CN110862949B - 枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的诱导培养基、方法及其应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的诱导培养基、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的诱导培养基、方法及其应用，属于应用微生物技术领域。所述培养基1000mL体系如下：酵母提取物5.0‑15.0g，KCl 20.0‑40.0mg，CaCl2·2H2O 0.2‑0.5g，MnCl2·4H2O 5.0‑15.0mg，MgSO4·7H2O 0.2‑0.5mg，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2。本发明进一步公开了枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的制备方法及其应用。制备枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢操作简单，发酵时间短，高产量，高纯度，成本低，作用效果强。

Description

枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的诱导培养基、方法及其应用
技术领域
本发明属于应用微生物技术领域，具体地，涉及一种枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的诱导培养基、方法及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var. niger）属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），营养细胞杆状，单个或呈短链状排列，细胞宽0.5~1.0μm，长2.0~4.0μm，革兰染色阳性，芽孢椭圆形，中生，不膨大，在胰胨大豆琼脂培养基上菌落表面光滑，不透明圆形，该菌株最显著的标志就是在含有机氮培养基上菌落呈褐色或棕红色。枯草芽孢杆菌黑色变种抗性强，无致病性，芽孢含水量低，芽孢壁分三层，厚而且致密，芽孢中的，批唆二经酸含量高以及含有耐热性酶，使得其在生物界成为抗逆性最强的生命体。
枯草芽孢杆菌黑色变种被广泛应用于科研、医疗、工业、农业和卫生等领域。国际上将该菌作为化学消毒剂、干热、环氧乙烷等杀菌效果的评价试验指标菌。我国卫生部也将该菌作为标准检测菌收入《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》（GB 15981-1995）及《消毒技术规范》中。
然而，在工业化生产中，枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢生成率低，制备周期长，难以满足灭菌生物指示剂制备所需芽孢数量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种快速制备枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的技术方案。为了完成该目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供一种诱导枯草芽孢杆菌黑色变种产生芽孢的诱导培养基，所述诱导培养基1000mL体系如下：酵母提取物5.0-15.0g，KCl 20.0-40.0mg，CaCl2•2H2O 0.2-0.5g，MnCl2•4H2O 5.0-15.0mg，MgSO4•7H2O 0.2-0.5mg，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述诱导培养基1000mL体系如下：酵母提取物12g，KCl 32mg，CaCl2•2H2O 0.25g，MnCl2•4H2O 10mg，MgSO4•7H2O 0.395mg，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2。
在发明的一些具体实施方案中，所述枯草芽孢杆菌黑色变种是指B. subtilis var. niger GDM1.370 ATCC 9372。
本发明第二方面提供一种枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的制备方法，包括以下步骤：
（1） 菌种增殖：将枯草芽孢杆菌黑色变种菌株B. subtilis var. niger GDM1.370 ATCC 9372接入至增殖培养基中进行增殖培养；
（2） 芽孢诱导：将步骤（1）增殖培养的菌液按一定接种量接种至本发明第一方面所述诱导培养基中进行诱导培养；
（3） 将诱导培养液进行离心，收集枯草芽孢杆菌黑色变种菌体及芽孢，去除枯草芽孢杆菌黑色变种菌体后即得到枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢芽孢。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增殖培养基为TSB培养基，1000mL体系如下：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，无水磷酸氢二钾2.5g，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2。
在本发明的一些实施方案中，所述增殖培养的条件是37℃、180rpm增殖培养9~10h。
在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中所述一定接种量是指10%。
在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中所述诱导培养的时间为38-40h。
在本发明的一些实施方案中，步骤（3）中所述离心的条件为：10000rpm、4℃离心4min。
在本发明的一些实施方案中，步骤（3）中所述去除枯草芽孢杆菌黑色变种菌体是指利用溶菌酶裂解所述枯草芽孢杆菌黑色变种菌体。在本发明的一些具体实施方案中，所述溶菌酶的浓度为0.3mg/mL。在本发明的一些更具体实施方案中，所述按原始诱导菌液与溶菌酶溶液的体积比为30:1加入所述溶菌酶。
在本发明的的一些实施方案中，在步骤（2）之前包括对增殖培养的菌液进行镜检的步骤，即取适量菌液制件涂片，在显微镜下进行观察。只能在显微镜下观察到杆菌无异常，才进行下一步诱导步骤。
在本发明的一些具体实施方案中，在收集枯草芽孢杆菌黑色变种菌体和芽孢之前，也包括对诱导培养后的菌液进行镜检并计算芽孢形成率的步骤。当所述芽孢形成率在95%以上，说明芽孢诱导率高，可以进行收集。
在本发明的一些具体实施方案中，在利用溶菌酶裂解后，进一步包括对裂解后的菌液进行镜检的步骤，当发现具有大量较小的细胞碎片，可以进行下一步操作，如此可得到高纯度的芽孢。
本发明第五方面提供利用本发明第一方面所述的制备方法制备的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢在制备灭菌生物指示剂中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述灭菌是指利用化学消毒剂、干热或环氧乙烷灭菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述灭菌是指利用环氧乙烷灭菌。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）操作简单，发酵时间短，只需一级增殖培养，发酵周期不超过40h；
