CN116515909A - 一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法及其应用 - Google Patents

一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法及其应用，属于饲用微生物添加剂技术领域，制备方法包括以下步骤：首先发酵丁酸梭菌至含菌量为5‑10×108CFU/mL，并将其发酵液在80‑100℃灭活10分钟；然后加入1‑2wt％的蔗糖，调节pH值至酸性，并接种罗伊氏乳杆菌，静置发酵至其含菌量为1‑5×108CFU/mL；最后用碱将发酵液pH值调至中性，80‑100℃灭活30分钟，并低温真空冷冻干燥成粉剂。尤其是，按本发明所述制备的后生元与羧甲基茯苓多糖粗提物复配之后可以改善动物肠道健康以及显著协同促进其生长。

Description

一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于饲用微生物添加剂技术领域，尤其涉及一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法及其应用。
背景技术
随着畜牧业全面进入“后抗生素时代”，“营养替抗”成为动保行业最新热点。茯苓是药食同源的传统中药，其主要药效成分为茯苓多糖，约占干重90％。然而，茯苓多糖中占绝大多数部分的碱溶性多糖因其水溶解性和生理活性差，不易被人体和畜禽吸收与利用。因此通过化学修饰将含量较高的茯苓酸性多糖转化为具有活性的水溶性多糖，对于茯苓多糖发挥其生物活性具有至关重要的作用。羧甲基化是目前茯苓多糖常用的分子修饰方法之一。据文献报道，相比于传统工艺，以茯苓粉为原料，氯乙酸为醚化剂和乙醇为反应介质的二次碱化法制备的羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran,CMP)，其取代度不低于1.0，收率不低于85％[石清东,蒋先明:二次碱化法制备羧甲基茯苓多糖.天然产物研究与开发1996,8(2):78-81]。虽然经过化学改性后的羧甲基茯苓多糖已被证明具有抗氧化、抗炎、增强免疫和促进肠道健康的功效，但其对动物的生长却没有显著的促进作用。然而动物的生长性能直接影响畜牧业的经济效益。因此，有必要筛选能够与羧甲基茯苓多糖协同促生长的饲料添加剂品种，从而显著提高其作为饲料添加剂的应用价值。
后生元(Postbiotics)是为弥补益生菌在应用过程中出现的一些不足之处而提出的新概念，是指对宿主健康有益的无生命的微生物和/或其成分(比如细胞壁中肽聚糖、壁磷壁酸、脂磷壁酸和细胞壁多糖以及细胞表面蛋白等)的制剂，也可以包括微生物的代谢产物(比如短链脂肪酸、有机酸、酶和抗菌肽等)。研究表明后生元的生物活性不仅能够与“活”的益生菌效果媲美，而且其副作用甚微。其主要通过抗氧化、抗炎、调节免疫与胃肠道功能以及保护肝脏等作用促进动物生长，从而提高畜牧与水产养殖效益。
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌，是芽孢杆菌科、梭菌属中一种产丁酸的革兰氏阳性厌氧细菌。丁酸梭菌的代谢产物中包含有短链脂肪酸(丁酸和乙酸)、抗菌肽、各种酶、维生素和氢气等多种有益物质。其中丁酸是肠道上皮细胞的主要供能物质，对于肠道上皮组织的再生和修复具有重要的作用，特别对于结肠细胞更为重要，丁酸是其最重要的能量来源。此外，丁酸也被证明能够上调抗氧化谷胱甘肽水平，从而提高宿主对氧化应激的耐受性。维生素是参与动物生长发育和代谢必须的有机物质，丁酸梭菌代谢过程中可以产生多种B族维生素、维生素K、烟酸和泛酸等，而B族维生素和维生素K在补充宿主营养的同时可以促进维生素E的吸收。丁酸梭菌MIYAIRI 588在37℃厌氧培养24h后，其上清液中叶酸浓度达8mmol/L，维生素B2含量达111ng/mL，维生素B12含量为93pg/mL【王腾浩:新型丁酸梭菌筛选及其对断奶仔猪生长性能和肠道功能影响的研究[D].浙江大学图书馆.浙江大学2015】。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是国际上公认的益生乳酸菌之一，属于革兰氏阳性菌，不形成芽孢，兼性厌氧。最适生长温度为37-42℃，最适pH为6.5左右。据报道，罗伊氏乳杆菌几乎天然存在于所有脊椎动物肠道内，是人和动物肠道微生物的主要成员。尤其是，罗伊氏乳杆菌是目前乳酸杆菌属中唯一被证实与所有宿主都存在共生关系的菌种。并且，从不同宿主分离的所有罗伊氏乳杆菌菌株对宿主均具有益生作用。罗伊氏乳杆菌发酵产生的乳酸和细菌素(罗伊菌素Reuterin、Reutericin、Reutericyclin以及AP48-MapA)均具有直接的抑菌和杀菌活性。此外，罗伊氏乳杆菌代谢产生的吲哚-3-乙醛及其菌体表面的表面蛋白、磷壁酸以及胞外多糖均具有免疫调节作用【侯成立:罗伊氏乳杆菌全基因组序列分析及其调节仔猪肠黏膜免疫功能的研究[D].中国农业大学图书馆.中国农业大学2015】。
但是，现有技术通常是将丁酸梭菌和罗伊氏乳杆菌作为单一添加剂用于畜禽与水产领域，经济效益有待进一步提升。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法及其应用。
