KR20040088416A - 신규한 해양 미생물 잔토모나스 에스피. 비에이치-1을이용한 알긴산 분해효소의 제조방법 - Google Patents

신규한 해양 미생물 잔토모나스 에스피. 비에이치-1을이용한 알긴산 분해효소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

갈조류의 일종인 톳으로부터 분리한 신규 해양 미생물 잔토모나스 에스피. 비에이치-1 케이씨티씨 10677비피(Xanthomonassp. BH-1 KCTC 10677BP)를 최적화 배지에서 배양하여 세포외 알긴산 분해효소의 고효율 제조방법에 관한 것이다. 본 발명으로 제조된 알긴산 분해효소는 미역, 톳, 다시마 등과 같은 해조류 유래 천연 다당류인 알긴산을 효소적 가수분해에 의해 알긴산 올리고당을 경제적으로 대량생산할 수 있는 알긴산 분해효소를 제공한다.

Description

신규한 해양 미생물 잔토모나스 에스피. 비에이치-1을 이용한 알긴산 분해효소의 제조방법 {Manufacturing process for producing Alginate lyase using Xanthomonas sp. BH-1, newly isolated marine bacterium}
우리나라 해안에는 약 46속 95종의 갈조류가 분포하는 것으로 알려졌으며, 이중 미역, 톳, 다시마 등 주요 식용 갈조류는 연간 총생산량이 약 47만 M/T에 이른다. 해조류의 주요 구성 성분은 탄수화물이 가장 많으며, 갈조류 중 알긴산은 건물 중 약 70~80%정도 함유하고 있으며 그 외 후코이단, 라미나란 등으로 구성되어있다. 해조류 유래 다당류 알긴산은 미역, 톳, 다시마 등과 같은 갈조류에서 추출한 물질로서 갈조류의 세포벽 구성 물질이며 만뉴론산(D-mannuronic acid)와 글루론산(L-guluronic acid)이 1,4-글리코시드 결합으로 구성된 직쇄 공중합체 다당류로 이들 조성비에 따라 다양한 물성을 가지며 식품, 의료, 제지, 염색공업 분야에서 증점제, 안정제, 유화제, 점결제 등으로 널리 이용되고 있다[Biosynthesis and application of alginates,Polym. Degrad. Stab.,59: 85-91, 1998]. 일반적으로 알긴산은 상온에서 용해시키는데 많은 시간이 필요하고 농도가 높아짐에 따라 필요 이상의 강한 점성을 갖게 되며, 0.5%이상의 농도가 식품에 첨가되어질 경우 식품 고유의 특성을 잃게 하는 단점이 있다. 따라서 알긴산의 특성을 유지하면서 점성이나 겔화성을 적절하게 조절할 수 있고, 용해성을 향상 시킬 수 있다면 필요에 따라 첨가량의 범위를 제한하지 않아도 되고, 식품 제조 시 식품의 점성이나 겔화성을 인위적으로 조절할 수 있어 알긴산의 이용범위는 훨씬 광범위해 질 수 있다. 최근 알긴산 이용의 범위를 확대하기 위해 여러 가지 연구가 행해지고 있으며, 그 한 분야로 미생물에 의한 알긴산의 저분자화 또는 올리고당에 대한 연구이다. 또한 올리고당이 갖는 여러 가지 기능성이 최근 밝혀지면서 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 공업적으로 생산되어 이용되는 올리고당도 있으며, 다양한 생리기능, 항충치, 저 칼로리, 비피더스균의 선택적 이용이 밝혀지면서 많은 당질관련 연구자들의 관심의 대상이 되고 있다. 올리고당은 단당이 2~13개 정도 결합한 당을 지칭하며, 특정 생리기능을 가진 당을 의미한다. 현재 올리고당은 설탕, 전분 등 다양한 당질을 원료로 하여 주로 효소적인 방법으로 생산되고 있으며, 일부는 산업적으로 생산되어 여러 가지 가공식품에 널리 이용되고 있다. 한편, 해조 유래 다당류의 이용에 대한 다양한 연구가 진행되고 있는데, 그 중 하나가 해조 다당류인 알긴산의 저분자화 또는 올리고당화에 의한 식품 또는 의약분야에의 이용이라 할 수 있다. 해조 다당류의 저분자화 또는 올리고당화는 효소분해법이나 물리·화학적인 분해법으로 가능하나 아직까지 전 세계적으로 알긴산 분해효소는 거의 상용화되지 않았으며 국내의 경우 초산, 구연산, 젖산, 숙신산, 말레산, 개미산 등과 같은 유기산을 이용하는 산 가수분해와 고온·고압에서 분해하는 열 가수분해를 병행하고 있는 실정이다[유기산에 의한 알긴산 올리고당의 제조방법, 대한민국 특허출원 제1999-0034911호; 알긴산을 이용한 천연 다당류인 알긴산 올리고당 및 그의 제조방법, 대한민국 특허출원 제2000-0045776호; 저분자 폴리만유로네이트의 제조방법 및 혈청지질개선제로서 이의 신규용도 및 이를 함유하는 기능성 식품 및 건강보조식품, 대한민국 특허출원 제2003-0022565호].
