CN116121120B - 具有抑菌作用的副干酪乳杆菌gf009、其后生元制备方法及其应用 - Google Patents

具有抑菌作用的副干酪乳杆菌gf009、其后生元制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009、其后生元制备方法及其应用，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24259，上述具有副干酪乳杆菌GF009可应用于制备后生元，本发明还公开了该后生元的制备方法及应用。本发明的副干酪乳杆菌GF009为一种具有抑菌作用的益生菌，菌株生产性能稳定、发酵性能良好；应用该副干酪乳杆菌GF009可制备出安全、稳定、易于储运且具有防治细菌性腹泻功能的副干酪乳杆菌GF009后生元，该后生元的制备方法简便、生产效率高，利于规模化工业化生产，该后生元可进一步应用于制备食品、保健食品、膳食补充剂或药品。

Description

具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009、其后生元制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，涉及益生菌，具体地说是一种具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009及其应用。
背景技术
副干酪乳杆菌是一种具有增强免疫力、维持肠道菌群平衡、促进消化、降血压、降胆固醇等作用的益生菌，自2008年卫生部将其列为新资源食品以来，副干酪乳杆菌被广泛用于乳制品、保健食品、饮料、饼干、糖果、冰淇淋等领域。然而，益生菌在食品中的应用在技术上面临重大挑战。首先，益生菌的生存能力是其生物效应的必要条件，在加工、储存甚至消化过程中，微生物的浓度必须始终保持在107～109CFU/g以上；其次，益生菌产品的开发必须符合严格的标准，以便使菌株能够在大规模的工业生产中存活，并在储运、消费阶段保持活力。然而，在工业加工过程中，许多因素如食物基质的组成(pH、蛋白质、脂肪和碳水化合物浓度、水活性、天然抗生素)、加工和储存条件(时间、温度、接种率、pH、含氧量、包装材料)均可能降低益生菌的细胞活力。
随着人类对益生菌的研究范围和功能的扩大深入，研究者们发现不仅活菌能够发挥益生功能，有一些“非活菌”组分也表现出明显的促进健康的作用，如灭活的菌体细胞、菌体死亡后溶解释放的成分，以及细菌的代谢产物，这些具有促进健康功效的灭活菌和代谢物均属于“后生元”的范畴。已报道的后生元的生物活性包括免疫调节、平衡肠道菌群、调节生理机能、防治腹泻等生物活性。与益生菌相比,后生元具有化学结构清晰、安全剂量高、保质期长等优点，其储存、处理和运输也更容易，在开发新型健康功能食品方面具有广阔前景。
由于中国的益生菌研究起步较晚，益生菌产品相对来讲品种较单一。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是要提供一种新的益生菌，即具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009；
本发明的另一目的，旨在提供上述具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009的一种应用，用于制备副干酪乳杆菌GF009后生元，以达到该菌株工业化应用；
本发明的第三个目的，旨在提供上述后生元的一种制备方法，该制备方法简便、生产效率高，利于工业化生产；
本发明还有一个目的，是要提供上述副干酪乳杆菌GF009后生元的一种应用，可广泛用于食品、保健食品、膳食补充剂或药品的制备。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009，已于2022年01月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24259，拉丁文名称为Lactobacillusparacasei。
作为对发明的一种限定，具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009的16SrDNA基因序列如下：
