muestras de tejido de planta se pulverizaron en nitrógeno líquido antes de la adición del TRIzol Reagent, y luego se homogenizaron adicionalmente con un mortero y pistilo. La adición de cloroformo seguido por la centrifugación se condujo para la separación de una fase acuosa y una fase orgánica. El RNA total se recuperó por precipitación con alcohol isopropílico de la fase acuosa. B. Aislamiento de Poli (A) + RNA La selección de Poli (A) + RNA del RNA total se realizó utilizando el sistema PolyATract (Promega Corporation, Madison, WI) . En resumen, cebadores oligo(dT) biotinilados se utilizaron para hibridizar a las colas de 3' poli (A) en mRNA. Los híbridos se capturaron utilizando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas y un pedestal de separación magnético. El mRNA se lavó a una condición de alta severidad y se eluyó con agua desionizada libre de RNasa. C. Construcción de la Biblioteca de. cDNA Se realizó la síntesis de cDNA y las bibliotecas de cDNA unidireccionales se construyeron utilizando el SuperScript Plasmid System (Life Techonology Inc. Gaithersburg, MD) . La primera hebra de cDNA se sintetizó al cebar un cebador oligo(dT) que contiene un sitio Not I. La reacción se catalizó por SuperScript Reverse Transcriptase II a 45°C. La segunda hebra de cDNA se marcó con alfa-32P-dCTP y una porción de la reacción se analizó mediante la electroforesis en gel de agarosa para determinar los tamaños de cDNA. Moléculas de cDNA más pequeñas que 500 pares base' y adaptadores no ligados se retiraron mediante la cromatografía en Sep¾acryl-S400. Las moléculas de cDNA seleccionadas se ligaron en el vector pSPORTl entre los sitios Not 1 y Sal 1. Ejemplo 2: Sec enciación y procedimientos de sustracción de cDNA utilizados para los EST' s de maíz A. Preparación del Patrón de Secuenciación Colonias individuales se recolectaron y el DNA se preparó ya sea por PCR con cebadores delanteros M13 y cebadores traseros M13, o por el aislamiento de plásmido . Todos los clones de cDNA se secuenciaron utilizando los cebadores traseros M13. B. Procedimiento de Sustracción con Q-bot Bibliotecas de cDNA sometidas al procedimiento de sustracción se extendieron en placa de agar de 22 x 22 cm2 a una densidad de aproximadamente 3,000 colonias por placa. Las placas se incubaron en una incubadora a 37°C durante 12-24 horas. Las colonias se recolectaron en placas de 384 cavidades mediante un recolector de colonias robótico, Q-bot (GENE IX Limited) . Estas placas se incubaron durante la noche a 37°C. Una vez que se recolectaron suficientes colonias, ellas se aseguraron sobre membranas de nylon de 22 x 22 cm2 utilizando Q-bot. Cada membrana contuvo 9,216 colonias o 36,864 colonias. Estas membranas se colocaron en placas de agar individuales con antibiótico apropiado. Las placas se incubaron a 37°C. durante la noche. Después de que se recuperaron las colonias en el segundo dia, estos filtros se colocaron en papel filtro prehumectado con solución desnaturalizante por cuatro minutos, luego se incubaron en la parte superior de un baño de agua hirviendo por cuatro minutos adicionales . Los filtros luego se colocaron en papel filtro prehumectado con solución neutralizante por cuatro minutos. Después de que se retiró la solución en exceso al colocar los filtros sobre papeles filtros secos durante un minuto, el lado de la colonia de los filtros se colocó en solución de Proteinasa K, se incubaron a 37°C durante 40-50 minutos. Los filtros se colocaron en papeles filtros secos para secar durante la noche. El DNA luego se retículo a la membrana de nylon mediante el tratamiento con luz UV. La hibridización de la colonia se condujo como es descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. , (in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Edition) . Las siguientes sondas se utilizaron en la hibridización de la colonia: 1. Primera hebra de cDNA del mismo tejido dé la cual se hizo la biblioteca para retirar los clones más redundantes .
2. 48-192 clones de cDNA más redundantes de la misma biblioteca basados en los datos de secuenciación previos . 3. 192 clones de cDNA más redundantes en la base de datos de la secuencia de maíz entera. 4. Un oligonucleótido Sal-A20: TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA. AAA AAA, retira los clones que contienen una cola de poli A pero no de cDNA. Ver la SEQ ID NO: 28. 5. Clones de cDNA derivados de rRNA. La imagen de la autorradiografía se exploró en computadora y la intensidad de la señal y las direcciones de la colonia fria de cada colonia se analizaron. El rearreglo de las colonias fías de placas de 384 cavidades a placas de 96 cavidades se condujo utilizando Q-bot. Ejemplo 3: Identificación y aislamiento de los genes IPPK utilizando PCR La ' resencia del polinucleótido IPPK es analizada por PCR utilizando el Roche Expand High Fidelity PCR System comercialmente disponible. El DNA patrón se aisló utilizando el método CTAB del Ejemplo 5C . Los cebadores de las SEQ ID NOS: 26 y 27 se utilizaron para ampliar el gen de interés de varias líneas de maíz. Las concentraciones de solución reguladora y polimerasá se utilizaron como es definido para el kit con las concentraciones de DNA y las condiciones del ciclo como sigue:
Concentraciones de DNA: 500 ng de DNA patrón y cebadores de 0.3 uM en 50 pL de mezcla de reacción de PCR que contiene 200 µ? de dNTPs en solución reguladora y polimerasa proporcionada por el kit Roche. Las condiciones de los termociclos son como sigue: 1 ciclo: desnaturalización 2 min. a 94 °C 10 ciclos: desnaturalización 15 seg. a 9 °C recocimiento 30 seg. a 55°C alargamiento 60 seg. a 68°C 15 ciclos: desnaturalización 15 seg. a 9 °C recocimiento 30 seg. a 55°C alargamiento 60 seg.+ 5 seg. cada ciclo a 68°C 1 ciclo: alargamiento 7 min. a 72°C Los productos de la reacción de PCR se analizaron en geles de agarosa utilizando técnicas de biologia molecular estándares . Ejemplo 4: Construcción del Vector · Todos los , vectores se construyeron utilizando técnicas de biologia molecular estándares utilizadas por aquellos expertos en la técnica (Sambrook y colaboradores, supra) . A. Vectores para la Transformación de Planta Se construyeron vectores para la transformación de planta utilizando ya sea el bombardeo de partículas o los protocolos de transformación de Agrobacteri m. Se construyeron plásmidos al insertar casetes de expresión IPPK, que incluyen lo siguiente: promotor de oleosina: :IPPK: :terminador nos, promotor de oleosina: :intrón de ubiquiton: : IPPK: : terminador nos, o promotor de globulina 1: :IPPK: : terminador de globulina 1, en un plásmido descendente de pSBll que .contiene el cásete de expresión BAR. Ambos de los casetes de expresión IPPK y BAR fueron localizados entre los limites derecho e izquierdo del T-DNA.
• Por ejemplo, la región de codificación IPPK de Zea mays, que incluye el 5' UTR y 3' UTR, se aisló de un clon EST de longitud completa como un fragmento EcoRI/SapI de 1.18 kb. El fragmento se despuntó utilizando Klenow y el fragmento se insertó en la estructura en un sitio EcoRV de un plásmido entre el promotor oleosina y el terminador Nos . La orientación se confirmó utilizando una digestión de enzima de restricción. La unidad de transcripción del promotor de oleosina: : IPPK: : terminador nos es -flanqueada por los sitios BstEII que se utilizaron para extirpar el fragmento e insertarlo en un vector binario que contiene el marcador seleccionable BAR. El cásete IPPK es enlazado al marcador seleccionable entre los limites derecho e izquierdo del T-DNA. Este vector se utilizó para la preparación del inserto para la transformación por pistola de partículas asi como para la generación de los vectores de transformación de Agrobactérium como es descrito enseguida. En este caso, el inserto de DNA para la transformación por pistola de particula se generó al aislar el fragmento Pmel de 6.16 kb del vector. El plásmido pSBll se obtuvo de Japan Tobacco Inc. (Tokio, Japan) . La construcción de pSBll del pSB21 y la construcción de pSB21 de los vectores de partida es .descrita por Komari y colaboradores (1996, Plant J. 10:165-174) . El T-DNA del plásmido se integró en el plásmido superbinario PSB1 (Saito y colaboradores, EP 672 752 Al) mediante la recombinación homologa entre los dos plásmidos . El plásmido pSBl también se obtuvo de Japan Tobacco Inc. Estos plásmidos se utilizaron ya sea para la transformación por bombardeo de partículas, o para la transformación mediada por Agrobacteríum después de hacer un cointegrado en una cepa de Agrobacteríum apropiada como es descrito más completamente después . Células competentes del pSBl hospedado en la cepa LBA4404 de Agrobacterium se crearon utilizando el protocolo como es descrito por Lin (1995) in Methods in Molecular Biology, ed. Nickoloff, J.A. (Humana Press, Totowa, NJ) . El plásmido que contiene los casetes de expresión se electroporó en células competentes del pSBl hospedado en la cepa LBA4404 de Agrobacterium para crear el plásmido cointegrado en Agrobacterium. Las células y el DNA se prepararon para la electroporacion al mezclar 1 L de DNA de plásmido (-100 ng) con 20 µ?? de células de Agrobacterium competentes en una probeta con espacio de electrodo de 0.2 cm (Bio-Rad Cat# 165-2086, Hercules, CA) . La electroporación se realizó en un Bio-Rad Micrópulser (Cat# 165-2100, Hercules, CA) utilizando la fijación EC2, que suministra 2.5 kV a las células. La recombinación exitosa se verificó mediante el análisis de restricción del plásmido después de la transformación del plásmido cointegrado nuevamente en las células DH5a de E. coli. B. Vectores para la Expresión de Proteina In Vitro en E. coli Se construyen vectores para la expresión de proteina de