KR20030037232A - 곡물 가공 방법 및 이에 유용한 유전자이식 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전분 및 단백질의 추출가능성 및 회수를 증강시키기 위하여 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 사용하는, 옥수수 및 대두 같은 곡물의 신규한 가공 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 열안정성 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 발현하는 신규한 유전자이식 식물을 제공한다.

Description

곡물 가공 방법 및 이에 유용한 유전자이식 식물 {Grain processing method and transgenic plants useful therein}
본 발명은, 특히 옥수수 습식 제분 및 대두 가공 방법에서, 단백질 및 전분 회수를 증강시키기 위한 개선된 곡물 가공 방법 뿐만 아니라 상기 방법에 유용한 신규한 유전자이식 식물에 관한 것이다.
티오레독신(TRX) 및 티오레독신 리덕타제(TR)는 NADPH를 사용하여 단백질에서 이황화 결합을 환원시키는 효소이다. 단백질 이황화결합은 곡물 가공 효율 및 곡물 가공으로부터 회수된 생성물의 품질에 중요한 역할을 한다. 곡물에서 단백질 이황화 결합 정도를 제거하거나 감소시키는 효과적인 방법의 개발은 가공 효율을 증가시킬 것이다. 부가적으로, 가축 사육에서 곡물 및 곡물-유도된 생성물 성능은 또한 분자간 및 분자내 이황화결합에 의해 영향을 받는다. 곡물 소화성(digestibility), 영양 이용가능성 및 영양 저해 인자(예를 들면, 프로테아제, 아밀라제 억제제 등)의 중화는 이황화 결합의 정도를 감소시킴으로써 증가될 것이다[참조: 1999년 12월 15일자로 출원된 제WO 00/36126호].
옥수수 및 대두에서의 유전자이식된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현 및 곡물 가공, 예를 들면, 습식 제분에서 티오레독신의 사용은 신규하며, 산업적 가공 동안 또는 가공 이전에 곡물 단백질내 이황화 결합을 감소시키는또 다른 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 변형된 저장 단백질 품질을 갖는 곡물 뿐만 아니라 산업적 가공 또는 동물 소화 동안(이후 둘 모두는 "가공"으로 언급됨) 정상 곡물과 정성적으로 상이하게 수행되는 곡물을 제공한다.
티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제 전달의 상기 방법은 가공 동안 부가하기 위한 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 외인성 공급원을 개발할 필요성이 없게 한다. 곡물을 통해서 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 공급하는 두 번째 잇점은 가공 전에 또는 추가의 가공 단계로서 종자의 저장 또는 매트릭스 단백질을 효소와 접촉시키기 위하여 종자 무결성을 물리적으로 파괴할 필요가 없다는 것이다.
곡물 가공에서 티오레독신 용도의 세 가지 방식이 제공된다:
1. 수확된 곡물의 조성물 및 품질을 변화시키기 위하여 종자 발생 동안 발현 및 작용;
2. 가공시 생성물의 품질을 변화시키기 위하여 종자 발생 동안 발현(활성은 없음);
3. 가공 동안 부가함으로써 다른 곡물 생성물의 품질을 변화시키는데 사용되는 곡물 중 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 생산.
본원에 기술된 발명은 모든 곡물 수확물, 특히 옥수수, 대두, 밀 및 보리, 가장 바람직하게는 옥수수 및 대두, 특히 옥수수에 적용할 수 있다. 곡물에서 유전자이식된 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제의 발현은 곡물 가공을 하고자 하는물질(종자)의 품질을 변화시키고, 곡물 가공으로부터 유도된 물질의 품질을 변화시키고, 가공 동안 특정 종자 성분의 생산량을 최대화시키고(효율 증가), 가공 방법을 변화시키며, 제분 스트림으로부터의 종자-유도된 분획물 또는 성분들에 대한 새로운 용도를 창출하는 수단이 된다.
따라서, 본 발명은 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제, 예를 들면, 식물에서 천연적으로는 발현되지 않는 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제를 발현하는 식물, 예를 들면, 바람직하게는 유도성 프로모터, 예를 들면, 화학적으로-유도가능한 프로모터의 조절하에, 예를 들면, 유도가능한 프로모터에 작동적으로 연결되거나 트랜스활성화인자(transactivator)-조절된 프로모터의 조절하에, 핵 또는 색소체 DNA에 안정하게 통합된 티오레독신을 암호화하는 이종성 DNA 서열을 포함하는 식물을 제공하며, 이때, 상응하는 트랜스활성화인자는 유도가능한 프로모터의 조절하에 있거나 제2 식물에서 발현되어 상기 프로모터가 제2 식물과 하이브리드화되어 활성화되고, 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제가 바람직하게는 열안정성이거나 진핵생물 리덕타제이고, 상기 식물은 또한 임의로 처리(예를 들면, 프라이밍 또는 제피)되고/되거나 포장된, 예를 들면, 사용을 위한 지침서와 함께 백(bag)내에 넣은 이의 종자, 및 상기 기술된 바와 같은 제분 공정에서 사용하기 위한 식물로부터 회수된 이의 종자를 포함한다.
본 발명의 유전자이식 식물은 임의로 티오레독신 리덕타제 및/또는 NADPH의 증강된 생산을 위한 유전자들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로, 상기 기술된 바와 같은 티오레독신-발현 식물을 재배함을포함하는 티오레독신 생산 방법, 상기 기술된 바와 같은 식물로부터 수확된 종자로부터 전분 또는 단백질을 추출함을 포함하는 전분 및/또는 단백질의 생산 방법, 및 상기 기술된 바와 같은 티오레독신-발현 식물로부터의 종자를 침지시키고 이로부터 전분 및/또는 단백질을 추출함을 포함하는 습식 제분 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제, 바람직하게는 고온성 유기체, 예를 들면 시원세균군(archea), 예를 들면, 하기 기술되는 바와 같은 메타노코커스 자나스치이(Methanococcus jannaschii) 또는 아캐오글로버스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 유도된 티오레독신의 암호화 영역을 포함하는 식물 발현가능한 발현 카셋트[이때, 암호화 영역은 바람직하게는 식물 선호되는 코돈을 함유하도록 최적화되고, 식물에서 기능하는 프로모터 및 종결인자 서열에 작동적으로 연결되며; 이때, 프로모터는 바람직하게는 종자 특이적 프로모터 또는 유도가능한 프로모터, 예를 들면, 화학적으로 유도가능한 또는 트랜스활성화인자-조절된 프로모터이다], 예를 들면, 프로모터, 즉, 핵 트랜스활성화인자에 의해 조절되는 트랜스활성화인자-매개된 프로모터(예를 들면, 트랜스활성화인자가 이의 발현이 임의로 유도가능한 프로모터의 조절하에 있는 T7 RNA 폴리머라제인 경우 T7 프로모터)를 포함하는 색소체 또는 핵 발현가능한 발현 카셋트를 제공한다.
본 발명은 추가로, 상기 식물 발현가능한 발현 카셋트를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로, 상기 벡터로 형질전환시킨 식물, 또는 이의 게놈내에, 예를 들면, 이의 핵 또는 색소체 게놈내에 상기 식물 발현가능한 발현 카셋트를 포함하는 유전자이식된 식물을 제공한다.
본 발명은 또한, 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 결합되어 조절되는 트랜스활성화인자-매개된 프로모터를 포함하는 이종성 발현 카셋트를 포함하는, 바람직하게는 불임화되거나 웅성 불임화된 제1 식물을, 상기 트랜스활성화인자-매개된 프로모터를 조절할 수 있는 트랜스활성화인자를 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는 이종성 발현 카셋트를 포함하는 제2 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이렇게 수분된 식물로부터의 곡물을 회수함을 포함하는, 고수준의 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제를 포함하는 곡물을 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, 단자엽 식물, 바람직하게는 옥수수에서의 발현을 위해서 최적화된, 진핵생물 아라비돕시스 NADPH+의존성 티오레독신 리덕타제(NTR)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열이며, 바람직하게는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 암호화한다.
본 발명은 또한, 진핵생물성 쌀의 NADPH+의존성 티오레독신 리덕타제(NTR)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 암호화한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 목록의 간략한 설명
서열 번호 1은 메타노코커스 자나스치이(gil1591029)로부터의 티오레독신의 단백질 서열이다.
서열 번호 2는 아캐오글로버스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)(gil2649903)로부터의 티오레독신의 단백질 서열(trx-1)이다.
서열 번호 3은 아캐오글로버스 풀기두스(gil2649838)로부터의 티오레독신 단백질 서열(trx-2)이다.
서열 번호 4는 아캐오글로버스 풀기두스(gil2649295)로부터의 티오레독신 단백질 서열(trx-3)이다.
서열 번호 5는 아캐오글로버스 풀기두스(gil2648389)로부터의 티오레독신 단백질 서열(trx-4)이다.
서열 번호 6은 메타노코커스 자나스치이(gil1592167)로부터의 티오레독신 리덕타제의 단백질 서열(trxB)이다.
서열 번호 7은 아캐오글로버스 풀기두스(gil2649006)로부터의 티오레독신 리덕타제의 단백질 서열(trxB)이다.
서열 번호 8은 프라이머 NMD109이다.
서열 번호 9는 프라이머 NMD110이다.
서열 번호 10은 프라이머 NMD102이다.
서열 번호 11은 프라이머 NMD103이다.
서열 번호 12는 프라이머 NMD124A이다.
서열 번호 13은 프라이머 NMD125A이다.
서열 번호 14는 프라이머 NMD126이다.
서열 번호 15는 프라이머 NMD127이다.
서열 번호 16은 프라이머 NMD128이다.
서열 번호 17은 프라이머 NMD129이다.
서열 번호 18은 프라이머 STRF1A이다.
서열 번호 19는 프라이머 STRF1B이다.
서열 번호 20은 프라이머 STRF2A이다.
서열 번호 21은 프라이머 STRF2B이다.
서열 번호 22는 프라이머 STR3A이다.
서열 번호 23은 프라이머 STR3B이다.
서열 번호 24는 옥수수 최적화된 아라비돕시스 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제 암호화 서열이다.
서열 번호 25는 서열 번호 24에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 번호 26은 쌀 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제(NTR) 암호화 서열이다.
서열 번호 27은 서열 번호 26에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 번호 28은 프라이머 P9이다.
서열 번호 29는 프라이머 P10이다.
서열 번호 30은 프라이머 P4이다.
서열 번호 31은 프라이머 P1이다.
서열 번호 32는 프라이머 P2이다.
서열 번호 33은 프라이머 P5이다.
서열 번호 34는 프라이머 P12이다.
서열 번호 35는 프라이머 P11이다.
서열 번호 36은 프라이머 P27이다.
서열 번호 37은 프라이머 P28이다.
서열 번호 38은 프라이머 P29이다.
서열 번호 39는 프라이머 P26이다.
서열 번호 40은 프라이머 P31이다.
서열 번호 41은 프라이머 Thiorodoxubi 1603이다.
서열 번호 42는 프라이머 Thiorodox 2364이다.
"~와 연결된/작동적으로 결합된"은 물리적으로 및 기능적으로 관련된 두 개의 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 프로모터 또는 조절성 DNA 서열은 두개의 서열이 작동적으로 결합되거나, 조절성 DNA 서열이 암호화 또는 구조 DNA 서열의 발현 수준에 영향을 미치게 되는 상태인 경우, RNA 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 "연결된" 것으로 언급된다.
"키메라 유전자"는 프로모터 또는 조절성 핵산 서열이 mRNA를 암호화하거나 단백질로서 발현되는 핵산 서열과 작동적으로 결합되거나 이에 연결되어, 조절성핵산 서열이 연결된 핵산 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있는 재조합 핵산 서열이다. 키메라 유전자의 조절성 핵산 서열은 천연에서 발견되는 바와 같은 연결된 핵산 서열에 정상적으로는 작동적으로 결합되지 않는다.
"암호화 서열"은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA 같은 RNA로 전사되는 핵산 서열이다. 바람직하게는, RNA는 유기체내에서 해독되어 단백질을 생산한다.
"상보적인"은 역평행한 뉴클레오타이드 서열내에서 상보적인 염기 잔기 사이에서 수소 결합을 형성하는 경우 서로 염기쌍을 형성할 수 있는 역평행한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 두 개의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"DNA 셔플링(DNA shuffling)"은 DNA 분자내에서 신속하고, 용이하고 효과적으로 돌연변이 또는 재배열을, 바람직하게는 랜덤하게 도입하거나 두 개 이상의 DNA 분자 사이에서 DNA 서열의 교환을, 바람직하게는 랜덤하게 생성시키는 방법이다. DNA 셔플링으로부터 수득되는 DNA 분자는 하나 이상의 주형 DNA 분자로부터 유도된 비천연성 DNA 분자인 셔플링된 DNA 분자이다. 셔플링된 DNA 분자는 주형 DNA에 의해 암호화된 효소와 관련하여 변형된 효소를 암호화하며, 바람직하게는 주형 DNA에 의해 암호화된 효소와 관련하여 변형된 생물학적 활성을 갖는다.
"효소/단백질 활성"은 본원에서 기질의 생성물로의 전환을 촉매하는 효소(또는 단백질)의 능력을 의미한다. 효소에 대한 기질은 효소에 대한 천연 기질 뿐만 아니라 또한 천연 기질의 유사체를 포함하며, 이는 또한 효소에 의해 생성물 또는 생성물의 유사체로 전환될 수 있다. 효소 활성은 예를 들면, 특정 기간 후 반응물에서 생성물의 양을 결정함으로써, 또는 특정 기간 후 반응 혼합물에 잔류하는 기질의 양을 결정함으로써 측정된다. 효소 활성은 또한 특정 기간 후 반응 혼합물에 잔류하는 반응물의 비사용된 보조 인자의 양을 결정함으로써 또는 특정 기간 후 반응 혼합물에서 사용된 보조 인자의 양을 결정함으로써 측정된다. 효소 활성은 또한 특정 기간 후 반응 혼합물에 잔류하는 유리 에너지 공여체 또는 에너지 풍부 분자(예를 들면, ATP, 포스포에놀피루베이트, 아세틸 포스페이트 또는 포스포크레아틴)의 양을 결정함으로써 또는 특정 기간 후 반응 혼합물내 사용된 유리 에너지 공여체 또는 에너지 풍부 분자(예를 들면, ADP, 피루베이트, 아세테이트 또는 크레아틴)의 양을 결정함으로써 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "발현 카셋트"는 종결 시그날에 작동적으로 결합된 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하는, 적합한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 이는 또한, 전형적으로 뉴클레오타이드 서열의 적합한 해독에 필요한 서열을 포함한다. 암호화 영역은 일반적으로 관심 대상의 단백질을 암호화하지만, 또한 관심 대상의 기능성 RNA, 예를 들면, 안티센스 RNA 또는 센스 또는 안티센스 방향의 비해독 RNA를 암호화할 수 있다. 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카셋트는 키메라일 수 있으며, 즉 이의 성분 중 하나 이상이 이의 다른 성분 중 하나 이상과 관련하여 이종성임을 의미한다. 발현 카셋트는 또한 천연성지만, 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득되어진 것일 수 있다. 그러나, 전형적으로는, 발현 카셋트는 숙주에 대해서 이종성이며, 즉 발현 카셋트의 특정 DNA 서열이 숙주 세포에서 천연적으로 생성되지 않으며 형질전환 방법에 의해서 숙주 세포 또는 숙주 세포의 선조 세포내로 도입되어져야만 한다. 발현 카셋트내 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성성 프로모터, 또는 숙주 세포가 특정 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 곤충 같은 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관, 또는 발생 단계에 특이적일 수 있다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 절편을 의미하는데 널리 사용된다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 암호화 서열의 발현에 필요한 조절성 서열을 포함한다. 유전자는 또한, 예를 들면, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비발현되는 DNA 절편을 포함한다. 유전자는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있으며, 관심 대상 공급원으로부터 클로닝하거나 공지되거나 예견된 서열 정보로부터 합성하는 것을 포함하며, 바람직한 변수들을 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종성 DNA 서열", "이종성 DNA 절편" 또는 "이종성 핵산"은 각각 외래 공급원으로부터 특정 숙주 세포로 도입된 서열, 또는 동일한 공급원인 경우 이의 최초 형태로부터 변형된 서열을 의미한다. 따라서, 숙주 세포내 이종성 유전자는 특정 숙주 세포에 대해서 내인성이지만 예를 들면, DNA 셔플링의 사용을 통해서 변형된 유전자를 포함한다. 상기 용어들은 또한, 천연 DNA 서열의 비천연 다중 복사수를 포함한다. 따라서, 상기 용어들은 세포에 대해서 외인성 또는 이종성이거나, 세포에 대해서 상동성이지만 숙주 세포 핵산내에서 통상적으로 발견되지 않는 위치에 존재하는 DNA 절편이다. 외인성 DNA 절편은 발현되어 외인성 폴리펩타이드를 생성한다.
"상동성 DNA 서열"은 숙주 세포와 천연적으로 관련된 DNA 서열을 의미한다.
"상동 색소체성"은 모든 색소체가 유전적으로 동일한 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 의미한다. 이는 색소체가 형질전환, 돌연변이 또는 그밖에 유전적으로 변화되지 않은 식물에서의 정상 상태이다. 상이한 조직 또는 발생 단계에서, 색소체는 상이한 형태, 예를 들면, 엽록체, 전색소체, 에티오플라스트, 전분체, 유색체 등의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 내용에서 "분리된" DNA 분자 또는 "분리된" 효소는 인위적으로, 이의 천연 환경으로부터 분리되어 존재하는 DNA 분자 또는 단백질을 의미하며, 따라서 천연 생성물이 아니다. 분리된 DNA 분자 또는 단백질은 정제된 형태로 존재할 수 있거나 예를 들면, 유전자이식된 숙주 세포내에서와 같이 비천연 환경내에 존재할 수 있다.
"성숙 단백질"은 세포 소기관내로 정상적으로 표적화되며 이로부터 통과 펩타이드(transit peptide)가 제거된 단백질이다.
"최소 프로모터"는 불활성이거나 상류 활성화 부재로 프로모터 활성이 거의 감소된 프로모터 요소, 특히 TATA 요소이다. 적합한 전사 인자의 존재하에서, 최소 프로모터는 전사를 허용하도록 기능한다.
"변형된 효소 활성"은 천연 효소 활성을 억제하는 억제제에 내성이 있는 곤충에서 천연 생성되는 효소 활성(즉, 인위적으로 상기 활성의 직접적인 또는 간접적인 조작의 부재하에서 천연 생성되는 효소 활성)과 상이한 효소 활성이다.
"천연"은 비형질전환된 곤충 세포의 게놈에 존재하는 유전자를 의미한다.
용어 "천연 생성되는"이란 사람에 의해 인공적으로 생성되는 것과는 상이하게, 천연에서 발견될 수 있는 대상물을 기술하는데 사용된다. 예를 들면, 천연 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체(바이러스 포함)내에 존재하는 단백질 또는 뉴클레오타이드 서열이 천연 생성된 것이다.
용어 "핵산"은 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 의미한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 그밖에 특별히 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명백하게 지시된 서열 뿐만 아니라 또한 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)]. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 또한 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"식물"은 모든 발생 단계의 식물, 특히 종자 식물이다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태, 또는 예를 들면, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물 같은 보다 고도로 조직화된 단위의 일부일 수 있다.
"식물 세포 배양물"은 예를 들면, 원형질체, 세포 배양 세포, 식물 조직 중 세포, 화분, 화분관, 배주, 배낭, 접합체 및 다양한 발생 단계의 배(embryo) 같은 식물 단위의 배양물을 의미한다.
"식물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꽃 부분, 과실, 화분, 난세포, 접합체, 종자, 절단물, 세포 또는 조직 배양물, 및 식물의 모든 다른 부분 또는 생성물을 의미한다.
"식물 기관"은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃눈, 또는 배 같은 식물의 독특하고 가시적으로 구조화되고 분화된 부분이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "식물 조직"은 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 의미한다. 식물 및 배양물 중 식물의 모든 조직이 포함된다. 상기 용어는 전체 식물, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양물 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 모든 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 목록화된 바와 같고 상기 정의에 의해 그밖에 포함되는 바와 같이 식물 조직의 모든 측정 형태와 관련하여 또는 이의 부재하에서 상기 용어의 사용은 식물 조직의 임의의 다른 유형의 배제를 의미하는 것은 아니다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제 II의 결합 부위를 함유하고 DNA의 전사를 개시하는 암호화 영역 상류의 비해독 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 영역은 또한 유전자 발현의 조절인자로서 작용하는 다른 요소들을 포함할 수 있다.
"원형질체"는 세포벽을 갖지 않거나 세포벽의 일부만을 갖는 분리된 식물 세포이다.
핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합되는 다른 세포 성분들로부터 본질적으로 유리되는 것을 의미한다. 이는 무수 상태로 또는 수용액 중에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 균질한 상태로 존재한다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피 같은 분석학적 화학 기술을 사용하여 결정된다. 제제 중에 존재하는 우세종인 단백질이 실질적으로 정제된다. 용어 "정제된"이란 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 형성함을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 85%이상, 및 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수한 것을 의미한다.
"조절 요소"는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는데 관여하는 서열을 의미한다. 조절 요소는 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열 및 종결 시그날에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함한다. 이들은 또한 전형적으로 뉴클레오타이드 서열의 적합한 해독에 필요한 서열을 포함한다.