CGTGCGATCGCTTATCTGCAGTCGACGAGGTCTCGTTCATCTCGGCGCTTGCACCCATATTCAACGTGGATCTACTGGCGGGCGGGGGAGTCCACGAGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTATCAAACAGATGCTAATACCGCGAAGATCCCACAACCGATTGGTTCTTGGGTGAGGGATGGGGTAAGCTATGGCTTTAGGATGGACCGGCCGGATATGATCAACTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCCATAATCCTTAGCCAAACTGAGAGGTTGATCGGCCACCTTGGGACTGAGACACGATCCAAACTCCTACGGGAGGTGATGATAGGGAATCTTCCACAATGGACTTTTACCTGATGGATCATGACCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCCTCCACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGGAGATTAACTGTTGCCGAATTGACGGTATCCAACCACAAAGCCGCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGCTGATACTCAAGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTGTTGCGCTTGAATCCAGCGCAGGCGATTTTTATTCTCTGATGTGAAAGCCCTCTGCTTAACCTACGAAACACCTCCAGATGCTGAAAAACTTGCGTGCAAATGATGACGATGCAACTCCGTGTGTACCTGTGAAATGCATAGATATATGGAACAACACCAGTCCACGAAGGCGGCTGTCAGGACTGTATCTGACGCTGATGCTCGATTGCATGGCTAGCCAACAGCATTAGATACTCTGCTAGTCCATGTACGTACGCGATGTATGCTCTGTGTTGAATTGTCTCCGGCCCTGCACTGCCGCATGCTAAACATCATTGATTTCATTTCCGACCTGAGCGAGTTACGAACCGTTACCGGTTTGGAATATCGTCATAGTGCAAGTTAGCACATGTGCGCGCAGGCACAAAGTCCGTCTTGCCAGCTAATCGGTGGATCTTGAGATTACGACAGCCATACGCTCGACGCAATTGGAGA。
本发明还提供了上述具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009的一种应用，该菌株可用于制备副干酪乳杆菌GF009后生元。
本发明还提供了上述副干酪乳杆菌GF009后生元的一种制备方法，该制备方法包括依次进行的以下步骤：
S1.种子液的制备
菌种经活化，两次扩大培养，制得具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009种子液；
S2.菌种的发酵
将上述种子液接种至发酵培养基中，发酵培养至OD值为11.5～12.5，pH为3.7～3.8，终止培养，得发酵液；
S3.菌体的获得
离心上述发酵液，弃去上清液得菌体；
S4.菌体的灭活及干燥
向菌体中加入溶菌酶，保温，均质，冷冻干燥，即得所述后生元。
现有的后生元大多与多种菌种或其他成分进行混合使用，其制备方法复杂，产品性能不稳定。中国专利公布号为CN114480192A的文件公开了单一菌种发酵制备后生元的制备方法，该制备方法中应用加热处理灭活、浓缩、喷雾干燥的工艺，其在制备时未考虑到工业化生产，因为实际生产中培养基中含有大量的盐类，应用浓缩干燥时水分蒸发但盐类基本都保留下来了，大量盐类的存在导致体系渗透压增大，许多功效成分在高盐、高渗透压环境中变性失活；另外，该专利中选用用喷雾干燥工艺，该工艺不仅会加速后生元中短链脂肪酸的氧化酸败，还会导致后生元中小分子肽和多肽等功效成分活性降低。
作为对上述制备方法的限定，所述步骤S1中，种子液活菌数为3.5×109～5.0×109cfu/mL。
作为对上述制备方法的第二种限定，所述步骤S2中，种子液接种量为2～4％，发酵培养温度为35～37℃，培养时间为16～18h。