해조 다당류 알긴산의 올리고당화를 위한 알긴산 분해효소를 생산하는 미생물로서Pseudomonas, Sphingomonas, Xanthomonas, Enterobacter, Bacillus속 미생물의 일부가 보고 되었으나 알긴산 분해효소의 역가가 0.004~0.03 U/ml (μmoles-Reducing sugar/ml-Enzyme·min-Reaction time) 매우 낮아 상용화가 어려운 실정이다[An exotype alginate lyase inSphingomonassp. A1: overexpression inEscherichia coli, purification, and characterization of alginate lyase IV,Protein Expression and Purification, 29:33~41, 2003; Production of alginate lyase fromEnterobacter cloacaeM-1, 미국특허 제5,348,875호; Production of alginate lyase, 일본특허 제63,039,581호, Thermostable alginate lyase fromBacillus stearothermophilus, 미국특허 제5,139,945호] 또한 김으로부터 분리한 호염성 미생물Pseudomonassp. W7의 알긴산 분해효소 유전자를 분리하여 대장균에 클로닝하여 세포내 알긴산 분해효소를 0.047 U/mL을 생산하였으며[Alginate lyase production of halophilicPseudomonassp. by recombinantEscherichia coli,J. Microbiol. Biotechnol.5:92~95, 1995], 토양, 해수, 미역, 전복, 고둥, 성게 등으로부터 알긴산 분해 미생물을 탐색하여 176종의 미생물을 분리하였으며 이 중 가장 알긴산 분해효소 생산성이 높은Enterobacter속 미생물이 0.355 mg-Reducing sugar/mL-Enzyme 정도의 알긴산 분해효소 활성을 보였다[알긴산 분해 세균의 분리및 생육 특성,한국산업미생물학회지, 21(3):207~213, 1993]고 보고 되었다. 알긴산 올리고당의 생리활성 및 그 이용에 대한 보고[Growth-promotion of plants with depolymerized alginates by irradiation,Rad. Phys. Chem., 59:97-101, 2000]가 있었으며 지속적으로 연구가 이루어지고 있다. 이와 같이 해양생물자원으로서 중요한 천연물질인 알긴산은 일부 세균과 식물병원성 곰팡이 균주에 대하여 항균활성을 나타내고 있는 것으로 확인되고 있으며 항바이러스와 항곰팡이성을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다[알긴산 올리고당유도체를 이용한 가축질병 예방 및 치료제, 대한민국 특허등록 제0307187호; 알긴산올리고당유도체를 이용한 적조소멸제 및 어병치료제, 대한민국 특허등록 제0322511호]. 또한 알긴산 추출물 및 그 유도체는 항바이러스, 항박테리아 기능 외에 저밀도 콜레스테롤 농도를 낮추고, 면역학적 반응을 안정화시키는 등의 기능이 알려지면서[Medical and biotechnological applications of marine macroalgal polysaccharides,Mar. Biotechnol., 1:181-196, 1993] 생물자원으로서 뿐만 아니라 의약품의 원료로서 연구되고 있다. 알긴산염 및 알긴산올리고당 제조에 관한 연구 동향은 알긴산염에서 화학적인 방법 및 알긴산 분해효소를 이용한 알긴산염-올리고당의 제조법이 1976년에 알려진 후 제조부분 및 활용성에 있어서 많은 연구가 진행되어 응용분야 및 미생물유래 분해효소 생산에 관한 연구[Production of alginase fromEnterobacter cloacaeM-1, 미국특허 제5,348,875호, Alginate oligosaccharide and method for producing the same, 미국특허 제5,516,666호]가 진척되었음에도 불구하고 미생물 유래 알긴산 분해효소 생산에 관한 연구결과는 미진한 편이며 알긴산 분해효소를 고효율로 생산하는 미생물을 분리하는 연구 보고는 거의 없는 실정이다.
