CN117987399A - 一种苏氨酸脱氨酶突变体及其在异亮氨酸制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种ilvA基因突变体及其编码核酸序列，通过在重组菌株中表达ilvA基因突变体从而提高异亮氨酸的发酵产量。含有ilvA突变体的基因工程菌株相对于含有野生型ilvA基因的菌株L‑异亮氨酸生产能力大幅提高，具有重大的产业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种苏氨酸脱氨酶突变体及其在异亮氨酸制备中的应用。
背景技术
L-异亮氨酸属于支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人与动物自身不能合成而必需以来外源供给的八大必需氨基酸之一，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种，目前在工业生产上实施的只有发酵法。在发酵法使用的微生物中，L-异亮氨酸的合成途径及调控方式较复杂，苏氨酸脱氨酶是L-异亮氨酸生物合成的关键酶，是异亮氨酸合成的限速步骤，也是发酵法高效生产L-异亮氨酸及其衍生物的关键限制因素。苏氨酸脱水酶亦称苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)此酶催化苏氨脱水分解生成氨和α-酮丁酸的反应，编码该酶的基因为ilvA。
ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶BTD_ilvA主要有3个结构域，分别为N端的催化结构域(PALP)和C端的两个调控结构域(ACT_like)。苏氨酸作为底物可以与ilvA的PALP结构域对接，而异亮氨酸与ilvA的C端调控域结合后，会对ilvA形成反馈抑制，抑制其与底物苏氨酸的结合。人们希望通过对ilvA结构的研究从而提高其与底物的亲和力，或者解决反馈抑制，进而提高ilvA基因表型的活性。
发明内容
本发明的发明人通过对ilvA基因的结构研究，对ilvA进行定点突变，将突变的ilvA基因转入宿主菌，提高了宿主菌中异亮氨酸的产量，使得ilvA基因的表型活性得到提高。
本发明提供了一种突变的ilvA基因、含有该突变基因的表达载体，以及含有该基因的工程菌，及其在提高异亮氨酸产量及发酵生产中的应用。
本发明的第一个方面，涉及一种多核苷酸分子，包括实质上该核酸分子编码解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶，所述苏氨酸脱氨酶是相对于野生型具有氨基酸水平的突变的基因。
在一个实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因是突变的ilvA基因。本发明ilvA基因相较于野生型ilvA基因(核苷酸序列如Seq No.1所示；氨基酸序列如Seq No.2所示)发生变异(核苷酸序列为Seq No.3,5或7所示)，该变异解除了L-异亮氨酸对ilvA基因编码的反馈抑制的变异，例如H418Y或H418F或H418W，分别如本申请Seq No.4,6,8所示。
本发明还涉及一种基因工程菌株，所述菌株包含突变的苏氨酸脱氨酶的基因。
在一个实施例中，所述解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因可以是突变的ilvA基因。
如上所述基因工程菌，可以将本发明的ilvA基因插入到载体DNA后，再导入宿主内。本发明的ilvA基因可以作为质粒类染色体外DNA保留在宿主内，也可以通过利用转导作用、易位子、Mu噬菌体或同源性重组的方法将上述基因编入宿主微生物的染色体内。为了有效地进行上述基因的表达，可以将本发明的ilvA置于lac、trp、PL和tac等在微生物内起作用的启动子控制之下。
在一个实施例中，所述含有突变的ilvA基因的异亮氨酸发酵工程菌株具有比含有野生型ilvA基因的工程菌株高43％的异亮氨酸产率。
本发明所述基因工程菌株可以用于发酵生产L-异亮氨酸。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明提供了一种突变的ilvA基因及其编码核酸序列
2、本发明提供了一种提高异亮氨酸产量的方法，通过在重组菌株中表达突变的ilvA基因从而提高异亮氨酸的发酵产量，并将其用于L-异亮氨酸工程菌株的构建和L-异亮氨酸的高效发酵。含有ilvA H418W的基因工程菌株相对于含有野生型ilvA基因的菌株L-异亮氨酸生产能力增加了43％，具有重大的产业应用价值。
附图说明
图1为BTD_ilvA的野生型WT的催化结构域PALP与底物苏氨酸的分子对接图
图2为BTD_ilvA的野生型WT调控结构域与底物异亮氨酸的分子对接图
图3为BTD_ilvA的突变体H418Y的催化结构域PALP与底物苏氨酸的分子对接图
图4为BTD_ilvA的突变体H418Y调控结构域与底物异亮氨酸的分子对接图
图5为BTD_ilvA的突变体H418F的催化结构域PALP与底物苏氨酸的分子对接图
图6为BTD_ilvA的突变体H418F调控结构域与底物异亮氨酸的分子对接图
图7为BTD_ilvA的突变体H418W的催化结构域PALP与底物苏氨酸的分子对接图
图8为BTD_ilvA的突变体H418W调控结构域与底物异亮氨酸的分子对接图
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的试剂和材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：ilvA基因的生物信息学结构模拟——AutoDock Vina分子对接
ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶BTD_ilvA主要有3个结构域，分别为N端的催化结构域(PALP)和C端的两个调控结构域(ACT_like)。其中，以苏氨酸为底物与BTD_ilvA的PALP结构域对接，观察其相互作用；而异亮氨酸与BTD_ilvA的C端调控域结合后，会对BTD_ilvA形成反馈抑制，抑制其与底物苏氨酸的结合。根据其结构分析可知，异亮氨酸与BTD_ilvA的结合区域位于两个C端调控域的界面之间，将其命名为Ile1区域和Ile2区域，其中Ile 1区域更靠近PALP催化结构域，推测该区域结合异亮氨酸对BTD的反馈抑制影响更大。