作为对上述制备方法的第三种限定，所述步骤S4中，溶菌酶活力为1800～2000U/mg、添加量为菌体质量的0.03～0.05％。
上述制备方法还有一种限定，所述步骤S4中，均质温度为18～25℃、均质压力为18～27MPa。
本发明提供了上述副干酪乳杆菌GF009后生元的一种应用，它可用于制备食品、保健食品、膳食补充剂或药品。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
①本发明提供的具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009，对大肠杆菌具有很好的抑制作用，是一株实用性强、市场潜力大的益生菌菌株；
②本发明提供的具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009，可用于制备符合现代保健观念的副干酪乳杆菌GF009后生元，该后生元内含丰富的肽聚糖、N-乙酰胞壁酸、多糖、短链脂肪酸、酶类和多肽等，具有保健功效；同时后生元安全剂量高、保质期长、易于储存和运输等优势；
③本发明提供的副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，是结合具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009菌种特性确定的，对细菌灭活时采用溶菌酶处理、干燥方式选择冷冻干燥。选择酶处理的原因，在于首先溶菌酶能有效催化革兰氏阳性菌细胞壁中乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰壁氨酸之间的β-1,4糖苷键，而本发明中副干酪乳杆菌GF009即为革兰氏阳性菌；其次，常规灭菌时一般是将含菌的发酵液在121℃下处理20min，该工序包含升温时间、加热处理时间和降温时间，若工业生产工时远远大于酶处理工时，对设备、人员素质、水电资源的要求也较严格。选择冷冻干燥的原因在于，最大程度地保留后生元中包含酶类、小分子肽、小分子蛋白在内的功效成分的活性；
④本发明制备的后生元潜在的广泛的应用领域，可作为原料用于食品、保健食品、膳食补充剂或药品的制备。
综上所述，本发明提供的具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009，该菌株生产性能稳定、发酵性能良好；应用副干酪乳杆菌GF009可制备出具有安全、稳定、易于储运的、具有防治细菌性腹泻功能的副干酪乳杆菌GF009后生元，且该后生元的制备方法简便、生产效率高，利于规模化工业化生产。
本发明提供的副干酪乳杆菌GF009为一种具有抑菌作用的益生菌，可用于制备后生元，后生元可进一步应用于制备食品、保健食品、膳食补充剂或药品。
附图说明
图1为本发明实施例9中样品1-4抑菌效果图；
图2为本发明实施例9中样品4-7抑菌效果图；
图3为本发明实施例10中模型组小鼠粪便短链脂肪酸气相色谱图；
图4为本发明实施例10中正常组小鼠粪便短链脂肪酸气相色谱图；
图5为本发明实施例10中实验组小鼠粪便短链脂肪酸气相色谱图；
图6为本发明实施例10中阳性对照组小鼠粪便短链脂肪酸气相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009的获得及保藏
本实施例为具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009的获得及保藏，该菌的获得过程包括副干酪乳杆菌GF009的分离纯化，该分离纯化方法按照以下步骤顺序进行:
(1)益生菌的获得
本实施例所涉及的副干酪乳杆菌GF009是通过以下的操作获得的：
①样品采集
随机取广西壮族自治区北流市圭江鱼农业有限公司2021年5月份生产的三个批次(生产日期分别为2021年5月3日、2021年5月8日、2021年5月13日)的罐装果蔬酸料15罐，充分摇匀后每罐中取汁液1mL，分别放入15管装有9mL由表1所示配比组成的cMRS液体培养基的试管中，进行1:10梯度稀释，稀释后的试管标号为A1～A15；
②样品的富集
取A1～A15试管中菌液各1mL，分别置于装有由表2所示配比组成的cMRS固体分离培养基的平皿中，在厌氧环境，37℃条件下培养72h，平皿标号为B1～B15；
③菌株分离筛选及纯化
挑取平皿B1～B15中有透明光圈的单菌落，继续采用厌氧培养进行3次菌株纯化；
④菌株特性鉴定
