DE10131544A1

DE10131544A1 - Butinol I Esterase

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Publication number: DE10131544A1
Application number: DE10131544A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Hauer; Thomas Friedrich; Christoph Nuebling; Rainer Stuermer; Wolfgang Ladner
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2003-01-16

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Proteine mit Esterase-Aktivität, insbesondere Butinol I Esterase-Aktivität, aus Pseudomonas glumae, dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen; Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und deren Verwendung zur enzymatischen, insbesondere enantioselektiven enzymatischen Esterhydrolyse oder Umesterung organischer Ester.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Proteine mit Esterase-Aktivität, insbesondere Butinol I Esterase-Aktivität, aus Pseudomonas glumae, dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen; Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und deren Verwendung zur enzymatischen, insbesondere enantioselektiven enzymatischen esterhydrolyse oder Umesterung organischer Ester.
Esterasen und Lipasen gehören zu den Hydrolasen, die zur Synthese optisch aktiver, organischer Verbindungen in technischen Prozessen eingesetzt werden können und sich durch hohe Substratspezifität auszeichnen. Sie können in einem den Serinproteasen ähnlichen Mechanismus Acylgruppen auf Nukleophile, wie z. B. Carbonylgruppen, übertragen oder Esterbindungen hydrolytisch spalten. Den Esterasen, Lipasen und Serinproteasen ist die katalytische Triade gemeinsam, ein Sequenzmotiv aus den Aminosäuren Ser, His und Asp, wobei das aktive Ser das Carbonylkohlenstoffatom nukleophil angreift und es unter Beteiligung der anderen beiden Aminosäuren zu einer Ladungsverteilung kommt. Esterasen und Lipasen können Acylgruppen auch auf andere Nukleophile, wie Thiogruppen eines Thioethers oder aktivierte Amine, übertragen.
Lipasen hydrolysieren langkettige Glycerinester und zeichnen sich durch Grenzflächenaktivierung aus, d. h. dass das aktive Zentrum nur in Gegenwart des Lipidsubstrats zugänglich wird. Lipasen sind in nicht-wässrigen organischen Lösungsmitteln stabil und werden in zahlreichen technischen Prozessen zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt, d. h. ein Enantiomer wird wesentlich schneller als das andere umgesetzt. Dieses läßt sich nachfolgend aufgrund unterschiedlicher physikalischer und chemischer Eigenschaften aus der Reaktionslösung gewinnen.
Nakamura (Nakamura, K. et al., Tetrahedron; Asymmetry 9, (1999), 4429-4439) beschreibt die Racematspaltung von 1-Alkyn-3-ol durch Umesterung mit Hilfe käuflich erhältlicher Lipasen (Amano AK, AH und PS; Amano Pharmaceuticals Co. Ltd.) in hydrophoben Lösungsmitteln, wobei die Enantioselektivität mit der Kettenlänge des Acyldonors steigt und sterisch große Reste (Chloracetat, Vinylbenzoat) die Reaktion negativ beeinflussen. Yang (Yang, H. et al., J. Org. Chem. 64, (1999), 1709-1712) beschreibt die enantioselektive Herstellung optisch aktiver Säuren durch Umesterung mit Vinylestern unter Verwendung der Lipase B aus Candida antarctica als Katalysator. Ethylester führen hier zu einer deutlich geringeren Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität. Eine aus Burkholderia plantarii (Pseudomonas plantarii oder glumae) DSM 6535 isolierte Lipase wird zur enantioselektiven Acylierung racemischer Amine mit Hilfe von Ethylmethoxyacetat eingesetzt (Balkenhohl, F. et al., J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384).
