MXPA02001666A

MXPA02001666A - Metodo para la produccion de acido calendico, un acido graso que contiene dobles enlaces conjugados delta-8,10, 12 y acidos grasos relacionados que tiene una modificacion en la posicion delta-9.

Info

Publication number: MXPA02001666A
Application number: MXPA02001666A
Authority: MX
Inventors: William Dean Hitz
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1999-08-16
Filing date: 2000-08-15
Publication date: 2002-10-23
Also published as: BR0013309A; EP1208203B1; CA2372991C; JP2003507041A; BRPI0017553B1; HUP0203560A3; WO2001012800A8; AR025290A1; AU784471B2; AU2006202904A1; HUP0203560A2; DE60043701D1; US7786356B2; WO2001012800A3; ATE455172T1; EP1208203A2; US6593514B1; US20030204871A1; AU6907500A; AR066399A2

Abstract

Se describen la preparacion y uso de fragmentos de acido nucleico que codifican para enzimas de modificacion de acido graso vegetal asociadas con la modificacion de la posicion delta-9 de acidos grasos, en particular, la formacion de dobles enlaces conjugados. Se pueden usar genes quimericos que incorporen estos fragmentos de acido nucleico y secuencias reguladoras adecuadas para crear plantas transgenicas que tengan perfiles de lipidos alterados. Tambien se describen la preparacion y uso de fragmentos de acido nucleico que codifican para enzimas de modificacion de acido graso vegetal asociadas con la formacion de un doble enlace trans delta-12. Pueden usarse los genes quimericos que incorporan estos fragmentos de acido nucleico y secuencias reguladoras adecuadas para crear plantas transgenicas que tengan perfiles de lipidos alterados.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE ACIDO CALENDICO, UN ACIDO GRASO QUE CONTIENE DOBLES ENLACES CONJUGADOS DELTA-8, 10, 12 Y ÁCIDOS GRASOS RELACIONADOS QUE TIENEN UNA MODIFICACIÓN EN LA POSICIÓN DELTA-9 Campo de la invención Esta invención se refiere a la biosintesis de ácidos grasos y, en particular, a la preparación y uso de fragmentos de ácido nucleico que codifican para enzimas de modificación de ácido graso vegetal asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos y, en particular, la formación de dobles enlaces conjugados. Los genes quiméricos que incorporan estos fragmentos de ácido nucleico y secuencias reguladoras adecuadas pueden usarse para crear plantas transgénicas que tengan perfiles de lipidos alterados. Esta invención se refiere también a la preparación y uso de fragmentos de ácido nucleico que codifican para enzimas de modificación de ácido graso vegetal asociadas con la formación de un enlace doble trans-delta-12 . Los genes quiméricos que incorporan estos fragmentos de ácido nucleico y secuencias reguladoras adecuadas se pueden usar REF: 135288 -5 íA??.? Í.Á?é¿Í? „ .^...,^ . , . X7X. .1 . .1 . * - .,?A*í^.e¿,*&..... . . ". ,k.^?m»ISÍHt át ?.£ i . para crear plantas transgénicas que tengan perfiles de lipidos alterados.

Antecedentes de la invención Los ácidos grasos que portan modificaciones químicas además de los dobles enlaces comunes se encuentran en los lipidos de almacenamiento de muchas semillas oleaginosas (Badami y Patil (1981) Prog. Lipid Res . 19 : 119- 153) . Algunas de estas modificaciones funcionalizan al ácido graso para producir productos que sean útiles en aplicaciones industriales; esto es una alternativa para el uso más común de lipidos derivados de plantas como alimentos. Ejemplos son el uso del ácido graso hidroxilado ácido ricinoleico en lubricantes, y los ácidos grasos de longitud de cadena corta o media de aceite de palma en detergentes. En algunos casos, la composición de ácidos grasos de los lipidos de almacenamiento de semillas oleaginosas producidas en climas templados pueden modificarse mediante la adición de genes de fuentes exóticas de manera para que produzcan grandes cantidades de ácidos grasos únicos (Ohlrogge, J. B. (1994) Plant Physiol . 104, 821-826).

Los ácidos grasos que contienen dobles enlaces conjugados son los principales componentes de la semilla oleaginosa de un número limitado de especies vegetales. Por ejemplo, el ácido caléndico (ácido 8-trans, 10-trans, cis-12- 5 octadecatrienoico) compone más del 50% de los ácidos grasos totales del aceite de la semilla de Caléndula officinalis (Crombie y Holloway (1984) J. Chem. Soc . Chem. Commun . 15, 953-955, Chisholm, M.J. & Hopkins, C.Y. (1967) Can . J. Biochem 45:251-254) . Otro ejemplo, ácido a-parinárico (ácido 10 9-cis, 11-trans, 13-trans, 15-cis-octadecatetraenoico) y ácido ß-parinárico (ácido 9-trans, 11-trans, 13-trans, 15- cis-octadecatretraenoico) componen más del 25% de los ácidos grasos totales del aceite de la semilla de la especie Impatiens (Bagby, M.O., Smith, C.R. y Wolff, Hopkins, C.Y. 15 (1966) Lipids 1 , 263-267) . Ademáss, el ácido a-eleosteárico (ácido 9-cis, 11-trans, 13-trans-octadecatrienoico) y ácido ß-eleosteárico (ácido 9-trans, 11-trans, 13-trans- octadecatrienóico) componen >55% de los ácidos grasos totales del aceite de la semilla de Morfodica charantia (Chisolm, 20 M.J. y Hopkins, C.Y. (1964) Can J. Biochem. 42, 560-564; Liu, L., Hammond, E.G. y Nikolau, B.J. (1997) Plant Physiol . 113, 1343-1349) . El ácido caléndico y ácido eleosteárico son ,. ,... f.^.íl^,t.~;.?i£?e**~¿ a bos ácidos grasos 18:3, al igual que el ácido linolénico, sin embargo, sus estructuras son bastante diferentes, como se muestra en la figura 1. Otro ácido graso que contiene dobles enlaces conjugados se encuentra en las semillas de Dimorphotheca sinua ta . Este inusual ácido graso de Cíe, ácido dimorfecólico (9-OH-18 :2?10trans'12trans) , contiene dos dobles enlaces trans conjugados entre los átomos de carbono ?10 y ?11 y entre los átomos de carbono ?12 y ?13, asi como un grupo hidroxilo en el átomo de carbono ?9 [Binder, R.G. y otros, (1964) J. Am. Oil Chem. Soc. 41:108-111; Morris, L.J. y otros, (1960) J. Am. Oil Chem. Soc. 37:323-327]. De esta manera, existen ciertos ácidos grasos vegetales 18:2 y 18:3 que contienen dobles enlaces conjugados. La presencia de dobles enlaces conjugados en ácidos grasos proporciona la base funcional para aceites de secado tales como aceite de palo que son enriquecidos en isómeros de ácido eleosteárico. Esto se debe en gran parte al hecho de que los ácidos grasos con dobles enlaces conjugados despliegan altas velocidades de oxidación, particularmente cuando se les compara con ácidos grasos poliinsaturados con dobles enlaces interrumpidos por metileno. Los aceites de ^ .¿ l a? ? ^ *-. &s¡ £e¿3L*sm? secado, tales como el aceite de palo, se usan como componentes de pinturas, barnices y tintas. Los ácidos grasos conjugados también pueden usarse como un aditivo de alimentos para animales. Los ácidos linoleicos conjugados (CLAs, 18:2) se han usado para mejorar la composición de grasa en alimentos para animales. La patente de E.U.A. No. 5,581,572, expedida a Cook y otros el 22 de diciembre de 1998, describe un método para incrementar la firmeza de la grasa y mejorar la calidad de carne en animales usando ácidos linoleicos conjugados. La patente de E.U.A. No. 5,554,646, expedida a Cook y otros el 10 de septiembre de 1996, describe un método para reducir la grasa corporal en animales usando ácidos linoleicos conjugados. La patente de E.U.A. No. 5,519,451, expedida a Cook y otros el 6 de julio de 1999, describe un método para mejorar el crecimiento o la eficiencia de la conversión de alimentos de un animal, que incluye partículas de alimento para animales que tienen un núcleo interno de nutrientes y una capa externa que contiene un ácido graso conjugado o un anticuerpo que puede proteger al animal de contraer enfermedades que puedan afectar adversamente la capacidad del .:k 4. -a. animal para crecer o convertir de manera eficiente su alimento en tejido corporal. La patente de E.U.A. No. 5,428,072, expedida a Cook y otros el 27 de junio de 1995, describe un método para mejorar la ganancia de peso y eficiencia de alimentación en animales, el cual incluye el uso de ácido linoleico conjugado. Se desconoce el mecanismo mediante el cual se logran estos efectos. Se cree nadie hasta la fecha ha descrito el uso de ácidos grasos 18:3 conjugados (ácidos linolénicos conjugados o ClnAs) , para mejorar las características del cadáver del animal. No se entiende bien la biosintesis de ácidos grasos con dobles enlaces conjugados. Varios reportes han indicado que los dobles enlaces conjugados se forman mediante la modificación de un doble enlace existente (Crombie, L. y Holloway, S.J. (1985) J. Chem. Soc . Perkins Trans . 11985, 2425-2434; Liu, L., Hammond, E.G. y Nikolau, B.J. (1997) Plant Physiol . 113, 1343-1349). Por ejemplo, los dobles enlaces en los átomos de carbono 11 y 13 del ácido eleosteárico han mostrado originarse a partir de la modificación del doble enlace ?12 del ácido linoleico (18:2?9'12) (Liu, L., Hammond, E.G. y Nikolau, B.J. (1997) =,.^ p— . _ ^ *. .

Plant Physiol . 113, 1343-1349) . Sin embargo, hasta el momento no se ha determinado el mecanismo exacto implicado en la formación de dobles enlaces conjugados en ácidos grasos. Las enzimas relacionadas con ácido graso desaturasa (Fad) son responsables de producir aceites 18:3 ?9'11'13 tales como ácido a y ß-eleosteárico y aceites 18:4 ?9'11'13,15 tales como ácido a y ß-parinárico en Impatiens Momordica y Chrysobalanus . La inserción de un gen quimérico que comprende un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para estas enzimas en especies que no acumulan normalmente dobles enlaces conjugados que contienen ácidos grasos dio como resultado la producción de ácidos eleosteárico y/o parinárico (Cahoon y otros (1999) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 96: 12935-12940; y WO 00/11176, publicada el 2 de marzo de 2000, cuya descripción se incorpora en la presente a manera de referencia) . La presente invención extiende este trabajo al responder si los ácidos grasos 18:3 ?8'10'12 tales como ácidos caléndico o dimorfecólico también pueden producirse en plantas transgénicas. A diferencia de las enzimas relacionadas con Fad que modifican la posición delta-12 para producir ácidos eleosteárico y parinárico, las enzimas de la presente invención (con una excepción como la descrita abajo con respecto a DMFad2-l) modifican la posición delta-9 de los ácidos grasos para producir ácidos caléndico y dimorfecólico. Se describe en la presente una enzima que está asociada con la formación de un doble enlace trans-delta-12. El producto de esta reacción enzimática se convierte después en el substrato para una reacción que incluye la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una posición delta-9 de ácidos grasos. En la presente se describe el aislamiento y caracterización de dos moléculas de ADNc de Caléndula, dos moléculas de ADNc de Dimorphotheca , y la expresión de un transgen quimérico.

Sumario de la invención Esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una posición delta-9 de ácidos grasos en la que dicho fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. En un segundo aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una posición delta-9 de ácidos grasos en donde el fragmento, o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo, codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13. En un tercer aspecto, esta invención se refiere a un gen quimérico que comprende esos fragmentos de ácido nucleico aislados, o un subfragmento funcionalmente equivalente de los mismos, o un complemento de los mismos, unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas. En un cuarto aspecto, esta invención se refiere a una célula huésped o planta transformada que comprende este gen quimérico. En un quinto aspecto, esta invención se refiere a un método para alterar el nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, en donde estos ácidos grasos comprenden una modificación en una posición delta-9, el método comprende : (a) transformar una célula huésped o planta con un gen quimérico como el descrito arriba; (b) cultivar la célula huésped o planta transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar esas células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos con dobles enlaces. En un sexto aspecto, la invención se refiere a un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden una posición delta-9 modificada en las semillas de plantas, el cual comprende: (a) transformar una célula vegetal con ese gen quimérico; (b) cultivar una planta madura fértil de la célula vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) para obtener un aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan una posición delta-9 modificada. En un séptimo aspecto, esta invención se refiere a un método para producir enzimas de modificación de ácidos grasos vegetales asociadas con la modificación de una posición delta-9 de ácidos grasos, el cual comprende; (a) transformar una célula huésped microbiana con los genes quiméricos reclamados; (b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas que contengan niveles alterados de proteina codificada por el gen quimérico. En un octavo aspecto, esta invención se refiere a un método para aislar fragmentos de ácido nucleico y subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la modificación de una posición delta-9 de ácidos grasos, el cual comprende: (a) comparar SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13 y otras secuencias de polipéptidos de enzimas modificadoras de ácidos grasos vegetales; (b) identificar las secuencias conservadas de cuatro o más aminoácidos obtenidos en la etapa (a) ; (c) diseñar oligómeros degenerados con base en las secuencias conservadas identificadas en la etapa (b) ; y (d) usar los oligómeros degenerados de la etapa (c) para aislar secuencias que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal o una porción de la misma asociada con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos mediante protocolos dependientes de secuencia. En un noveno aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es al menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas.

En un décimo aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13. En un onceavo aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos, en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida al fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 2 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es al menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislado de la reivindicación 2 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. También son de interés los genes quiméricos que comprenden estos fragmentos de ácido nucleico aislados, o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos, o un complemento de los mismos, unidos operablemente a secuencias reguladoras adecuadas. Las células huésped o plantas transformadas que comprenden estos genes quiméricos son de interés. De hecho, estos fragmentos de ácido nucleico se pueden usar en cualquiera de las métodos identificados arriba tales como la alteración del nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, la producción de enzimas modificadoras de ácidos grasos vegetales asociadas con la modificación de una posición delta-9 de un ácido graso, etc. En un doceavo aspecto, esta invención se refiere a un alimento para animales que comprende un ingrediente derivado de procesar cualquiera de las semillas obtenidas de plantas transformadas con los genes quiméricos descritos en la presente y a un método para mejorar la calidad del cadáver de un animal complementando la dieta del animal con estos alimentos para animales. En un treceavo aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12, en donde la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 75% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas, determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. También son de interés los genes quiméricos que comprenden estos fragmentos de ácido nucleico aislados, o un subfragmento funcionalmente equivalente de los mismos, o un complemento de los mismos, unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas. Son interesantes las células huésped o plantas transformadas que comprenden estos genes quiméricos. De hecho, estos fragmentos de ácidos nucleico se pueden usar en cualquiera de los métodos identificados arriba tales como la alteración del nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, la producción de enzimas de modificación de ácido graso vegetal asociadas con la modificación de una posición delta-9 de un ácido graso, etc.

Breve descripción de las figuras y descripciones de secuencias La invención se puede entender más completamente a partir de la siguiente descripción detallada y de las descripciones de figuras y secuencias que forman una parte de esta solicitud. Las descripciones de secuencia resumen el Listado de Secuencias anexo a la presente. El Listado de Secuencias contiene códigos de una letra para caracteres de secuencias de nucleótidos y códigos de tres letras para aminoácidos, como se define por las normas IUPAC-IUB descritas en Nuclei c Acids Research 13:3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (No . 2) :345-373 (1984), y los símbolos y formato usados para todos los datos de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos cumplen además con las reglas que rigen las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos en solicitudes de patente, como se describe en 37 C.F.R. §1.821-1.825 y la Norma St.25 de la WIPO. La figura 1 muestra las estructuras de ácido a-linolénico, ácido caléndico y ácido a-eleosteárico. La figura 2 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos de semillas de Cal éndula officinalis (CalFad2-l y CalFad2-2), Dimorphotheca sinua ta (DMFad2-2) y una enzima de modificación de delta-12 de Dimorphotheca sinuata (DMFad2-l) . Los dos genes de Caléndula, que codifican para enzimas que forman dobles enlaces conjugados 18 : 3?8,10'12, se comparan con los genes de Impa tiens balsamina (ImpFad2 H8) , Momordica charantia (MomFad2) y Chrysobalanus icaco (ChrFad2) que codifican para enzimas que forman dobles enlaces conjugados 18 : 3?9'11'13, una ácido graso hidroxilasa de semilla de ricino (Hidroxilasa) y una omega-6 oleato desaturasa de soya (omega-6 de soya) . Las dos secuencias de aminoácidos de Dimorphotheca sinuata (DMFad2-l y DMFad2-2) se comparan con las delta-12 ácido graso desaturasas de girasol (Helianthus annuus) y borraja (Borago officinalis) , respectivamente. Los motivos de histidina conservados encontrados en las desaturasas e hidroxilasas están encerrados en un cuadro. La posición de la sustitución con glicina para alanina, mencionada en el ejemplo 5, está resaltada con un asterisco (*). La figura 3 muestra el perfil de ácido graso para levadura transgénica que expresa la enzima de modificación de ácido graso de Caléndula asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos. Se muestran cromatogramas de gas de esteres metílicos de ácido graso preparados de levadura tipo silvestre (A) , y levadura transgénica que expresa al gen CalFad2-l de Caléndula . La figura 4 muestra el perfil de ácido graso de callo de tabaco transgénico que expresa la enzima de modificación de ácido graso de Caléndula asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos. Se muestran cromatogramas de gas de esteres metílicos de ácido graso preparados de callo de tabaco tipo silvestre (A) , y callo de tabaco transgénico que expresa al gen CalFad2-l de Caléndula, y ácidos grasos aislados de semillas de Caléndula tipo silvestre. La figura 5 muestra un análisis cromatográfico de gas de esteres metílicos de ácido graso preparados a partir de embriones de soya somáticos que expresan CalFad2-2. Se muestran cromatogramas de gas de esteres metílicos de ácido graso de embriones de soya no transformados (A) y embriones transgénicos que expresan CalFad2-2 (B) . En C se muestra un cromatograma de gas de una mezcla de éster metílico de ácido graso estándar preparada a partir de semillas de Púnica granatum, Momordica charantia y Caléndula officinalis, todas las cuales acumulan ácidos grasos con dobles enlaces conjugados. Las semillas de Púnica acumulan ácido punicico (18:3?9c?s'lltrans'13cis) , las semillas de Momordica acumulan ácido a-eleosteárico (18 : 3?9cis'lltrans'13trans) y las semillas de Caléndula acumulan ácido caléndico (18 : 3?8trans'10trans'12cis) . Como se muestra, el novedoso pico de éster metílico de ácido graso en embriones de soya que expresan CalFad2-2 tiene el mismo tiempo de retención (3.26 minutos) que el ácido metilcaléndico de semillas de Caléndula officinalis . (El pico en B marcado con un asterisco se identifica tentativamente como metilo 18 : 3?8trans'10t"ns'12trans) . La figura 6 muestra un análisis espectral de masas de derivados de 4-metil-l, 2, 4-triazolino-3, 5-diona (MTAD) de ácido metil caléndico de semillas de Caléndula officinali s (A) y de embriones de soya somáticos transgénicos que expresan CalFad2-2 (B) . El reactivo de MTAD reacciona de preferencia con los dobles enlaces ?8trans y ?10trans conjugados de ácido metil caléndico para producir el derivado mostrado en A. Como se indica, el espectro de masas del derivado de MTAD preparado de embriones de soya transgénicos que expresan CalFad2-2 (B) es idéntico al del derivado de MTAD de ácido metil caléndico de semillas de Caléndula (A) . Un espectro de masas similar se obtuvo también de derivados de MTAD preparados de embriones de soya transgénicos que expresan CalFad2-l (datos no mostrados) . La figura 7 muestra la biosintesis de ácido dimorfecólico en embriones de soya somáticos transgénicos. La via biosintética se basa en resultados de la expresión transgénica de DMFad2-l y DMFad2-2 como se describe en el ejemplo 11. La figura 8 muestra los análisis cromatográficos de gas de esteres metílicos de ácido graso de embriones de soya somáticos no transformados (A) , embriones de soya somáticos que expresan DMFad2-l (B) y semillas de Dimorphotheca sinua ta en desarrollo. El pico marcado 18 :2i corresponde al isómero trans-A12 de ácido linoleico (18 : 2?9cis'12trans) . El pico marcado Dimorph . en el panel C corresponde a ácido dimorfecólico . La figura 9 muestra los cromatogramas de iones seleccionados de análisis de CG-EM de derivados de éster metílico de ácido graso de semillas de Dimorphotheca sinuata en desarrollo (A) y embriones de soya somáticos transgénicos que coexpresan DMFad2-l y DMFad2-2 (B y C) . Los cromatogramas se obtuvieron explorando para el ion 225 m/z, el cual es el ion primario del derivado de trimetilsililo de ácido metil dimorfecólico. Los extractos de embriones de soya somáticos mostrados en el panel B carecían de las cantidades detectables del 18:2 ?9c?s'12trans, el substrato que se prefiere para la síntesis de ácido dimorfecólico que se forma por la actividad de DMFad2-l. En contraste, 18:2 ?9cis,12trans componía >10% de los ácidos grasos totales en los extractos de embriones de soya somáticos mostrados en el panel C. cis-Dimorph.=el isómero cis-Á12 tentativamente identificado de ácido dimorfecólico (9-OH-18 :2?9cis'12cis) . Dimorph.=ácido dimorfecólico (9-OH-18 : 2?9c?s'12trans) . La figura 10 muestra los espectros de masa para el derivado de trimetilsililo de ácido metil dimorfecólico a partir de semillas de Dimorphotheca sinuata en desarrollo (k) y de embriones de soya somáticos transgénicos que co-expresan DMFad2-l y DMFad2-2 (B) . SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon ecslc.pk009.nl4 (CalFad2-l) que codifica para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos de semillas de Caléndula officinalis. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende al inserto de ADNc en CalFad2-l. SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon ecslc.pk008.a24 (CalFad2-2) que codifica para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos de semillas de Cal éndula officinalis . SEQ ID NO: 4 y es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en CalFad2-2. SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos que codifica para la enzima ácido graso desaturasa de soya (Glycine max) ilustrada en la figura 2. SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos que codifica para la enzima ácido graso hidroxilasa de semilla de ricino (Ricinus communis) ilustrada en la figura 2. SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon Imph8Fad2 que codifica para enzimas de modificación de ácidos grasos asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados de semillas de Impatiens balsamina . SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon MomFad2 que codifica para enzimas de modificación de ácidos grasos asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados de semillas de Momordica charantia . SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon de ChrFad2 que codifica para enzimas de modificación de ácidos grasos asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados de semillas de Chrysobalanus icaco . SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon dms2c.pk006.d7 (DMFad2-l) que codifica para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos de semillas de Dimorphotheca sinuata . SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en DMFad2-l. SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en el clon dms2c.pk001.113 (DMFad2-2) que codifica para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos de semillas de Dimorphotheca sinuata . SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos que comprende el inserto de ADNc en DMFad2-2. SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos que codifica para la enzima ácido graso desaturasa de girasol (Helianthus annuus) ilustrada en la figura 2. SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos que codifica para la enzima ácido graso hidroxilasa de borraja (Borago officinalis) ilustrada en la figura 2. SEQ ID NO: 16 es el cebador "sentido" del extremo 5' que contiene BamHl usado para amplificar la región de codificación de Caléndula offi cinalis para clonarla en el vector pBI121 para su expresión en tabaco. SEQ ID NO: 17 es el cebador "antisentido" del extremo 3' que contiene SstI usado para amplificar la región de codificación de Caléndula officinalis para clonarla en el vector pBI121 para su expresión en tabaco. SEQ ID NO: 18 es el cebador "sentido" del extremo 5' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación CalFad2-l de Caléndula officinalis para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya. SEQ ID NO: 19 es el cebador "antisentido" del extremo 3' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación CalFad2-l de Caléndula officinalis para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya. SEQ ID NO: 20 es el cebador "sentido" del extremo 5' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación CalFad2-2 de Caléndula officinalis para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya. SEQ ID NO: 21 es el cebador "antisentido" del extremo 3' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación CalFad2-2 de Caléndula officinalis para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya. SEQ ID NO: 22 es el cebador "sentido" del extremo 5' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación DMFad2-l de Dimorphotheca sinua ta para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya. SEQ ID NO: 23 es el cebador "antisentido" del extremo 3' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación DMFad2-l de Dimorphotheca sinua ta para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya.