本发明的内容之一，提供了一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法，包括以下步骤：
首先发酵丁酸梭菌至含菌量为5-10×108CFU/mL，并将其发酵液在80-100℃灭活10分钟；然后加入1-2wt％的蔗糖，调节pH值至酸性，并接种罗伊氏乳杆菌，静置发酵至其含菌量为1-5×108CFU/mL；最后用碱将发酵液pH值调至中性，80-100℃灭活30分钟。
进一步地，在所述协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法中，加入蔗糖后，调节pH值至6.5；
所述碱为氢氧化钠或者氢氧化钙。
进一步地，接种罗伊氏乳杆菌后，静置发酵温度为37℃。
本发明通过两步发酵法制备丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元(即协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元)，工艺程序依次为：发酵丁酸梭菌、高温灭活，补充培养基成分、调pH、接种罗伊氏乳杆菌、二次发酵，调pH和高温灭活。其中二次发酵相对单次发酵会使发酵液中益生菌及其代谢产物如营养因子、核苷酸、小肽、多糖和有机酸等种类和含量更加丰富，并且会使培养基中营养成分被菌体利用的更加充分，同时也节约复配成本和时间。
本发明的内容之二，提供了一种根据上述制备方法得到的协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元。
本发明的内容之三，提供了一种含有上述协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的复合饲料添加剂，在发酵灭活的发酵液中加入羧甲基茯苓多糖和辅料(麦芽糊精和轻质碳酸钙)，混匀，然后依次进行低温真空冷冻干燥、粉碎、混匀、分装与包装，得到复合饲料添加剂。
进一步地，在所述复合饲料添加剂中，按照重量份数计，包括以下组分：羧甲基茯苓多糖粗提物10-20份、协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元40-50份、麦芽糊精35-50份以及轻质碳酸钙2-3份。
进一步地，在所述复合饲料添加剂中，所述复合饲料添加剂在基础日粮中添加量为3-12wt‰，仅添加少量就可以改善动物肠道健康以及显著协同促进其生长。
本发明的内容之四，所述协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元在调节动物肠道菌群平衡和促生长中的应用。
进一步地，在所述应用中，所述动物包括畜禽、水产和宠物，包括经济养殖或观赏动物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次基于理论基础将丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌两步发酵之后，高温灭活制备成后生元，将羧甲基茯苓多糖粗提物与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配作为促生长饲料添加剂，仅添加少量就可以改善动物肠道健康以及显著协同促进其生长。
采用本发明的复合饲料添加剂饲喂小鼠13天后，虽然料重比未见明显改善，但是相对空白对照组，羧甲基茯苓多糖(1‰)组、后生元(5‰)组以及羧甲基茯苓多糖(1‰)与后生元(5‰)复合物组昆明小鼠体重分别增加1.69％(p>0.05)、4.35％(p>0.05)和9.19％(p<0.05)；羧甲基茯苓多糖(1‰)与后生元(5‰)复合物组相对羧甲基茯苓多糖(1‰)组和后生元(5‰)组，昆明小鼠体重分别增加了7.37％(p<0.05)和4.63％(p>0.05)。因此，以上数据说明羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配具有协同促进昆明小鼠生长的作用。
分析肠道菌群测序结果表明，虽然饲喂本发明所述复合饲料添加剂对昆明小鼠肠道菌群的多样性没有显著影响，但是考虑到昆明小鼠饲喂周期只有两周，而肉鸡、猪和水产动物的饲喂周期均在40天以上。并且与空白对照组相比，日粮添加本发明所述复合饲料添加剂后，昆明小鼠盲肠中肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)、Helicobacter apodemus和肠鼠杆菌(Muribaculum intestinale)等有害菌的丰度明显降低。尤其是，饲喂本发明所述复合饲料添加剂对昆明小鼠肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比值明显升高，从而容易导致小鼠肥胖。因此，以上研究结果提示本发明所述复合饲料添加剂具有通过调节动物肠道菌群平衡改善宿主肠道健康和生长性能的应用潜力。