Esterasen katalysieren enantioselektiv die Bildung und Auflösung von Esterbindungen (Hin- und Rückreaktion). Bei der Umesterung zur Gewinnung optisch aktiver Alkohole werden vorzugsweise Vinylester eingesetzt, da die Alkoholfunktion des Esters nach der Umsetzung durch Tautomerisierung zu Aldehyd oder Keton nicht mehr zur Verfügung steht und damit die Rückreaktion vermieden werden kann. Esterasen sind im Gegensatz zu Lipasen nicht grenzflächenaktiviert und setzen auch organische Verbindungen kürzerer Kettenlänge um. Aus verschiedenen Organismen wurden Esterasen unterschiedlicher Substratspezifität isoliert.
So findet die Esterase aus Pseudocardia thermophila FERM-BP-6275 Verwendung bei der Hydrolyse optisch aktiver Chromanessigsäureester (EP-A-0 892 044).
Eine Esterase aus Bacillus acidocaldarius hydrolysiert Ester eines engen Substratspektrums und mit niedriger Enantioselektivität (Manco, G. et al., Biochem. J. 332, (1998), 203-212).
Acylase 1 aus Aspergillus wird zur Gewinnung sekundärer Alkohole durch Umesterung mit Vinylestern in organischen unpolaren Lösungsmitteln verwendet, wobei bevorzugt sekundäre Alkohole mit kurzen Seitenketten umgesetzt werden (Faraldos, J. et al., Synlett 4, (1997), 367-370). Aus Pseudomonas fluorescens DSM 50 106 wurde eine Membran-gebundene Lacton-spezifische Esterase kloniert (Khalameyzer, V. et al., Appl. and Environ. Microbiol. 65(2), (1999), 477-482), und aus der Q-Mutante von E. coli eine Acetylesterase (Peist, R. et al., J. Bacteriol. 179, (1997), 7679-7686). Jedoch wurden Enantioselektivität und Substratspezifität dieser beiden Esterasen nicht näher untersucht wurden. Rhodococcus sp. NCBM 11216 exprimiert 4 Esterasen, RR1 bis RR4, die unterschiedliche Spezifität aufweisen. Bei der Estersynthese aus Naphthol und einer Säure bevorzugen RR1 und RR2 Säuren mit kurzen Kohlenstoffketten, während RR3 und RR4 spezifisch Säuren mit längeren Kohlenstoffketten und sterisch größeren Resten umsetzen (Gudelj, M. et al., J. Mol. Cat. B, Enzymatic 5, (1998), 261-266).
Zur Herstellung kleiner organischer Moleküle, wie optisch aktiver Alkohole, Säuren oder Ester mit kurzen Kohlenstoffketten, stehen jedoch keine Esterasen zur Verfügung, die ein breites Substratspektrum besitzen, eine hohe Enantioselektivität aufweisen und in technischen Prozessen eingesetzt werden können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Esterasen, welche wenigstens eine der oben genannten Eigenschaften aufweisen.
Diese Aufgabe konnte überraschenderweise durch die Bereitstellung eines Proteins mit Butinol I Esterase-Aktivität, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst oder von einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 kodiert wird, sowie von funktionalen Äquivalenten dieses Proteins gelöst werden. Diese werden im Folgenden der Einfachheit halber als Butinol I Esterasen bezeichnet.
Funktionale Äquivalente weisen eine von SEQ ID NO: 2 in mindestens einer Position abweichende Sequenz auf, wobei die Veränderung in der Sequenz die Esteraseaktivität vorzugsweise nur unwesentlich, d. h. nicht um mehr als etwa ± 90, insbesondere ± 50% oder nicht mehr als ± 30% verändert. Diese Veränderung kann unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. Butinol-butyrat unter standardisierten Bedingungen (wie z. B. 20 mM Substrat, 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 T = 20°C) bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche funktionalen Äquivalente, welche wenigstens eine Teilsequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen und obige Aktivität gegenüber dem Referenzsubstrat besitzen.
Nichtlimitierende Beispiele für derartige Teilsequenzen sind im folgenden genannt:

a) FIETLGLERPVLVGHSLGGAIALAVGLDYPER,
b) IALIAPLTHTETEP,
c) GGGMMGLRPEAFYAASSDLV
d) AIDAIFAPEPV

Funktionale Äquivalente der erfindungsgemäßen Esterasen umfassen z. B. wenigstens eine der obigen Teilsequenzen oder eine davon abgeleitete Teilsequenz oder eine von SEQ ID NO: 2 abgeleitetete Sequenz, wobei in Vergleich zur konkret angegebenen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, invertiert oder addiert sind, und wobei sich die Esteraseaktivität nicht um mehr als ± 90% oder ± 50%, vorzugsweise nicht um mehr als ± 30% von der Esteraseaktivität des nativen Proteins (SEQ ID NO: 2) unterscheidet.
Die erfindungsgemäße Butinol I Esterase weist ein Molekulargewicht von etwa 40 bis 42 kDa, insbesondere etwa 41,3 kDa, Bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese auf. Sie ist insbesondere aus Pseudomonas glumae Lu 2023 der Hinterlegungsnummer DSM 3176 erhältlich. Weitere Stammvarianten sind z. B. ausgehend von Pseudomonas glumae Lu 8093 durch Selektion, wie beispielsweise durch Kultur auf Minimalmedium-Platten, mit Ethylphenylacetat als einziger Kohlenstoffquelle, zugänglich.
Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die für die Butinol I Esterase kodieren und eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine davon abgeleitete Sequenz umfassen. Erfindungsgemäß umfasst sind auch deren funktionale Äquivalente sowie damit hybridisierbare oder dazu komplementäre Sequenzen. Funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Polynukleotide weisen eine durch Nukleotidsubstitution, -deletion, -inversion oder -addition veränderte Sequenz auf, kodieren jedoch ebenfalls für eine Protein mit gleicher oder vergleichbarer Esteraseaktivität (insbesondere in oben angegebenen Schwankungsbereich der enzymatischen Aktivität).
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, das mit regulatorischen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft ist. Vorzugsweise liegt 5'-stromaufwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Promotorsequenz und ermöglicht auf diese Weise eine kontrollierte Expression der Butinol I Esterase. Besonders bevorzugt liegt 3'-stromabwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulatorische Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der die Butinol I Esterase kodierenden Sequenz. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulatorische Elemente derart, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion vor, während oder nach Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für weitere operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere brauchbare regulatorische Elemente umfassen selektierbare Marker, Reportergene, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen.
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Die Expressionskassette kann aber auch einfacher aufgebaut sein, d. h. es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder 1-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der P_rP_l-Promotor.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht wird.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einem geeigneten die Butinol I Esterase kodierenden Polynukleotid, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinante Vektoren zur Transformation von eukaryontischen und prokaryontischen Wirten, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette tragen. Diese Vektoren erlauben in einem geeigneten Wirtsorganismus eine Expression der Butinol I Esterase. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion rekombinanter Esterase eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionskassetten als Teil eines Expressionsvektors in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.
Als Wirtsorganismen zur Transformation mit erfindungsgemäßen Vektoren sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Polynukleotide, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Organismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.
Gegenstand der Erfindung sind somit auch Mikroorganismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor tragen sowie die Pseudomonas glumae- Mutante, Lu 2023, mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176, die die Butinol I Esterase endogen exprimiert.
Die erfindungsgemäßen Butinol I Esterasen sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine der folgenden Reaktionen katalysieren:

a) enantioselektive Hydrolyse optisch aktiver Ester der Formel I

R¹-COO-R² (I),

worin R¹ für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl und R² für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl, C₇-C₁₅-Aralkyl oder für einen ein- oder mehrkernigen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten aromatischen Rest steht,
R¹ und/oder R² wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstoffatom umfasst,
wobei besonders bevorzugt entweder das mit dem Kohlenstoffatom oder das mit dem Sauerstoffatom der Esterbindung verbundene Kohlenstoffatom aus R¹ bzw. R² ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ist; und
b) enantioselektive Umesterung eines Esters der Formel I mit einem optisch aktiven Alkohol der Formel II

