JPWO2011118582A1 - アルギン酸の分解方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]配列番号1のアミノ酸配列からなるか、または配列番号1のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド;
[2]配列番号1のアミノ酸配列と20%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸配列の80位および232位に相当する位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド;
[3]配列番号1のアミノ酸配列と20%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸配列の80位および/または232位に相当する位置におけるシステイン残基以外のアミノ酸残基をシステイン残基に置換して、これらの位置の両方にシステイン残基が存在するようにすることを含む、温度特性が向上したアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法;
[4][1]または[2]のポリペプチドをアルギン酸に作用させることを含む、アルギン酸の分解方法;
[5][1]または[2]のポリペプチドを含む、アルギン酸分解用組成物、
に関する。
本明細書において使用する「アルギン酸」という用語は、β−1,4’−マンヌロノ−1,4’−L−グルロノグリカンとも呼ばれるβ−D−マンヌロン酸(M)とα−L−グルロン酸(G)の2種のウロン酸のピラノース環が主としてβ1→4結合した多糖を指す。アルギン酸中にはβ−D−マンヌロン酸のホモポリマー(以下、「ポリ(M)」または「Mブロック」とも呼ぶ)、α−L−グルロン酸のホモポリマー(以下、「ポリ(G)」または「Gブロック」とも呼ぶ)、β−D−マンヌロン酸とα−L−グルロン酸のヘテロポリマー(以下、「ポリ(MG)」または「MGブロック」とも呼ぶ)の領域が存在する。アルギン酸の由来には限定なく、例えば、褐藻類などの藻類、細菌類などから得ることができる。
Nitratiruptor sp. SB155-2株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーNitAly−F1(配列番号5)およびNitAly−R1(配列番号6)を使用したPCRによりアルギン酸リアーゼ様ポリペプチド(NitAlyと称する)をコードするDNAを得、これをE. coli DH5α(Biodynamics)を宿主としてクローニングベクターpTac−1(Biodynamics)中にクローニングした。得られたNitAly遺伝子のヌクレオチド配列およびそれにコードされるNitAlyの推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号2および1に示す。
NitAlyによる基質の分解様式を調べるために、酵素反応中の反応混液の経過時間における粘度低下を調べた。測定はオストワルド粘度計を用いて行い、反応系(0.005mg/ml NitAly、50mM酢酸緩衝液(pH5.0)、1%アルギン酸ナトリウム、1M NaCl)は5mlとした。反応液は恒温槽を用いて30℃の一定温度に保った。また、粘度測定と併せて反応液の吸光度も測定した。同条件において480分間酵素反応を行い、経過時間ごとに反応液の235nmにおける吸光度も同時に測定した。
NitAlyの基質特異性を以下のようにして調べた。アルギン酸のポリ(M)、ポリ(G)、ポリ(MG)、および解集合アルギン酸は、既報の方法(P. Gacesa et al., Appl. Environ. Microbiol, 56:2265-2267 (1990))に従い、市販のアルギン酸ナトリウム(Sigma、Macrosystis pyrifera由来)から調製した。
NitAlyの示すアルギン酸リアーゼ活性を各種温度で測定した。対照として、市販のFlavobacterium sp.由来アルギン酸リアーゼ(FlaAly)(Sigma)を10mg/mlとなるように50mMリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解し、酵素溶液とした。
NitAlyのpH依存性は、pH3.3〜3.8の範囲では50mMグリシン−HCl緩衝液を、pH3.8〜5.9の範囲では50mM酢酸緩衝液を、pH6.0〜7.4の範囲では50mMリン酸緩衝液を、pH7.0〜8.3の範囲では50mM Tris−HCl緩衝液を、pH8.1〜10.5の範囲では50mM NaOH−グリシン緩衝液をそれぞれ使用し、1M NaCl、0.25%ポリ(M)、アルギン酸リアーゼ(0.01 mg/ml NitAly)を含む1mlの反応液中で、40℃に保ち10分間活性測定した。
NitAlyのpH安定性を以下のように調べた。NitAlyを精製後、直ちに1,000倍容量のpH4〜8(pH4および5は50mM酢酸緩衝液、pH6および7は50mMリン酸緩衝液、pH8は50mM Tris−HCl緩衝液を使用)の各緩衝液に対して0℃、12時間透析した後、0.01mg/ml NitAly、50mM酢酸緩衝液(pH5.0)、1M NaCl、0.25%ポリ(M)を含む1mlの反応液を調製し、40℃に保って10分間活性測定した。
NitAlyの塩濃度依存性は50mM酢酸緩衝液(pH5.0)、25〜1600mM NaCl、0.25%ポリ(M)、アルギン酸リアーゼ(0.01mg/ml NitAly)を含む1mlの反応液中で、40℃に保ち10分間活性測定した。
NitAlyを50mM酢酸緩衝液(pH5.0)に対して透析して得た酵素溶液(0.5mg/ml)を様々な温度(0〜100℃)で30分間インキュベートした後に10分間の氷冷を行い、0.01mg/ml NitAly、50mM酢酸緩衝液(pH5.0)、1M NaCl、0.25%ポリ(M)を含む1mlの反応液を調製し、40℃に保って10分間活性測定した。