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为相对空白对照组，饲粮添加羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物实验组昆明小鼠盲肠内容物中微生物群落组成的α多样性和β多样性分析，其中(A-D)为α多样性的箱型图，(A)Chao1指数组间差异箱线图；(B)Faith’s PhylogeneticDiversity(PD)组间差异箱线图；(C)Simpson指数组间差异箱线图；(D)Shannon指数组间差异箱线图；横坐标代表组别名，纵坐标代表α多样性指数的值。靠近横坐标下侧的箱线代表下四分位数，等于该样本中所有数值由小到大排列后第25％的数字。其次的箱内竖线为中位数(median)，等于该样本中所有数值由小到大排列后第50％的数字，上侧的箱线代表上四分位数，等于该样本中所有数值由小到大排列后第75％的数字。延长线的下端和上端分别代表下边缘和上边缘。点代表离群值(outlier)；(E-F)不同处理样品的PCoA(E)和NMDS(F)图。在PCoA点图中，横坐标和纵坐标分别代表对差异贡献较大的两个主坐标及其对样本差异的贡献率，每个点代表一个样本，样本点距离的远近代表样本中微生物群落的相似性，距离越小则相似性越高，同一组的样本使用相同的颜色和形状来表示。在NMDS点图中，其中每个点代表一个样本，点与点之间的距离表示差异程度的大小，同一组的样本使用相同的颜色和形状来表示。当Stress<0.2时，说明NMDS可以准确反映样本间的差异程度。NC(Normal control)表示日粮中未添加复合物饲料添加剂的正常对照组，PB+CMP表示日粮中添加后生元(Postbiotics,PB)与羧甲基茯苓多糖(CMP)复合物的实验组。
图2为门水平肠道菌群组成，横坐标为组名，纵坐标为相对丰度，不同颜色代表不同的类群，Others表示排名为20以外的所有种以及没有注释信息的种的相对丰度之和。NC(Normal control)表示日粮中未添加复合物饲料添加剂的正常对照组，PB+CMP表示日粮中添加后生元(Postbiotics,PB)与羧甲基茯苓多糖(CMP)复合物的实验组。
图3为属水平肠道菌群组成，横坐标为组名，纵坐标为相对丰度，不同颜色代表不同的类群，Others表示排名为20以外的所有种以及没有注释信息的种的相对丰度之和。NC(Normal control)表示日粮中未添加复合物饲料添加剂的正常对照组，PB+CMP表示日粮中添加后生元(Postbiotics,PB)与羧甲基茯苓多糖(CMP)复合物的实验组。
图4为种水平肠道菌群组成，横坐标为组名，纵坐标为相对丰度，不同颜色代表不同的类群，Others表示排名为20以外的所有种以及没有注释信息的种的相对丰度之和。NC(Normal control)表示日粮中未添加复合物饲料添加剂的正常对照组，PB+CMP表示日粮中添加后生元(Postbiotics,PB)与羧甲基茯苓多糖(CMP)复合物的实验组。
图5为饲喂和未饲喂羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元组成的复合物的昆明小鼠盲肠内容物中微生物组成的显著差异物种LDA值分布柱状图。横坐标代表LDA值的大小，也就是柱子的长度越长，代表此类群越重要。颜色代表不同组，说明在这个组里这些类群具有显著富集的特征，即平均丰度是最高的同时组间差异是显著的。
图6为饲喂和未饲喂羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元组成的复合物的昆明小鼠盲肠内容物中微生物组成的物种分支进化图。根据分类数据的层次结构对检验结果显著的类群构建环形树状图。NC(Normal control)表示日粮中未添加复合物饲料添加剂的正常对照组，PB+CMP表示日粮中添加后生元(Postbiotics,PB)与羧甲基茯苓多糖(CMP)复合物的实验组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
如无特殊说明，本发明实施例中的“份”均按重量份数计。
本发明实施例中的丁酸梭菌HADIG-CB004和罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003均通过购买得到，其菌种鉴定测序所得16S rRNA序列在GenBank数据库中登记号分别为OP984128和OP984131。
本发明首先发酵丁酸梭菌HADIG-CB004至含菌量为5-10×108CFU/mL，并将其发酵液在80-100℃灭活10分钟；然后加入1-2wt％的蔗糖，调节pH值至6.5，并接种罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003，37℃静置发酵至其含菌量为1-5×108CFU/mL；最后用氢氧化钠将发酵液pH值调至7.0，80-100℃灭活30分钟，发酵液即为协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元。
本发明实施例中丁酸梭菌种子液采用商品化的RCM培养基，其发酵培养基配方为：1-1.5wt％葡萄糖、1.5-2wt％酵母浸粉、2-3wt％鱼蛋白胨、0.5-1wt％柠檬酸钠、0.05-0.2wt％磷酸二氢钾、0.1-0.4wt％磷酸氢二钾、0.02-0.1wt％MgSO4·7H2O、0.005-0.02wt％MnSO4·H2O、0.1-0.2wt％半胱氨酸盐酸盐、0.5-1mL/L吐温-80，pH 7.0。丁酸梭菌接种量为3-5wt％。罗伊氏乳杆菌种子液采用商品化的MRS培养基培养，接种量为5-10wt％。
