BRPI0809039A2 - Microorganismos metabolicamente projetados úteis para a produção de 1,2-propanodiol - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "MICROORGANISMOS METABOLICAMENTE PROJETADOS ÚTEIS PARA A PRODUÇÃO DE 1,2-PROPANODIOL" .

A presente invenção envolve um microorganismo metabolicamente projetado e seu uso para a preparação de 1,2-propanodiol.

0 1,2-propanodiol ou propilenoglícol, um diálcool C3, é uma substância química amplamente utilizada. Ele é um componente das resinas de poliéster insaturadas, detergentes líquidos, refrigerantes, anticongelantes e fluidos descongelantes para aeronaves. Propilenoglicol tem sido cada vez mais usado desde 1993 - 1994 como um substituto dos derivados de etileno, os quais são reconhecidos como sendo mais tóxicos do que os derivados de propileno.

O 1,2-propanodiol é atualmente produzido por meios químicos usando um processo de hidratação de óxido de propileno que consome grandes quantidades de água. Óxido de propileno pode ser produzido por qualquer um dentre dois processos, um usando epicloridrina e o outro peróxido de hidrogênio. Ambas as vias usam substâncias altamente tóxicas. Além disso, a via do peróxido de hidrogênio gera subprodutos tais como terc-butanol e 1-feniletanol. Para que a produção de propileno se torne lucrativa, um uso deve ser encontrado para esses subprodutos. A via quimica geralmente produz 1,2-propanodiol racêmico, enquanto cada um dos dois estereosiômeros (R)1,2-propanodiol e (S)1,2- propanodiol são de interesse para certas aplicações.

As desvantagens dos processos químicos para a produção

de 1,2-propanodiol tornam a sintese biológica uma alternativa atrativa. Duas vias foram caracterizadas para a produção natural de 1,2-propanodiol a partir de açúcares por microorganismos.

Na primeira via os açúcares 6-desóxi (por exemplo, L

ramnose ou L-fucOse) são clivados em diidroxiacetona fosfato e (S)-Iactaldeido, os quais podem ser ainda reduzidos a (S)-1,2-propanodiol (Badia et al, 1985). Esta via é funcional em E. coli, porém não pode gerar um 15 processo economicamente viável devido ao custo elevado das desoxiexoses.

A segunda via é o metabolismo dos açúcares comuns (por exemplo, glicose ou xilose) pela via da glicólise seguido pela via do metilglioxal. Diidroxiacetona fosfato é 20 convertida em metilglioxal, que pode ser reduzido a lactaldeido ou a acetol. Esses dois compostos podem então sofrer uma segunda reação de redução produzindo 1,2- propanodiol. Esta via é utilizada por produtores naturais de (R)-1,2-propanodiol, tais como Clostridium sphenoídes e Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Clostridium sphenoides tem sido usada para produzir 1,2-propanodiol em um titulo de 1,58 g/L sob condições de fosfato limitadas (Tran Din e Gottschalk, 1985). Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum também foi investigado em relação à produção de 1,2-propanodiol (Cameron e Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987). Os melhores desempenhos obtidos foram um título de 9 g/L e um rendimento de glicose de 0,2 g/g. Entretanto, a melhoria dos desempenhos obtidos com esses organismos parece ser limitada devido à falta das ferramentas genéticas disponíveis.

TÉCNICA ANTERIOR

Cameron et al (1998) investigou o uso de E. coli como uma plataforma para a engenharia metabólica para a conversão de açúcares em 1,2-propanodiol. Suas análises teóricas mostraram que o limite superior do rendimento de produto realístico (considerando o balanços de massa e a produção de energia para o crescimento) é significativamente diferente dependendo das condições de cultivo. Sob condições anaeróbicas, o acetato será produzido como um subproduto para reciclar os co-fatores reduzidos e o melhor rendimento deve ser limitado a 1 mol de 1,2-propanodiol por mol de glicose (0,42 g/g). Sob condições aeróbicas, a reciclagem dos co-fatores deve ser assegurada pela cadeia respiratória usando oxigênio como aceptor de elétrons final e poderia ser possível produzir

1,2-propanodiol sem a produção de subprodutos. Sob essas condições, o rendimento poderia alcançar no máximo 1,42 mol/mol (0,6 g/g). Considerando o título máximo de 1,2- propanodiol, Cameron et al discutiu a sua dependência do produto e a toxicidade do subproduto. 1,2-propanodiol é significativamente menos tóxico do que 1,3-propanodiol e a E. coli exibe uma taxa de crescimento residual de 0,5 h"1 com 100 g/L de 1,2-propanodiol. A inibição do crescimento é mais provável de ser decorrente do subproduto acetato que é conhecido por ser altamente inibitório do crescimento. 0 desenvolvimento de um processo anaeróbico para a produção de 1,2-propanodiol com altos títulos e rendimentos terá que endereçar o problema do acetato. A conversão do acetato em acetona, a qual é menos inibitória e facilmente removida in situ foi proposta (WO 2005/07 3364).

Várias investigações para as modificações genéticas de E. coli para obter um produtor de 1,2-propanodiol usando fontes de carbono simples foram feitas pelo grupo de Cameron (Cameron et al, 1998, Altaras e Cameron, 1999, Altaras e Cameron, 2000) e o grupo de Bennett (Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003). Estes estudos se baseiam, por outro lado, na expressão de uma ou de várias atividades enzimáticas na via a partir de diidroxiacetona fosfato em 1,2-propanodiol e, por outro lado, na remoção de NADH e nas vias de consumo de carbono na cepa hospedeira. Os melhores resultados obtidos pelo grupo de Cameron são a produção de 1,4 g/L de 1,2-propanodiol em cultura em frasco anaeróbico com um rendimento de 0,2 g/g de glicose consumida. Quando extrapolada no fermentador de alimentação em lote anaeróbico, a produção foi de 4,5 g/L de 1,2- propanodiol com um rendimento de 0,19 g/g de glicose, muito longe das suas expectativas teóricas. Esses desempenhos foram obtidos com a superexpressão do gene da metilglioxal sintase de E. coli (mgs), o gene da glicerol desidrogenase de E. coli (gldA) e o gene da oxidorredutase de 1,2- propanodiol de E. coli (fuço) em uma cepa sem o gene que codifica a lactato desidrogenase (IdhA). Os resultados obtidos com a mesma abordagem, porém com títulos e rendimentos menores também estão descritos nas patentes US 6.087.140, US 6.303.352 e WO 98/37204.

O grupo de Bennett também utilizou uma cepa hospedeira de E. coli sem IdhA para a superexpressão do gene mgs de Clostridium acetobutylicum e o gene gldA de E. coli. Culturas em frasco sob condições anaeróbicas produziram um título de 1,3 g/L e um rendimento de 0,12 g/g, enquanto culturas microaeróbicas produziram um título de 1,4 g/L com um rendimento de 0,13 g/g.