对分离并纯化的菌株进行革兰氏染色和接触酶试验，将革兰氏染色为阳性、接触酶试验为阴性的菌株初步确定为益生菌，共27株，保藏备用。
其中cMRS液体培养基配比表见表1；
cMRS固体培养基配比表见表2。
表1cMRS液体培养基配比表
表2cMRS固体培养基配比表
(2)益生菌菌株的初步筛选
将获得的27株益生菌菌株分别进行过氧化氢酶试验、明胶液化试验、运动性试验、氧化酶试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验。选择上述6个试验结果均为阴性的菌株，共计23株菌株，标号为GF001～GF0023，并于-18～-20℃保藏。
(3)益生菌菌株的二次筛选
将纯化并活化好的23个菌株按1％接种量接种于10mL灭菌的MRS培养基中，37℃静置培养6h，检测菌液pH值和OD600吸光值，筛选出产酸快，生长迅速的菌株。益生菌菌株发酵后pH值和OD600值见表3。
表3益生菌菌株发酵后pH值和OD600值一览表
由表3可知，经37℃静置培养6h后，有11株菌株pH达到5.0以下且OD600值达到3.0以上，具体分别为GF007、GF009、GF010、GF011、GF014、GF016、GF017、GF020、GF021、GF022、GF023。以此11株菌株进一步筛选有抑菌特性的菌株。
(4)益生菌菌株抑菌特性筛选
以大肠杆菌为指示菌株，以牛津杯法对11株菌进行抑菌活性测定。分别对受试菌株37℃活化培养18h，取200μL培养完成后的发酵液，加入至含有大肠杆菌的无菌营养琼脂平板的牛津杯中，37℃培养48h后测量抑菌圈大小，其实验结果见表4。
表4不同菌株对大肠杆菌抑菌结果
注：抑菌圈直径不含孔径
由表4可知，在筛选的11个菌株中，菌株GF009产生的抑菌圈最大，其次为菌株GF020和GF023，其他菌株对大肠杆菌的抑制作用不明显。
本实施例进一步将菌株GF009进行菌株鉴定及保藏，具体如下：
(5)菌株的鉴定
将对大肠杆菌具有抑制作用的菌株GF009进行DNA提取，并以提取的DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增成功的PCR产物送至上海生工公司进行测序，经测序，其16S rDNA基因序列如下：
CGTGCGATCGCTTATCTGCAGTCGACGAGGTCTCGTTCATCTCGGCGCTTGCACCCATATTCAACGTGGATCTACTGGCGGGCGGGGGAGTCCACGAGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTATCAAACAGATGCTAATACCGCGAAGATCCCACAACCGATTGGTTCTTGGGTGAGGGATGGGGTAAGCTATGGCTTTAGGATGGACCGGCCGGATATGATCAACTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCCATAATCCTTAGCCAAACTGAGAGGTTGATCGGCCACCTTGGGACTGAGACACGATCCAAACTCCTACGGGAGGTGATGATAGGGAATCTTCCACAATGGACTTTTACCTGATGGATCATGACCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCCTCCACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGGAGATTAACTGTTGCCGAATTGACGGTATCCAACCACAAAGCCGCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGCTGATACTCAAGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTGTTGCGCTTGAATCCAGCGCAGGCGATTTTTATTCTCTGATGTGAAAGCCCTCTGCTTAACCTACGAAACACCTCCAGATGCTGAAAAACTTGCGTGCAAATGATGACGATGCAACTCCGTGTGTACCTGTGAAATGCATAGATATATGGAACAACACCAGTCCACGAAGGCGGCTGTCAGGACTGTATCTGACGCTGATGCTCGATTGCATGGCTAGCCAACAGCATTAGATACTCTGCTAGTCCATGTACGTACGCGATGTATGCTCTGTGTTGAATTGTCTCCGGCCCTGCACTGCCGCATGCTAAACATCATTGATTTCATTTCCGACCTGAGCGAGTTACGAACCGTTACCGGTTTGGAATATCGTCATAGTGCAAGTTAGCACATGTGCGCGCAGGCACAAAGTCCGTCTTGCCAGCTAATCGGTGGATCTTGAGATTACGACAGCCATACGCTCGACGCAATTGGAGA。