本发明的实施例提供一种含有上述协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的复合饲料添加剂，在发酵灭活的发酵液中加入羧甲基茯苓多糖和辅料(麦芽糊精和轻质碳酸钙)，混匀，然后依次进行低温真空冷冻干燥、粉碎、混匀、分装与包装，得到复合饲料添加剂。
本发明实施例中羧甲基茯苓多糖粗提物以湖南怀化靖县的茯苓丁为原料，采用二次碱化法制备羧甲基茯苓多糖，最终所获羧甲基茯苓多糖粗提物中羧甲基茯苓多糖的含量不低于60％、取代度不低于0.55。
实施例1
首先发酵丁酸梭菌HADIG-CB004至含菌量为8×108CFU/mL，并将其发酵液在90℃灭活10分钟；然后加入1.5wt％的蔗糖，调节pH值至6.5；接种罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003，37℃继续静置发酵20h至含菌量为3×108CFU/mL；最后用氢氧化钠将发酵液pH调至7.0，90℃灭活30分钟，得到发酵液，即为丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元。
其中丁酸梭菌HADIG-CB004种子液采用商品化的RCM培养基，其发酵培养基配方为：1-1.5wt％葡萄糖、1.5-2wt％酵母浸粉、2-3wt％鱼蛋白胨、0.5-1wt％柠檬酸钠、0.05-0.2wt％磷酸二氢钾、0.1-0.4wt％磷酸氢二钾、0.02-0.1wt％MgSO4·7H2O、0.005-0.02wt％MnSO4·H2O、0.1-0.2wt％半胱氨酸盐酸盐、0.5-1mL/L吐温-80，pH 7.0。丁酸梭菌HADIG-CB004接种量为5wt％。罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003种子液采用商品化的MRS培养基培养，接种量为8wt％。
实施例2
首先发酵丁酸梭菌HADIG-CB004至含菌量为5×108CFU/mL，并将其发酵液在100℃灭活10分钟；然后加入1wt％的蔗糖，调节pH值至6.5；接种罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003，37℃继续静置发酵16h至含菌量为1×108CFU/mL；最后用氢氧化钙将发酵液pH调至7.0，100℃灭活30分钟，得到发酵液。
丁酸梭菌HADIG-CB004种子液和罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003种子液培养基同实施例1，丁酸梭菌HADIG-CB004接种量为3wt％，罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003接种量为10wt％。
实施例3
首先发酵丁酸梭菌HADIG-CB004至含菌量为10×108CFU/mL，并将其发酵液在80℃灭活10分钟；然后加入2wt％的蔗糖，调节pH值至6.5；接种罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003，37℃继续静置发酵24h至含菌量为5×108CFU/mL；最后用氢氧化钠将发酵液pH调至7.0，80℃灭活30分钟，得到发酵液。
丁酸梭菌HADIG-CB004种子液和罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003种子液培养基同实施例1，丁酸梭菌HADIG-CB004接种量为5wt％，罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003接种量为5wt％。
在45份实施例1中灭活的发酵液中依次加入40份麦芽糊精和3份轻质碳酸钙辅料，添加15份羧甲基茯苓多糖粗提物(其中羧甲基茯苓多糖的含量为65％、取代度为0.6)，以未添加羧甲基茯苓多糖粗提物作为对比，搅拌混匀之后进行低温真空冷冻干燥(-80℃预冻过夜，真空度为4.9Pa，干燥温度为-56℃、干燥时间为48h)，最后将冻干粉粉碎(粉碎细度为200目，主轴转速为1000r/min)、混匀(筒体转速为10r/min，混合时间为10-20min)、分装与包装，得到复合饲料添加剂。
将上述制备的复合饲料添加剂添加进基础日粮中研究复合饲料添加剂对宿主生长性能和肠道菌群结构的影响：
实验动物：
昆明雄性小鼠(2周龄)，体质量10g左右，24只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物饲养环境为12h昼夜交替，室内温度27℃左右，所有动物均能自由饮食和饮水。本发明方案经湖南湘农动物药业有限公司动物管理伦理委员会批准，所有动物均严格按照动物伦理程序和规范处理。
动物分组及处理：
