CN105755019A - 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用 - Google Patents

一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105755019A
CN105755019A CN201610127030.8A CN201610127030A CN105755019A CN 105755019 A CN105755019 A CN 105755019A CN 201610127030 A CN201610127030 A CN 201610127030A CN 105755019 A CN105755019 A CN 105755019A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nicotinamide
transferase gene
adenylyl transferase
mononucleotide
nicotinamide mononucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610127030.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马骥
韩诗蕾
王三永
李春荣
杨定乔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FOOD INDUSTRY INSTITUTE OF GUANGDONG PROVINCE
South China Normal University
Original Assignee
FOOD INDUSTRY INSTITUTE OF GUANGDONG PROVINCE
South China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FOOD INDUSTRY INSTITUTE OF GUANGDONG PROVINCE, South China Normal University filed Critical FOOD INDUSTRY INSTITUTE OF GUANGDONG PROVINCE
Priority to CN201610127030.8A priority Critical patent/CN105755019A/zh
Publication of CN105755019A publication Critical patent/CN105755019A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07001—Nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase (2.7.7.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中所示。还公开了一种表达载体，并用所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的步骤的方法制备的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。并公开了该重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用。以及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的合成方法，以烟酰胺单核甙酸NMN为原料，在所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因作用下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+。

Description

一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+)是生物体内不可缺少的小分子化合物。NAD+依赖型生物大分子在生命活动中具有非常重要的作用,参与能量传递，物质代谢和信号传导等过程。NAD+/NADH参与生物体内的氧化还原反应，保持细胞内氧化还原平衡。此外，其是生命体内200多种还原反应的辅酶，同时还是3类NAD+消耗酶的底物，在各种细胞生理过程中起着至关重要的作用，NAD+的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡。NAD+的代谢在健康和疾病状态中起到重要作用，已经引起了人们越来越多的关注，因而参与NAD+生物合成和代谢的酶也成为各种疾病的药物发现中极具吸引力的靶标。
烟酰胺单核酸苷酸腺苷转移酶(nicotinamidemononucleotideadenylyltransferase，NMNATs,EC2.7.7.1)在体内使烟酰胺单核苷酸(NMN)腺苷化，合成烟酰胺腺嘌呤辅酶Ⅰ(NAD+)。1957年，Todd等在水和吡啶(Py)的混合溶剂中，将NMN和AMP通过二环己基碳二亚胺(DCC)偶联首次实现了NAD+的化学合成。近年来，有采用N,N-羰基二咪唑(CDI)，MnCl2，1H-四唑活化磷酸单酯合成NAD+的报道。相比于化学合成方法，酶催化合成NAD+的转化率高，分离较为简单，成本降低。
而在已报道的酶催化方法中，催化用的焦磷酸酶NADPP需要经过比较复杂的纯化过程，这是对大规模工业化生产的一个制约。
生物或化学法催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的半合成
以上方法属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)半合成方法，即采用化学或生物的方法催化烟酰胺单核苷酸(NMN)生成目标化合物，但烟酰胺单核苷酸(NMN)价格昂贵，不易获得，人们相继对其合成进行了开发。Toddd等人最先开发了β-NMN的溴带乙酰核糖方法，1980年Mikhailopulo等用SO2作为糖苷化反应的溶剂，使得选择性生成β型NMN(乙酸基保护β:α＝25:l，苯甲酰基保护β:α＝30:l)，1999年，Jaemoonlee课题组报道了用乙腈作溶剂代替剧毒且操作复杂对仪器设备要求较高的S02，虽然β构型比例不如后者髙，只有β:α＝3.3:1，在-15℃下选择性结晶，从混合物中成功得到65％的纯β-NMN，该方法产率虽然降低了，但反应过程更加经济环保。该课题组以SO2作糖苷化溶剂时，整个全合成NMN的产率达到80％。
经过上述三个课题组的改进，该方法合成β-NMN已然相当成熟，羟基保护的核糖(R＝乙酰基或苯甲酰基)，经溴代后在乙腈溶剂中与烟酰胺发生缩合反应生成核苷，反应结束后经过NH3/MeOH氨解脱去保护基，最后一步以磷酸三甲酯做溶剂与三氯氧磷反应经水解生成烟酰胺单核苷酸(NMN)。这条合成路线立体选择性强，但溴代核糖不稳定，S02作溶剂，对反应仪器要求较高，增加生产成本，这些都成为限制它大规模应用的因素。