Neste estágio, todos estes resultados não são melhores do que aqueles obtidos com as espécies T. thermosaccharolyticum.

5 O catabolismo da glicose pela via da glicólise em E.

coli resulta em duas moléculas de triose fosfato, diidroxiacetona fosfato (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato, depois da clivagem de frutose-1,6-bisfosfato. Essas duas moléculas de triose fosfato podem ser interconvertidas pela 10 atividade da triose fosfato isomerase. É geralmente reconhecido que DHAP é convertido em GA3P e os dos GA3P originários da glicose são posteriormente catabolizados.

A gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, também chamada GAPDH, é uma das enzimas chaves envolvidas na conversão glicolitica de glicose em ácido pirúvico. GAPDH catalisa a reação a seguir:

Gliceraldeído 3-fosfato + fosfato + NAD+ —» 1,3- bisfosfoglicerato + NADH + H+

O gene codificando esta enzima foi clonado em 1983 em 20 E. coli (Branlant et al., Gene, 1983) e nomeado "gap". Posteriormente outro gene codificando um produto com a mesma atividade enzimática foi identificado e chamado de gapB (Alefounder et al., Microbiol, 1987). A caracterização das cepas de E. coli com genes gapA e gapB eliminados demonstrou que gapA é essencial para a glicólise, apesar de gapB ser dispensável (Seta et al. , J. Bacter., 1997). Um microorganismo com um gene gapA infrarregulado foi reportado no pedido de patente WO 2004/033646 para a 5 produção de 1,3-propanodiol a partir de glicose por fermentação.

Os inventores da presente invenção demonstraram que 2 fatores juntos são necessários para obter um aumento do rendimento de 1,2-propanodiol:

- uma atividade melhorada da via de biossintese de

1,2-propanodiol, e

- uma atenuação da atividade de GAPDH.

Os inventores também demonstraram que o aumento da concentração de fosfoenolpiruvato intracelular ou o uso do sistema transportador de açúcar pode ainda estimular a produção de 1,2-propanodiol por fermentação de um microorganismo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada com um microorganismo útil para a produção de 1,2-propanodiol a partir de uma fonte de carbono, em que o referido microorganismo é caracterizado por:

a) uma atividade melhorada da via biossintética de diidroxiacetona fosfato para 1,2-propanodiol, e b) uma atividade atenuada da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.

A atividade melhorada da via Biosintética de DHAP para 1,2-propanodiol é obtida pelo aumento da atividade de pelo menos uma enzima envolvida na referida via biossintética. Isto pode ser obtido pelo aumento da expressão do gene codificando a referida enzima e, particularmente, pela expressão de pelo menos um gene selecionado dentre mgsA, yqhD, yafB, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC, gldA e fucO. Preferivelmente, a expressão dos três genes mgsA, yqhD e gldA é aumentada.

Em outro aspecto da invenção, a via Entner-Doudoroff é eliminada pela anulação ou do gene edd ou do gene eda ou de ambos. Além disso, a síntese de subprodutos indesejados é atenuada pela anulação dos genes codificando as enzimas envolvidas na síntese de lactato a partir de metilglioxal (tal como gloA, Alda, aldB), lactato a partir de piruvato (IdhA), formato (pflA, pflB), etanol (adhE) e acetato (ackA, pta, poxB).

A atividade do gliceraldeído 3-fosfato é atenuada para redirecionar uma parte do gliceraldeído 3-fosfato disponível para a síntese de 1,2-propanodiol através da ação da enzima triose fosfato isomerase. O rendimento de

1,2-propanodiol em relação à glicose pode ser então maior do que 1 mol/mol. Entretanto, devido à produção reduzida de fosfoenolpiruvato (PEP), o sistema de importação de açúcar dependente de PEP será negativamente impactado. Consequentemente, em um aspecto da invenção, a eficiência da importação de açúcar é aumentada, seja pelo uso de uma importação de açúcar independente de PEP tipo aquela codificada por galP, ou pelo fornecimento de mais PEP para o sistema açúcar-fosfotransferase. Isto é obtido pela eliminação das vias que consomem PEP como as piruvato quinases (codificadas pelos genes pykA e pykF) e/ou pela promoção da síntese de PEP, por exemplo, pela superexpressão do gene ppsA codificando a PEP sintase.

Adicionalmente, é valioso para a enzima conversora de piruvato em acetil-CoA que seja resistente Às elevadas concentrações de NADH encontradas sob condições anaeróbicas. Isto pode ser obtido por uma mutação específica no gene lpd. Finalmente, para poupar NADH para a redução e acetol em 1,2-propanodiol, os genes arcA e ndh podem ser anulados.

0 microorganismo usado para o preparo de 1,2- propanodiol é selecionado dentre bactérias, leveduras e fungos, porém é preferivelmente das espécies Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum.

É também um objeto da presente invenção fornecer um processo para a produção de 1,2-propanodiol pelo cultivo do microorganismo modificado em um meio de crescimento apropriado e pela recuperação e purificação do 1,2- propanodiol produzido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

0 desenho associado que é incorporado e constitui parte desse relatório descritivo exemplifica a invenção e, juntamente com a descrição, serve para explicar os princípios dessa invenção.

A Fxgura 1 demonstra a engenharia genética do

metabolismo central no desenvolvimento de um sistema de produção de 1,2-propanodiol a partir dos carboidratos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme aqui utilizados, os termos a seguir podem ser usados para a interpretação das reivindicações e relatório descritivo.

De acordo com a invenção, os termos "cultura", "crescimento" e "fermentação" são usados

intercambiavelmente para denotar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples.

0 termo "fonte de carbono", de acordo com a presente invenção, denota qualquer fonte de carbono que possa ser usada pelas pessoas versadas na técnica para manter o crescimento normal de um microorganismo, e a qual pode ser hexoses, pentoses, monossacarídeos, dissacarideos, oligossacarideos, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e suas combinações.

0 termo "útil para a produção de 1,2-propanodiol"

denota que o microorganismo produz o referido produto de interesse, preferivelmente por fermentação. Fermentação é um processo clássico que pode ser efetuado sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

A frase "atenuação da atividade de uma enzima" se

refere a um decréscimo da atividade da enzima de interesse na cepa modificada em comparação com a atividade na cepa inicial antes de qualquer modificação. A pessoa versada na técnica conhece várias formas de obter este resultado. Exemplos possíveis incluem:

- Introdução de uma mutação no gene, reduzindo o nível de expressão desse gene, ou o nível de atividade da proteína codificada.

- Substituição do promotor natural do gene por um promotor de baixa força, resultando em uma expressão mais

baixa.

Uso dos elementos que desestabilizam o RNA mensageiro correspondente ou a proteína.

Anulação do gene se não mais for necessária expressão .