SEQ ID NO: 24 es el cebador "sentido" del extremo 5' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación DMFad2-2 de Dimorphotheca sinuata para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya. SEQ ID NO: 25 es el cebador "antisentido" del extremo 3' que contiene Notl usado para amplificar la región de codificación DMFad2-2 de Dimorphotheca sinuata para clonarla en el vector pKS67 para su expresión en soya.

Descripción detallada de la invención En el contexto de esta descripción, se usarán un número de términos. Según se usa en la presente, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polimero de ARN o ADN de una o de dos hebras, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polimero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. Los términos "subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "subfragmento funcionalmente equivalente" se usan de manera intercambiable en la presente. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en la cual la capacidad para alterar la expresión de genes o producir cierto fenotipo es conservada ya sea que el fragmento o subfragmento codifique o no para una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento puede usarse en el diseño de genes quiméricos para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Los genes quiméricos se pueden diseñar para usarse en la cosupresión o antisentido uniendo un fragmento de ácido nucleico o subfragmento del mismo, ya sea que codifique o no para una enzima activa, en la orientación adecuada con relación a una secuencia promotora vegetal. Los términos "sustancialmente similar" y "que corresponde sustancialmente", según se usan en la presente, se refieren a fragmentos de ácido nucleico en los que cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión génica o producir cierto fenotipo. Estos términos se refieren también a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tales como deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteren sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento inicial y no modificado.

Se entiende por lo tanto, como lo apreciarán los expertos en la técnica, que la invención abarca más que las secuencias ejemplares especificas. Además, la persona capacitada reconoce que las secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares abarcadas por esta invención también son definidas por su capacidad para hibridar, bajo condiciones moderadamente severas (por ejemplo, 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 60°C) con las secuencias ejemplificadas en la presente, o a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos reportadas en la presente, y las cuales son funcionalmente equivalentes al promotor de la invención. Las secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares que se prefieren y abarcas por esta invención son aquellas secuencias que son 40% idénticas a los fragmentos de ácido nucleico reportados en la presente o las cuales son 40% idénticas a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos reportadas en la presente. Se prefieren más los fragmentos de ácido nucleico que son 50% idénticos a las secuencias de ácido nucleico reportadas en la presente, o los cuales son 50% idénticos a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos reportadas en la presente. Se prefieren más los fragmentos de ácido nucleico que son 60% idénticos a las secuencias de ácido nucleico reportadas en la presente, o los cuales son 60% idénticos a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos reportadas en la presente. Las alineaciones de secuencia y cálculos de similitud porcentual se pueden determinar usando el programa Megalign de la serie de cómputo de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl) . La alineación múltiple de las secuencias se lleva a cabo usando el método Clustal de alineación (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros por omisión (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) [PENALIDAD DE ESPACIO=10, PENALIDAD DE LONGITUD DE ESPACIO=10] . Los parámetros por omisión para las alineaciones por pares y el cálculo de la identidad porcentual de las secuencias de proteínas usando el método Clustal son KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5 (KTUPLE=1, PENALIDAD DE ESPACIO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5) . Para ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 y DIAGONALS SAVED=4 (KTUPLE=2, PENALIDAD DE ESPACIO=5, VENTANA=4 y DIAGONALES SALVADAS=4) . Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen como para producir la identificación putativa de ese polipéptido o gen, ya sea mediante la evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica, o por medio de comparación e identificación de secuencias automatizada por computadora usando algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F. y otros, (1993) J. Mol . Biol . 215:403-410) y Gapped Blast (Altschul, S. F. y otros, (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389-3402, véase también ww . ncbi . nlm. nih . gov/BLAST/ ) . "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteina especifica, incluyendo secuencias reguladoras anteriores (secuencias no codificadoras 5') y posteriores (secuencias no codificadoras 3') de la secuencia de codificación. "Gen nativo" se refiere a un gen como el encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y de codificación que no se encuentren juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que se deriven de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su lugar natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un en que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. "Secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos especifica. "Secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas hacia el extremo 5' (secuencias no codificadoras 5' ) , dentro, o hacia el extremo 3' (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia de codificación, y las cuales tienen influencia en la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no están limitadas a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. "Promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. La secuencia promotora consiste en elementos hacia el extremo 5' proximales y más distales, los últimos elementos siendo comúnmente referidos como mejoradores. En consecuencia, un "mejorador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o especificidad de tejido de un promotor. Los promotores se pueden derivar en su totalidad a partir de un gen nativo, o pueden estar compuestos de elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Se entiende por los expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células diferentes, o en etapas de desarrollo diferentes, o en respuesta a condiciones ambientales diferentes. Los promotores que ocasionan que un gen sea expresado en la mayoría de los tipos de células casi siempre se refieren comúnmente como "promotores constitutivos". Promotores nuevos de varios tipos útiles en células vegetales se están descubriendo constantemente; numerosos ejemplos se pueden encontrar en la recopilación por Okamuro y Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Se reconoce además que ya que en la mayoría de los casos los limites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, fragmentos de ADN de cierta variación pueden tener actividad promotora idéntica. Un "intrón" es una secuencia de intervención en un gen que no codifica para una porción de la secuencia de proteínas. De esta manera, esas secuencias se transcriben en ARN pero después son cortadas y no son traducidas. El término se usa también para las secuencias de ARN cortadas. Un "exón" es una porción de la secuencia de un gen que es transcrita y se encuentra en el ARN mensajero maduro derivado del gen, pero que no necesariamente es una parte de la secuencia que codifica para el producto génico final. La "secuencia lider de traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia lider de traducción está presente en el ARNm completamente procesado hacia el extremo 5' de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia lider de traducción puede afectar el procesamiento del transcripto primario a ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficiencia de traducción. Ejemplos de secuencias líderes de traducción se han descrito (Turner, R. y Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225) . Las "secuencias no codificadoras 3' " se refieren a secuencias de ADN localizadas hacia el extremo 3' de una secuencia de codificación e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican para señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente porque afecta la adición de tractos de ácido poliadenilico al extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificadoras 3' se ejemplifica por Ingelbrecht y otros, (1989) Plant Cell 1:671-680. "Transcripto de ARN" se refiere al producto que resulta de la trascripción de una secuencia de ADN catalizada por ARN polimerasa. Cuando el transcripto de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, es referido como el transcripto primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento post-transcripcional del transcripto primario y es referida como el ARN maduro. "ARN mensajero (ARNm)" se refiere al ARN que está sin intrones y que puede traducirse en proteina por la célula. "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario a, y sintetizado de un molde de ARNm usando la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser de hebra individual o convertirse en la forma de doble hebra usando el fragmento klenow de ADN polimerasa I. ARN "sentido" se refiere a un transcripto de ARN que incluye al ARNm y que por lo tanto puede introducirse en proteina dentro de una célula o in vi tro. "ARN antisentido" se refiere a un transcripto de ARN que es complementario a todo o parte del transcripto primario objetivo o ARNm, y que bloquea la expresión de un gen objetivo (patente de E.U.A. No. 5,107,065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcripto génico especifico, es decir, en la secuencia no codificadora 5' , secuencia no codificadora 3', intrones o la secuencia de codificación. "ARN funcional" se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que pudiera no ser traducido pero que tenga un efecto en los procesos celulares. Los términos "complemento" y "complemento inverso" se usan en forma intercambiable en la presente con respecto a transcriptos de ARNm, e intentan definir el ARN antisentido del mensaje. El término "unido operablemente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico para que la función de uno sea afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor es unido operablemente con una secuencia de codificación cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación esté bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden unirse operablemente a secuencias reguladoras en orientación de sentido o antisentido. El término "expresión", según se usa en la presente, se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión o sobre-expresión de un gen incluye la trascripción del gen y la traducción del ARNm en un precursor o proteina madura. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcriptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteina objetivo. "Sobre-expresión" se refiere a la producción de un producto génico en organismos transgénicos que excede niveles de producción en organismos normales o no transformados. "Co-supresión" se refiere a la producción de transcriptos de ARN sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (patente de E.U.A. No. 5,231,020) . "Expresión alterada" se refiere a la producción de productos génicos en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que son diferentes significativamente de la actividad en tejido comparable (de órganos y de tipo en desarrollo) de organismos tipo silvestre.

Proteina "madura" se refiere a un polipéptido procesado después de la traducción; es decir, uno del cual cualquier pre o propéptido presente en el producto de traducción primaria haya sido removido. Proteina "precursora" se refiere al producto primario de la traducción de ARNm; es decir, con pre y propéptidos aún presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no están limitados a, señales de localización intracelular. Un "péptido de tránsito a cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que es traducida en conjunto con una proteina y dirige la proteina al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la cual se haga la proteina. "Secuencia de tránsito a cloroplasto" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de transito a cloroplasto. Un "péptido de señal" es una secuencia de aminoácidos que es traducida en conjunto con una proteina y dirige la proteina al sistema secretor (Chrispeeis, J. J., (1991) Ann. Rev. Plant Phys . Plant Mol .

Biol . 42:21-53). Si la proteina va a ser dirigida a una vacuola, una señal de dirección vacuolar (véase arriba) puede añadirse también, o si es hacia el retículo endoplásmico, se puede añadir una señal de retención de retículo endoplásmico (véase arriba) . Si la proteina va a dirigirse al núcleo, cualquier péptido de señal presente debe removerse y en lugar de éste incluirse una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys . 100:1627-1632). "Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, originando una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son conocidos como organismos "transgénicos". El método preferido para la transformación de arroz, maiz y otras monocotiledóneas es el uso de tecnología de transformación de partículas aceleradas o "pistola de genes" (Klein y otros, (1987) Nature (Londres) 327:70-73; patente de E.U.A. No. 4,945,050), o un método mediado por Agrobacteri um usando un plásmido Ti adecuado que contenga al transgen (Ishida Y. y otros, 1996, Na ture Biotech . 14:745-750) . Las técnicas estándares de ADN recombinante y de clonación molecular usadas en la presente se conocen bien en la técnica y se describen más completamente en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cl oning: A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (en adelante "Sambrook") .

"PCR" o "Reacción en Cadena de la Polimerasa" es una técnica para síntesis de grandes de cantidades de segmentos de ADN específicos, consiste en una serie de ciclos repetitivos (Perkin El er Cetus Instruments, Norwalk, CT) . Típicamente, el ADN de doble hebra se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios a los limites 3' del segmento objetivo son unidos a baja temperatura y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas es conocido como un ciclo. Una "construcción de expresión" según se usa en la presente comprende cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención usados ya sea solos o en combinación unos con otros como se describió aqui, y se pueden usar además en conjunto con un vector o un subfragmento del mismo. Si se usa un vector, entonces la elección del vector depende del método que se usará para transformar plantas huésped como se conoce bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un vector plasmidico. La persona capacitada está consiente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para poder transformar, seleccionar y propagar exitosamente células o plantas huésped que comprendan cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. Esta persona capacitada también reconocerá que los diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y otros, (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Al eida y otros, (1989) Mol . Gen . Genetics 218:78-86), y de esta manera que deben analizarse varios eventos para poder obtener lineas que desplieguen el nivel y patrón de expresión deseados. Este análisis puede lograrse mediante el análisis Southern de ADN, el análisis Northern de la expresión de ARNm, el análisis Western de la expresión de proteínas, o el análisis fenotipico. Los términos "construcción de expresión" y "construcción de expresión recombinante" se usan de manera intercambiable en la presente. El término "?6-ácido oleico desaturasa" se refiere a una enzima cistosólica que cataliza la inserción de un doble enlace en ácido oleico entre el doceavo y treceavo átomos de carbono en relación al extremo carboxilo de la cadena acilo. Los dobles enlaces se conocen como "cis" o "trans" debido a que son unidades quirales que pueden asumir las siguientes estructuras no equivalentes: -(H)2C C(H) H C(H)2- \ / \ / c=c c=c I \ I \ H H -(H)2C H cis trans El substrato de ácido linoleico para esta enzima puede unirse a un glicerolipido tal como fosfatidilcolina. En cadenas de ácido graso los carbonos omega se cuentan desde el extremo metilo, mientras que los carbonos delta se cuentan desde el extremo carboxilo. Asi, el término "posición delta-9", según se usa en la presente, significa el noveno átomo de carbono contando desde el extremo carboxilo de la cadena de ácido graso. Las modificaciones que incluyen la posición delta-9 incluyen, pero no están limitadas a, por lo menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en la formación de dobles enlaces, la formación de dobles enlaces conjugados, hidroxilación, epoxilación, hidroxi-conjugación y similares. Por ejemplo, una modificación puede incluir sólo una alteración como una formación de doble enlace conjugado, o una modificación puede incluir más de una alteración tal como la formación de dobles enlaces conjugados y la hidroxilación (hidroxi-conjugación) . El término "modificación de la posición delta-9 (?9) " y "una posición delta-9 (?9) modificada" se usan en forma intercambiable. Asimismo, el término "modificación de la posición delta-12", según se usa en la presente, significa una formación de doble enlace que incluye al carbono 12 contando desde el extremo carboxilo de la cadena de ácido graso. Esta modificación que se describe en la presente invención incluye la formación de un doble enlace trans-?l2 dando como resultado la formación de ácido trans-linoleico (18:2 ?9c?s'12trans) . En la producción de ácido caléndico, el doble enlace delta-9 de ácido linoleico (18:2 ?9'12) se convierte por la actividad de CalFad2-l o CalFad2-2 en dobles enlaces delta-8 y delta-10. El ácido caléndico resultante, un derivado de ácido linolénico, contiene dobles enlaces delta-8, delta-10 y delta-12 en conjugación (18:3 ?8'10"12) . CalFad2-l y CalFad2-2 son de esta forma distintos de todos los polipéptidos relacionados con Fad2 reportados anteriormente por su capacidad para modificar la posición delta-9 en lugar de la posición delta-12 de un ácido graso. Las enzimas de Impatiens balsamina, Momordica charantia y Chrysobalanus icaco, mostradas en la figura 2, todas convierten el doble enlace delta-12 de ácido linoleico en dobles enlaces conjugados delta-11 y delta-13, para formar ácido eleosteárico (18 : 3?9'11'13) . En la producción de ácido dimorfecólico (9-hidroxi-18:2 ?10trans'12trans, véase figura 7 para la estructura) ácido oleico se convierte primero en ácido trans-linoleico (18:2?9cls'1 trans) por la enzima designada DMFad2-l. Esta enzima (DMFad2-l) es una enzima de modificación de ácido graso de Dimorphotheca sinuata asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12, en donde la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos insertando un doble enlace que tenga una configuración trans entre los átomos de carbono 12 y 13. El producto resultante de esta reacción enzimática es ácido trans-linoleico. Este producto se vuelve después el substrato para la siguiente reacción enzimática en esta via. En forma especifica, el ácido trans-linoleico se convierte por la enzima DMFad2-2 en ácido dimorfecólico, el cual es un ácido graso que contiene doble enlace conjugado. La enzima DMFad2-2 es una ?-9 hidroxi-conjugasa de Dimorphotheca sinuata . La enzima introduce un grupo hidroxilo en la posición 9 y convierte 18 : 2?9c?s'12trans (ácido trans-linoleico) en el ácido dimorfecólico que contiene enlace doble conjugado (9-hidroxi-18 : 2?10tran?'12trans) . Un producto relacionado, ácido cis-dimorfecólico (9-hidroxi-18:2?10trans'12cls, véase figura 7 para la estructura) se produce mediante DMFad2-2 a partir de ácido linoleico de soya endógeno (18 : 2?9trans'12cis) . Se cree que la forma trans- del ácido linoleico es el substrato que se prefiere para DMFad2-2. Las enzimas de la presente invención, con excepción de DMFad2-l, comprenden actividades que incluyen la modificación de ácidos grasos en la posición delta-9, dando como resultado la formación de dobles enlaces conjugados. El término "doble enlace conjugado" se define como dos dobles enlaces en las posiciones relativas indicadas por la fórmula -CH=CH-CH=CH- (Grant & Hackh' s Chemical Dictionary, Quinta Ed., R. Grant y C. Grant eds., McGraw-Hill, Nueva York). Los electrones p-orbitales son compartidos entre los dobles enlaces conjugados, pero permanecen relativamente independientes en dobles enlaces conjugados. Esto explica la mayor reactividad de los dobles enlaces conjugados a la oxidación. Las enzimas de modificación, asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados descrita en la presente, están relacionadas con, y comparten homología de secuencia para, las ácido graso desaturasas (Fads) , especialmente la clase Fad2. Las Fads introducen dobles enlaces en cadenas de ácido graso que resultan en la formación de los aceites mono y poliinsaturados, tales como oleato, linoleato y linolenato, pero no producen dobles enlaces conjugados. Los términos "relacionada con Fad2" y "tipo Fad2" reflejan la conservación y diferencias en la homología de la secuencia de ácido nucleico entre los genes que codifican para las enzimas Fad2 contra los genes de la presente invención. Esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-9 de ácidos grasos, o en el caso de DMFad2-l, la modificación de una posición delta-12, en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas, determinado por una comparación diseñada para detectar secuencias homologas.

Esta invención se refiere también a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas, determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. Estas enzimas se expresan normalmente en semillas en desarrollo de Calenula officinalis o Dimorphotheca sin?ata que son similares en secuencia a ácido graso desaturasas vegetales y unidas a la membrana. Sin embargo, estas enzimas de modificación de ácido graso son diferentes de las ácido graso desaturasas unidas a la membrana en su funcionalidad. En forma especifica, estas enzimas están asociadas con la formación de ácidos grasos que tienen dobles enlaces conjugados y, más particularmente, con la formación de ácidos linolénicos conjugados. Ejemplos de ácidos grasos que tienen dobles enlaces conjugados incluyen, pero no están limitados a, ácido eleosteárico y/o ácido parinárico. Los aceites vegetales que ocurren naturalmente y que contienen ácido eleosteárico incluyen aceite de palo de Aleuri tes fordii o montana, el cual contiene hasta 69% de ácido a-eleosteárico en el aceite extraído de las semillas, o aceites de especies de valeriana ( Centrathus microsiphon) . También se puede mencionar el ácido jacárico (del árbol de Jacaranda, Jacaranda mimosifolia y Jacaranda chelonia, i8:3?8c?s'10trans'12cls) , ácido caléndico (de caléndula o margarita africana, Caléndula officinalis, Osteospermum spinescens y Osteospermum hyoseroides, 18 : 3?8tra^'10trans'1 cls) , ácido catálpico (del jazmín trompeta, Catalpa ovata, o speciosa, o bigninioides, !8.3?9trans'lltrans'13c?s) , y ácido punicico (del melón amargo o granado, o especie Tricosanthes, Cucúrbi ta y Púni ca granatum, Tricosanthes cucumeorides, 18:3?9c?s'lltrans'13c?s) . Estos y otros ejemplos de ácidos grasos que tienen dobles enlaces conjugados se pueden encontrar en "The Lipid Handbook" (Segunda Edición, Gunstone, F.D., y otros, eds., Chapman y Hall, Londres, 1994), Crombie y Holloway (J. Chem. Soc . Perkins Trans. 1985:2425-2434) y Liu, y otros ( Plant . Physiol .