R²-OH (II),

worin R² eine der obenstehenden Bedeutungen besitzt, und gegebenenfalls wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstoffatom aufweist,
wobei besonders bevorzugt, das Kohlenstoffatom, welches die OH-Gruppe trägt, ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ist.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur enantioselektiven Esterhydrolyse unter Verwendung der Butinol I Esterase, wobei die Butinol I Esterase mit einem Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I in Kontakt gebracht wird und die bei der stereoselektiven Hydrolyse eines der beiden Stereoisomere anfallenden optisch aktiven Verbindungen und/oder das nicht hydrolysierte Esterenantiomer aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird. Die Butinol I Esterase kann aber auch solche Ester der Formel I hydrolysieren, die nicht optisch aktiv sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur enantioselektiven Umesterung, wobei ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Alkohols der Formel II mit einem Ester der Formel I in Gegenwart der Butinol I Esterase in Kontakt gebracht wird und das nicht umgesetzte Alkoholstereoisomer aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird, oder ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I mit einem Alkohol der Formel II in Gegenwart der Butinol I Esterase in Kontakt gebracht wird und ein Stereoisomer des im Ester enthaltenen optisch aktiven Alkohols aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird. Vorzugsweise werden zur Umesterung Vinylester als Acylierungsmittel für einen optisch aktiven Alkohol verwendet. Dies ist deshalb vorteilhaft, weil die Alkoholfunktion des Vinylesters nach der Umsetzung durch Tautomerisierung nicht mehr für die Rückreaktion zur Verfügung steht. Die Butinol I Esterase katalysiert auch Umesterungsprozesse, bei denen weder der Ester noch der Alkohol optisch aktiv sind.
Bevorzugte Substrate zur Esterhydrolyse sind Ester des Ethanols, Propanols, Butanols und besonders bevorzugt Butinylester (Butinolester, Ester des 1-Methyl-prop-2-ynols) mit Carbonsäuren wie beispielsweise Essigsäure, Propansäure, Buttersäure, Pentansäure, Hexansäure, Heptansäure, Octansäure, Milchsäure, 2-Ethylhexansäure, 3-Methylbuttersäure, Methoxyessigsäure, 2-Methylpropionsäure, 2-Butensäure, 3-Chlorpropionsäure und 2-Methylpentansäure. Besonders bevorzugt sind Buttersäure- (Butinylbutyrat) und Methylbuttersäurebutinylester.
Bevorzugte Alkohole bei der Umesterung sind Ethanol, Propanol und Butanol, besonders bevorzugt ist Butinol.
Bevorzugte Ester bei der Umesterung sind Vinylester, wie beispielsweise Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäurevinylester.
Als Reaktionsmedium werden in oben stehenden Verfahren organische Lösungsmittel verwendet, wie beispielsweise Alkane, Ether, Toluol, Dioxan, Methylisobutylketon, Methyl-tertiär-butylether (MTBE) und dergleichen. Bei der Esterhydrolyse können auch Gemische aus der verwendeten Pufferlösung und organischen Lösungsmitteln wie beispielsweise MTBE und Heptan oder Toluol verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch obenstehende Verfahren unter Verwendung der Butinol I Esterase hergestellten optisch aktiven Alkohole, Carbonsäuren oder Ester.
Die Racematspaltung, d. h. die Enantioselektivität, und Reaktionsgeschwindigkeit sind über Größe und Hydrophobizität des Säureteils beeinflußbar. Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur bei einem pH-Wert von 6 bis 9, besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,4 durchgeführt. Dabei kann die Esterase in Form von isoliertem oder aufgereinigtem Enzym, Zellen des die Esterase exprimierenden Mikroorganismus, dessen Kulturüberstand, Zelllysat oder Extrakt, oder als immobilisierte Esterase eingesetzt werden. Die Reaktionsprodukte können aus der Reaktionslösung durch dem Fachmann bekannte chemische oder physikalische Trennverfahren isoliert werden. Die Butinol I Esterase kann aus dem Reaktionsgemisch durch Membranfiltration isoliert werden.
Die Immobilisierung der Esterase kann mit Hilfe von Polyacrylamid, Alginsäure oder Carragenen erfolgen. Die Esterase läßt sich auch mittels bekannter Methoden kovalent oder durch Absorption an passende Carrier binden. Vorzugsweise wird die Butinol I Esterase durch Lyophilisation auf Kieselgur oder durch Ammoniumsulfatfällung immobilisiert.
Wie oben erwähnt ist die Butinol I Esterase aus Pseudomonas glumae Lu 2023 erhältlich. Sie läßt sich allerdings auch mittels bekannter Peptidsyntheseverfahren herstellen.
Weiterhin ist die Butinol I Esterase auch aus eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen erhältlich, wenn diese die Butinol I Esterase exprimieren, wie beispielsweise Mikroorganismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor tragen.
Gegenstand der Erfindung sind somit auch Verfahren zur Herstellung der Butinol I Esterase, wobei man Mikroorganismen, welche die Butinol I Esterase produzieren, oder einen mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierten Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Butinol I Esterase induziert und die Butinol I Esterase aus der Kultur isoliert. Die Mikroorganismen können nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Nach Kultivierung werden die Zellen aufgeschlossen und die Butinol I Esterase durch Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren, vorzugsweise Glaskugelmühlen, oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden. Nach einer Zentrifugation bleiben Proteine und andere lösliche Moleküle im Überstand. Durch Ausfällen der DNA mit Manganchlorid kann eine Lösung mit deutlich niedrigerer Viskosität erhalten werden. Proteine können durch "Aussalzen" beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder Kaliumphosphat selektiv präzipitiert werden. Die Präzipitation kann auch durch pH- oder Temperaturveränderung oder durch organische Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol oder Aceton erfolgen. Nach der Präzipitation durch Salze können diese wieder durch Dialyse entfernt werden.
Eine weitere Aufreinigung der Butinol I Esterase kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), Q-Sepharose-Chromatographie, ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation und nativer Gelelektrophorese.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht limitierenden Beispiele unter Bezugnahme auf beiliegende Figuren näher erläutert. Dabei zeigt:
Fig. 1 ein Sequenz-Alignment einer erfindungsgemäßen Aminosäure- Teilsequenz der Butinol I Esterase mit einer Teilsequenz einer Lacton-spezifischen Esterase aus Pseudomonas fluorescens ist in Fig. 1 gezeichnet. Query: Teil-Sequenz des erfindungsgemäßen Klones LU 2898. Sbjct: Teil-Sequenz des P. fluorescens Enzyms, (Accession No.: 087637)