0 termo "expressão" se refere à transcrição e tradução de uma seqüência gênica que leva à geração da proteína correspondente, produto do gene.

Vantajosamente, a atividade da gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase é menor do que 30% da atividade observada em uma cepa não-modificada sob as mesmas condições, mais preferivelmente menor do que 10%.

O termo "atividade melhorada da via de biossíntese da diidroxiacetona fosfato em 1,2-propanodiol" significa que pelo menos uma das atividades enzimáticas envolvidas na via é melhorada (ver abaixo).

Vantajosamente, o microorganismo da invenção é geneticamente modificado para aumentar a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na via biossintética de diidroxiacetona fosfato para 1,2-propanodiol.

Preferivelmente, o aumento da atividade de uma enzima .é obtido pelo aumento da expressão do gene codificando a referida enzima.

Para obter uma superexpressão de um gene de interesse,

a pessoa versada na técnica conhece diferentes métodos, tais como:

- Substituição do promotor endógeno com um promotor mais forte; Introdução no microorganismo de um vetor de expressão carregando o referido gene de interesse;

- Introdução de cópias adicionais do gene de interesse no cromossomo.

Várias técnicas são atualmente usadas para introduzir

DNA em uma cepa bacteriana. Uma técnica preferida é a eletroporação, a qual é bem conhecida pelas pessoas versadas na técnica.

Vantajosamente, pelo menos um gene de interesse é superexpresso, selecionado dentre: mgsA, yafB, yeaE, yghZ, yqhE, yqhD, ydhF, ycdW, yajO, ydjG, ydbC, tas, gldA e fucO.

O gene mgsA codifica a metilglioxal sintase catalisando a conversão de DHAP em metilglioxal. Os genes yafB, yeaE, yghZ, yqhE, yqhD, ydhF, ycdW, yajO, ydjG, ydbC 15 e tas codificam atividades enzimáticas capazes de converter metilglioal em acetol. O gene gldA codifica glicerol desidrogenase, a qual catalisa a conversão do acetol em

1,2-propanodiol. 0 gene fucO codifica 1,2-propanodiol oxidorredutase catalisando a conversão de lactaldeido em 1,2-propanodiol.

Um microorganismo preferido abriga modificações que levam à superexpressão dos três genes de interesse particular: mgsA, yqhD e gldA.

Preferivelmente, no microorganismo de acordo com a invenção, pelo menos um gene envolvido na via EntnerDoudoroff é atenuado. A via Entner-Doudoroff fornece uma via alternativa para degradar glicose em gliceraldeído-3- fosfato e piruvato, além de glicólise. A atenuação da via 5 Entner-Doudoroff assegura que a maior parte ou, na melhor das hipóteses, toda a glicose é degradada via glicólise e pode ser usada para a produção de 1,2-propanodiol.

Particularmente, pelo menos um dos dois genes dessa via edd ou eda é atenuado.

O termo "atenuação da expressão de um gene", de acordo

com a invenção, denota a supressão parcial ou completa da expressão de um gene, o qual é então dito como sendo "atenuado". Esta supressão da expressão pode ser ou uma inibição da expressão do gene, a supressão de um mecanismo 15 de ativação do gene, uma anulação de toda ou parte da região promotora necessária para a expressão gênica ou uma anulação na região codificadora do gene. Preferivelmente, a atenuação de um gene é essencialmente a anulação completa daquele gene, cujo gene pode ser substituído por um gene 20 marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das cepas de acordo com a invenção. Um gene é preferivelmente inativado pela técnica de recombinação homóloga, conforme descrito em Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escheríchia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6640-6645).

Preferivelmente, no microorganismo de acordo com a invenção, pelo menos uma enzima envolvida na conversão de 5 metilglioxal em lactato é atenuada. 0 propósito desta atenuação é que o metilglioxal disponível seja usado pela maquinaria celular essencialmente para a síntese de 1,2- propanodiol (ver figura 1).

Os genes envolvidos na conversão de metilglioxal em lactato são, particularmente:

- Genes codificando as enzimas com atividade glioxalase, tal como o gene gloA codificando a glioxalase I, catalisando a síntese de lactoil glutationa a partir de metilglioxal;

- os genes Alda e aldB que codificam a lactaldeído desidrogenase (Catalisando a síntese de (S) lactato a partir de (S) lactaldeído).

A expressão de um ou mais desses genes é vantajosamente atenuada na cepa inicial. Preferivelmente, o gene gloA é completamente anulado.

No microorganismo da invenção, é preferível que pelo menos uma enzima envolvida na síntese de subprodutos tais como lactato, etanol e formato seja atenuada.

Particularmente, é vantajoso atenuar o gene IdhA que codifica a lactato desidrogenase catalisando a síntese de lactato a partir de piruvato, e o gene adhE codificando álcool-aldeído desidrogenase catalisando a síntese de etanol a partir de acetil-CoA.

Semelhantemente, é possível forçar o microorganismo a

usar o complexo da piruvato desidrogenase para produzir acetil-CoA, CO2 e NADH a partir de piruvato, ao invés de acetil-CoA e formato. Isto pode ser conseguido pela atenuação dos genes pflA e pflB que codificam a piruvato formato liase.

Em outra modalidade específica da invenção, a síntese do subproduto acetato é evitada pela atenuação de pelo menos uma enzima envolvida na sua síntese. É preferível evitar tal síntese de acetato para melhorar a produção de 1, 2-propanodiol.

Para prevenir a produção de acetato, vantajosamente a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre ackA, pta e poxB é atenuada. Todos esses genes codificam enzimas envolvidas nas diferentes vias de biossíntese de acetato (ver figura 1).

Preferivelmente, no microorganismo de acordo com a invenção, a eficiência de importação de açúcar é aumentada. Uma forte atenuação da expressão do gene gapA resultando em um decréscimo do fluxo de carbono na reação GAPDH de mais de 50%, isso irá resultar na síntese de menos de 1 mol de fosfoenolpiruvato (PEP) por mol de glicose importada. PEP é requerido pelo sistema açúcar-fosfotransferase (PTS) normalmente usado para a importação e açúcares simples para 5 dentro da célula, uma vez que a importação é acoplada com uma fosfotransferência de PEP para glicose, produzindo glicose-6-fosfato. Deste modo, a redução da quantidade de PEP irá impactar negativamente na importação de açúcar.

Em uma modalidade específica da invenção, o açúcar deve ser importado no microorganismo por um sistema de importação de açúcar independentemente do

fosfoenolpiruvato. 0 simportador da galactase-próton codificado pelo gene galP que não envolve a fosforilação pode ser utilizado. Neste caso, a glicose importada tem que 15 ser fosforilada pela glicose quinase codificada pelo gene glk. Para promover esta via, a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre galP e glk é aumentada. Como resultado, o PTS se torna dispensável e pode ser eliminado pela atenuação de pelo menos um gene selecionado dentre 20 ptsH, ptsl ou crr.