[1997] 113:1343-1349). Estos ácidos grasos conjugados también se conocen como ClnAs (ácidos linolénicos conjugados) porque todos tienen una composición 18:3. Esto contrasta con los CLAs (ácidos linoleicos conjugados) que tienen una configuración 18:2. La nomenclatura "18:3" indica el número de carbonos en la cadena de ácido graso (en este caso "18" o longitud de ácido esteárico) , y el número de dobles enlaces no saturantes (en este caso "3" que especifica a este ácido graso como linolénico) . Aunque 18:2 y 18:3 denotan ácido linoleico y ácido linolénico, respectivamente, las posiciones de los dobles enlaces no son especificadas (es decir, pueden ser no conjugadas o conjugadas, cis o trans) . El término "ácido caléndico" según se usa en la presente, se refiere a una mezcla de isómeros cis-trans de ácido ?8'10'12-octadecatrienoico (18 : 3?8'10'12) . Esta mezcla está compuesta principalmente del isómero ?8trans'10trans'12c?s del ácido octadecatrienoico (18:3) pero también puede contener varios isómeros cis-trans de este ácido graso. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, los diferentes isómeros del ácido caléndico se separan fácilmente mediante cromatografía de gas-espectrometria de masas (CG-EM, véase figura 3) . Más detalles acerca de los análisis de CG-EM se encuentran en los ejemplos 3, 4, 6, 7 y 8. El término "ácido dimorfecólico" se usa en la presente para referirse a 9-hidroxi-18 :2?10tran?,12trans (véase figura 7 para la estructura) . Este inusual ácido graso y el intermediario que es su precursor (ácido trans-linoleico, l8:2?9cis,12trans) se pueden analizar mediante análisis de CG-EM (véase ejemplo 11) y mediante resonancia magnética nuclear de correlación bidimensional 1H-13C RMN (véase ejemplo 12) . Ejemplos de métodos de comparación que detectan homología de secuencias incluyen pero no se limitan al método de computadora BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y otros (1993) J. Mol . Biol . 215:403-410; véase también ww . ncbi . lm. ih. gov/BLAST/ ) que incluye BLASTN (nucleótido, ambas hebras), BLASTX (nucleótido, traducción de seis marcos), BLASTP (proteina), TBLASTN (proteina, de traducción de seis marcos) , TBLASTX (nucleótido, traducción de seis marcos) , (para más información acerca de BLAST, véase "ayuda" o "manuales de blast" localizados en blast@r.cbi .nlm.nih. gov/BLAST/) , el programa Megalign de la serie de cómputo de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl, usado para calcular la identidad porcentual) , y el método Clustal de alineación de secuencias múltiples (Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153). Los parámetros por omisión se usaron para todas las comparaciones y para todos los métodos. La serie BLAST en NCBI tiene una descripción detallada de sus algoritmos en su sitio de red, el programa Megalign usa un programa Clustal que comparte parámetros por omisión con Clustal, a saber, para varias alineaciones de secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) [PENALIDAD DE ESPACIO=10, PENALIDAD DE LONGITUD DE ESPACIO=10] , para alineaciones por pares de ácidos nucleicos (KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WIND0W=4, DIAGONALS SAVED=4) [KTUPLE=2, PENALIDAD DE ESPACI0=5, VENTANA=4 y DIAGONALES SALVADAS=4), y para alienaciones por pares de polipéptidos (KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5, DIAGONALS SAVED=5) [KTUPLE=1, PENALIDAD DE ESPAC10=3, VENTANA=5, DIAGONALES SALVADAS=5) . Esta invención se refiere también a lo siguiente: a) un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-9 de ácidos grasos, en donde el fragmento codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13, asi como b) un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalentemente del mismo codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13. En otro aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden en la posición delta-9 de ácidos grasos o un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica la posición delta-9 del ácido graso en donde los fragmentos o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos hibridan a cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifican para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-9 de ácidos grasos o asociada con la modificación de la posición delta-9, en donde los fragmentos o subfragmentos codifican para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13, y además en donde los fragmentos o subfragmentos (a) hibridan a estos fragmentos de ácido nucleico aislados o subfragmentos funcionalmente equivalentes bajo condiciones de severidad moderada o (b) son por lo menos 40% idénticos a un polipéptido codificado por cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados anteriores o subfragmentos funcionalmente equivalentes del mismo según se determina por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. Ejemplos de métodos de comparación adecuados que detectan secuencias homologas se describen arriba. También es de interés un gen quimérico que comprende cualquiera de los presentes fragmentos de ácido nucleico aislados, o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos, o un complemento de los mismos unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas, en donde la expresión del gen quimérico da como resultado la producción de niveles alterados de la enzima deseada en una célula huésped o planta transformada. La invención se refiere también a métodos para usar estos fragmentos de ácido nucleico aislados, o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos, o el complemento de los mismos, para alterar el nivel de ácidos grasos que comprenden una modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en una célula huésped o planta, el cual comprende: (a) transformar una célula huésped o planta con cualquiera de los presentes genes quiméricos; (b) cultivar la célula huésped o planta transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una modificación en la posición delta-9. En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden una modificación en la posición delta-9 en las semillas de plantas, el cual comprende: (a) transformar una célula vegetal con cualquiera de los presentes genes quiméricos; (b) cultivar una planta madura fértil a partir de la célula vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una modificación en la posición delta-9; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) para obtener aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan una modificación en la posición delta-9. En otro aspecto más, esta invención se refiere a un método para producir enzimas de modificación de ácido graso vegetal asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos, el cual comprende: (a) transformar una célula huésped microbiana con cualquiera de los presentes genes quiméricos; (b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas que contengan niveles alterados de proteina codificada por el gen quimérico. Los fragmentos de ácido nucleico aislados que codifican para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis se proporciona en SEQ ID NO:l y 3, y las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes se proporcionan en SEQ ID NO: 2 y 4, y en las semillas de Dimorphotheca sinuata se proporcionan en SEQ ID NO: 12, y las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes se proporcionan en SEQ ID NO: 13. Las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos de otras plantas y de otras enzimas de modificación de ácidos grasos vegetales que son capaces de modificar la posición delta-9 de un ácido graso se pueden identificar ahora mediante cuando la secuencia de nucleótidos hibride a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID N0:1, 3 y 12 bajo condiciones de severidad moderada, como se describió arriba, o (b) sea por lo menos 40% idéntica a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID N0s:l, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. Las secuencias de aminoácidos codificadas por estas secuencias de nucleótidos descritas en la presente se comparan en la figura 2 con las secuencias que codifican para enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos conjugados en Impa tiens, Momordica , Chrysobalanus, y delta-12 desaturasas de Helianthus y Borago, asi como las ácido graso desaturasas de soya que insertan el segundo doble enlace entre los átomos de carbono 12 y 13 en ácido graso monoinsaturado, ácido oleico para producir ácido linoleico. Los fragmentos de ácido nucleico aislados de la presente invención, o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos, o el complemento de los mismos, se pueden usar para crear genes quiméricos para transformar células huésped o plantas. Ejemplos de células huésped que se pueden transformar incluyen células procarióticas y eucarióticas. Se pueden mencionar microorganismos tales como la bacteria E. coli y levadura Saccharomyces cerevisiae . Ejemplos de células vegetales incluyen pero no están limitadas a las obtenidas de soya, especie Brassi ca de semillas oleaginosas, maiz, cacahuate, arroz, trigo, girasol, cártamo, algodón, palma, lino y cacao. De esta manera, los genes quiméricos de la presente invención se pueden usar para crear plantas transgénicas en las cuales las enzimas de modificación de ácido graso que modifican la posición delta-9 de los ácidos grasos en las semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata estén presentes a niveles más altos que los normales o en tipos de células o etapas de desarrollo en las cuales no se encuentre normalmente. También son de interés las semillas obtenidas de estas plantas y el aceite obtenido de estas semillas. Se pueden hacer plantas transgénicas en las cuales la enzima de modificación de ácido graso asociada con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos esté presente a niveles más bajos que los normales o en tipos de células o etapas de desarrollo en las cuales no se encuentre normalmente. Esto tendría el efecto de alterar el nivel de estos ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada en esas células. Podria ser deseable reducir o eliminar la expresión de un gen que codificara para estas enzimas en plantas para algunas aplicaciones. Para lograr esto, un gen quimérico diseñado para la co-supresión de la enzima endógena podria construirse uniendo un gen o fragmento génico que codifique para una enzima de modificación de ácido graso asociada con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos a secuencias promotoras vegetales . Como alternativa, un gen quimérico diseñado para expresar ARN antisentido para todo o parte del presente fragmento de ácido nucleico se puede construir uniendo el gen o un fragmento génico en orientación inversa a secuencias promotoras vegetales. Ya sea la co-supresión o genes quiméricos antisentido se podrían introducir en las plantas mediante transformación, en donde la expresión de los genes endógenos correspondientes se reduzca o se elimine. Cuando son sobre-expresadas en células vegetales, la enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata puede ser útil para causar la biosintesis y acumulación de ácidos grasos con dobles enlaces conjugados, tales como ácido caléndico, en esas células. Es particularmente útil usar enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata para producir ácidos grasos que contengan dobles enlaces conjugados en las células de las semillas o de plantas de cultivo de semillas oleaginosas. La sobre-expresión de las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata se puede lograr construyendo primero un gen quimérico en el cual la región de codificación de moléculas de ADNc para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata se una operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en la etapa de desarrollo deseada. Por motivos de conveniencia, el gen quimérico puede comprender una secuencia promotora y una secuencia lider de traducción derivada del mismo gen. También deben proporcionarse secuencias no codificadoras 3' que codifiquen para señales de terminación de traducción. Los presentes genes quiméricos también pueden comprender uno o más intrones para facilitar la expresión génica. Vectores, tales como vectores plasmidicos, que comprendan los presentes genes quiméricos pueden construirse después. La elección del vector plasmidico depende del método que se usará para transformar plantas huésped. El experto en la técnica conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector plasmidico para poder transformar, seleccionar y propagar exitosamente células huésped o plantas que contengan al gen quimérico. El experto en la técnica reconocerá también que diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y otros, (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida y otros, (1989) Mol . Gen . Genetics 218:78-86), y de esta manera que se deben analizar varios eventos para poder obtener lineas que desplieguen el nivel y patrón de expresión deseado. Estos análisis se pueden lograr mediante el análisis Southern de ADN, el análisis Northern de la expresión de ARNm, el análisis Western de la expresión de proteínas o el análisis fenotipico. Para algunas aplicaciones podria ser útil dirigir las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata a diferentes compartimientos celulares, o facilitar su secreción de la célula. Se vislumbra de esta manera que los genes quiméricos descritos arriba pueden complementarse más alterando las secuencias de codificación para codificar enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata descritas en la presente con secuencias de dirección intracelular adecuadas tales como secuencias de tránsito (Keegstra, K. (1989) Cell 56:247-253), secuencias de señal o secuencias que codifiquen para la localización del retículo endoplásmico (Chrispeeis, J.J., (1991) Ann. Kev. Plant . Phys . Plant Mol . Biol . 42:21-53), o señales de localización nucleares (Raikhel, N. (1992) Plant Phys . 100:1627-1632) añadidas y/o con secuencias de dirección que ya estén removidas actualmente. Aunque las referencias citadas dan ejemplos de cada uno de estos, la lista no es exhaustiva y se pueden descubrir más señales de dirección de utilidad en el futuro. Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, o el subfragmento funcionalmente equivalente de los mismos, se pueden usar para aislar moléculas de ADNc y otros fragmentos de ácido nucleico que codifiquen para enzimas de modificación de ácido graso homologas de la misma u otras especies vegetales. El aislamiento de los genes homólogos usando protocolos dependientes de secuencia se conoce bien en la técnica. Ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no están limitados a, métodos de hibridación de ácido nucleico, y métodos de amplificación de ADN y ARN como los ejemplificados por varios usos de tecnologias de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa, reacción en cadena de ligasa) . El término "secuencias conservadas" según se usa en la presente, abarca tanto la conservación estricta como la conservación de una mayoría de las secuencias usadas en una alineación, por ejemplo, conservación con respecto a una secuencia de consenso.

Asi, en un aspecto más esta invención se refiere a un método para aislar fragmentos de ácido nucleico y subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos, que comprende: (a) comparar SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13 u otras secuencias de polipéptidos de enzima de modificación de ácido graso vegetal; (b) identificar secuencias conservadas de cuatro o más aminoácidos obtenidos en la etapa (a) ; (c) diseñar oligómeros degenerados con base en las secuencias conservadas identificadas en la etapa (b) ; y (d) usar los oligómeros degenerados de la etapa (c) para aislar secuencias que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal o una porción de la misma asociada con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos mediante protocolos dependientes de secuencia. Por ejemplo, los genes que codifican para enzimas de modificación de ácido graso homologas, ya sea como moléculas de ADNc o moléculas de ADN genómicas, podrían aislarse directamente usando todos o una porción de los presentes fragmentos de ácido nucleico como sondas de ^^. hibridación de ADN para analizar bibliotecas de cualquier planta deseada empleando metodología bien conocida por los expertos en la técnica. Las sondas de oligonucleótidos especificas basadas en las presentes secuencias de ácido nucleico se pueden diseñar y sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook) . Además, las secuencias completas se pueden usar directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por el experto en la técnica tales como marcación de ADN con cebadores aleatorios, traducción de mella o técnicas de marcado de extremos, o sondas de ARN usando sistemas de transcripción in vi tro disponibles. Además, se pueden diseñar cebadores específicos y usarse para amplificar una parte de, o la longitud completa de las secuencias. Los productos de amplificación resultantes se pueden marcar directamente durante reacciones de amplificación, o marcarse después de reacciones de amplificación, y usarse como sondas para aislar ADNc de longitud completa o fragmentos genómicos bajo condiciones de severidad adecuadas. Además, dos segmentos cortos de los presentes fragmentos de ácido nucleico se pueden usar en protocolos de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifiquen para genes homólogos de ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también puede llevarse a cabo en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados en donde la secuencia de un cebador se derive de los presentes fragmentos de ácido nucleico, y la secuencia del otro cebador saque ventaja de la presencia de los tractos de ácido poliadenilico hacia el extremo 3' del precursor de ARNm que codifique para genes vegetales. Como alternativa, la segunda secuencia de cebadores se puede basar en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el experto en la técnica puede seguir el protocolo RACE (Froh an y otros, (1988) PNAÜ USA 85:8998) para generar moléculas de ADNc mediante el uso de PCR para amplificar copias de la región entre un solo punto en el transcripto y el extremo 3' ó 5' . Los cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' se pueden diseñar a partir de las presentes secuencias. Usando los sistemas 3'RACE o 5'RACE disponibles comercialmente (BRL), se pueden aislar fragmentos de ADNc 3' o 5' específicos (Ohara y otros, (1989) PNAUS USA 86:5673, Loh y otros, (1989) Science 243:217). Los productos generados por los procedimientos RACE 3' y 5' se pueden combinar para generar moléculas de ADNc de longitud completa (Forman, M.A. y Martin, G.R., (1989) Techniques 1:165).

De esta manera, otros fragmentos de ácido nucleico que codifiquen para enzimas asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos se pueden identificar usando cualquiera de las metodologías generales descritas arriba. Por ejemplo, se puede identificar un grupo general de moléculas de ADNc relacionadas con ácido graso desaturasa (FAD) , y un subconjunto especifico de estas enzimas de codificación de moléculas de ADNc implicadas en la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos se puede detectar o analizar mediante transformación. Un grupo de secuencias de ADNc que codifiquen para enzimas tipo ácido graso desaturasa puede identificarse usando hibridación de baja severidad (por ejemplo 2X SSC, 0.1% SDS, 60°C) con una sonda que corresponda a cualquier secuencia de FAD conocida, y/o toda o parte de las secuencias presentadas en cualquiera de SEQ ID NOs:l, 3 ó 12. Como alternativa, moléculas de ADNc secuenciadas en forma aleatoria se pueden analizar por medio de un programa de computadora diseñado para detectar secuencias homologas, tales como, pero no limitados a, BLAST o BLAST por espacios (usando parámetros por omisión estándares) . BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y otros (1993) J. Mol . Biol . 215:403-410; véase también www.ncbi .nl . ni . gov/BLAST/ ) busca la similitud a secuencias contenidas en la base de datos "nr" de BLAST (que comprende todas las traducciones de CDS GenBank no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, la última liberación principal de la base de datos de la secuencia de proteínas SWISS-PROT, EMBL y las bases de datos DDBJ) . Las secuencias de prueba se analizan para similitud a todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) . Las secuencias de ADN se traducen en todos los marcos de lectura y se comparan para similitud con todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nature Genetics 3:266-272) proporcionado por el NCBI . Por motivos de conveniencia, el valor P (probabilidad) , o "pLog" (el negativo del logaritmo del valor P) , se da como una medida de similitud entre las dos secuencias. Una secuencia de prueba y una secuencia contenida en las bases de datos buscadas se comparan, y la probabilidad de que las dos secuencias se relacionen sólo por posibilidad se calcula mediante BLAST y se reporta como un valor "pLog". En consecuencia, entre mayor sea el valor pLog, mayor será la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el "acierto" de BLAST representen proteínas homologas. Las secuencias con pLogs mayores que 5, o de preferencia mayores que 10, o muy preferiblemente mayores que 15, y más preferiblemente mayores que 20, que se definen como FADs o lipido desaturasas son candidatos. Las moléculas de ADNc que codifican para enzimas asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos se pueden identificar de los grupos de candidatos usando análisis de transformación. Las moléculas de ADNc individuales se insertan en vectores de expresión y se transforman en células huésped de levadura o vegetales usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véanse los ejemplos 3, 4, 6, 7 y 8) . La producción de ácidos grasos que contienen dobles enlaces conjugados se confirma mediante análisis de CG-EM como los descritos en los ejemplos 3 y 4. Células de cultivo de tejido de levadura o planta se prefieren para el análisis inicial gracias a la velocidad y a la facilidad con la cual se pueden manejar cuando se manejan grandes números de transformantes y la biología de células y fisiología de células eucarióticas adecuadas. Las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de i^j >....<- , , ,.^? > . ácidos grasos en semillas de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata producidas en células huésped o plantas heterólogas, particularmente en las células de huéspedes microbianos, se pueden usar para preparar anticuerpos para las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Cal éndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata en células o in vi tro en extractos de células. Las células huésped heterólogas que se prefieren para la producción de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinua ta son huéspedes microbianos. Los sistemas de expresión microbianos y los vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas extrañas se conocen bien por los expertos en la técnica. Cualquiera de estos se puede usar para construir genes quiméricos para la producción de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata . Estos genes quiméricos pueden introducirse después en microorganismos adecuados mediante transformación para proporcionar expresión de alto nivel de las enzimas de modificación de ácido graso codificadas asociadas con la modificación de la posición delta-9 de un ácido graso en semillas de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata . Un ejemplo del uso de la enzima de modificación de ácido graso de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata en Saccharomyces cerevisiae para la producción de ácido caléndico se describe abajo en el Ejemplo 4. Un ejemplo de un vector para la expresión de alto nivel de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos en semillas de Caléndula afficinalis o Dimorphotecha sinuata en una célula huésped bacteriana se describe abajo en el Ejemplo 8. En otro aspecto más, se ha encontrado que los ácidos grasos modificados en la posición delta-9, y en particular, los ácidos grasos que tienen dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-9, más específicamente, ácidos linolénicos conjugados también pueden usarse como un aditivo de alimento para animales. La calidad de la carne para consumo depende de muchas variables que finalmente tienen influencia en la demanda en el mercado por el producto. Por ejemplo, la mejora en la calidad de la carne de cerdo es un enfoque primario en la industria de la carne de cerdo. Las variables de calidad incluyen el color de la carne de cerdo, la capacidad de retención de agua, el tamaño, la composición química y la firmeza del tejido magro y graso. Experimentos han mostrado que la firmeza de la grasa del puerco puede influenciarse por la adición de ácido linoleico conjugado (18 :2?9c?s'lltrans o ?10trans'12c?s) a las dietas de marranos (Eggert, J.M., y otros (1999) J. Anim. Sci . 77 (Suppl): 53; Thiel, R.C. y otros (1998) J. Anim. Sci . 76(Suppl): 13; Wiegand, B.R., F.C. Parrish Jr y J.C. Sparks (1999) J. Anim. Sci . 77 (Suppl) : 19; patente de E.U.A. No. 5,554,646 y patente de E.U.A. No. 5,851,572). Algunos experimentos también han reportado un carácter magro de cadáver mejorado y la eficiencia de utilización del alimento cuando se añade ácido linoleico conjugado (CLA) como un complemento para la dieta. Se desconoce si el alimentar ácidos grasos conjugados diferentes pudiera tener efectos similares. La presente invención describe la producción de dobles enlaces conjugados en ácidos grasos 18:3 y 18:4 que se derivan de ácidos grasos 18:3 en semillas transgénicas que se pueden usar como aditivos para alimentos. De esta manera, la presente invención se refiere a alimento para animales que comprende un ingrediente derivado del procesamiento de cualquiera de las semillas obtenidas de plantas o células vegetales transformadas con cualquiera de los genes quiméricos. El ingrediente o ácido linolénico conjugado debe estar presente en una cantidad mejoradora de la calidad del cadáver. Una "cantidad mejoradora de la calidad del cadáver" es aquella cantidad necesaria para mejorar la calidad del cadáver de un animal. El ingrediente puede ser una mezcla de ácidos grasos obtenidos de estas semillas. Esta mezcla puede estar en cualquier forma adecuada para usarse como un aditivo para alimentos. Por ejemplo, la mezcla puede estar en forma de un aceite ya sea que esté o no saponificado. También de interés es un alimento para animales que comprenda un aceite obtenido de cualquiera de las semillas anteriores. Esta invención incluye también un método para mejorar la calidad del cadáver de un animal complementando una dieta del animal con cualquiera de los alimentos para animales descritos arriba.

En un aspecto más la presente invención se refiere también a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal (DMFad2-l) asociada con la modificación de la posición delta-12 de ácido oleico para producir ácido trans-linoleico, en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es al menos 75% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 11 o un subfragmento funcionalmente equivalente de la misma determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. Esta invención se refiere también a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 75% idéntico a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 11 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas . Esta invención se refiere también a lo siguiente: a) un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprende la posición delta-12 de ácidos grasos, en donde el fragmento codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO: 11, asi como b) un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO: 11. En otro aspecto, esta invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprende la posición delta-12 de ácidos grasos o un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, en donde la enzima modifica la posición delta-12 del ácido graso, en donde los fragmentos o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos hibridan a cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifican para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-12 de ácidos grasos o asociada con la modificación de la posición delta-12, en donde los fragmentos o subfragmentos codifican para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO: 11 y además en donde los fragmentos o subfragmentos (a) hibridan a estos fragmentos de ácido graso nucleico aislado o subfragmentos funcionalmente equivalentes bajo condiciones de severidad moderada o (b) son al menos 75% idénticos a un polipéptido codificado por cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados anteriores o un subfragmento funcionalmente equivalente de los mismos determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. Ejemplos de métodos de comparación adecuados que detectan secuencias homologas se describen arriba. También es de interés un gen quimérico que comprende cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico 5 aislados, o subfragmentos funcionalmente equivalentes del mismo, o un complemento del mismo unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas, en donde la expresión del gen quimérico da como resultado la producción de niveles alterados de la enzima deseada en una célula huésped o planta 10 transformada. La invención se refiere también a métodos para usar estos fragmentos de ácido nucleico aislados, o subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos, o el complemento de los mismos, para alterar el nivel de ácidos grasos que 15 comprenden una modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en una célula huésped o planta, el cual comprende: (a) transformar una célula huésped o planta con cualquiera de los presentes genes quiméricos; (b) cultivar la célula huésped o planta 20 transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una modificación en la posición delta-12. En otro aspecto más, esta invención se refiere a un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden una modificación en la posición delta-12 en las semillas de plantas, el cual comprende: (a) transformar una célula vegetal con cualquiera de los presentes genes quiméricos; (b) cultivar una planta madura fértil de la célula vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una modificación en la posición delta-12; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) para obtener aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan una modificación en la posición delta-12. En un aspecto más, esta invención se refiere a un método para producir enzimas de modificación de ácido graso vegetal asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos, el cual comprende: (a) transformar una célula huésped microbiana con cualquiera de los presentes genes quiméricos; (b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas que contengan niveles alterados de proteina codificada por el gen quimérico. Los fragmentos de ácido nucleico aislados que codifican para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-12 de los ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata se proporcionan en SEQ ID NO: 10, y las secuencias de aminoácidos deducidas correspondientes se proporcionan en SEQ ID NO: 11. Las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos de otras enzimas de modificación de ácido graso vegetal que son capaces de modificar la posición delta-12 de un ácido graso se pueden identificar ahora mediante cuando la secuencia de nucleótidos hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 10 bajo condiciones de severidad moderada, como se describió arriba, o (b) es al menos 75% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. Asi, los genes quiméricos de la presente invención se pueden usar para crear plantas transgénicas en las cuales las enzimas de modificación de ácido graso que modifican la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata estén presentes a niveles más altos que los normales o en tipos de células o etapas de desarrollo en las cuales no se encuentre normalmente. También son de interés las semillas obtenidas de estas plantas y el aceite obtenido de estas semillas. Se pueden hacer plantas transgénicas en las cuales la enzima de modificación de ácido graso asociada con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos esté presente a niveles más bajos que los normales, o en tipos de células o etapas de desarrollo en las cuales no se encuentre normalmente. Esto tendría el efecto de alterar el nivel de estos ácidos grasos que comprendan una posición delta-12 modificada en esas células. Podria desearse reducir o eliminar la expresión de un gen que codifique para estas enzimas en plantas para algunas aplicaciones. Para poder lograr esto, un gen quimérico diseñado para la co-supresión de la enzima endógena puede construirse uniendo un gen o fragmento de gen que codifique para una enzima de modificación de ácido graso asociada con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos a secuencias promotoras vegetales. Como alternativa, un gen quimérico diseñado para expresar ARN antisentido para todo o parte del fragmento de ácido nucleico puede construirse uniendo el gen o un fragmento del gen en orientación inversa a secuencias promotoras vegetales. Ya sea la co-supresión o genes quiméricos antisentido podrían introducirse en plantas mediante transformación, en donde la expresión de los genes endógenos correspondientes se reduzca o elimine. Cuando se sobre-expresan en células vegetales, las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata pueden ser útiles para ocasionar la biosintesis y acumulación de ácidos grasos con dobles enlaces conjugados, tales como ácido caléndico, en esas células. Es particularmente útil utilizar enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata para producir ácidos grasos que contengan dobles enlaces conjugados en las células de las semillas de plantas de cultivo de semillas oleaginosas. La modificación de la posición delta-12 por DMFad2-l lleva a un intermediario (ácido trans-linoleico) que es el precursor para ácido dimorfecólico. La sobre-expresión de enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata se puede lograr construyendo primero un gen quimérico en el cual la región de codificación de moléculas de ADNc para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata se una operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en la etapa de desarrollo deseada. Por motivos de conveniencia, el gen quimérico puede comprender una secuencia promotora y una secuencia lider de traducción derivada del mismo gen. También pueden proporcionarse secuencias no codificadoras 3' que codifican para señales de terminación de traducción. Los presentes genes quiméricos pueden comprender también uno o más intrones para facilitar la expresión génica.

