CN116144528A - 一株产蛋白酶罗伊氏乳杆菌wbt0063及其在发酵豆粕和饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株产蛋白酶罗伊氏乳杆菌WBT0063及其在发酵豆粕和饲料中的应用，可有效用来制备发酵豆粕和饲料，提高豆粕的营养价值，其解决的技术方案是，所述的产蛋白酶的菌株WBT0063，分类命名为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23367，保藏日期2021年9月6号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，本发明菌株是新筛选的一株菌株WBT0063，有效用于产蛋白酶的制备，并用于发酵豆粕中提高豆粕的营养价值，所制得的发酵豆粕可应用于饲料、养殖等领域，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一株产蛋白酶罗伊氏乳杆菌及其在发酵豆粕和饲料中的应用。
背景技术
随着国家禁抗形势的日益严峻，微生态制剂在饲料业中和养殖业的地位越来越重，乳酸菌作为益生菌的重要组成部分，发挥着不可替代的作用。乳酸菌通过发酵过程可以代谢产生乳酸等短链脂肪酸，调节肠道酸度值，抑制肠道病原菌的增殖，调节肠道微生态平衡。罗伊氏乳杆菌是一种功能性极强的乳酸菌，能够产生胞外多糖来促进动物的肠道健康，增加肠道黏附和益生菌的定殖，抑制产肠毒素大肠杆菌的增殖，从而促进生长。更重要的是罗伊氏乳杆菌也可以制备微生物发酵饲料，尤其是豆粕饲料抗营养因子含量高，适口性较差，导致豆粕饲料的推广应用受限，通过罗伊氏乳杆菌的发酵，可以改善饲料的营养价值，消除饲料中大豆蛋白、β-伴大豆蛋白等抗营养因子，提高饲料中游离氨基酸和小肽含量，.增加饲料中粗蛋白和粗脂肪含量，改善饲料适口性，提高诱食量，最终提升饲料的营养价值及消化利用率。通过分析国内国内豆粕饲料的营养成分以后，目前工业利用微生物提高豆粕的营养价值工艺尚不成熟，发现新的产蛋白酶菌株并应用于发酵豆粕的生产具有重要意义。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株产蛋白酶罗伊氏乳杆菌WBT0063及其在发酵豆粕和饲料中的应用，可有效解决提高豆粕营养价值的应用问题。
本发明解决的技术方案是，本发明所述的产蛋白酶的菌株WBT0063，分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23367，保藏日期2021年9月6号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
该菌株WBT0063能产蛋白酶，可通过发酵提高豆粕营养价值实现制备发酵豆粕和饲料的价值。
本发明所述的产蛋白酶的菌株WBT0063在发酵豆粕中的应用，所述的发酵豆粕为：
1)发酵菌液的制备
A、菌种活化及种子培养：将冻存保藏菌株WBT0063，接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃、180r/min培养24h，然后将上述活化菌株按照接种量1％接种于MRS液体培养基中进行种子培养，37℃、180r/min培养24h；
B、发酵培养：将上述种子液按照接种量2％接种于MRS液体培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为蛋白酶酶液；
所述的MRS液体培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80mL、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、pH6.4，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；
2)发酵豆粕的制备
称取20g发酵底物，该发酵底物由80％豆粕和20％玉米粉组成，加入8mL蒸馏水、2mL发酵菌液，在37℃条件下发酵培养48h，发酵完成后，发酵固体经50℃24h烘干，研磨粉碎过60目筛，即得。
本发明所述的产蛋白酶的菌株WBT0063在发酵饲料中的应用，所述的发酵饲料为：玉米22％、小麦34.7％、发酵豆粕5％、次粉24.75％、DDGS 10％、石粉1.2％、碳酸氢钙0.6％、苏氨酸0.07％、赖氨酸0.6％、蛋氨酸0.08％、预混料1％，预混料中含维生素、微量元素、酸化剂、抗氧化剂，总量100％。