IPPKs (SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22 y 24) en E. coli utilizando protocolos estándares. Cada secuencia IPPK puede ser fusionada con GST para producir proteínas etiquetadas con GST que pueden facilitar la purificación. Si es necesario, se introducen sitios de clonación en las secuencias IPPK por PCR. Por ejemplo, se diseña un cebador que introduce un sitio Smal al extremo 5' de la secuencia, y se diseña otro cebador que introduce un sitio Notl al extremo 3' de la secuencia. Utilizando estas enzimas de restricción, la secuencia IPPK es clonada en el vector PGEX-4T-2 (PHARMACIA BIOTECH) para, generar el vector de expresión etiquetado con GST de IPPK. Estos vectores de expresión son utilizados para transformar la cepa DH5a de E. col! utilizando técnicas estándares. La expresión de las proteínas IPP etiquetadas con GST y el análisis para la especificidad del sustrato es descrita adicionalmente en el Ejemplo 7. Ejemplo 5: Transformación de Planta A. Transformación por Bombardeo de Partículas y Regeneración del Callo de Maíz Embriones de maíz inmaduros de invernadero o plantas donadoras High tipo II cultivadas en campo son bombardeados con un plásmido que contiene un polinucleótido IPPK de la invención operablemente enlazado a un promotor apropiado . Sí el polinucleótido no incluye un marcador seleccionable, otro plásmido que contiene un gen marcador seleccionable puede ser coprecipitado en las partículas utilizadas para el bombardeo. Por ejemplo, se puede utilizar un plásmido que contiene el gen PAT (Wohlleben y colaboradores (1988) Gene 70:25-37)· que confiere resistencia al herbicida, Bialaphos. La transformación se realiza como sigue . Las mazorcas son esterilizadas en la superficie en blanqueador Chlorox al 50% más detergente Micro al 0.5% durante 20 minutos, y enjuagadas dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros son extirpados y colocados con el lado del eje del embrión hacia abajo (lado del escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa. Estos son cultivados en medio agar 560L 4 días antes del bombardeo en la oscuridad. El medio 560L es un medio basado en N6 que contiene vitaminas de Eriksson, tiamina, sucrosa, 2,4-D, y nitrato de plata. El dia del bombardeo, los embriones son transferidos al medio 560Y durante 4 horas y son arreglados dentro de la zona objetivo de 2.5 cm. El medio 560Y es un medio altamente osmótico (560L con alta concentración de sucrosa) . Un vector de plásmido que comprende un polinucleótido de la invención operablemente enlazado al promotor seleccionado es construido. Este DNA de plásmido, más DNA de plásmido que contiene un marcador seleccxonable de PAT si es necesario, es precipitado sobre pelotillas de tungsteno de 1.1 um (diámetro promedio), utilizando un procedimiento de precipitación con CaCl2 como sigue: 100 µ?, de partículas de tungsteno preparadas (0.6 mg) en agua, 20 µ?, (2 g) DNA en solución reguladora TrisEDTA (1 g total), 100 µ?? de CaCl2 2.5 M, 40 µ? de espermidina 0.1 M. Cada reactivo se adiciona secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno. La mezcla final es sonicada brevemente. Después del periodo de precipitación, los tubos son centrifugados brevemente, retirado el liquido, lavados con 500 mi de etanol al 100%, y centrifugados nuevamente durante 30 segundos. Nuevamente el liquido es retirado, y se adicionan 60 µ?, al 100% a la pelotilla de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tungsteno/DNA son brevemente sonicadas y 5 ?? manchadas sobre el centro de cada macroportador y dejadas secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestra son bombardeadas a una distancia de 8 cm desde la criba de tapón al tejido, utilizando una pistola de partículas de helio biolística DuPont. Todas las muestras reciben un solo disparo a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/DNA. Cuatro a 12 horas después del bombardeo, los embriones son movidos a 560P (un medio de iniciación de callo bajamente osmótico similar a 560L pero con menor nitrato de plata) , durante 3 7 días, luego transferidos al medio de selección 560R, un medio basado en N6 similar a 560P que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y subcultivados cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo son muestreados para PCR y la actividad del polinucleótido de interés. Líneas positivas son transferidas al medio 288 J, un medio basado en MS con menores niveles de sucrosa y hormonas, para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas), embriones somáticos bien desarrollados son transferidos al medio para la germinación y transferidos al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, plántulas desarrolladas son transferidas al medio en tubos 7-10· dias hasta que las plántulas están bien establecidas. Las plantas luego son transferidas a insertes en cajones semilleros (equivalente a maceta de 2.5") que contiene tierra de maceta y cultivadas durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente, se cultivaron 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfirieron a 600 macetas Classic^ (1.6 galones) y se cultivaron a la madurez . Las plantas son inspeccionadas para la expresión del polinucleotido de interés. B. Transformación Mediada por Agrobacterium y Regeneración del Callo de Maiz Para la transformación mediada por Agrojbacterium del maiz, una secuencia de nucleótidos IPPK de la presente invención, se introdujo utilizando el método de Zhao (patente norteamericana No. 5,981,840, y la publicación de patente PCT W098/32326; los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia) . Brevemente, embriones inmaduros se aislaron del maiz y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium que contiene un polinucleótido de la presente invención, donde las bacterias son capaces de transferir la secuencia de nucleótidos de interés a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones se co-cultivaron durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo) . Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido después de la etapa de infección. Después de este periodo de co-cultivo se contempla una etapa' de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incubaron en la presencia de por lo menos un antibiótico conocido que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (paso 3: etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivaron en el medio que contiene un agente selectivo y se recuperó el callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección) . Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de células transformadas. El callo luego se regeneró en plantas (etapa 5: la . etapa de regeneración) , y callos cultivados en el medio selectivo se cultivaron en el medio sólido para regenerar las plantas. C. Transformación de Dicotiledóneas con Transgen Un cásete de expresión, con un polinucleótido de la presente invención operablemente enlazado a elementos reguladores apropiados para la expresión puede ser introducido en cultivos en suspensión embriogénicos de soya mediante el bombardeo de partículas utilizando esencialmente los métodos descritos en Parrott, W.A., L.M. Hoffman, D.F. Hildebrand, E.G. TFilliams, y G.B. Collins, (1989) ecovery of primary transformante of soybean, Plant Cell Rep. 7:615-617. Este método, con modificaciones, es descrito enseguida. Semilla es retirada de las vainas cuando las cotiledóneas están entre 3 y 5 mm en longitud. Las semillas son esterilizadas en una solución blanqueadora (0.5 %) por 15 minutos, tiempo después del cual las semillas son enjuagadas con agua destilada estéril. Las cotiledóneas inmaduras son extirpadas al primero cortar la porción de la semilla que contiene el eje embriónico. Las cotiledóneas luego son retiradas del tegumento al empujar suavemente el extremo distante de la semilla con el extremo despuntado de la cuchilla de escalpelo. Las cotiledóneas luego son colocadas (lado plano hacia arriba) en el medio de iniciación SB1 (sales MS, vitaminas B5, 20 mg/L de 2,4-D, 31.5 g/L de sucrosa, 8 g/L de Agar TC, pH 5.8) . Las placas Petri son incubadas en la luz (16 horas del día: 75-80 µ?) a 26°C. Después de 4 semanas de incubación, las cotiledóneas son transferidas al medio SB1 fresco. Después de dos semanas adicionales, embriones somáticos en etapa globular que exhiben áreas proliferat.ivas son extirpados y transferidos al medio liquido N Lite (Samoylov, V.M. , D.M. Tucker, y W.A. Parrott (1998) Soybean [Giycine max (L.) Merrill] embryogenic cultures: the role of sucrose and total nitrogen content on proliferation. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 34:8-13). -Aproximadamente 10 a 12 montones pequeños ' de embriones somáticos son colocados en matraces de 250 mi que contienen 35 mi de medio SB172. Los cultivos en suspensión embriogénicos de soya son mantenidos en 35 mL de medio liquido en un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes (20 µ?) en un programa de dia/noche de 16:8 horas. Los cultivos son subcultivados cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio liquido . Cultivos en suspensión embriogénicos de soya luego son transformados utilizando el bombardeo con pistola de partículas (Klein y colaboradores (1987) Nature (London) 327:70, patente norteamericana No. 4,945,050). Un instrumento BioRad BiolisticMR PDS100/HE se puede utilizar para estas transformaciones. Un gen marcador seleccionable, que es utilizado para facilitar la transformación de soya, es un gen quimérico compuesto del promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell y colaboradores (1985) Nature 313:810-812), el gen de fosfotransferasa de higromicina del plásmido pJR225 (de E coli; Gritz y colaboradores (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de sintasa de nopalina del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. A 50 µ?? de una suspensión de partículas de oro de 1 um de 60 mg/mL se adiciona (en orden) : 5 µ de DNA (1 µg/µL), 20 µ? de espermidina (0.1 M) , y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas es agitada por tres minutos, girada en una microcentrífuga por 10 segundos y el sobrenadante retirado. Las partículas recubiertas con DNA son lavadas una vez en 400 µL de etanol al 70% y resuspendidas en 40 µL de etanol anhidro. La suspensión de DNA/partículas es sonicada tres veces por una segunda vez . Cinco µL de las partículas de oro recubiertas con DNA luego son cargados en cada disco macroportador . Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas, son colocados en una placa petri de 60 x 15 mm vacía y el líquido residual retirado del tejido con una pipeta. La presión de ruptura de la membrana es ajustada a 1100 psi y la cámara es evacuada a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido es colocado aproximadamente 8 cm separado de la criba de retención, y es bombardeado tres veces. Después del bombardeo, el tejido es dividido a la mitad y colocado nuevamente en 35 mi de medio FN Lite. Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido es intercambiado con medio fresco. Siete días después del bombardeo, el medio es intercambiado con medio fresco que contiene 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo es renovado cada semana. Siete a ochos semanas después del bombardeo, tejido transformado, verde, será observado que crece de los montones embriogénicos, necróticos no transformados. Tejido verde aislado es retirado e inoculado en matraces individuales para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada nueva linea es tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego son subcultivadas y mantenidas como montones de embriones inmaduros, o el tejido es regenerado en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones individuales . D. Aislamiento de DNA del Callo y los Tejidos de Hoja Para clasificar los eventos de transformación putativos para la presencia del transgen, DNA genómico es extraido de los callos u hojas utilizando una modificación del método de CTAB (bromuro de cetiltrietilamonio, Sigma H5882) descrito por Stacey e Isaac (1994). Aproximadamente 100-200 mg de tejidos congelados son molidos a polvo en nitrógeno liquido y homogenizados en 1 mi de solución reguladora de extracción CTAB (CTAB 2%, EDTA 0.02 M, Tris-Cl 0.1 M pH 8, NaCl 1.4 M, DTT 25 mM) durante 30 min. a 65°C. Muestras homogenizadas se dejan enfriar a temperatura ambiente durante 15 min. antes de que se haga una sola extracción de proteina con aproximadamente 1 mi de cloroformo:octanol 24:1 v/v. Muestras son centrifugadas por 7 min. a 13,00 rpm y la capa superior del sobrenadante recolectada utilizando puntas de pipeta de boca ancha. DNA es precipitado del sobrenadante por incubación en etanol al 95% sobre hielo durante 1 h. Hebras de DNA son enredadas en un gancho de vidrio, lavadas en etanol al 75% que contiene acetato de sodio 0.2 M durante 10 min., secadas con aire durante 5 min. y resuspendidas en solución reguladora TE. Cinco µL de RNAsa A son adicionados a las muestras e incubadas a 37 °C durante 1 h. Para la cuantificación del DNA genómico, se realiza la electroforesis de gel utilizando un gel de agarosa al 0.8% en solución reguladora 1 x TBE. Un microlitro de las muestras son fraccionadas a lo largo de 200, 400, 600 y 800 ng µ?"1 ? de marcadores de DNA sin cortar. Ejemplo 6: Identificación de Lineas de Maíz Transgénieas de Alto Contenido de Fósforo/Bajo contenido de Fitato Los transformantes resultantes son clasificados para los niveles de fósforo inorgánico y/o fitato utilizando los ensayos colorimétricos como es descrito enseguida. El procedimiento de extracción utilizado es compatible con ambos ensayos. Los ensayos colorimétricos pueden ser realizados secuencialmente o simultáneamente. Eventos putativos son de manera usual inicialmente clasificados para niveles incrementados de fósforo inorgánico comparados con el control de tipo silvestre y luego además caracterizados por el ensayo de fitato . A. Preparación de Muestra Núcleos individuales son triturados a un polvo fino utilizando un dispositivo de molienda de molino de bolas . La molienda de ciertas muestras, por ejemplo lineas de maiz de alto contenido de aceite, puede ser facilitada al enfriar la muestra en el aparato de molienda a -80°C durante 2 horas antes de la molienda. Transferir 25-35 mg de cada muestra molida a un nuevo tubo de microcentrifuga de 1.5 mi . Extraer cada muestra con 1 mi de ácido clorhídrico 0.4N (HCl) durante 3.5 horas a temperatura ambiente con agitación para mantener la harina suspendida. Transferir 1 mi de esta suspensión a un tubo Megatiter