CN101942405B

CN101942405B - 一种己酸菌

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Publication number: CN101942405B
Application number: CN2010102381067A
Authority: CN
Inventors: 陈茂彬; 镇达; 方尚玲; 汪江波
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2030-07-27
Also published as: CN101942405A

Abstract

本发明的目的在于提供一种己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌株CCTCCNO.M2010175。该菌株具有高产己酸及较好的生长稳定性特征，经强化功能菌后可用于制备高浓度复合己酸菌液，与应用于人工窖泥的培养，在实际生产中达到缩短新建窖池老熟周期与退化窖池功能复壮的效果，提高了出酒率和优品率，解决退化老窖池复壮及缩短新建窖池老熟时间等问题。

Description

一种己酸菌

技术领域

本发明涉及一种微生物，尤其是涉及一种能够应用于人工窖泥培养及退化老窖池养护，快速增加窖泥中主要功能菌数量，缩短窖池老熟时间的高产己酸菌株。

背景技术

浓香型大曲酒发酵采用独特的泥窖发酵工艺，属于多种微生物群的共同发酵，是一个复杂的生物化学反应体系。研究发现，浓香型白酒以己酸乙酯为主体香味物质，己酸乙酯含量多少直接影响大曲酒的质量。它来源于栖息在窖泥中一类梭状芽孢杆菌-己酸菌所产己酸与酒醅中酵母产生的乙醇的化合。在发酵过程中，己酸与己酸乙酯的生成主要在窖泥与酒醅接触的界面上进行，梭状芽孢杆菌在环境条件适宜时，通过下列途径合成己酸乙酯：

(1)乙醇和乙酸结合生成丁酸，丁酸再与乙醇结合生成己酸。

CH₃CH₂OH+CH₃COOH→CH₃(CH₂)₂COOH+H₂O

↓+CH₃CH₂OH

CH₃(CH₂)₄COOH+H₂O

(2)己酸与乙醇发生酯化反应，生成浓香型白酒的主体香己酸乙酯。

CH₃(CH₂)₄COOH+CH₃CH₂OH→CH₃(CH₂)₄COOC₂H₅+H₂O

人们很早就在生产实践过程中发现，浓香型大曲酒产酒质量的优劣与泥窖的窖龄有关。一般而言，发酵窖池窖龄越长，产酒质量越好。但是，新建窖池依靠自然老熟要达到老窖的标准，需要经过漫长的岁月，短则数十年长则几十年。同时，发酵窖池由于自然环境的变化、窖池内生化反应作用等综合原因，使得窖泥中的营养成分的缺失及酸碱度的变化，己酸菌生长繁殖与代谢受到抑制，引起窖池老化、功能退化，产酒质量下降的现象。己酸菌作为窖泥中关键功能菌，在窖泥中含量多少决定了窖泥的质量。

浓香型大曲酒厂随着生产需求的不断扩大，要构建新窖池，但新建窖池并不能马上生产出优质酒，并且老窖池由于各种原因可能也会出现退化。为了使新建窖池和退化老窖池尽快产出好酒，科研技术工作者开始对发酵窖池的研究，利用各种生物科技手段，探究老窖泥生化功能及发酵窖泥的老熟机理，以期缩短新建窖池达到优质窖泥水平自然老熟过程及恢复退化窖池的生化功能。

高素洁等人(《生物技术》1997年第7期《己酸菌的分离筛选及发酵条件的研究》)公开了一株从黑龙江省富裕酒厂的窖泥中分离到高产己酸的菌株，并通过发酵条件的研究，该菌株己酸最高产量可达540mg/100ml。然而，该文献没有对该菌株做种属鉴定，也没有公开该菌株的拉丁名称。吴根福等人(《杭州太学学报(自然科学版)》1996年7月第23卷第3期《己酸菌的自然选育及其生物学特性的初步研究》)公开了一株从杭州酒厂三家村分厂的大曲酒窖池底泥中分离到产己酸量较高的菌株，经初步鉴定为梭状芽孢杆菌属，并推测是克氏控状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)，其最适生长温度35℃，最适pH为7.0左右，最适酵母提取物浓度在生长时为1％、产酸时为0.1％，乙醇浓度在1％-4％范围内对生长和产酸影响不大；在醋酸钠培养基中生长10天，己酸产量最高可达380mg/100ml。周春红等人(《食品与发酵工业》，《浓香型大曲酒生产中己酸菌的制备》)公开了从白酒厂的窖池中提取己酸菌进行人工培养强化，再模仿天然状态条件混合窖泥共同厌氧发酵，以达到己酸菌的自然生长条件，并对采用人工窑泥生产的浓香型白酒进行了评定，结果是，己酸乙酯的含量最高为3.05g/L，总酯的产量最高为4.62g/L。中国专利CN101306020公开了己酸菌在制备预防和治疗肠癌药物组合物中的应用，包括预防肠息肉、克罗恩病、溃疡性结肠炎等慢性肠道疾病癌变、晚期不能手术肠癌的辅助治疗、肠癌手术后的辅助治疗等，己酸菌选自但不限于己酸菌(Clostridium butyricum)CGMCC 0313.1。

