CN102703331A - 一种白藜芦醇生物转化菌种筛选、菌种鉴定及利用该菌种进行白藜芦醇生物转化的方法 - Google Patents
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Abstract
一种白藜芦醇生物转化菌种筛选、菌种鉴定及进行白藜芦醇生物转化的方法，筛选方法是将富集培养基加入虎杖浸出液中，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d后，将得出转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28℃下培养，得水解圈培养基，用甲醇提取，经TLC分析和HPLC分析，得到具有高转化能力的菌种S-4。经鉴定，该菌种为卡门培尔青霉。该菌种的培养液具有很强的催化能力，能将白藜芦醇苷完全转化为白藜芦醇，同时菌株利用生成的葡萄糖作为碳源，不具有催化能力的菌种会在生长过程中慢慢消亡。本发明为白藜芦醇的高效、安全及低成本的生产具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物活性物质生物转化技术领域，特别是一种能高效将白藜芦醇类似物转化为白藜芦醇的菌种的筛选方法及菌种鉴定及利用该菌种进行白藜芦醇生物转化的方法。
背景技术
白藜芦醇作为天然活性物，在自然界中含量低，而白藜芦醇与葡萄糖结合的糖甙类物质——白藜芦醇苷，则含量较高，研究有效提高白藜芦醇产量的途径具有重要的产业化意义。都建立等建立一种化学合成方法，白藜芦醇的总收率41.9％，仅三步就成功的合成了白藜芦醇(都建立，邹永，肖春芬.白藜芦醇的简便合成.精细化工，2009，26(6)：580-584)。丁刘刚等改进了Wittig反应，产率可65.3％(丁刘刚，晏日安，黄雪松等.白藜芦醇合成过程中双键形成方法的研究.现代食品科技，2007，23(1)：48-49)。Moro等以重氮盐为离去基团用3步反应合成白藜芦醇，总收率达72％(Moro.et al.2008)。虽然化学合成白藜芦醇的方法取得了较大的进展，但是所有的方法都存在着，合成成本高，污染大，产品安全性差等问题，均有待进一步改进。生物转化与化学催化相比，具有选择性及专一性强，催化效率高，反应过程条件温，应用范围广，绿色，天然等多项优点，生物转化中使用的是天然生物催化剂，包括微生物、植物、动物及其酶都是可再生的，并且使用后易被降解。从白藜芦醇转化菌种的筛选出发，获得具产有转化能力的菌种，并对其进行较准确的鉴定，保证其安全性，具有重要意义。
发明内容
为克服上述缺点，本发明提供一种能高效将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的菌种的筛选方法及菌种鉴定方法，还提供一种利用为该菌种进行白藜芦醇生物转化的方法，可以有效提高虎杖中白藜芦醇类似物的转化率，具有高效、安全及低成本的特点。
为达到上述目的，本发明的实施方案为：一种白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，包括以下步骤：
1)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子水，料液重量体积比为1g/2ml，静置24h，得虎杖浸出液；
2)取富集培养基分装至若干个三角烧瓶中，分别标号并加入虎杖浸出液20μL，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d后，采用TLC方法检测，得出转化效率最高的培养液；
3)将转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28℃下培养，然后观察是否有能形成水解圈的菌种长出，挑出单菌落重复操作，48h后观察水解圈形成情况；
4)取水解圈培养基，用甲醇提取，水解圈培养基/甲醇＝1g/10ml，稀释后进行TLC分析，并对白藜芦醇生成的提取物进行HPLC分析，观察白藜芦醇生成情况，根据得到的水解圈及白藜芦醇生成情况得到具有高转化能力的菌种S-4。
步骤2)中，所述富集培养基由以下方法制得：
a)称取硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g于容量瓶，蒸馏水定容至100mL，即得基础培养基；
b)将无菌白藜芦醇苷100mg加入基础培养基中，制得富集培养基。
c)在步骤a)所得基础培养基中添加基础培养基重量1.5％的琼脂固定，使用前加热溶解，冷却至50℃时称取无菌白藜芦醇苷100mg加入其中，充分混匀，即得筛选培养基。
上述步骤中，所述无菌白藜芦醇苷是在无菌工作环境下将白藜芦醇苷加入无菌乙醇中，自然挥干所得，白藜芦醇苷∶无菌乙醇＝0.5g∶10ml。
上述菌种S-4的鉴定方法包括以下步骤：
1)菌种的形态学观察，将PDA固体培养，察氏固体培养基倒平板，冷凝后用接种钩挑取菌丝少许，点接于平板，30℃培养箱中倒置培养48h以上，观察菌落形成的过程和形态；
2)用水浸片法制片，在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗；
3)参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，完成后经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察与拍摄结果；
4)将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性。
本发明的菌种鉴定为卡门培尔青霉。