烟酰胺单核苷酸(NMN)的合成方法一
2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应成α/β混合的NMN，然后经过活性炭柱色谱分离得到β-NMN，产率达到58％。该方法所加催化剂TMSOTf摩尔量为底物摩尔量的10倍，糖苷化反应完毕后，直接加甲醇室温搅拌对呋喃糖进行脱保护基，看似简单，但重复性不好，得到的目标化合物谱图与其他实验组有差异，该方法可行性有待进一步论证。
烟酰胺单核苷酸(NMN)的合成方法二
2004年，Palmarisa课题组对Tanimori等人的方法进行了改进，他们使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，将酰胺键保护起来，反应完毕后蒸出多余的硅烷化试剂，然后与四乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应，在甲醇胺进行脱保护后得到烟酰胺核糖的产率为45％，并且直接生成了β型的化合物，避免了对两种构型的分离，但此方法将烟酰胺硅烷化后需要先蒸馏出多余的硅烷化试剂，且硅烷化反应操作要求绝对无水。
烟酰胺单核苷酸(NMN)的合成方法三
2007年Tianle等改进了Palmarisa等对烟酰胺进行硅烷化的实验方法，他们用TMSOTf催化烟酸乙酯与四乙酰核糖反应，然后用NH3/MeOH对乙酰基保护基进行脱保护，烟酸乙酯上的酯基重新生成酰胺基，从而得到目标化合物。此方法也是直接生成β型化合物且操作步骤简单，重复性强，化合物进行甲醇胺脱保护后得到的产率达到85％，相比Palmarisa等人的方法产率提高将近1倍。
烟酰胺单核苷酸(NMN)的合成方法四
但目前并未有人研究来源于Methanothermobactersp.CaT2的烟酰胺单核酸苷酸腺苷转移酶，并将其用于作为酶催化剂合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸方面的研究。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用。
本发明所要解决的第一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
该基因序列含有528bp碱基。
该基因的氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。其包含175个氨基酸。
本发明中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，来源于Methanothermobactersp.CaT2，由金斯瑞生物科技有限公司合成。
该基因编码的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶能催化NMN转化为NAD+，至今未发现该烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的相关研究的报道。
一种表达载体，所述的表达载体含有上述烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。
本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，包括用上述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的步骤的方法制备。
该重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的制备方法，包括用上述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。
其中宿主细胞是大肠杆菌。
本发明基于生物信息学的分析方法和分子生物学技术所获得的核酸序列是一种高活性的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，可将其与载体连接后转化至宿主细胞内生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，粗酶液经过高温加热精制，可以很好的去除副反应，精制的酶能高效催化NMN转化为NAD+。
而且，来源于Methanothermobactersp.CaT2的烟酰胺单核酸苷酸腺苷转移酶有很好的热稳定性，其最适温度60～70℃，90℃下也可以稳定两小时，这种特性可以极大的简化酶的提取纯化过程。
本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用。
本发明采用Tianle等人的方法进行合成烟酰胺单核苷酸NMN，来源于Methanothermobactersp.CaT2的烟酰胺单核酸苷酸腺苷转移酶作为酶催化剂合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+。
本发明合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的流程图
优选的，所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用时，反应温度为30～80℃。
最佳的，所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用时，反应温度为65℃。
本发明还提供了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的合成方法，以烟酰胺单核甙酸NMN为原料，在上述重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因作用下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+。
本发明具有以下优点：
(1)本发明构建了一种来源于Methanothermobactersp.CaT2的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，至今未发现该烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的相关研究的报道；
(2)本发明将该烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因用于在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中，结果表明，该烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因对底物NMN的转化率均大于99％；