de 1.1 mi (Cat# 2610, Continental Labs) y colocar en la placa Megatiter de 96 cavidades (Cat# 2405, Continental Labs) . Clarificar el extracto por centrifugación a baja velocidad, por e emplo, 4000 rpm durante 15 minutos en una centrifuga Jouan. El sobrenadante clarificado es utilizado para los ensayos descritos en las secciones 6B y 6C a continuación. B. Ensayo de Fosfato Inorgánico Cuantitativo Este ensayo se realiza por duplicado para cada muestra. Para cada muestra, mezclar una alícuota de 200 ul de extracto clarificado con 100 µ? de ácido trifluoroacético (TCA) al 30%. Clarificar mediante la centrifugación a baja velocidad. Transferir 50 µ?, de sobrenadante clarificado a una placa microtitulo de 96 cavidades. Adicionar 100 ?) del reactivo de color (7 partes de molibdato de amonio al 0.42% en H2S04 1N: 1 parte de ácido ascórbico al 10%) e incubar a - 37 °C durante 30 minutos. Una. curva estándar de fosfato es generada utilizando aH2PÜ4 en . el rango de 0-160 nmol diluida de una solución de extracto 10 mM en 2 partes de HCl 0.4N: 1 • parte de TCA al 30%. Medir la absorbencia a 800 nm. C. Ensayo de Fitato Cuantitativo Este- ensayo es modificado de Haug y Lantzsch (1983) J. Sci. Food Agrie. 34:1423-1426. Este ensayo es realizado por duplicado para cada muestra. Solución de extracto estándar de fitato (Cat# P-7660, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se hace al disolver 150 mg de fitato en 100 mi de agua destilada (DDW) . Se hacen estándares en el rango de 0-35 µg/ml mediante la dilución con HCl 0.2N. Se preparan muestras en placas de microtitulo de 96 cavidades al mezclar 35 µ? de sobrenadante clarificado (de 6A) con 35 µ? de DDW, adicionar 140 µ? de solución férrica (0.2 g de dodecahidrato de sulfato de amonio hierro (III) (Merck Art 3776) /litro en HCl 0.2N). Las placas son selladas e incubadas durante 30 minutos a 99°C, luego enfriadas a 4°C. Las placas son mantenidas en un baño de hielo-agua durante 15 minutos, luego transferidas a temperatura ambiente durante 20 minutos. Centrifugar las placas a baja velocidad para precipitar la pelotilla, por ejemplo giro de 30 minutos a 4000 rpm en una centrifuga Jouan. Después de la centrifugación, transferir 80 µ? de sobrenadante clarificado a una nueva placa de 96 cavidades y mezclar con 120 µ? de solución de 2 , 2' -bipiridina (10 g de 2 , 2 ' -bipiridina- - (Merck Art. 3098), . 10 mi de ácido tioglicólico (Merck Art. 700) en DDW a 1 litro).-, Cada planta identificada como una planta transgénica de alto contenido de fósforo potencial es probada nuevamente para confirmar la lectura de fósforo elevada original. Lineas de alto contenido de fósforo confirmadas son seleccionadas en la base de uniformidad para el rasgo o cualidad. ¦ Los transformantes que son positivos con los ensayos colorimétricos luego serán sometidos al análisis más riguroso que incluye el manchado de Southern, Northern y Western y/o la cuantificación e identificación de ácido típico e intermediarios de fosfato inositol mediante HPLC. E escoplo 7: Determinación de la Especificidad del Sustrato de los Clones ITPK A. Expresión de IPPK y Purificación Una sola colonia de la cepa DH5a de E. coli que contiene un vector de expresión ITPK etiquetado con GST descrito en el Ejemplo 4 es cultivada durante la noche a 37 °C en medio LB que contiene ampicilina (Amp) . El cultivo durante la noche es diluido 1:10 con LB+Amp fresco e incubado a 37 °C con agitación vigorosa hasta que la lectura A600 del cultivo está en el rango de 1 - 2 unidades O.D. La expresión de proteina de fusión GST es inducida mediante la adición de IPTG al cultivo a una concentración final de 1 uM. Los cultivos son incubados a 37°C con agitación durante 3 hrs. adicionales . Células son cosechadas por centrifugación a 7,700 _x , g durante 10 minutos a 4°C. Las células son lisadas en hielo mediante la sonicación y el lisado es clarificado mediante la centrifugación a 12,000 x g durante 10 minutos a 4°C. Las proteinas GST-IPPK son purificadas por afinidad mediante la absorción por lotes a la resina de cuentas de Glutathione Sepharose 4B (Bulk GST Purification kit, Pharmacia Biotech) a una relación de 1 mi del volumen de lecho de la suspensión espesa de Glutathione Sepharose 4B al 50% por 100 mi del lisado clarificado. Siguiendo las condiciones detalladas en las instrucciones del fabricante, las cuentas son lavadas y la proteina IPPK etiquetada con GST eluida con glutationa reducida 10 mM en Tris-HCl 50 mM (pH 8.0). Después de la elución, se adiciona glicerol a una concentración final de 50% y las proteinas GST-IPPK purificadas son almacenadas en glicerol al 50% a -20°C. La concentración de proteina es ajustada a aproximadamente 50 g/ l. B. Ensayo para la Actividad de IPPK y la Especificidad del Sustrato Proteínas de fusión GST-IPPK purificadas son utilizadas en ün ensayo de actividad de quinasa polifosfato inositol. El ensayo de actividad es realizado en un volumen de 25 µ??. La mezcla de ensayo contiene HEPES 20 mM, H 7.2, MgCl2 6 mM, LiCl 10 mM, DTT 1 mM, sustrato de fosfato inositol 40 -µ?, ATP 40 µ?, 0.5 µ? ?