在NCBI上，利用BLAST将测序结果与Gen Bank中的标准菌株16S rDNA序列进行比对，确定GF009菌株为副干酪乳杆菌，拉丁文名称为Lactobacillus paracasei。
将该副干酪乳杆菌GF009菌株于2022年01月06日保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24259。
实施例2一种副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法
本实施例为副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，具体包括依次进行的以下步骤：
S1.种子液的制备
将具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009在MRS液体培养基中活化两代后，按3％接种量接入90mL MRS液体培养基中，置于37℃下恒温扩大培养，制得具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009种子液，测得该种子液的活菌数为4.0×109cfu/mL；
S2.菌种的发酵
将种子液按3％接种量，接入至3L由表5所示配比组成的发酵培养基中，置于37℃下恒温培养16.5h，测得发酵液OD值为11.5，pH为3.80，终止培养，得发酵液；
表5发酵培养基配比表
S3.菌体的获得
在4℃环境中，将发酵液在8000rpm离心20min后，弃去上清液得菌体，经称量，菌体质量为48g；
S4.菌体的灭活及干燥
向菌体中加入浓度为0.5％的溶菌酶溶液(由19.2mg溶菌酶活力为2000U/mg的溶菌酶粉剂与水配置而成)，37℃保温30min后，在均质温度20℃、均质压力25MPa条件下均质20min，置于冷阱温度为-40℃条件下冷冻干燥48h，收集冻干后的菌粉，粉碎，过80目筛，即得所述后生元，称量，后生元质量为4.2g。
实施例3-8副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法
实施例3-8分别为一种副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，它们的制备工艺与实施例2基本相同，不同之处在于控制参数不同，不同实施例控制参数一览表见表6。
表6实施例3-8中控制参数一览表
实施例9副干酪乳杆菌GF009后生元抑菌性实验
本实施例考察了在制备副干酪乳杆菌GF009后生元过程中的中间体、三种常用的副干酪乳杆菌制备的后生元与副干酪乳杆菌GF009后生元在抑菌性能方面的区别，具体方法如下：
本实施例共制作6组对比实施例，其中:
对比实施例1为实施例1中完成步骤S3所得的菌体，记作样品1；
对比实施例2为将样品1冷冻干燥所得，记作样品2；
对比实施例3为实施例1中步骤S3均质后所得物料，记作样品3；
实施例1所得副干酪乳杆菌GF009后生元，记作样品4；
对比实施例4为仅将实施例1中副干酪乳杆菌GF009替换为君乐宝乳业集团有限公司的副干酪乳杆菌N1115，其余原料及工艺参数不做变动制备的后生元，记作样品5；
对比实施例5为仅将实施例1中副干酪乳杆菌GF009替换为景岳生物科技股份有限公司的副干酪乳杆菌LP-33，其余原料及工艺参数不做变动制备的后生元，记作样品6；
对比实施例6为仅将实施例1中副干酪乳杆菌GF009替换为诺森生物技术有限责任公司的副干酪乳杆菌LPc-83，其余原料及工艺参数不做变动制备的后生元，记作样品7。
采用大肠杆菌为指示菌株，以牛津杯法进行不同样品抑菌活性测定。具体方法如下：
分别取1g样品1、样品3，分别溶于9mL浓度为0.9％的无菌生理盐水中，制成待测液1、待测液3；
