CN105567613A - 一种人工窖泥的制备方法 - Google Patents

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黄训端
张部昌
陈兴杰
祝熙
董宏
谢国排
彭兵
马玉磊
张宝年
杨牢记
程伟
丁鹏飞
王明才
徐亚磊
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Abstract

本发明公开了一种人工窖泥的制备方法。本发明的人工窖泥的制备方法是将窖泥复合菌液、黄泥、曲粉、干酵母、酯化红曲、窖底泥、池头泥、小麦粉、豆饼、酵母膏、乙酸钠、磷酸铵、硫酸铵、磷酸氢二钾和食用酒精混匀后培养得到的，所述窖泥复合菌液是将克氏梭状芽孢杆菌(Clostridium？kluyveri)JZZ？CGMCC？No.11948培养液和窖泥混合菌培养液混匀得到的菌液。通过实验证明：本发明制备的人工窖泥当年即可产出好酒，优质率提高11％左右，而且口感纯正、香气浓厚，尾净余长。本发明工艺简单，操作便捷，成本低廉，可推广应用。

Description

一种人工窖泥的制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种人工窖泥的制备方法，属于白酒酿造生产技术领域。
背景技术
窖泥是浓香型白酒生产的基础物质，富集有多种有益微生物，尤其是功能己酸菌，其代谢产物己酸为浓香型白酒特征成分己酸乙酯的合成提供了前体物。在自然状态下，窖泥的培养是一个长期过程，微生物驯化期长达几年甚至数十年，窖泥的老熟过程极其缓慢。为此，各大酒企争相开发新窖泥培养技术及其生产工艺，但不同酒厂在窖泥研制培养过程中，添加的原辅料及具体的工艺技术不同，造成最终的窖泥质量各不相同，有的效果不甚理想。
在酿酒实践中，人工窖泥应用效果不良主要表现在：一是缺乏窖底香，窖泥微生物数量以及产酸产酯能力有限，所产白酒淡薄味短，主体香气不浓或没有香味成分；二是人工窖泥往往带有泥杂味，所产白酒不同程度携带泥臭味、泥腥味、泥霉味等不良气味，致使白酒品质低劣。上述问题根源在于人工窖泥熟化程度不够。浓香型白酒窖底香气主要成分为己酸乙酯，其关键功能菌为己酸菌。在人工窖泥中，提高己酸菌数量，并在窖泥中提供己酸菌的优越营养需求，是解决缺乏窖底香的根本途径。
刚采集的鲜黄泥一般为生泥，生活着大量土壤放线菌、霉菌、真菌、细菌等微小生物，这些微生物的代谢产物是导致泥臭味、泥腥味、泥霉味等泥杂味的根源，同时，土壤具有复杂的空间异质性，土壤间隙长期积累了异味气体。由于制作窖泥时，黄泥用量很大，又属于食品行业，不能使用杀菌剂，其中的原有微生物难以杀灭，不仅影响接种窖泥功能菌的生存，而且也为酿酒中的泥杂味带来隐患。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于制备人工窖泥的窖泥复合菌液。
本发明提供的用于制备人工窖泥的窖泥复合菌液按照如下方法制备：将克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液和窖泥混合菌培养液混匀，得到窖泥复合菌液；
所述克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液中JZZ菌量和所述窖泥混合菌培养液的总菌量的个数比为1：1；
所述窖泥混合菌培养液为培养窖泥得到的培养液。
本发明的克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948于2015年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.11948。
上述方法中，
所述窖泥是指产酒特优率在20％或20％以上的窖泥，上述特优率的计算方法如下：特优率＝特优质原酒的质量/总产原酒质量*100％。其中，发酵期满，酒醅出池，上甄蒸馏，分段摘酒，各段摘酒原量质量(kg)总和记录为每窖池总产原酒质量(kg)；对每段所摘的原酒进行己酸乙酯含量检测，其中己酸乙酯含量大于3.0g/kg的记录为特优质原酒，称量特优质原酒的质量(kg)。本发明所用的窖泥为老窖泥；所述老窖泥是安徽金种子酒业股份有限公司的产品。
上述方法中，
所述克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液按照包括如下方法步骤制备：培养JZZ菌株至菌浓度为108-109CFU/mL，得到JZZ菌株培养液；
所述窖泥混合菌培养液按照包括如下方法步骤制备：培养窖泥至总菌浓度为108-109CFU/mL，得到窖泥混合菌培养液。
上述方法中，