-32?-??? - (3000 Ci/mmol) . 5 µ? de enzima por reacción. La mezcla de reacción se incuba a 30°C, o a temperatura ambiente, durante 30 minutos. La reacción se detiene mediante la adición de 2.8 µ? de solución de detención (HCl 3M, KH2PO4 2M) a los 25 µL de reacción. Muestras de un microlitro de cada reacción, junto con estándares de fosfato inositol, son separadas en una placa de cromatografí de capa delgada de polietilenimina (PEI)-celulosa (Merck) con HCl 0.5M de acuerdo con Spencer y colaboradores (Jn Methods in Inositide Research, (1990) pp. 39-43, Ed. R. F. Irvine, Raven Press, NY) . Después de la separación, la placa de TLC se secó con aire a 70°C, se envolvió en envoltura de plástico y se expuso a la película de rayos X para detectar los productos de reacción marcados con 32P. Los productos de reacción se cuantificaron al cortar la mancha de la placa de TLC y al medir la radioactividad en un contador de centelleo líquido. La identidad del producto de reacción se confirmó al comparar la distancia migrada con respecto a la migración de los controles estándares de fosfato inositol corridos en cada placa TLC. Varios sustratos de fosfato inositol son probados para determinar la especificidad del sustrato de las enzimas IPPK. Los otros sustratos probados bajo las mismas condiciones anteriores son: Ins(l)P, Ins(2)P, Ins(4)P, Ins(l,4)P2, Ins(4,5)P2, Ins (1,3, 4) P3, Ins (3, 4, 5) P3, Ins (1, 4, 5) P3/ Ins (3, 4, 5, 6) P4, Ins(l,3,4,6)P4, Ins (1, 3, , 6) P4 e Ins (1, 3, , 5, 6) P5. Ejemplo 8 : Mutantes de Impacto de Ma z ITPK Poblaciones de maiz etiquetadas con Mu (TUSC) son clasificadas para los impactos del gen IPPK, utilizando los cebadores específicos a la secuencia IPPK de interés emparejada con un cebador Mu en las reacciones PCR. Lineas identificadas por tener una inserción Mu en el gen IPPK son clasificadas por ensayos adicionales. Núcleos de estas lineas son clasificados para los niveles de fitato y fosfato inorgánico contra los mutantes de fitato Lpal y Lpa2, asi como con controles de tipo silvestre, utilizando los ensayos descritos en el Ejemplo 6. Ejemplo 9: Ensayo de Mio-inositol Eventos putativos también pueden ser clasificados para determinar el efecto que el transgen puede tener en los niveles de mio-inosotil en el núcleo utilizando un método de cromatografía de gases/espectrometria de masas. Brevemente, 20 núcleos secos, maduros, enteros, representativos son molidos a una harina fina en un aparato de molino de bolas. Cada muestra es analizada por triplicado.
Para la extracción, tres alícuotas de 0.5 g de harina para cada muestra son extraídas con 5 mi de alcohol etílico al 50% v/v (alcohol etílico al 100%:DDW 1:1) a temperatura ambiente durante una hora con agitación vigorosa. El sobrenadante de extracto es decantado y filtrado a través de _-un filtro de jeringa de .0.45 u ,. El residuo de harina es reextraído con 5 mi de etanol al 50% fresco siguiendo el mismo procedimiento, combinando los dos filtrados. Cada muestra es formada en vórtice, y una alícuota de 1 mi tomada y evaporada a sequedad en un SpeedVac a calor medio. Un extracto estándar de mio-inositol de 10 mg/ml se hace en agua doblemente destilada (DDW) que es utilizada para hacer un extracto de trabajo de solución estándar de 1 mg/ml. Alícuotas de 50 µ?, 100 µ?, 200 µ? y 300 µ? son transferidas a nuevos tubos e vaporadas a sequedad en un SpeedVac como es descrito anteriormente. Este equipo de calibración cubre un rango de concentración de 5 µg/¦ml a 30 g/ml de cada componente . Estándares completamente secados y muestras son resuspendidos en 50 µ? de piridina. A esto, 50 µ? de trimetilsililimadazol-trimetilclorosilano (TMSI-TMCS) 100:1 se adicionó a cada muestra. Las muestras son comprometidas si se forma un precipitado. Tubos son sellados, girados en vórtice e incubados 15 min. a 60"C. Después de la incubación, se adicionan 1 mi de 2, 2, 4-trimetilpentano y 0.5 mi de DDW.