(3)相较于一般依赖化学合成的生产方法，采用本发明中的应用方式，可以大大降低工艺难度、后期分离，有效降低生产成本，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为实施例2中烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因表达载体的构建图；
图2为实施例5中底物烟酰胺单核苷酸(NMN)的氢谱图；
图3为实施例5中底物烟酰胺单核苷酸(NMN)的碳谱图；
图4为实施例5中产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的氢谱图；
图5为实施例5中产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的碳谱图；
图6为实施例5中底物烟酰胺单核苷酸(NMN)的HPLC图；
图7为实施例5中产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的HPLC图。
具体实施方式
本发明提供了编码具有烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是从Methanothermobactersp.CaT2中克隆得到的，具有SEQIDNO：1的核苷酸序列，它编码175个氨基酸的多肽，如SEQIDNO：2中所示。
本发明还涉及一种重组载体，该载体包含本发明的核苷酸序列SEQIDNO：1的目的基因，以及包含重组质粒的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组质粒和宿主细胞的方法，以及用重组工程菌生产烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的方法。
本发明的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法，重组法，或人工合成法获得。
本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。
重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括：氯化钙热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。
本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆菌等。常用的真核细胞如酵母细胞，或各种动植物细胞。
本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的克隆
本发明中所使用的来源于Methanothermobactersp.CaT2的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因由金斯瑞生物科技有限公司合成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示，培养基LB(g·L-1)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl10g，补蒸馏水至1L。
构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：
上游引物(NMNAT-sense含NcoⅠ)为：
5'-CATGCCATGGGCATGCGTGGTTTCATC-3'
下游引物(NMNAT-anti含BamHⅠ)为：
5'-CGCGGATCCTTATTTATCGGTTTGCGCC-3'
所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。基因的PCR条件：94℃变性7min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，56℃退火60s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。PCR反应结束后取产物2μL，然后在浓度为0.8％的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用TaKaRa公司的DNA纯化回收试剂盒(TaKaRaAgaroseGelDNAPurification)回收目的片段(NMNAT)用于重组表达载体pET-28a-NMNAT的构建。
实施例2重组表达载体pET-28a-NMNAT的构建
用NcoⅠ及BamHⅠ分别酶切pET-28a(购于Novagen默克中国)及所扩增含有两个酶切位点的目的基因(实施例1PCR扩增获得)，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-28a与目的基因(SEQIDNO：1所示的基因)用T4-DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行过夜连接，得到重组载体pET-28a-NMNAT；将10μL的连接产物加入100μL的大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90s。冰上放置2min。加入预热的0.45mLSOC培养基(2％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母浸粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，20mM葡萄糖。)。220rpm37℃1h。将200μL菌液加入含有30μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h，得到重组菌E.coliBL21(含pET-28a-NMNAT)。构建图谱见图1。
实施例3烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达
挑取重组菌E.coliBL21(含pET-28a-NMNAT)及对照菌E.coliBL21(含pET-28a)至含30μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。然后按2％接种量分别接种到新鲜含30μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol·L-1，16℃，220rpm，诱导表达24h后，离心(4℃，5000rpm，15min)，菌泥用100mMTris-HCl缓冲(pH9.0)重悬，超声破碎细胞(功率300W，超声3s，间歇5s，共5min)，离心(4℃，12000rpm，15min)。