Vectores, tales como vectores plasmidicos, que comprendan los presentes genes quiméricos pueden construirse después. La elección del vector plasmidico depende del método que se usará para transformar las plantas huésped. El experto en la técnica conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector plasmidico para poder transformar, seleccionar y propagar exitosamente células huésped o plantas que contengan al gen quimérico. El experto en la técnica reconocerá también que diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y otros, (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeida y otros, (1989) Mol . Gen . Genetics 218: 78-86), y de esta manera que diferentes eventos deben analizarse para poder obtener lineas que desplieguen el nivel y patrón de expresión deseados. Este análisis se puede lograr mediante el análisis Southern de ADN, el análisis Northern de la expresión de ARNm, el análisis Western de la expresión de proteínas, o el análisis fenotipico. Para algunas aplicaciones podria ser útil dirigir las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata a diferentes compartimientos celulares, o facilitar su - "»»"-secreción de la célula. Se vislumbra entonces que los genes quiméricos descritos arriba pueden complementarse más alterando las secuencias de codificación para que codifiquen enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorptoheca sinuata descritas en la presente con secuencias de dirección intracelular adecuadas tales como secuencias de tránsito (Keegstra, K. (1989) Cell 56: 247-253) , secuencias de señal o secuencias que codifiquen para la localización del retículo endoplásmico (Chrispeeis, J. J., (1991) Ann . Rev. Plant Phys . Plant Mol . Biol . 42:21-53), o secuencias de localización nuclear (Raikhel, N. (1992) Plant Phys . 100: 1627-1632) añadidas y/o con secuencias de dirección que ya estén presentes removidas. Aunque las referencias citadas arriba dan ejemplos de cada una de estas, la lista no es exhaustiva y se pueden descubrir en el futuro más señales de dirección de utilidad. Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, o un subfragmento funcionalmente equivalente de los mismos, se pueden usar para aislar moléculas de ADNc u otros fragmentos de ácido nucleico que codifiquen para enzimas de modificación de ácido graso homologas de la misma o de otras especies de plantas. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos dependientes de secuencia se conoce bien en la técnica. Ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no están limitados a, métodos de hibridación de ácido nucleico y métodos de amplificación de ADN y ARN como los ejemplificados por varios usos de tecnologias de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa) . El término "secuencias conservadas" según se usa en la presente, abarca tanto la conservación estricta como la conservación de una mayoría de las secuencias usadas en una alineación, por ejemplo, la conservación con respecto a una secuencia de consenso. De esta manera, en un aspecto más esta invención se refiere a un método para aislar fragmentos de ácido nucleico y subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos, que comprende: (a) comparar SEQ ID NO: 11 y otras secuencias de polipéptido de enzima de modificación de ácido graso vegetal; (b) identificar las secuencias conservadas de cuatro o más aminoácidos obtenidas en la etapa (a) ; (c) diseñar oligómeros degenerados con base en las secuencias conservadas identificadas en la etapa (b) ; y (d) usar los oligómeros degenerados de la etapa (c) para aislar secuencias que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal o una porción de la misma asociada con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos mediante protocolos dependientes de secuencia. Por ejemplo, los genes que codifican para enzimas de modificación de ácido graso homologas, ya sea como moléculas de ADNc o moléculas de ADN genómicas, se pueden aislar directamente usando todos o una porción de los presentes fragmentos de ácido nucleico como sondas de hibridación de ADN para analizar bibliotecas de cualquier metodología que emplee plantas bien conocida por los expertos en la técnica. Las sondas de oligonucleótidos especificas basadas en las presentes secuencias de ácido nucleico se pueden diseñar y sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook) . Además, las secuencias completas pueden usarse directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por el experto en la técnica tales como el marcado de ADN con cebadores aleatorios, traducción de mella o técnicas de marcado de extremos, o sondas de ARN que usen sistemas de trascripción in vi tro disponibles. Además, se pueden diseñar cebadores específicos y usarse para amplificar una parte de, o la longitud completa de las presentes secuencias. Los productos de amplificación resultantes pueden marcarse directamente durante reacciones de amplificación o marcarse después de las reacciones de amplificación, y usarse como sondas para aislar ADNc de longitud completa o fragmentos genómicos bajo condiciones de severidad adecuada. Además, dos segmentos cortos de los presentes fragmentos de ácido nucleico pueden usarse en protocolos de reacción en cadena de polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifiquen para genes homólogos de ADN o ARN. La reacción en cadena de polimerasa también puede llevarse a cabo en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados en donde la secuencia de un cebador sea derivada de los presentes fragmentos de ácido nucleico, y la secuencia del otro cebador saque ventaja de la presencia de los tractos de ácido poliadenilico hacia el extremo 3' de precursor de ARNm que codifique para genes vegetales. Como alternativa, la segunda secuencia de cebadores se puede basar en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el experto en la técnica puede seguir el protocolo RACE (Frohman y otros, (1988) PNAS USA 85: 8998) para generar moléculas de ADNc usando PCR para amplificar copias de la región entre un solo punto en el trascripto y el extremo 3' ó 5'. Los cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' pueden diseñarse a partir de las presentes secuencias. Usando sistemas 3' RACE o 5' RACE disponibles comercialmente (BRL) , se pueden aislar fragmentos de ADNc 3' ó 5' específicos (Ohara y otros, (1989) PNAS USA 86: 5673; Loh y otros, (1989) Science 243: 217). Los productos generados por los procedimientos RACE de 3' y 5' se pueden combinar para generar moléculas de ADNc de longitud completa (Frohman, M.A. y Martin, G.R., (1989) Techniques 1:165) . De esta manera, otros fragmentos de ácido nucleico que codifiquen para enzimas asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos se pueden identificar usando cualquiera de las metodologías generales descritas arriba. Por ejemplo, se puede identificar un grupo general de moléculas de ADNc relacionadas con ácido graso desaturasa (FAD) , y un subconjunto especifico de esas enzimas de codificación de moléculas de ADNc implicadas en la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos se puede detectar o analizar mediante transformación. Un grupo de secuencias de ADNc que codifiquen para enzimas tipo ácido ,4,4»..... J 4j¿fc..[ , .^«M^t. graso desaturasa se puede identificar usando hibridación de baja severidad (por ejemplo 2X SSC, 0.1% SDS, 60°C) con una sonda que corresponda a cualquier secuencia de FAD conocida, y/o toda o parte de las secuencias presentadas en cualquiera de SEQ ID NO: 10. Como alternativa, las moléculas de ANDc secuenciadas en forma aleatoria se pueden analizar por un programa de computadora diseñado para detectar secuencias homologas, tal como, pero no limitado a, BLAST o BLAST con espacios (usando parámetros por omisión estándares) . BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y otros (1993) J. Mol . Biol . 215: 403-410; véase también ww . ncbi . nlm. r.i . gov/BLAST/) busca la similitud a secuencias contenidas en la base de datos "nr" de BLAST (que comprende todas las traducciones de CDS GenBank no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, la última liberación principal de la base de datos de la secuencia de proteínas SWISS-PROT, EMBL y las bases de datos DDBJ) . Las secuencias de prueba se analizan para similitud a todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) . Las secuencias de ADN se traducen en todos los marcos de lectura ,j,.l.j «H. , . . , j ., . . ,->,, 4, . n: a . *.-*. «- .j.Jt— - -i»»-.4 - - - r*. t. t i . t?itt??. y se comparan para similitud con todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nature Genetics 3:266-272) proporcionado por el NCBI. Por motivos de conveniencia, el valor P (probabilidad) , o "pLog" (el negativo del logaritmo del valor P) , se da como una medida de similitud entre las dos secuencias. Una secuencia de prueba y una secuencia contenida en las bases de datos buscadas se comparan, y la probabilidad de que las dos secuencias se relacionen sólo por posibilidad se calcula mediante BLAST y se reporta como un valor "pLog". En consecuencia, entre mayor sea el valor pLog, mayor será la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el "acierto" de BLAST representen proteínas homologas. Las secuencias con pLogs mayores que 5, o de preferencia mayores que 10, o muy preferiblemente mayores que 15, y más preferiblemente mayores que 20, que se definen como FADs o lipido desaturasas son candidatos. Las moléculas de ADNc que codifican para enzimas asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos se pueden identificar de los grupos de candidatos usando análisis de transformación. Las moléculas de ADNc individuales se insertan en vectores de expresión y se transforman en células huésped de levadura o vegetales usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véanse los ejemplos 3, 4, 6, 7 y 8) . La producción de ácidos grasos que contienen dobles enlaces conjugados se confirma mediante análisis de CG-EM como los descritos en los ejemplos 3 y 4. Células de cultivo de tejido de levadura o planta se prefieren para el análisis inicial gracias a la velocidad y a la facilidad con la cual se pueden manejar cuando se manejan grandes números de transformantes y la biología de células y fisiología de células eucarióticas adecuadas. Las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorphotecha sinuata producidas en células huésped o plantas heterólogas, particularmente en las células de huéspedes microbianos, se pueden usar para preparar anticuerpos para las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorphotecha sinuata mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorphotecha sinuata in si tu en células o in vi tro en extractos de células. Las células huésped heterólogas que se prefieren para la producción de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorphotecha sinua ta son huéspedes microbianos. Los sistemas de expresión microbianos y los vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas extrañas se conocen bien por los expertos en la técnica. Cualquiera de estos se puede usar para construir genes quiméricos para la producción de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorphotecha sinuata . Estos genes quiméricos pueden introducirse después en microorganismos adecuados mediante transformación para proporcionar expresión de alto nivel de las enzimas de modificación de ácido graso codificadas asociadas con la modificación de la posición delta-12 de un ácido graso en semillas de Dimorphotecha sinuata . Un ejemplo de un vector para la expresión de alto nivel de las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de la posición delta-12 de ácidos grasos en semillas de Dimorphotecha sinuata en una célula huésped bacteriana se describe abajo en el Ejemplo 8.

Ejemplos La presente invención se define mejor en los siguientes ejemplos, en los cuales todas las partes y porcentajes son en peso y los grados son centígrados, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se dan a manera de ilustración únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención, y sin alejarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones .

Ejemplo 1 Composición de bibliotecas de ADNc; aislamiento y secuenciación de clones de ADNc Se prepararon bibliotecas de ADNc que representan moléculas de ARNm de semillas en desarrollo de Caléndula officinalis . Las semillas elegidas fueron ácidos grasos de acumulación activa con dobles enlaces conjugados. Las bibliotecas se prepararon usando un equipo Uni-ZAP™ XR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) , excepto que las moléculas de ADNc se clonaron en los sitios EcoRI y Xhol del vector bacteriano pBluescript SK(-) en lugar de en un vector de fago. Las bibliotecas se mantuvieron en células DH10B de E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los insertos de ADNc de colonias bacterianas elegidas aleatoriamente que contenían plásmidos pBluescript recombinantes se dejaron crecer y se purificaron por plásmidos. Las moléculas de ADNc se secuenciaron se usando cebadores específicos para secuencias de vectores que flanquean las secuencias de ADNc insertadas. Las moléculas de ADN insertadas se secuenciaron en reacciones de secuenciación de cebador con colorante para generar secuencias de ADNc parciales (marcas de secuencia expresadas Üalk.¿- í^ ? ,,,. J: .i.*¿~...-. :t _-^-.. 0 "ESTs"; véase Adams, M.D. y otros, (1991) Science 252:1651) usando un secuenciador fluorescente Perkin Elmer Modelo 377. Las ESTs resultantes se analizaron usando métodos computacionales como los descritos abajo.

Ejemplo 2 Identificación y caracterización de clones de ADNc ESTs que codifican para enzimas de modificación de ácido graso de Caléndula officinalis se identificaron llevando a cabo búsquedas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F. y otros, (1993), J. Mol . Biol . 215: 403- 410; véase también www.ncbi .nlm.p h .gov/BLAST/) para la similitud a secuencias contenidas en la base de datos "nr" de BLAST (que comprende todas las traducciones de secuencia de codificación ["CDS"] de GenBank no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, la última liberación principal de la base de datos de la secuencia de proteínas SWISS-PROT, EMBL y las bases de datos DDBJ) . Las secuencias de ADNc obtenidas en el Ejemplo 1 se analizaron para similitud a todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) . Las secuencias de ADN se tradujeron en todos los marcos de lectura y se compararon para similitud con todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nature Genetics 3:266-272) proporcionado por el NCBI. Por motivos de conveniencia, el valor P (probabilidad) de observar un apareamiento de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos escrutadas simplemente por oportunidad calculada por BLAST se reportan en la presente como valores "pLog", los cuales representan el negativo del logaritmo del valor P reportado. En consecuencia, entre mayor sea el valor pLog, mayor será la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el "acierto" de BLAST representen proteínas homologas. La búsqueda de BLASTX usando información de secuencia derivada del clon ecslc.pk009.nl4 (CalFad2-l) completo de Caléndula officinalis reveló fuerte similitud con las proteínas codificadas por ADNc para omega-6 ácido graso desaturasas de Petroselinum crispum (Genbank No. de Acceso gi2501790; pLog=133.00) y Brassica j úncea (Genbank No. de Acceso gi3334184; pLog=127.00) . La búsqueda BLASTX usando información de secuencia derivada del clon ecslc.pk008.a24 iei -i .A-.JXA ?*¿A~¿ ... a. ^z?..^ (CalFad2-2) completo de Caléndula officinalis reveló fuerte similitud con las proteínas codificadas por moléculas de ADNc para delta-12 ácido graso desaturasa de Borago officinalis (Genbank No. de Acceso gi3417601; pLog=135.00) y Brassica carina ta (Genbank No. de Acceso gi4378875; pLog=135.00) . SEQ ID NO:l muestra la secuencia de nucleótidos del clon ecslc.pk009.nl4 de ADNc de Caléndula officinalis completo; la secuencia de aminoácidos deducida se muestra en SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de Caléndula officinalis completo en el clon ecslc.pk008.a24; la secuencia de aminoácidos deducida se muestra en SEQ ID NO: 4. Las alineaciones de secuencia y puntuaciones y probabilidades de BLAST indican que los presentes fragmentos de ácido nucleico codifican para proteínas de Caléndula officinalis que están relacionadas estructuralmente con la clase omega-6 y delta-12 de ácido graso desaturasas. Los clones para estas proteínas se designaron CalFad2-l y CalFad2-2, respectivamente .

Ejemplo 3 Expresión de CalFad2-l, un Fad2 de Caléndula divergido, en células de tabaco Para caracterizar la actividad de CalFad2-l en células vegetales transgénicas, el ADNc (ecslc.pk009.nl4) que codifica para esta enzima se expresó en callo de tabaco con el gen bajo control del virus del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. El marco de lectura abierto del ADNc para CalFad2-l se amplificó mediante PCR para generar sitios de enzima de restricción 5' BamHl y 3' SstI flanqueantes para clonarlos en el vector de expresión vegetal. La secuencia del oligonucleótido de sentido usado en la reacción de amplificación fue 5' -tttgagctcTACACCTAGCTACGTACCATG-3' (SEQ ID NO: 16), y la secuencia del oligonucleótido de antisentido fue 5'-tttggatccTCACGGTACTGATGATGGCAC-3' (SEQ ID NO: 17) [Nota: las bases en minúsculas contienen los sitios de restricción añadidos, los cuales están subrayados, y la secuencia de flanqueo para facilitar la digestión con enzimas de restricción] . El diseño de los cebadores de PCR se basó en la secuencia del ADNc de CalFad2-l mostrado en SEQ ID NO:l. Se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación por PCR en un volumen de 100 µl usando Pfu polimerasa (Stratagene) y 25 ng de pBluescript SK(-) que contenia el ADNc de CalFad2-l. El producto de esta reacción se subclonó en PPCR-Script AMP (Stratagene) . Después de la digestión de restricción con ßamHI y SstI, el producto de PCR se movió de pPCR-Script AMP en los sitios correspondientes del vector de expresión vegetal pBI121 (Clontech) . El vector pBI121 se usa para la expresión constitutiva de transgenes mediada por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. Este vector contiene regiones limítrofes derecha e izquierda que flanquean la fusión del gen insertado para facilitar la transformación mediada por Agrobacteri um estable de la célula vegetal huésped y contiene también dentro de las regiones limítrofes un gen de nopalina fosfotransferasa II (NPTII) bajo control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor para proporcionar la selección de células vegetales transformadas mediante resistencia a kanamicina. La construcción resultante que contenia al promotor 35S fusionado con ADNc de CalFad2-l se transformó en células LBA4404 de Agrobacteri um tumefaciens . Los cultivos derivados de estas células se usaron para la transformación de discos de hoja de tabaco ( Ni cotiana tabacum cv. Xanthi) de acuerdo con el protocolo descrito por Rogers, S.G., Horsch, R.B., y Fraley, R.T (1986) Methods Enzymol . 118: 627-648.

El callo de tabaco resistente a kanamicina que resultó de la transformación se examinó para verificar la presencia de ácido caléndico que se origina de la actividad de CalFad2-l. Se prepararon esteres metílicos de ácido graso mediante la homogeneización del callo de tabaco transgénico en 1% (p/v) de metóxido de sodio en metanol usando métodos descritos por Hitz y otros (1994) Plant Physi ol . 105: 635-461. Los esteres metílicos de ácido graso recuperados se analizaron después usando un cromatógrafo Hewlett-Packard 6890 equipado con una columna Omegawax 320 (30 m x 0.32 mm de diámetro interno; Supelco) . La temperatura del horno se programó de 220°C (mantenida 2 minutos) a 240°C a una velocidad de 20°C/minuto. El tiempo de retención del ácido metil caléndico en extractos de callo de tabaco se comparó con el del ácido metil caléndico en semillas de Cal éndula offi cinalis . La cromatografía de gas-espectometria de masa (CG-EM) se llevó a cabo también para confirmar la identidad de ácido caléndico en callo de tabaco que expresaba CalFad2- 1. El éster metílico de ácido graso preparado del callo de tabaco transgénico se analizó con un HP6890 interconectado con un detector selectivo de masa HP5973 (Hewlett-Packard) . Los compuestos se resolvieron usando una columna HP-5 (30m x 0.25 mm de diámetro interno) con la temperatura del horno programada de 185°C (mantenida 2 minutos) a 215°C a una velocidad de 5°C/minuto. El espectro de masa del ácido metil caléndico de extractos de semilla de Caléndula se caracteriza por un ion molecular abundante de 292 m/z . En esteres metílicos de ácido graso preparados a partir del callo de tabaco establemente transformado, se detectó ácido metil caléndico en cantidades de hasta 11.4% de los ácidos grasos totales (figura 3) . El pico identificado como ácido metil caléndico en callo que expresaba CalFad2-l tuvo un tiempo de retención y espectro de masa que fue idéntico a los del ácido metil caléndico en semillas de Caléndula officinalis . No se detectó ácido metil caléndico alguno en callo de tabaco transformado con el vector que carecía del inserto de ADNc. Estos resultados demuestran más la capacidad para producir ácido caléndico mediante la expresión transgénica de CalFad2-l.

Ejemplo 4 Expresión de los clones CalFad2-l y CalFa2-2 de Caléndula offic±nalls en Saccharomyces cerevislae Los clones CalFad2-l y CalFad2-2 de Caléndula officinalis se digirieron con las enzimas de restricción Í .*„1,? ., S.?..*, ,.* ., . f-coRI y Xhol. Los fragmentos de ADN resultantes que contenían los insertos de ADNc completos se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las moléculas de ADNc purificadas se ligaron en los sitios £,coRI y Xhol del vector de expresión pYES2 de Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen) usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs) . Los plásmidos pYes2/CalFad2-l y pYes2/CalFad2-2 resultantes se introdujeron en células INVScl (Invitrogen Corp.) de Saccharomyces cerevisiae mediante transformación mediada por acetato de litio [Sherman F, Fink GR, Hicks JB, Methods in Yeast Genetics : A Laboratory Course Manual , Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY (1987) ] . Las células transformadas se seleccionaron por su capacidad para crecer en ausencia de uracilo. Colonias individuales de células transformadas se dejaron crecer después durante 2 dias a 30°C en medios de crecimiento que carecían de uracilo [0.17% (p/v) de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos (Difco) , 0.5% (p/v) de sulfato de amonio y 0.18% de SC-URA (BiolOl) ] complementado con glicerol y glucosa a una concentración final de 5% (v/v) y 0.5% (p/v), respectivamente. Las células se lavaron después dos veces en los medios de crecimiento descritos arriba que se complementaron con galactosa hasta una concentración final de 2% (p/v) . Las células lavadas se diluyeron después a 0.0.600*0.2 en los medios de crecimiento que contenían galactosa que también contenían Tergitol NP-40 (Sigma) a una concentración de 0.2% (p/v). Alícuotas de estas células se dejaron crecer sin ácidos grasos exógenos o con la adición de ácido linoleico (18 : 2?9cis,12cls) hasta una concentración final de 2 mM. Después de 4 dias de crecimiento a 16°C, las células de S. cerevisiae se cosecharon y se examinaron para verificar la acumulación de ácidos grasos que contenían dobles enlaces conjugados como los descritos en el ejemplo 4. En las células que crecieron en medios que contenían ácido linoleico, se detectó ácido caléndico (?8 : 3?8trans'10trans'12cis) en cantidades de hasta 2.9% (p/p) de los ácidos grasos totales de los cultivos que expresaban CalFad2-l (figura 3) y en cantidades de hasta 0.2% de los ácidos grasos totales de cultivos que expresaban CalFad2-2. La identidad del ácido caléndico se estableció mediante la comparación del tiempo de retención cromatográfico de gas y el espectro de masa de su derivado de éster metílico con el de ácido metil caléndico en extractos de semillas de Caléndula . No se detectó ácido caléndico en cultivos que portaban al vector de expresión sin un inserto de ADNc o en células que crecieron en ausencia de ácido linoleico exógeno. Estos datos son consistentes con el ácido linoleico que sirve como el substrato para la síntesis de ácido caléndico por medio de la actividad de la enzima de modificación de ácido graso de Caléndula officinalis asociada con la formación de dobles enlaces conjugados y la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos. En esta reacción, el doble enlace delta-9 del ácido linoleico se convierte por la actividad de CalFad2-l o CalFad2-2 en dobles enlaces delta-8 y delta-10. El ácido graso resultante, ácido caléndico, contiene dobles enlaces delta-8, delta-10 y delta-12 en conjugación. CalFad2-l y CalFad2-2 son entonces distintos de todos los polipéptidos relacionados con Fad2 previamente reportados por su capacidad para modificar la posición delta-9 en lugar de la posición delta-12 de un ácido graso.