利用上述菌种转化白藜芦醇类似物为白藜芦醇的工艺，包括以下步骤：
1)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子，料液重量体积比为1g/2ml，静置16-24h得虎杖浸出液；
2)另取PDA培养基装容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液；
3)将菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的体积比为0.5∶1，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d。
采用高效液相色谱分析表明，该菌种的培养液具有很强的催化能力，能将白藜芦醇苷完全转化为白藜芦醇。同时菌株利用生成的葡萄糖作为碳源，不具有催化能力的菌种会在生长过程中慢慢消亡。
具体实施方式
实施例1：白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，具体步骤是：
(1)白藜芦醇苷前处理及培养基配置
无菌工作环境下将0.5g白藜芦醇苷加入10mL无菌乙醇中，自然挥干，得无菌白藜芦醇苷备用；
称量硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g于容量瓶，蒸馏水定容至100mL，即得基础培养基。使用前称取无菌白藜芦醇苷100mg加入已灭菌基础培养基中，制备富集培养基。
(2)同理，使用上述基础培养基并添加基础培养基重量1.5％琼脂固定，使用前加热溶解，冷却至50℃时称取无菌白藜芦醇苷100mg加入其中，充分混匀，防止结块，即得筛选培养基。
(3)白藜芦醇与白藜芦醇苷TLC与HPLC检测方法
标准品采用甲醇稀释5倍后，于展开剂为氯仿∶丙酮∶无水∶乙醇∶水＝4∶4∶0.5∶0.2的TLC条件下测定Rf值。采用色谱条件：迪马C18钻石柱(200×4.6mm)；检测波长：306nm；流动相：A(0.05％磷酸水溶液)，B(乙腈)，A∶B＝65∶35；流速：1mL/min；进样体积10μL。同时，使用外标法建立标准曲线，建立白藜芦醇与白藜芦醇苷同时检测的有效条件。
(4)菌种的筛选
取打碎的虎杖10.0g置于烧杯中，向其中加入20mL去离子，静置24h，得虎杖浸出液备用。另取富集培养基分装至5个三角烧瓶中，分别标号并加入虎杖浸出液20μL，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d后，采用TLC方法检测。
将转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28℃下培养，然后观察是否有能形成水解圈的菌种长出，挑出单菌落重复操作，48h后观察水解圈形成情况。
取水解圈培养基，用刀片切出1g，用10mL甲醇提取后，稀释后进行TLC分析，并对白藜芦醇生成的提取物进行HPLC分析，观察白藜芦醇生成情况。根据得到水解圈及白藜芦醇生成情况得到具有高转化能力的菌种S-4。
实施例2：白藜芦醇生物转化菌种的鉴定方法。
对待鉴定菌种S-4分别进行形态学观察及分子生物学鉴定，具体方法是：
1)菌种的形态学观察，将PDA固体培养，察氏固体培养基倒平板，冷凝后用接种钩挑取菌丝少许，点接于平板，30℃培养箱中倒置培养48h以上，观察菌落形成的过程和形态；
2)用水浸片法制片，在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察。观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗；
3)参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA。按照表1所示配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增。完成后经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察与拍摄结果；
表1菌种18SrDNA片段PCR扩增体系
注：上游引物NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC下游引物NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA
4)将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性(Altschul et al.，1997)。使用软件DNAMAN 6.4.0进行分析构建菌株同源进化关系树。从GenBank公共数据库中收集整理一些已报道的代表不同种属的青霉菌菌株的ITS序列，加上本实验得到的ITS序列，利用NJ法构建系统进化树。
5)检测结果
经菌落形态观察，在察氏培养基上，菌落呈青绿色，圆形，中间有突起，边缘呈白色，参考真菌鉴定手册，根据菌落形态上的观察，该菌种疑似为青霉菌，有待进一步显微镜下染色观察。
经乳酸石碳酸棉兰染色液染色后于观察发现，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚。与《真菌鉴定手册》中关于青霉的描述一致，可鉴定为子囊菌亚门(Ascomycotina)，不整囊菌纲(Plectomycetes)，散囊菌目(Eurotiales)，散囊菌(Eurotiaceae)，青霉属(Penicillium)。