Beispiel 1

Selektion einer Butinol I Esterase exprimierenden Mutante von Pseudomonas glumae

Ausgangsstamm des Screenings war der Lipase-Produzent Pseudomonas (Burkholderia) glumae Lu 8093. Mit der von diesem Stamm produzierten Lipase lassen sich eine ganze Reihe interessanter Reaktionen durchführen (Balkenhohl, F. et al., J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384). Milchsäureester, Methylbuttersäureester und Phenylessigsäureester sind jedoch kein Substrat für die Lipase und können auch sonst nicht von diesem Stamm hydrolysiert werden.
Die Hydrolyseprodukte sind jedoch als Kohlenstoffquelle verwertbar. Es wurde deshalb nach Mutanten von Lu 8093 gesucht, die diese Ester hydrolysieren können und mit den Hydrolyseprodukten als Kohlenstoffquelle wachsen können. Mutanten mit neuer Esteraseaktivität sollten sich daher durch Wachstum auf diesen Estern zu erkennen geben.
Selektionsbedingungen: Lu 8093 wurde auf Medium für 16 h kultiviert und durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden 2 mal mit Saline gewaschen. 10⁶ Zellen wurden auf Minimalmedium Platten, die 0,5 bzw. 1,0 g/l Ethylphenylacetat als einzige Kohlenstoffquelle enthielten, ausplattiert. Zunächst zeigte sich jedoch kein Wachstum. Erst nach 4 bis 6 Tagen waren einzelne Kolonien zu erkennen. Deren Zahl nahm in den nächsten Tagen weiter zu.
Von den so erhaltenen Esterase-positiven Mutanten wurde die Mutante Lu 2023 ausgewählt. Überraschenderweise war die neue Esterase-Aktivität auch zur selektiven Hydrolyse kleiner organischer Moleküle geeignet. Am Beispiel von Butinolester wurde die selektive Hydrolyse gezeigt.