所述培养时间为5-7天，所述培养时间具体为7天；所述培养温度为37℃；所述培养基为乙酸钠液体培养基，所述乙酸钠液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度为：乙酸钠0.5％(质量分数)、酵母膏0.1％(质量分数)、硫酸镁0.02％(质量分数)、磷酸氢二钾0.04％(质量分数)、硫酸铵0.05％(质量分数)、碳酸钙1％(质量分数)，乙醇2％(质量分数)。
上述方法中，
所述窖泥复合菌液为将所述克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液和所述窖泥混合菌培养液按照体积比为1:1混匀得到的菌液。
本发明的另一个目的是提供上述窖泥复合菌液的新用途。
本发明提供了上述窖泥复合菌液在制备人工窖泥中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种人工窖泥的制备方法。
本发明提供的人工窖泥的制备方法包括如下步骤：将上述窖泥复合菌液、黄泥、曲粉、干酵母、酯化红曲、窖底泥、池头泥、小麦粉、豆饼、酵母膏、乙酸钠、磷酸铵、硫酸铵、磷酸氢二钾和食用酒精混匀，培养，得到人工窖泥。
上述方法中，
所述窖泥复合菌液、所述黄泥、所述曲粉、所述干酵母、所述酯化红曲、所述窖底泥、所述池头泥、所述小麦粉、所述豆饼、所述酵母膏、所述乙酸钠、所述磷酸铵、所述硫酸铵、所述磷酸氢二钾和所述食用酒精的质量比为(100-300)：1000：(20-40)：(0.05-0.10)：(5-10)：(30-50)：(10-30)：(20-60)：(5-10)：(2-4)：(12-24)：(2-4)：(4-8)：(4-8)：(10-30)。
上述方法中，
所述窖泥复合菌液、所述黄泥、所述曲粉、所述干酵母、所述酯化红曲、所述窖底泥、所述池头泥、所述小麦粉、所述豆饼、所述酵母膏、所述乙酸钠、所述磷酸铵、所述硫酸铵、所述磷酸氢二钾和所述食用酒精的质量比为200：1000：30：0.075：7.5：40：20：30：7.5：3：18：3：6：6：20。
上述方法中，
所述培养为厌氧培养；所述厌氧培养的时间为50-90天；所述厌氧培养的温度为30-37℃。
上述方法中，
在所述培养前，还包括向混匀产物中加水并搅拌至窖泥颗粒小于0.5cm的步骤；所述水在所述混匀产物中的质量分数为45％。
上述方法中，
所述黄泥为爆晒后的黄泥。
本发明的最后一个目的是提供上述方法制备得到的人工窖泥。
上述窖泥复合菌液或上述方法或上述人工窖泥在制备窖池或酿酒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明依据老窖泥的特征，紧紧围绕窖泥培养存在的突出问题，在黄泥处理、功能菌强化、营养配方以及人工窖泥工艺等方面进行了优化，提供了一种浓香型人工窖泥的制备方法。该方法在新窖泥生产中的原料处理上，先爆晒新黄泥，杀灭“土著”微生物，释放泥土间隙气体，消除新泥可能带入的泥杂味；合理配料，添加C、N、P、S等元素改善新泥营养结构；强化接种高活性己酸菌和优质窖泥混合菌，定植、扩增窖泥酿造微生物；下池后水密封厌氧培养，精心管理，快速熟化人工窖泥。通过熟化处理，窖泥中己酸的含量达到5.0mg/g、己酸乙酯的含量达到0.50mg/g；感官上表现为：色泽乌黑，柔软适度，粘附力强，有窖底香气，无不良气味。本发明制备的人工窖泥当年即可产出好酒，优质率提高11％左右，而且口感纯正、香气浓厚，尾净余长。本发明工艺简单，操作便捷，成本低廉，可推广应用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的乙酸钠液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度为：乙酸钠0.5％(质量分数)、酵母膏0.1％(质量分数)、硫酸镁0.02％(质量分数)、磷酸氢二钾0.04％(质量分数)、硫酸铵0.05％(质量分数)、碳酸钙1％(质量分数)，乙醇2％(质量分数)，灭菌后添加，pH为6.5。称量溶解后，121℃灭菌30min。
实施例1、克氏梭状芽胞杆菌JZZ的获得
一、菌株的分离
1、窖泥的发酵培养
将乙酸钠液体培养基装入试管中(装液量90％)，向试管中加入1g老窖泥(安徽金种子酒业股份有限公司)，80℃水浴热处理10min，密封，37℃发酵培养7d，得到发酵液。
2、发酵液的纯化培养
用乙醚萃取步骤1获得的发酵液，并用硫酸铜显色法初筛，蓝色为阳性；取初筛为阳性的菌液1mL，添加到装有乙酸钠液体培养基的试管中，80℃水浴热处理10min，密封，37℃培养7d；重复纯化2-3次，得到纯化后发酵液。
3、纯化后发酵液
将步骤2获得的纯化后发酵液进行梯度稀释，并在乙酸钠固体培养基中涂平板，37℃培养7d后，挑取单个菌落进行发酵，并通过气相色谱对发酵培养得到的菌液中乙酸含量进行检测。最终筛选到一株高产己酸的菌株，将其命名为JZZ。