Ejemplo 5 Comparación de las proteínas de Caléndula con enzimas de Impatiens, Momordica y Chrysobalanus implicadas en la formación de enlaces de ácido graso conjugados, asi como miembros de la clase omega-6 desaturasa de enzimas Las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones CalFad2-í, CalFd2-2, ImpFad2 H8 y MomFad2 de ADNc se _ compararon con las secuencias de aminoácidos deducidas que codifican para (i) una ácido graso desaturasa de soya conocida (Publicación de Patente Mundial No. W094/11516) y (ii) una ácido graso hidroxilasa de semilla de ricino (van de Loo, F.J. y otros (1995) Proc . Nati . Acad. Sci . E.U.A. 92 (15) : 6743-6747) usando el programa de comparación de secuencias múltiples Megalign (v3.1.7) del paquete de software Lasergene™ (DNASTAR Inc. Madison, Wl) y el método Clustal de alineación (parámetros de programa por omisión) . Las secuencias alineadas se muestran en la figura 2. Todas las siete secuencias, incluyendo aquellas de las proteínas de Cal éndula officinalis están relacionadas por ocho residuos de histidina altamente conservados que se cree forman parte del sitio de unión para el racimo de doble hierro que se requiere en el sitio activo de esta clase de enzimas (Shaniklin, J. y otros (1994) Biochemistry 33:12787-12793). Estos residuos conservados se identifican como elementos encerrados en un cuadro en la figura 2. La secuencia de aminoácidos codificada por el clon ImpH8Fad2 del ADNc de Impatiens balsamina es 57.0% idéntica a la secuencia de soya, y 55.2% idéntica a la secuencia de ricino. La secuencia de aminoácidos codificada por el clon MomFad2 del ADNc de Momordica charantia es 67% idéntica a la secuencia de soya y 53.5% idéntica a la secuencia de ricino. En general, la similitud de secuencias compartida por las dos proteínas de Caléndula officinalis es de 94.6%. CalFad2-l es 45.5% idéntica a la secuencia de soya y 44.1% idéntica a la secuencia de ricino. CalFad2-2 es 46.8% idéntica a la secuencia de soya y 44.1% idéntica a la secuencia de ricino. El residuo inmediatamente adyacente al primer cuadro de histidina en ambas enzimas de Caléndula es una glicina (indicada por un asterisco en la figura 2) . Una glicina en esta posición sólo se observa en enzimas relacionadas con ?6-ácido oleico desaturasa que tienen funcionalidad divergida, tales como la ácido graso hidroxilasa de ricino (van de Loo, F.J. y otros (1995) Proc . Nati . Acad. Sci . E.U.A. 92: 6743-6747) y la epoxidasa de Crepis palaestina ( Lee, M. y otros (1998) Science 280: 915-918) . Dada esta característica de su estructura primaria y su relación más distante con las ?d-ác?do oleico desaturasas conocidas, se cree que los polipéptidos codificados por CalFad2-l y CalFad2-2 están asociados con la formación de dobles enlaces conjugados y no son ácido graso desaturasas convencionales (como la secuencia de soya de la figura 2) . La enzima de Impatiens (ImpFad2H8) se sabe que hace ácido eleosteárico, un ácido graso conjugado, y también contiene esta glicina para la sustitución de alanina. Asi, los cambios en un número comparativamente pequeño de residuos de aminoácidos en regiones conservadas de la proteina son suficientes para alterar la actividad en esta clase de enzimas de uno de introducir un doble enlace (es decir, una desaturasa) a uno de introducir un grupo hidroxilo (es decir, una hidroxilasa) o a uno que sea activo para convertir ácidos grasos poliinsaturados en ácidos grasos que contengan varios dobles enlaces conjugados.

Ejemplo 6 Expresión de genes quiméricos en células de monocotiledóneas Los tejidos de almacenamiento de aceite de la mayoría de las semillas de pastos son el embrión y sus tejidos adjuntos, el escutelo y hasta cierto punto la aleurona. Las secuencias promotoras tales como aquellas que controlan la expresión de las proteínas de almacenamiento Globulina 1 (Belanger, S.C. y Kriz, A. L. (1989) Plant Physi ol . 91: 636-643) y Globulina 2 (Wallace, N.H. y Kriz, A. L. (1991) Plant Physiol . 95: 973-975) son adecuadas para la expresión de genes quiméricos en estos tejidos.

Se puede construir un gen quimérico que comprenda un ADNc que codifica para enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la síntesis de dobles enlaces conjugados que comprenden la posición delta-9 en semillas de Cal éndula officinalis en orientación de sentido con respecto al promotor de Globulina 2 de maiz que se localiza 5' al fragmento de ADNc, y el extremo 3' de Globulina 2 que se localiza 3' al fragmento de ADNc. El fragmento de ADNc de este gen puede generarse mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) del clon de ADNc usando oligonucleótidos cebadores adecuados. Los sitios de clonación se pueden incorporar en los oligonucleótidos para proporcionar la orientación adecuada del fragmento de ADN cuando se inserte en el vector de expresión diseñado adecuadamente. Estos vectores de expresión deben incluir elementos de secuencias genéticas que confieran un origen de replicación para el plásmido en su huésped, un gen capaz de conferir un rasgo seleccionable tal como autotrofia o tolerancia a antibióticos a la célula huésped que porte el plásmido y las secuencias promotoras para la expresión de genes deseados en células vegetales huésped. Las características de diseño adicionales pueden incluir sitios de reconocimiento con endonucleasa de restricción únicos entre los elementos de los elementos del promotor del gen vegetal para permitir que genes de introducción convenientes sean controlados por esos elementos. Las plantas que pueden servir como huéspedes adecuados incluyen, pero no están limitadas a, maiz, arroz, trigo y palma. Los genes quiméricos construidos como se indicó arriba se pueden introducir después en células de maíz mediante el siguiente procedimiento. Embriones de maiz inmaduros pueden extirparse de cariopsis en desarrollo derivados de cruzas de lineas de maiz de cruza H99 y LH132. Los embriones son aislados 10 a 11 dias después de la polinización cuando miden 1.0 a 1.5 mm de largo. Los embriones se colocan después con el lado del eje dando hacia abajo y en contacto con un medio N6 solidificado con agarosa (Chu y otros, (1975) Sci . Sin . Peking 18: 659-668). Los embriones se mantienen en la oscuridad a 21 ° C El callo embriogénico friable que consiste en masas no diferenciadas de células con proembrioides y embrioides somáticos que crecieron sobre estructuras suspensoras proliferan del escutelo de estos embriones inmaduros. El callo embriogénico aislado del explante primario se puede cultivar sobre medio N6 y subcultivarse sobre este medio cada 2 a 3 semanas.

El plásmido, p35S/Ac (obtenido del Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) se puede usar en experimentos de transformación para proporcionar un marcador seleccionable. Este plásmido contiene al gen Pa t (véase Publicación de Patente Europea 0 242 236) que codifica para fosfinotricina acetil transferasa (PAT) . La enzima PAT confiere resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas tales como fosfinotricina. El gen pat en p35S/Ac está bajo el control del promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell y otros (1985) Nature 313: 810-812) y la región 3' del gen de nopalina sintasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacteri um tumefaciens . El método de bombardeo con partículas (Klein y otros, (1987) Nature 327:70-73) se puede usar para transferir genes a las células de cultivo de callo. De acuerdo con este método, partículas de oro (1 µm de diámetro) son revestidas con ADN usando la siguiente técnica. Diez µg de moléculas de ADNc plasmidicas se añaden a 50 µL de una suspensión de partículas de oro (60 mg por L) . Se añaden a las partículas cloruro de calcio (50 µL de una solución 2.5 M) y base libre de espermidina (20 µL de una solución 1.0 M). La suspensión se vortexea durante la adición de estas soluciones. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugan brevemente (5 segundos a 15,000 rpm) y se remueve el sobrenadante. Las partículas se resuspenden en 200 µL de etanol absoluto, se centrifugan de nuevo y se remueve el sobrenadante. El enjuague con etanol se lleva a cabo de nuevo y las partículas se resuspenden en un volumen final de 30 µL de etanol. Una alícuota (5 µL) de las partículas de oro revestidas con ADN se pueden poner en el centro de un disco volador Kapton® (Bio-Rad Labs) . Las partículas se aceleran después en el tejido de maiz con un Biolistic® PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) , usando una presión de helio de 70.3 kg/cm2, una distancia de espacio de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm. Para el bombardeo, el tejido embriogénico se pone sobre papel filtro encima de un medio N6 solidificado con agarosa. El tejido se dispone como una película delgada y se cubre un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La caja de petri que contiene el tejido se puede colocar en la cámara del PDS-1000/He aproximadamente a 8 cm del tamiz de detención. El aire en la cámara se evacúa después hasta un vacío de 711 milímetros de Hg. El macroportador se acelera con una onda de choque de helio usando una membrana de ruptura que estalla cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 70.3 kg/cm2. Siete dias después del bombardeo el tejido se puede transferir a medio N6 que contenga glufosinato (2 mg por litro) y carezca de caseína o prolina. El tejido continua creciendo lentamente sobre este medio. Después de dos semanas adicionales el tejido se puede transferir a medio N6 fresco que contenga glufosinato. Después de seis semanas, áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callo de crecimiento activo se pueden identificar sobre algunas de las placas que contienen el medio complementado con glufosinato. Los callos pueden continuar creciendo cuando sean subcultivados sobre el medio selectivo. Las plantas se pueden regenerar del callo transgénico transfiriendo primero racimos de tejido a medio N6 complementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir a medio de regeneración (Fromm y otros, (1990) Bio/Technology 8: 833-839) .

Ejemplo 7 Expresión de genes quiméricos en células de dicotiledóneas Enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la síntesis de doble enlace conjugado que comprenden la posición delta-9 en semillas de Caléndula officinalis se pueden expresar en células de dicotiledóneas que produzcan normalmente lipidos de almacenamiento mediante la construcción de genes quiméricos adecuados seguida por la introducción estable de esos genes en la planta huésped. Un ejemplo de este método es la expresión especifica de semilla en soya de enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la síntesis de doble enlace conjugado en semillas de Caléndula officinalis . Otras plantas que se pueden usar incluyen, pero no están limitadas a, especies Brassica de semillas oleaginosas, cacahuate, girasol, cártamo, algodón, lino y cacao. Un plásmido pKSldHH que contiene genes quiméricos para permitir la expresión de Higromicina B Fosfotransferasa en ciertas bacterias y en células vegetales se puede construir a partir de los siguientes elementos genéticos: a) Promotor T7 + Shine-Delgarno / Higromicina B Fosfotransferasa (HPT) / Secuencia Terminadora T7, b) Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) / Higromicina B Fosfotransferasa (HPT) / Nopalina Sintasa (N0S3' de ADN-T de Agrobacteri um tumefaciens, y c) vector del plásmido pSP72 [de Promega] con región de codificación de ß-lactamasa (gen de resistencia a ampicilina) removido. El gen de Higromicina B Fosfotransferasa se puede amplificar mediante PCR a partir de la cepa W677 de E. coli , la cual contiene un plásmido pJR225 derivado de Klebsi ella . Iniciando con el vector pSP72, los elementos son ensamblados en un solo plásmido usando métodos de clonación estándares (Maniatis) . El plásmido pKSldHH contiene entonces el cásete de promotor T7/HPT/terminador T7 para la expresión de la enzima HPT en ciertas cepas de E. coli , tal como NovaBlue (DE3) [de Novagen] , que son lisógenas para lambda DE3 (el cual porta al gen de T7 ARN polimerasa bajo control de lacV5) . El plásmido pKSldHH también contiene el cásete 35S/HPT/NOS para la expresión constitutiva de la enzima HPT en plantas, tales como soya. Estos dos sistemas de expresión permiten el uso de la selección para el crecimiento en presencia de higromicina como un medio para identificar células que contengan al plásmido en sistemas tanto vegetales como bacterianos . pKSldHH también contiene tres sitios de endonucleasa de restricción únicos adecuados para la clonación de otros genes quiméricos en este vector. Un plásmido para la expresión del ADNc que codifica para enzimas de modificación de ácido graso asociado con la síntesis de doble enlace conjugado en semillas de Caléndula officinalis se hace para estar bajo el control de un promotor de ß-conglicina de soya (Beachy y otros, (1985) EMBO J. 4: 3047-3053) . La construcción de este vector se facilita mediante el uso de plásmidos pCW109 y pMLld, ambos de los cuales han sido descritos (véase Publicación de Patente Mundial No. W094/11516) . Un sitio Not I único se introduce en la región de clonación entre el promotor de ß-conglicina y el extremo 3' de faseolina en pCW109 mediante digestión con Neo I y Xba I seguida por la remoción de los extremos de ADN de una sola hebra con exonucleasa de semilla. Los enlazadores Not I (New England Biochemical número de catálogo NEB 1125) son ligados en el plásmido linearizado para producir el plásmido pAW35. El sitio Not I individual en pMLld se destruye mediante digestión con Not I, llenando los extremos de una sola hebra con dNTP' s y fragmento Klenow seguidos por la re-ligación del plásmido linearizado. El pML18 modificado se digiere después con Hind III y se trata con fosfatasa intestinal CalFad. El cásete de expresión de ß-conglicinina:Not I: faseolina en pAW35 se remueve mediante digestión con Hind III y el fragmento de 1.79 kB se aisla mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento aislado se liga en la construcción pMLld modificada y linearizada descrita arriba. Un clon con la orientación deseada se identificó mediante digestión con Not I y Xba I para liberar un fragmento de 1.08 kB que indicara que la orientación de la unidad de transcripción de ß-conglicina fuera la misma que la unidad de transcripción del marcador seleccionable. Al plásmido resultante se le da el nombre de pBS19. Hind III es uno de los únicos sitios de clonación disponibles en pKS18HH. Para ensamblar el cásete de expresión final pBS19 y pKSldHH se digieren ambos con Hind III. El fragmento que contiene ß-conglicinina de pBSl9 se aisla mediante electroforesis en gel y se liga en el pKS18HH digerido, el cual habla sido con fosfatasa alcalina de CalFad. El plásmido resultante es llamado pRB20. Los productos de PCR amplificados de clones para los polipéptidos de Caléndula (descritos en el Ejemplo 3 anterior) se digieren con enzimas de restricción para cortar los sitios designados en los cebadores de PCR. El plásmido pRB20 se digiere también de una manera compatible con sitios de clonación convencionales para la introducción de los fragmentos de PCR. Después del tratamiento con fosfatasa del pRB20 linearizado, los productos de PCR son ligados en pRB20 y las mezclas de ligación se usan para transformar la cepa DH10B de E. coli . Las colonias se seleccionan y se cultivan en medios líquidos para la preparación de ADN plasmidico. La digestión de las moléculas de ADN plasmidicas con un diagnóstico de enzima para la orientación adecuada de las secuencias de codificación relativas al promotor de ß- conglicinina identifica clones para usarlos en la transformación de soya. Los embriones de soya se transforman después con el vector de expresión que comprende secuencias que codifican para los polipéptidos de Cal éndula descritos arriba. Para inducir embriones somáticos, cotiledóneas de 3-5 mm de longitud extirpadas de semillas inmaduras y de superficie esterilizada de un cultivo de soya, tales como A2872, se pueden cultivar en la luz u oscuridad a 26°C sobre un medio de agar adecuado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se cortan después y se colocan en un medio liquido adecuado. Después *"""» - -.«... A. A de la selección repetida para racimos de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones de etapas globulares tempranos, las suspensiones se mantienen como se describe abajo. Los cultivos de suspensión embriogénica de soya se mantienen en 35 mL de medios líquidos sobre un agitador giratorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes en un programa diurno/nocturno de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio liquido. Los cultivos de suspensión embriogénica de soya se pueden transformar después mediante el método de bombardeo con pistola de partículas (Kline y otros (1987) Nature (Londres) 327: 70, patente de E.U.A. No. 4,945,050). Un instrumento Du Pont Biolistic™ PDS1000/HE (readaptación con helio) se puede usar para estas transformaciones. Un gen marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación de soya es un gen quimérico compuesto del promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell y otros (1985) Nature 313: 810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli ; Gritz y otros (1983) Gene 25: 179-188) y la región 3' del gen de nopalina sintasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacteri um tumefaciens . El cásete de expresión de semilla que comprende la región 5' de faseolina, el fragmento que codifica para la enzima de modificación de ácido graso conjugado de Caléndula y la región 3' de faseolina se pueden aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento se puede insertar después en un sitio de restricción único del vector que porta al gen marcador. A 50 µL de una suspensión de 60 mg/mL de partículas de oro de 1 mm se le añade (en orden) : 5 µL de ADN (1 µg/lµL), 20 µL de espermidina (0.1 M) y 50 µL de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas se agita después durante tres minutos, se centrifuga en una microcentrífuga durante 10 ¡segundos y se remueve el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan después una vez en 400 µL de etanol al 70% y se resuspenden en 40 µL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/particulas se puede sonificar tres veces durante un segundo cada una. Cinco µL de las partículas de oro recubiertas con ADN se cargan después sobre cada disco macroportador . Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas de edad se ponen en una caja de petri de 60 x 15 mm vacia y el líquido residual se remueve del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, aproximadamente 5-10 placas de tejido se bombardean normalmente. La presión de ruptura de la membrana se ajusta a 77.33 kg/cm2 y la cámara se evacúa a un vacio de 711 milímetros de mercurio. El tejido se pone aproximadamente a 8.90 cm lejos del tamiz de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir a la mitad, ponerse de nuevo en líquido y cultivarse como se describió arriba. Cinco a siete días después del bombardeo, los medios líquidos se pueden intercambiar con medios frescos, y once a doce días después del bombardeo con medios frescos que contengan 50 mg/mL de higromicina. Estos medios selectivos se pueden refrescar semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar un tejido verde y transformado creciendo a partir de racimos embriogénicos necróticos y no transformados. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénica transformados y clonalmente propagados. Cada linea nueva se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar después y mantenerse como racimos de embriones inmaduros o regenerarse en plantas enteras mediante maduración y germinación de embriones somáticos individuales. Con el uso de los métodos descritos en este ejemplo, se pueden identificar y propagar embriones de soya transformados con niveles detectables de ácidos grasos poliinsaturados conjugados.

Ejemplo 8 Expresión de genes quiméricos en células microbianas Las moléculas de ADNc que codifican para las presentes enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la síntesis de doble enlace conjugado que comprenden la posición delta-9 en semillas de Caléndula officinalis se pueden insertar en el vector de expresión pET24d (Novagen) de E. coli T7. Por ejemplo, ADN plasmidico que contenga un ADNc se puede digerir adecuadamente para liberar un fragmento de ácido nucleico que codifique para las enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la síntesis de doble enlace conjugado en semillas de Caléndula officinalis . Este fragmento se puede purificar después en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% NuSieve GTG™ (FMC) . El regulador de pH y agarosa contienen 10 µg/ml de bromuro de etidio para la visualización del fragmento de ADN. El fragmento se puede purificar después del gel de agarosa mediante digestión con GELase™ (Epicentre Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, precipitarse en etanol, secarse y resuspenderse en 20 µL de agua. Los adaptadores de oligonucleótidos adecuados se pueden ligar al fragmento usando T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA) . El fragmento que contiene los adaptadores ligados se puede purificar de los adaptadores en exceso usando agarosa de baja fusión como la descrita arriba. El vector pET24d es digerido, desfoforilado con fosfatasa alcalina (NEB) y desproteinizado con fenol/cloroformo como se describió arriba. El vector preparado pET24d y el fragmento se pueden ligar después a 16°C durante 15 horas seguidos por la transformación en células electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL) . Se pueden seleccionar transformantes sobre placas de agar que contengan medios 2xYT y 50 µg/mL de kananicina. Los transformantes que contengan al gen son analizados después para verificar la orientación adecuada con respecto al promotor T7 del pET24d mediante análisis con enzimas de restricción. Los clones en la orientación adecuada con respecto al promotor T7 se pueden transformar en células competentes BL21 (DE3) (Novagen) y seleccionarse sobre placas de agar 2xYT que contengan 50 µg/mL de kanamicina. Una colonia que se origine de esta construcción de transformación se puede cultivar durante la noche a 30°C en medios 2xYT con 50 µg/mL de kanamicina. El cultivo se diluye después dos veces con medios frescos, se deja volver a crecer durante 1 hora y se induce mediante la adición de tiogalactopiranósido de isopropilo hasta una concentración final de 1 mM. Las células se cosechan después mediante centrifugación después de 3 horas y se re-suspenden en 50 µL de Tris-HCl 50 mM a pH 8.0 que contiene DTT 0.1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0.2 mM. Se puede añadir una cantidad pequeña de esferas de vidrio de 1 mm y la mezcla sonificarse tres veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonificador de microsonda. La mezcla se centrifuga y la concentración de proteínas del sobrenadante se determina. Un µg de proteina de la fracción soluble del cultivo se puede separar mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Los geles se pueden observar para bandas de proteínas que migren al peso molecular esperado. Én A ii ,t ¿ i .Ü?~x . i, .

Ejemplo 9 Los ácidos grasos 18:3 conjugados pueden mejorar la calidad del cadáver cuando se añaden a alimento para animales Se llevaron a cabo experimentos para evaluar los efectos de alimentar ácidos grasos eleosteáricos (18:3) conjugados en el crecimiento, características del cadáver y firmeza de grasa de cerdo. Veinticuatro cerdos (machos castrados de PIC genetics) con una capacidad para altas velocidades de crecimiento magro diario y grasa subcutánea reducida se asignaron en forma aleatoria por crias de la misma carnada, peso y bloque a tres tratamientos dietéticos. Al grupo uno se le alimentó con maiz normal, el grupo dos recibió alimento de maiz normal complementado con CLA y el tercer grupo recibió alimento de maiz normal complementado con ácidos linolénicos conjugados, es decir, ClnAs (ácidos grasos conjugados 18:3). Los cerdos fueron aislados individualmente y se identificaron por tatuajes en la oreja. El peso inicial promedio de los cerdos macho castrados fue de 57 kilos. Los cerdos se pusieron en sus dietas de prueba respectivas a los 68 kilos, después de haber sido alimentados con una dieta común.

Las dietas se alimentaron en dos fases: Fase 1 (68 a 91 kilos) , y Fase 2 (91 a 113 kilos) . Las composiciones de ingredientes y nutrientes de las dietas de tratamiento se muestran en la Tabla 4 y Tabla 5, respectivamente. Las dietas se formularon para ser isocalóricas .