发明内容

本发明的目的在于提供一种己酸菌(Clostridium butyricum)GK13。该菌株具有高产已酸及较好的生长稳定性特征，经强化功能菌后可用于制备高浓度复合己酸菌液，应用于人工窖泥的培养，在实际生产中达到缩短新建窖池老熟周期与退化窖池功能复壮的效果，提高了出酒率和优品率，解决退化老窖池复壮及缩短新建窖池老熟时间等问题。

发明人通过大量试验筛选各地名优浓香型大曲酒优质老窖泥，最终获得了本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13，并于2010年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2010175。

本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13的形态特征如下：

于1000倍显微镜观察高产己酸菌株GK13的菌体形态，菌株形态特征为：梭状芽孢杆菌，短杆端生芽孢，呈鼓锤状，1.8μm～2.4μm，革兰氏阴性菌。

本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13的培养特征如下：

分离培养基(乙醇醋酸钠培养基，Ethanol～acetate Medium，EAM)：乙醇2.0％(灭菌后使用前加入)、NaAc0.5％、酵母0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄0.04％、(NH₄)₂SO₄0.05％、CaCO₃1.0％，自然pH；固体培养基加入3.0％的琼脂(参见图1)。

乙酸钠培养基CO₂厌氧培养箱35℃培养4d，淡褐色，扁平中间稍凸起，质地柔软，菌落大小(1.4～2.0)cm。

乙酸钠培养基真空厌氧培养35℃培养4d，浅黄色，扁平中间稍凸起，质地柔软，菌落大小(0.8～1.6)cm(参见图2)。

本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13的生物学特性如下：

己酸菌(Clostridium butyricum)GK13己酸菌菌体芽孢菌数数量与产酸量随着培养时间增加先后达到峰值，芽孢菌数6d～7d达到高峰，己酸产量则在10d左右达到高峰。生长温度范围为25℃～45℃，最适培养温度为32℃～38℃；对乙醇有较好的耐受性，在乙醇浓度0～7％范围内均能生长，最适培养乙醇浓度为2.0％；在pH2.0～pH7.0范围内均能生长，不适宜在碱性环境下生长，最适pH值为pH6.5～pH7.0。

本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13的在EAM培养基35℃培养4d，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。

本发明涉及的微生物，通过强化功能菌方式，而获得高浓度复合己酸菌系，运用于退化老窖池的复壮与人工窖泥的培养，能够在较短的周期内提高退化窖池与新建窖池的出酒率和优质率。该操作简单，效果明显，不改变原有的生产流程，且酒的质量和风味都稳定。既经济又环保，减少企业开支，提高经济效益。

本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌种与现有技术相比，具有如下有益的技术效果：

1)通过实施例2可以看出，含有己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌种的复合已酸菌系，产己酸的水平为856.0mg/100mL，产丁酸的水平为362.0mg/100mL，比高素洁等人(《生物技术》1997年第7期《己酸菌的分离筛选及发酵条件的研究》报道的菌株产己酸量高316.0mg/100mL，具有显著的进步。

2)通过实施例3可以看出，利用本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌种制备的复合己酸菌菌系ZC-21，在人工窖泥培养中的总酸产量水平可高达1.15g/L，总酯产量水平可高达5.71g/L，己酸乙酯的产量水平可高达269.19mg/100mL。比周春红等人(《食品与发酵工业》，《浓香型大曲酒生产中己酸菌的制备》)报道的菌株总酯产量高1.09g/L。另外，从表2～4实验结果表明，应用复合己酸菌ZC-21菌液于人工培养的老窖泥，能够有效的维护老窖池中窖泥的营养平衡，稳定并增强窖内优势菌群，感官评定、理化和微生物指标均与优质老窖泥质量相接近。应用于扩建的新窖池中能快速形成窖内有益微生物生态环境，窖泥质量在短期内接近于成熟窖池，第三排便所产原酒的四大酯比例为：己酸乙酯∶乳酸乙酯∶乙酸乙酯∶丁酸乙酯＝1∶0.63∶0.59∶0.096，其比例协调，感官评定完全达到了优质基酒的标准。