"유의한 증가"는 측정 기술에서 본질적인 오차 한계 이상으로 큰 효소 활성의 증가, 바람직하게는 억제제의 존재하에서 야생형 효소 활성의 약 2배 이상의 증가, 보다 바람직하게는 약 5배 이상의 증가, 및 가장 바람직하게는 약 10배 이상의 증가를 의미한다.
두 개 이상의 핵산 또는 단백질 서열의 관계에서 용어 "동일한" 또는 "동일성(%)"은 하기 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하여 측정하거나 가시적인 조사로 측정하는 바와 같이, 최대 상응성에 대해서 비교하고 배열하는 경우, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 특정 백분율을 갖는 두 개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다.
두 개의 핵산 또는 단백질 서열의 관계에서 구 "실질적으로 동일한"은 하기 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하여 측정하거나 가시적인 조사로 측정하는 바와 같이, 최대 상응성에 대해서 비교하고 배열하는 경우, 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90 내지 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 두 개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다. 바람직하게는, 실질적인 동일성은 약 50개 이상의 길이, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 길이, 및 가장 바람직하게는 서열이 약 150개 이상의 잔기에 대해서 실질적으로 동일한, 서열 영역에 대해서 존재한다. 가장 바람직한 구체적인 양태에서, 서열은 암호화 영역의 전체 길이에 대해서 실질적으로 동일하다. 추가로, 실질적으로 동일한 핵산 또는 단백질 서열은 실질적으로 동일한 기능을 수행한다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교하는 참조 서열로서 사용된다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 서브서열 배위를 디자인하고 서열 알고리듬 프로그램 변수들을 디자인한다. 이후, 서열 비교 알고리듬은 디자인된 프로그램 변수들에 기초하여, 참조 서열과 관련하여 시험 서열(들)에 대해 서열 동일성(%)을 산출한다.
비교를 위한 서열의 최적 배열은 예를 들면, 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국소 상동성 알고리듬에 의해서, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]의 상동성 배열 알고리듬에 의해서, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 조사 방법에 의해서, 이러한 알고리듬[GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 컴퓨터화된 수행에 의해서, 또는 가시적 조사[일반적으로 참조: Ausubel et al., 하기]에 의해서 수행할 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 측정하는데 적합한 알고리듬의 한 가지 예는 BLAST 알고리듬이며, 이는 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]에 기술되어져 있다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI[the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]를 통해서 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리듬은 우선, 데이터베이스 서열 중 동일한 길이의 단어와 배열시키는 경우, 특정 포지티브-값의 역치 득점 T와 일치하거나 이를 만족시키는, 조회 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고 득점화 서열쌍(HSP)을 확인하는 것과 관련된다.T는 이웃 단어 득점 역치로서 참조된다[Altschul et al., 1990]. 이러한 초기 이웃 단어 적중은 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 찾고자 하는 조사를 개시하기 위한 근원으로서 작용한다. 이후, 단어 적중은 누적 배열 득점이 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라서 양 방향으로 신장된다. 누적 득점은 뉴클레오타이드 서열에 대해서는 변수 M(일치하는 잔기쌍에 대한 보상 득점: 항상 > 0)과 N(불일치하는 잔기에 대한 페널티 득점; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 득점을 계산한다. 각각의 방향에서 단어 적중의 신장은 누적 배열 득점이 이의 최대 달성된 값으로부터 정량 X 만큼 떨어지는 경우, 하나 이상의 네가티브-득점 잔기 배열의 누적으로 인해 0 또는 그 이하로 도달하는 경우, 또는 각각의 서열의 말단에 도달하는 경우에 중지된다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 배열의 감수성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열을 위한)을 디폴트로서 단어길이(W) 11, 기대값(E) 10, 100의 컷오프, M=5, N=4, 및 양쪽 쇄 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해서, BLASTP 프로그램을 디폴트로서 단어길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 득점 매트릭스[참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)]를 사용한다.
서열 동일성(%)를 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리듬은 또한 두 개의 서열 간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다[참조: 예를 들면, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)]. BLAST 알고리듬에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 측정법은 최소 합계 가능성(P(N))이며, 이는 두 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생하게 되는 가능성의 지표를 제공한다. 예를 들면, 참조 핵산 서열에 대한 시험 핵산 서열의 비교에서 최소 합계 가능성이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 시험 핵산 서열은 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
두 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 두 개의 분자가 서로 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 것이다. '~에 특이적으로 하이브리드화하는'이라는 구는 서열이 복합 혼합물(예를 들면, 전체 세포성) DNA 또는 RNA 중에 존재하는 경우 엄격한 조건하에서 특정 뉴클레오타이드 서열에 대해서만 분자가 결합, 이본쇄화 또는 하이브리드화하는 것을 의미한다. '실질적으로 결합한다'는 프로브 핵산과 표적 핵산 사이의 상보성 하이브리드화를 의미하며 표적 핵산 서열의 바람직한 검출을 달성하기 위해 하이브리드화 매질의 엄격성을 감소시킴으로써 조절될 수 있는 최소 불일치를 포함한다.
서던 및 노던 하이브리드화 같은 핵산 하이브리드화 실험의 내용에서 '엄격한 하이브리드화 조건' 및 '엄격한 하이브리드화 세척 조건'은 서열 의존성이며, 상이한 환경적 변수에 따라 상이하다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산 하이브리드화에 대한 상세한 설명은 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of pinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"Elsevier, New York]에서 확인된다. 일반적으로, 높은 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건은 정의된 이온 농도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열성 융점(Tm) 보다 약 5℃ 미만으로 선택된다. 전형적으로, '엄격한 조건'하에서, 프로브는 이의 표적 서브 서열에만 하이브리드화되며, 다른 기타 서열에는 하이브리드화되지 않는다.
Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치된 프로브에 하이브리드화되는 온도(정의된 이온 농도 및 pH하에서)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하게 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에서 100개 이상의 상보적인 잔기를 갖는 상보적인 핵산의 하이브리드화를 위한 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 42℃에서 헤파린 1㎎을 갖는 50% 포름아미드이며, 상기 하이브리드화는 밤새 수행된다. 높은 엄격한 세척 조건의 예는 약 15분 동안 72℃에서 0.15M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 15분 동안 65℃에서 0.2 x SSC 세척이다[참조: Sambrook, 이하, SSC 완충액에 대한 기술]. 종종, 높은 엄격한 세척은 백그라운드 프로브 신호를 제거하기 위해서 낮은 엄격한 세척을 먼저 수행하게 된다. 예를 들면, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 이본쇄에 대한 중간 정도의 엄격한 세척의 예는 15분 동안 45℃에서 1 x SSC이다. 예를 들면, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 이본쇄에 대한 낮은 엄격한 세척의 예는 15분 동안 40℃에서 4 내지 6 x SSC이다. 짧은 프로브(예를 들면, 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드)에 있어서, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 미만의 Na 이온의 염 농도, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도(또는 다른 염)이며, 온도는 전형적으로 약 30℃ 이상이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드 같은 불안정화제의 부가로 달성될 수 있다. 일반적으로, 특정 하이브리드화 분석법에서 관련이 없는 프로브에 대해 관찰된 것 보다 2x(또는 그 이상)의 시그날 대 노이즈 비율은 특이적인 하이브리드화의 검출을 나타낸다. 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화되지 않은 핵산들도, 이들이 암호화하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우 또한 실질적으로 동일하다. 이는, 예를 들면, 핵산의 복사체가 유전자 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 제조되는 경우 일어난다.
하기는 본 발명의 참조 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 상동성 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하기 위하여 사용될 수 있는 하이브리드화/세척 조건의 세트의 예이다: 참조 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 2 X SSC, 0.1% SDS로 세척시켜, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서 1 X SSC, 0.1% SDS로 세척시켜, 보다 더 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서 0.5 X SSC, 0.1% SDS로 세척시켜, 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS로 세척시켜, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA에서 65℃에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS로 세척시켜, 참조 뉴클레오타이드에 하이브리드화시킨다.
두 개의 핵산 서열 또는 단백질이 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는 제1 핵산에 의해 암호화된 단백질이 제2 핵산에 의해 암호화된 단백질과 면역학적으로 교차반응하거나 이에 특이적으로 결합하는 것이다. 따라서, 단백질은, 예를 들면, 두 개의 단백질이 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 전형적으로 제2 단백질에 실질적으로 동일하다.
'특이적으로(또는 선택적으로) 항체에 결합한다' 또는 '특이적으로(또는 선택적으로) ~와 면역반응성이다'라는 구는 단백질 또는 펩타이드에 대해 인용되는 경우, 단백질 및 다른 생물학적 물질(biologics)의 이종성 집단의 존재하에서 상기 단백질의 존재에 대한 결정 요인인 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지시된 면역분석법 조건하에서, 특정 항체는 특정 단백질에 결합하며 샘플중에 존재하는 다른 단백질에는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 상기 조건하에서 항체에 대한 특정 결합은 특정 단백질에 대한 이의 특이성에 대해 선택된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열 중 하나에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해 생성된 항체는 상기 단백질과 특이적으로 면역반응하며 다형성 변이체를 제외한 다른 단백질과는 면역반응을 하지 않는 항체를 수득하기 위해서 선택될 수 있다. 다양한 면역검정법 형태들을 사용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택할 수 있다. 예를 들면, 고체-상 ELISA 면역검정법, 웨스턴 블롯, 또는 면역조직화학을 통상적으로 사용하여 단백질과 특이적으로 면역반응하는 모노클로날 항체를 선택한다. 특정 면역반응성을 측정하는데 사용할 수 있는 면역검정법 및 조건에 대한 기술에 대해서는 문헌[Harlow and Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lane"]을 참조한다. 전형적으로 특정 또는 선택성 반응은 백그라운드 시그날 또는 노이즈보다 2배 이상일 것이며, 보다 전형적으로는 백그라운드의 10 내지 100배 이상이다.
특정 핵산 서열에 대한 '보존적으로 변형된 변이'는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열, 또는 핵산 서열이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 수 많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들면, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 암호화된 단백질을 변형시키지 않고도 기술된 상응하는 코돈 중 하나로 변형될 수 있다. 상기 핵산 변이는 '보존적으로 변형된 변이'의 한 가지 종인 '침묵 변이(silent variation)'이다. 단백질을 암호화하는 본원에 기술된 모든 핵산 서열은 또한 모든 가능한 침묵 변이를 기술하며, 단 특별히 지시되는 경우에는 예외적이다. 숙련자는 핵산에서 각각의 코돈(ATG 제외, 이는 통상 메티오닌에 대한 유일한 코돈이다)이 변형되어 표준 기술에 의해 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 단백질을 암호화하는 핵산의 각각의 '침묵 변이'는 각각의 기술된 서열내에 내포된다.
추가로, 숙련자는 암호화된 서열 중에서 하나의 아미노산 또는 아미노산의 작은 비율(전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로는 1% 미만)을 변형, 부가 또는 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 '보존적으로 변형된 변이'이며 상기 변형은 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산을 치환시킨다는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적인 치환 표는 당해 분야에 공지되어져 있다. 하기 5개 그룹 각각은 서로에 대해서 보존적인 치환인 아미노산을 함유한다: 지방족: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루이신(L), 이소루이신(I); 방향족: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황-함유: 메티오닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 라이신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q). 또한, 문헌을 참조한다[Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]. 또한, 암호화된 서열 중의 단일 아미노산 또는 아미노산의 작은 비율을 변형, 부가 또는 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 부가는 또한 '보존적으로 변형된 변이'이다.
'서브 서열'은 각각, 보다 긴 핵산 또는 아미노산(예를 들면, 단백질)의 일부를 포함하는 핵산 또는 아미노산의 서열을 의미한다.
핵산은 부가적인 뉴클레오타이드(또는 다른 유사한 분자)가 핵산내로 도입되는 경우 '신장'된다. 가장 흔히, 이는 폴리머라제(예를 들면, DNA 폴리머라제), 예를 들면, 핵산의 3' 말단에 서열을 부가하는 폴리머라제를 사용하여 수행된다.
두 개의 핵산 각각으로부터의 서열이 자손 핵산에서 혼합되는 경우, 두 개의 핵산은 '재조합'된다. 핵산 둘 모두가 재조합을 위한 기질인 경우, 두 개의 서열은 '직접적으로' 재조합된다. 서열들이 교차 올리고뉴클레오타이드 같은 중간체를 사용하여 재조합되는 경우, 두 개의 서열은 '간접적으로 재조합'된다. 간접적인재조합을 위해서, 서열 중 단지 하나만이 재조합을 위한 실질적인 기질이며, 특정의 경우에, 서열 중 어느 하나도 재조합을 위한 기질이 되지 않는다.
"합성적인"은 천연 서열에서 존재하지 않는 구조적 특성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들면, 쌍자엽 및/또는 단자엽 유전자의 보다 밀접한 G+C 함량 및 정상 코돈 분포를 닮은 인공 서열은 합성된 것으로 언급된다.
"트랜스활성화인자"는 상응하는 트랜스활성화인자-매개된 프로모터의 조절하에서 암호화 영역의 전사를 야기할 수 있는 단백질 그 자체, 또는 하나 이상의 부가적인 단백질과 혼용되는 단백질이다. 트랜스활성화인자 시스템의 예는 파아지 T7 유전자 10 프로모터를 포함하며, 이의 전사 활성화는 파아지 T7 RNA 폴리머라제 같은 특정 RNA 폴리머라제에 따른다. 트랜스활성화인자는, 프로모터를 직접적으로 활성화시키거나, 예를 들면 레프레서 단백질의 발현 또는 축적을 억제시켜 레프레서 유전자를 불활성화시킴으로써, 전형적으로 특정 프로모터와 상호작용하여 전사를 개시시킬 수 있는 RNA 폴리머라제 또는 DNA 결합 단백질이다. DNA 결합 단백질은 적합한 전사 활성화인자 도메인에 결합된 결합 영역(예를 들면, GAL4 결합 영역)을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다. 특정 트랜스활성화인자 시스템은 다중 트랜스활성화인자, 예를 들면, 폴리머라제 뿐만 아니라 프로모터 인식, DNA 결합 또는 전사 활성화를 위한 특정 서브유니트(시그마 인자)를 필요로 하는 프로모터를 가질 수 있다. 트랜스활성화인자는 바람직하게는 식물에 대하여 이종성이다.
"형질전환"은 이종성 DNA를 세포, 조직 또는 곤충내로 도입하는 방법이다.
형질전환된 세포, 조직 또는 곤충은 형질전환 과정의 최종 생성물 뿐만 아니라 이의 형질전환된 자손을 포함하는 것으로 이해된다.
"형질전환된(transformed)", "유전자이식된(transgenic)" 및 "재조합"은 이종성 핵산 분자가 도입되어진 세균 또는 식물 같은 숙주 유기체를 의미한다. 핵산 분자는 숙주 게놈내에 안정하게 통합되거나 핵산 분자는 또한 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 상기 염색체외 분자는 자가 복제될 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 생성물 뿐만 아니라 이의 유전자이식된 자손을 포함하는 것으로 이해된다. "비형질전환된(non-transformed)", "비유전자이식된(non-transgenic)" 및 "비재조합(non-recombinant)" 숙주는 야생형 유기체, 예를 들면, 이종성 핵산 분자를 함유하지 않는 세균 및 식물을 의미한다. 뉴클레오타이드는 하기 표준 약어에 의해서 이의 염기로 표시된다: 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 및 구아닌(G). 아미노산은 하기 표준 약어에 의해서 마찬가지로 표시된다: 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파르트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소루이신(Ile; I), 루이신(Leu; L), 라이신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 및 발린(Val; V). 추가로, (Xaa, X)는 모든 아미노산을 나타낸다.
습식 제분
습식 제분은 곡물, 가장 흔히 시리얼, 예를 들면, 옥수수의 전분, 단백질 및오일 성분들을 분리하는 방법이다. 이는 본원에서 곡물을 단순히 분쇄시키는 건식 제분과는 구분된다. 옥수수 습식 제분은 낟알을 침지시키고, 분쇄시키고 낟알의 성분들을 분리시키는 단계들을 포함한다. 습식 제분에서 제1 단계는 일반적으로 침지 단계이며, 이때, 곡물을 낟알을 연화시키고 성분들의 분리를 촉진시키는 조심스럽게 조절된 조건하에서 물에 침지시킨다. 낟알은 전형적으로 약 0.2 중량%의 농도로 이산화황을 함유하는 약 120℉의 온도에서 물의 역류를 사용하는 침지 탱크에서 침지된다. 낟알은 약 24 내지 48시간 동안 침지 탱크내에 유지시킨다. 이후, 낟알을 탈수시키고 마멸형 제분기 세트에 적용시킨다. 마멸형 제분기 제1 세트는 낟알을 파열시켜 배아를 방출시키고 낟알의 나머지 부분으로부터 옥수수 오일을 방출시킨다. 원심분리를 사용하여 낟알의 나머지 부분으로부터 배아를 분리한다. 오일 함유 배아가 수용액 표면에 부유하며 이를 제거한다.
다음으로, 급수 및 탈수, 제분, 스크리닝, 원심분리 및 세척의 방법에 의해서, 전분을 단백질로부터 분리하고 정제한다. 배아를 제거한 후, 전분, 껍질, 섬유 및 글루텐을 포함하는 잔류하는 낟알 성분을 제2 마멸 제분기에 적용하고 일련의 세척 스크리닝을 통해 전분 및 글루텐으로부터 섬유 성분을 분리시킨다. 전분 및 글루텐은 스크린을 통해 통과하지만 섬유는 통과하지 못한다. 원심분리 또는 원심분리 후 제3 제분을 사용하여 단백질로부터 전분을 분리시킨다. 원심분리로 전분 과립을 함유하는 슬러리를 생성시키고, 이를 탈수하고, 신선한 물로 세척한 후 약 12% 습도로 건조시킨다. 그 결과, 이러한 방식으로 옥수수 낟알로부터의 실질적으로 순수한 전분 분획물을 회수한다. 주요한 난점은 곡물의 배유를 구성하는단백질의 복잡한 매트릭스 및 세포벽 물질로부터 전분 과립이 느슨하게 하는 것이다. 이러한 난점의 한 가지 이유는 분자내 또는 분자간 이황화 결합의 존재로 인한 것으로 생각되며, 이러한 이황화 결합은 단백질 매트릭스를 보다 덜 가용성이 되게 하고 단백질가수분해 효소에 대해서 보다 덜 민감하게 하여, 곡물내 단백질 매트릭스로부터 전분 과립의 방출을 억제시킨다. 현재, 이러한 결합을 감소시키는 주요 방법은 이산화황의 존재하에서 상기 곡물을 침지시키는 것이지만, 이러한 방법은 비용이 많이 들고 환경 친화적이지 않으며, 최적으로 효과적이지 않다. 침지수가 이산화황을 함유하기 때문에, 이는 독성 폐기물로서 고려되며, 따라서 생성되는 용적을 최소화시키는 것이 유리하다. 대안으로, 이산화황에 대한 필요성을 제거시키는 것이다. 제분에 앞서 곡물 컨디셔닝에 필요한 침지 시간을 감소시키는 것이 배유 매트릭스내 이황화 결합의 정도를 감소시키는데 부가적으로 유리하다. 특정 돌연변이가 옥수수 낟알 배유의 단백질 매트릭스(분말성 및 불투명한) 상에 유리한 효과를 나타내지만, 낟알 무결성을 손상시키지는 않는다. 유전자이식된 티오레독신 발현은 이러한 돌연변이와 관련된 낟알 무결성 문제 중 일부를 야기하지 않으면서 상기 장점들 중 일부를 제공한다.
티오레독신의 수확 후 또는 가공-의존성 활성은 마찬가지로 유리한 효과를 갖는다. 예를 들면, 한 가지 구체적인 양태에서, 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제 효소는 세포 구획내로 표적화되어 축적된다. 단백질 감소는 종자의 물리적인 파괴를 야기한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 휴지기 배유 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제는 침지시 활성화된다. 바람직한 구체적인 양태에서, 본발명은 유전자이식된 열안정성 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제, 예를 들면, 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제가 고온(예를 들면, 50℃ 이상)을 제외하고는 현저하게 활성화되지 않는 고온성 유기체로부터 유도된 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제를 발현하는 식물을 제공한다. 한 가지 구체적인 양태에서, 열안정성 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제는 배유내 다른 열안정성 효소의 발현을 통해서 당화와 함께 상승작용한다.
사료 적용
곡물에서 유전자이식된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현은 또한 소화성, 특히 동물 사료에서 소화성과 관련된 곡물 특성들을 개선시키는데 유용하다. 프로테아제에 대한 사료 단백질의 감수성은 시간 및 단백질 구조의 함수이다. 낟알 분해 증류(cracking)는 종종 스팀 플레이킹(steam flaking)과 마찬가지로 사료 제형에서 사용된다. 이들 방법 모두는 낟알 소화성을 보조하기 위해서 디자인된다. 동물 위에서 낟알의 무결성이 보다 용이하게 파괴될 수 있는 보다 부드러운 낟알이 바람직하다. 단백질 간의 구조적 제약 및 교차 결합이 프로테아제 감수성의 주요 결정인자이다. 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제 발현을 증가시킴으로써 이러한 결합을 변형시키는 것은 소화에 도움을 준다.
옥수수 건식 제분/마사(masa)
단백질 함량 및 품질은 플레이킹 그릿 생산 및 마사 생산에서 중요한 결정인자이다. 이황화 결합의 감소는 옥수수 분말, 특히 고단백질 백색 옥수수 변종들로부터 제조된 분말의 특성을 변화시켜 밀 대용물로서 사용하기에 적합하게 한다.