将实验用小鼠随机分为空白对照组(NC)、羧甲基茯苓多糖组(1‰CMP，即每公斤基础日粮中添加1克CMP，下同)、丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元组(5‰PB)和后生元与羧甲基茯苓多糖复合物组(1‰CMP+5‰PB)，每组6只，分盒分开饲养。各组均饲喂商品化的基础日粮，连续饲喂13天，每隔三天对小鼠体重、采食量以及饮水量进行准时记录。
肠道菌群样品的获取：
在饲养期间，禁食12h后，在第13天解剖采集对照组和实验组小鼠的盲肠内容物样品，放入一次性使用采样器中保存，并寄送至成都罗宁生物科技有限公司进行三代测序与结果分析。
羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合饲料添加剂对昆明小鼠生长性能的影响见表1，如表1所示，饲喂13天后，虽然料重比未见明显改善，但是相对空白对照组，羧甲基茯苓多糖(1‰)组、后生元(5‰)组以及羧甲基茯苓多糖(1‰)与后生元(5‰)复合物组昆明小鼠平均日采食量分别增加7.0％、4.32％和16.26％，平均日增重分别增加2％、6％和14.67％(p<0.05)，体重分别增加1.69％(p>0.05)、4.35％(p>0.05)和9.19％(p<0.05)。羧甲基茯苓多糖(1‰)与后生元(5‰)复合物组相对羧甲基茯苓多糖(1‰)和后生元(5‰)组，昆明小鼠的平均日采食量分别增加8.65％和11.44％，平均日增重分别增加12.42％(p<0.05)和8.18％，体重分别增加了7.37％(p<0.05)和4.63％(p>0.05)。因此，以上结果说明，羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元具有协同促进昆明小鼠生长的应用潜力，并且其机理可能是通过提高动物采食量促进生长。
表1饲喂羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物对昆明小鼠生长性能的影响
备注：表1中数值均为means±SD(n＝6)，a,b,c表示同一行内携带不同字母上标的两组数据之间具有显著差异(p<0.05)。表中后生元含量是指除辅料以外的后生元含量，羧甲基茯苓多糖指的是纯多糖的含量。
在获得OTU丰度矩阵后，对两组昆明小鼠肠道菌群进行Alpha与Beta多样性分析，使用Chao1指数衡量物种丰度，使用PD、Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性。如图1中A-D所示，饲喂本发明所述复合饲料添加剂对昆明小鼠肠道菌群的物种多样性没有显著影响。但是，分别使用Unweighted UniFrac算法与Weighted UniFrac算法进行PCoA分析和NMDS统计，如图1中E-F所示，PCo1占总方差的16.8％，PCo2占总方差的14.2％，羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组与空白组样品距离明显分开，说明两组样品菌群结构主成分具有显著差异。在非度量多维尺度分析(Non-metric Multi-DimensionalScaling,NMDS)中，应力值(Stress)＝0.05，小于0.2，说明分组与抽样方法可靠。
为了得到各分类水平上各个类群的丰度信息，基于OTU丰度表和注释后的分类信息表，本发明在各个分类水平如Phylum(门)、Genus(属)、Species(种)，对数据进行转换，得到各个样本在各个分类水平上的相对丰度表。并且为了直观地展示每组样本高丰度类群(Top20)的平均丰度，对成组的数据求平均并使用柱状图展示(如图2-4所示)。
其中如图2所示，昆明小鼠基础日粮中添加本发明所述复合物饲料添加剂13天后，在门水平分类上，羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组和空白组比较，厚壁菌门(Firmicutes)和软壁菌门(Tenericutes)丰度百分比上调了19.14％和112.78％，变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度百分比下调了30.97％和31.28％。据美国科学院院刊报道，胖人的肠道菌群，相对正常人，拟杆菌(易瘦菌落)数量较少，而厚壁菌(易胖菌落)的数量较多。因此，厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)是判断个体胖瘦趋势的重要衡量指标。由于饲喂本发明所述复合物饲料添加剂昆明小鼠的F/B值明显升高，会导致小鼠容易发胖。
如图3所示，在属水平上，羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组与空白组相比，葡萄球菌属(Staphylococcus)、Lachnoclostridium、Anaerostipes、Anaerobutyricum和Herbinix属所占丰度百分比分别上调了28.22％、66.70％、47.58％、39.64％和24.93％。然而，螺杆菌属(Helicobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、Muribaculum属和不动杆菌属(Acinetobacter)分别下调了21.73％、29.29％、42.77％和99.41％。