Em outra modalidade específica da invenção, a eficiência do sistema açúcar-fosfotransferase (PTS) é aumentada pelo aumento da disponibilidade do metabólito fosfoenolpiruvato. Devido à atenuação da atividade gapA e do fluxo de carbono reduzido para o piruvato, a quantidade de PEP na cepa modificada da invenção poderia estar limitada, levando a uma menor quantidade de glicose transportada para dentro da célula.

Vários meios existem que podem ser usados para

aumentar a disponibilidade de PEP em uma cepa de microorganismo. Particularmente, uma forma é atenuar a reação PEP —> piruvato. Preferivelmente, pelo menos um gene selecionado dentre pykA e pykF, codificando a enzima 10 piruvato quinase, é atenuado na referida cepa para obter este resultado. Outra forma de aumentar a disponibilidade de PEP é favorecer a reação piruvato —>· PEP, catalisada pela fosfoenolpiruvato sintase pelo aumento da atividade da enzima. Essa enzima é codificada pelo gene ppsA. 15 Consequentemente, preferivelmente no microorganismo, a expressão do gene ppsA é preferivelmente aumentada. Ambas as modificações podem estar presentes no microorganismo simultaneamente.

Especialmente sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas, é vantajoso que o complexo piruvato desidrogenase (PDC), convertendo piruvato em acetil CoA tenha baixa sensibilidade à inibição por NADH. Uma sensibilidade mais baixa é definida com referência à sensibilidade da enzima não-modificada. Tal característica pode ser obtida pela introdução de uma mutação específica no gene Ipd (codificando a subunidade da lipoamida desidrogenase de PDC) resultando na substituição da alanina 5 55 na seqüência proteica da enzima com o resíduo de valina.

Sob condições anaeróbicas ou micraeróbicas, a disponibilidade de NADH para a redução dos precursores em

1,2-propanodiol é vantajosamente aumentada. Isto é obtido pelo alívio da repressão no ciclo do ácido tricarboxíIico 10 mediada pelo regulador global ArcA (codificado pelo gene arcA) . A concentração de NADH na célula pode também ser aumentada pela inativação da NADH desidrogenase II codificada pelo gene ndh. Consequentemente,

preferivelmente, pelo menos um gene selecionado dentre arcA e ndh é atenuado.

Preferivelmente, o microorganismo de acordo com a invenção é selecionado dentre bactérias, leveduras ou fungos. Mais preferivelmente, o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae e

Corynebacteriaceae. Ainda mais preferivelmente, o microorganismo é ou Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum.

Outro objeto da invenção é um método para preparar 1,2-propanodiol, em que um microorganismo, tal como descrito anteriormente, cresce em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples, e o 1,2- propanodiol produzido é recuperado. A produção de 1,2- 5 propanodiol é efetuada sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

As condições de cultivo para o processo de fermentação podem ser prontamente definidas pelas pessoas versadas na técnica. Particularmente, bactérias são fermentadas em 10 temperaturas entre 20 0C e 55 0C, preferivelmente entre 25 0C e 40 °C, e preferivelmente em cerca de 35 0C para C. acethutylicum e em cerca de 37 0C para E. coli.

Esse processo pode ser efetuado ou em um processo em lote, em um processo de alimentação de lote ou em um processo contínuo.

"Sob condições aeróbicas" significa que oxigênio é fornecido à cultura pela dissolução do gás na fase líquida. Isto poderia ser obtido pela (1) pulverização de gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na fase líquida, ou (2) 20 agitação do frasco contendo o meio de cultura para transferir o oxigênio contido no espaço de cabeça na fase líquida. Vantagens da fermentação sob condições aeróbicas ao invés de condições anaeróbicas é que a presença de oxigênio como um aceptor de elétrons melhora a capacidade da cepa de produzir mais energia na forma de ATP para processos celulares. Consequentemente, a cepa tem seu metabolismo melhorado de modo geral.

Condições microaeróbicas são definidas como condições 5 de cultivo em que porcentagens baixas de oxigênio (por exemplo, usando uma mistura de gás contendo entre 0,1 e 10% de oxigênio, completada até 100% de nitrogênio) são dissolvidas na fase liquida.

Condições anaeróbicas são definidas como condições de 10 cultivo em que nenhum oxigênio é fornecido no meio de cultivo. Condições estritamente anaeróbicas são obtidas pulverizando um gás inerte como nitrogênio no meio de cultura para remover traços de outros gases. Nitrato pode ser usado como um aceptor de elétrons para melhorar a 15 produção de ATP pela cepa e melhorar o seu metabolismo.

O termo "meio de crescimento apropriado", de acordo com a invenção, denota um meio de composição molecular conhecida adaptado ao crescimento do microorganismo. Por exemplo, um meio de cultura mineral de composição 20 estabelecida conhecida adaptado às bactérias usadas, contendo pelo menos uma fonte de carbono. Particularmente, o meio de crescimento mineral para E. coli pode deste modo ser de composição idêntica ou similar ao meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32:120-128), meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) ou um meio tal como aquele 5 definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88- 96) , e particularmente o meio de cultura mínimo chamado de

MPG descrito abaixo:

K2PO4 1,4 g/L

Ácido nitrilotriacético 0,2 g/L

Solução de elementos traço* 10 mL/L

(NHa) 2SOâ 1 g/L

NaCl 0,2 g/L

NaHCO3 0,2 g/L

MgSO4 O,2 g/L Glicose 20 a 100 g/L

NaNO3 0,424 g/L

Tiamina 10 mg/L

FeSO4. 7 H2O 50 mg/L

Extrato de levedura 4 g/L

0 pH do meio é ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio.

Solução de elementos traço*: ácido cítrico 4,37 g/L,

MnSO4 3 g/L, CaCl2 1 g/L, CoCl2 · 2 H2O 0,1 g/L, ZnSO4.7H20 0,10 g/L, CuSO4.5H20 10 mg/L, H3BO3 10 mg/L, Na2MoO4 8,31 mg/L.

Em uma modalidade específica da invenção, o método é efetuado com uma cepa de E. coli crescida em um meio 5 contendo uma fonte de carbono simples que pode ser arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose ou xilose. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é a glicose.

Em outra modalidade específica da invenção, o método é efetuado com uma cepa de C. acetobutylicum em um meio contendo uma fonte de carbono simples ou complexa.

0 meio de crescimcnto para C. acetobutylicum pode ser então de composição idêntica ou similar ao Meio de Crescimento de Clostrídio (CGM, Wiesenborn et al., Appl. 15 Environm. Microbiol., 54: 2717-2722) ou um meio de crescimento mineral conforme dado por Monot et al. (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1 318-1324) ou Vasconcelos et al. (J. Bacteriol., 176 : 1443-1450).