본 발명은 알긴산 분해효소를 생산하는 해양 미생물을 신규로 분리하여 알긴산 올리고당을 제조하기 위한 알긴산 분해효소(Alginate lyase)를 고효율로 생산하는 신규 해양미생물 및 이를 이용한 알긴산분해효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 해조류로부터 신규 해양 미생물 분리 및 이를 배양하여 알긴산 분해효소를 고효율로 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 이 알긴산 분해효소는 해조류 유래 다당류 알긴산을 효소적 가수분해에 의해 알긴산올리고당을 제조하는데 유용한 알긴산 분해효소를 제공하는데 있다.
도 1은Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 최적배지(Sucrose 5 g/L, (NH4)2SO49 g/L, (NH4)2HPO43 g/L, NaCl 10 g/L, KCl 3 g/L, CaCl20.05 g/L) 8L가 들어있는 10L 발효조를 이용하여 대량배양하였다. 호기성 미생물이므로 400rpm으로 교반하면서 공기를 0.1vvm으로 공급하고 2N 염산 수용액과 2N 가성소다 수용액을 이용하여 발효조 내의 pH를 8.0으로 자동제어하면서 54시간 동안 배양한 결과이다.
도 2-A는Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 최적 효소반응 온도를 결정하기 위하여 20~70℃까지 효소반응 온도를 달리하여 효소반응을 실시한 결과이다. 도 2-B는 최적 효소반응 pH를 결정하기 위하여 55℃에서 pH를 3~12까지 효소반응 pH를 달리하여 효소반응을 실시한 결과이다.
도 3-A는Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 열 안정성을 결정하기 위하여 효소 희석액을 10~70℃까지 온도를 달리하여 30분 내지 60분 동안방치한 후 효소반응으로 잔여활성을 분석한 결과이다. 도 3-B는 알긴산 분해효소의 pH 안정성을 결정하기 위하여 pH를 3~12까지 달리하여 30분 내지 60분 동안 방치한 후 잔여활성을 분석한 결과이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 해조류로부터 알긴산 분해효소 활성이 우수한 균주를 분리하고자 지속적인 연구를 수행한 결과 갈조류의 일종인 톳으로부터 알긴산 분해효소 생산성이 우수한 신규 해양 미생물을 분리하였으며, 이를 최적 조건에서 배양하여 알긴산 분해효소를 고효율로 제조하는 방법을 개발하였다. 이하, 실시 예에서 본 발명을 상세히 설명하나 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 알긴산 분해효소 생산 미생물의 분리 및 동정
전남 신안군 압해도의 갯뻘에서 갈조류의 일종인 톳을 채취하여 알긴산 분해효소를 생합성하는 미생물을 분리하기 위하여 121℃에서 15분간 멸균한 알긴산 분해 미생물 분리용 액체배지(Na-alginate 10 g/L, Yeast extract 2 g/L, NaCl 2 g/L, K2HPO42 g/L, MgSO4·7H2O 1 g/L, KCl 1 g/L, CaCl2·2H2O 0.05 g/L) 50mL이 들어있는 250mL 삼각플라스크에 생물 톳 0.5 g을 접종하여 30℃, 200rpm으로 유지되는 진탕배양기(VS-8480SF, Vision Scientific Co., Korea)에서 탄소원으로 알긴산을 분해하여 대사할 수 있는 미생물만 생존할 수 있도록 48시간씩 3회 배양하였다.