Tabla 4 Composición de ingredientes de las dietas f^^ ~j - & Á^^ ^l 1 - Maiz híbrido normal, W677, de Wyfiels, Atkinson, IL 2 - Perdue Farms . Inc., Greenville, NC 3 - Moyer Packin Co., Souderton, PA 4 - Archer Daniels Midland Co . , Decatur, IL 5 - Akey, Inc. Lewisburg, OH 6 - Potash Company of Saskatchewan, Davenport, IA 7 - Akey, Inc. Lewisburg, OH 8 - Premezcla de Minerales de Traza y Vitamina, Young' s, Greensboro, MD 9 - Akey, Inc. Lewisburg, OH 10 - Akey, Inc. Lewisburg, OH Tabla 5 Composición de nutrientes calculada para dietas de tratamiento El mezclador usado para preparar las dietas fue llenado con 136 kilos de maíz antes del mezclado y entre cada mezcla para evitar la contaminación cruzada. El ácido linoleico conjugado (CLA) se compró de Conlinco, Inc. (Detroit Lakes, MN) como "Clareen™". El ácido linolénico conjugado (ClnA) fue de una fuente comercial de aceite de palo (Industrial Oil Products, Woodbury, NY) que era aproximadamente 65% ácido a-eleosteárico. Para lograr una concentración de ácido graso conjugado final de 0.50%, se añadieron 0.38 kg de preparación de CLA/dieta de 45.3 kg y 0.33 kg de preparación de ClnA/dieta de 45.3 kg. Para minimizar la oxidación del ácido graso conjugado, las dietas se prepararon cada 14 dias y se refrigeraron hasta usarse. Se añadió alimento a los alimentadores en cantidades mínimas diariamente. El antibiótico metilen disalicilato de bacitracina (BDM, Alpharma, Inc., Fort Lee, NJ) se incluyó en todas las dietas (50 g/ton) . Las muestras de alimento se recogieron para el análisis de aminoácidos y ácidos grasos. Los pesos en vivo se registraron para determinar las ganancias diarias promedio: Fase 1 (68 a 91 kg) y Fase 2 (91 a 113 kg) . Los datos del peso del alimento se recabaron también para determinar la eficiencia del alimento. Los animales se observaron 2-3 veces al día para verificar su acceso a los alimentadores y suministradores de agua, temperaturas de alojamiento y cualesquiera condiciones de salud anormales. Los cerdos no se remplazaron durante la prueba. Cualquier animal que muriera fue sometido a necropsia para determinar la causa de muerte. Los pesos corporales del animal muerto se usaron para corregir la eficiencia del alimento. Cuando los cerdos alcanzaron 113 kilos de peso corporal fueron sacrificados, procesados y se tomaron las mediciones de cadáver estándares. Debido a las limitaciones en el ácido graso conjugado, los cerdos alimentados con CLA y CLnA fueron alimentados con una dieta común cuatro dias antes del sacrificio. Las panzas de los ocho cerdos en cada grupo de estudios se evaluaron para verificar la firmeza de la grasa evaluada midiendo el grosor de la panza antes y después de la compresión. La compresión de la grasa de logró colocando un peso de 23 kg sobre la panza fresca durante una hora. La compresión de la grasa se cuantificó restando el grosor de panza comprimida del grosor de panza inicial. El grosor de la panza se midió usando un micrómetro. Los resultados de la evaluación de compresión de panza se muestran en la Tabla 6. Los datos se analizaron como un diseño de bloque completo aleatorio usando el procedimiento GLM (General Linear Model) de SAS (Statistical Analysis Systems) . Los valores de la tabla representan la diferencia entre los grosores de panza de cerdo comprimida y no comprimida. Un número más pequeño indica compresión reducida (es decir, mayor firmeza) de las panzas de cerdo. Ya que la panza de un cerdo es más de 50% grasa, la prueba de compresión de panza es un indicador de la firmeza relativa de la grasa de la panza del cerdo. La adición de CLA o ClnA a las dietas NC dio como resultado una mayor firmeza de grasa en los cerdos. La firmeza de la grasa de los cerdos mejorada que resulta de la adición dietética de CLA es consistente con los resultados reportados por otros (Eggert, J.M. y otros (1999) J. Anim. Sci . 11 ( Suppl) : 53; Thiel, R.C., y otros (1998), J. Anim. Sci . 16 { Suppl ) : 13; Wiegand, B.R., F.C. Parrish Jr y J.C. Sparks (1999) J. Anim. Sci . 11 ( Suppl ) : 19; patente de E.U.A. No. 5,554,646 y patente de E.U.A. No. 5,851,572). Una firmeza de grasa mejorada que resulta de la inclusión de ClnA en la dieta no se ha reportado previamente. Con base en los resultados de este experimento, la adición de ácido linoleico conjugado (CLA) o ácido linolénico conjugado (ClnA) a dietas de cerdos da como resultado una firmeza de grasa mejorada.

Tabla 6 1Error estándar de la media 2Todos los tres medios de muestra de prueba fueron estadísticamente diferentes (P<0.05) Ejemplo 10 Producción de ácido caléndico en embriones de soya somáticos Los clones CalFad2-l y CalFad2-2 de Caléndula officinalis se expresaron en embriones de soya somáticos para poder examinar su actividad en una especie de cultivo. Los marcos de lectura abiertos de estas moléculas de AD?c se amplificaron mediante PCR para poder generar los sitios de enzima de restricción de flanqueo adecuados para clonarlos en el vector de expresión de soya. Los oligonucleótidos cebadores usados para la amplificación del marco de lectura abierto de CalFad2-l fueron: 5'-ttgcggccgcTACACCTAGCTACGTACCATG-3' (sentido, SEQ ID ?O:18) y 5'-ttgcggccgTCACGGTACTGATGATGGCAC-3' (antisentido, SEQ ID ••Mlfa'»44«ha MÉife ^j^ A-NO: 19). Los oligonucleótidos cebadores usados para la amplificación de la secuencia de codificación de CalFad2-2 fueron: 5' -agcggccgcTATACCATGGGCAAG-3' (sentido, SEQ ID NO: 20) y 5' -tgcggccgcTATGTTAAACTTC-3' (antisentido, SEQ ID NO:21). [Nota: las secuencias mostradas en minúsculas contienen un sitio Notl añadido junto con bases adicionales para facilitar la digestión con enzimas de restricción] . El molde fue el AD?c que corresponde a ecslc.pk009.nl4 (CalFad2-1) de EST o ecslc.pk008.a24 (CalFad2-2) de EST, y se usó Pfu polimerasa (Stratagene) para las reacciones de amplificación. Los productos de PCR resultantes se subclonaron en el vector intermedio pCR-Script AMP SK(+) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secuencias de codificación de CalFad2-l y CalFad2-2 amplificadas se liberaron después con digestión con Notl y se subclonaron después en el sitio correspondiente del vector de expresión de soya pKS67. El vector pKS67 contiene el promotor del gen para la subunidad a' de ß-conglicinina [Beachy y otros, (1985) EMBO J. 4: 3047-3053], que permite una expresión especifica en semilla fuerte de los transgenes. Este vector se construyó como sigue. Un plásmido pZBLlOO que contenía genes quiméricos para permitir la expresión de higromicina ß-fosfotransferasa en ciertas bacterias y en células vegetales se construyó a partir de los siguientes elementos genéticos: a) promotor T7 + Shine-Delgarno / higromicina B fosfotransferasa (HPT) / secuencia terminadora T7, b) promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) / higromicina B fosfotransferasa (HPT) / nopalina sintasa (NOS3' de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens y c) vector del plásmido pSP72 (Promega) con la región de codificación de ß-lactamasa (gen de resistencia a ampicilina) removida. El gen de higromicina B fosfotransferasa se amplificó mediante PCR a partir de la cepa W677 de E. coli (Gritz, L. y Davies, J (1983) Gene 25: 179-186 que contenía un plásmido pJR225 derivado de Klebsi ella (Gritz, L. y Davies, J (1983) Gene 25: 179-188. Iniciando con el vector pSP72 (Promega) , los elementos se ensamblaron en un solo plásmido usando métodos de clonación estándares (Maniatis) . El plásmido pZBLlOO contiene de esta manera el cásete de promotor T7/HPT/terminador T7 para la expresión de la enzima HPT en ciertas cepas de E. coli , tal como NovaBlue (DE3) (Novagen) , que son lisógenas para lambda DE3 (que porta al gen de T7 ARN polimerasa bajo control de lacUV5) . El plásmido pzBLlOO contiene también el cásete 35S/HPT/NOS para la expresión constitutiva de la enzima HPT en plantas, tales como soya. Estos dos sistemas de expresión permiten el uso Mi!4A..1 i í-sk A^ ^^ A de la selección para el crecimiento en presencia de higromicina como un medio para identificar células que contengan al plásmido en sistemas tanto vegetales como bacterianos . PZBL100 también contiene tres sitios de endonucleasa de restricción únicos adecuados para la clonación de otros genes quiméricos en este vector. La construcción de un plásmido para la expresión de las secuencias de codificación de CalFad2-l y CalFad2-2 bajo control del promotor de la subunidad a' de ß-conglicinina de soya (Beachy y otros, (1985) EMBO J. 4: 3047-3053) se facilitó mediante el uso de los plásmidos pCW109 y pMLld, ambos de los cuales han sido descritos (véase Publicación de Patente Mundial No. W094/11516) . Un sitio Notl único se introdujo en la región de clonación entre el promotor de ß-conglicinina y el extremo 3' de faseolina en pCW109 mediante digestión con Ncol y Xoal seguida por la remoción de los extremos de AD? de una sola hebra con exonucleasa de semilla. Los enlazadores Notl (?ew England Biolabs) se ligaron en el plásmido linearizado para producir el plásmido pAW35. El sitio Notl individual en pMLld se destruyó mediante digestión con Notl , llenando los extremos de un sola hebra con d?TPs y fragmento Klenow seguidos por la re-ligación del plásmido linearizado. El pMLld modificado se digirió después con Hindlll y se trató con fosfatasa intestinal de becerro. El cásete de expresión de ß-conglicinina : Notl : faseolina en pAW35 se removió mediante digestión con Hind III y el fragmento de 1.8 kB se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento aislado se ligó en la construcción pMLld modificada y linearizada descrita arriba. Un clon con la orientación deseada se identificó mediante digestión con Notl y Xioal para liberar un fragmento de 1.08 kB que indicara que la orientación de la unidad de transcripción de ß-conglicinina fuera la misma que la unidad de transcripción del marcador seleccionable. Al plásmido resultante se le dio el nombre de pBS19. Hindl l l es uno de los únicos sitios de clonación disponibles en pZBLlOO. Para ensamblar el cásete de expresión final, pBS19 y pZBLlOO se digirieron ambos con Hindl l l . El fragmento que contenia ß-conglicinina de pBS19 se aisló mediante electroforesis en gel y se ligó en el pZBLlOO digerido, el cual habla sido tratado con fosfatasa alcalina de becerro. Al plásmido resultante se le nombró pKS67. i j¿ Jk^^-fc **- » Las secuencias de codificación amplificadas por PCR de CalFad2-l y CalFa2-2 se fusionaron con el promotor de ß- conglicinina, y las secuencias de terminación de faseolina en el vector pKS67 se transformaron en embriones de soya somáticos como sigue. Para inducir embriones somáticos, cotiledóneas de 3.5 mm de longitud extirpadas de semillas inmaduras y de superficie esterilizada de un cultivo de soya A2872 o JACK-910 se cultivaron en la luz u oscuridad a 26°C sobre un medio de agar adecuado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se cortaron y colocaron después en un medio liquido adecuado. Después de la selección repetida para racimos de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones de etapa globular temprana, las suspensiones se mantuvieron como se describe abajo. Los cultivos de suspensión embriogénica de soya se mantuvieron en 35 mL de medios líquidos en un agitador giratorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes en un programa diurno/nocturno de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivaron cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 L de medio liquido. Los cultivos de suspensión embriogénica de soya se transformaron después con el vector pKS67 que contiene la ?l=lai B I- * '* -. «faA .ltljbdt »-. &,afc*,4Í« . ... ,,- »4 Jt»444.« «. »-. v « ~"> - 4 . » ^.^»,1. , .. ...a». *j¿±A.?~*< 4¡4 4.. * . * 4» .».-». t .t ~í-secuencia de codificación para CalFad2-l y CalFad2-2 mediante el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein y otros (1987) Nature (Londres) 327: 70, patente de E.U.A. No. 4,945,050). Un instrumento Du Pont Biolisticá PDS1000/HE (readaptación con helio) se usó para estas transformaciones. A 50 mL de una suspensión de 60 mg/mL de partículas de oro de 1 mm se le añadieron (en orden) : 5 mL de ADN (1 mg/mL), 20 ml de espermidina (0.1 M) y 50 ml de CaCl2 (2.5 M) . Las preparación de partículas se agitó después durante tres minutos, se centrifugó en una microcentrífuga durante 10 segundos y se removió el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavaron después una vez en 400 mL de etanol al 70% y se resuspendieron en 40 mL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/particulas se sonificó tres veces durante un segundo cada vez. Cinco mL de las partículas de oro recubiertas con ADN se cargaron después sobre cada disco macroportador . Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas de edad se colocaron en una caja de petri de 60 x 15 mm vacía y el líquido residual se removió del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, aproximadamente 5 a 10 placas de tejido fueron bombardeadas. La presión de la ruptura de la membrana se ajustó a 77.33 kg/cm2 y la cámara se evacuó a un vacio de 711 milímetros de mercurio. El tejido se puso aproximadamente a 8.90 cm lejos del tamiz de retención y se bombardeó tres veces. Después del bombardeo, el tejido se dividió a la mitad y se puso de nuevo en liquido y cultivarse como se describió arriba. Cinco a siete días después del bombardeo, los medios líquidos se intercambiaron con medios frescos, 'y once a doce dias después del bombardeo con medios frescos que contenían 50 mg/mL de higromicina. Estos medios selectivos se refrescaron semanalmente. Siete u ocho semanas después del bombardeo, se observó un tejido verde transformado que crecía a partir de racimos embriogénicos necróticos no transformados. El tejido verde aislado se removió y se inoculó en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénica transformados y clonalmente propagados. Cada linea nueva se trató como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se subcultivaron después y se mantuvieron como racimos de embriones inmaduros. Los embriones inmaduros en esta etapa produjeron productos de almacenamiento, incluyendo lipidos de almacenamiento que son similares en composición a los embriones cigóticos a una etapa de desarrollo similar (véase Publicación de Patente Mundial No. W094/11516) . Los embriones de soya transgénicos seleccionados y mantenidos de esta manera se analizaron para verificar el 5 contenido de ácido caléndico usando cromatografía de gas (CG) o cromatografía de gas-espectrometria de masas (CG-EM) . Los embriones individuales que expresaban CalFad2-l o CalFad2-2 se homogeneizaron en 1% (p/v) de metóxido de sodio en metanol. Los esteres metílicos de ácido graso que resultaron 0 de esta etapa de transesterificación se analizaron mediante CG y CG-EM usando métodos descritos en el ejemplo 3. En embriones somáticos que expresaban ADNc, se detectó un éster metílico de ácido graso con tiempo de retención y espectro de masas equivalente al del ácido metil caléndico de extractos 5 de semilla de Caléndula officinali s (figura 5) . Este éster metílico de ácido graso no se detectó en extractos de embriones no transformados. Para confirmar más la identidad del ácido metil caléndico en embriones de soya que expresaban CalFad2-l y CalFad2-2, esteres metílicos de ácido graso del 0 tejido transgénico se hicieron reaccionar con 4-metil-l, 2, 4- triazolino-3,5-diona (MTAD) [Dobson, G. (1998) J. Am. Oil Chem. Soc . 75: 137-142] y los derivados resultantes se analizaron mediante CG-EM. (Este reactivo reacciona principalmente con dobles enlaces trans conjugados para formar aductos de Diels-Alder con MTAD) . Un CG Hewlett-Packard 6890 conectado a un detector selectivo de masas Hewlett-Packard 5973 se usó para estos análisis. Las muestras se resolvieron con una columna DBl-Ht (15 m x 0.25 mm D.I.) (J&W Scientific), y la temperatura del horno se programó de 185°C (mantenida 3 minutos) a 265°C a una velocidad de 2°C/minuto. El espectro de masas del derivado de MTAD del éster metílico de ácido graso novedoso en los embriones de soya transgénicos que expresaban CalFad2-l y CalFad2-2 fue idéntico al del derivado de MTAD de ácido metil caléndico de extractos de semilla de Caléndula offi cinalis (figura 6) . Estos espectros de masas se caracterizaron por un ion molecular de 405 m/z y también por un ion de diagnóstico principal de 262 m/z . Estos resultados confirman entonces que los embriones de soya somáticos que expresan CalFad2-l o CalFad2-2 producen ácido caléndico. La Tabla 7 muestra una comparación de las composiciones de ácido graso de embriones de soya somáticos no transformados y embriones de lineas transgénicas MSE 284-2-6 y MSP 425-12-2 que son transformados con las moléculas de ADNc de CalFad2-l y CalFad2-2, respectivamente, detrás del promotor de la subunidad a' de ß-conglicinina especifico para semilla (como se describió arriba) .

Tabla 7 Composiciones de ácido graso de embriones somáticos a partir de líneas transgénicas de soya MSE 284-2-6 y MSP 425-12-2 que expresan las moléculas de ADNc de CalFad2-l y CalFad2-2 asociadas con la síntesis de ácido caléndico Xas composiciones de ácido graso se dan como el porcentaje en peso de ácidos grasos totales de embriones de soya somáticos medidos por la cromatografía de gas como se describió arriba. Xos valores se obtuvieron de cinco mediciones separadas (± desviación estándar) de embriones individuales. 3N.D., no detectado.

Ejemplo 11 Producción de ácido dimorfecólico en embriones de soya somáticos transgénicos El aceite de semilla de la especie Dimorphotheca que incluye Dimorphotheca sinuata es enriquecido en el inusual graso de Cíe ácido dimorfecólico (9-0H-18:2?10trans'12trans) , el cual contiene dos dobles enlaces trans conjugados entre los átomos de carbono ?10 y ?11 y entre los átomos de carbono ?12 y ?13 asi como un grupo hidroxilo en el átomo de carbono ?9 [Binder, R.G. y otros, (1964) J. Am . Oil Chem. Soc . 41: 108-111; Morris, L. J. y otros, (1960) J. Am. Oil Chem . Soc . 37: 323-327]. A partir de los resultados descritos abajo, se cree que el ácido dimorfecólico se produce en una vía biosintética que incluye las actividades de dos formas divergidas de la ?12-ácido oleico desaturasa (Fad2) de Dimorphotheca, designada DMFad2-l y DMFad2-2 (figura 7) . Los datos de expresión de embriones de soya somáticos transgénicos (como los descritos abajo) son consistentes con DMFad2-l que cataliza la formación de un doble enlace A12trans en ácido oleico para formar 16:2?9c?s'12tranX El doble enlace ?9c?s de este intermediario de ácido graso se modifica después mediante DMFad2-2 para formar 9-OH y un doble enlace ?10tranX Por lo tanto, la hidroxilación de la posición ?9 por DMFad2-2 lleva a la formación de dobles enlaces conjugados. El producto de estas dos etapas es ácido dimorfecólico. Las moléculas de ADNc de DMFad2-l y DMFad2-2 se derivaron de ESTs para Fad2s divergidos que se identificaron entre grupos de ESTs de una biblioteca de ADNc de semilla de Dimorphotheca sinuata (dms2c.pk006.d7, SEQ ID NO: 10; y dms2c.pk001.113, SEQ ID NO: 12). Es notable que la secuencia de aminoácidos que corresponde a DMFad2-2 (SEQ ID NO: 13) está más relacionada con las de CalFad2-l (SEQ ID NO: 2) y CalFad2-2 (SEQ ID NO: 4), las cuales han demostrado catalizar la formación de dobles enlaces conjugados mediante la modificación de la posición delta-9 de ácido linoléico (ejemplos 3, 4 y 10) . Usando el programa de comparación de secuencias múltiples Megalign (v3.1.7) del paquete de software Lasergene™ (DNASTAR Inc., Madison, Wl) y el método Clustal de alineación (parámetros de programa por omisión) , la secuencia de aminoácidos de DMFad2-2 (SEQ ID NO: 13) comparte 72.5% de identidad con la secuencia de aminoácidos de CalFad2-l (SEQ ID NO: 2) y 74.0% de identidad con la secuencia de aminoácidos de CalFad2-2 (SEQ ID NO: 4) . En contraste, la secuencia de aminoácidos de DMFad2-2 (SEQ ID NO: 13) comparte menos del 52% de identidad con cualquier otro de los polipéptidos relacionados con Fad2 mostrados en la figura 2, incluyendo aquellos de la hidroxilasa de ricino y ?6-ácido oleico desaturasas convencionales tales como polipéptidos de soya, borraja y girasol. Por lo tanto, dada su cercana relación con CalFad2-l y CalFad2-2, se cree que DMFad2-2 está asociado con la posición delta-9 modificada que está presente en ácido dimorfecólico. También es notable que el residuo inmediatamente adyacente al primer bloque de histidina en las secuencias de aminoácidos de DMFad2-l y DMFad2-2 es una glicina (indicada por un asterisco en la figura 2) . Una glicina en esta posición sólo se observa en enzimas relacionadas con ?6-ácido oleico desaturasa que tienen funcionalidad divergida, tales como la ácido oleico hidroxilasa de ricino (van de Loo, F. J. y otros (1995) Proc. Nati . Acad. Sci . E.U.A. 92: 6743-6747) y la epoxidasa de Crepis palaestina (Lee, M. y otros (1998) Sci ence 280: 915-918) . Dada esta característica de sus estructuras primarias, se cree que los polipéptidos codificados por DMFad2-l y DMFad2-2 están asociados con la síntesis de ácido dimorfecólico y no son ?d-ácido oleico desaturasas convencionales implicadas en la síntesis de ácido graso estándar. Inicialmente, los marcos de lectura abiertos de moléculas de ADNc para DMFad2-l y DMFad2-2 se amplificaron mediante PCR usando Pfu polimerasa (Stratagene) para generar los sitios de enzima de restricción adecuados para clonarlos en el vector de expresión de soya. Para la amplificación del marco de lectura abierto del ADNc de DMFad2-l, dms2c.pk006.d7 de EST (SEQ ID NO: 10 para la secuencia de nucleótidos, y SEQ ID NO: 11 para el producto de traducción de polipéptidos) se usó como el molde, y los oligonucleótidos cebadores fueron: 5'-tatgcggccgcAAATGGGAGCAGGAGGTTG-3' (sentido, SEQ ID NO: 22) y 5'-tttgcggccgcATTACATCTTATTCTTGTACC-3' (antisentido, SEQ ID NO: 23) . Para la amplificación del marco de lectura abierto del ADNc de DMFad2-2, dms2c.pk001.113 de EST (SEQ ID NO: 12 para la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 13 para el producto de traducción de polipéptidos) se usaron como el molde, y los oligonucleótidos cebadores fueron: 5'-tgcggccgcAATGGGTGGAGGGATGGGAGCATCTGAG-3' (sentido, SEQ ID NO: 24) y 5' -tagcggccgcTGATTAATCAAGTCTTAG-3' (antisentido, SEQ ID NO:25). Los nucleótidos mostrados en minúsculas no son secuencias de Dimorphotheca, sino que codifican para un sitio Notl añadido junto con bases adicionales para facilitar la digestión con enzimas de restricción. Los productos de PCR resultantes fueron subclonados en el vector intermedio pCR- Script AMP SK(+) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los productos de PCR DMFad2-l y DMFad2-2 se movieron después como fragmentos Notl en el sitio correspondiente del vector de expresión de soya pKS67 detrás del promotor del gen para la subunidad a' de ß-conglicinina. La construcción del vector pKS67 se describe en el ejemplo 10. El fragmento Notl de DMFad2-l también se subclonó en el vector de expresión de soya pKS17, el cual es equivalente al vector pKS67 excepto que carece del cásete de 35S/higromicina fosfotransferasa (HPT) /NOS para la expresión constitutiva de la enzima HPT en plantas. Las construcciones de expresión que contienen las secuencias de codificación de DMFad2-l y DMFad2-2 en el vector pKS67 se transformaron en embriones de soya somáticos usando el método biolistico como el descrito en el ejemplo 10. Para determinar sus funciones, DMFad2-l y DMFad2-2 se expresaron individualmente o se co-expresaron en embriones de soya somáticos. Las composiciones de ácido graso de los embriones de soya transgénicos resultantes se evaluaron después para verificar la presencia de estructuras de ácido graso novedosas. Los experimentos de transformación individuales fueron MSE 331 (DMFad2-l) y MSE 229 (DMFad2-2) . Se llevó a cabo un experimento de transformación por coexpresión (MSE 330) en el cual la secuencia de codificación de DMFad2-2 en el vector pKS67 se co-transformó con la secuencia de codificación de DMFad2-l en el vector pKS17 en embriones de soya somáticos, usana^ una relación molar de 1:10 de las dos construcciones de expresión para la transformación (usando los métodos descritos en el ejemplo 10) . Los embriones de soya transgénicos resultantes seleccionados para resistencia a higromicina se analizaron para verificar alteraciones en el contenido de ácido graso en relación con los embriones no transformados. Se prepararon esteres metílicos de ácido graso mediante homogeneización de embriones de soya somáticos no transformados y transgénicos en 1% (p/v) de metóxido de sodio en metanol usando métodos descritos por Hitz y otros (1994) Plant Physi ol . 105: 635- 641. Los esteres metílicos de ácido graso se secaron bajo nitrógeno y se reaccionaron con 50-100 µL del agente sililante bis (trimetilsilil) trifuoroacetamida : trimetilclorosilano (99 : 1 v/v) (Supelco) para poder convertir el grupo hidroxilo de ácido dimorfecólico en un derivado etéreo de trimetilsililo (TMS) para cromatografía de gas (CG) y cromatografía de gas- espectrometría de masas (CG-EM) . Los esteres metílicos de ácido graso recuperados y los derivados se analizaron después usando un cromatógrafo Hewlett-Packard 6890 equipado con una columna Omegawax 320 (30 m x 0.32 mm de diámetro interno; Supelco) . La temperatura del horno se programó de 185°C (mantenida 4 minutos) a 215°C a una velocidad de 5°C/min y después a 240°C a 20°C/min (1 minuto de mantenimiento) . Los esteres metílicos de ácido graso también se analizaron mediante CG-EM en un HP6890 interconectado a un detector selectivo de masas HP5973 (Hewlett Packard) . Los compuestos se resolvieron usando una columna HP-INNOWax (30 m x 0.25 mm de diámetro interno) con la temperatura del horno programada a 180°C (mantenida 3.5 minutos) a 215°C a una velocidad de 2°C/minuto (2 minutos de mantenimiento) y después a 230°C a 10°C/mmuto. El análisis por CG de los esteres metílicos de ácido graso de embriones de soya transgénicos que expresan DMFad2-l (experimento de transformación MSE 331) indicó la presencia de un pico que eluyó inmediatamente después del ácido metil linoleico (18 : 2?9cls'12c?s) (figura d), pero estuvo ausente de embriones no transformados. Este pico tuvo el mismo tiempo de retención y espectro de masas que el éster metílico de 16 : 2?9c??,1¿trans que se encuentra en semillas de Dimorphotheca sinuata en desarrollo. El ácido graso novedoso que resulta de la expresión de DMFad2-l en embriones de soya transgénicos se identifica entonces como 18 :2?9c?s,12trans. Las cantidades de este ácido graso medidas en embriones de soya individuales del experimento MSE 331 variaron de 0 a 21% en peso de los ácidos grasos totales. Con base en estos resultados, se identificó DMFad2-l como una enzima de modificación de ácido graso asociada con la síntesis del doble enlace trans-A12 de 18 :2?9cis'12tranX Los esteres metílicos de ácido graso de embriones de soya transgénicos que expresaban DMFad2-2 (experimento de transformación MSE 229) se analizaron mediante CG-EM usando exploración iónica seleccionada para el ion 225 m/z, el cual es el ion más abundante en el espectro de masas del derivado de TMS de ácido metil dimorfecólico. En estos cromatogramas iónicos seleccionados, se detectaron dos picos que desplegaban espectros de masa equivalentes a los del derivado de TMS de ácido metil dimorfecólico. Los menos abundantes de estos picos tuvieron el mismo tiempo de retención que el del derivado de TMS de ácido metil dimorfecólico de semillas de Dimorphotheca sinua ta . Sin embargo, los más grandes de los dos picos desplegaron un tiempo de retención más corto y se identifican tentativamente como la forma cis-A12 isomérica del a- .JLilJ^^i.» ,i , ácido dimorfecólico (9-OH-18 : 2?9c?s'12cis) , la cual se ha reportado previamente que ocurre en cantidades residuales en el aceite de semilla de especies de Dimorphotheca [Morris, L.J. y otros, (1960) J. Am. Oil Chem. Soc . 37: 323-327]. Esta forma isomérica del ácido dimorfecólico posiblemente se origina a partir de la modificación del doble enlace ?9 de ácido linoleico (18:2?9cis'12cis) por DMFad2-2. Los isómeros de ácido dimorfecólico detectados en embriones de soya que expresan DMFad2-2 equivalieron a <0.1% de los ácidos grasos totales. Los resultados de la expresión de DMFad2-2 solos sugieren que un factor limitativo en la síntesis del ácido dimorfecólico es la falta de un grupo de substrato significativo del isómero trans-A12 de ácido linoleico (18:2?9c?s'12trans) en embriones de soya somáticos. Como se describió arriba, este ácido graso es el producto de DMFad2-1. Por lo tanto, en un intento por aumentar las cantidades de ácido dimorfecólico en embriones transgénicos, DMFad2-l y DMFad2-2 se co-expresaron en embriones de soya somáticos (experimento de transformación MSE 330) . Los embriones resultantes acumularon tanto 16 : 2?9c?s,12trans como la forma predominante de ácido dimorfecólico (9-OH-18 :2?9cis,12trans) que también se encuentran en el aceite de semilla de Dimorphotheca sinuata (figuras 9 y 10) . En estos embriones, el ácido dimorfecólico equivalió a 0.5 a 1% en peso de los ácidos grasos totales en comparación con acumulaciones de menos del 0.1% en transformantes de "DMFad2-2 solo". Además, la forma primaria de ácido dimorfecólico detectada en las transformaciones de "DMFad2-2 solo" fue la identificada tentativamente como el isómero ?12c;LS de ácido diformecólico (9-OH-18:2?9cis'12cis, véase figuras 7 y 9) . Estos resultados son consistentes entonces con una via biosintética para el ácido dimorfecólico que implica la actividad inicial de DMFad2-l que genera 18 : 2?9c?s'12trans. El doble enlace ?9 de este ácido graso se modifica después a un doble enlace 9-hidroxi y ?10trans mediante DMFad2-2 para producir ácido dimorfecólico (figura 7) .