二、JZZ的鉴定
1、形态鉴定
经对JZZ菌株的形态观察，JZZ菌株的形态如下：直杆状，芽抱端生或近端生，在固体培养基培养7d后，形成圆形菌落，表面平滑、乳白色，有光泽，边缘整齐，不透明。
2、分子鉴定
提取菌株JZZ的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株JZZ16SrDNA保守区的片段并对其进行测序。引物序列如下：
27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
JZZ菌株的16SrDNA序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司(上海市浦东新区康新公路3399号时代医创园3号楼，021-51875086)完成。菌株JZZ16SrDNA为序列1。并将其在GeneBank中进行比对。
在GeneBank的比对结果显示，JZZ与克氏梭状芽孢杆菌(JN592512.1)的16SrDNA基因的相似性达到100％。
3、菌株的保藏
根据形态特征和分子鉴定结果和分析，将菌株JZZ确定为克氏梭状芽孢杆菌。菌株JZZ的分类命名为克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)，该菌株于2015年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.11948。
实施例2、人工窖泥的制备方法
一、窖泥复合菌液的制备
1、将实施例1分离的JZZ菌株在装有乙酸钠液体培养基的试管中(装液量90％)进行活化培养(37℃)，培养至菌浓度达到108-109CFU/mL(培养7天)，得到己酸菌株JZZ培养液；
2、取老窖泥(安徽金种子酒业股份有限公司，产酒特优率在20％或20％以上)在LB培养基中进行扩大培养(37℃)，扩培至菌浓度达到108-109CFU/mL(培养7天)，得到窖泥混合菌培养液；
3、将上述己酸菌株JZZ培养液和窖泥混合菌培养液按照体积比为1:1的比例混匀，得到窖泥复合菌液(菌浓度为108-109CFU/mL)。
二、人工窖泥的制备及培养
1、黄泥预处理
将黄泥(来源于安徽省阜阳市郊区)进行长时间爆晒，杀灭放线菌、霉菌以及杂细菌等土壤中原有微生物，并将土壤粒子中残存的微生物代谢物释放或光解，得到处理后的黄泥。在春夏季，挖取鲜黄泥摊成厚约30cm左右的薄层，露天爆晒20-30天，每隔3天上下翻转1次，遇阴雨天覆盖塑料布。一方面，有利于定植窖泥功能菌；另一方面，由于放线菌等杂菌存在会产生泥腥味、泥臭味、泥霉味，避免酿酒中产生嫌忌成分，提高酿酒品质。
2、将步骤1处理后的黄泥1000g、曲粉(安徽金种子酒业股份有限公司)30g、干酵母(安徽金种子酒业股份有限公司)0.075g、酯化红曲(安徽金种子酒业股份有限公司)7.5g、窖底泥(安徽金种子酒业股份有限公司)40g、池头泥(安徽金种子酒业股份有限公司)20g、小麦粉(安徽阜阳市场)30g、豆饼(安徽阜阳市场)7.5g、酵母膏(国药集团)3g、乙酸钠(国药集团)18g、磷酸铵(国药集团)3g、硫酸铵(国药集团)6g、磷酸氢二钾(国药集团)6g、食用酒精(国药集团，乙醇含量95％)20g和步骤一制备的窖泥复合菌液200g混匀，补水至含水量达到45％左右，得到窖泥。
3、和泥下池
采用搅泥机(3KW，螺旋式自制搅泥机)搅拌上述步骤2获得的窖泥3次，搅拌至窖泥颗粒小于0.5cm，得到搅拌后的窖泥。
4、水密封厌氧培养
将搅拌后的窖泥填入窖池(入池温度为32-34℃)，覆盖食品级塑料薄膜，窖池壁与塑料薄膜之间加水，以水密封，培养一段时候，大量气泡产生，形成厌氧环境，促进窖泥微生物生长，培养50天(30-37℃)，得到人工窖泥。
三、人工窖泥
1、人工窖泥的特性
人工窖泥的表现为：柔软适度，粘附力强，有窖底香气，无泥腥、泥臭和泥霉等不良气味。
2、人工窖泥的中己酸含量和己酸乙酯含量的检测
称取人工窖泥样品1.0g，加入10mL60％乙醇溶液，振荡，摇匀，静置12h后，离心取上清，采用0.22μm微孔滤膜过滤，取过滤液500μL于5mL容量瓶中，加乙醚定容至5mL，充分振荡2min，静置1min，吸取上层乙醚萃取液，备测。采用气相色谱分别检测己酸和己酸乙酯的含量。色谱条件为：进样口温度240℃；柱箱起始温度：100℃(1min)；升温速率：10℃/min；柱温终温度：220℃(2min)；检测器温度250℃；气体流量：氢气40ml/min，空气400ml/min，尾吹气30mL/min；进样方式：分流进样，分流比20:1；进样体积：1μL。
结果表明：人工窖泥中己酸的含量为5.0mg/g，己酸乙酯的含量为0.50mg/g左右。