대두 분쇄
미국 대두 농작물의 1/2 이상이 분쇄되거나 제분되며, 수득되는 저지방 대두분 또는 탈지 대두분(또는 대두 가루)에서 단백질 품질은 후속적인 가공에서 중요하다. 대두 가공 스트림으로부터의 단백질 생산량 및 품질은 경제적으로 중요하며, 주로 단백질 구조에 따른다. 유전자이식된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현을 통하여 티오레독신 활성을 증가시키는 것은 단백질 용해도를 증가시키며, 따라서, 수용성 단백질 분획물의 생산량을 증가시킨다. 회수는 염기성 조건하에서 탈지 대두 가루의 수성 추출을 통해서 촉진된다. 유전자이식된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현을 통해 티오레독신 활성을 증강시키는 것은 또한 효과적인 추출을 위해 요구되는 pH를 감소시키며 따라서 수산화칼슘 또는 수산화나트륨 투입량을 감소시킬 뿐만 아니라, 후속적인 산 침전을 위한 산 투입량을 감소시켜, 알칼리 손상 없이 단백질의 효과적인 회수를 가능하게 하며, 물 소비 및 가공 플랜트 폐기물 유출물(이는 상당한 생물학적 산소요구량 부담량을 함유한다)을 감소시킨다. 단백질 레독스 상태는 용해도, 물 소비, 점도, 부착/점착, 겔화 및 탄성도 같은 대두 단백질에 의해 공급되는 중요한 기능 특성들에 영향을 미친다. 대두 단백질 농축물 생산 동안의 섬유 제거 및 프로테아제에 의한 대두 단백질 분리물 가수분해는 본원에서 기술된 바와 같은 티오레독신 활성을 증가시킴으로서 증강된다. 유사하게, 상기 옥수수에 대해서 기술된 바와 같이, 형질전환된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현을 통한 티오레독신 활성 증가는 동물 사료에서 효소-활성화 대두분의 기능성 및 대두 가루 분획물 및 스팀 플레이킹 분획물의 소화성을 증강시킨다. 종자 발생 동안 및 가공 동안 단백질 품질의 변형이 모두 제공되지만, 형질전환된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제가 상기 기술된 바와 같이 세포 구획으로 표적화되고 열안정성이 되어, 종자 발생 동안 티오레독신 활성의 결과로서 직면하게 될 수 있는 저장 단백질 축적에 대한 상당한 역효과를 회피하는 것이 바람직하다. 대안으로, 곡물 무결성이 파괴될 때(분쇄 또는 오일 추출)까지는 이황화 결합을 파괴시킬 필요가 없기 때문에(옥수수 습식 제분과는 달리), 티오레독신은 가공 효소로서 부가될 수 있다.
이종성 발현을 위한 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제의 선택
티오레독신, 티오레독신 리덕타제 및 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI) 유전자는 식물, 진정 세균을 포함하는 진핵생물 뿐만 아니라 메타노코커스 자나스치이 및 아캐오글로버스 풀기두스 같은 고온성 유기체를 포함하는 원시 세균에서 확인된다. 특정 유전자의 선택은 목적하는 용도에 따라 부분적으로 결정된다. 본 발명의 목적을 위해서, 바람직한 티오레독신은 하기 특성을 갖는다:
1. 열 안정성 - 고온성 세균으로부터의 티오레독신 및 관련된 단백질들은 고온(> 50℃)에서 증가된 안정성 및 주위 온도에서 상대적으로 낮은 활성을 갖는 것으로 확인된다. 고온성 세균으로부터, 예를 들면, 메타노코커스 자나스치이 및 아캐오글로버스 풀기두스 같은 원시 세균 또는 다른 고온성 세균으로부터의 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현은 종자 발생 동안의 발현에 바람직하며, 결과적으로 티오레독신 활성은 곡물이 승온에서 침지되거나 가공될 때까지는 현저하게 증가되지 않는다. 대부분의 곡물 가공 방법은 고온 단계와 관련되거나 이에 적합하다. 따라서, 열안정성 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제가 바람직하다. "열안정한"이란 효소가 고온, 예를 들면, 40℃ 이상의 온도, 가장 바람직하게는 50℃ 이상의 온도, 예를 들면, 습식 제분의 경우 45 내지 60℃, 또는 보다 더 높은 온도, 예를 들면, 45 내지 95℃에서 우선적으로 활성인 것을 의미한다.
2. 기질 특이성 - 매트릭스내 구조 단백질 같은 특정 단백질 상에 우선적으로 작용하고 필수 대사 효소와는 낮은 활성을 갖는 티오레독신을 선택함으로써, 종자 발생 동안 바람직하지 않은 효과를 감소시키는 것이 또한 가능하다. 다양한 티오레독신이 레독스 조절하에서 존재하는 효소들과의 반응성에서 상이한 것으로 나타난다. 따라서, 과발현의 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서, 목적하는 표적 상에서 주로 작용하게 될 티오레독신을 선택하는 것이 가능하다.
적합한 열안정성 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제는 다음을 포함한다:
ㆍ 메타노코커스 자나스치이로부터의 티오레독신의 아미노산 서열 (gil1591029)
MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL (서열 번호 1);
ㆍ 아캐오글로버스 풀기두스로부터의 티오레독신의 아미노산 서열(gil2649903)(trx-1)
MPMVRKAAFYAIAVISGVLAAVVGNALYHNFNSDLGAQAKIYFFYSDSCPHCREVKPYVEEFAKTHNLTWCNVAEMDANCSKIAQEFGIKYVPTLVIMDEEAHVFVGSDEVRTAIEGMK (서열 번호 2);
ㆍ 아캐오글로버스 풀기두스로부터의 티오레독신의 아미노산 서열 (gil2649838)(trx-2)
MVFTSKYCPYCRAFEKVVERLMGELNGTVEFEVVDVDEKRELAEKYEVLMLPTLVLADGDEVLGGFMGFADYKTAREAILEQISAFLKPDYKN (서열 번호 3);
ㆍ 아캐오글로버스 풀기두스로부터의 티오레독신의 아미노산 서열 (gil2649295)(trx-3)
MDELELIRQKKLKEMMQKMSGEEKARKVLDSPVKLNSSNFDETLKNNENVVVDFWAEWCMPCKMIAPVIEELAKEYAGKVVFGKLNTDENPTIAARYGISAIPTLIFFKKGKPVDQLVGAMPKSELKRWVQRNL (서열 번호 4);
ㆍ 아캐오글로버스 풀기두스로부터의 티오레독신의 아미노산 서열 (gil2648389)(trx-4)
MERLNSERFREVIQSDKLVVVDFYADWCMPCRYISPILEKLSKEYNGEVEFYKLNVDENQDVAFEYGIASIPTVLFFRNGKVVGGFIGAMPESAVRAEIEKALGA (서열 번호 5);
ㆍ 메타노코커스 자나스치이로부터의 티오레독신 리덕타제(trxB)의 아미노산 서열 (gil1592167)
MIHDTIIIGAGPGGLTAGIYAMRGKLNALCIEKENAGGRIAEAGIVENYPGFEEIRGYELAEKFKNHAEKFKLPIIYDEVIKIETKERPFKVITKNSEYLTKTIVIATGTKPKKLGLNEDKFIGRGISYCTMCDAFFYLNKEVIVIGRDTPAIMSAINLKDIAKKVIVITDKSELKAAESIMLDKLKEANNVEIIYNAKPLEIVGEERAEGVKISVNGKEEIIKADGIFISLGHVPNTEFLKDSGIELDKKGFIKTDENCRTNIDGIYAVGDVRGGVMQVAKAVGDGCVAMANIIKYLQKL (서열 번호 6); 및
ㆍ 아캐오글로버스 풀기두스로부터의 티오레독신 리덕타제의 아미노산 서열 (gil2649006)(trxB)
MYDVAIIGGGPAGLTAALYSARYGLKTVFFETVDPVSQLSLAAKIENYPGFEGSGMELLEKMKEQAVKAGAEWKLEKVERVERNGETFTVIAEGGEYEAKAIIVATGGKHKEAGIEGESAFIGRGVSYCATCDGNFFRGKKVIVYGSGKEAIEDAIYLHDIGCEVTIVSRTPSFRAEKALVEEVEKRGIPVHYSTTIRKIIGSGKVEKVVAYNREKKEEFEIEADGIFVAIGMRPATDVVAELGVERDSMGYIKVDKEQRTNVEGVFAAGDCCDNPLKQVVTACGDGAVAAYSAYKYLTS (서열 번호 7).
본 발명에서 사용하기 위한 이러한 단백질을 암호화하는 유전자들은 바람직하게는 하기 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 식물 선호 코돈을 사용하여 역해독시켜 디자인하여 G-C 함량을 증강시키고 불리한 서열들을 제거시킨다. 단백질의 활성은 하기 기술되는 바와 같이, DNA 셔플링 또는 다른 방법들로 증강시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들 단백질로부터 유도된 단백질, 특히 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제 활성을 보유하는 실질적으로 유사한 단백질들을 포함한다.
곡물 발생 동안 활성을 위해 종자내에서 유전공학적인 티오레독신 발현을 위해서, 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제의 종자-특이적 발현을 지시하는 프로모터가 바람직하며, 이는 저장소로 표적화되어 상기 효소가 저장 단백질 상에서 바람직한 효과를 가질 것이며, 이는 특정 적용에서 바람직할 것이다. 그러나, 본 발명에 있어서, 축적을 위해서 및 곡물 발생 동안 불활성화를 위해서 종자내에서 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제 발현을 유전자 조작하는 것이 일반적으로 보다 바람직할 수 있다. 예를 들면, 하기 수 개의 전략들을 사용하여 정상 종자 발생에 현저한 영향을 미치지 않고 유전자이식된 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 발현하는 종자를 생산한다:
(i) 예를 들면, 전분체로 표적화하거나 전분체내에서 발현시킴으로서, 표적 단백질과 유의하게 상호작용하지 않도록 활성 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제를 구획화하는 것. 색소체 표적화 서열을 사용하여 전분체내에서의 축적을 지시한다. 대안으로, 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 분비 시그날을 사용하여 세포벽내 세포외 위치로 표적화시킨다. 또는 최종적으로, 단자엽 식물의 경우, 종자 발생 동안 호분립 같은 세포 유형에서의 발현을 사용하여 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 배유의 나머지 저장 구획으로부터 분리시킨다.
(ii) 고온성 유기체로부터의 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 발현을 유전자 조작하는 것. 주위 온도(실제 38 내지 39℃ 정도로 높은 온도)에서 거의 활성이 없거나 전혀 활성이 없는 효소는 발생 동안 거의 문제를 야기하지 않는다. 따라서, 바람직하게는, 효소는 주로 고온, 예를 들면, 40℃ 이상, 가장 바람직하게는 습식 제분의 경우 45 내지 60℃, 또는 보다 더 고온, 예를 들면, 45 내지 95℃에서 주로 활성적이다.
(iii) 유도성 프로모터, 예를 들면, 화학적으로 유도가능한 프로모터, 상처 유도성 프로모터, 또는 트랜스활성화인자를 발현하는 식물에 의한 수분시에 활성화되는 트랜스활성화인자 매개된 프로모터의 조절하에 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 위치시키는 것.
(iv) 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제 활성이 각각, 적합한 티오레독신 리덕타제 또는 티오레독신의 이용가능성을 통해 적합하게 조절되도록, 특정 티오레독신 리덕타제에 대한 특정 필요조건을 갖는 티오레독신을 사용하는 것. 예를 들면, 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제가 상이한 식물에서 발현되어, 결과적으로 활성 조합이 보충적 효소를 발현하는 식물에 의한 수분시에만 종자에서 이용가능하게 된다. 대안으로, 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제는 상기 기술된 바와 같이, 세포, 예를 들면, 색소체, 액포, 또는 아포플라스트에서 격리되어, 곡물이 가공될 때까지는 이용가능하지 않게 된다.
곡물 가공 방법
따라서, 본 발명은 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 사용하여 단백질 매트릭스로부터 전분의 분리를 증강시키는 신규한 방법을 제공한다. 제1 구체적인 양태에서, 티오레독신 활성은 습식 제분, 건식 제분, 오일종자 가공, 대두 가공, 밀 가공 및 밀가루/반죽 품질, 가장 특히 곡물, 특히 옥수수의 습식 제분을 포함하는 다양한 종자 가공 적용에서 유용한 것으로 확인된다. 따라서, 본 발명은 보충적인 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제의 존재하에서 곡물을 침지시키고 상기 곡물로부터 전분 및 단백질 성분을 분리하는 것을 포함하여, 제분 효능을 개선시키거나 제분 생산량을 증가시키거나, 전분 및 단백질의 분리 효능을 증가시키거나, 곡물로부터 전분 및 가용성 단백질의 생산량을 증강시키거나, 물 또는 다른 유기용매 중 단백질 용해도를 증가시키는 방법을 제공한다. 전형적으로, 침지는 제분 전에 수행하지만, 이후에 수행할 수도 있으며, 가공 방법 추출에서 하나 이상의 제분 또는 침지 단계가 존재할 수 있으며, 침지 동안 또는 침지 후 시점에서 종자로부터 단백질 생산량을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 보충적인 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제는 곡물이 수확되는 식물에서 형질전환 유전자의 발현에 의해 제공된다.
본 발명은 추가로 다음을 제공한다: 전분 또는 단백질의 제분 효율을 개선하거나 제분 생산량을 증가시키는 방법에서 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제의 용도, 예를 들면, 상기 기술된 모든 방법에서, 곡물 중 단백질로부터 전분의 분리를 촉진시키기 위한 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제 유효량을 포함하는 침지수; 단백질로부터 전분의 분리를 촉진시키기 위한 티오레독신 유효량에 노출시킨 곡물; 및 상기 기술된 방법으로 생산된 전분 또는 단백질. 상기 방법에서 티오레독신의 활성은 티오레독신 리덕타제 및/또는 NADPH로 침지수를 보충함으로써 증강시킬 수 있다. 습식 제분을 위한 침지수에 일반적으로 존재하는 예를 들면, 락트산을 생산하는 세균 같은 다른 성분들이 또한 존재할 수 있다. 바람직하게는, 침지는 약 52℃에서 22 내지 50시간의 주기 동안 수행될 수 있으며, 따라서 티오레독신이 이러한 조건하에서 안정한 것이 바람직하다.
곡물은 쌍자엽성 종자, 예를 들면, 오일 종자, 예를 들면, 대두, 해바라기 또는 캐놀라, 바람직하게는 대두일 수 있거나, 단자엽성 종자, 예를 들면, 시리얼종자, 예를 들면, 옥수수, 밀, 귀리, 보리, 호밀 또는 쌀, 가장 바람직하게는 옥수수일 수 있다.
티오레독신은 티오레독신 리덕타제의 존재하에서 가역적으로 산화되어 이황화 결합을 형성하거나 NADPH에 의해 환원될 수 있는 티올 그룹을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 티오레독신은 상기 기술된 바와 같이, 고온성 유기체로부터 유도된다. 본 발명에서 사용하기 위한 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제는 유전자 조작된 미생물, 예를 들면, 효모 또는 아스퍼길러스에서, 또는 매우 고발현할 수 있는 유전자 조작된 식물, 예를 들면, 보리에서, 예를 들면, 맥아 제조 동안 활성인 프로모터, 예를 들면, 고 pI 알파-아밀라제 프로모터 또는 다른 지베렐린 의존성 프로모터의 조절하에서 적합하게 생산된다. 이후, 티오레독신(분비되거나 추출된 형태 또는 생산 유기체 또는 이의 일부와 병용하여)이 침지수에 부가된다.
침지수에 대한 티오레독신의 부가에 대해 대안으로 또는 보충적으로서, 상기 효소는 제분하고자 하는 종자내에서 직접적으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 상기 효소는 곡물 성숙 동안 또는 컨디셔닝 가공 동안 발현된다.
따라서, 추가의 구체적인 양태에서, 본 발명은 유전자이식된 유기체, 예를 들면, 식물, 예를 들면, 보리 또는 옥수수 같은 시리얼, 또는 미생물, 예를 들면, 효모 또는 아스퍼길러스에서 산업적 규모로 티오레독신을 제조하는 방법을 제공하며, 예를 들면, 티오레독신을 발현하는 키메라 유전자를 갖는 유전자이식된 유기체를 배양하고 선택적으로 티오레독신을 분리하거나 추출하는 단계를 포함하는 방법;종자내 단백질의 양이 종자 발생 동안 또는 침지 가공 동안 내인성으로 합성된 티오레독신에 의해 영향을 받는 종자 성숙 또는 발아 동안 티오레독신의 증가된 양을 생산하는 유전자이식된 식물을 사용함으로써, 제분에 앞서 외인성 화학물질 또는 효소로 컨디셔닝할 필요를 제거하거나 감소시키는 방법; 종자내 단백질의 양이 종자 발생 동안 또는 침지 가공 동안 티오레독신에 의해 영향을 받는 종자 성숙 또는 발아 동안 티오레독신의 증가된 양을 생산하는 유전자이식된 식물을 제조함으로써, 제분에 앞서 외인성 화학물질 또는 효소로 컨디셔닝할 필요를 제거하거나 감소시키는 방법; 및 보다 높은 전분 및 가용성 단백질 생산량을 초래하는, 티오레독신을 함유하는 유전자이식된 종자를 사용하는 곡물 제분 방법.
본 발명은 추가로 작동적인 프로모터의 조절하에서 열안정성 또는 진핵생물의 티오레독신 또는 티오레독신 리덕타제를 암호화하는 암호화 영역을 포함하는 키메라 발현 카셋트를 이의 게놈내에 갖는 유전자이식된 유기체를 포함한다. 바람직하게는, 유전자이식된 유기체는 상기 식물 종에서 천연적으로는 생성되지 않는 형태로 티오레독신 및/또는 티오레독신 리덕타제를 발현하고 상기 식물 종에서 천연적인 것 보다 더 높은 수준으로 티오레독신을 발현하는 식물이다. 바람직하게는, 티오레독신은 종자 발생 동안 종자에서 발현되며, 따라서 종자 특이적인 프로모터의 조절하에 위치한다. 선택적으로, 티오레독신의 발현은 유도성 또는 트랜스활성화인자-조절된 프로모터의 조절하에 위치되어, 발현은 바람직한 경우 트랜스활성화인자와 화학물질의 유도 또는 이와의 하이브리드화에 의해서 활성화된다. 티오레독신은 액포 표적화 서열과의 융합에 의해 식물의 액포로 적합하게 표적화된다.본 발명에서, 티오레독신 암호화 서열은 식물에서 활성인 프로모터에 융합되어 핵 게놈 또는 색소체 게놈내로 형질전환된다. 상기 프로모터는 바람직하게는 감마-제인 프로모터 같은 종자 특이적인 프로모터이다. 상기 프로모터는 선택적으로 담배 PR-1a 프로모터 같은 화학적 유도가능한 프로모터일 수 있거나, 트랜스활성화인자가 화학적으로 유도되는 프로모터의 조절하에 있는 화학적으로 유도되는 트랜스활성화인자 조절된 프로모터일 수 있지만, 특정 상황에서는, CaMV 35S 또는 겔빈(Gelvin) 프로모터 같은 구성성 프로모터가 사용될 수 있다. 화학적으로 유도가능한 프로모터를 사용하는 경우, 식물내로 형질전환된 티오레독신 유전자의 발현은 화학적 유도제의 잎 적용에 의해 적합한 시간에 활성화될 수 있다.
대안으로, 티오레독신 암호화 서열은 트랜스활성화인자 조절된 프로모터의 조절하에 위치하며, 발현은 트랜스활성화인자를 발현하는 제2 식물과 상기 서열로 형질전환된 식물을 이종교배시켜 달성한다. 상기 방법의 바람직한 형태에서, 티오레독신 암호화 서열을 함유하는 제1 식물은 종자 모(parent)이며 웅성 불임인 반면, 트랜스활성화인자를 발현하는 제2 식물은 수분인자(pollinator)이다. 종자에서 티오레독신의 발현은 제1 및 제2 식물을 체내배양시켜 달성되며, 예를 들면, 그 결과, 제1 식물은 제2 식물에 의해 수분되며 티오레독신은 제2 모로부터의 트랜스활성화인자 유전자에 의해 발현된 트랜스활성화인자와 트랜스활성화인자 조절된 프로모터의 활성화에 의해 제1 식물의 종자에서 발현된다.
본원에서 기술된 핵산 서열들은 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 세포내로 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 이는 본 발명의 암호화 서열을 암호화서열이 이종성인(즉, 정상적으로는 존재하지 않는) 발현 시스템내로 당해 분야에 공지된 표준 클로닝 방법을 사용하여 삽입시키는 것과 관련된다. 벡터는 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자들을 함유한다. 당해 분야에 공지된 수많은 벡터 시스템, 예를 들면, 플라스미드, 박테리오파아지 바이러스 및 기타 변형된 바이러스들이 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 람다 벡터 시스템 λgtl1, λgt10 및 카론 4 같은 바이러스성 벡터, pBI121, pBR322, pACYC177, pACYC184, pAR 시리즈, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII 같은 플라스미드 벡터, 및 다른 유사한 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 발현 시스템의 성분들은 또한 발현을 증가시키기 위해서 변형될 수 있다. 예를 들면, 말단 절단된 서열, 뉴클레오타이드 치환 또는 다른 변형들이 사용될 수 있다. 본원에 기술된 발현 시스템들을 사용하여 적합한 조건하에서 사실상 모든 농작물 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환된 세포는 전체 식물로 재생되어 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 유전자이식된 식물에서 발현될 수 있다.