如图4所示，在种水平分类上，相对空白组，在羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组中，肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)、Helicobacterapodemus、肠鼠杆菌(Muribaculum intestinale)、Acinetobacter sp.ACNIH1等有害菌的丰度百分比分别下调了17.16％、55.10％、42.77％和99.89％。而宠大真杆菌(Anaerostipes hadrus)、厌氧丁酸菌(Anaerobutyricum hallii)和哈尔滨毛螺菌(Herbinix luporum)等有益菌的丰度百分比分别上调了47.58％、39.64％和24.93％。不容忽视的是，相对空白组，在羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Helicobactertyphlonius和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)等致病菌所占丰度百分比均有所上升，但没有统计学意义。推测这可能与各组采集样品个数偏少有关。同时也提示有待进一步改进发酵工艺，显著提升发酵液中丁酸、乙酸、乳酸和细菌素等具有抑制致病菌功效代谢产物的含量，以及进一步提高具有清除幽门螺旋杆菌功效的罗伊氏乳杆菌在后生元中所占比例。
综上所述，饲喂由羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元组成的复合饲料添加剂可以有效降低昆明小鼠盲肠内容物中螺杆菌属和肠鼠杆菌等有害菌的丰度，以及提升厚壁菌门与拟杆菌门的比值，促进小鼠肥胖。
为了找到重要的并且在组之间差异显著的物种，本发明采用LEfSe分析筛选羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组和空白组之间具有统计学差异的物种(LDA值>3)。如图5-6所示，共有20个物种对两组间差异贡献大，且具有统计学意义，其中10个物种在空白组显著富集，包括假单胞菌目(Pseudomonadales)、不动杆菌属(Acinetobacter)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)和气球菌属(Aerococcus)；10个物种在羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复配组显著富集，主要是Cellulosilyticum属、梭菌属(Clostridium)和梭菌科(Clostridiaceae)。因此，以上结果提示饲喂由羧甲基茯苓多糖与丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元组成的复合物饲料添加剂可显著提高有益菌丰度。
将实施例2-3的后生元按照与实施例1相同方法制备成复合饲料添加剂，按照上述方法进行测试，发现与实施例1的结果无显著差异。
以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先发酵丁酸梭菌至含菌量为5-10×108CFU/mL，并将其发酵液在80-100℃灭活10分钟；然后加入1-2wt％的蔗糖，调节pH值至酸性，并接种罗伊氏乳杆菌，静置发酵至其含菌量为1-5×108CFU/mL；最后用碱将发酵液pH值调至中性，80-100℃灭活30分钟。
2.根据权利要求1所述一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元的制备方法，其特征在于，加入蔗糖后，调节pH值至6.5；
所述碱为氢氧化钠或者氢氧化钙。
3.一种协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元，其特征在于，根据权利要求1-2任一项所述制备方法得到。
4.一种复合饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求3所述协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元。
5.根据权利要求4所述一种复合饲料添加剂，其特征在于，按照重量份数计，包括以下组分：羧甲基茯苓多糖粗提物10-20份、协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元40-50份、麦芽糊精35-50份以及轻质碳酸钙2-3份。
6.根据权利要求4所述一种复合饲料添加剂，其特征在于，所述复合饲料添加剂在基础日粮中添加量为3-12wt‰。
7.权利要求3所述协同羧甲基茯苓多糖促生长后生元在调节动物肠道菌群平衡和促生长中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述动物包括畜禽、水产和宠物。
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