上清酶活的测定：酶反应体系包括100mMHEPES缓冲(pH7.4)，13mMMgCl2，0.2mMATP，0.2mMNMN,70℃预热3min，加酶液至终体系为150μL，并在70℃下反应10min。采用高效液相色谱(HPLC)测定ATP，NMN，NAD，ADP浓度。高效液相色谱仪采用美国戴安(DIONEX)公司UltiMate3000，色谱柱为美国Bio-Rad公司a7.5-cmby4.6-mm-inside-diameterSupelcosilLC-18-DB3-mm-particle-sizereversed-phase(300x7.8mm)色谱柱；流动相为0.1M磷酸钾(PH6.0)；流速1mL/min；柱温为65℃；采用紫外检测器，波长340nm。酶活定义为每分钟内生成1μmolNAD+所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，对照菌E.coliBL21(含pET-28a)的比酶活为0，而重组菌E.coliBL21(含pET-28a-NMNAT)的比酶活为12.1U/mg。
实施例4重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的获取
取实施例3诱导表达后离心收集的菌泥用Tris-HCl缓冲(100mmol·L-1，pH9.0)洗涤两次，称取10g(湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于200mL的pH9.0Tris-HCl缓冲液中。超声处理细胞(功率300W，超声3s，间歇5s，共5min)，得到粗酶液。将粗酶液缓慢加热到70℃，并搅拌120分钟，离心去沉淀，浓缩干燥，得到精制的酶粉(即重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因)。
实施例5重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用
取烟酸乙酯(41mL，0.3mol)及四乙酰核糖(51g，0.16mol)溶于100mL，2-二氯乙烷，45℃下搅拌30min，滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，40mL，0.207mol)，40min内滴加完毕。16h反应完毕后，蒸干溶剂，用甲醇/环己烷萃取五次，收集甲醇层蒸干得到粗品A。
取装有2L甲醇的圆底烧瓶通入实验室制备的氨气，制备4N的甲醇胺溶液，置于-5℃的低温反应仪中30min，将粗品A加入到甲醇胺中低温反应至TLC薄层板上A点基本消失，反复减压蒸馏除去多余的氨，得到烟酰胺核糖(NicotinamideRiboside,NR)粗品。
取干燥的烟酰胺核糖(117.5g，0.46mol)溶于磷酸三甲酯中，置于-5℃低温反应仪中滴加POCl3(327g，2.13mol)，24h反应完毕后加入冰水混合物猝灭反应，减压蒸馏除去大部分水得到烟酰胺单核苷酸(NMN)的粗品水溶液。将上述水溶液通过Dowex离子交换树脂1×2(CH3COO-型，200-400目)分离提纯得到烟酰胺单核苷酸(NMN)78.41g产率51％。
底物烟酰胺单核苷酸(NMN)的核磁数据：
1HNMR(300MHz,D2O)δ9.42(s,1H),9.25(d,J＝6.2Hz,1H),8.94(d,J＝8.0Hz,1H),8.36–8.15(m,1H),6.17(s,1H),4.59(s,1H),4.52(t,J＝5.1Hz,1H),4.46–4.35(m,1H),4.26(d,J＝10.3Hz,1H),4.10(dd,J＝11.2,3.6Hz,1H)。
13CNMR(300MHz,D2O)δ165.94(s),165.94(s),145.97(s),142.07(s),139.86(s),133.95(s),128.51(s),128.51(s),99.95(s),87.40(d,J＝8.2Hz),77.63(s),77.63(s),70.74(s),70.74(s),64.18(s)。
烟酰胺单核苷酸(NMN)的氢谱图如图2中所示，烟酰胺单核苷酸(NMN)的碳谱图如图3中所示。图2、图3可证明烟酰胺单核苷酸(NMN)结构正确；底物烟酰胺单核苷酸(NMN)的HPLC图如图6中所示；图6说明底物烟酰胺单核苷酸纯度高。
高效液相测定条件：Grace-smartC18反相柱，流速1.0mL/min，254nm紫外检测，柱温：25℃，进样量：100μL；流动相:80％10mmol/LKH2PO4(pH7.0)+20％甲醇。
取精制的酶粉10g(实施例4制备获得)，腺苷三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate,ATP)100mmol，烟酰胺单核苷酸(NMN)100mmol，加入到1000mL、pH7.5的磷酸盐缓冲液中，65℃，搅拌反应120分钟。取样检测，反应液中NAD+的含量达66.0g/L，为99mmol，转化率达到99.0％。
产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的核磁数据：
1HNMR(300MHz,D2O)δ9.39(s,1H),9.24(d,J＝6.2Hz,1H),8.89(d,J＝8.0Hz,1H),8.50(s,1H),8.27(dd,J＝16.9,9.2Hz,2H),6.15(d,J＝5.3Hz,1H),6.03(s,1H),4.65(s,1H),4.54(dd,J＝12.1,6.8Hz,2H),4.49–4.30(m,4H),4.30–4.11(m,3H)。
13CNMR(300MHz,D2O)δ165.39(s),149.87(s),148.05(s),145.91(s),145.27(s),142.50(s),142.05(s),139.83(s),133.74(s),128.58(s),118.10(s),99.86(s),87.74(s),87.05(d,J＝8.5Hz),83.98(d,J＝8.4Hz),77.55(s),74.63(s),70.71(s),70.13(s),65.01(dd,J＝13.5,4.8Hz)。
高效液相测定条件：Grace-smartC18反相柱，流速1.0mL/min，254nm紫外检测，柱温：25℃，进样量：100μL；流动相:80％10mmol/LKH2PO4(pH7.0)+20％甲醇。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的氢谱图如图4中所示，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的碳谱图如图5中所示，图4、图5可证明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)结构正确；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的HPLC图如图7中所示，图7说明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的纯度高。
结果表明，本发明首次将重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶应用于NMN合成NAD+，对底物NMN的转化率均大于99％；指NMN转化为NAD的摩尔量比。