암호화 서열 및 인접 서열의 변형
미생물 공급원으로부터 유도된 유전자의 식물내 유전자이식된 발현은 식물에서의 이들의 발현을 달성하고 최적화시키기 위한 유전자의 변형을 필요로 할 수 있다. 특히, 개별적인 효소를 암호화하지만 천연 미생물내 동일한 전사체에 의해서 암호화되는 세균성 ORF가 개별적인 전사체에 대해서 식물에서 가장 잘 발현된다.이를 달성하기 위해서, 각각의 미생물 ORF를 개별적으로 분리하고 상기 ORF의 5' 말단에서 식물 프로모터 서열 및 3' 말단에서 식물 전사종결인자를 제공하는 카셋트내에서 클로닝시킨다. 분리된 ORF 서열은 바람직하게는 개시 ATG 코돈 및 종결 STOP 코돈을 포함하지만, 개시 ATG 및 STOP 코돈 이외의 부가적인 서열을 포함할 수도 있다. 또한, ORF를 말단 절단시키지만, 여전히 필요한 활성을 유지시킬 수 있다; 특히 긴 ORF인 경우, 활성을 유지하는 말단 절단된 형태는 유전자이식된 유기체내에서 발현을 위해 바람직할 것이다. "식물 프로모터" 및 "식물 전사종결인자"란 식물 세포내에서 작동하는 프로모터 또는 전사종결인자를 의미하는 것을 의도한다. 이는 바이러스(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스) 같은 비식물 공급원으로부터 유도된 것일 수 있다.
특정의 경우에, ORF 암호화 서열 및 인접 서열에 대한 변형이 불필요하다. 관심 대상의 ORF를 함유하는 단편을 분리하여 이를 식물 프로모터 하류에 삽입하는 것으로 충분하다. 예를 들면, 문헌[Gaffney et al., Science 261: 754-756 (1993)]은 암호화 서열의 변형없이 성공적으로, 여전히 부착된 ATG의 상류에 슈도모나스 유전자 x bp 및 nahG ORF에 대해 여전히 부착된 STOP 코돈의 하류에 y bp를 갖는, CaMV 35S 프로모터 및 CaMV tml 종결인자의 조절하에서 형질전환된 식물에서 슈도모나스 nahG 유전자를 발현시킨다. 바람직하게는, ATG의 상류 및 STOP 코돈 하류에는 인접 미생물 서열이 거의 부착되어 잔류하지 않아야 한다. 실시에서, 상기 작제는 제한 부위의 이용가능성에 따라 결정될 수 있다.
또 다른 경우에, 미생물 공급원으로부터 유도된 유전자의 발현은 발현상 문제를 야기할 수 있다. 이러한 문제들은 당해 분야에 잘 특성화되어져 있으며 특히 바실러스 같은 특정 공급원으로부터 유도된 유전자에 대해서는 일반적이다. 이러한 문제들은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 적용될 수 있으며 상기 유전자들의 변형은 당해 분야에 현재 잘 공지되어져 있는 기술들을 사용하여 수행할 수 있다. 하기 문제들이 직면될 수 있다.
1. 코돈 이용가능성
식물에서 선호되는 코돈 사용은 특정 미생물에서 선호되는 코돈 사용과 상이하다. 클로닝된 미생물 ORF내 코돈 사용의 식물 유전자(및 특히, 표적 식물로부터의 특정 유전자)에서의 사용과의 비교는 바람직하게 교환되어야 하는 ORF내 코돈을 확인시켜 줄 것이다. 전형적으로 식물 진화는 단자엽 식물의 제3 염기 위치에서 뉴클레오타이드 C 및 G의 강력한 선호 경향을 갖는 반면, 쌍자엽 식물에서는 종종 동일 위치에서 뉴클레오타이드 A 또는 T를 사용한다. 특정 표적 형질전환된 종에 대해 선호되는 코돈 사용의 도입을 위해 유전자를 변형시킴으로써, GC/AT 함량 및 변칙적인 스플라이싱에 대한 하기 기술된 수 많은 문제들이 극복될 것이다.
2. GC/AT 함량
식물 유전자는 전형적으로 35% 이상의 GC 함량을 갖는다. A 및 T 뉴클레오타이드가 풍부한 ORF 서열은 식물에서 몇 가지 문제점을 야기시킬 수 있다. 첫번째, ATTTA의 모티프는 메세지의 불안정성을 야기하는 것으로 생각되며 수 많은 단명 mRNA의 3' 말단에서 발견된다. 두번째, 메세지내 부적합한 위치에서 AATAAA 같은 폴리아데닐화 시그날의 발생은 전사의 미성숙 말단 절단화를 야기하는 것으로 생각된다. 또한, 단자엽식물은 AT-풍부 서열을 스플라이스 위치로 인식할 수 있다(하기 참조).
3. 개시 메티오닌 인접 서열
식물은 이의 메세지가 정의된 리보좀 결합 부위를 갖지 않는다는 점에서 미생물과는 상이하다. 오히려, 리보좀은 메세지의 5' 말단에 부착하여 해독을 개시하기 위한 최초 이용가능한 ATG를 스캐닝하는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, ATG에 인접하는 특정 뉴클레오타이드에 대한 선호 경향이 있으며 미생물 유전자의 발현은 ATG에서 진핵생물성 컨센서스 해독 개시인자의 포함에 의해 증강될 수 있다. 문헌[Clontech, 1993/1994 catalog, page 210]은 식물에서 이. 콜라이 uidA 유전자의 발현을 위한 컨센서스 해독 개시인자로서 한 가지 서열을 제시하였다. 추가로, 문헌[Joshi, NAR 15: 6643-6653 (1987)]은 ATG에 인접한 수 많은 식물 서열들을 비교하고 또 다른 컨센서스 서열을 제시한다. 식물에서 미생물 ORF의 발현에서 난제들이 직면되는 상황에서, 개시 ATG에서 이러한 서열들 중 하나의 포함은 해독을 개선시킬 수 있다. 상기의 경우, 컨센서스 중 마지막 세번째 뉴클레오타이드는 이의 제2 AA 잔기의 변형으로 인해 변형된 서열 중에 포함하기에 부적합할 수 있다. 개시 메티오닌에 인접하는 바람직한 서열은 식물 종에 따라서 상이할 수 있다. GenBank 데이터베이스에 존재하는 14개 옥수수 유전자에 대한 조사로 하기 결과를 수득하였다:
14개 옥수수 유전자 중 개시 ATG 앞의 위치:
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
C 3 8 4 6 2 5 6 0 10 7
T 3 0 3 4 3 2 1 1 1 0
A 2 3 1 4 3 2 3 2 2 3
G 6 3 6 0 6 5 4 1 1 5
이러한 분석은 뉴클레오타이드 서열이 도입되는 바람직한 식물 종들 및 선호되는 뉴클레오타이드를 도입하기 위해 변형된 ATG 인접 서열에 대해서 수행할 수 있다.
4. 변칙적인 스플라이스 위치의 제거
비식물 공급원으로부터 클로닝되고 식물에서 발현을 위하여 최적화되지 않은 유전자는 또한 식물에서 5' 또는 3' 스플라이스 부위로 인식될 수 있는 모티프를 함유할 수 있으며, 따라서 절단되어 말단 절단된 또는 결실된 메세지를 생성할 수 있다. 이러한 부위들은 당해 분야에 공지된 기술들을 사용하여 제거시킬 수 있다.
암호화 서열 및 인접 서열의 변형을 위한 기술들은 당해 분야에 공지되어져 있다. 미생물 ORF의 개시 발현이 낮고 상기 기술된 서열을 변형하기에 적합한 경우, 합성 유전자의 작제는 당해 분야에 공지된 방법들에 따라서 달성될 수 있다. 이들은 예를 들면, 문헌[공개된 특허 문헌 EP 제0 385 962호(Monsanto), EP 제0 359 472호(Lubrizol) 및 WO 제93/07278호(Ciba-Geigy)]에 기술되어져 있다. 대부분의 경우, 유전자이식시킬 식물로의 전달 전에 일시적인 분석 프로토콜(이는 또한당해 분야에 공지되어져 있다)을 사용하여 유전자 작제물의 발현을 분석하는 것이 바람직하다.
식물 발현 카셋트의 작제
유전자이식된 식물에서의 발현을 위해 의도된 암호화 서열은 우선 식물에서 발현가능한 적합한 프로모터 뒤에서 발현 카셋트내에 조합된다. 발현 카셋트는 또한 이식되는 유전자의 발현을 위해서 필요하거나 선택된 임의의 추가 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 전사 종결인자, 인트론 같은 발현을 증강시키기 위한 외인성 서열, 생명 유지에 필요한 서열, 및 특정 세포 소 기관 및 세포 구획들로 유전자 생성물을 표적화시키기 위해 의도된 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 이러한 발현 카셋트는 하기 기술된 식물 형질전환 벡터내로 용이하게 전달될 수 있다. 하기는 전형적인 발현 카셋트의 다양한 성분들에 대한 기술이다.
1. 프로모터
발현 카셋트에서 사용되는 프로모터의 선택은 유전자이식된 식물 중 이식되는 유전자의 공간적 및 시간적 발현 패턴에 따라 결정될 것이다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(예를 들면, 잎 표피 세포, 엽육 세포, 근 피질 세포)에서 또는 특정 조직 또는 기관(예를 들면, 근, 잎 또는 꽃)에서 이식된 유전자를 발현할 것이며 상기 선택은 유전자 생성물의 축적의 바람직한 위치를 반영할 것이다. 대안으로, 선택된 프로모터는 다양한 유도성 조건하에서 유전자의 발현을 구동시킬 것이다. 프로모터는 이의 강도, 즉 전사를 촉진하는 능력에 있어서 다양하다. 사용되는 숙주 세포 시스템에 따라서, 유전자의 천연 프로모터를 포함하는 수 많은 적합한 프로모터 중 임의의 하나가 선택될 수 있다. 하기는 발현 카셋트에서 사용될 수 있는 프로모터의 비-제한적인 예이다.
a. 구성성 발현, 유비퀴틴 프로모터
유비퀴틴은 수 많은 세포 유형에서 축적되는 것으로 공지된 유전자 생성물이며 이의 프로모터는 유전자이식된 식물에서의 사용을 위해서 수 개의 종으로부터 클로닝되었다[예를 들면, 해바라기 - Binet et al., Science 79: 87-94 (1991); 옥수수 - Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989); 및 아라비돕시스 - Norris et al., Plant Mol. Biol. 21: 895-906 (1993)]. 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 유전자이식된 단자엽 시스템들에서 개발되어져 왔으며 이의 서열 및 단자엽 형질전환을 위해 작제된 벡터들은 특허 공개 공보[EP 제0 342 926호(Lubrizol에게 허여됨)]에 기술되어져 있다. 문헌[Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)]에는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 제1 인트론을 포함하며, 미세발사체 폭격에 의해 도입되는 경우 수 많은 단자엽 식물의 세포 현탁액 중에서 높은 활성을 갖는 벡터(pAHC25)를 기술하고 있다. 아라비돕시스 유비퀴틴 프로모터는 특히 본 발명의NIM1동족체와 함께 사용하기에 바람직하다. 유비퀴틴 프로모터는 단자엽 및 쌍자엽 모두의 유전자이식된 식물에서 유전자 발현에 적합하다. 적합한 벡터는 적합한 유비퀴틴 프로모터 및/또는 인트론 서열의 도입에 의해 변형된,pAHC25의 유도체 또는 본원에서 기술된 형질전환 벡터 중 하나이다.
b. 구성성 발현, CaMV 35S 프로모터
플라스미드 pCGN1761의 작제는 공개된 특허원[EP 제0 392 225호(실시예 23)]에 기술되어져 있다. pCGN1761은 프로모터와 종결인자 사이에서 유일한 EcoRI 부위와 함께 "이중" CaMV 35S 프로모터 및 tml 전사 종결인자를 함유하며 pUC-유형 골격을 갖는다. pCGN1761의 유도체는 존재하는 EcoRI 부위 이외에 NotI 및 XhoI 부위를 포함하는 변형된 폴리링커를 갖도록 작제되었다. 이러한 유도체는 pCGN1761ENX로 명명되었다. pCGN1761ENX는 유전자이식된 식물에서 35S 프로모터의 조절하에서 이의 발현을 위하여 폴리링커내에 cDNA 서열 또는 암호화 서열(미생물 ORF 서열을 포함)을 클로닝하는데 유용하다. 상기 작제물의 전체 35S 프로모터-암호화 서열-tml 종결인자 카셋트는 프로모터의 5' 쪽으로 HindIII, SphI, SalI 및 XbaI 부위에서 및 종결인자의 3' 쪽으로 XbaI, BamHI 및 BglII 부위에서 절개되어 하기 기술되는 바와 같은 형질전환 벡터내로 전달될 수 있다. 추가로, 이중 35S 프로모터 단편은 HindIII, SphI, SalI, XbaI 또는 PstI으로 5' 쪽에서의 절개 및 폴리링커 제한 부위(EcoRI, NotI 또는 XhoI) 중 하나로 3' 쪽에서의 절개에 의해 제거되어 또 다른 프로모터로 대체될 수 있다. 바람직한 경우, 해독을 증강시킬 수 있는 서열을 도입함으로써 클로닝 부위 주변을 변형시킬 수 있다. 이는 과발현이 바람직한 경우 특히 유용하다. 예를 들면, pCGN1761ENX는 문헌[미국 특허 제5,639,949호의 실시예 37]에 기술된 바와 같이 해독 개시 부위의 최적화에 의해서 변형될 수 있다.
c. 구성성 발현, 액틴 프로모터
액틴의 수 개의 동형들이 대부분의 세포 유형에서 발현되는 것으로 공지되어져 있으며 결과적으로 액틴 프로모터는 구성성 프로모터를 위한 적당한 선택이다. 특히, 벼 ActI 유전자로부터의 프로모터가 클로닝되었으며 특성화되었다[McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)]. 상기 프로모터의 1.3kb 단편은 벼 원형질체에서 발현을 위해 필요한 모든 조절 인자를 함유하는 것으로 확인되었다. 추가로, ActI 프로모터에 기초하는 수 많은 발현 벡터들이 특히 단자엽 식물에서의 사용을 위해서 작제되었다[McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)]. 이는 ActI-인트론 1, AdhI 5'-플랭킹 서열 및 AdhI-인트론 1(옥수수 알콜 데하이드로게나제 유전자로부터) 및 CaMV 35S 프로모터로부터의 서열을 도입한다. 최고의 발현을 나타내는 벡터는 35S 및 ActI 인트론 또는 ActI 5' 플랭킹 서열 및 ActI 인트론의 융합체이다. 개시 ATG(GUS 리포터 유전자의) 주변의 서열 최적화는 또한 발현을 증강시켰다. 문헌[McElroy et al. Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)]에 기술된 프로모터 발현 카셋트는 유전자 발현을 위해서 용이하게 변형될 수 있으며 특히 단자엽 숙주에서의 용도를 위해서 적합하다. 예를 들면, 프로모터-함유 단편을 McElroy 작제물로부터 제거하고 pCGN1761ENX 중 이중 35S 프로모터로 교체하여 사용되며, 이는 이후 특정 유전자 서열의 삽입에 이용가능하다. 이후, 이렇게 작제된 융합 유전자는 적합한 형질전환 벡터내로 전달될 수 있다.또 다른 보고에서, 이의 제1 인트론과 함께 벼 ActI 프로모터는 또한 배양된 보리 세포에서 높은 발현을 지시하는 것으로 확인되었다[Chibbar et al., Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)].
d. 유도성 발현, PR-1 프로모터
pCGN1761ENX 중 이중 35S 프로모터는 적합하게 높은 발현 수준을 초래하게 될 선택된 또 다른 임의의 프로모터로 대체될 수 있다. 예로서, 문헌[미국 특허 제5,614,395호]에 기술된 화학적으로 조절가능한 프로모터 중 하나가 이중 35S 프로모터를 대체할 수 있다. 선택되는 프로모터는 바람직하게는 제한 효소에 의해 이의 공급원으로부터 절개되지만, 대안으로 적합한 말단 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 PCR-증폭될 수 있다. PCR-증폭을 수행하는 경우, 프로모터는 증폭 오류에 대한 검사를 위해서 재서열분석한 후 표적 벡터내로 증폭된 프로모터를 클로닝시켜야 한다. 화학적/병원체 조절가능한 담배 PR-1a 프로모터는 플라스미드 pCIB1004[작제에 대해서는, EP 제0 332 104호의 실시예 21 참조]로부터 절단하여 플라스미드 pCGN1761ENX내로 전달된다[Uknes et al., 1992]. pCIB1004는 NcoI으로 절단하고 수득되는 선형화된 단편의 3' 돌출부는 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활말단화시킨다. 이후, 상기 단편을 HindIII로 절단하고 수득되는 PR-1a 프로모터 함유 단편을 겔 정제한 후, 이중 35S 프로모터를 제거시킨 pCGN1761ENX내로 클로닝시킨다. 이는, XhoI으로 절단한 후 T4 폴리머라제로 평활말단화시키고, HindIII로 절단한 후 보다 큰 벡터-종결인자 함유 단편을 분리하여 이에 pCIB1004 프로모터단편을 클로닝하여 수행한다. 이로써 PR-1a 프로모터 및 tml 종결인자 및 유일한 EcoRI 및 NotI 부위를 갖는 개재하는 폴리링커를 갖는 pCGN1761ENX 유도체를 생성시킨다. 선택된 암호화 서열을 상기 벡터내로 삽입할 수 있으며, 융합 생성물(즉, 프로모터-유전자-종결인자)은 후속적으로 하기 기술된 바와 같은 것들을 포함하는 임의의 선택된 형질전환 벡터내로 전달될 수 있다. 문헌[미국 특허 제5,523,311호 및 제5,614,395호]에 기술된 벤조티아디아졸, 이소니코틴산, 및 살리실산 화합물을 포함하는 다양한 화학적 조절인자들을 사용하여 본 발명에 따라 형질전환된 식물에서 선택된 암호화 서열의 발현을 유도할 수 있다.
e. 유도성 발현, 에탄올-유도성 프로모터
에탄올 같은 특정 알콜 또는 케톤에 의해 유도되는 프로모터를 또한 사용하여 본 발명에 따른 암호화 서열의 유도성 발현을 제공할 수 있다. 상기 프로모터는 예를 들면, 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)[Caddick et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16: 177-180]로부터의 alcA 유전자 프로모터가 있다. 에이. 니둘란스에서, alcA 유전자는 알콜 데하이드로게나제 I을 암호화하며, 이의 발현은 화학적 유도제의 존재하에서 AlcR 전사 인자에 의해 조절된다. 본 발명의 목적상, 최소 35S 프로모터에 융합된 alcA 유전자 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드 palcA:CAT[Caddick et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16: 177-180] 중 CAT 암호화 서열을 본 발명의 암호화 서열로 교체하여 alcA 유전자 프로모터의 조절하에서 암호화 서열을 갖는 발현 카셋트를 형성시킨다. 이는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행한다.
f. 유도성 발현, 글루코코르티코이드-유도성 프로모터
스테로이드 호르몬에 기초하는 시스템을 사용한 본 발명의 핵산 서열의 유도성 발현이 또한 포함된다. 예를 들면, 글루코코르티코이드-매개된 유도성 시스템을 사용하며[Aoyama and Chua, (1997) The Plant Journal 11: 605-612], 유전자 발현은 글루코코르티코이드, 예를 들면, 합성 글루코코르티코이드, 바람직하게는 덱사메타손을 바람직하게는 0.1mM 내지 1mM, 보다 바람직하게는 10mM 내지 100mM의 농도로 적용하여 유도시킨다. 본 발명의 목적상, 루시퍼라제 유전자 서열은 본 발명의 핵산 서열로 대체하여 35S 최소 프로모터에 융합된 GAL4 상류 활성화 서열의 6개 복수체의 조절하에서 본 발명의 핵산 서열을 갖는 발현 카셋트를 형성시킨다. 이는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 트랜스-활성화 인자는 랫트 글루코코르티코이드 수용체의 호르몬-결합 도메인[Picard et al., (1988) Cell 54: 1073-1080]에 융합된 헤르페스 바이러스 단백질 VP16[Triezenberg et al., Genes Devel. 2: 718-729 (1988)]의 트랜스활성화 도메인에 융합된 GAL4 DNA-결합 도메인[Keegan et al., (1986) Science 231: 699-704]을 포함한다. 융합 단백질의 발현은 당해 분야에 공지된 또는 본원에 기술된 식물 중에서 발현에 적합한 임의의 프로모터에 의해 조절된다. 이러한 발현 카셋트는 또한 6개의 GAL4/최소 프로모터에 융합된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 식물중에 포함된다. 따라서, 융합 단백질의 조직- 또는 기관-특이성이 달성되어 NIM1 동족체의 유도성 조직- 또는기관-특이성을 초래한다.
g. 근(root) 특이적인 발현
유전자 발현의 또 다른 패턴은 근 발현이다. 적합한 근 프로모터는 문헌[Framond, FEBS 290: 103-106 (1991)]에 기술되어져 있으며 또한 공개된 특허원[EP 제0 452 269호]에 기술되어져 있다. 상기 프로모터는 선택된 유전자의 삽입을 위한 pCGN1761ENX 같은 적합한 벡터내로 전달된 후, 후속적으로 관심 대상의 형질전환 벡터내로 전체 프로모터-유전자-종결인자 카셋트가 전달된다.
h. 상처-유도성 프로모터
상처-유도성 프로모터가 또한 유전자 발현에 적합할 수 있다. 수 많은 상기 프로모터가 기술되어져 있으며[예를 들면, Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993); Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989); Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993); Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993); Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993)], 모두는 본 발명에 사용하기에 적합하다. 문헌[Logemann et al.]은 쌍자엽 감자 wunI 유전자의 5' 상류 서열을 기술하고 있다. 문헌[Xu et al.]은 단자엽 벼에서 쌍자엽 감자로부터의 상처-유도성 프로모터(pin2)가 활성적임을 나타낸다. 추가로, 문헌[Rohrmeier & Lehle]는 상처 유도되고 표준 기술을 사용하여 동족 프로모터를 분리하는데 사용할 수 있는 옥수수 WipI cDNA의 클로닝을 기술하고 있다. 유사하게, 문헌[Firek et al. and Warner et al.]은 단자엽 식물 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis)로부터의 상처-유도성 유전자를 기술하고 있으며, 상기 유전자는 국부적인 상처 및 병원균 침입 부위에서 발현된다. 당해 분야에 공지된 클로닝 기술을 사용하여, 이러한 프로모터를 적합한 벡터내로 전달하여 본 발명에 따른 유전자에 융합시키고, 식물 상처 부위에서 이러한 유전자를 발현시키는데 사용할 수 있다.
i. 수(pith)-우선 발현
특허원[WO 제93/07278호]는 수 세포에서 우선적으로 발현되는 옥수수 trpA 유전자의 분리를 기술하고 있다. 상기 유전자 서열 및 전사 개시부로부터 -1726bp까지 신장된 프로모터가 제시된다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 프로모터 또는 이의 일부분을 pCGN1761 같은 벡터내로 전달할 수 있으며, 이때 이는 35S 프로모터를 대체할 수 있으며 수-우선적인 방식으로 외래 유전자의 발현을 구동하는데 사용할 수 있다. 사실, 수-우선적인 프로모터 또는 이의 일부분을 함유하는 단편은 모든 벡터에 전달되어 유전자이식된 식물에서 사용하기 위해서 변형될 수 있다.
j. 잎-특이적인 발현
포스포에놀 카복실라제(PEPC)를 암호화하는 옥수수 유전자는 문헌[Hudspeth & Grula, Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)]에서 기술되어져 왔다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 유전자에 대한 프로모터를 사용하여 유전자이식된 식물에서 잎-특이적인 방식으로 모든 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다.
k. 화분-특이적인 발현
문헌[WO 제93/07278호]는 화분 세포에서 발현되는 옥수수 칼슘-의존성 단백질 키나제(CDPK) 유전자의 분리를 기술하고 있다. 상기 유전자 및 프로모터는 전사 개시부로부터 1400bp까지 신장된다. 표준 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 프로모터 또는 이의 일부분을 pCGN1761 같은 벡터내로 전달시킬 수 있으며, 이때 이는 35S 프로모터를 대체하여 화분-특이적인 방식으로 본 발명의 핵산 서열의 발현을 구동시키는데 사용할 수 있다.