A fonte de carbono usada para a cultura de C. 20 acetobutylicum é ou um carbono simples ou complexo. A fonte de carbono simples pode ser arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose ou xilose. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é a glicose. A fonte de carbono complexa pode ser amido ou hemicelulose. Uma fonte de carbono complexa especialmente preferida é o amido.

Vantajosamente, o 1,2-propanodiol recuperado é adicionalmente purificado. A pessoa versada na técnica 5 conhece várias formas de recuperar e purificar o 1,2- propanodiol.

A invenção é descrita acima, abaixo e nos Exemplos em relação à E. coli. Deste modo os genes que podem ser atenuados, eliminados ou superexpressos para as cepas 10 iniciais e evoluídas de acordo com a invenção são principalmente definidas usando a denominação dos genes de E. coli. Entretanto, esta designação tem um significado mais genérico de acordo com a invenção, e cobre os genes correspondentes nos outros microorganismos. Usando as 15 referências do GenBank dos genes de E. coli, as pessoas versadas na técnica podem determinar genes equivalentes em outros organismos diferentes de E. coli.

Os meios de identificação das seqüências homólogas e de suas homologias de porcentagem são bem conhecidos pelas 20 pessoas versadas na técnica e incluem particularmente os programas BLAST que podem ser usados no sítio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros predefinidos indicados naquele sítio. As seqüências obtidas podem ser exploradas (alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), com os parâmetros predefinidos indicados nesses sitios.

0 bando de dados PFAM (banco de dados das famílias proteicas dos alinhamentos e modelos Markov escondidos 5 http: //www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) é uma grande coletânea de alinhamentos de seqüências proteicas. Cada PFAM torna possível a visualização de alinhamentos múltiplos, ver domínios proteicos, avaliar distribuições dentre os organismos, ganhar acesso a outros bancos de 10 dados e visualizar estruturas proteicas conhecidas.

COGs (clusters de grupos ortólogos de proteínas http://www.ncbi.nlm.nih.qov/COG/) são obtidas pela comparação das seqüências proteicas derivadas de 66 genomas unicelulares totalmente sequenciados representando 44

principais linhagens filogenéticas. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, tornando possível a identificação de velhos domínios conservados.

REFERÊNCIAS na ordem de citação no texto

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EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção das cepas modificadas de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA: :cm (pMElOIVBO1 -yqhD-mgsA-gldA) , E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA: :cm (pME101VB01-ya£B-mgsA-g2dA) e de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA: : cm (pMElQlVBOl-yqhE-mgsA-gldA) .

Para aumentar a produção de 1,2-propanodiol diferentes combinações dos genes foram expressas a partir do plasmídeo pMElOlVBOl usando o promotor trc.

a) Construção das cepas modificadas de E. coli MGl655 (pMEl0IVB01 -yqhD-mgsA-gldA) , MG1655 (pMElOlVBO 1-ya.fB-mgsAgldA) e MG1655 (pME10IVB01 -yqhE-mgsA-gldA) .

Construção do plasmideo pMElOlVBOl O plasmídeo pMElOlVBOl foi derivado do plasmideo pMElOl e abrigou um sítio de clonagem múltiplo contendo seqüências do sítio de reconhecimento específicas para as endonucleases de restrição raras NheI, SnaBI, PacI, Bg/II, 5 AvrII, SacII e AgeI seguido pelo terminador de transcrição adc de Clostridium acetobutylicum ATCC824.

Para a expressão de um vetor de cópia baixo o plasmídeo pMElOl foi construído da seguinte forma. 0 plasmídeo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 10 - GenBank AX085428) foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos PME101F e PME101R e o fragmento BstZl7IXmnI do vetor pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) abrigando o gene IacI e o promotor trc foi inserido no vetor amplificado.

PME101F (SEQ ID NO 1): ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R (SEQ ID NO 2): agcttagtaaagccctcgctag

Um ligante de ácido nucleico de fita dupla sintético compreendendo o sítio de multiclonagem e o terminador transcricional adc foram usados para gerar pMElOlVBOl. Dois 20 oligonucleotídeos com 100 bases que flanqueiam o complemento pelos sítios de restrição digeridos NcoI ou HindIII foram anelados. 0 produto com 100 pares de base foi subclonado no plasmídeo pMElOl digerido NcoI/HindIII para gerar pMElOlVBOl. pMElOlVBO 1, consistindo de 100 bases (SEQ ID NO: 3): catggqctagctacgtattaattaaagatctcctaggqaqctcaccggtTAAAAATAAG AGTTAC CTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca pMElOlVBOl 2, consistindo de 100 bases (SEQ ID NO 4):

agct tgqcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccg gtgagctccctagqaqatctttaattaatacgtagctagcc com:

uma região (letras minúsculas sublinhadas) correspondendo ao sitio de multiclonagem;

- uma região (letras maiúsculas) correspondendo ao

terminador de transcrição adc (seqüência 179847 a 179814) de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 pSOLl (NC_001988).

Construção dos plasmideos para a expressão de diferentes combinações dos genes da via biossintética de 1,2-propanodiol (pMEl 0IVBO1 -yqhD-mgsA- gldA, pMElOlVBOlya£B-mgsA-gldA e pMElOlVBOl -yqhE-mgsA-gldA)

Os genes diferentes foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico de E. coli MG1655 usando os oligonucleotídeos dados na Tabela 1.

2 0 Tabela 1: oligonucleotídeos usados para a amplificação

dos genes da via do 1,2-propanodiol. Nome Nomes SEQ ID Homologia com Sitios de do dos gene restrição gene oligos yqhD yqhDR2 No. 5 3153369 - BspHI yqhDF2 No. 6 3153400 adicionado 3154544 - BspHI removido 3154475 NheI adicionado mgs A mg s AF No. 7 1026268 - SnaBI mg s AR No. 8 1026248 adicionado 1025780 - BglII 1025800 adicionado gldA gldAF No. 9 4136631 - AvrII gldAR No. 10 4136612 adicionado 4135512 - SacI 4135530 adicionado yafB yafB F2 No. 11 229167 - NcoI yafB R No. 12 229190 adicionado 229970 - NheI 229950 adicionado yqhE yqhE F No. 13 3154641 - NcoI yqhE R No. 14 3154661 adicionado Nome Nomes SEQ ID Homologia com Sitios de do dos gene restrição gene oligos 3155464 - NheI 3155444 adicionado Os fragmentos amplificados por PCR foram cortados com as enzimas de restrição mencionadas na Tabela 1 e clonados nos sítios de restrição do plasmídeo pMElOlVBOl. Os plasmídeos a seguir foram construídos: pMElOlVBOl-ygiiD5 mgsA-gldA, pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA e pMElOlVBOl-ygiiEmgsA-gldA.