Claims (10)

1.一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，其特征是：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，其特征是：该基因的氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。
3.一种表达载体，其特征是：所述的表达载体含有权利要求1或2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。
4.一种重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的制备方法，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因。
5.根据权利要求4所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的制备方法，其特征是：其中宿主细胞是大肠杆菌。
6.一种重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的步骤的方法制备。
7.权利要求6所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是：所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用时，反应温度为30～80℃。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是：所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因在体外将烟酰胺单核甙酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+中的应用时，反应温度为65℃。
10.一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的合成方法，其特征是：以烟酰胺单核甙酸NMN为原料，在权利要求6所述的重组烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因作用下，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+。
CN201610127030.8A 2016-03-07 2016-03-07 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用 Pending CN105755019A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610127030.8A CN105755019A (zh) 2016-03-07 2016-03-07 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610127030.8A CN105755019A (zh) 2016-03-07 2016-03-07 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105755019A true CN105755019A (zh) 2016-07-13

Family

ID=56332606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610127030.8A Pending CN105755019A (zh) 2016-03-07 2016-03-07 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105755019A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653257A (zh) * 2017-09-30 2018-02-02 广州大学 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用
CN107955791A (zh) * 2017-11-20 2018-04-24 苏州东和盛昌生物科技有限公司 一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用
WO2018120069A1 (zh) * 2016-12-29 2018-07-05 苏州汉酶生物技术有限公司 一种酶法制备β- 烟酰胺单核苷酸的方法
CN109053838A (zh) * 2018-07-26 2018-12-21 四川大学 制备β-烟酰胺单核苷酸或β-烟酰胺核糖的方法
CN112725395A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 江苏诚信药业有限公司 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法
CN113755415A (zh) * 2020-06-04 2021-12-07 苏州华赛生物工程技术有限公司 一种新的具有nmn合成路径的重组微生物及生产方法
CN114438052A (zh) * 2020-10-30 2022-05-06 尚科生物医药（上海）有限公司 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用
CN114807078A (zh) * 2022-04-19 2022-07-29 四川盈嘉合生科技有限公司 一种生物合成nmn的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D SCHOMBURG等: "《Springer Handbook of Enzymes》", 31 December 1997, SPRINGER *
KOSAKA T等: "登录号：AP011952.1", 《GENBANK》 *
KOSAKA T等: "登录号：BAM69364.1", 《GENBANK》 *
V SARIDAKIS等: "Insights into Ligand Binding and Catalysis of a Central Step in NAD+ Synthesis", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018120069A1 (zh) * 2016-12-29 2018-07-05 苏州汉酶生物技术有限公司 一种酶法制备β- 烟酰胺单核苷酸的方法
CN107653257A (zh) * 2017-09-30 2018-02-02 广州大学 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用
CN107955791A (zh) * 2017-11-20 2018-04-24 苏州东和盛昌生物科技有限公司 一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用