2. 전사 종결인자
다양한 전사 종결인자가 발현 카셋트내에서 사용하기 위해서 이용가능하다. 이들은 이식되는 유전자 뒤에서 전사 종결 및 이의 정확한 폴리아데닐화에 관여한다. 적합한 전사 종결인자는 식물에서 기능하는 것으로 공지된 것들이며 CaMV 35S 종결인자, tml 종결인자, 노팔린 신타제 종결인자 및 pea rbcS E9 종결인자를 포함한다. 이들은 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에서 사용될 수 있다. 또한, 유전자의 천연 전사 종결인자를 사용할 수 있다.
3. 발현의 증강 또는 조절을 위한 서열
수 많은 서열들이 전사 단위내로부터 유전자 발현을 증강시키는 것으로 확인되어져 왔으며 이러한 서열들은 유전자이식된 식물에서 본 발명의 유전자와 연결되어 이의 발현을 증가시키는데 사용할 수 있다.
다양한 인트론 서열들이 특히 단자엽 세포에서 발현을 증강시키는 것으로 나타났다. 예를 들면, 옥수수 adhI 유전자의 인트론은 옥수수 세포내로 도입되는 경우 이의 천연 프로모터 하에서 야생형 유전자의 발현을 현저하게 증강시키는 것으로 확인되었다. 인트론 1이 특히 효과적인 것으로 확인되었으며 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자[Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)]를 갖는 융합 작제물에서 발현을 증강시켰다. 동일한 실험 시스템에서, 옥수수 bronze 1 유전자로부터의 인트론이 유사한 발현 증강 효과를 갖는다. 인트론 서열은 일상적으로 식물 형질전환 벡터내로, 전형적으로는 비-해독 리더 서열내로 도입되어져 왔다.
바이러스로부터 유도된 수 많은 비-해독 리더 서열이 또한 발현을 증강시키는 것으로 공지되어져 있으며, 이들은 특히 쌍자엽 세포에서 효과적이다. 구체적으로, 담배 모자이크 바이러스(TMV, "W-서열"), 옥수수 백화 얼룩병 바이러스(MCMV) 및 알파파 모자이크 바이러스(AMV)로부터의 리더 서열은 발현 증강에서 효과적인 것으로 나타났다[예를 들면, Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)].
4. 세포내에서 유전자 생성물의 표적화
유전자 생성물의 표적화를 위한 다양한 메카니즘이 식물에 존재하는 것으로 공지되어져 있으며 이러한 메카니즘의 기능화를 조절하는 서열이 일부 상세히 특성화되었다. 예를 들면, 엽록체에 대한 유전자 생성물의 표적화는 엽록체 내입 동안 절단되어 성숙 단백질을 생성하는 다양한 단백질의 아미노 말단에서 확인되는 시그날 서열에 의해 조절된다[예를 들면, Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)]. 이러한 시그날 서열들은 이종 유전자 생성물에 융합되어 엽록체내로의 이종성 생성물의 내입을 초래할 수 있다[Van den Broeck et al., Nature 313: 358-363 (1985)]. 적합한 시그날 서열을 암호화하는 DNA는 엽록체내에 국재하는 것으로 공지된 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질 및 많은 다른 단백질로부터 분리시킬 수 있다. 또한 문헌을 참조한다[the section entitled "Expression With Chloroplast Targeting" in Example 37 of U.S. Patent No. 5,639,949].
다른 유전자 생성물은 미토콘드리아 및 퍼옥시좀 같은 다른 세포 기관으로 국재화된다[예를 들면, Unger at al., Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)]. 이러한 생성물들을 암호화하는 cDNA를 또한 조작하여 이러한 세포 기관내로 이종성 유전자 생성물의 표적화를 초래할 수 있다. 상기 서열들의 예는 미토콘드리아에 대한 핵-암호화된 ATPase 및 특정 아스파르테이트 아미노 트랜스퍼라제 동형이다. 표적화 세포 단백질체는 문헌[Rogers et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516 (1985)]에서 기술되어져 있다.
또한, 다른 세포 구획으로 유전자 생성물을 표적화시키는 서열들이 특성화되었다. 아미노 말단 서열들은 ER, 아포플라스트(apoplast)로의 표적화 및 호분 세포로부터 세포외 분비에 관여한다[Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)]. 부가적으로, 카복시 말단 서열과 함께 아미노 말단 서열은 유전자 생성물의 액포 표적화에 관여한다[Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)].
상기 기술된 적합한 표적화 서열을 관심 대상의 이식되는 유전자 서열에 융합시킴으로써, 모든 세포 소 기관 또는 세포 구획내로 유전자이식된 생성물을 지시하는 것이 가능해 진다. 엽록체 표적화에 있어서, 예를 들면, RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 신타제 유전자, 또는 GS2 유전자로부터의 엽록체 시그날 서열을 형질전환되는 유전자의 아미노 말단 ATG에 프레임내로 융합시킨다. 선택된 시그날 서열은 공지된 절단 부위를 포함해야만 하며, 작제된 융합물은 절단에 필요한 절단 부위 뒤에 임의의 아미노산들을 고려해야만 한다. 특정의 경우, 이러한 필요성은 절단 부위와 이식되는 유전자 ATG 사이에 소수의 아미노산을 부가함으로써 충족될 수 있거나, 대안으로, 이식되는 유전자 서열내에서 특정 아미노산을 대체하여 충족시킬 수 있다. 엽록체 내입을 위해서 작제된 융합물은 문헌[Bartlett et al., Edelman et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091 (1982) and Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)]에 기술된 기술들을 사용하여, 시험관내 전사된 작제물의 시험관내 해독 이후 시험관내 엽록체 흡수에 의한 엽록체 흡수의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 작제 기술은 당해 분야에 공지되어져 있으며 동등하게 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 적용할 수 있다.
상기-기술된 세포 표적화 메카니즘은 이의 천연 프로모터와 연계하여 뿐만 아니라 이종성 프로모터와 연계하여 사용되어, 표적화 신호가 유도되는 프로모터의 발현 패턴과는 상이한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 전사 조절하에서 특정 세포-표적화 목적을 달성할 수 있다.
식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 유용한 수 많은 형질전환 벡터가 식물 형질전환 분야의 통상적인 숙련자에게 공지되어져 있으며, 본 발명과 관련된 유전자들이 모든 상기 벡터와 연계하여 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환시키고자 하는 표적 종에 따라 결정될 것이다. 특정 표적 종에 있어서, 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에서 통상적으로 사용되는 선택 마커는 nptII 유전자(이는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여한다)[Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)], bar 유전자(이는 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여한다)[White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990); Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)], hph 유전자(이는 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여한다)[Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931], dhfr 유전자(이는 메타트렉세이트에 대한 내성을 부여한다)[Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)], EPSPS 유전자(이는 글리포세이트에 대한 내성을 부여한다)[미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호], 및 만노오스-6-포스페이트 이소머라제 유전자(이는 만노오스를 대사시키는 능력을 제공한다)[미국 특허 제5,767,378호 및 제5,994,629호]를 포함한다.
1. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
수 많은 벡터들이 아그로벡테리움 투메패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 형질전환시키는데 이용가능하다. 이들은 전형적으로 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 가지며 pBIN19[Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)] 및 pXYZ같은 벡터를 포함한다. 하기에서, 아그로박테리움 형질전환에 적합한 두 개의 전형적인 벡터가 기술된다.
a. pCIB200 및 pCIB2001
이원 벡터 pCIB200 및 pCIB2001을 아그로박테리움과 함께 사용하기 위한 재조합 벡터의 작제용으로 사용하여 하기 방식으로 작제하였다. pTJS75[Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)]의 NarI 절단으로 테트라사이클린-내성 유전자의 절단을 허용한 후, NPTII를 갖는 pUC4K[Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)]로부터 AccI 단편을 삽입시켜 pTJS75kan을 제작하였다. XhoI 링커를 좌우 T-DNA 경계, 식물 선택가능한 nos/nptII 키메라 유전자와 pUC 폴리링커를 함유하는 pCIB7[Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)]의 EcoRV 단편에 결합시킨 후,XhoI-절단된 단편을 SalI-절단된 pTJS75kan내로 클로닝하여 pCIB200을 작제하였다[또한, 참조: EP 제0 332 104호, 실시예 19]. pCIB200은 하기 유일한 폴리링커 제한 부위를 함유한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI 및 SalI. pCIB2001은 부가적인 제한 부위의 폴리링커내로의 삽입에 의해 작제된 pCIB200의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커내 유일한 제한 부위는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI 및 StuI이다. 이러한 유일한 제한 부위를 함유하는 이외에, pCIB2001은 또한 식물 및 세균 카나마이신 선택, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 좌우 T-DNA 경계, 이. 콜라이 및 다른 숙주 사이의 이동을 위한 RK-2-유도된 trfA 작용기, 및 또한 RK2로부터의 OriT 및 OriV 작용기를 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 이의 자체 조절 신호를 함유하는 식물 발현 카셋트의 클로닝에 적합하다.
b. pCIB10 및 이의 하이그로마이신 선택 유도체
이원 벡터 pCIB10은 식물에서 선택을 위한 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자 및 T-DNA 좌우 경계 서열을 함유하며 광범위한 숙주 범위 플라스미드 pRK252로부터의 서열을 도입하여 이. 콜라이 및 아그로박테리움 모두에서 복제되게 한다. 이의 작제는 문헌[Rothstein et al. Gene 53: 153-161 (1987)]에 기술되어져 있다. pCIB10의 다양한 유도체는 문헌[Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983)]에 기술된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 도입하도록 작제하였다. 이러한 유도체는 하이그로마이신 단독(pCIB743) 또는 하이그로마이신 및 카나마이신(pCIB715, pCIB717) 상에서 유전자이식된 식물 세포의 선택을 가능하게 한다.
2. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 투메패시언스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터내 T-DNA 서열에 대한 필요성을 우회하며 결과적으로, 이러한 서열들이 결핍된 벡터들이 T-DNA 서열을 함유하는 상기 기술된 것들과 같은 벡터에 부가하여 사용될 수 있다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술은 입자 폭격을 통한 형질전환법, 원형질체 흡수(예를 들면, PEG 및 전기천공법) 및 미세주입법을 포함한다. 벡터의 선택은 주로 형질전환시키고자 하는 종에 대한 바람직한 선택에 따라 결정된다. 하기, 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 전형적인 벡터의 작제가 기술된다.
a. pCIB3064
pCIB3064는 제초제 바스타(또는 포스피노트리신)에 의한 선택을 병용하는 직접적인 유전자 전달 기술에 적합한 pUC-유도된 벡터이다. 플라스미드 pCIB246은 이. 콜라이 GUS 유전자에 작동적으로 융합되는 CaMV 35S 프로모터 및 CaMV 35S 전사 종결인자를 포함하며 이는 문헌[PCT 공개된 출원 WO 제93/07278호]에 기술되어져 있다. 상기 벡터의 35S 프로모터는 개시 부위의 5'쪽에서 두 개의 ATG 서열을 함유한다. 이러한 부위는 ATG를 제거하는 것과 같은 방법으로 표준 PCR 기술을 사용하여 변형되어 제한 부위 SspI 및 PvuII를 생성시켰다. 상기 신규 제한 부위는유일한 SalI 부위로부터 96 및 37bp 떨어져 있으며 실질적인 개시 부위로부터 101 및 42bp 떨어져 있다. 수득되는 pCIB246의 유도체는 pCIB3025로 명명되었다. 이후, GUS 유전자를 pCIB3025로부터 SalI 및 SacI을 사용하여 절단하여 말단 평활말단화시킨 후, 재연결하여 플라스미드 pCIB3060을 생성시켰다. 플라스미드 pJIT82를 기관(John Innes Centre, Norwich)으로부터 수득하여 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터의 bar 유전자를 함유하는 400bp SmaI 단편을 절개하여 pCIB3060의 HpaI 부위내로 삽입하였다[Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2523 (1987)]. 이로써 pCIB3064를 작제하였으며, 이는 CaMV 35S 프로모터 및 종결인자의 조절하에 제초제 선택을 위한 bar 유전자, 암피실린 내성을 위한 유전자(이. 콜라이에서의 선택을 위해서) 및 유일한 부위 SphI, PstI, HindIII 및 BamHI을 갖는 폴리링커를 포함한다. 상기 벡터는 이의 자체 조절 신호를 함유하는 식물 발현 카셋트의 클로닝에 적합하다.
b. pSOG19 및 pSOG35
pSOG35는 선택성 마커로서 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 이. 콜라이 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DFR)을 사용하는 형질전환 벡터이다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(-800bp), 옥수수 Adh1 유전자(-550bp)로부터의 인트론 6 및 pSOG10으로부터의 GUS 비해독 리더 서열의 18bp를 증폭시켰다. 이. 콜라이 디하이드로폴레이트 리덕타제 유형 II 유전자를 암호화하는 250bp 단편을 또한 PCR로 증폭시키고 이들 두 PCR 단편들을, pUC19 벡터 골격 및 노팔린 신타제 종결인자를포함하는 pB1221(제조원: Clontech)로부터의 SacI-PstI 단편과 조합시켰다. 이러한 단편들의 조합으로 인트론 6 서열, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 종결인자와 융합시킨 35S 프로모터를 함유하는 pSOG19를 생성시켰다. pSOG19내 GUS 리더를 옥수수 백화 얼룩병 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 교체하여 벡터 pSOG35를 생성시켰다. pSOG19 및 pSOG35는 암피실린 내성을 위한 pUC 유전자를 가지며 외래 물질의 클로닝에 이용가능한 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 갖는다.
3. 엽록체 형질전환에 적합한 벡터
식물 색소체에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위해서, 색소체 형질전환 벡터 pPH143[WO 97/32011, 실시예 36]를 사용한다. 뉴클레오타이드 서열을 PROTOX 암호화 서열을 대체시킴으로써 pPH143내로 삽입한다. 이후, 상기 벡터를 색소체 형질전환 및 스펙티노마이신 내성에 대한 형질전환체의 선택에 사용한다. 대안으로, 뉴클레오타이드 서열을 aadH 유전자를 대체하도록 pPH143내로 삽입시킨다. 이러한 경우, 형질전환체는 PROTOX 억제제에 대한 내성에 대해서 선택된다.
형질전환
관심 대상의 유전자 서열을 발현 시스템내로 클로닝시킨 후, 이를 식물 세포에 형질전환시킨다. 식물의 형질전환 및 재생 방법은 당해 분야에 공지되어져 있다. 예를 들면, 직접적인 DNA 흡수, 리포좀, 전기천공법, 미세주입법 및 미세발사체 뿐만 아니라, Ti 플라스미드 벡터가 외래 DNA의 전달을 위해서 사용되어져 왔다. 또한, 아그로박테리움 속으로부터의 세균을 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 하기는 대표적인 색소체 형질전환 기술 뿐만 아니라 쌍자엽 및 단자엽 식물 모두를 형질전환시키는 대표적인 기술에 대한 설명이다.
1. 쌍자엽 식물의 형질전환
쌍자엽 식물에 대한 형질전환 기술은 당해 분야에 공지되어져 있으며 아그로박테리움-기초 기술 및 아그로박테리움을 필요로 하지 않는 기술을 포함한다. 비-아그로박테리움 기술은 원형질체 또는 세포에 의한 외인성 유전 물질의 직접적인 흡수와 관련된다. 이는 PEG 또는 전기천공법 매개된 흡수, 입자 폭격-매개된 전달, 또는 미세주입법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 기술의 예는 문헌[Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985); Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986); and Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)]에 기술되어져 있다. 각각의 경우, 형질전환된 세포는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 전체 식물로 재생된다.
아그로박테리움-매개된 형질전환은, 높은 형질전환 효율 및 수 많은 상이한 종에 대한 광범위한 유용성으로 인해 쌍자엽 식물의 형질전환에 바람직한 기술이다. 아그로박테리움 형질전환은 전형적으로, 공-잔류하는 Ti 플라스미드 상에서또는 염색체적으로 숙주 아그로박테리움 균주(예를 들면, pCIB200 및 pCIB2001에 대해서 균주 CIB542)[Uknes et al., 1993]가 보유하는 vir 유전자의 보충물에 따라 결정될 수 있는 적합한 아그로박테리움 균주에 대한 관심 대상의 외래 DNA를 함유하는 이원 벡터(예를 들면, pCIB200 또는 pCIB2001)의 전달과 관련된다. 재조합 이원 벡터의 아그로박테리움으로의 전달은 재조합 이원 벡터를 갖는 이. 콜라이, pRK2013 같은 플라스미드를 가지며 표적 아그로박테리움 균주로 재조합 이원 벡터를 이동시킬 수 있는 헬퍼 이. 콜라이 균주를 사용하는 3중 모 교배 방법으로 달성된다. 대안으로, 재조합 이원 벡터는 DNA 형질전환법[Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)]에 의해 아그로박테리움내로 전달될 수 있다.
재조합 아그로박테리움에 의한 표적 식물 종의 형질전환은 일반적으로 식물로부터의 이식편과 아그로박테리움의 공-배양과 관련되며 당해 분야에 공지된 프로토콜에 따른다. 형질전환된 조직은 이원 플라스미드 T-DNA 경계 사이에 존재하는 항생제 또는 제초제 내성 마커를 갖는 선택가능한 배지 상에서 재생된다.
식물 세포를 유전자로 형질전환시키는 또 다른 방법은 불활성 또는 생물학적으로 활성인 입자를 식물 조직 또는 세포에 추진시키는 것과 관련된다. 이러한 기술은 문헌[미국 특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호; 모두 Sanford 등에게 허여됨]에 기술되어져 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 세포의 외부 표면을 투과하여 이의 내부로 도입되기에 효과적인 조건하에서 불활성 또는 생물학적으로 활성인 입자를 세포에 추진시키는 것과 관련된다. 불활성 입자를 사용하는 경우, 벡터는 입자를 목적하는 유전자를 함유하는 벡터로 피복시킴으로써세포내로 도입시킬 수 있다. 대안으로, 표적 세포를 벡터로 에워싸서 상기 벡터가 입자의 뒤를 따라 세포내로 도입되게 하는 것이다. 생물학적으로 활성인 입자(예를 들면, 건조된 효모 세포, 건조된 세균 또는 박테리오파아지, 각각은 도입시키고자 하는 DNA를 함유한다)가 또한 식물 세포 조직으로 추진될 수 있다.