Se giran en vórtice las muestras y se centrifugan a baja velocidad (2000 rpm) durante 5 minutos. La capa superior orgánica es transferida a un frasquito automuestreador de 2 mi que puede ser almacenado a 4°C hasta que se puede analizar. Muestras - son - analizadas . en un aparato de Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (GC/MS) Hewlett-Packard 5890/7673/5972 utilizando una columna 5MS de espesor de película de 30 m X 0.25 m i.d. X 0.25 um Hewlett-Packard bajo las siguientes condiciones: Temperatura de Entrada: 250°C Volumen de Inyección: 1 mi Relación de Separación: Sin separación Temperatura del Horno: 70°C inicial, mantenida por 2 min. Pendiente a 25/min. a 170°C, mantenida por 0 min. Pendiente a 5/min. a 215°C, mantenida por 0 min. Mantenida por 5 min. , para un tiempo de corrida total de 23.4 min. Temperatura del Detector: 250°C Gas Portador: Helio, 36.6 cm/seg a 70°C (1 ml/min. ) Exploración completa {m/z 50-650), 5 min. de retardo de recolección de datos. Los resultados son repostados como µg ml para la muestra final anali2ada por el GC/MS, esta concentración es multiplicada por un factor de 20 antes de la utilización para .calcular g/g de, tejido de peso seco. El contenido de humedad de los núcleos maduros es determinado de una alícuota separada de cada muestra experimental, de modo que los resultados se pueden ajustar a una base de peso seco. Los niveles de mio-inositol son cuantificados como sigue: g mio-inositol = g (X20) X 1 mi muestra . X 10 mi extracto g tejido de mi muestra 1 mi extracto 0.5 g tejido peso seco
Ejemplo 10: HPLC de Fitato e Intermediarios de Fosfato Inositol Fósforo e intermediarios de fosfato inositol asociados con el ácido fítico en semillas de trigo, maíz y soya pueden ser identificados y cuantificados utilizando la HPLC de cromatografía de intercambio aniónico de gradiente con detección de conductividad. Fitato y los fosfatos inositol intermediarios pueden ser identificados utilizando este método. Sin embargo, el método practicado actualmente se ha optimisado para el fitato, no es optimizado para la cuantificación de fosfatos inositol intermediarios. Para otras separaciones de HPLC de fosfatos inositol ver también Anonymous, (1990) "Analysis . of inositol phosphates" Dionex Corp. Application Note AN 65; Xu, P., Price, J., y Aggett, P. (-1992) Progress in -Food and JJutrition Science 16:245262; Rounds, M.A. y Nielsen, S.S.(1993) J. Chromatogr 653: 148-152; y Trugo, L. y von Baer, D. (1998) Association for animal production, publication 93:1128. Fosfatos inositol también pueden ser identificados mediante los métodos cromatográficos de capa delgada, ver por ejemplo Spencer, C.E.L. y colaboradores (1990) Ch. 4 en Methods in Inositide Research, Ed. R.F. Irving, Raven Press, Ltd., NY pp. 39-43; y Hatzack, F. y Rasmussen, S.K. (1999) J. Chromatogr B 736:221-229. Para la HPLC de intercambio aniónico, un rango estándar de ácido fitico de 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 y 3.0 mg/ml es preparado en ácido clorhídrico 0.4M (HCl) de un extracto de trabajo de 20 mg/ml en HCl 0.4M. Muestras de semillas son preparadas al moler semillas a una harina fina en un aparato de molienda de molino de bolas. Alícuotas duplicadas son pesadas y extraídas en HCl 0.4M en una relación de 0.1 g harina/1 mi de HCl 0.4M. Usualmente se utilizan 5 mi de HCl 0.4M para extraer 0.5 g de harina de maíz o trigo, mientras que se utilizan 15 mi de HCl 0.4M para extrae 1.5 g de harina de soya. Después de la adición de la solución reguladora de extracción, las muestras se extraen con agitación vigorosa moderada durante 2 hrs. a temperatura ambiente, luego se transfieren a 4°C durante la noche sin agitación. Los sobrenadantes de maiz y trigo son clarificados mediante la centrifugación a baja velocidad. Debido al alto contenido de grasa, el- sobrenadante de baja velocidad.de los extractos de muestra de soya, además es clarificado mediante la ultracentrifugación a .55,000 rpm a 4°C durante 1 hora. Después de la ultracentrifugación, la capa media, clara, es retirada con una aguja o pipeta de transferencia desechable de punta extendida. Las muestras clarificadas son filtradas a través de un filtro de jeringa de 0.45 um y almacenadas a 4°C hasta el análisis. Justo antes del análisis, una alícuota de cada muestra es filtrada con una unidad de filtro centrífugo Millipore Durapore ULTRAFREE-MC de 0.22 um, o equivalente. Las muestras son sometidas a separación de HPLC de intercambio aniónico por un gradiente lineal de hidróxido de sodio (NaOH) 0.06-0.118M en alcohol isopropílico al 1% en una columna Dionex OmniPac PAX-100 a una tasa de flujo de 1 ml/min. El tiempo de corrida total es de 30 min. con la recolección de datos de 0 a 20 minutos. La recolección de la señal es ajustada a 0.5 Hz, unidades del detector en ]iS, corriente a 300 mA, con el Estabilizador de Detección regulado a 30°C y una compensación de temperatura a 1.7. Veinticinco microlitros de extracto son cargados en la columna. Muestras de soya se presentan que ocasionan deterioro del desempeño de la columna, por lo tanto es útil interponer una corrida de limpieza de columna corta entre las muestras. La corrida de limpieza comprende una serie de inyecciones para HC1 1M, NaOH 1M, y acetonitrilo al 90%. Los ejemplos anteriores- se proporcionan para ilustrar la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto ordinario en la técnica y están comprendidas por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y programas de computadora citadas en la presente, son incorporadas en la presente por referencia.