本发明菌株是新筛选的一株菌株WBT0063，有效用于产蛋白酶的制备，并用于发酵豆粕中提高豆粕的营养价值，制备和应用方法简单，绿色环保，所制得的发酵豆粕可应用于饲料、养殖等领域，能有效提高营养吸收率，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明产蛋白酶的菌株WBT0063，分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，是从河南林州市猪场新鲜仔猪粪便样品分离得到的，称取1g样品用无菌水制成悬液，于100mL MRS培养基中37℃摇床培养24h，取上清液，按照10-1、10-3、10-5、10-7四个浓度梯度逐步稀释后涂布于脱脂乳琼脂平板上，37℃培养48h，观察透明圈较大的菌株，将产蛋白酶菌株挑出于MRS平板划线纯化，多次重复直至获得具有乳酸菌典型菌落形态的纯种单菌落。筛选得到编号为WBT0063的菌株，分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.23367，保藏日期2021年9月6号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
本发明菌株WBT0063为产蛋白酶的菌株，其在发酵豆粕中的应用包括以下步骤：
1)发酵菌液的制备
A、菌种活化及种子培养：将冻存保藏菌株WBT0063，接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃、180r/min培养24h，然后将上述活化菌株按照接种量1％接种于MRS液体培养基中进行种子培养，37℃、180r/min培养24h。所述MRS液体培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80mL、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、pH6.4，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用。
B、发酵培养：将上述种子液按照接种量2％接种于MRS液体培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为蛋白酶酶液，酶活测定：
1mL酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/mL表示，计算公式为：
式中：A表示标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，V1表示稀释样品所用的容量瓶体积，V2表示反应试剂的总体积，n表示样品的稀释倍数，m表示样品的质量，t表示酶解反应时间，蛋白酶活力为9.8U/mL。
2)发酵豆粕制备及处理
称取20g发酵底物(80％豆粕，20％玉米粉)，加入8mL蒸馏水2mL发酵菌液，在37℃条件下发酵培养48h，发酵完成后，发酵固体经50℃24h烘干，研磨粉碎过60目筛。
3)指标测定
A、抗营养因子含量测定
抗营养因子大豆蛋白、β-伴大豆蛋白及大豆胰蛋白酶抑制剂三者含量采用酶联免疫法进行测定，在酶标板微孔条上预包被抗营养因子抗原，样本中抗营养因子和预包被的抗原竞争抗体，加入酶标二抗后，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色，样本吸光度值与其所含抗营养因子含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中的抗营养因子含量。每个样品做三次重复。测定结果如表1所示，发酵豆粕中大豆蛋白、β-伴大豆蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂含量均低于发酵前，其中大豆蛋白降解率达到48.06％，β-伴大豆蛋白降解率达到39.75％，大豆胰蛋白酶抑制剂降解率达到60.15％，说明对抗营养因子的降解能力十分显著。
表1发酵后抗营养因子降解率
B、游离氨基酸、酸溶蛋白、小肽含量测定
酸溶蛋白及游离氨基酸含量按照GB/T 22492-2008进行测定，高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的酸溶蛋白可溶于酸性溶液中，具体酸溶蛋白含量计算公式为：
式中：V1表示样品消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，V2表示空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，c表示硫酸或盐酸标准滴定液浓度，m表示样品的质量，87.5表示换算系数。
游离氨基酸用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样测定液的氨基酸含量，游离氨基酸含量计算公式为：
式中：F表示稀释倍数，V表示试样定容体积，c表示试样测定液中的氨基酸含量，M表示氨基酸相对分子质量，m表示试样的质量，2×10-9表示换算系数。
小肽含量为酸溶蛋白含量与游离氨基酸之差。