상기 배양액을 연속적으로 102부터 109까지 희석하여 알긴산 분해 미생물 분리용 고체배지(Na-alginate 10 g/L, Yeast extract 2 g/L, NaCl 2 g/L, K2HPO42 g/L, MgSO4·7H2O 1 g/L, KCl 1 g/L, CaCl2·2H2O 0.05 g/L, Agar 18 g/L)에 각각 30㎕를 접종하여 유리막대로 잘 분산시켜 30℃ 항온배양기(IB-25G, Jeio tech Co., Korea)에서 24시간 배양 후 107희석액을 접종한 고체배지에서 알긴산 용해 능력이 있는 콜로니 3개를 분리하였다. 이 들 콜로니를 상기 알긴산 분해 미생물 분리용 액체배지에 접종하여 진탕배양기에서 24시간 동안 배양하여 알긴산 분해효소 활성이 가장 우수한 BH-1 균주를 선발하였다.
상기에서 신규로 분리한 BH-1균주의 정확한 계통학적 분류를 위하여 16S rDNA 유전자를 분리하여 아래 그림과 같은 1,447개의 염기서열을 분석하여PHYLIP(Phylogency Inference Package) 데이타베이스의 다양한 미생물의 염기서열과 비교한 결과Xanthomonas속, Pseudomonas속, Stenotrphomonas속 미생물과 97%이상 유사한 염기서열을 보여 해조류 톳에서 신규로 분리한 BH-1 균주를Xanthomonassp. BH-1이라 명명하고, 2004년 8월 11일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10677BP를 부여받았다.
실시예 2 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 탄소원의 영향
실시예 1의 알긴산 분해 미생물 분리용 기본배지에서 탄소원으로 알긴산을 설탕으로 대체한 알긴산 분해효소 생산용 기본배지(Sucrose 10 g/L, Yeast extract 2 g/L, NaCl 2 g/L, K2HPO42 g/L, MgSO4·7H2O 1 g/L, KCl 1 g/L, CaCl2·2H2O 0.05 g/L) 100mL이 들어있는 250mL 삼각플라스크에 상기 톳에서 분리/동정한 알긴산 분해효소 생합성 균주Xanthomonassp. BH-1 한 백금이를 옮겨 30℃, 250rpm을 유지되는 진탕배양기(KMC-8480SF, Vision Scientific Co., Korea)에서 20시간 동안 배양하여 접종균으로 이용하였다. 알긴산 분해효소 생산용 기본배지 중 탄소원으로서 초기 설탕 농도를 달리하여 위와 동일한 조건으로 20시간 동안 배양하였다. 세포성장은 흡광도가 0.7이하가 되도록 배양액을 희석한 후 분광광도계(UV/VIS 1601, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 알긴산 분해효소 활성은 기질로써 0.5% sodium alginate 0.95ml에 배양액 0.05ml을 첨가하여, 50℃에서 15분간 반응시킨 후 DNSA법에 의해 흡광도(520nm)를 측정하여 우론산으로서 D-glucuronic acid 생성량을 측정하였다. 알긴산 분해효소 1 Unit은 효소반응 1분 동안 1μmole의 우론산을 생산하는데 필요한 효소량으로 정의하였다. 표 1은 설탕 농도의 영향을 살펴보기 위하여 설탕 농도를 0~40 g/L로 농도를 달리하여 배양한 결과로서 배양초기에 설탕 5~30 g/L를 첨가할 경우 알긴산 분해효소 활성이 거의 유사한 결과를 보였다. 따라서Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위한 최적 설탕 농도는 5 g/L임을 알 수 있었다.
[표 1]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 탄소원으로서 설탕 농도의 영향
설 탕 농 도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
0 3.81 0.10
5 6.66 0.38
10 4.56 0.32
15 4.17 0.36
20 4.02 0.40
25 3.87 0.41
30 3.81 0.45
35 3.45 0.27
40 3.48 0.19
실시예 3 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 질소원의 영향
실시예 2의 기본배지에서 탄소원을 설탕 5 g/L로 대체하고Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 질소원의 영향을 살펴보기 위하여 여러 종류의 질소원을 각각 10 g/L로 첨가하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 결과 표 2와 같은 결과를 얻었으며, 암모늄 설페이트 10 g/L를 질소원으로 이용할 경우 알긴산 분해효소 활성이 0.48 U/ml을 얻었다.