将BTD_ilvA的野生型WT以及其三个突变体H418Y、H418F和H418W分别在AutoDockVina中进行分子对接，底物选择苏氨酸和异亮氨酸，对接完成后在Pymol中可视化(见附图1-图8)，结果如表1所示，BTD_ilvA的野生型WT的催化结构域PALP与底物苏氨酸的亲和力为-4.6kcal/mol，WT的调控结构域与异亮氨酸的亲和力分别为-4.8kcal/mol和-6.5kcal/mol。H418F和H418W两个突变体的催化结构域与底物苏氨酸的亲和力较WT有了提升，为-4.8kcal/mol，且苏氨酸与H418W的结合位点较WT来说在结合口袋较浅的位置(如图1和图7所示)，更容易结合。同时这两个突变体的调控结构域Ile1与异亮氨酸的亲和力明显下降，H418F与异亮氨酸的亲和力降为-4.5kcal/mol，H418W与异亮氨酸的亲和力降为-4.4kcal/mol。H418F和H418W与异亮氨酸的亲和力降低，意味着异亮氨酸与突变体的结合能力下降，从而降低了异亮氨酸与BTD_ilvA的反馈抑制。
表1：ilvA基因突变体与底物亲和性分析
实施例2：ilvA基因突变菌株的构建
本发明构建的ilvA突变的基因工程菌株可以将培养基中的苏氨酸转化为异亮氨酸。以大肠杆菌CGMCC No.19458为初始菌(参见，中国专利CN202010401422.5中的菌种Sval065菌株，保藏编号为CGMCC NO.19458，该菌株含有野生型ilvA基因)，通过敲除编码苏氨酸脱水酶基因(tdh基因)，并且导入编码苏氨酸脱氨酶基因(ilvA)，从而构建发酵生产异亮氨酸的重组菌。敲除编码苏氨酸脱水酶(Tdh蛋白)的基因，可阻止培养基中的苏氨酸消耗生成副产物甘氨酸，并且导入编码苏氨酸脱氨酶的基因，该基因可以将苏氨酸转变为异亮氨酸合成的关键前体物质α-酮戊二酸，从而增加异亮氨酸的产量。
表2：本发明所用菌株和质粒
表3：本发明所用的引物
(一)、CGMCC No.19458菌株中苏氨酸脱氢酶tdh的敲除
从大肠杆菌CGMCC No.19458出发，采用两步同源重组的方法苏氨酸脱氢酶tdh，具体步骤如下：
第一步，以pRE112质粒DNA为模板，使用引物tdh-cs-up/tdh-cs-down扩增出3569bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
扩增体系为：Phusion 5X缓冲液(NewEngland Biolabs)10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸4分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将上述DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒-(购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌CGMCC No.19458，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌CGMCC No.19458。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌CGMCC No.19458的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，所用引物XZ-tdh-up/XZ-tdh-down，正确的菌落扩增产物为4449bp的片段，挑选一个正确的单菌落，命名为mIVL001。
第二步，以大肠杆菌CGMCC No.19458的基因组DNA为模板，用引物XZ-tdh-up/tdh-del-down扩增出532bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。扩增条件和体系同第一步中所述。将DNA片段II电转至菌株Sval001。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的mIVL001的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mlLB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-tdh-up/tdh-del-down，正确的菌落扩增产物为532bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为mIVL002。
(二)、苏氨酸脱氨酶基因ilvA的突变
通过两步同源重组的方法在ilvA基因中引入突变解除L-异亮氨酸的反馈抑制，具体步骤如下：
第一步，以pRE112质粒DNA为模板，使用引物ilvA-mut-cat-up/ilvA-mut-cat-down扩增出3539bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
扩增体系为：Phusion 5X缓冲液(NewEngland Biolabs)10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸4分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将上述DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒-(购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌mIVL002，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌mIVL002。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌mIVL002的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，所用引物XZ-ilvA-mut-up/XZ-ilvA-mut-down，正确的菌落扩增产物为4746bp的片段，挑选一个正确的单菌落，命名为mIVL003。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物ilvA-ilvA-H418Y-F/ilvA-mut-cs-R扩增出2528bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株mIVL003。