酸溶蛋白、游离氨基酸及小肽含量测定结果如表2所示，发酵后大部分氨基酸含量高于发酵前，蛋氨酸含量和缬氨酸含量变化最为明显，发酵后蛋氨酸含量为发酵前的2倍，发酵后缬氨酸含量为发酵前的1.87倍，苏氨酸、丙氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量都在发酵前的1.5倍以上，其他氨基酸含量大多在发酵前的1倍以上。并且游离氨基酸总和发酵后是发酵前的1.23倍。酸溶蛋白含量发酵后是发酵前的2.14倍，小肽含量是发酵前的2.73倍。
表2发酵后游离氨基酸、酸溶蛋白、小肽含量变化
C、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪含量测定
粗蛋白含量按照GB/T 6432-2018进行测定，试样在催化剂作用下，经硫酸消解，含氮化合物转化成硫酸铵，加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收以后，再用盐酸标准滴定液滴定，测出氮含量，乘以换算系数，即为蛋白质含量，试样中粗蛋白含量以质量分数表示，每个样品做三次重复。
式中：V2表示滴定试样所消耗盐酸标准滴定液的体积，V1表示滴定空白所消耗盐酸标准滴定液的体积，c表示盐酸标准滴定液的浓度，m表示试样的质量，V表示试样消煮液总体积，V'表示蒸馏用消煮液体积，8.75表示换算系数。
粗脂肪含量按照GB/T 6433-2006进行测定，样品用盐酸加热水解，水解溶液冷却、过滤，洗涤残渣并干燥后用石油醚提取，蒸馏、干燥除去溶剂，残渣称量即为粗脂肪含量。每个样品做三次重复。
式中：m1表示盛有金刚砂的烧瓶和获得的石油醚提取干燥残渣的质量，m2表示盛有金刚砂的烧瓶的质量，m表示试样的质量，f表示单位校正因子。
粗纤维含量按照GB/T 6434-2006进行测定，用固定量的酸和碱，在特定条件下消煮样品，再用醚、丙酮除去醚溶物，经高温灼烧扣除矿物质的量，所余量即为粗纤维含量，每个样品做三次重复。
式中：m1表示试样的质量，m2表示灰化盘、滤锅以及在130℃干燥后获得的残渣质量，m3表示灰化盘、滤锅以及在500℃干燥后获得的残渣质量。
发酵后粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量变化如表3所示，经过发酵之后粗蛋白含量发酵后比发酵前提高22.7％，显著性差异分析结果显示发酵前和发酵后粗蛋白含量有显著性差异。经过发酵之后粗脂肪含量发酵后比发酵前提高38.0％，显著性差异分析结果显示发酵前和发酵后粗脂肪含量有显著性差异。经过发酵之后粗纤维含量发酵后比发酵前降低34.8％，显著性差异分析结果显示发酵前和发酵后饲粗纤维含量有显著性差异。
表3发酵后粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量变化
注:上标字母不同表示差异显著(P＜0.05)，上标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)。
实施例2
本发明菌株WBT0063为产蛋白酶的菌株，其在饲料中的应用包括以下步骤：
试验选取60头30kg左右健康状况良好的“长大”二元生长猪，随机分为试验组和对照组，每组3个重复，每个重复10头猪。试验组使用发酵豆粕替代正常饲料配方中的豆粕，其他组分相同，进行饲喂，对照组使用正常饲料配方进行饲喂。试验期28天，饲喂方式为自由进食。实验结束后称重并计算日增重和料肉比。饲料配方为：玉米22％、小麦34.7％、豆粕5％、次粉24.75％、DDGS 10％、石粉1.2％、碳酸氢钙0.6％、苏氨酸0.07％、赖氨酸0.6％、蛋氨酸0.08％、预混料1％，预混料中含维生素50％、微量元素30％、酸化剂15％、抗氧化剂5％。
由表4可知，在平均日增重方面，饲喂添加发酵豆粕饲料的试验组比对照组提高40.7％，且显著性差异分析结果显示试验组和对照组平均日增重有显著性差异。在平均日采食量方面，饲喂添加发酵豆粕饲料的试验组比对照组提高20.7％，且显著性差异分析结果显示试验组和对照组平均日采食量有显著性差异。在料肉比方面，饲喂添加发酵豆粕饲料的试验组比对照组降低7.7％，且显著性差异分析结果显示试验组和对照组料肉比有显著性差异。说明利用该罗伊氏乳杆菌制备发酵豆粕在饲料中应用对生长猪日增重、料肉比等生长性能有明显改善作用。
表4对生长猪生长性能的试验结果
注:上标字母不同表示差异显著(P＜0.05)，上标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)。
本发明菌株是新筛选出的一株产蛋白酶的菌株WBT0063，分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，并经实地应用取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
1、菌株的筛选