实施例3、人工窖泥在酿酒中的应用
将实施例2制备的人工窖泥踩制新窖池，作为试验窖泥池进行酿酒(设置试验池2个，分别编号：1、2)，发酵期满，酒醅出池，上甄蒸馏，分段摘酒，各段摘酒原量质量(kg)总和记录为每窖池总产原酒质量(kg)；对每段所摘的原酒进行己酸乙酯含量检测，其中己酸乙酯含量大于3.0g/kg的记录为特优质原酒，称量特优质原酒的质量(kg)。特优率＝特优质原酒的质量/总产原酒质量*100％。同时以车间正常生产的老窖池为对照窖池(设置对照池5个，分别编号：3、4、5、6、7)。
上述原酒的己酸乙酯含量检测方法：将原酒采用0.22μm微孔滤膜过滤，取过滤液500μL于5mL容量瓶中，加乙醚定容至5mL，充分振荡2min，静置1min，吸取上层乙醚萃取液，备测。采用气相色谱检测己酸乙酯含量。色谱条件为：进样口温度240℃；柱箱起始温度：100℃(1min)；升温速率：10℃/min；柱温终温度：220℃(2min)；检测器温度250℃；气体流量：氢气40ml/min，空气400ml/min，尾吹气30mL/min；进样方式：分流进样，分流比20:1；进样体积：1μL。
结果如表1所示：从表1中可以看出，试验池的特优率平均为25.54％，对照池的特优率为13.39％，添加窖泥强化营养菌剂的试验池的特优率的明显高于对照池，每池特优率提高11％左右。说明了本发明的人工窖泥的产酒质量高于老窖泥。
表1、试验池与对照池的特优率

Claims (10)

1.一种用于制备人工窖泥的窖泥复合菌液，按照如下方法制备：将克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液和窖泥混合菌培养液混匀，得到窖泥复合菌液；
所述克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液中JZZ菌量和所述窖泥混合菌培养液的总菌量的个数比为1：1；
所述窖泥混合菌培养液为培养窖泥得到的培养液。
2.根据权利要求1所述的窖泥复合菌液，其特征在于：
所述克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZCGMCCNo.11948培养液按照包括如下方法步骤制备：培养JZZ菌株至菌浓度为108-109CFU/mL，得到JZZ菌株培养液；
所述窖泥混合菌培养液按照包括如下方法步骤制备：培养窖泥至总菌浓度为108-109CFU/mL，得到窖泥混合菌培养液。
3.权利要求1或2所述的窖泥复合菌液在制备人工窖泥中的应用。
4.一种人工窖泥的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1中的窖泥复合菌液、黄泥、曲粉、干酵母、酯化红曲、窖底泥、池头泥、小麦粉、豆饼、酵母膏、乙酸钠、磷酸铵、硫酸铵、磷酸氢二钾和食用酒精混匀，培养，得到人工窖泥。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述窖泥复合菌液、所述黄泥、所述曲粉、所述干酵母、所述酯化红曲、所述窖底泥、所述池头泥、所述小麦粉、所述豆饼、所述酵母膏、所述乙酸钠、所述磷酸铵、所述硫酸铵、所述磷酸氢二钾和所述食用酒精的质量比为(100-300)：1000：(20-40)：(0.05-0.10)：(5-10)：(30-50)：(10-30)：(20-60)：(5-10)：(2-4)：(12-24)：(2-4)：(4-8)：(4-8)：(10-30)。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述窖泥复合菌液、所述黄泥、所述曲粉、所述干酵母、所述酯化红曲、所述窖底泥、所述池头泥、所述小麦粉、所述豆饼、所述酵母膏、所述乙酸钠、所述磷酸铵、所述硫酸铵、所述磷酸氢二钾和所述食用酒精的质量比为200：1000：30：0.075：7.5：40：20：30：7.5：3：18：3：6：6：20。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述培养为厌氧培养；
所述厌氧培养的时间为50-90天；
所述厌氧培养的温度为30-37℃。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述培养前，还包括向混匀产物中加水并搅拌至窖泥颗粒小于0.5cm的步骤；
所述水在所述混匀产物中的质量分数为45％。
9.由权利要求4-8中任一所述的方法制备得到的人工窖泥。
10.权利要求1或2所述的窖泥复合菌液或权利要求4-8中任一所述的方法或权利要求9所述的人工窖泥在制备窖池或酿酒中的应用。
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