Beispiel 2

Fermentation von Pseudomonas glumae Lu 2023

Zur Gewinnung der Butinol I Esterase wurde Pseudomonas glumae Lu 2023 im 14 l-Maßstab kultiviert und die aktive Biomasse geerntet.
Im Labor wurde Pseudomonas glumae Lu 2023 auf Agarplatten mit Mineralsalzmedium M12 mit 1 g/l EPA ausgestrichen und bei 28°C für 36 bis 48 Stunden inkubiert. Die Platten konnten dann bei 4°C vier Wochen gelagert werden.
Die Fermentation des Stammes wurde in einem 14 l-Fermenter Infors xxy durchgeführt. Für die Vorkultur wurden 250 ml Medium mit 2 bis 3 Pt-Ösen beimpft und 24 h bei 200 Upm und 28°C inkubiert. Die Hauptkultur wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Temperatur: 28°C
Zuluft: 7 l/min
Rührung: 600 Upm
Fermentationslaufzeit etwa 24 h
Eingebaute pH- und pO₂-Messung Medium für Vorkultur und Hauptkultur 15 g/l Springer Hefeautolysat 65%
1,6 g/l Magnesiumsulfat × 7 Wasser
0,02 g/l Calciumchlorid × 2 Wasser
3,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat
3,5 g/l Dikaliumhydrogenphosphat
5 g/l di-Ammoniumhydrogenphosphat
6 ml Pluriol P2000 Antischaummittel
Die obenstehenden Inhaltsstoffe wurden in VE-Wasser gelöst und mit 25% Ammoniaklösung den pH auf 6,5 eingestellt. 5 ml/l Trace Elements (Spurensalzlsg.) und 2 g/l Glucose wurden separat sterilfiltriert.
Nach dem Sterilisieren und Komplettieren des Mediums wurden 0,5 g/l Ethylphenylacetat in den Fermenter gegeben. Während der Fermentation auftretender Schaum wurde durch die Zugabe von Pluriol P2000 eingedämmt. Die Fermentation wurde abgebrochen, wenn der pO₂-Wert im Fermenter wieder über 85% anstieg. Der Fermenterinhalt wurde dann bei einer Temperatur von unter 15°C und etwa 9000 bis 10000 g zentrifugiert und der Klarlauf verworfen. Die Zellmasse wurde bei -16°C eingefroren.