产蛋白酶菌株WBT0063的筛选分离方法：取河南林州市猪场新鲜仔猪粪便样品，称取1g样品用无菌水制成悬液，于100mL MRS培养基中37℃摇床培养24h，取上清液，按照10-1、10-3、10-5、10-7四个浓度梯度逐步稀释后涂布于脱脂乳琼脂平板上，37℃培养48h，观察透明圈较大的菌株，将产蛋白酶菌株挑出于MRS平板划线纯化，多次重复直至获得具有乳酸菌典型菌落形态的纯种单菌落，筛选得到编号为WBT0063的菌株，所述的脱脂乳琼脂平板为：脱脂乳粉10％，琼脂粉1.5％，115℃灭菌15分钟，而后制备平板。
2、菌株的鉴定
(1)形态学观察
产蛋白酶菌株呈乳白色菌落、近圆形、边缘整齐光滑、略隆起。
(2)生理生化分析
利用乳酸菌生化鉴定试剂盒对菌株WBT0063进行生化特性试验，结果如表5所示，发现该菌能发酵七叶苷、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、乳糖、马尿酸钠，不发酵纤维二糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、菊糖。
表5菌株WBT0063生化反应结果
+代表阳性，-代表阴性
经16S rDNA序列分析，利用基因组提取试剂盒对菌株基因组进行提取。选择27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')为引物，以提取基因组为模板。反应体系为：BGI2×Super PCR Mix 25μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板1μL，dd H2O 23μL；扩增条件为：94℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30循环，72℃终延伸5min。扩增完成后送华大基因公司测序，而后在NCBI BLAST数据库进行16S rDNA序列比对，使用MEGA 10.0进行系统进化树的构建，最终结合外观形态特征、生理生化特性及分子生物学结果综合确定菌株种属归属为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，命名为WBT0063，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23367，保藏日期2021年9月6号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
以上实验资料表明，本发明方法简单，绿色无污染，发酵豆粕可应用于饲料、养殖等领域，能有效提高营养吸收率，具有良好的应用和推广价值。
Claims (5)
1.一株产蛋白酶罗伊氏乳杆菌WBT0063，其特征在于，其分类命名为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23367，该菌株的16S rDNA 基因序列如SEQ ID No.1 所示。
2.权利要求1所述的产蛋白酶罗伊氏乳杆菌WBT0063在发酵豆粕中的应用。
3.根据权利要求2所述的产蛋白酶罗伊氏乳杆菌WBT0063在发酵豆粕中的应用，其特征在于，所述的发酵豆粕为：
1）发酵菌液的制备
A、菌种活化及种子培养：将冻存保藏菌株WBT0063，接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃、180r/min培养24h，然后将上述活化菌株按照接种量1%接种于MRS液体培养基中进行种子培养，37℃、180r/min培养24h；
B、发酵培养：将上述种子液按照接种量2%接种于MRS液体培养基中，37℃、180r/min培养48h得到发酵液，而后在4℃、12000r/min条件离心10min，得到上清液即为发酵菌液；
所述的MRS液体培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 mL、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、pH6.4，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌25分钟，冷却备用；
2）发酵豆粕的制备
称取20g发酵底物，该发酵底物由80%豆粕和20%玉米粉组成，加入8mL蒸馏水、2mL发酵菌液，在37 ℃条件下发酵培养48h，发酵完成后，发酵固体经50℃ 24h烘干，研磨粉碎过60目筛，即得。
4.权利要求2或3所述的发酵豆粕在发酵饲料中的应用。
5.权利要求4所述的发酵豆粕在发酵饲料中的应用，其特征在于，所述的发酵饲料为：玉米22%、小麦34.7%、发酵豆粕5%、次粉24.75%、DDGS 10%、石粉1.2%、碳酸氢钙0.6%、苏氨酸0.07%、赖氨酸0.6%、蛋氨酸0.08%、预混料1%，所述的预混料中含维生素50%、微量元素30%、酸化剂15%、抗氧化剂5%。
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