최적 질소원으로 암모늄 설페이트 농도의 영향을 살펴보기 위하여 암모늄 설페이트 농도를 0~21 g/L로 달리하여 배양한 결과 표 3과 같은 결과를 얻었으며,Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위한 최적 질소원은 암모늄 설페이트 9 g/L임을 알 수 있었다.
[표 2]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한질소원 종류의 영향
질 소 원[10 g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
대 조 구 0.21 0.19
암모늄 클로라이드 0.30 0.20
암모늄 설페이트 4.05 0.48
쇠고기 추출물 4.35 0.38
옥수수 침지액 0.30 0.24
소디움 글루타메이트 0.72 0.22
맥아 추출물 0.63 0.02
박토펩톤 4.35 0.20
폴리펩톤 4.80 0.32
효모 추출물 5.22 0.33
[표 3]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 최적 질소원으로서 암모늄 설페이트 농도의 영향
암모늄 설페이트 농도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
0 0.21 0.19
3 1.29 0.30
6 2.64 0.34
9 4.41 0.44
12 5.19 0.37
15 5.43 0.37
18 5.79 0.35
21 6.15 0.29
실시예 4 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 인산염의 영향
실시예 2의 알긴산 분해효소 생산용 기본배지에서 탄소원으로 설탕 5 g/L와 질소원으로 암모늄 설페이트 9 g/L로 대체하고Xanthomonassp. BH-1을 이용하여 알긴산 분해효소 생산에 대한 인산염 종류의 영향을 살펴보기 위하여 여러 종류의 인산염을 각각 2 g/L로 첨가하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 결과 표 4와 같은 결과를 얻었으며, 제2인산 나트륨에서 0.40 U/ml과 제2인산 암모늄에서 0.51U/ml을 생산하여 최적 인산염 종류는 제2인산 나트륨과 제2인산 암모늄이었다.
최적 인산염으로 제2인산 나트륨과 제2인산 암모늄 농도의 영향을 살펴보기 위하여 제2인산 나트륨과 제2인산 암모늄 농도를 각각 1~5 g/L로 달리하여 배양한 결과 표 5와 같은 결과를 얻었으며,Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위한 최적 인산염은 제2인산 암모늄 3 g/L임을 알 수 있었다.
[표 4]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 인산염 종류의 영향
인 산 염[2 g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
제1인산 칼 륨 0.75 0.21
제2인산 칼 륨 0.75 0.20
제1인산 나트륨 0.75 0.27
제2인산 나트륨 3.75 0.40
제1인산 암모늄 0.78 0.24
제2인산 암모늄 3.99 0.51
[표 5]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 최적 인산염으로서 제2인산 나트륨 및 제2인산 암모늄 농도의 영향
인 산 염 농 도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
제2인산나트륨 1 3.78 0.43
2 4.26 0.52
3 3.78 0.48
4 3.81 0.49
5 4.11 0.53
제2인산암모늄 1 4.44 0.46
2 4.20 0.58
3 4.50 0.59
4 4.38 0.57
5 4.41 0.57
실시예 5 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 소디움 클로라이드 농도의 영향
Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 소디움 클로라이드 농도의 영향을 살펴보기 위하여 상기 실시예 4까지의 결과로부터 얻은 최적배지에서 소디움 클로라이드 농도를 0~30 g/L까지 달리하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 결과 표 6과 같은 결과를 얻었으며,Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위한 최적 소디움 클로라이드 농도는 10 g/L임을 알 수 있었다.
[표 6]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 소디움 클로라이드 농도의 영향
소디움 클로라이드 농도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
0 4.83 0.58
2 4.98 0.59
4 4.98 0.64
6 4.80 0.64
8 4.74 0.70
10 4.59 0.76
15 4.35 0.76
20 4.11 0.58
30 3.96 0.42
실시예 6 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 마그네슘 설페이트 농도의 영향
Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 마그네슘 설페이트 농도의 영향을 살펴보기 위하여 상기 실시예 5까지의 결과로부터 얻은 최적배지에서 마그네슘 설페이트 농도를 0~9 g/L까지 달리하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 결과 표 7과 같은 결과를 얻었으며,Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위해서는 마그네슘 설페이트를 첨가하지 않는 것이 유리함을 알 수 있었다.