Os plasmídeos foram a seguir introduzidos na cepa de E. coli MGl655.

b) Construção de tuna cepa modificada de E. coli MGl 655 Ptrcl6-gapA:: cm

A substituição do promotor gapA natural com o promotor Ptrcl6 curto sintético (SEQ ID NO: 15:

gagctgttgacgattaatcatccqgctcgaataatgtgtgg) na cepa de E. coli MG1655 foi feita pela substituição de 225 pb da seguência gapA à montante com FRT-CmR-FRT e um promotor projetado. A técnica usada foi descrita por Datsenko, K.A.

& Wanner, BX. (2000).

Os dois nucleotídeos usados para substituir o promotor gapA natural de acordo com o Protocolo 1 são dados na Tabela 2.

Protocolo 1: Introdução de um produto de PCR para a recombinação e seleção dos recombinantes.

5 Os oligonucleotídeos escolhidos e dados na Tabela 2 para substituição de um gene ou uma região intergênica foram usados para amplificar ou o cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmídeo pKD3 ou o cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, 10 B.L. (2000)). 0 produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na cepa receptora com o plasmídeo pKD4 6 na qual o sistema Red (. . exo) expresso favorece bastante a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes a antibiótico foram então selecionados e a inserção do 15 cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotídeos apropriados dados na Tabela 3.

A cepa resultante foi chamada de E. coli MG1655 Ptrcl6- gapA::cm.

Os 3 plasmídeos foram introduzidos separadamente na cepa de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA::cm.

Tabela 2: Oligonucleotídeos usados para a substituição de uma região cromossomal por recombinação com um produto de PCR na cepa de E. coli MG1655. Nome da Nome dos SEQ ID Homologia com região oligos região cromossomal Ptrc-gapAF No. 16 1860478 Promotor GAPA 1860536 ( Ptrcl6-gapA) Ptrcl6-gapAR No. 17 1860762 1860800 DeddF No. 18 1932582 Genes edd e 1932501 eda DedaR No. 19 1930144 1930223 GLOAD f No. 20 1725861 Gene gloA GLOA D R No. 21 1725940 1726268 1726189 AldA D f No. 22 1486256 gene aldA aldAD r No. 23 1486336 1487695 1487615 AldB D f No. 24 3752603 gene aldB aldBD r No. 25 3752682 3754141 3754062 Nome da Nome dos SEQ ID Homologia com região oligos região cromos somai DldhAF No. 26 1440865 gene IdhA DldhAR No. 27 1440786 1439378 1439958 DpflB r No. 28 952315 Gene pfIAB DpflAf No. 29 952236 949470 949549 DadhE r No. 30 1297344 Gene adhE DadhEf NO. 31 1297264 1297694 1297773 DackAF No. 32 2411494 Genes ackA- 2411573 pta DptaR No. 33 2414906 2414830 DpoxBF No. 34 908557 gene poxB DpoxBR No. 35 908635 910262 910180 Nome da Nome dos SEQ ID Homologia com região oligos região cromossomal DpykAF No. 36 1935756 Gene pykA DpykAR No. 37 1935836 1755129 1755051 DpykFF No. 38 1753689 1753766 Gene pykF DpykFR No. 39 1755129 1755051 Tabela 3: Oligonucleotídeos usados para verificar a

inserção de um cassete de resistência ou a perda de -um

cassete de resistência

Nome da Nome dos SEQ ID Homologia com região região oligos cromossomal Promotor GAPA yeaAF No. 40 1860259 - 1860287 (Ptrcl6-gapA) gapAR No. 41 1861068 - 1861040 Genes edd e eddF No. 42 1932996 - 1932968 eda edaR No. 43 1929754 - 1929777 Gene gloA NemAQd No. 44 1725331 a 1725361 Rnt Cr No. 45 1726795 a 1726765 Nome da Nome dos SEQ ID Homologia com região região oligos cromossomal gene aldA Ydc FCf No. 46 1485722 a 1485752 gapCCr No. 47 1488225 a 1488195 gene aldB aldB C f No. 4 8 3752056 a 3752095 YiaYCr No. 49 3754674 a 3754644 gene IdhA IdhAF No. 50 1439724 a 1439743 IdhAR No. 51 1441029 a 1441007 Gene pflAB pfIAB 1 No. 52 948462 a 948491 pflAB 2 No. 53 953689 a 983660 Gene adhE ychGf No. 54 1294357 a 1294378 adhECr No. 55 1297772 a 1297749 Genes ackA- B2295 No. 56 2410900 a 2410919 pta YfcCR No. 57 2415164 a 2415145 gene poxB poxBF No. 58 908475 a 908495 poxBR No. 59 910375 a 910352 Gene pykA pykAF No. 60 1935338 a 1935360 pykAR No. 61 1937425 a 1937401 Gene pykF pykFF No. 62 1753371 a 1753392 pykFR No. 63 1755518 a 1755495 Exemplo 2: Construção das cepas modificadas de E. coli

MG1655 Ptrcl 6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF (pMEIOIVBO1 -yqhD-mgsA-gldA) , (pJB137-PgapA-ppsA) , E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF (pME10IVB01 - ya.fB-mgsA-gldA) , (pJB137-PgapA-ppsA) e E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF 5 (pME 10IVBO 1-yqhE-mgsA-gldA) , (pJB137-PgapA-ppsA) capazes de produzir 1,2-propanodiol com alto rendimento.

Os genes edd-eda foram inativados na cepa de E. coli MG1655 pela inserção de um cassete de resistência de antibiótico canamicina e anulando a maior parte dos genes 10 envolvidos usando a técnica descrita no Protocolo 1 com os oligonucleotídeos dados na Tabela 2. A cepa obtida foi nomeada E. coli MG1655 Aedd-eda::km.

A anulação foi transferida para a cepa de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA::cm de acordo com o Protocolo 2.

Protocolo 2: Transdução com o fago Pl para anulação de

um gene

A anulação do gene escolhido por substituição do gene por um cassete de resistência (canamicina ou cloranfenicol) na cepa de E. coli receptora foi efetuada pela técnica de 20 transdução com o fago Pl. 0 protocolo se deu em dois passos, (i) a preparação do lisato de fago na cepa MG1655 com um único gele anulado e (ii) a transdução da cepa receptora por este lisato de fago. Preparação do lisato de fago - Semeadura com 100 μΐ; de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 com um único gene eliminado de 10 mL de LB + Cm 30 μg/mL + glicose 0,2% + CaCl2 5 mM.

- Incubação por 30 min a 37 0C com agitação.

- Adição de 100 μL de lisato de fago Pl preparado na cepa de tipo selvagem MG1655 (aprox. 1 x IO9 fago/mL) .

- Agitação a 37 °C por 3 horas até todas as células serem lisadas.