（2）诱导培养小于40h芽孢形成率高达95%以上；
（3）芽孢收集纯化工艺简单，分层明显，纯化完全，镜检芽孢纯度高达99%；
（4）低成本，高产量，每升菌体发酵液的芽孢产量≥4*1011cfu；
（5）作用效果强，符合环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢标准，为环氧乙烷灭菌监控生物指示剂的生产提供优质中间产物枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢。
附图说明
图1示出了利用现有技术诱导培养基的芽孢诱导结果。
图2示出了利用本发明诱导培养基的芽孢诱导结果。
图3示出了诱导培养38-40h后经纯化的芽孢。
图4示出了诱导培养48h后经纯化的芽孢。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 1 枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢制备
所使用的菌种：广东省微生物菌种保藏中心B. subtilis var. niger GDM1.370ATCC9372。
所用培养基为：
TSA培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂16g，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2。
TSB培养基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，无水磷酸氢二钾2.5g，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2，灭菌条件：115℃，30min。
诱导培养基：酵母提取物12g，KCl 32mg，CaCl2·2H2O 0.25g，MnCl2·4H2O 10mg，MgSO4·7H2O 0.395mg，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2，灭菌条件：115℃，30min。
芽孢制备方法如下：
1. 甘油菌按1%接种TSB增殖培养基，37℃、180rpm增殖培养9~10h。涂片镜检观察枯草芽孢杆菌黑色变种杆菌形态。
镜检结果发现：杆菌无异常。
2. 将TSB增殖培养液按10%接种比例接种至诱导培养基，37℃、180rpm诱导培养基诱导培养38~40h。涂片镜检诱导培养液，计算芽孢形成率。
通过镜检计数芽孢，并进一步计算芽孢形成率，结果发现，经过诱导后，芽孢形成率高达95%以上。
3. 收集芽孢/菌体，经10000rpm、4℃离心4min后去上清，并使用无菌水连续洗涤两次，去除上清液。按原始诱导菌液与溶菌酶的溶液的体积为30:1的比例加入0.3mg/mL溶菌酶溶液，在30℃条件下裂解1~2h，取样涂片观察菌体裂解。
镜检结果发现，裂解后有大量较小的细胞碎片，说明菌体裂解成功。
4. 离心，纯化至无明显分层，涂片镜检，计算芽孢纯度。
通过镜检发现，离心纯化后得到的芽孢纯度达到99%以上。
5. 将收集的芽孢进行适当梯度稀释，取100μL加入已凝固的TSA平板，进行涂布，37℃倒置培养48h进行计数，计算芽孢产量。
结果发现，每升菌体发酵液的芽孢产量≥4*1011cfu。
利用本发明制备得到的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢作用效果强，符合环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢标准。
实施例 2 诱导培养基的优化
发明人为了证明本发明诱导培养基的效果，与现有技术诱导培养基进行了比较。
现在技术诱导培养基（A）：胰蛋白胨5g/L、酪蛋白3g/L、酵母提取物3g/L、牛肉浸出粉3g/L、KCl 32mg/L、MnCl2·4H2O 10mg/L、MgSO4·7H2O 0.395g/L、CaCl2·2H2O 0.25g/L，pH 7.0-7.2。
本发明诱导培养基（B）：酵母提取物12g/L，KCl 32mg/L，CaCl2·2H2O 0.25g/L，MnCl2·4H2O 10mg/L，MgSO4·7H2O 0.395mg/L，pH7.0-7.2。
其余试剂及方法同实施例1。
结果如图1所示，利用诱导培养基（A）进行诱导，诱导率极低，小于10%（如图1）；而利用诱导培养基（B）进行诱导，诱导率≥95%（如图2）。由此可见，利用本发明的诱导培养基诱导枯草芽孢杆菌黑色变种，芽孢诱导率显著提高。
实施例 3 诱导时间的优化
发明人还进一步对实施例1诱导步骤的培养时间进行优化：分别诱导38-40h或诱导48h以上。
结果发现，诱导培养38-40h的发酵液经纯化后即可得到纯度高的芽孢悬液，纯度≧99%（如图3），但诱导培养48h后发酵液中出现较多次级代谢产物，如粘稠液体（如图4），无法有效纯化，导致纯化后的芽孢悬液纯度低（≦80%）。
因此，本发明中采用诱导培养38-40h，可以得到纯度较高的芽孢。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种增殖：将枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus. subtilis var. Niger）菌株ATCC9372接入至增殖培养基中进行增殖培养；
（2）芽孢诱导：将步骤（1）增殖培养的菌液按10%接种量接种至诱导培养基中进行诱导培养；
（3）将诱导培养液进行离心，收集枯草芽孢杆菌黑色变种菌体及芽孢，去除枯草芽孢杆菌黑色变种菌体后即得到枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢，
其中，所述增殖培养基为TSB培养基，1000mL体系如下：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，无水磷酸氢二钾2.5g，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2；所述诱导培养基1000mL体系如下：酵母提取物12g，KCl 32mg，CaCl2·2H2O 0.25g，MnCl2·4H2O10mg，MgSO4·7H2O 0.395mg，利用纯化水配置1000mL，调pH至7.2±0.2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述增殖培养的条件是37℃、180rpm增殖培养9~10h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述离心的条件为：10000rpm、4℃离心4min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述去除枯草芽孢杆菌黑色变种菌体是指利用溶菌酶裂解所述枯草芽孢杆菌黑色变种菌体。
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