分别取0.1g样品2、样品4、样品5、样品6、样品7，分别溶于9.9mL浓度为0.9％的无菌生理盐水中，制成待测液2、待测液4、待测液5、待测液6、待测液7；
因样品1、样品3为液体未进行冻干，干物质含量为10％左右，因此取样量为1g；而样品2、样品4-7样品已冻干，取样量为0.1g；
每组实验3个平行，以无菌生理盐水作为空白对照。
分别取200μL待测液加至含有大肠杆菌的无菌营养琼脂平板的牛津杯中，37℃培养48h后观察并测定结果；
副干酪乳杆菌GF009后生元及其制备过程中中间体的抑菌圈对比图见图1，分别以副干酪乳杆菌GF009、副干酪乳杆菌N1115、副干酪乳杆菌LP-33、副干酪乳杆菌LPc-83制备的后生元的抑菌圈对比图见图2；7种不同样品抑菌圈测量结果统计表见表7。
表7不同样品对大肠杆菌抑菌结果统计表
样品名称 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7
抑菌圈直径(mm) 10.81 13.25 16.74 20.15 0.10 0.21 0.12
注：抑菌圈直径不含孔径
结合图1、图2及表7可知，样品1对大肠杆菌有抑菌效果，但抑菌圈模糊，不明显；样品2有明显的抑菌圈抑菌圈大小为13.25mm；样品3和样品4抑菌效果显著，抑菌圈大且明显；与三种不同亚种的副干酪乳杆菌菌株制备的后生元比较可知，副干酪乳杆菌GF009后生元能抑制大肠杆菌且产生抑菌圈，抑菌圈大小为20.15mm；副干酪乳杆菌N1115、副干酪乳杆菌LP-33、副干酪乳杆菌LPc-83制备的后生元对大肠杆菌抑制作用不明显，均未能产生明显的抑菌圈。
实施例10副干酪乳杆菌GF009后生元对细菌性腹泻小鼠的影响
本实施例考察副干酪乳杆菌GF009后生元对大肠埃希菌ATCC25922诱导的腹泻小鼠的影响，具体方法如下：
选取体重18～20g、周龄7～8周的健康昆明小鼠80只，环境适应性饲养一周。将小鼠随机分为4组，分别为对照组、模型组、实验组、阳性对照组，每组20只，所有小鼠单笼饲养。灌胃前禁食24小时、禁水1小时。对照组灌胃0.5mL无菌生理盐水；模型组、实验组和阳性对照组每只小鼠灌胃0.5mL含菌量为4×108cfu的大肠埃希菌ATCC25922菌悬液，灌胃完毕1小时后统一给食水，灌胃24小时后小鼠出现腹泻，饮食减少，表明建模成功。
对建模成功后的四组小鼠给药，具体给药方案见表8所示。
表8给药方案一览表
观察、记录灌胃前后小鼠的饮食变化、粪便变化及死亡情况，分别取给药第5天对照组、模型组、实验组、阳性对照组的小鼠粪便迅速冷冻至-80℃冰箱，采用气相色谱仪对其进行短链脂肪酸含量分析。
其中，短链脂肪酸含量具体检测方法如下所示：
(1)巴豆酸偏磷酸溶液的制备
分析天平称取2.5000±0.0050g偏磷酸、0.6464g的巴豆酸加超纯水充分溶解后定容至100mL，混匀后分装保存。
(2)样品的处理
准确称取0.8000±0.010g粪便放入粪便样本盒中，用HALO-F100粪便处理仪处理，配制10％粪便悬浊液，取出w/v为10％粪便悬浊液2mL置入新的2mL灭菌离心管中。4℃、10000rpm条件下离心5min，取上清加入2mL灭菌离心管并混匀，制得样品提取液。
(3)待测液的制备
取500μL样品提取液置于1.5mL离心管中，并加入100μL巴豆酸偏磷酸溶液，-30℃冻结24h，解冻后10000rpm、4℃离心3min，取上清，0.22μm过滤器过滤，制得待测液。
(4)气相色谱测定含量
取100μL待测液，加入气相样品瓶内插管中，用盖子盖紧排除气泡后即可上样分析。
气相色谱条件如下所示：
气相色谱仪：安捷伦1100；色谱柱：Agilent FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)；检测条件：进样口温度250℃，进样体积1.0μL，分流比为5:1；载气：高纯氮；流速：2.5mL/min保持6.5min，2.8mL/min升至2.8mL/min保持2min；色谱条件：初始温度为75℃，20℃/min升温至180℃，保持1min；随后，50℃/min升温至220℃，保持1min；检测器及温度：FID检测器，250℃。
经观察、记录，给药治疗观察结果见下表表9所示。
表9给药治疗观察结果
注：“+”代表正反应；“-”代表负反应；“--”代表负反应严重；“---”代表负反应严重，出现死亡