NitAlyをアルギン酸に作用させた際に生じる分解物を以下のように調べた。薄層クロマトグラフィー(TLC)はTLC plate Silicagel-60(MERCK)を用いて行った。試料とするための酵素反応液は、50mM酢酸緩衝液(pH5.0)、600mM NaCl、0.25%アルギン酸ポリ(M)および0.02mg/ml NitAlyを含むものを用い、30℃で酵素反応させた。経時的にこの反応液の235nmにおける吸光度を測定した後に反応液を250μlずつ分取した。その後、脱塩濃縮を行うために、イソプロパノール沈殿を行った。すなわち、分取した反応液を氷冷し、同じく氷冷した750μlのイソプロパノールを加えてよく混合し、遠心分離(16,000×g、5分)して沈殿を得た。次いで1000μlのイソプロパノールを加えてよく混合し、遠心分離して得られた沈殿に室温のエタノールを1000μl加え、混合し遠心分離を行った。得られた沈殿を風乾し、10μlの蒸留水に溶解してスポット用試料とした。試料は1μlずつスポットし、乾燥後、1−ブタノール:酢酸:蒸留水(3:2:2、v/v/v)を展開溶媒としてスポットの展開を行った。プレート上に展開された糖質は、10%硫酸−エタノール溶液を噴霧し、130℃で15分間加熱することで検出した。マーカーとして、アルギン酸のアワビ粗酵素によるアルギン酸M−block分解物溶液を用いた(図9中のM)。
NitAly(0.5mg/ml、50mM酢酸緩衝液(pH5.0))を様々な温度(20〜50℃)で0〜16時間インキュベートした後に10分間の氷冷を行い、0.01mg/ml NitAly、50mM酢酸緩衝液(pH5.0)、1M NaCl、0.25%ポリ(M)を含む1mlの反応液を調製し、40℃で10分間活性を測定した。
NitAlyのアミノ酸配列を既知の他種のアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列と詳細に比較したところ、NitAlyに特有の2個のシステイン(Cys)残基(配列番号1の80位および232位)が見出された。図11にNitAlyの予測立体構造を示す。上記2つのCys残基は立体構造において互いに近接していることが予測された。すなわち、これらのCys残基によって形成され得るジスルフィド結合がNitAlyの高い熱安定性に寄与している可能性があると考えられた。そこで、NitAlyの温度依存性および熱安定性に対する、ジスルフィド結合を切断する還元剤DTTの影響を調べた。
配列番号1の80位および232位におけるCys残基によって形成され得るジスルフィド結合のNitAlyの温度特性(温度依存性、熱安定性)に対する影響をより詳細に調べるために、Cys残基を別のアミノ酸残基に置換したNitAly変異体を作製した。実施例1で得られたDNAを鋳型とし、NitAlyの80位のCys残基をグリシン(Gly)残基に置換するためのプライマーC80G−F(配列番号9)およびC80G−R(配列番号10)またはNitAlyの80位のCys残基をアラニン(Ala)残基に置換するためのプライマーC80A−F(配列番号11)およびC80A−R(配列番号12)を使用したPCRにより、80番目のCys残基をGly残基またはAla残基に置換した変異体(それぞれC80G、C80A)をコードするDNAを得、実施例1と同様にして精製タンパク質を調製して、その温度依存性と熱安定性を調べた。
実施例12で得られた知見をもとに、熱安定性が低いPorphyra yezoensisのアルギン酸リアーゼに、NitAlyの場合と同様にジスルフィド結合を形成するように2個のCys残基を置換により79位および229位に導入した変異体を作製した。Porphyra yezoensisのアルギン酸リアーゼ(PyAly)遺伝子のヌクレオチド配列およびPyAlyのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号4および3に示す。配列番号3のヌクレオチド配列を有するDNAを鋳型にし、PyAlyの79位のGly残基をCys残基に置換するためのプライマーPy−G79CF(配列番号13)およびPy−G79CR(配列番号14)ならびにPyAlyの229位のプロリン(Pro)残基をCys残基に置換するためのプライマーPy−P229CF(配列番号15)およびPy−P229R(配列番号16)を使用して、79位および229位にCys残基を有する変異体(PyAlyCys)をコードするDNAを得た。PyAlyCysのアミノ酸配列を配列番号17に示す。このDNAからPyAlyCysを実施例1と同様に発現させ精製し、その温度依存性と熱安定性を調べた。
Claims (5)
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるか、または配列番号1のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列と20%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸配列の80位および232位に相当する位置にシステイン残基を有するアミノ酸配列からなり、かつアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列と20%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号1のアミノ酸配列の80位および/または232位に相当する位置におけるシステイン残基以外のアミノ酸残基をシステイン残基に置換して、これらの位置の両方にシステイン残基が存在するようにすることを含む、温度特性が向上したアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
- 請求項1または2記載のポリペプチドをアルギン酸に作用させることを含む、アルギン酸の分解方法。
- 請求項1または2記載のポリペプチドを含む、アルギン酸分解用組成物。
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