- Adição de 200 μL de clorofórmio, e submissão ao vórtex.

- Centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar os fragmentos celulares.

- Transferência do sobrenadante em um tubo estéril e adição de 200 μL de clorofórmio.

- Armazenamento do lisato a 4 °C.

Transdução

- Centrifugação por 10 min a 1500 g de 5 mL de uma cultura de um dia para o outro da cepa receptora de E. coli em meio LB.

- Suspensão do pélete celular em 2,5 mL de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM.

- Tubos de controle: 100 μL de células 100 μΐ, de fagos Pl da cepa MG1655 com um único gene eliminado.

- Tubo de teste: 100 μΐ- de células + 100 μΐ. de fagos Pl da cepa MG1655 com um único gene eliminado.

- Incubação por 30 min a 30 0C sem agitação.

- Adição de 100 μΐ· de citrato de sódio I M em cada tubo, e submissão ao vórtex.

- Adição de I mL de LB.

- Incubação por 1 hora a 37 °C com agitação.

- Plaqueamento em placas LB + Cm 30 μg/mL depois da centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm.

- Incubação a 37 0C de um dia para o outro.

Os transformantes resistentes a antibióticos foram então selecionados e a inserção da anulação foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos apropriados.

A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ptrcl6- gapA::cm, Aedd-eda::km.

Os cassetes de resistência a antibióticos foram então eliminados de acordo com o Protocolo 3.

Protocolo 3: Eliminação dos cassetes de resistência

Os cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou canamicina foram eliminados de acordo com a técnica a seguir. O plasmídeo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sítios FRT dos cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou canamicina foram introduzidos nas cepas recombinantes por eletroporação. Depois do cultivo em série 5 a 42 °C, a perda dos cassetes de resistência a antibióticos foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotídeos dados na Tabela 3.

A cepa MG1655 AgloA::cm foi construída de acordo com o Protocolo 1 com os oligonucleotídeos dados na Tabela 2 e 10 essa anulação foi transferida para a cepa previamente construída de acordo com o Protocolo 2. A cepa resultante foi chamada de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA::cm.

0 gene pykA foi inativado na cepa anterior pela 15 inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina de acordo com o Protocolo 1 com os oligonucleotídeos dados na Tabela 2. A cepa resultante foi chamada de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA::cm, ApykA::km.

Os cassetes de resistência a antibiótico foram então

eliminados de acordo com o Protocolo 3.

0 gene pykF foi inativado pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol de acordo com o Protocolo 1 com o oligonucleotídeos dados na Tabela 2. A cepa resultante foi chamada de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF::cm.

0 cassete de resistência a antibiótico foi a seguir eliminado de acordo com o Protocolo 3.

Em cada passo, a presença de todas as anulações previamente construídas foi verificada usando o oligonucleotídeos dados na Tabela 3.

Para aumentar a produção do fosfoenolpiruvato, o gene

ppsA foi expresso a partir do plasmídeo pJB137 usando o promotor gapA. Para a construção do plasmídeo pJB137-PgapAppsA, o gene ppsA foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de E. coli MG1655 usando os seguintes nucleotídeos:

1. gapA-ppsAF, consistindo de 65 bases (SEQ ID NO 64)

ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGC TGGTGC com:

- uma região (letras maiúsculas) homólogas à seqüência (1785106 - 1785136) do gene ppsA (1785136 a 1782758), uma

seqüência de referência do sítio

http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), e

- uma região (letras minúsculas) homólogas ao promotor gapA (1860794 - 1860761).

2. ppsAR, consistindo de 43 bases (SEQ ID NO 65) aatcgcaacicttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC com:

- uma região (letras maiúsculas) homólogas à seqüência (1782758 - 1782780) da região do gene ppsA (1785136 a 1782758) ,

- um sitio de restrição HindIII (letras sublinhadas)

Ao mesmo tempo, a região promotora gapA do gene gapA de E. coli foi amplificada usando os oligonucleotídeos a seguir:

1. gapA-ppsAR, consistindo de 65 bases (SEQ ID NO: 66) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttag

tgaataaaagg com:

- uma região (letras maiúsculas) homólogas à seqüência (1785106 - 1785136) do gene ppsA (1785136 a 1782758), e

- uma região (letras minúsculas) homólogas ao promotor gapA (1860794 - 1860761).

2. gapAF, consistindo de 33 bases (SEQ ID NO: 67) ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc com:

- uma região (letras minúsculas) homólogas ao promotor gapA (1860639 - 1860661).

- um sítio de restrição SmaI (letras sublinhadas)

Ambos os fragmentos foram subsequentemente fundidos usando os oligonucleotídeos ppsAR e gapAF (Horton et al. 1989 Gene 77: 61-68). Os fragmentos amplificados por PCR foram cortados com as enzimas de restrição HindIII e SmaI e clonados nos sítios HindIII/Smal do vetor pJB137 (Número de acesso EMBL: U75326 originando o vetor pJB137-PgapA-ppsA.

Os diferentes plasmídeos pMElOlVBOl e pJB137-PgapA-ppsA foram introduzidos na cepa de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, 5 Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF. As cepas obtidas foram nomeadas respectivamente como E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF, pMElOlVBOl-yqhD-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (cepa 1) , E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF, pMElOIVBOl-yafB-mgsA-gldA, 10 pJB137-PgapA-ppsA (cepa 2) e E. coli MGl 655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF, pMEl01VB01-yqhE-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (cepa 3) .

Exemplo 3: Construção de cepas modificadas de E. coli MGl655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, 15 ApflAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF (pME101VB01- yqhD-mgsA-gldA) , (pJB137-PgapA-ppsA) , E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApflAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF (pME101VB01-yafBmgsA-gldA) , (pJBl37- PgapA-ppsA) e E. coli MG1655 Ptrcl6- 20 gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApflAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF (pME 10IVB 01 -yqhE-mgsAgldA) , (pJB137-PgapA- ppsA) capazes de produzir 1,2- propanodiol com um maior rendimento do que I mol/mol de glicose.

As cepas MG1655 AaldA::km, MG1655 AaldB::cm, MG1655 ApflAB::km MG1655 AadhZ::cm, MG1655 AackA-pta::cm são 5 construídas de acordo com o Protocolo 1 com os oligonucleotídeos dados na Tabela 2 e essas anulações são transferidas na cepa previamente construída de acordo com o Protocolo 2. Quando necessário, os cassetes de resistência a antibiótico são eliminados de acordo com o Protocolo 3.

0 gene IdhA e o gene poxB são inativados na cepa

previamente construída pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol de acordo com o Protocolo 1 com os oligonucleotídeos dados na Tabela 2. Quando necessário, os cassetes de resistência a antibiótico são eliminados de acordo com o Protocolo 3.