2. 단자엽 식물의 형질전환
대부분의 단자엽 종의 형질전환이 또한 현재 일상화되었다. 바람직한 기술은 PEG 또는 전기천공 기술을 사용하여 원형질체내로의 유전자의 직접적인 전달, 및 캘러스 조직내로의 입자 폭격을 포함한다. 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다중 DNA 종(즉, 공-형질전환)으로 수행할 수 있으며 이러한 기술 모두가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 공-형질전환은 완벽한 벡터 작제를 회피하고 관심 대상의 유전자와 선택가능한 마커를 위한 비연쇄된 좌위를 갖는 유전자이식된 식물을 생성시키는 장점을 가질 수 있으며, 이로써, 바람직한 경우, 후속적인 세대에서 선택가능한 마커를 제거할 수 있다. 그러나, 공-형질전환을 사용하는 단점은 개별적인 DNA 종들이 게놈내로 통합되는 빈도가 100% 미만이라는 것이다[Schocher et al., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)].
문헌[특허원 EP 제0 292 435호, EP 제0 392 225호 및 WO 제93/07278호]는 옥수수의 우수하게 동계 교배된 세포주로부터 캘러스 및 원형질체를 제조하는 기술, PEG 또는 전기천공법을 사용하여 원형질체를 형질전환시키는 기술, 및 형질전환된 원형질체로부터 옥수수 식물을 재생시키는 기술을 기술하고 있다. 문헌[Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2: 603-618 (1990) and Fromm et al. Biotechnology 8: 833-839 (1990)]은 입자 폭격을 사용하여 A188-유도된 옥수수의 형질전환 기술을 공개하였다. 추가로, 문헌[WO 제93/07278호 및 Koziel et al. Biotechnology 11: 194-200 (1993)]은 입자 폭격에 의한 옥수수의 우수하게 동계 교배된 세포주의 형질전환 기술을 기술하고 있다. 이러한 기술은 수분 14 내지 15일 후 옥수수 이삭으로부터 1.5 내지 2.5㎜ 길이로 절개된 미성숙 옥수수 배아 및 폭격을 위한 PDS-1000He Biolistics 장치를 사용한다.
벼의 형질전환은 원형질체 또는 입자 폭격을 사용하는 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행될 수 있다. 원형질체-매개된 형질전환은 자포니카-유형(Japonica-type)과 인디카-유형(Indica-type)[Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8: 736-740 (1990)]에 대해서 기술되어져 왔다. 두 유형 모두는 또한 입자 폭격을 사용하여 일상적으로 형질전환가능하다[Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)]. 추가로, 문헌[WO 제93/21335호]는 전기천공법을 통한 벼의 형질전환 기술을 기술하고 있다.
문헌[특허원 EP 제0 332 581호]는 푸이데애(Pooideae) 원형질체의 생성, 형질전환 및 재생 기술을 기술하고 있다. 이러한 기술들은 닥틸리스(Dactylis) 및 밀의 형질전환을 가능하게 한다. 추가로, 밀 형질전환은 C형 장기 재생가능한 캘러스의 세포내로의 입자 폭격을 사용하는 문헌[Vasil et al. Biotechnology 10: 667-674 (1992)] 및 미성숙 배아 및 미성숙 배아-유도된 캘러스의 입자 폭격을 사용하는 문헌[Vasil et al. Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) and Weeks et al. Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)]에 의해 기술되어져 왔다. 그러나, 밀 형질전환을 위한 바람직한 기술은 미성숙 배아의 입자 폭격에 의한 밀의 형질전환과 관련되며 유전자 전달에 앞서 고 슈크로오스 또는 고 말토오스 단계 중 하나를 포함한다. 폭격에 앞서, 임의의 수의 배아(0.75 내지 1㎜ 길이)를 3% 슈크로오스[Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)] 및 체세포성 배아의 유도를 위한 2,4-D 3㎎/ℓ를 갖는 MS 배지 상에 플레이팅한 후, 암 상태에서 진행시켰다. 폭격을 위한 선택일에, 배아를 유도 배지로부터 제거하여 삼투압조절제(즉, 바람직한 농도, 전형적으로 15%로 부가된 슈크로오스 또는 말토오스를 갖는 유도 배지) 상에 위치시켰다. 상기 배아를 2 내지 3시간 동안 원형질분리시킨 후 폭격하였다. 표적 플레이트 당 20개 배아가 전형적이기는 하지만, 결정적으로 중요하지는 않다. 적합한 유전자-함유 플라스미드(예를 들면, pCIB3064 또는 pSG35)를 표준 방법을 사용하여 마이크로미터 크기의 금 입자 상에 침전시켰다. 배아의 각각의 플레이트에 표준 80 메쉬 스크린을 사용하여 약 1000 psi의 폭발 압력을 사용하는 DuPont Biolistics헬륨 장치로 발사하였다. 폭격 후, 배아를 다시 암 상태로 위치시켜 약 24시간 동안(여전히 삼투압조절제 상에서) 회복되게 하였다. 24시간 후, 배아를 삼투압조절제로부터 제거하여 유도 배지 상으로 복귀시키며, 여기서 이들은 약 한 달 동안 유지시킨 후 재생시켰다. 약 한 달 후, 발생하는 배아성 캘러스를 갖는 배아 이식물을 적합한 선택제(pCIB3064의 경우 바스타 10㎎/ℓ 및 pSOG35의 경우 메토트렉세이트 2㎎/ℓ)를 추가로 함유하는 재생배지(MS + NAA 1㎎/ℓ, GA 5㎎/ℓ)로 옮겼다. 약 한 달 후, 발생된 어린싹을 1/2 농도 MS, 2% 슈크로오스, 및 동일한 농도의 선택제를 함유하는 "GA7"로 공지된 보다 큰 멸균 용기내로 옮겼다.
아그로박테리움을 사용하는 단자엽 식물의 형질전환이 또한 기술되어져 왔다. 문헌을 참조한다[WO 제94/00977호 및 미국 특허 제5,591,616호].
3. 색소체의 형질전환
또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 직접적으로 색소체 게놈내로 형질전환된다. 색소체 형질전환의 주요 잇점은 색소체가 일반적으로 실질적인 변형없이 세균 유전자를 발현할 수 있으며 색소체는 단일 프로모터의 조절하에서 다중 개방 판독 프레임을 발현시킬 수 있다는 것이다. 색소체 형질전환 기술은 문헌[미국 특허 제5,451,513호, 제5,545,817호 및 제5,545,818호, PCT 출원 제WO 95/16783호, 및 문헌: McBride et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305]에 광범위하게 기술되어져 있다. 색소체 형질전환에 대한 기초적인 기술은 관심 대상의 유전자와 함께 선택가능한 마커를 플랭킹하는 클로닝된 색소체 DNA의 영역을 적합한 표적 조직내로, 예를 들면, 생체탄도(biolistics) 또는 원형질체 형질전환(예를 들면, 염화칼슘 또는 PEG 매개된 형질전환)을 사용하여 도입시키는 것과 관련된다. 표적화 서열로 명명된, 1 내지 1.5kb 플랭킹 영역은 색소체 게놈과의 상동성 재조합을 촉진시키고 따라서, 플라스톰(plastome)의 특정 영역의 대체 또는 변형을 가능하게 한다. 처음에, 염색체 16S rRNA 및 스펙티노마이신 및/또는 스트렙토마이신 내성을 부여하는 rps12 유전자내 점 돌연변이를 형질전환에 대한 선택가능한 마커로서 사용한다[Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Staub, J.M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4: 39-45]. 이는 표적 잎 100회 폭격 당 대략 하나 정도의 빈도로 안정한 동일 플라스미드 형질전환체를 생성시킨다. 이러한 마커들 사이의 클로닝 부위의 존재는 외래 유전자의 도입을 위한 색소체 표적화 벡터의 제조를 가능하게 한다[Staub, J.M., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606]. 형질전환 빈도의 상당한 증가는 열성 rRNA 또는 r-단백질 내성 유전자를 우성 선택가능한 아미노글리코사이드-3'-아데닐트랜스퍼라제 [Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917]로 대체시킴으로써 수득된다. 이전에, 상기 마커는 녹조류 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)[Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089]의 색소체 게놈의 고빈도 형질전환을 위해서 성공적으로 사용되어져 왔다. 색소체 형질전환에 유용한 다른 선택가능한 마커들은 당해 분야에 공지되어져 있으며 본 발명의 범위내에 포함된다. 전형적으로, 형질전환 후 대략 15 내지 20개 세포 분할 주기가 동일 색소체 상태에 도달하는데 필요하다. 유전자가 상동성 재조합에 의해서 각각의 식물 세포내에 존재하는 원형 색소체 게놈의 모든 수천개 복사수내로 삽입되는, 색소체 발현은 핵-발현된 유전자에 비해 전체 가용성 식물 단백질의 10%를 용이하게 초과할 수 있는 발현 수준을 가능하게 하는 무수히 많은 복사수 잇점을 사용한다. 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 색소체 표적화 벡터내로 삽입되어 목적하는 식물 숙주의 색소체 게놈내로 형질전환된다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 색소체 게놈에 동일한 색소체형 식물이 수득되며, 바람직하게는 상기 뉴클레오타이드 서열의 고발현을 가능하게 한다.
본 발명은 하기 상세한 실시예를 참조로 추가로 기술될 것이다. 이들 실시예는 단지 예시를 위해서 제공되며, 특별한 언급이 없는 한 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 공지되어져 있으며, 문헌[Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); and by T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)]에 기술되어져 있다.
실시예 1
열-안정성 티오레독신을 사용한 옥수수의 형질전환
서열 번호 1로 나타낸 서열을 갖는 메타노코커스 자나스치이로부터의 열-안정성 티오레독신을 발현하는 유전자는 종자-특이적 감마-제인 프로모터의 조절하에서 문헌[미국 특허 제5,625,136호]에 기술된 바와 같은 옥수수 선호 코돈 및 pGIGUP 플라스미드의 T-DNA 경계 사이에 도입된 발현 카셋트를 사용하여 제조한다.
균주 아그로박테리움 투메패시언스 LBA4404(pAL4404, pSB1)을 상기 실험에서 사용한다. pAL4404는 무해한 헬퍼 플라스미드이다. pSB1은 pGIGUP와 상동성인 영역 및 pTiBo542[Ishida et al., 1996; High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens, Nature Biotechnology 14, 745-750]의 독성 영역으로부터의 15.2kb KpnI 단편을 함유하는 광범위한 숙주 범위 플라스미드이다. 전기천공법에 의한 플라스미드 pGIGUP의 LBA4404(pAL4404, pSB1)내로의 도입은 pGIGUP 및 pSB1의 공-통합을 초래한다. 이러한 플라스미드의 T-DNA는 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 만노오스-6-포스페이트 이소머라제 유전자를 함유하고 있어 만노오스를 대사시킬 수 있는 능력 뿐만 아니라 상기 기술된 티오레독신 유전자를 대사시킬 수 있는 능력을 제공한다.
아그로박테리움은 스텍티노마이신 50㎎/ℓ 및 테트라사이클린 10㎎/ℓ으로 보충된 YP 배지(효모 추출물 5g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 아가 15g/ℓ, pH 6.8) 상에서 3일 동안 성장시킨다. 상기 세균을 루프로 수집하여 109내지 5x 109세포/㎖의 밀도로 N6 액체 배지상에 현탁시킨다. 아그로박테리움 세포는 또한 YP 배지에서의 밤새 배양물로부터 수집하여 N6 액체 배지 상에 현탁시킬 수 있다.
옥수수 미성숙 배아는 자가수분 대략 10 내지 14일 후에 수득한다. 미성숙 접합체 배아는 플레이트 당 약 25개 미성숙 배아에서 배아발생 캘러스 형성을 유도하고 지지할 수 있는 배지를 함유하는 상이한 플레이트 상에서 분할시킨다.
미성숙 배아는 선택가능한 마커 유전자를 포함하는 Ti 플라스미드를 갖는 아그로박테리움과 함께 플레이트 상에 또는 액체상에 접종시킨다. 미성숙 배아는 아그로박테리움으로 접종하기 전 및 접종한 후 즉시 질산은(10㎎/ℓ)을 함유하는 캘러스 개시 배지 상에 플레이팅한다. 대략 25개 미성숙 배아를 각각의 플레이트 상에 위치시킨다. 접종 16 내지 72시간 후, 미성숙 배아를 질산은 및 세포탁심을 함유하는 캘러스 개시 배지로 옮긴다. 형질전환된 세포의 선택은 하기와 같이 수행한다: 만노오스는 시험관내 형질전환된 세포를 선택하는데 사용한다. 상기 선택은 접종 후 2 내지 20일까지는 1g/ℓ의 적은 양으로 적용시키고 전체 2 내지 12주 동안 유지시킬 수 있다. 이렇게 수득된 배아발생 캘러스는 표준 재생 배지 상에서 만노오스의 존재 또는 부재하에서 재생된다. 모든 식물을 만노오스에 대한 내성을 위한 클로로페놀 레드(CR) 시험으로 시험한다. 상기 분석법은 세포가 만노오스의 존재하에서 성장하는지를 나타내는 pH 감수성 표지 염료를 사용한다. 세포가 성장하면 배지내 pH 변화가 야기되며 지시약 클로로페놀 레드는 붉은색에서 황색으로 변한다. 만노오스에 내성을 나타내는 식물은 이러한 시험으로 용이하게 확인된다. CR 시험에 의해 포지티브인 식물은 만노오스 유전자의 존재에 대해서 PCR로 분석한다. PCR 시험에서 포지티브인 식물은 서던 블롯으로 분석한다.
재생된 식물은 티오레독신의 발현에 대해서 분석한다. 식물은 발생학적으로 정상적이다. 최고의 발현물로부터 유도된 자손 식물로부터의 옥수수 곡물을 소규모 습식 제분 방법으로 분석하고 전분 추출가능성을 티오레독신 이식된 유전자를갖지 않는 동일한 유전자형의 옥수수와 비교하여 측정한다. 티오레독신 유전자를 발현하는 옥수수는 동계 비-형질전환된 옥수수에 비해 습식 제분 방법에서 실질적으로 보다 큰 전분 이용가능성을 나타낸다.
실시예 2
열-안정성 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제를 사용한 옥수수의 형질전환
실시예 1에 기술된 방법을 사용하여, 옥수수를 메타노코커스 자나스치이로부터의 티오레독신(서열 번호 1) 및 티오레독신 리덕타제(서열 번호 6) 모두를 암호화하는 유전자들로 공-형질전환시킨다. 두 유전자 모두는 종자 특이적인 감마 제인 프로모터의 조절하에 있게 된다. 두 유전자를 pGIGUP 플라스미드의 좌 및 우측 경계 사이에 연결시켜 위치시킴으로써 두 유전자 모두가 단일 삽입물로서 식물의 염색체내로 도입될 가능성을 증강시킨다.
재생된 식물은 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제의 발현에 대해서 분석한다. 식물은 발생학적으로 정상적이다. 고발현물로부터 유도된 자손 식물로부터의 옥수수 곡물은 소규모 습식 제분 방법으로 분석하며 전분 이용가능성은 티오레독신/티오레독신 리덕타제 이식 유전자의 부재하의 동일한 유전형의 옥수수와 비교하여 측정한다. 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제 유전자를 발현하는 옥수수는 동계 비-형질전환된 옥수수에 비해 습식 제분 방법에서 실질적으로 보다 큰 전분 이용가능성을 나타낸다.
실시예 3
티오레독신 유전자의 클로닝 및 식물 형질전환 벡터의 작제
벼 및 밀 티오레독신-h cDNA(trx-h)는 각각, 벼 및 밀 발아된 종자로부터의 전체 RNA를 사용한 RT-PCR로 클로닝한다. trx cDNA의 증폭은 벼에 대해서는 프라이머 NMD109(5'-GGA TCC ACC ATG GCC GCC GAG GAG-3', 서열 번호 8) 및 NMD110(5'-GAG CTC TTA GGC AGA AGC AGA TG-3', 서열 번호 9), 및 밀에 대해서는 NMD102(5'-GGA TCC ACC ATG GCG GCG TCG G-3', 서열 번호 10) 및 NMD103(5'-GAG CTC TTA CTG GGC CGC GTG T-3', 서열 번호 11)을 사용하여 수득한다. 식물 발현 벡터내로 유전자를 클로닝하는데 필요한 적합한 제한 부위, 즉 5' 말단에서 BamHI 및 3' 말단에서 SacI의 삽입이 또한 상기 반응으로 달성된다. 정확한 크기의 PCR 생성물을 겔 정제시키고 Topo PCR 2.1 클로닝 벡터(제조원: Invitrogen)를 사용하여 클로닝한다. 정확한 삽입물을 함유하는 콜로니를 하기 제한 분석으로 서열분석한다. 벼 trx 서열은 Genbank 승인 번호 U92541로 공지된 것과 일치한다. 밀 cDNA 서열은 티. 애스티비움(T. aestivium)(Genbank 승인 번호 X69915)으로부터의 trx-h와 일치한다.
γ제인 프로모터의 클로닝: 673 bp γ제인 프로모터는 브라이언 라킨스 박사로부터 수득한 플라스미드 pGZ27.3으로부터 증폭시킨다. 상기 서열은 또한 오파크2 변형인자 5' 영역(opaque2 modifier 5' region)(Genbank 승인 번호 S78780) 뿐만 아니라 문헌[Marzabal et al. 1998. Plant J. 16: 41-52]과 정확하게 일치한다. γ제인 프로모터는 배유 특이성을 나타내었다[Torrent et al., (1997)Plant Mol. Biol. 34: 139-149].
pNOV3401: PMI 선택을 사용하는 아그로박테리움 형질전환 벡터 중 옥수수 유비퀴틴 프로모터 + 인트론-벼 trx-h-35S 종결인자:
벼 trx 유전자는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 + 인트론 및 35S 종결인자를 함유하는 식물 발현 벡터내에 클로닝시킨다. 수득되는 작제물 pNOV3400을 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 KpnI으로 절단시켜 아그로박테리움 형질전환 이원 벡터 카셋트 pNOV2117내로 서브클로닝시켜 pNOV3401을 수득한다.
pNOV3405: PMI 선택을 사용하는 아그로박테리움 형질전환 벡터 중 γ제인 프로모터-벼 trx-h-35S 종결인자.
pNOV3406: PMI 선택을 사용하는 아그로박테리움 형질전환 벡터 중 γ제인 프로모터-밀 trx-h-35S 종결인자.
벼 및 밀 trx-h 유전자 모두는 상기 기술된 γ제인 프로모터 및 35S 종결인자를 함유하는 식물 발현 벡터내로 클로닝된다. 수득되는 작제물은 HindIII 및 KpnI으로 절단하여 프로모터, 유전자, 종결인자 단위를 수득한 후 아그로박테리움 이원 벡터 pNOV2117내로 서브클로닝하여 각각, pNOV3405 및 pNOV3406을 수득한다. pNOV2117은 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 포스포만노오스 이소머라제의 유전자 + 인트론 및 NOS 종결인자를 갖는 이원 벡터이다.
pNOV3408: PMI 선택을 사용하는 아그로박테리움 형질전환 벡터 중 γ제인 시그날 서열-벼 trx-h-γ제인 3' 말단-35S 종결인자:
세포의 내막 시스템에 티오레독신을 표적화시키기 위해서, γ-제인 유전자의N 말단 및 C 말단으로부터의 시그날을 사용한다[Torrent et al. (1994) Planta 192: 512-518]. 돌연변이 유발 프라이머 NMD124A(5'-GAGCTCTTGA GCGCTAGCAG ATG-3' 서열 번호 12) 및 NMD125A(5'-GGATCCACCA GCGCTGCCGA-3', 서열 번호 13)를 사용한 PCR 돌연변이 유발에 의해서 제한 부위 Eco47AIII을 최초 ATG 이후 벼 티오레독신 유전자의 5' 말단에 삽입하고 제한 부위 NheI을 3' 말단에 삽입한다. 모든 돌연변이는 침묵 돌연변이다. 유전자를 topo PCR2.1 벡터내로 클로닝하고 서열분석한다. trx 단편을 제한 효소 Eco47AIII 및 NheI으로 절단하여 수득한다. 네 개의 올리고뉴클레오타이드를 γ제인 시그날 서열 및 C 말단을 암호화하도록 제조한다: NMD126(5'-GATCCACCAT GAGGGTGTTG CTCGTTGCCC TCGCTCTCCT GGCTCTCGCT GCGAGCGCCA CCAGC-3', 서열 번호 14); NMD127(5'-GCTGGTGGCG CTCGCAGCGA GAGCCAGGAG AGCGAGGGCA ACGAGCAACA CCCTCATGGT G-3', 서열 번호 15); NMD128(5'-CTAGCGCTCT GCAGCAGCCG ACTCCATGCC CCTACGCTGC TGCCGGCGGT GTCCCCCACT GAGAGCT-3', 서열 번호 16); 및 NMD129(5'-CTCAGTGGGG GACACCGCCG GCAGCAGCGT AGGGGCATGG AGTCGGCTGC TGCAGAGCG-3', 서열 번호 17). 올리고 쌍 NMD 126 및 127, 및 NMD 128 및 129를 하이브리드화시키고 표준 프로토콜에 따라서 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화시킨다. 이들 두 개의 하이브리드화된, 키나제 처리된 올리고 쌍들을 상기 기술된 Eco47AIII, NheI 절단된 trx 및 γ제인 프로모터 및 35S 종결인자를 함유하는 식물 발현 벡터 카셋트와 함께 4가지 방식으로 연결 반응으로 연결시킨다. 수득된 작제물을 HindIII 및 KpnI으로 절단하여 프로모터, 유전자 및 종결인자 단위를 수득하여 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 선택가능한 마커포스포만노오스 이소머라제(PMI) 유전자를 함유하는 아그로박테리움 이원 벡터 pNOV2117에 서브클로닝하여 pNOV3408을 수득한다.
pNOV3401, pNOV3405, pNOV3406 및 pNOV3408을 아그로박테리움 균주 LBA4404(pSB1)내로 형질전환시키고 안정한 옥수수 형질전환을 위해 사용한다.