3)通过实施例4可以看出，利用本发明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌种制备的复合己酸菌菌系ZC-21，在退化老窖池复壮中的己酸乙酯产量依然可以高达330.78mg/100mL，总酯的产量可高达823.95mg/100mL，比周春红等人(《食品与发酵工业》，《浓香型大曲酒生产中己酸菌的制备》)报道的菌株总酯产量高3.62g/L，己酸乙酯产量高出0.26g/L。另外，表5数据结果表明，复合己酸菌菌系ZC-21能有效补充了窖内优势菌群，提高了窖泥的生香功能。采用窖泥培养液复壮窖池，激活和增加了有益微生物菌群，使己酸乙酯含量显著提高。四大酯比例较为协调，窖内发酵能力增强，生香功能明显提高。

附图说明

图1为本发明所述的高产己酸菌株GK13在EAM培养基上CO₂厌氧培养的菌落图

图2为本发明所述的高产己酸菌株GK13在EAM培养基上真空培养的菌落图

图3为本发明所述的高产己酸菌株GK13在1000倍显微镜菌体形态图

图4为本发明所述的高产己酸菌株GK13在16S rDNA PCR产物电泳图，其中1为DNAMarker，2为16SrDNA PCR产物

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1己酸菌(Clostridium butyricum)GK13的制备

己酸菌(Clostridium butyricum)GK13是一株分离于浓香型白酒优质老窖泥的梭状芽孢杆菌，分离培养基(EAM培养基)乙醇2.0％(灭菌后使用前加入)、NaAc0.5％、酵母0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄0.04％、(NH₄)₂SO₄0.05％、CaCO₃1.0％，自然pH；固体培养基加入3.0％的琼脂。取各窖泥样品通过80℃热处理方式，经富集培养做硫酸铜显色进行初筛，选取产酸产气情况较好的样品进一步筛选，对产物做气相色谱定性定量分析，选取产己酸水平最佳的试样进行分离纯化。取复筛试样液1mL，加无菌水10ml，振荡1mim，接种环取少量液体在琼脂分离培养基上划线，每样4皿。在真空条件与CO₂厌氧条件下，35℃培养3d～4d，获得单菌落。该菌种在平板上纯化，确定为单一菌种后，经镜检观察选取梭状芽孢杆菌，接种于EAM液态培养基发酵培养2周，对产物做气相色谱分析，最终确定筛选菌株，对该菌株进行生理生化鉴定和性能实验，该菌最适生长温度35℃，最适pH范围pH6.5～pH7.0在液体静止培养时利用乙醇、乙酸钠与各类微量因子等多种底物生长，生成己酸和丁酸为主的产物，经16S rDNA测序鉴定为己酸菌(Clostridium butyricum)，并命名为己酸菌(Clostridiumbutyricum)GK13，已于2010年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.M2010175。

实施例2复合己酸菌系的制备

取己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌种，复合甲烷菌与丁酸菌进行强化，采用80℃热处理方式对复合菌系进行复壮，制备成高浓度复合己酸菌菌系ZC-21。经强化后，ZC-21产酸水平与产芽孢总量菌有较大幅度的提升，并且经多次传代培养结果分析表明，该菌系产酸水平及芽孢菌体生长情况未出现退化现象，具有较好的稳定性。试验结果见表1。

表1复合己酸菌菌系ZC～21产酸、芽孢的水平

实施例3实施例2制备的复合己酸菌菌系ZC～21在人工窖泥培养中的应用

(1)人工窖泥培养配方：复合己酸菌液10％，优质大曲粉2.0％，优质母糟6.6％，老窖泥4.4％，豆饼粉1.3％，骨粉1.3％，尿素1.3‰，白糖1.3‰，磷酸氢二钾1.3‰，酒尾(酒精)2.8％，黄泥10.0％，底锅黄水25.0％，黄土36.21％。

(2)人工窖泥培养工艺流程

粘黄土粉、泥、窖皮泥等→分层配料→润料(酯化液+营养液)→翻拌(复合己酸菌液+酒尾等)→踩揉和泥→堆积发酵→入池发酵→窖泥质量检测→生产应用

(3)人工窖泥培养操作步骤

步骤一：先将鲜黄泥(干细黄泥)或优质泥、窖皮泥、活性淤泥、粮糟、泥碳等原辅料按配方一层层铺好，厚度控制在30cm～50cm左右，然后加入由接种泥、己酸菌培养液、发酵液、大曲酒等的混合液体，充分拌匀、收堆，高约1m，再泼部分混合液，控制水分在35％～38％，表面拍光，涂上一层黄泥浆。外用塑料薄膜盖住，边头处用黄泥密封。插上温度计，观察发酵变化情况。如温度不够，用热丢糟进行覆盖，使发酵温度保持在32℃以上。发酵25d～30d，进行常规理化分析和感官鉴定。