[표 7]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 마그네슘 설페이트 농도의 영향
마그네슘 설페이트 농도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
0 4.11 0.95
1 4.62 0.79
2 4.59 0.69
3 4.71 0.70
4 4.77 0.71
5 4.68 0.68
6 4.68 0.65
7 4.65 0.56
8 4.50 0.54
9 4.65 0.55
실시예 7 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 포타시움 클로라이드 농도의 영향
Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 포타시움 클로라이드 농도의 영향을 살펴보기 위하여 상기 실시예 6까지의 결과로부터 얻은 최적배지에서 포타시움 클로라이드 농도를 0~4.5 g/L까지 달리하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 결과 표 8과 같은 결과를 얻었으며,Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위한 최적 포타시움 클로라이드 농도는 3 g/L임을 알 수 있었다.
[표 8]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 포타시움 클로라이드 농도의 영향
포타시움 클로라이드 농도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
0.0 4.17 0.82
0.5 4.20 0.85
1.0 4.26 0.85
1.5 4.35 0.87
2.0 4.29 0.90
2.5 4.26 0.90
3.0 4.29 0.91
3.5 4.29 0.91
4.0 4.29 0.91
4.5 4.32 0.91
실시예 8 : 알긴산 분해효소 생산에 대한 칼슘 클로라이드 농도의 영향
Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 칼슘 클로라이드 농도의 영향을 살펴보기 위하여 상기 실시예 7까지의 결과로부터 얻은 최적배지에서 칼슘 클로라이드 농도를 0~1.0 g/L까지 달리하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 결과 표 9와 같은 결과를 얻었으며,Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 제조를 위한 최적 칼슘 클로라이드 농도는 0.05 g/L임을 알 수 있었다.
[표 9]Xanthomonassp. BH-1 배양시 세포성장 및 알긴산 분해효소 생산에 대한 칼슘 클로라이드 농도의 영향
칼슘 클로라이드 농도[g/L] 세 포 성 장[OD660] 알긴산 분해효소 활성[U/ml]
0.0 3.99 0.75
0.05 4.17 0.87
0.1 4.26 0.87
0.2 4.32 0.85
0.4 4.35 0.86
0.6 4.44 0.88
0.8 4.47 0.88
1.0 4.53 0.85
실시예 9 : 발효조 배양에 의한 알긴산 분해효소 제조
상기 플라스크 배양으로부터 얻은Xanthomonassp. BH-1을 이용한 알긴산 분해효소 생산에 대한 최적배지(Sucrose 5 g/L, (NH4)2SO49 g/L, (NH4)2HPO43 g/L, NaCl 10 g/L, KCl 3 g/L, CaCl20.05 g/L) 8L가 들어있는 10L 발효조(KF-10L, KoBioTech Co., Korea)를 이용하여 대량배양을 실시하였다. 호기성 미생물이므로 400rpm으로 교반하면서 공기를 0.1vvm으로 공급하고 2N 하이드로 클로라이드 수용액과 2N 소디움 하이드록사이드 수용액을 이용하여 발효조 내의 pH를 8.0으로 자동제어하고 배양온도를 30℃로 유지하면서 54시간 동안Xanthomonassp. BH-1을 배양한 결과 도 1에 보인 바와 같이 배양 48시간 후에 알긴산 분해효소 4.91 U/ml(약 40,000 Unit)을 제조 할 수 있었다.
실시예 10 : Xanthomonas sp. BH-1 알긴산 분해효소의 생화학적 특성 조사
상기 발효조 배양으로부터 얻은Xanthomonassp. BH-1 배양액을 15,000rpm으로 30분간 원심분리(CR21G, HITACHI Co., Japan)하여 균체를 제거하고, 배제 분자량 100,000Da의 중공사막 카트리지를 장착한 한외여과장치(U/F system, ChemiCore Inc., Korea)에 균체가 제거된 상등액 3L(약 15,000 Unit)를 70ml/min의 유속으로 여과하여 고분자 물질을 제거하여 2.7L의 배양액을 얻었다. 상기 배양액을 배제 분자량 10,000Da의 중공사막 카트리지가 장착된 한외여과장치에서 저분자 물질을 제거하여 0.75L(약 12,300 Unit)로 농축하였다. 이 농축액에 2.25L의 0.2M 포타시움 포스페이트 완충액(pH 7.0)을 3회로 나누어 첨가하면서 배제 분자량 10,000Da의 중공사막 카트리지가 장착된 한외여과장치에서 70ml/min의 유속으로 여과하여 탈염을 한 후 0.44L(약 9,200 Unit)의 탈염 알긴산 분해효소 수용액을 얻었다. 이를 48시간 동안 동결건조(SFDSM24, Samwon Freezing Eng. Co., Korea)하여 분말형태의 동결건조 알긴산 분해효소 1.83g(약 7,100 Unit)을 수득하였으며 이를 이용하여 효소의 생화학적 특성을 조사하였다.
Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 최적 효소반응 온도를 결정하기 위하여 상기 동결건조 알긴산 분해효소 0.5g을 0.2M 포타시움 포스페이트 완충액(pH 7.0) 100ml에 용해(2 U/ml 알긴산 분해효소 표준용액)하여 20~70℃까지 효소반응 온도를 달리하여 실시예 2와 동일한 조건으로 효소반응을 실시한 결과 도 2-A에 나타낸 바와 같이Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 최적 효소반응 온도는 55℃이었다.Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 최적 효소반응 pH를 결정하기 위하여 55℃에서 pH를 3~12까지 효소반응 pH를 달리하여 실시예 2와 동일한 조건으로 효소반응을 실시한 결과 도 2-B에 나타낸 바와 같이Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 최적 효소반응 pH는 6~11이었다.
Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 열 안정성을 결정하기 위하여 효소 희석액을 10~70℃까지 온도를 달리하여 30분 내지 60분 동안 방치한 후 실시예 2와 동일한 조건의 효소반응으로 잔여활성을 분석한 결과 도 3-A에 나타낸 바와 같이Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소는 10~55℃ 범위에서 열 안정성을 가지고 있었으며 최적 열 안정성은 40℃이었다.
Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 pH 안정성을 결정하기 위하여 pH를 3~12까지 달리하여 30분 내지 60분 동안 방치한 후 실시예 2와 동일한 조건의 효소반응으로 잔여활성을 분석한 결과 도 3-B에 나타낸 바와 같이Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소는 pH 7~10 범위 내에서 pH 안정성을 가지고 있었으며 최적 pH 안정성은 pH 9.0이었다.
따라서,Xanthomonassp. BH-1이 생산한 알긴산 분해효소의 열 안정성과 pH 안정성을 고려해 볼 때 해조류 유래 알긴산을 가수분해하여 알긴산 올리고당 제조를 위한 효소반응공정의 최적 온도는 40℃이고 최적 pH는 9.0임을 알 수 있었다.
상기 실시예에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 갈조류의 일종인 톳으로부터 분리한 신규 해양 미생물Xanthomonassp. BH-1 KCTC 10677BP를 최적화 배지(Sucrose 5 g/L, (NH4)2SO49 g/L, (NH4)2HPO43 g/L, NaCl 10 g/L, KCl 3 g/L, CaCl20.05 g/L)에서 배양한 결과Xanthomonassp. BH-1 배양 48시간 후에 세포외 알긴산 분해효소 4.91 U/ml을 생산할 수 있었다. 따라서 본 발명은 미역, 톳, 다시마 등과 같은 해조류 유래 천연 다당류인 알긴산을 효소공학적 가수분해에 의해 알긴산 올리고당을 경제적으로 대량생산할 수 있는 고효율 알긴산 분해효소를 제공한다.

Claims (1)

  1. 신규한 해양 미생물 잔토모나스 에스피. 비에이치-1 케이씨티씨 10677비피(Xanthomonassp. BH-1 KCTC 10677BP)를 이용하는 것을 특징으로 하는 알긴산 분해효소의 제조방법.
KR10-2004-0073608A 2004-09-15 2004-09-15 신규한 해양 미생물 잔토모나스 에스피. 비에이치-1을이용한 알긴산 분해효소의 제조방법 KR100462904B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113662181A (zh) * 2021-10-25 2021-11-19 中国海洋大学 具有抗疲劳功能活性的马尾藻水解物及其制备方法与应用

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