Ejemplo 12 Caracterización del producto trans linoleico de DMFad2-l Para caracterizar más la estructura del isómero 18 : 2?9c?s,12trans putativo de embriones de soya que expresan DMFad2-l, el éster metílico de este ácido graso se purifica a .,í-Í,?Í:i Á.?.;lmí.A .t.,,., 4 casi homogeneidad a partir de los embriones transgénicos y se analiza mediante resonancia magnética nuclear por correlación bidimensional ^-"C RMN. El éster metílico del 18 :2?9c?s,12trans putativo se purifica de extractos de embriones de soya transgénicos usando una combinación de cromatografía de capa delgada (CCD) de fase inversa y argentación. Los esteres metílicos de ácido graso de embriones de soya que expresan DMFad2-l se revuelven inicialmente mediante CCD de fase inversa usando un sistema de solventes de metanol: acetonitrilo: agua (60:40:1 v/v/v) y placas para CCD RPis de 20 cm x 20 cm (Merck) . Las placas de CCD que contienen los esteres metílicos de ácido graso crudos se desarrollan secuencialmente a 10 cm, 15 cm y finalmente a la longitud completa de la placa. Las placas de CCD se secan bajo nitrógeno entre desarrollos. Una banda que contiene una mezcla de 18 : 2?9c?s'12c?s de metilo y 18 : 2?9c?s'12trans putativo se identifica mediante tinción ligera con vapor de yodo y después se recupera de la matriz de CCD raspada usando hexano: isopropanol (7:2 v/v). Estos dos isómeros se revuelven después usando CCD de argentación con placas K60 de gel de silice de 10 cm x 20 cm (Whatman) que son saturadas con una solución de 5% (p/v) de nitrato de plata en acetonitrilo. Los isómeros de metilo 18 : 2?9c?s'12c?s y putativo 18:2?9c?s'12trans se separan después sobre las placas de argentación usando un sistema de solventes de hexano: éter etílico (80:20 p/p) y desarrollos secuenciales como los descritos arriba. El isómero de metilo putativo 5 18:2?9c?s'12trans, el cual despliega una movilidad más alta que el metilo 18 : 2?9 ?s,12ci?, se identifica mediante absorbancia ultravioleta después de rociar la placa con 0.1% (p/v) de 2, 7-diclorofluoresceina en metanol. El isómero de metilo putativo i8:2?9c?s,12trans se recupera después de la matriz de 10 CCD raspada con hexano:éter etílico (50:50 v/v), y la diclorofluoresceína residual se remueve mediante el lavado de la capa orgánica con Tris 1M (pH 9.0) . La muestra se pasa finalmente sobre una columna de silice y se eluye con hexano:éter etílico (80:20 v/v) para remover cualquier 15 impureza. El isómero de metilo putativo 18 : 2?9ci?'12trans purificado derivado de embriones de soya transgénicos se analiza después mediante RMN de correlación bidimensional 1U- 13C. El espectro muestra desplazamientos químicos de protón 20 de vinilo (protones asociados con dobles enlaces de carbono) que son diferentes cuando los protones están en la orientación cis versus trans. Por ejemplo, los — ... — -4...«44>MM&trihrtWlÍ4j .*.J« jfcJ t . t t.Jl .. . . - 4t4t^_||„a,jt44¡ desplazamientos de protón de vinilo de un estándar 18:2?9ci£'12cls de metilo son 5.396, 5.360, 5.348 y 5.340 ppm (una lectura para cada protón en los dos dobles enlaces), en comparación con estándar 18 : 2?9c?s'12trans de metilo que tiene desplazamientos químicos de 5.400, 5.392, 5.434 y 5.434 ppm. Los ácidos grasos de soya transgénica se analizan en un experimento comparable y se comparan con el isómero 18:2?9c?s,:2trans de metilo aislado de aceite de semilla de Dimorphotheca (Morris, y otros, (1960) J. Am. Oil Chem. Soc . 37:323-327; Morris y Marshall (1966) Chem & Ind 1493-1494) . 1*J.? ??*? .*??*.*.4 LISTADO DE SECUENCIAS <110> E.I. du Pont de Nemours and Company <120> MÉTODO PARA A PRODUCCIÓN DE ACIDO CALENDICO, UN ACIDO GR SO QUE CONTIENE DOBLES ENLACES CONJUGADOS DELTA-8, 10, 12 Y CIDOS GRA ?., RELACIONADOS QUE TIENEN UNA MODIFICACIÓN EN LA POSICIÓN DE 1A <130> <140> BB1371 <141> <150> BB-1371-P1 <151> 1999-08-16 <160> 25 <170> Microsoft Office 97 <210> 1 <211> 1457 <212> DNA <213> Caléndula officmalis <220> <221> CDS <222> (31) .. (1152) <400> 1 aaaccactat actacaccta gctacgtacc atg ggc aaa gga gca tea aac aag 54 Met Gly Lys Gly Ala Ser Asn Lys 1 5 aag gtt ttg gaa cga gtt cea ate acá aaa ceg cea ttc gaa tac aat 102 Lys Val Leu Glu Arg Val Pro He Thr Lys Pro Pro Phe Glu Tyr Asn 10 15 20 gat ctg aag aaa gca gta cea cea cat tgt ttt tea cga cea ctt ttc 150 Asp Leu Lys Lys Ala Val Pro Pro His Cys Phe Ser Arg Pro Leu Phe 25 30 35 40 cgt tcg ttt tat ttc cta ctt cae gac att att gta acá tgt ate ctt 198 Arg Ser Phe Tyr Phe Leu Leu His Asp He He Val Thr Cys He Leu 45 50 55 ttc tac gta gca tea aac tac att cct atg etc cct ggt ttc ctt tec 246 Phe Tyr Val Ala Ser Asn Tyr He Pro Met Leu Pro Gly Phe Leu Ser 60 65 70 tac att gta tgg cct gtt tac tgg ate tec caá gga gtt ttt ctt ggc 294 Tyr He Val Trp Pro Val Tyr Trp He Ser Gln Gly Val Phe Leu Gly 75 80 85 aga ttg tgg atg att ggc cat gaa tgc ggc cat cat agt ttt agt aat 342 Arg Leu Trp Met He Gly His Glu Cys Gly His His Ser Phe Ser Asn 90 95 100 tac cgt tgg gtc gac gat agt gtt ggt ttt tta ate cat acg gcc acc 390 Tyr Arg Trp Val Asp Asp Ser Val Gly Phe Leu He His Thr Ala Thr 105 110 115 120 etc act ccc tat tti. tec ttc aaa tat agt cae cgt aat cae cat gca 438 Leu Thr Pro Tyr Phe Ser Phe Lys Tyr Ser His Arg Asn His His Ala I %kj *LÁz Í.*&* i*J> -•*>*** itoá » * 125 130 135 cae acc aat tec atg gaa tat gac gaa gtt cat ate ceg aaa cgc aaa 486 His Thr Asn Ser Met Glu Tyr Asp Glu Val His He Pro Lys Arg Lys 140 145 150 tec gaa gct cta gat etc tac ttt gaa ttt etc ggc aac aac ceg atg 534 Ser Glu Ala Leu Asp Leu Tyr Phe Glu Phe Leu Gly Asn Asn Pro Met 155 160 165 ggg tta atg ate acc atg tta tgt aaa etc act ttt gga tat gca gct 582 Gly Leu Met He Thr Met Leu Cys Lys Leu Thr Phe Gly Tyr Ala Ala 170 175 180 tac att atg ttc aat tat acá ggc aag aag cae aaa tet ggg ggt tta 630 Tyr He Met Phe Asn Tyr Thr Gly Lys Lys His Lys Ser Gly Gly Leu 185 190 195 200 gca agt cae ttc tac cea caá age cct etc ttt aac gac age gaa cgt 678 Ala Ser His Phe Tyr Pro Gln Ser Pro Leu Phe Asn Asp Ser Glu Arg 205 210 215 aat cat gtt ttg ttc tet gat gtc ggg att tgc ate gtc ttg tac gca 726 Asn His Val Leu Phe Ser Asp Val Gly He Cys He Val Leu Tyr Ala 220 225 230 tgt tac cgt att gtg atg gtc acá ggg gca atg tcg gca ttt tat gtg 774 Cys Tyr Arg He Val Met Val Thr Gly Ala Met Ser Ala Phe Tyr Val 235 240 245 tac ggc att cct tgg gtt ata atg agt gct att etc ttt gca gca act 822 Tyr Gly He Pro Trp Val He Met Ser Ala He Leu Phe Ala Ala Thr 250 255 260 tat tta caá cae act cat cct tcg ate cct cat tat gat acá act gag 870 Tyr Leu Gln His Thr His Pro Ser He Pro His Tyr Asp Thr Thr Glu 265 270 275 280 tgg aac tgg ctt aga ggg gca tta tcg acá att gat aga gat tta ggg 918 Trp Asn Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr He Asp Arg Asp Leu Gly 285 290 295 ttc ttc aac atg aac aaa acá cat tat cat gtt ate cae cat tta ttt 966 Phe Phe Asn Met Asn Lys Thr His Tyr His Val He His His Leu Phe 300 305 310 cct gtc att ceg gaa tac cat gca caá gag gca act gag gcc ate aag 1014 Pro Val He Pro Glu Tyr His Ala Gln Glu Ala Thr Glu Ala He Lys 315 320 325 ccc ate tta ggt caá tat tac aag tat gat ggt act ceg ttt tta aag 1062 Pro He Leu Gly Gln Tyr Tyr Lys Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Leu Lys 330 335 340 gcg ttg tgg aga gaa atg aag gac tgt att tat gta gaa tec gat caá 1110 Ala Leu Trp Arg Glu Met Lys Asp Cys He Tyr Val Glu Ser Asp Gln 345 350 355 360 ggt cag aag aaa caá ggt att tac tgg ttc aag aat aag att 1152 Gly Gln Lys Lys Gln Gly He Tyr Trp Phe Lys Asn Lys He 365 370 tgaagtttca aataatctgg actaegttta attttgtgcc atcatcagta ccgtgaatta 1212 í .*-,h:Á.H ?. í ,*,A?u. ...... gttttgttgt ggagagaaat gaaggactgt atttatgtag aatccgatca aggtcagaag 1272 aaacaaggta tttactggtt caagaataag atttgaagtt tcaaataatc tggactacgt 1332 ttaattttgt gccatcatca gtaccgtgaa ttagttttgt tgtgttttta attttaattt 1392 cgtgtgatgg tgtaatgtaa tataattcag tataataaag gcgttatcct ttcatgggtt 1452 taaaa 1457 <210> 2 <211> 374 <212> PRT <213> Caléndula officinalis <400> 2 Met Gly Lys Gly Ala Ser Asn Lys Lys Val Leu Glu Arg Val Pro He 1 5 10 15 Thr Lys Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Asp Leu Lys Lys Ala Val Pro Pro 20 25 30 His Cys Phe Ser Arg Pro Leu Phe Arg Ser Phe Tyr Phe Leu Leu His 35 40 45 Asp He He Val Thr Cys He Leu Phe Tyr Val Ala Ser Asn Tyr He 50 55 60 Pro Met Leu Pro Gly Phe Leu Ser Tyr He Val Trp Pro Val Tyr Trp 65 70 75 80 He Ser Gln Gly Val Phe Leu Gly Arg Leu Trp Met He Gly His Glu 85 90 95 Cys Gly His His Ser Phe Ser Asn Tyr Arg Trp Val Asp Asp Ser Val 100 105 110 Gly Phe Leu He His Thr Ala Thr Leu Thr Pro Tyr Phe Ser Phe Lys 115 120 125 Tyr Ser His Arg Asn His His Ala His Thr Asn Ser Met Glu Tyr Asp 130 135 140 Glu Val His He Pro Lys Arg Lys Ser Glu Ala Leu Asp Leu Tyr Phe 145 150 155 160 Glu Phe Leu Gly Asn Asn Pro Met Gly Leu Met He Thr Met Leu Cys 165 170 175 Lys Leu Thr Phe Gly Tyr Ala Ala Tyr He Met Phe Asn Tyr Thr Gly 180 185 190 Lys Lys His Lys Ser Gly Gly Leu Ala Ser His Phe Tyr Pro Gln Ser 195 200 205 Pro Leu Phe Asn Asp Ser Glu Arg Asn His Val Leu Phe Ser Asp Val 210 215 220 Gly He Cys He Val Leu Tyr Ala Cys Tyr Arg He Val Met Val Thr 225 230 235 240 Gly Ala Met Ser Aid Phe Tyr Val Tyr Gly He Pro Trp Val He Met 245 250 255 . ^ ¿ ¿.^^ ¿^ Ser Ala He Leu Phe Ala Ala Thr Tyr Leu Gln His Thr His Pro Ser 260 265 270 He Pro His Tyr Asp Thr Thr Glu Trp Asn Trp Leu Arg Gly Ala Leu 275 280 285 Ser Thr He Asp Arg Asp Leu Gly Phe Phe Asn Met Asn Lys Thr His 290 295 300 Tyr His Val He His His Leu Phe Pro Val He Pro Glu Tyr His Ala 305 310 315 320 Gln Glu Ala Thr Glu Ala He Lys Pro He Leu Gly Gln Tyr Tyr Lys 325 330 335 Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Leu Lys Ala Leu Trp Arg Glu Met Lys Asp 340 345 350 Cys He Tyr Val Glu Ser Asp Gln Gly Gln Lys Lys Gln Gly He Tyr 355 360 365 Trp Phe Lys Asn Lys He 370 <210> 3 <211> 1311 <212> DNA <213> Caléndula officinalis <220> <221> CDS <222> (39).. (1154) <400> 3 aggaattegg caccagccaa aaccaaagcc actatacc atg ggc aag gca gca tea 56 Met Gly Lys a Ala Ser 1 5 gcc aag aag gtt ttg gag cga gtt cea ate tea aaa ceg cea ttc gaa 104 Ala Lys Lys Val Leu Glu Arg Val Pro He Ser Lys Pro Pro Phe Glu 10 15 20 tac aat gat ctg aag aaa gca gta cea cea cat tgt ttt tea cga cea 152 Tyr Asn Asp Leu Lys Lys Ala Val Pro Pro His Cys Phe Ser Arg Pro 25 30 35 ctt tec cga tec ttg tat ttc etc ttt cae gac att att gta acá tgt 200 Leu Ser Arg Ser Leu Tyr Phe Leu Phe His Asp He He Val Thr Cys 40 45 50 ate ctt ttc tac gta gca tea aac tac att cat atg etc cct cgt ttc 248 He Leu Phe Tyr Val Ala Ser Asn Tyr He His Met Leu Pro Arg Phe 55 60 65 70 ctt tec tgc ate gta tgg cct gtt tac tgg ate tec caá gga gtt ttt 296 Leu Ser Cys He Val Trp Pro Val Tyr Trp He Ser Gln Gly Val Phe 75 80 85 etc ggc aga ttg tgg atg ate ggc cae gaa tgc ggt cat cat age ttc 344 Leu Gly Arg Leu Trp Met He Gly His Glu Cys Gly His His Ser Phe 90 95 100 agt aat tac cgt tgg gtc gac gat acá gtc ggt ttt cta ate cat acg 392 Ser Asn Tyr Arg Trp Val Asp Asp Thr Val Gly Phe Leu He His Thr 105 110 115 gcc acc etc act ccc tat ttt tec ttc aaa tat age cae cgt aat cae 440 Ala Thr Leu Thr Pro Tyr Phe Ser Phe Lys Tyr Ser His Arg Asn His 120 125 130 cat gca cae acc aat tec atg gaa tac gac gag gtt cat ate ceg aaa 488 His Ala His Thr Asn Ser Met Glu Tyr Asp Glu Val His He Pro Lys 135 140 145 150 cgc aaa tea gaa gct etc tac ttt gaa ttt ctg ggc aac aac cea ate 536 Arg Lys Ser Glu Ala Leu Tyr Phe Glu Phe Leu Gly Asn Asn Pro He 155 160 165 ggc tta atg ate acc atg cta tgt aaa ctg act ttc gga tat gca gct 584 Gly Leu Met He Thr Met Leu Cys Lys Leu Thr Phe Gly Tyr Ala Ala 170 175 180 tac att atg ttc aat tac acá ggt aag aag cae aaa tet ggg ggc tta 632 Tyr He Met Phe Asn Tyr Thr Gly Lys Lys His Lys Ser Gly Gly Leu 185 190 195 gcg age cae ttc tac cea caá age cct etc ttt aac gac age gaa cgt 680 Ala Ser His Phe Tyr Pro Gln Ser Pro Leu Phe Asn Asp Ser Glu Arg 200 205 210 aac cat gtt ttg ttc tet gac ate ggg att tgc ate gtc ttg tac gcg 728 Asn His Val Leu Phe Ser Asp He Gly He Cys He Val Leu Tyr Ala 215 220 225 230 tgt tac cgt att gtg acg gtc acá ggg gca atg ceg gca ttt tat gtg 776 Cys Tyr Arg He Val Thr Val Thr Gly Ala Met Pro Ala Phe Tyr Val 235 240 245 tac ggt att cct tgg gtt ata atg agt gct att etc ttt gca gca act 824 Tyr Gly He Pro Trp Val He Met Ser Ala He Leu Phe Ala Ala Thr 250 255 260 tat tta caá cae act cat cct tea ate cct cat tat gat acá acg gag 872 Tyr Leu Gln His Thr His Pro Ser He Pro His Tyr Asp Thr Thr Glu 265 270 275 tgg aac tgg ctt aga ggg gct tta tcg acá att gat aga gat tta ggg 920 Trp Asn Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr He Asp Arg Asp Leu Gly 280 285 290 ttc ttc aac atg aac aaa acá cat tat cat gtt ate cae cat ttg ttt 968 Phe Phe Asn Met Asn Lys Thr His Tyr His Val He His His Leu Phe 295 300 305 310 cct gtc att ceg gaa tac cat gca caá gag gca acc gag gcc ate aag 1016 Pro Val He Pro Glu Tyr His Ala Gln Glu Ala Thr Glu Ala He Lys 315 320 325 ccc ate tta ggt caá tat tac aag tat 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1 5 10 15 Lys Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Asp Leu Lys Lys Ala Val Pro Pro His 20 25 30 Cys Phe Thr Arg Ser Leu Ser Leu Ser Phe Tyr Tyr Leu Phe Tyr Asp 35 40 45 Leu He Lys Val Cys He Leu Phe Tyr Val Ala Ser Lys Tyr He Pro 50 55 60 Met Leu Pro Tyr Ser Leu Ser Cys He Val Trp Pro Leu Tyr Trp Phe 65 70 75 80 Phe Gln Gly Ala Phe Leu Gly Arg Leu Trp Met He Gly His Glu Cys 85 90 95 Gly H s His Ser Phe Ser Asn Tyr Arg Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly 100 105 110 Phe Leu Val His Thr Ala Thr Leu Thr Pro Tyr Phe Ser Phe Lys Tyr 115 120 125 Ser His Arg Asn His His Ala His Thr Asn Ser Leu Glu Tyr Asp Glu 130 135 140 Val His Val Pro Lys He Arg Lys Phe Lys Ser Glu His Leu Tyr Ser 145 150 155 160 Glu Phe Leu Thr Asn Asn Pro Phe Gly Leu Val Val Asn Met Val Phe 165 170 175 Glu Leu Thr Phe Gly Tyr Pro Ser Tyr Leu He Phe Asn Tyr Ser Gly 180 185 190 Arg Lys Leu Thr Gln Ala Gly Phe Ala Ser His Leu Tyr Pro Gln Ser 195 200 205 Pro He Phe Asn Asp Ser Glu Arg Asn His Val Phe Phe Ser Asp Val 210 215 220 Gly He Cys He Val Leu Tyr Ala Leu Tyr Arg He Ala He Ala Lys 225 230 235 240 Gly Ala Met Leu Val Leu Tyr Val Tyr Gly Leu Pro Trp Val Val Met 245 250 255 Ser Ala Phe He Phe Ser Leu Thr Tyr Leu Gln His Thr His Pro Ser 260 265 270 He Pro His Tyr Asp Ser Thr Glu Trp Asn Trp Leu Arg Gly Ala Leu 275 280 285 Ser Ser He Asp Arg Glu Leu Ala Gly Ala Phe Asn He Lys Lys Thr 290 295 300 His Tyr His Val Val His His Leu Phe Pro Phe He Pro Glu Tyr His 305 310 315 320 Ala His Asp Ala Thr Glu Ala Leu Lys Pro He Leu Gly Pro Tyr Tyr 32b 330 335 Lys Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Tyr Lys Ala Leu Trp Arg Glu Met Lys 340 345 350 Asp Cys Leu Tyr Val Glu Ser Asp Asp Gly Pro Asn Lys Thr Gly Val 355 360 365 Tyr Trp Phe Lys Thr Lys Thr 370 375 <210> 14 <211> 378 <212> PRT <213> Helianthus annuus <400> 14 Met Gly Ala Gly Glu Tyr Thr Ser Val Thr Asn Glu Asn Asn Pro Leu 1 5 10 15 Asp Arg Val Pro His Ala Lys Pro Pro Phe Thr He Gly Asp Leu Lys 20 25 30 Lys Ala He Pro Pro His Cys Phe Gln Arg Ser Leu Thr Arg Ser Phe 35 40 45 Ser Tyr Val Leu Ser Asp Leu Thr He Thr Ala Val Leu Tyr His He 50 55 60 Ala Thr Thr Tyr Phe His His Leu Pro Thr Pro Leu Ser Ser He Ala 65 70 75 80 Trp Ala Ser Tyr Trp Val Val Gln Gly Cys Val Leu Thr Gly Val Trp 85 90 95 Val He Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser Asp Tyr Gln Trp 100 105 110 Val Asp Asp Thr Val Gly Phe Val Leu His Ser Ser Leu Leu Val Pro 115 120 125 Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His His Arg His His Ser Asn Thr Gly 130 135 140 Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys Ser Arg Ser Lys Val 145 150 155 160 Pro Trp Tyr Ser Lys Tyr Phe Asn Asn Thr Val Gly Arg He Val Ser 165 170 175 Met Phe Val Thr Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Ala Phe Asn 180 185 190 Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys His Tyr Val Pro Thr 195 200 205 Ser Pro Met Tyr Asn Glu Arg Lys Arg Tyr Gln He Val Met Ser Asp 210 215 220 He Gly He Val He Thr Ser Phe He Leu Tyr Arg Val Ala Met ala 225 230 235 240 Lys Gly Leu Val Trp Val He Cys Val Tyr Gly Val Pro Leu Met Val 24b 250 255 Val Asn Ala Phe Leu Val Leu He Thr Tyr Leu Gln His Thr His Pro 260 265 270 Gly Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Glu Trp Leu Lys Gly Ala 275 280 285 Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Val Leu Asn Lys Val Phe His 290 295 300 His He Thr Asp Thr His Val Val His His Leu Phe Ser Thr Met Pro 305 310 315 320 His Tyr Asn Ala Met Glu Ala Gln Lys Ala Leu Arg Pro Val Leu Gly 325 330 335 Glu Tyr Tyr Arg Phe Asp Lys Thr Pro Phe Tyr Val Ala Met Trp Arg 340 345 350 Glu Met Lys Glu Cys Leu Phe Val Glu Gln Asp Asp Glu Gly Lys Gly 355 360 365 Gly Val Phe Trp Tyr Lys Asn Lys Met Asn 370 375 <210> 15 <211> 383 <212> PRT <213> Borago officinalis <400> 15 Met Gly Gly Gly Gly Arg Met Pro Val Pro Thr Lys Gly Lys Lys Ser 1 5 10 15 Lys Ser Asp Val Phe Gln Arg Val Pro Ser Glu Lys Pro Pro Phe Thr 20 25 30 Val Gly Asp Leu Lys Lys Val He Pro Pro His Cys Phe Gln Arg Ser 35 40 45 Val Leu His Ser Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Val He Ala Ala 50 55 60 Leu Phe Phe Tyr Thr Ala Ser Arg Tyr He His Leu Gln Pro His Pro 65 70 75 80 Leu Ser Tyr Val Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Phe Cys Gln Gly Ser Val 85 90 95 Leu Thr Gly Val Trp Val He Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe 100 105 110 Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Leu Leu His Ser 115 120 125 Ala Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His 130 135 140 His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys 145 150 155 160 Lys Arg Ser Gly He Ser Trp Ser Ser Glu Tyr Leu Asn Asn Pro Pro 165 170 175 Gly Arg Val Leu Val Leu Leu Val Gln Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu 180 185 190 Tyr Leu Met Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys 195 200 205 His Phe Asp Pro Lys Ser Pro He Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu Gln 210 215 220 He Tyr He Ser Asp Ala Gly He Val Ala Val Met Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Arg Leu Val Ala Ala Lys Gly Val Ala Trp Val Val Cys Tyr Tyr Gly 245 250 255 Val Pro Leu Leu Val Val Asn Gly Phe Leu Val Leu He Thr Tyr Leu 260 265 270 Gln His Thr Gln Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp 275 280 285 Trp Leu Lys Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Phe Leu 290 295 300 Asn Lys Val Leu His Asn He Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu 305 310 315 320 Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala He 325 330 335 Lys Pro He Leu Gly Asp Tyr Tyr Gln Cys Asp Arg Thr Pro Val Phe 340 345 350 Lys Ala Met Tyr Arg Glu Val Lys Glu Cys He Tyr Val Glu Ala Asp 355 360 365 Glu Gly Asp Asn Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Lys Asn Lys Leu 370 375 380 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial : cebador de PCR de Caléndula officinalis . <400> 16 tttgagctct acacctagct acgtaccatg 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial : cebador de PCR de Caléndula officinalis <400> 17 • tttggatcct cacggtactg atgatggcac 30 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> secuencia Artificial uáA . At. <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-1 de Caléndula <400> 18 ttgcggccgc tacacctagc tacgtaccat g 31 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-1 de Caléndula <400> 19 ttgcggccgt cacggtactg atgatggcac 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuen <400> 20 agcggccgct ataccatggg caag 24 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-2 de Caléndula <400> 21 tgcggccgct atgttaaact te 22 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-2 de Caléndula <400> 22 tatgcggccg caaatgggag caggaggttg 30 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-2 de Caléndula <400> 23 tttgcggccg cattacaict tattcttgta ce 32 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-2 de Caléndula <400> 24 tgcggccgca atgggtggag ggatgggagc atctgag 37 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Definición de Secuencia Artificial: cebador de PCR Fad2-2 de Caléndula <400> 25 tagcggccgc tgattaatca agtcttag 28 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes 5 reivindicaciones:

1. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces 10 conjugados que comprenden una posición delta-9 de ácidos grasos, caracterizado porque el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo 15 menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas. 20

2. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una posición delta-9 de ácidos grasos, caracterizado porque el fragmento, o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo, codifica para una proteina que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13.

3. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de dobles enlaces conjugados que comprenden una posición delta-9 de ácidos grasos, caracterizado porque el fragmento, o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo, (a) hibrida al fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es al menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de conformidad con la reivindicación 2 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas.

4. El fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 47, 48 ó 49, t,^.Á4taj -?uáA?^i^^ H*«cjL?yH4,1 caracterizado porque el fragmento es aislado de Caléndula officinalis o Dimorphotheca sinuata .

5. El fragmento de ácido nucleico aislado de 5 conformidad con la reivindicación 1 , 2, 3, 47, 48 ó 49, caracterizado porque la enzima de modificación de ácido graso vegetal está asociada con la formación de ácido caléndico o ácido dimorfecólico. 10

6. Un gen quimérico caracterizado porque comprende el fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 47, 48 ó 49 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo o un complemento del mismo unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas. 15

7. Un gen quimérico caracterizado porque comprende el fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 4 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo o un complemento del mismo unido operablemente a 20 secuencias reguladoras adecuadas.

8. Un gen quimérico caracterizado porque comprende el fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la - - -j«*-'---*iMBíaiig4=iaaifeaJj,^,Jti^i ürf, reivindicación 5 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo o un complemento del mismo unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas.

9. Una célula huésped o planta transformada, caracterizada porque comprende en su genoma al gen quimérico de conformidad con la reivindicación 6.

10. Una célula huésped o planta transformada, caracterizada porque comprende en su genoma al gen quimérico de conformidad con la reivindicación 7.

11. Una célula huésped o planta transformada, caracterizada porque comprende en su genoma al gen quimérico de conformidad con la reivindicación 8.

12. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en soya, especies Brassica de semillas oleaginosas, maiz, cacahuate, arroz, trigo, girasol, cártamo, algodón, palma, lino y cacao. i.4¿...*.á .1.1

13. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en soya, especies Brassica de semillas oleaginosas, maiz, cacahuate, arroz, trigo, 5 girasol, cártamo, algodón, palma, lino y cacao.

14. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en soya, especies Brassica 10 de semillas oleaginosas, maiz, cacahuate, arroz, trigo, girasol, cártamo, algodón, palma, lino y cacao.

15. La célula huésped o planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula se 15 selecciona del grupo que consiste en células vegetales y microorganismos .

16. La célula huésped o planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la célula se 20 selecciona del grupo que consiste en células vegetales y microorganismos .

17. La célula huésped o planta de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste en células vegetales y microorganismos .

18. Semillas caracterizadas porque se obtienen de una planta transformada con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 6.

19. Semillas caracterizadas porque se obtienen de una planta transformada con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 7.

20. Semillas caracterizadas porque se obtienen de una planta transformada con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 8.

21. Aceite caracterizado porque se obtiene de las semillas de conformidad con la reivindicación 18.

22. Aceite caracterizado porque se obtiene de las semillas de conformidad con la reivindicación 19.

23. Aceite caracterizado porque se obtiene de las semillas de conformidad con la reivindicación 20.

24. Un método para alterar el nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, en donde estos ácidos grasos comprenden una modificación en una posición delta-9, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula huésped o planta con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 6; (b) cultivar la célula huésped o planta transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada.

25. Un método para alterar el nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, en donde estos ácidos grasos comprenden una modificación en una posición delta-9, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula huésped o planta con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 7; (b) cultivar la célula huésped o planta transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada.

26. Un método para alterar el nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, en donde estos ácidos grasos comprenden una modificación en una posición delta-9, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula huésped o planta con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 8; (b) cultivar la célula huésped o planta transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada.

27. El método de conformidad con la reivindicación 24, 25 ó 26, caracterizado porque la célula huésped o planta se selecciona del grupo que consiste en células vegetales y microorganismos .

28. El método de conformidad con la reivindicación 5 24, 25 ó 26, caracterizado porque el nivel de ácido caléndico es alterado.

29. Un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden una posición delta-9 10 modificada en las semillas de plantas, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula vegetal con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 6; (b) cultivar una planta madura fértil de la célula 15 vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) 20 para obtener un aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan una posición delta-9 modificada.

30. Un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden una posición delta-9 modificada en las semillas de plantas, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula vegetal con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 7; (b) cultivar una planta madura fértil de la célula vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) para obtener un aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan una posición delta-9 modificada.

31. Un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden una posición delta-9 modificada en las semillas de plantas, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula vegetal con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 8; ^ .¿^Tgg^lg^^ t-"jgt?t? (b) cultivar una planta madura fértil de la célula vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-9 modificada; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) para obtener un aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan una posición delta-9 modificada.

32. El método de conformidad con la reivindicación 29, 30 ó 31, caracterizado porque las plantas se seleccionan del grupo que consiste en soya, especies Brassi ca de semillas oleaginosas, maiz, cacahuate, arroz, trigo, girasol, cártamo, algodón y cacao.

33. El método de conformidad con la reivindicación 29, 30 ó 31, caracterizado porque el aceite de semilla contiene un nivel alterado de ácido caléndico o ácido dimorfecólico.

34. Un método para producir enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de una posición * tteJB?^li«i?iii»i4¡3tBtigí ^f-'4-----¿-- ..-..ni «..» *»-.». ,^i&iat?.A?t delta-9 de ácidos grasos, el método se caracteriza porque comprende : (a) transformar una célula huésped bacteriana con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 6; (b) cultivar la célula huésped bacteriana bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas que contengan niveles alterados de proteína codificada por el gen quimérico.

35. Un método para producir enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de una posición delta-9 de ácidos grasos, el método se caracteriza porque comprende : (a) transformar una célula huésped bacteriana con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 7; (b) cultivar la célula huésped bacteriana bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas que contengan niveles alterados de proteína codificada por el gen quimérico. iAA,A? uá k**.**? "-•'

36. Un método para producir enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la modificación de una posición delta-9 de ácidos grasos, el método se caracteriza porque comprende : 5 (a) transformar una célula huésped bacteriana con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 8; (b) cultivar la célula huésped bacteriana bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas 10 que contengan niveles alterados de proteína codificada por el gen quimérico.

37. El método de conformidad con la reivindicación 34, 35 ó 36, caracterizado porque la enzima de modificación 15 de ácido graso está asociada con la formación de ácido caléndico o ácido dimorfecólico.

38. El fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 47, 48 o la 20 reivindicación 49, caracterizado porque el programa de computadora se selecciona del grupo que consiste en: el método computacional BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [Herramienta de Búsqueda de Alineación de Secuencias Básica] el cual incluye BLASTN (nucleótido, ambas hebras) , BLASTX (nucleótido, traducción de seis marcos), BLASTP (proteína) , TBLASTN (proteína, de traducción de seis marcos) y TBLASTX (nucleótido, traducción de seis marcos) ; el programa Megalign del método de cómputo de bioinformática LASARGENE (DNASTAR) o el método Clustal de alineación de secuencias múltiples.

39. Un método para aislar fragmentos de ácido nucleico y subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la modificación de una posición delta-9 de ácidos grasos, el método se caracteriza porque comprende : (a) comparar SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13 y otras secuencias de polipéptidos de enzimas modificadoras de ácidos grasos vegetales; (b) identificar las secuencias conservadas de cuatro o más aminoácidos obtenidos en la etapa (a) ; (c) diseñar oligómeros degenerados con base en las secuencias conservadas identificadas en la etapa (b) ; y (d) usar los oligómeros degenerados de la etapa (c) para aislar secuencias que codifiquen para una enzima de jj¡&¡í.tt,?*~*- -ft*** M?a»t44ifeáte-»fc4-. ,....,. JU+ modificación de ácido graso vegetal o una porción de la misma asociada con la modificación de la posición delta-9 de ácidos grasos mediante protocolos dependientes de secuencia.

40. Un alimento para animales, caracterizado porque comprende un ingrediente derivado del procesamiento de cualquiera de las semillas de conformidad con las reivindicaciones 18, 19 ó 20.

41. Un alimento para animales, caracterizado porque comprende cualquiera las semillas de conformidad con las reivindicaciones 18, 19 ó 20.

42. Un alimento para animales, caracterizado porque comprende el aceite de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21, 22 ó 23.

43. Un método para mejorar la calidad del cadáver de un animal, caracterizado porque es mediante la complementación de una dieta del animal con el alimento de conformidad con la reivindicación 40. Jiá?m?J^i??A?m^t kM.^^^?t,»^^.^^ ^- ~ ¿^¿^¡¿^é & ^^ ..

44. Un método para mejorar la calidad del cadáver de un animal, caracterizado porque es mediante la complementación de una dieta del animal con el alimento de conformidad con la reivindicación 41.

45. Un método para mejorar la calidad del cadáver de un animal, caracterizado porque es mediante la complementación de una dieta del animal con el alimento de conformidad con la reivindicación 42.

46. El complemento del fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 47, 48 ó 49.

47. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, caracterizado porque la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo: (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es al menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NOs: 1, 3 ó 12 o un subfragmento funcionalmente equivalente de las mismas determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas .

48. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, caracterizado porque la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo codifica para una proteína que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NOs: 2, 4 ó 13.

49. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal, caracterizado porque la enzima modifica una posición delta-9 de ácidos grasos, en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo: (a) hibrida al fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es al menos 40% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas.

50. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12, caracterizado porque la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo : (a) hibrida a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 75% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en SEQ ID NO: 10 o un subíragmento funcionalmente equivalente de las mismas, determinado por un método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas.

51. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12, caracterizado porque la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo codifica para una proteína que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO: 11.

52. Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12, caracterizado porque la enzima modifica una posición delta-12 de ácidos grasos y además en donde el fragmento o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo: (a) hibrida al fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51 bajo condiciones de severidad moderada o (b) es por lo menos 75% idéntico a un polipéptido codificado por cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51 o un subfragmento funcionalmente equivalente de los mismos, determinado por un ¿¿¿¡¡^¡^^j^ ?Ad,<i4fc4fa t»tt , 11 rüiitftr n' If Ji-JÉ-" método de comparación diseñado para detectar secuencias homologas .

53. El fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 50, 51 ó 52, caracterizado porque el fragmento es aislado de Dimorphotheca sinuata .

54. El fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 50, 51 ó 52, caracterizado porque la enzima de modificación de ácido graso vegetal está asociada con la formación de ácido trans-linoleico.

55. Un gen quimérico caracterizado porque comprende el fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 50, 51 ó 52 o un subfragmento funcionalmente equivalente del mismo o un complemento del mismo unido operablemente a secuencias reguladoras adecuadas.

56. Una célula huésped o planta transformada, caracterizada porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 55. itii tfe *fcaa a ^^^^^^^ *g^^^^^

57. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en soya, especies Brassica de semillas oleaginosas, maíz, cacahuate, arroz, trigo, girasol, cártamo, algodón, palma, lino y cacao.

58. La célula huésped o planta de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste en células vegetales y microorganismos.

59. Semillas caracterizadas porque se obtienen de una planta transformada con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 55.

60. Aceite caracterizado porque se obtiene de las semillas de conformidad con la reivindicación 59.

61. Un método para alterar el nivel de ácidos grasos en una célula huésped o planta, en donde estos ácidos grasos comprenden un doble enlace trans delta-12, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula huésped o planta con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 55; (b) cultivar la célula huésped o planta transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped o plantas transformadas que tengan niveles alterados de ácidos grasos que comprendan un doble enlace trans delta-12.

62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la célula huésped o planta se selecciona del grupo que consiste en células vegetales y microorganismos .

63. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el nivel de ácido trans-linoleico es alterado.

64. Un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos que comprenden un doble enlace trans delta-12 en las semillas de plantas, el método se caracteriza porque comprende : t^t.A.. (a) transformar una célula vegetal con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 55; (b) cultivar una planta madura fértil de la célula vegetal transformada de la etapa (a) ; (c) analizar semillas de progenie de las plantas fértiles de la etapa (b) para niveles alterados de ácidos grasos que comprendan una posición delta-12 modificada; y (d) procesar la semilla de progenie de la etapa (c) para obtener un aceite de semilla que contenga niveles alterados de ácidos grasos vegetales que comprendan un doble enlace trans delta-12.

65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste en soya, especies Brassica de semillas oleaginosas, maíz, cacahuate, arroz, trigo, girasol, cártamo, algodón y cacao.

66. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el aceite de semilla contiene un nivel alterado de ácido trans-linoleico. j jytdiáiÉl! . AjUti ti- ii-í

67. Un método para producir enzimas de modificación de ácido graso asociadas con la formación de un doble enlace trans delta-12, el método se caracteriza porque comprende: (a) transformar una célula huésped microbiana con el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 55; (b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen quimérico; y (c) seleccionar las células huésped transformadas que contengan niveles alterados de proteínas codificadas por el gen quimérico.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la enzima de modificación de ácido graso está asociada con la formación de ácido trans-linoleico.

69. El fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, 52 ó 53, caracterizado porque el programa de computadora se selecciona del grupo que consiste en: el método computacional BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [Herramienta de Búsqueda de Alineación de Secuencias Básica] el cual incluye BLASTN (nucleótido, ambas hebras) , BLASTX (nucleótido, traducción de seis marcos), BLASTP (proteína), TBLASTN (proteína, de traducción de seis marcos) y TBLASTX (nucleótido, traducción de seis marcos) ; el programa Megalign del método de cómputo de bioinformática LAS.ARGENE (DNASTAR) o el método Clustal de alineación de secuencias múltiples.

70. Un método para aislar fragmentos de ácido nucleico y subfragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12, el método se caracteriza porque comprende : (a) comparar SEQ ID NO: 11 y otras secuencias de polipéptidos de enzimas modificadoras de ácidos grasos vegetales; (b) identificar las secuencias conservadas de cuatro o más aminoácidos obtenidos en la etapa (a) ; (c) diseñar oligómeros degenerados con base en las secuencias conservadas identificadas en la etapa (b) ; y (d) usar los oligómeros degenerados de la etapa (c) para aislar secuencias que codifiquen para una enzima de modificación de ácido graso vegetal o una porción de la misma asociada con la formación de un doble enlace trans delta-12 mediante protocolos dependientes de secuencia.