步骤二：进行翻堆，断面色泽鲜艳，气味正常无明显的异杂味、泡气。根据检测结果，补充所需的营养成分。控制水分在36％～39％，32℃以上堆积发酵25～30d，处理方法同前。

步骤三：经过两轮的发酵，窖泥已基本成熟，感官上呈黄褐色或黑褐色，基本上无原料本色，有较明显的老窖泥气味。镜检中有较多的梭状芽孢杆菌，理化指标基本上能达到。处理得当，该轮结束就可以做为成品泥。此轮翻堆足将泥踩至柔熟，重点补充菌液及营养物质。收堆后表面上喷洒高浓度酒，保持温度于38℃，发酵25d～30d。

步骤四：经过三个月的发酵，窖泥已经成熟。成熟的窖泥色泽呈乌黑、黑褐色，无原料本色，质地均匀，断面泡气，有明显的老窖泥气味，镜检含有丰富、健壮的梭状芽孢杆菌。

(4)人工窖泥的应用效果检验

对比分析退化窖泥、人工窖泥及优质窖泥营养成分和微生物指标，以及将经复合己酸菌系培育的人工窖泥应用实际生产酿造过程，同经退化窖池与优质老窖池发酵产酒质量对比分析其理化指标。结果见表2～4。

表2三种窖泥成分比较

表3窖泥感官比较

表4产酒理化指标比较

从表2～4实验结果表明，应用复合己酸菌ZC-21菌液于人工培养的老窖泥，能够有效的维护老窖池中窖泥的营养平衡，稳定并增强窖内优势菌群，感官评定、理化和微生物指标均与优质老窖泥质量相接近。应用于扩建的新窖池中能快速形成窖内有益微生物生态环境，窖泥质量在短期内接近于成熟窖池，第三排便所产原酒的四大酯比例为：己酸乙酯∶乳酸乙酯∶乙酸乙酯∶丁酸乙酯＝1∶0.63∶0.59∶0.096，其比例协调，感官评定完全达到了优质基酒的标准。

实施例4复合己酸菌菌系ZC～21在退化老窖池复壮中的应用：

(1)复壮培养液配方及制备方式

ZC～21复合己酸菌液25～30kg，优质窖泥(常压杀菌半个小时)10～15kg，黄土30kg，20°酒尾15～20kg，洗糟水(煮沸去渣)13～20kg，大曲粉6kg，生香酵母(32～35℃温水活化2个小时)300g，乙酸钠130g，磷酸氢二钾50g，磷酸铵50g，酯化红曲475g。

将上述原料拌和成糊状，酒度调整为2％，pH6～pH 6.5，培养品温32～35℃，第2d搅拌一次，密封培养7d左右，即可使用。

(2)退化窖池复壮方法

对老化窖池的窖泥进行认真化验分析。测定窖泥水分、pH值、N，P，K含量、腐植质、厌氧芽孢杆菌总数、己酸含量等指标。

先将窖壁，窖底残糟清扫干净，铲除老化窖泥和窖壁受杂菌感染的窖泥。窖壁30°角打孔，孔径为8～10mm，孔距6～8cm。孔打好后将培养好的糊状培养液，由上往下浇灌。浇灌后，将剩余的培养液与窖底泥拌和成柔泥，用柔泥将浇灌后的窖壁抹平。窖底撒大曲粉15～25kg，翻窖底15cm左右。翻底后将窖底泥、大曲粉和窖泥培养液拌匀、蹂柔铺平窖底，全窖撒大曲粉5～8kg，即可按正常工艺入窖。

(3)窖池复壮效果检验

表5复合己酸菌菌系ZC～21对老化窖池的复壮效果

表5数据结果表明，复合己酸菌菌系ZC～21能有效补充了窖内优势菌群，提高了窖泥的生香功能。采用窖泥培养液复壮窖池，激活和增加了有益微生物菌群，使己酸乙酯含量显著提高。四大酯比例较为协调，窖内发酵能力增强，生香功能明显提高。

从上述实施例3、4可以看出，利用复合己酸菌菌系ZC～21能有效增强窖泥中功能菌数量，提高产酒中己酸乙酯的含量，可提高出酒率和优质率，缩短窖池老熟周期，提高经济效益。该操作简单，效果明显，不改变原有的生产流程，且酒的质量和风味都稳定。

本发明中所描述的具体实施例仅仅对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采取类似的方式替代，但是并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书保护的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明，并引证了一些具体的实施例，但是对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或者修正是显然的。

Claims

1.己酸菌（Clostridium butyricum）GK13菌株 CCTCC NO. M2010175。