由表9可知，在实验中，对照组小鼠无异常，反应灵敏，饮食正常，无腹泻现象；模型组小鼠前两天腹泻严重，精神萎靡，不喜饮食，第三天有2只小鼠出现死亡，第四天死亡3只小鼠，第五天死亡1只小鼠；实验组小鼠前三天出现精神萎靡、行动迟缓、饮食减少，第三天时有9只小鼠腹泻症状减轻，第四天有13只小鼠腹泻症状减轻，7只小鼠排便正常明显，第五天20只小鼠排便都恢复正常，未出现死亡；阳性对照组小鼠前两天饮食减少，行动迟缓，精神萎靡，此后三天逐步恢复正常，第二天有3只小鼠腹泻症状明显减轻，第三天有15只小鼠腹泻症状明显减轻，1只小鼠排便恢复正常，第四天6只小鼠腹泻症状明显减轻，14只小鼠排便正常，第五天20只小鼠排便都恢复正常，未出现死亡。
对给药第5天时四组小鼠粪便进行短链脂肪酸检测，对照组、模型组、实验组、阳性对照组小鼠粪便的气相色谱图见图3-6，经分析计算得各组小鼠粪便中短链脂肪酸含量，其结果见表10。
表10四组小鼠粪便中短链脂肪酸分析表
结合表10可知，短链脂肪酸在小鼠腹泻过程中出现明显变化，模型组小鼠短链脂肪酸显著减少，小鼠服用药物恩诺沙星和样品4后，肠道中短链脂肪酸恢复接近正常，说明样品4的效果与药物恩诺沙星相近。
实施例11副干酪乳杆菌GF009后生元的应用
鉴于副干酪乳杆菌GF009后生元具有抑制大肠杆菌、防治细菌性腹泻的功能，可将副干酪乳杆菌GF009后生元作为食品、保健食品、膳食补充剂或药品的原料，按照现有技术中后生元的常规应用方法进一步用于制备食品、保健食品、膳食补充剂或药品。

Claims (9)

1.一种具有抑菌作用的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）GF009，其特征在于，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24259。
2.根据权利要求1所述的具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009的一种应用，其特征在于，该副干酪乳杆菌GF009用于制备副干酪乳杆菌GF009后生元。
3.根据权利要求1所述的具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009制备副干酪乳杆菌GF009后生元的一种制备方法，其特征在于，该制备方法包括依次进行的以下步骤：
S1.种子液的制备
菌种经活化，两次扩大培养，制得具有抑菌作用的副干酪乳杆菌GF009种子液；
S2.菌种的发酵
将所述种子液接种至发酵培养基中，发酵培养至OD值为11.5~12.5，pH为3.7~3.8，终止培养，得发酵液；
S3.菌体的获得
离心所述发酵液，弃去上清液，得菌体；
S4.菌体的灭活及干燥
向所述菌体中加入溶菌酶，保温，均质，冷冻干燥，即得所述副干酪乳杆菌GF009后生元。
4.根据权利要求3所述的副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，种子液活菌数为3.5×109～5.0×109cfu/mL。
5.根据权利要求3或4所述的副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，种子液接种量为2~4%；
发酵培养温度为35～37℃，时间为16～18h。
6.根据权利要求3或4所述的副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，溶菌酶活力为1800～2000U/mg、添加量为菌体质量的0.03~0.05%。
7.根据权利要求5所述的副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，溶菌酶活力为1800～2000U/mg、添加量为菌体质量的0.03~0.05%。
8.根据权利要求3、4或7所述的副干酪乳杆菌GF009后生元的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，均质温度为18～25℃，压力为18～27MPa。
9.根据权利要求3~8任一项所述的制备方法制备的副干酪乳杆菌GF009后生元的一种应用，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌GF009后生元用于制备食品、保健食品、膳食补充剂或药品。
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