以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物ilvA-ilvA-H418F-F/ilvA-mut-cs-R扩增出2528bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株mIVL003。
以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物ilvA-ilvA-H418W-F/ilvA-mut-cs-R扩增出2528bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株mIVL003。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的Sval001的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mlLB培养基转移至电击杯中，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-ilvA-mut-up/ilvA-mut-ilvA-down，正确的菌落扩增产物为2528bp的片段，挑选一个野生型ilvA基因第418个氨基酸成功突变为酪氨酸的单菌落，命名为mIVL004，挑选一个野生型ilvA基因第418个氨基酸成功突变为苯丙氨酸的单菌落，命名为mIVL005、挑选一个野生型ilvA基因第418个氨基酸成功突变为色氨酸的单菌落，命名为mIVL006。
实施例3：使用重组菌株发酵生产L-异亮氨酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO48.8g/L、(NH4)2SO42.5g/L、MgSO4·7H2O2g/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50g/L，并额外添加15g/L苏氨酸。
mIVL002、mIVL004、mIVL005、mIVL006的厌氧发酵包括以下步骤：
(1)种子培养：将LB平板上新鲜的克隆接种到含有4ml种子培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。然后，按照2％(V/V)的接种量将培养物转接到含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在37℃，250rpm振荡培养12小时得到种子培养液用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子培养液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵4天，得到发酵液。中和剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0。培养过程中不通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1260)高效液相色谱仪对发酵3天的发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的AminexHPX–87H有机酸分析柱。氨基酸测定使用Sielc氨基酸分析柱primesep 100250×4.6mm。
将实验重复3次，并且其分析结果的平均值呈现于以下表4中。
表4:L-异亮氨酸菌株的生产能力比较
| 菌株 | 特性 | L-异亮氨酸浓度(g/L) |
| mIVL002 | CGMCC No.19458△tdh(野生型ilvA基因) | 10.2 |
| mIVL004 | CGMCC No.19458△tdh△ilvA::ilvA H418Y | 11.3 |
| mIVL005 | CGMCC No.19458△tdh△ilvA::ilvA H418F | 13.5 |
| mIVL006 | CGMCC No.19458△tdh△ilvA::ilvA H418W | 14.6 |
如表4所呈现，在含有苏氨酸的培养基中，与对照组mIVL002相比，mIVL004、mIVL005、mIVL006具有提高的异亮氨酸产率，特别是mIVL006(ilvA H418W)菌株相对于含有mIVL002(野生型ilvA)菌株L-异亮氨酸生产能力增加了43％。实验数据表明H418W的Ile产量为14.6g/L，与分子对接分析的结果一致。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种ilvA基因突变体，其特征在于：与野生型相比在氨基酸序列的418位具有突变。
2.根据权利要求1所述的ilvA基因突变体，其特征在于：所述突变为H418Y或H418F或H418W。
3.根据权利要求2所述的ilvA基因突变体，其特征在于：所述突变体氨基酸序列为序列表Seq No.4,6,8所示。
4.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-3所述的变体。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：多核苷酸序列如序列表Seq No.3,5或7所示。
6.一种表达载体，其含有编码权利要求1-3所述的变体的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述多核苷酸如序列表Seq No.3,5或7所示。
8.一种重组菌株，其包含根据权利要求1-3所述的变体或编码所述变体的多核苷酸，或含有所述变体的多核苷酸的表达载体以及所述菌株在制备异亮氨酸中的用途。
9.根据权利要求1-3所述的变体、权利要求4-5所述的多核苷酸，或权利要求6-7的表达载体在制备异亮氨酸重组菌株的应用。
10.一种提高异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所用菌株中含有ilvA基因的突变体，所述突变为在野生型ilvA氨基酸序列的418位。
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