아라비돕시스 티오레독신 리덕타제는 시험관내에서 벼 티오레독신을 환원시키는데 활성인 것으로 확인되었다. 따라서, 옥수수 최적화된 NTR 유전자가 작제된다.
실시예 4
옥수수 최적화된 아라비돕시스 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제 유전자의 작제
아라비돕시스 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제 유전자(NTR)은 35kD 단백질이다. 합성 유전자를 디자인하기 위해서, NTR 유전자(Genbank 승인 번호 # Z23109)의 추론된 펩타이드 서열을 옥수수 선호 코돈 표를 사용하는 위스콘신 대학교 GCG 그룹의 프로그램에서 확인되는 "역해독" 프로그램을 사용하여 역해독시킨다[Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-498]. "옥수수 최적화된" 서열은 추가로 클로닝을 촉진시키기 위한 유일한 부위들을 삽입하도록 변형된다. 상기 유전자는 세 개의 부분들로 클로닝되도록 디자인된다. 각각의 단편은 유전자의 두 쇄 모두를 나타내는 60 내지 75개 길이의 뉴클레오타이드의 올리고머 8 내지 10개 쌍의 하이브리드화에 의해서 작제된다. 정확한 배향과 조립을 위해서 연속적인 올리고 쌍 사이에 15개 뉴클레오타이드 중복부를 디자인한다. 올리고들은 공급원(Genosys Inc., Texas)에 의해 합성된다. 유전자의 단편 1(뉴클레오타이드 1 내지 305에 상응함)은 Taq 폴리머라제 및 공급원에 의해 추천된 표준 조건, 주형으로서 8개 올리고머의 등몰량 혼합물, 및 프라이머 STRF1A(5'-ggATCCACCA TgAACggCCT ggAg-3', 서열 번호 18) 및 STRF1B(5'-CTCgAgAAgT CCACCTTggT CAC-3', 서열 번호 19)를 사용하여 PCR로 305bp 단편을 증폭시켜 작제한다. 유전자의 제2 단편은 주형으로서 10개 올리고머의 등몰량 혼합물 및 프라이머 STRF2A (5'-CTCgAgCAAg CCgTTCAA-3', 서열 번호 20) 및 STRF2B ( 5'-gACgTCgATC TTCgggTTgg A-3', 서열 번호 21)를 사용하여 PCR로 346bp 단편(뉴클레오타이드 299 내지 645)을 증폭시켜 작제한다. 유전자의 제3 단편은 주형으로서 10개 올리고머의 등몰량 혼합물 및 프라이머 STR3A (5'-CgACgTCATC TggAACTCCT-3', 서열 번호 22) 및 STR3B (5'-gAgCTCAgAT CTAgTCggAC TTg-3', 서열 번호 23)를 사용하여 PCR에 의해 382bp 단편(뉴클레오타이드 639 내지 1021)을 증폭시켜 작제한다. 각각의 단편에 대한 증폭된 DNA는 topo PCR2.1T 벡터(제조원: Invitrogen)내로 클로닝한다. 정확한 서열을 갖는 유전자 단편들은 중복 제한 엔도뉴클레아제 부위 XhoI 및 AatlI을 사용하여 연결시킨다. 옥수수 최적화된 아라비돕시스 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제 암호화 서열은 서열 번호 24에 나타내며 암호화된 아미노산 서열은 서열 번호 25에 나타낸다. 완전한 서열을 작제하고 서열분석한 후 γ제인 프로모터 및 35S 종결인자를 함유하는 식물 발현 벡터 카셋트내로 서브클로닝한다. 이후, 프로모터, 유전자, 종결인자 단위는 단독으로 및 벼 및 밀 티오레독신 유전자와 함께 아그로박테리움 옥수수 형질전환 벡터내로 서브클로닝시킨다.
실시예 5
벼 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제(NTR) 유전자
벼 NADPH 의존성 티오레독신 리덕타제(NTR) 암호화 서열을 서열 번호 26에 나타내며 상응하는 아미노산 서열을 서열 번호 27에 나타낸다.
실시예 6
상기 기술된 아라비돕시스 NTR 및 벼 서열의 배열
배열된 서열
참조 분자: arab trPG(서열 번호 25), 1 내지 1002(334 aa)
서열 2: TRCONAA.TXT(서열 번호 27), 1 내지 310(310 aa)
상동성 70%
배열 유형: 구형 단백질
변수: 불일치 2; 오픈 갭 4; 신장 갭 1; 보존적 N
실시예 7
식물 형질전환 벡터
pNOV4100-PTX5'-At PPO-35ST' 및 Ubq3 (At)-인트론-NOS 벡터:
PBH28(아라비돕시스 Ubq3int-NOS)은 EcoRI으로 절단하고 4756bp 밴드를 절단하여 클레나우로 보충한 후, HindIII로 절단하여 2386bp 밴드를 분리하여 클레나우로 보충시킨 pCTK2(PTX5'-AtPPO-35ST)에 결합시킨다. pNOV4100은 PTX5', AtPPo, 35ST', amp, Ubq3(At) 인트론 NOS를 함유한다. 연접부를 서열분석한다.
pNOV4101- PPO 벡터 pNOV4100 중 β콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터-대두 티오레독신-NOS:
pNOV4100을 HindIII 및 SacI으로 절단한다. 대두 β-콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터(Genbank 승인 번호 # M13759)는 대두 잎 게놈 DNA 및 올리고 P9(5'-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3', 서열 번호 28) 및 P10(5'-gctttt ccc aat acg caa tgc-3', 서열 번호 29)을 사용하여 PCR로 클로닝한다[Sylvain et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19: 937-949]. 이러한 PCR 생성물을 pCR2.1 TOPO 벡터내로 클로닝하고 서열분석한다. 상기 작제물을 올리고 P4(5'-gac tag cgc tga cag aaa ctg atg cta gga a-3', 서열 번호 30) 및 P9(5'-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3', 서열 번호 28)를 사용하는 PCR에서 주형으로서 사용한다. HindIII 및 Eco47III을 사용하여 절단한다. 대두 티오레독신은 대두 발아된 종자로부터의 전체 RNA 및 올리고 P1(5'-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggt tgt c-3', 서열 번호 31) 및 P2(5'-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3', 서열 번호 32)를 사용하여 RT-PCR에 의해서 클로닝된다. PCR 생성물을 pCR2.1 TOPO 벡터내로 클로닝한 후 서열분석한다. 상기 작제물을 올리고 P2(5'-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3', 서열 번호 32) 및 P5(5'-gac tag cgc tga aga ggg tca ggt tgt cg-3', 서열 번호 33)를 사용하는 PCR에서 주형으로서 사용한다. Eco47III 및 SacI으로 절단한다. 상기 세 개의 단편을 사용하여 세 가지를 연결시키고, 서열을 확인한다.
pNOV4102 - PPO 벡터 pNOV4100 중 β-콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터-대두 티오레독신-담배 키티나제 액포 시그날 서열-NOS. pNOV4100을 HindIII 및 SacI로 절단한다. 대두-β콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터는 대두 잎 게놈 DNA 및 올리고 P9(5'-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3', 서열 번호 28) 및 P10(5'-gct ttt ccc aat acg caa tgc-3', 서열 번호 29)을 사용하여 PCR에 의해 클로닝한다. 상기 PCR 생성물을 pCR2.1 TOPO 벡터내로 클로닝하고 서열분석하였다. 이러한 작제물을 올리고 P4(5'-gac tag cgc tga cag aaa ctg atg cta gga a-3', 서열 번호 30) 및 P9(5'-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3', 서열 번호 28)를 사용하는 PCR에서 주형으로 사용한다. HindIII 및 Eco47III을 사용하여 절단한다. 대두 티오레독신(Genbank 승인 번호 # AI441505)을 대두 발아된 종자로부터의 전체 RNA 및 올리고 P1(5'-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggt tgt c-3', 서열 번호 31) 및 P2(5'-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3', 서열 번호 32)를 사용하여 RT-PCR로 클로닝시킨다. 상기 PCR 생성물을 pCR 2.1 TOPO 벡터내로 클로닝하고 서열분석한다. 이러한 작제물은 올리고 P2(5'-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3', 서열 번호 32) 및 P5(5'-gac tag cgc tga aga ggg tca ggt tgt cg-3', 서열 번호 33)를 사용한 PCR에서 주형으로서 사용한다. Eco47III 및 SacI으로 절단한다. 상기 세 가지 단편들을 사용하여 세 가지를 연결시키고, 서열을 확인한다.
pNOV4103 - PPO 벡터 pNOV4100 중 β 콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터 + β 콘글리시닌의 프로펩타이드 부분-대두 티오레독신-NOS. 대두 β 콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터 + β 콘글리시닌의 프로펩타이드 부분을 대두 잎 게놈 DNA 및 올리고 P9(5'-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3', 서열 번호 28) 및 P12(5'-cag tag gct taa gga ggt tgc aac gag-3', 서열 번호 34)를 사용하여 PCR에 의해 클로닝시키고, 상기 단편을 pCR 2.1 TOPO내로 클로닝시킨다. 상기 작제물(12-4-4)를 StuI 및 SacI으로 절단하고 대두 티오레독신을 상기 벡터내로 클로닝시킨다. 대두 티오레독신에 대한 제한 부위를 올리고 P2(SacI)(5'-cgt agagct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3', 서열 번호 32) 및 P11(PvuII)(5'-cag tca gct gaa gag ggt cag gtt gtc-3', 서열 번호 35)을 사용하여 PCR로 변형시킨다. 이로써 A-6으로 명명된 pCR 2.1 TOPO내 β 콘글리시닌 프로모터 + 프로펩타이드 + 티오레독신을 생산한다. A-6 및 pNOV4100을 HindIII 및 SacI으로 절단한다. A-6으로부터의 1459bp 단편을 pNOV4100에 연결시킨다.
pNOV4104 - PPO 벡터 pNOV4100 중 β콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터 + β 콘글리시닌의 프로펩타이드 부분-대두 티오레독신-담배 키티나제 액포 시그날 서열-NOS. pCR 2.1 TOPO(12-4-4) 중 대두 β콘글리시닌 프로모터 + 프로펩타이드를 StuI 및 SacI로 절단한다. PCR 단편은 P11(5'-cag tca gct gaa gag ggt cag gtt gtc-3', 서열 번호 35) 및 P17(5'-cta gga gct cta cat ggt gtc cac cag cag-3', 서열 번호 36), 및 주형 BTC4(대두 티오레독신 및 담배 키티나제 액포 시그날 서열을 함유하는 pBluescript)를 사용하여 생성한다. 상기 단편을 PvuII 및 SacI으로 절단하고, StuI-SacI 단편과 함께 연결시킨다. 이로써, A3-10(β 콘글리시닌 프로모터 + 프로펩타이드-대두 티오레독신-tob. 키티나제 vac. 시그날 서열을 갖는 pCR 2.1 TOPO)이 생성된다. A3-10 및 pNOV4100을 HindIII 및 SacI으로 절단하고 연결시킨다.
pNOV4105-Ubq3(At)-인트론-담배 키티나제 ER 시그날 서열-NOS 및 PTX5'-AtPPO-35ST'. pNOV4105 = BamHI 및 PstI을 사용한 pNOV4100 절단물의 BamHI 및 PstI을 사용한 pCIB 8418 절단물로부터의 담배 키티나제 ER 시그날 서열에 대한 결합물. 상기 벡터는 담배 키티나제 ER 시그날 서열과 Ubq3 프로모터 및 인트론을함유한다.
pNOV4106 - PPO 벡터 pNOV4105 중 Ubq3(At)-인트론-담배 키티나제 ER 시그날 서열-대두 티오레독신-담배 키티나제 액포 시그날 서열-NOS. pNOV4105 및 pNOV4102를 Eco47III 및 SacI으로 절단한다. pNOV4102로부터의 387bp를 절단된 pNOV4105에 연결시킨다.
pNOV4107 - PPO 벡터 pNOV4105 중 Ubq3(At)-인트론-담배 키티나제 ER 시그날 서열-대두 티오레독신-NOS. pNOV4105 및 pNOV4101를 Eco47III 및 SacI로 절단한다. pNOV4101로부터의 360bp 밴드를 절단된 pNOV4105에 연결시킨다.
pNOV4108 - 이원 벡터 pCIB200 중 β 콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터-대두 티오레독신-담배 키티나제 액포 시그날 서열-NOS. pCIB200을 XbaI으로 절단하고 클레나우로 보충시킨다. pNOV4101을 HindIII 및 KpnI으로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활말단화시키고 절단된 pCIB200에 1626bp 밴드를 연결시킨다.
pNOV4109 - 이원 벡터 pCIB200 중 β 콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터 + β 콘글리시닌의 프로펩타이드 부분-대두 티오레독신-NOS. pCIB200을 XbaI으로 절단하고 클레나우로 보충한다. pNOV4103을 HindIII 및 KpnI으로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활말단화시킨 후 1748bp 밴드를 절단된 pCIB200에 연결시킨다.
pNOV4110 - β 콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터-대두 티오레독신-NOS. pCIB200을 XbaI으로 절단하고 클레나우로 보충한다. pNOV4102를 PvuII 및 KpnI으로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활말단화시키고 1843bp 밴드를 절단된 pCIB200에 연결시킨다.
pNOV4111 - 이원 벡터 pCIB200 중 β 콘글리시닌 α' 서브유니트 프로모터 + β 콘글리시닌의 프로펩타이드 부분-대두 티오레독신-담배 키티나제 액포 시그날 서열-NOS. pCIB200을 XbaI으로 절단하고 클레나우로 보충시킨다. pNOV4104를 PvuII 및 KpnI으로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활말단화시키고 1969bp 밴드를 절단된 pCIB200에 연결시킨다.
pNOV4112 - 이. 콜라이 단백질 발현 벡터 pET29a 중 대두 티오레독신. 대두 티오레독신은 대두 발아된 종자로부터의 전체 RNA 및 올리고 P1(5'-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggt tgt c-3', 서열 번호 31) 및 P2(5'-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3', 서열 번호 32)를 사용하여 RT-PCR로 클로닝시킨다. 상기 PCR 생성물을 BamHI 및 SacI으로 절단하고 BamHI 및 SacI으로 절단시킨 pET29a내로 클로닝시킨다. 서열을 확인한다.
pNOV4113 - 이. 콜라이 단백질 발현 벡터 pET29a내 벼 티오레독신. pNOV3400을 BamHI 및 SacI으로 절단하고, 벼 티오레독신 (378bp)를 BamHI 및 SacI으로 절단시킨 pET29a내로 클로닝시킨다. 서열을 확인한다.
pNOV4114 - 이. 콜라이 단백질 발현 벡터 pET29a 중 밀 티오레독신. pNOV3406을 BamHI 및 SacI으로 절단하고, 밀 티오레독신(387bp)을 BamHI 및 SacI으로 절단시킨 pET29a내로 클로닝시킨다. 서열을 확인한다.
pNOV4115 - 이. 콜라이 단백질 발현 벡터 pET29a 중 아라비돕시스 NADPH 티오레독신 리덕타제. 아라비돕시스 NADPH 티오레독신 리덕타제(Genbank 승인 번호 # Z23109)를 RT-PCR로 클로닝시킨다. 전체 RNA를 트리졸(Trizol, 제조원: GibcoBRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 아라비돕시스 잎으로부터 분리시킨다. 전체 RNA 1㎍을 Superscript one step RT-PCR 시스템(제조원: GibcoBRL, Gaithersburg, MD)에서 사용하여 1 단계로 cDNA 및 PCR 생성물을 생성시킨다. 프라이머 P28(5'-ctc att ctg gtc cat caa tgt c-3', 서열 번호 37) 및 P29(5'-ctc att ctg gtc cat caa tgt c-3', 서열 번호 38)를 상기 반응에서 사용한다. 제조업자의 프로토콜을 따른다. 수득되는 PCR 생성물을 1:10으로 희석하고 1㎕를 프라이머 P26(5'-gac tgt cga ctc aat cac tct tac ctt gct gag-3', 서열 번호 39) 및 P31(5'-gac tgg atc caa tgg tct cga aac tca caa c-3', 서열 번호 40)과 함께 네스티드 PCR 반응에서 사용한다. 네스티드 PCR 생성물(998bp)을 겔 정제하고, BamHI 및 SacI으로 절단하여 BamHI 및 SacI으로 절단된 pET29a내로 클로닝시킨다. 서열을 확인한다. pNOV4109 - pCIB200을 XbaI으로 절단하고 클레나우로 보충시킨다. pNOV4103을 HindIII 및 KpnI으로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활말단화시킨 후 1748bp 밴드를 절단된 pCIB200내로 연결시킨다. 상기 작제물을 대두에서의 일시적인 발현 분석 뿐만 아니라 아라비돕시스 및 티오레독신과 관련된 다른 쌍자엽 식물의 안정한 형질전환에 사용한다.
pNOV4101, pNOV4102, pNOV4103, pNOV4104, pNOV4106, 및 pNOV4107은 대두 떡잎에서의 일시적인 발현 실험에서 사용된다.
티오레독신의 발현은 웨스턴 블롯 분석으로 분석된다.
pNOV4108, pNOV4109, pNOV4110, 및 pNOV4111은 안정한 아라비돕시스 형질전환 실험에서 사용된다. 티오레독신의 발현은 웨스턴 블롯 분석으로 분석된다. 발현시 티오레독신 효과 및 종자 특이적인 단백질의 활성을 시험한다. pNOV4112, pNOV4113 및 pNOV4114는 각각, 이. 콜라이 발현 벡터 pET29a(제조원: Novagen) 중 대두, 벼 및 밀 trx-h 유전자를 함유하는 작제물이다. 이들 작제물을 사용하여항체 제조 및 정제를 위한 티오레독신 단백질 뿐만 아니라 티오레독신 효소 분석법의 표준으로서의 티오레독신을 제조한다.
실시예 8
단백질 발현 및 정제
하기 작제물들을 사용하여 이. 콜라이에서 단백질 발현시킨다: pNOV4112(pET29a 중 대두 티오레독신), pNOV4113(pET29a 중 벼 티오레독신), pNOV4114(pET29a 중 밀 티오레독신) 및 pNOV4115(pET29a 중 아라비돕시스 티오레독신 리덕타제). 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) pLysS를 각각의 작제물로 형질전환시킨다. LB 배지 중 글리세롤 스톡으로부터의 분취액, 카나마이신 50㎍/㎖, 클로람페니콜 34㎍/㎖를 함유하는 배양물을 600㎚에서의 광학밀도가 0.6으로 측정될 때까지 37℃에서 성장시킨다. 상기 배양물을 다음날까지 4℃에서 저장한다. 이들 배양물을 원심분리시키고 세포를 신선한 LB에 재현탁시킨다. 대량 배양은 대량 배양물 25㎖ 당 소량 배양물 1㎖를 사용하여 개시한다. 세포를 카나마이신 50㎍/㎖, 클로람페니콜 34㎍/㎖를 함유하는 LB 배지에서 600㎚에서의 광학 밀도가 0.6에 도달할때까지 37℃에서 성장시킨다. IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드)를 최종 농도 0.4mM로 부가하여 단백질 발현을 유도시킨다. 배양물을 37℃에서 3시간 동안 추가로 성장시킨다. 배양물을 3000g에서 10분 동안 원심분리시키고 세포를 배양물용적의 1/25에 상당하는 양을 사용하여 BugBuster(제조원: Novagen, Madison, WI)에 재현탁시킨다. BugBuster 1㎖ 당 Dnase 1 단위를 부가한다. 세포를 밤새 -20℃에서 위치시킨다. 세포를 해동시키고 실온에서 30분 동안 항온처리한다. 세포 분쇄물을 4℃에서 14,000g로 20분 동안 원심분리하여 제거한다.
발현된 단백질은 5' 말단에서 S-Tag(15개 아미노산) 및 트롬빈 절단 부위(6개 아미노산)을 함유하는 융합 단백질이다. cDNA의 5' 말단 클로닝 부위로서 BamHI 부위를 사용하여, 부가적인 31개 아미노산을 관심 대상의 단백질의 5' 말단에 부가한다.
융합 단백질을 친화도 크로마토그래피로 정제한다. 단백질 추출물을 S-단백질 아가로오스 슬러리(제조원: Novagen, Madison, WI)에 부가한다. 필요한 S-단백질 아가로오스의 양은 발현되는 융합 단백질의 양이 가변적이기 때문에 각각의 실험에서 결정된다. 생산량은 수지 1㎖ 당 정제된 단백질 0.5㎎이다. 제조업자의 프로토콜에 따른다. S-Tag를 제거하기 위해서, S-Tag 트롬빈 정제 키트(제조원: Novagen, Madison, WI)를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용한다.
실시예 9
항체 생산
대두 티오레독신 항체 생산: 대두 티오레독신은 S-단백질 아가로오스를 사용하는 친화도 크로마토그래피로 정제하며 S-Tag는 상기 기술된 바와 같이 제거한다. 오염된 단백질이 제조중에 존재하기 때문에, 단백질을 4 내지 20% 트리스-글리신 겔(제조원: Novex, San Diego) 상에서 전기영동하고 대두 티오레독신 밴드를 겔로부터 절단한다. 겔 슬라이스를 표준 공정 방법 CG1 "Polyclonal Antibody Production in Rabbits, Sheeps & Goats"에 따라서 염소에서 항체 생산을 위해서 회사(Duncroft, Inc., Lovettsville, VA)에 제공한다.