Em cada passo, a presença de todas as anulações previamente construídas é verificada usando os oligonucleotídeos dados na Tabela 3.

A cepa resultante é chamada de E. coli MG1655 Ptrcl6- gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApflAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF.

Os diferentes plasmídeos pMElOlVBOl e pJB137-PgapA-ppA são introduzidos na cepa de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApflAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF. As cepas obtidas são denominadas respectivamente de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApflAB, AadhE, 5 AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF (pMElOlVBO1-yqhD-mgsAgldA), (pJB137-PgapA-ppsA) , E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApflAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF, pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA, pJBl37-PgapA-ppsA e E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, 10 AgloA, AaldA, AaldB, AldhA, ApfIAB, AadhE, AackA-pta, ApoxB, ApykA, ApykF, pMElOlVBOl-yqhE-mgsA-gldA, pJB137- PgapA- ppsA.

Exemplo 4: Comparação das diferentes cepas para a produção de 1,2-propanodiol sob condições aeróbicas.

As cepas obtidas estão descritas no Exemplo 2 (Cepas

1, 2 e 3) e as cepas de controle (controle 1: MG1655 pME10IVB01-yqhD-mgsA-gldA, controle 2 : MG1655 pMElOlVBOlyafB-mgsA-gldA, controle 3: MG1655 pME 101VB01-yqhE-.mgs AgldA e controle 4: MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, 20 ApykA, ApykF) foram cultivadas em um ensaio em frasco de erlenmeyer sob condições aeróbicas em meio mínimo com glicose como fonte de carbono. O cultivo foi efetuado a 34 0C ou 37 0C e ο ρΗ foi mantido pelo tamponamento do meio de cultura com MOPS. No final do cultivo, 1,2-propanodiol, acetol e glicose residual no caldo de fermentação foram analisados por HPLC e os rendimentos de 1,2-propanodiol em 5 relação à glicose e 1,2-propanodiol + acetol em glicose foram calculados. A melhor cepa foi então selecionada para uma cultura em alimentação em lote fermentadora.

Cepa Título de Título de Rendimento Rendimento 1,2- acetol de 1,2- de 1,2- propanodiol (g/L) propanodiol propanodiol (g/L) (g/g de + acetol glicose) (g/g de glicose) Controle 1 0, 02 0 0, 004 0, 004 Controle 2 0 0 0 0 Controle 3 0, 01 0 0, 002 0,002 Controle 4 0,05 0, 34 0 0,04 Cepa 1 2,25 1, 40 0,14 0,23 Cepa 2 1, 64 1, 31 0,10 0,18 Cepa 3 0,77 0, 47 0,06 0, 10 Exemplo 5: Produção de 1,2-propanodiol em cultura em alimentação em lote com a melhor cepa.

A melhor cepa selecionada no experimento anterior é

cultivada em um fermentador de 2 L usando um protocolo de alimentação em lote.

A temperatura da cultura é mantida constante a 37 0C e o pH é permanentemente ajustado até valores entre 6,5 e 8 usando uma solução de NH4OH. A taxa de agitação é mantida entre 200 e 300 rpm durante a fase de batelada e é aumentada até 1000 rpm no final da fase de alimentação em lote. A concentração do oxigênio dissolvido é mantida em valores entre 30 e 40% de saturação pelo uso de um controlador de gás. Quando a densidade ótica alcançar um valor entre três e cinco, a alimentação em lote é iniciada com uma taxa de fluxo inicial entre 0,3 e 0,5 mL/h e um aumento progressivo até valores de taxa de fluxo entre 2,5 e 3,5 mL/h. Neste ponto, a taxa de fluxo é mantida constante por 24 a 48 horas. 0 meio da alimentação é à base de meio minimo contendo glicose nas concentrações entre 300 e 500 g/L.

Claims (31)

1.Microorganismo útil para a produção de 1,2- propanodiol a partir de uma finte de carbono em que o referido microorganismo é caracterizado pelo fato de apresentar: • uma atividade melhorada da via biossintética de diidroxiacetona fosfato para 1,2-propanodiol, e • uma atividade atenuada da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase

2.Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele é geneticamente modificado para aumentar a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na via biossintética de diidroxiacetona fosfato em 1,2-propanodiol.

3.Microorganismo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o aumento da atividade de pelo menos uma enzima é obtido pelo aumento da expressão do gene codificando a referida enzima.

4.Microorganismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre o grupo consistindo de: mgsA, yafB, yeaE, yghZ, yqhE, yqhD, ydhF, ycdW, yajO, ydjG, ydbC, tas, gldA e fucO é aumentada.

5.Microorganismo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a expressão dos três genes mgsA, yqhD e gldA é aumentada.

6. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizado pelo fato de que a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na via Entner-Doudoroff é atenuada.

7. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: edd, eda.

8. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado pelo fato de que a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na conversão de metilglioxal em lactato é atenuada.

9. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos genes a seguir é atenuada: gloA, aldA, aldB.

10. Microorganismo, de acordo com as Reivindicações 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9, caracterizado pelo fato de que a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na síntese de lactato, formato ou etanol é atenuada.

11. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: IdhA, pflA, pflB, adhE.

12. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na sintese de acetato é atenuada.

13. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: ackA, pta, poxB.

14. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13, caracterizado pelo fato de que a eficiência da importação de açúcar é aumentada.

15. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que um sistema de importação de açúcar independente do fosfoenolpiruvato é usado.

16. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre galP e glk é aumentada.

17. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a eficiência do sistema açúcar-fosfotransferase é melhorada pelo aumento da disponibilidade do metabólíto "fosfoenolpiruvato".

18. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a atividade de pelo menos uma enzima piruvato quinase é atenuada.

19. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre pykA e pykF é atenuada.

20. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18 e 19, caracterizado pelo fato de que a atividade da fosfoenolpiruvato sintase é aumentada.

21. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene ppsA é aumentada.

22. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a enzima que favorece o metabolismo do piruvato em acetil-CoA tem sensibilidade menor à inibição por NADH do que a enzima não-modificada.

23. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o gene Ipd tem uma mutação pontual que leva à substituição de alanina 55 com valina.

24. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre arcA e ndh é atenuado.

25. Microorganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de bactérias, leveduras e fungos.

26. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é selecionado do grupo consistindo de Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae.

27. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é ou Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum.

28. Método de preparação de 1,2-propanodiol caracterizado pelo fato de que um microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27 cresce em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono, e o1,2-propanodiol produzido é recuperado.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Escherichia coli e a fonte de carbono é uma fonte de carbono simples.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Clostridium acetobutylicum e a fonte de carbono é uma fonte de carbono complexa.

31. Método, de acordo com qualquer uma das Reivindicações28, 2 9 e 30, caracterizado pelo fato de que o 1.2- propanodiol recuperado é adicionalmente purificado.