CN107955791B (zh) * 2017-11-20 2021-01-15 江苏美科生物科技有限公司 一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用
CN109053838A (zh) * 2018-07-26 2018-12-21 四川大学 制备β-烟酰胺单核苷酸或β-烟酰胺核糖的方法
CN113755415A (zh) * 2020-06-04 2021-12-07 苏州华赛生物工程技术有限公司 一种新的具有nmn合成路径的重组微生物及生产方法
CN113755415B (zh) * 2020-06-04 2024-03-29 苏州华赛生物工程技术有限公司 一种新的具有nmn合成路径的重组微生物及生产方法
CN114438052A (zh) * 2020-10-30 2022-05-06 尚科生物医药（上海）有限公司 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用
CN114438052B (zh) * 2020-10-30 2024-02-09 尚科生物医药（上海）有限公司 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用
CN112725395A (zh) * 2020-12-30 2021-04-30 江苏诚信药业有限公司 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法
CN112725395B (zh) * 2020-12-30 2024-04-09 江苏诚信药业有限公司 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法
CN114807078A (zh) * 2022-04-19 2022-07-29 四川盈嘉合生科技有限公司 一种生物合成nmn的方法
CN114807078B (zh) * 2022-04-19 2023-09-01 四川盈嘉合生科技有限公司 一种生物合成nmn的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105755019A (zh) 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用
CN112795606B (zh) 一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法
CN111534493B (zh) 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用
CN112359082B (zh) 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法
JP4505011B2 (ja) ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸の酵素合成法
Kamel et al. Chemo-enzymatic synthesis of α-D-pentofuranose-1-phosphates using thermostable pyrimidine nucleoside phosphorylases
JP6638086B2 (ja) フルクトースからアロースを生産する菌株およびこれを用いたアロース生産方法
CN108018252B (zh) 一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法
CN113373100A (zh) 一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用
CN111269870A (zh) 一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用
CN110551781A (zh) 一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法
CN117070491B (zh) 嘌呤核苷磷酸化酶突变体及2'-氟代核苷的制备方法
JP2024515083A (ja) β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用
WO2024082546A1 (zh) 阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物
WO2024040628A1 (zh) 酶催化合成嘌呤核苷的方法及组合物
US6040158A (en) Process for preparing sugar nucleotide
JP3764755B2 (ja) 「アデノシン５’−三リン酸の製造法及びその応用」
CN105154457B (zh) 一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用
JP5140242B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN117106744B (zh) 嘧啶核苷磷酸化酶突变体及2'-氟代核苷的制备方法
KR101818561B1 (ko) 바실러스 유래 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 3'-아미노-2',3'-디데옥시아데노신의 제조 방법
CN116144720B (zh) 一种酶法生产假尿苷的方法
CN117467726B (zh) 一种嘌呤核苷的制备方法
CN116064703A (zh) 酶催化合成含有保护基的核苷的方法及组合物
RU2230118C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1-β-D-РИБОФУРАНОЗИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛ-3-КАРБОКСИАМИДА (РИБАВИРИНА)

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 510006 College of chemistry and environment, South China Normal University, Guangdong, Guangzhou, China

Applicant after: South China Normal University

Applicant after: Guangdong Food Industry Research Institute Co Ltd

Address before: 510006 College of chemistry and environment, South China Normal University, Guangdong, Guangzhou, China

Applicant before: South China Normal University

Applicant before: Guangdong Prov. Food Industry Inst.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160713