벼 티오레독신-특이적 항체 정제: 벼 티오레독신은 S-단백질 아가로오스(제조원: Novagen, Madison, WI)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 친화도 정제한다. S-Tag는 제거하지 않는다.
Affi-Gel-10 컬럼의 제조: 정제된 벼 티오레독신(1㎎)을 0.1M NaHCO3, pH 8.3 2ℓ에 대해서 5시간 동안 투석하고 제조원의 지침에 따라서 Bio-rad Affi-Gel 10 겔에 커플링시킨다. 간략하면, Affi-Gel 10 슬러리 대략 2㎖를 진공으로 부착된 유리 프릿된 깔때기로 옮기고, 용매를 제거하고, 겔을 빙냉시킨 dH2O(적어도 3 베드 용적)로 2회 세척한다. 이후, 습한 겔 케이크를 투석된 벼 티오레독신을 함유하는 튜브내로 옮기고 회전 휠 상에서 밤새 4℃에서 항온처리한다. 모든 점유되지 않은 활성 부위를 차단하기 위해서, 1M 에탄올아민 HCl(pH 7.0) 0.1㎖를 겔에 부가하고 4℃에서 1시간 동안 회전시킨다. 이후, 겔을 컬럼으로 옮기고, PBS로 세척하고 0.1M 글리신-HCl pH 2.5(0.4㎖)로 예비 용출시키고 PBS로 평형시킨다. 최종 컬럼 용적은 0.8㎖이다. 사용하지 않는 경우, 컬럼을 0.2% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS 중에서 4℃에서 보관한다.
벼 티오레독신-특이적 항체의 정제: 대두 티오레독신 염소 항혈청은 벼 티오레독신의 Affi-Gel 10 컬럼을 사용하여 면역친화적으로 정제한다. 각각의 실시에서, 혈청 2㎖를 중력에 의해 컬럼 상에 충전시킨다. 컬럼을 A280이 < 0.015가 될 때까지 PBS로 세척한 후 0.1M 글리신-HCl pH 2.5 0.4㎖로 용출시킨다. 분획물(1㎖)을 수집하고 0.5M 트리스 pH 8.5 50㎕로 중화시킨다. 0.05 이상의 A280을 갖는 분획물을 모은다.
실시예 10
티오레독신 분석
인슐린 환원 분석법 - [Arne Holmgren (1979) J. Biol. Chem. 254: 9627-9632]. 상기 분석법에서, DTT(디티오트레이톨)은 티오레독신을 환원시킨다. 이후, 환원된 티오레독신은 인슐린내 이황화 결합을 환원시켜 백색 침전물의 형성을 야기한다. 침전율은 650㎚에서 기록된다. 인슐린(0.1M 인산칼륨 중 1㎎/㎖, pH 6.5), 2mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 및 100mM DTT의 신선하게 제조된 용액을 얼음 위에서 유지시킨다. 분석 혼합물을 큐빗내에서 제조한다. 각각의 큐빗은 1㎎/㎖ 인슐린 750㎕, DTT 3.3㎕ 및 최종 용적 1㎖를 형성하는 물을 함유한다. 블랭크는 티오레독신을 함유하지 않으며, 샘플은 다양한 양의 티오레독신(분석을위한 최소량은 10㎕이다)을 함유한다. 샘플을 제조하고 실온에서 최소한 20분 동안 항온처리한 후 650㎚에서 광학 밀도를 판독한다.
DTNB[5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)] 분석 - [Oblong et al. (1993) Biochemistry 32: 7271-7277]. 상기 분석법에서, 티오레독신 리덕타제 및 NADPH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트)를 사용하여 티오레독신을 환원시킨 후 이는 DTNB를 환원시킨다. 412㎚에서의 광학 밀도 변화를 4분 마다 모니터링한다. DTNB(DMSO 즉 디메틸 설폭사이드 중 100mM), NADPH(H2O 중 20mM) 및 완충액 100mM 트리스 pH 8.0, 0.1㎎/㎖ BSA의 신선하게 제조된 용액이 필요하다. 분석 혼합물을 큐빗에서 제조한다. DTNB 10㎕, NADPH 10㎕, 티오레독신 5㎕, 아라비돕시스 또는 이. 콜라이 티오레독신 리덕타제 2㎍ 및 최종 용적 1㎖를 형성하는 완충액을 큐빗에 부가한다. 티오레독신이 부가된 직후, 뒤집어 혼합하고 즉시 412㎚에서의 광학 밀도 변화를 측정한다. 이는 느린 반응이다. Y-축은 0에서 0.5A로 세팅되어야 한다. 블랭크는 어떠한 티오레독신도 함유하지 않는다.
실시예 11
옥수수의 아그로박테리움-매개된 형질전환
형질전환 색소체 및 선택가능한 마커: 형질전환에 사용되는 유전자는 옥수수 형질전환에 적합한 벡터내로 클로닝된다. 사용되는 벡터는 만노오스를 사용하여 형질전환된 세포를 선택할 수 있게 하는 포스포만노오스 이소머라제(PMI) 유전자를함유한다.
아그로박테리움 투메패시언스의 제조: 식물 형질전환 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 균주 LBA4404(pSB1)을 적합한 항생제(스펙티노마이신 100㎎/ℓ, 테트라사이클린 10㎎/ℓ)를 함유하는 YEPC[효모 추출물 5g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, CaCl2ㆍ2H2O 1.029g/ℓ] 고체 배지 상에서 28℃에서 2 내지 4일 동안 성장시킨다. 대략 0.75 x 108개 아그로박테리움을 100μM 아세토시링곤[Negrotto et al., (2000) Plant Cell Rep(인쇄중): 0.1 x 포스페이트로 변형됨]으로 보충된 LS 변형된 액체 감염 배지 상에 현탁시킨다. 세균을 상기 배지에서 0.5 내지 2시간 동안 예비 유도한 후 사용한다. 세균 농도는 660㎚에서 측정하고 광학 밀도를 대략 0.75로 조정한다.
접종: 8 내지 9일령 이삭으로부터 A188, Hi-II 또는 A188 X Hi-II로부터의 미성숙 배아를 절개하여 100μM 아세토시링곤으로 보충된 LS 변형된 액체 감염 배지를 함유하는 1.5㎖ 원심분리 튜브내로 직접적으로 넣는다. 전체 절개 시간은 30분이다. 배아를 5초 동안 볼텍싱하고 정착시켜 감염 배지를 제거한다. 신선한 감염 배지를 부가한다. 튜브를 수욕 상에 위치시킴으로써 배아를 45℃에서 5분 동안 열 쇼크 처리한다. 감염 배지를 제거하고 아그로박테리움 용액으로 교체한다. 배아를 30초 동안 볼텍싱하고 5분 동안 세균과 함께 정착시킨다. 세균/배아 용액을 고화된 500μM 아세토시링곤으로 보충된 LS 변형된 감염 배지[Negrotto et al. ibid: 0.1 X 포스페이트로 변형됨] 상에 붓는다. 세균 용액을 조심스럽게 피펫으로 뽑아 배아를 플레이트의 깨끗한 절편으로 옮긴다. 배아를 배반(scutellum) 표면 위에 위치시키고 22℃에서 2 내지 3일 동안 공배양시킨다.
형질전환된 세포 선택 및 형질전환된 식물의 재생: 공배양 후, 배아를 캘러스 형성 개시를 위해서 AgNO3및 티카르실린 200㎎/ℓ로 보충된 JMS 배지[Suttie et al., (1991) 3rdInternational Congress Molecular Biology of Plant Growth and Development Poster #905] 상에 위치시킨다. 티카르실린은 모든 후속 배지에서 사용된다. 28℃에서 암실 배양 10일 후, 배아생성 캘러스의 형성이 개시된다. 캘러스를 선택을 위해서 은 비함유 및 만노오스 10g/ℓ, 슈크로오스 5g/ℓ를 함유하는 JMS 배지로 옮긴다. 2 내지 3주 후, 생존하는 캘러스를 신선한 선택 배지로 옮긴다. 2 내지 3주 후, 생존 캘러스를 재생을 위해서 슈크로오스 20g/ℓ, 만노오스 5g/ℓ, 안시미돌 0.25㎎/ℓ, 키네틴 0.5㎎/ℓ, 및 KH2PO4170㎎/ℓ로 보충된 MSAK + PO4배지[Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473-439]로 옮긴다(28℃, 암실, 10 내지 14일). 캘러스를 신선한 MSAK + PO4배지로 옮기고 광(16시간 광/8시간 암) 조건으로 옮긴다. 1주 후, 재생하는 슈트(shoot)를 슈크로오스 20g/ℓ 및 만노오스 5g/ℓ로 보충된 호르몬 비함유 MS 배지로 옮긴다. 뿌리를 내린 슈트를 추가의 성장을 위해서 Plant Preservative MixtureTM10㎖/ℓ 및 슈크로오스 10g/ℓ로 보충된 0.75 농도의 MS 배지를 갖는 MagentaTMGA-7 박스내로 옮긴다. 분석은 GA-7 박스로부터 직접적으로 식물에 대해서 또는 토양으로 옮긴 식물에 대해서 수행한다.
실시예 12
대두 떡잎 일시적인 발현 시스템
S3911 노바티스 육종주의 멸균 종자를 16/8 광주기로 25℃에서 6일 동안 MS 고체 배지에서 플레이트 당 5개로 발아시킨다. 떡잎을 이식편으로 잘라 1 내지 2㎜ 정육면체로 절편화시킨다. 한쌍의 떡잎으로부터의 정육면체를 BAP 1㎎/ℓ 및 NAA 0.5㎎/ℓ를 갖는 MS 배지를 함유하는 페트리 디쉬의 중심에서 직경 1 내지 2㎝로 원형으로 배열한다. 조직을 DuPont 매뉴얼에 따라 PDS-1000 헬륨 총으로 폭격한다. 각각의 플레이트를 1550 psi 파열 디스크를 사용하여 2회 폭격한다. DNA를 갖는 금 미세담체를 매뉴얼에 따라 제조한다. 선택된 플라스미드 DNA 0.6㎍을 각각의 미세담체에 도포시킨다. 스테인레스 스틸 스크린을 사용하여 쇼크 파를 방지한다. 폭격 후, 플레이트를 25℃, 16/8 광 주기내로 복귀시킨다. 제1 샘플링은 48시간째에 수행한다.
실시예 13
pNOV3401로 형질전환시킨 유전자이식 식물의 분석
A. PCR:
샘플을 GA-7 박스내 유전자이식된 식물로부터 확보한다. DNA를 제조업자의 지침에 따라서 96웰 형태의 Gentra DNA 추출 키트를 사용하여 추출한다. PCR은Jumpstart Redtaq Readymix(제조원: Sigma) 및 각각 최종 농도 2.5μM로 프라이머 Thiorodoxubi 1603(5'-GCGGTCGTTC ATTCGTTCTA-3', 서열 번호 41) 및 Thiorodox 2364(5'-ACGTGCTTCA CGATGGTGTT-3', 서열 번호 42)를 사용하여 수행한다. PCR로 확인된 티오레독신 유전자를 함유하는 유전자이식된 식물을 온실로 옮긴다.
B. 유전자이식된 식물로부터의 티오레독신 RNA에 대한 노던 블롯 분석에 의한 분석:
전체 RNA를 문헌[Lagrimini et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 7542-7546]에 기술된 방법에 의해서 유전자이식된 식물의 잎 및 종자 조직으로부터 제조한다. 프로브를 완전한 벼 trx-h 유전자로부터 제조한다. 플라스미드 pNOV3401을 BamHI-SacI으로 절단하여 327bp 단편을 수득하고 이를 겔 정제한 후 랜덤 프라이머 표지화 키트(제조원: Life Technologies Inc.)를 사용하여32P α-CTP로 표지한다.
대표적인 유전자이식 식물로부터의 잎 및 종자 RNA의 노던 블롯 분석은 잎 및 종자 조직에서 티오레독신 mRNA의 발현을 나타낸다.
C. 유전자이식된 식물로부터의 티오레독신 단백질 분석:
옥수수 잎 샘플의 단백질 추출 및 웨스턴 분석: 에펜도르프 뚜껑 크기의 작은 원을 각각의 잎 샘플로부터 압인한다. 조직을 에펜도르프 튜브내에 위치시키고드라이 아이스에서 동결시킨다. 작은 막자를 사용하여 에펜도르프내에서 상기 조직을 분쇄시킨다. 100mM 트리스 pH 8.0 400㎕를 분쇄시킨 조직에 부가하고, 샘플을 실온에서 30분 동안 회전시킨 후 원심분리시키고 추출물을 회수한다. 모든 샘플을 3000MW 컷오프를 갖는 센트리콘(centricon)을 사용하여 농축한다. 각각의 샘플 12.5㎕를 트리스-글리신-SDS(24mM 트리스, 52mM 글리신, 1% 나트륨 도데실 설페이트) 전기영동 완충액을 사용하여 16% 트리스-글리신(제조원: Novex, San Diego, CA) 미니 겔 상에서 전기영동하고, 단백질을 PVDF로 옮긴다. 블롯은 TBS-2% 트윈(TBS-150mM NaCl, 30mM 트리스, pH 10.2)으로 실온에서 15분 동안 차단시키고, 밤새 4℃에서 TBS-0.05% 트윈 1㎖ 당 벼 티오레독신 항체(염소 항-대두 티오레독신으로부터 친화도 정제됨) 1㎎과 함께 항온처리한다. 상기 블롯을 5분 동안 TBS-0.05% 트윈으로 3회 세척하고, TBS-0.05% 트윈 1㎖ 당 HRP(서양고추냉이 퍼옥시다제) 래빗 항-염소 IgG 50ng과 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, TBS-0.05% 트윈으로 세척하고, 실온에서 5분 동안 슈퍼시그날 웨스트 펨토 화학형광 기질(제조원: Pierce, Rockford, IL)과 함께 항온처리한다. 블롯을 필름에 대해 위치시키고 30초 동안 노출시킨다.
단백질 추출 및 옥수수 종자 샘플의 웨스턴 블롯: 각각으로부터 하나의 종자를 반으로 나누고, 그중 하나를 드라이 아이스에서 동결시키고 막자사발 및 막자로 분쇄시키고, 이에 트리스 pH 8.0 1.5㎖를 부가하고 회전과 함께 30분 동안 실온에서 항온처리한다. 샘플을 원심분리시키고 각각으로부터 단백질 추출물을 10,000 MW 컷오프를 갖는 센트리콘을 사용하여 농축한다. 각각의 샘플 12.5㎕를 16% 트리스-글리신 겔(잎 샘플과 동일한 조건) 상에서 전기영동한다. 상기 겔을 니트로셀룰로오스로 옮기고, TBS-2% 트윈으로 15분 동안 차단하고, 벼 티오레독신 항체(TBS-0.05% 트윈 1㎖ 당 항체 1㎍)와 함께 실온에서 1.5시간 동안 항온처리하고 세척한 후, 상기 기술된 바와 같이 HRP 래빗 항-염소 IgG와 함께 항온처리한다. 블롯을 슈퍼시그날 웨스트 피코 화학형광 기질(제조원: Pierce, Rockford, IL)과 함께 실온에서 5분 동안 항온처리한다. 블롯을 필름에 대해서 위치시키고 5분 동안 노출시킨다. 웨스턴 블롯 분석은 잎 및 종자 조직에서 벼 티오레독신 단백질의 발현을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석은 또한, 유전자이식된 식물에서 발현된 벼 티오레독신이 동일 겔 상에 충전된 대조군 벼 티오레독신과 비교하여, 예견된 크기를 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 14
이. 콜라이에서 발현된 재조합 티오레독신 및 티오레독신 리덕타제의 효소적 활성
이. 콜라이에서 발현된 재조합 대두 티오레독신은 S-단백질 아가로오스를 사용한 친화도 크로마토그래피로 정제하고 트롬빈 절단으로 S-Tag를 제거한다. 상기 단백질을 상기 기술된 바와 같은 인슐린 환원 반응에서 시험한다. 친화도 정제된 티오레독신(오염성 단백질 존재) 4, 20, 40 및 80㎍을 시험한다. 31분 후, 650㎚에서의 광학 밀도 변화를 측정한다.
티오레독신(㎍) OD 650㎚(31분 후) 침전율(△A650/분)
0 .0000 .000000
1 .0010 .000032
2 .0077 .00025
3 .0084 .00027
4 .0117 .00038
하기 재조합 단백질을 NADPH 티오레독신 리덕타제 DTNB 분석법에서 시험한다: S-tag를 갖는 대두 티오레독신, S-tag를 갖지 않는 대두 티오레독신, S-tag를 갖는 벼 티오레독신, S-tag를 갖는 밀 티오레독신 및 S-tag를 갖지 않는 아라비돕시스 티오레독신 리덕타제. 이. 콜라이 티오레독신 리덕타제(T-7915, 제조원: Sigma, St. Louis, MO)를 또한 본 분석법에서 사용한다. 412㎚에서 광학 밀도 변화를 4분 동안 모니터링한다.
티오레독신 티오레독신 리덕타제 △A412
0㎕ 1.5㎕(약 0.5㎍) 아라비돕시스 0.06
30㎕(약 12㎍) 대두 2.3㎍ 이. 콜라이 0.333
30㎕(약 12㎍) 대두 1.5㎕(약 0.5㎍) 아라비돕시스 0.42
30㎕(약 6㎍) 대두 2.3㎍ 이. 콜라이 0.20
30㎕(약 15㎍) 벼 1.5㎕(약 0.5㎍) 아라비돕시스 0.66
30㎕(약 15㎍) 벼 2.3㎍ 이. 콜라이 0.30
30㎕(약 0.6㎍) 밀 2.3㎍ 이. 콜라이 0.30
30㎕(약 0.6㎍) 밀 1.5㎕(약 0.5㎍) 아라비돕시스 0.08
30㎕(약 1.2㎍) 밀 1.5㎕(약 0.5㎍) 아라비돕시스 0.08
아라비돕시스 티오레독신 리덕타제 및 이. 콜라이 티오레독신 리덕타제는 S-tag의 존재 또는 부재하에서 대두 티오레독신을 환원시킬 수 있다. 아라비돕시스 및 이. 콜라이 티오레독신 리덕타제는 또한 벼 티오레독신을 환원시킬 수 있다. 밀 티오레독신은 이. 콜라이 티오레독신 리덕타제에 의해 환원될 수 있지만, 아라비돕시스 티오레독신 리덕타제에 의해서는 환원되지 않는다.

Claims (19)

  1. (a) 보충적인 진핵생물성 티오레독신 리덕타제의 존재하에서 승온에서 곡물을 침지시키는 단계; 및 (b) 곡물의 전분 및 단백질 성분을 분리시키는 단계를 포함하는, 제분 공정에서 곡물의 전분 및 단백질 성분을 분리시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 곡물이 티오레독신 리덕타제를 발현하는 유전자이식(transgenic) 식물로부터의 곡물을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 식물이 옥수수인 방법.
  4. 핵 게놈 또는 색소체 게놈내에 안정하게 통합된 진핵생물성 티오레독신 리덕타제를 암호화하는 이종성 DNA를 포함하는 유전자이식 식물.
  5. 제4항에 있어서, 옥수수 또는 대두인 식물.
  6. 제4항에 있어서, 티오레독신 리덕타제가 서열 번호 25 또는 서열 번호 27을 포함하는 식물.
  7. 식물에서 기능하는 프로모터 및 종결인자 서열에 작동적으로 연결된 진핵생물성 티오레독신 리덕타제의 암호화 영역을 포함하는 키메라 발현 카셋트.
  8. 제7항에 있어서, 티오레독신 리덕타제가 서열 번호 25 또는 서열 번호 27을 포함하는 키메라 발현 카셋트.
  9. 제7항의 발현 카셋트로 식물을 형질전환시킴을 포함하는, 진핵생물성 티오레독신 리덕타제의 증가된 수준을 발현하는 곡물을 생산하는 방법.
  10. 제8항의 발현 카셋트로 식물을 형질전환시킴을 포함하는, 진핵생물성 티오레독신 리덕타제의 증가된 수준을 발현하는 곡물을 생산하는 방법.
  11. 진핵생물성 티오레독신 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 트랜스활성화인자-매개된 프로모터를 포함하는 이종성 발현 카셋트를 포함하는 제1 식물을, 상기 트랜스활성화인자-매개된 프로모터를 조절할 수 있는 트랜스활성화인자를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 이종성 발현 카셋트를 포함하는 제2 식물로부터의 화분으로 수분시키는 단계; 및 이렇게 수분된 식물로부터 곡물을 회수하는 단계를 포함하는, 티오레독신 리덕타제의 증가된 수준을 발현하는 곡물을 생산하는 방법.
  12. 서열 번호 24 또는 서열 번호 26을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자에 작동적으로 연결된 식물에서 활성인 프로모터를 포함하는 키메라 유전자.
  14. 제13항의 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제13항의 키메라 유전자를 포함하는 유전자이식된 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 유전자이식 식물 세포인 유전자이식된 숙주 세포.
  17. 제16항의 유전자이식 식물 세포를 포함하는 유전자이식된 식물.
  18. 제17항에 있어서, 옥수수 또는 대두인 유전자이식된 식물.
  19. 제13항의 키메라 유전자를 포함하는 제17항에 따른 유전자이식된 식물로부터의 종자.
KR1020027017416A 2000-06-21 2001-06-19 곡물 가공 방법 및 이에 유용한 유전자이식 식물 KR20030037232A (ko)

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