PCR扩增成功获得一条长度约在1800左右的亮带，参考其他文献中所述，疑似所需条带，条带亮度较高，同时无其他杂带干扰，将PCR产物外送上海吉美生物工程有限公司进行测序，得到测序结果后使用Bioedit等软件进行拼接。得到测序数据并经软件拼接得到该菌种18SrDNA序列，长度为1735。经NCBI序列比对，该序列与青霉属具有高度的同源性，与卡门培尔青霉(Penicillium camemberti)等同源性在99％以上。
从系统进化树上可看出，菌株在分类地位上位于青霉属的分支中，由此可以确定，菌株为青霉菌属中的不同种类。经查询资料，卡门培尔青霉是一种用于干酪生产上的菌种，有数百年的使用经历，充分保证了本研究中获得菌种的安全性。
实施例3：
转化白藜芦醇类似物的方法，步骤为：
1)取打碎的虎杖10.0g置于烧杯中，向其中加入20mL去离子，静置16-24h，得虎杖浸出液备用；
2)另取PDA培养基装至三角烧瓶中，加入虎杖浸出液20μL，封口备用；
3)将0.5mL菌液加入1mL的2)所得虎杖苷溶液中，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d；
4)培养液经甲醇稀释五倍后，采用高效液相色谱分析转化率(色谱条件：迪马C18钻石柱(200×4.6mm)；检测波长：306nm；流动相：0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35；流速：1mL/min；进样体积10μL。)。结果表明，利用该菌种能将80μg/mL的白藜芦醇苷完全转化为白藜芦醇。
Claims (6)
1.一种白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子水，料液重量体积比为1g/2ml，静置24h，得虎杖浸出液；
2)取富集培养基分装至若干个三角烧瓶中，分别标号并加入虎杖浸出液20μL，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d后，采用TLC方法检测，得出转化效率最高的培养液；
3)将转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28℃下培养，然后观察是否有能形成水解圈的菌种长出，挑出单菌落重复操作，48h后观察水解圈形成情况；
4)取水解圈培养基，用甲醇提取，水解圈培养基/甲醇＝1g/10ml，稀释后进行TLC分析，并对白藜芦醇生成的提取物进行HPLC分析，观察白藜芦醇生成情况，根据得到的水解圈及白藜芦醇生成情况得到具有高转化能力的菌种S-4。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，所述富集培养基的制备方法是，称取硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，氯化钟0.05g，硫酸亚铁0.001g于容量瓶，蒸馏水定容至100mL，即得基础培养基；使用前称无菌白藜芦醇苷100mg加入已灭菌基础培养基中，制得富集培养基。
3.根据权利要求1所述的白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，所述筛选培养基的制备方法是，称取硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g于容量瓶，蒸馏水定容至100mL，即得基础培养基；在基础培养基中添加基础培养基重量1.5％的琼脂固定，使用前加热溶解，冷却至50℃时称取无菌白藜芦醇苷100mg加入其中，充分混匀，即得筛选培养基。
4.根据权利要求2或3所述的白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，所述无菌白藜芦醇苷是在无菌工作环境下将白藜芦醇苷加入无菌乙醇中，自然挥干所得，白藜芦醇苷∶无菌乙醇＝0.5g∶10ml。
5.一种白藜芦醇生物转化菌种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种的形态学观察，将PDA固体培养，察氏固体培养基倒平板，冷凝后用接种钩挑取菌丝少许，点接于平板，30℃培养箱中倒置培养48h以上，观察菌落形成的过程和形态；
2)用水浸片法制片，在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗；
3)参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，完成后经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察与拍摄结果；
4)将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性。
6.一种利用如权利要求所述的方法筛选的菌种进行白藜芦醇生物转化的方法，包括以下步骤：
1)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子，料液重量体积比为1g/2ml，静置16-24h得虎杖浸出液；
2)另取PDA培养基装容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液；
3)将菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的体积比为0.5∶1，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d。
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