Beispiel 3

Reinigung der Butinol I Esterase aus Pseudomonas glumae Lu 2023

Zellen (100 ml, 50 g Feuchtmasse) von Pseudomonas glumae (Lu 2023) wurden in einer Glaskugelmühle (100 ml Glaskugeln, Durchmesser 0,5 mm) bei 400 und 3000 Upm aufgeschlossen. Nach Zentrifugation (30 min, 10000 rpm) und Waschen der Glaskugeln wurde mit dem Überstand (300 ml) eine Manganchloridfällung (pH 7 bis 7,5; 50 mM Endkonzentration) durchgeführt. Nach erneuter Zentrifugation wurde der pH des Überstandes auf 8,0 eingestellt und EDTA zu einer Konzentration von 50 mM zugegeben. Dieses Volumen wurde durch Chromatographie an Q-Sepharose (300 ml) gereinigt. Nach der Aufgabe der Probe wurde die Säule mit 50 mM Tris/HCl gespült. Die Wertfraktion wurde gesammelt und durch Ultrafiltration (100 kDa) konzentriert. Durch Molekularsiebchromatographie (5 cm Durchmesser, 90 cm Höhe; S-300 Material) wurde die Butinol I Esterase von einer unspezifischen Esterase getrennt. Die erhaltene aktive Fraktion war trübe und wurde erneut konzentriert. Die Esterase war offensichtlich membrangebunden. Die Membranfraktion wurde nun zunächst mit einer Protease verdaut (Trypsin, Gewichtsverhältnis 1 : 50 bis 1 : 100). Dabei verschwanden alle Proteine aus der Membranfraktion bis auf wenige Banden in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. Die Aktivität blieb erhalten. Diese Banden wurden durch eine native Gelelektrophorese (0,04% SDS) voneinander getrennt und ein Aktivitätstest in diesem nativen Gel identifizierte die Esterase. Diese wurde aus dem Gel eluiert und zeigte sich nun als saubere Bande in einer denaturierenden SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
Das so gereinigte Protein wurde auf eine PVDF-Membran durch Blotten überführt und sequenziert oder die Peptide wurden nach Trypsinspaltung durch Reversed-Phase HPLC getrennt und sequenziert. Da der Aminoterminus des Proteins blockiert war, wurden nur tryptische Peptide erhalten. Die verschiedenen Aminosäuresequenzen wiesen schwache Homologien zu einer Muconatcycloisomerase, EC 5.5.1.1, aus Acinetobacter Iwoffii und Pseudomonas putida, sowie zur Lactonesterase aus Pseudomonas fluoreszens auf. Das Peptid mit der Sequenz AIDAIFAPEGV wies Homologie zu Pectinesterasen (EC 3.1.1.11) auf.
Ein Sequenz-Alignment einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz mit einer Teilsequenz einer Lacton-spezifischen Esterase aus Pseudomonas fluorescens ist in Fig. 1 gezeichnet.

Beispiel 4

Immobilisierung der Butinol I Esterase

Zur Immobilisierung wurden verschiedene Methoden eingesetzt.

1. Die Butinol I Esterase wurde durch Fällung mit Aceton in Gegenwart von Kieselgur weitgehend inaktiviert. 25 mg Protein wurde mit 3,5 g Kieselgur (Merck) versetzt und 1,4 l Aceton (-20°C) wurde für 10 min zugegeben. Der beladene Träger wurde dann über eine G3 Glasnutsche abgetrennt, der Filterkuchen mit kaltem Aceton gewaschen und getrocknet.
2. Die Butinol I Esterase bindet nicht an Accurel (Akzo).
3. Die Butinol I Esterase konnte durch (2,3 Units/g, EPA-Test) Lyophilisation auf Kieselgur immobilisiert werden. Dazu wurde die Enzymlösung mit Kieselgur vermischt und bei -80°C gefroren. Anschließend wurde der Feststoff durch Lyophilisation getrocknet.
4. Die Butinol I Esterase wurde (454 mUnits/g, EPA-Test) durch Ammoniumsulfatfällung immobilisiert. Dazu wurde das Enzym mit einer Sättigung von 80% an Ammoniumsulfat in Gegenwart von Kieselgur gefällt.

Beispiel 5

Racematspaltung mit der Butinol I Esterase aus Pseudomonas glumae Lu 2023

Durchführung (Standardansatz)

100 Units Butinol I Esterase wurden mit 20 mMol Butinol-butyrat (Buttersäure-1-methyl-prop-2-ynyl-ester) in Phosphatpuffer (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) unter Rühren umgesetzt. Der pH-Wert wurde kontinuierlich gemessen und durch Zugabe von Natronlauge auf ca. pH 7,4 gehalten. Zu den in der Tabelle 1 angegebenen Zeiten wurden Proben entnommen, mit Methyl-tertiär-butylether (MTBE) zweimal ausgeschüttelt und die organische Phase durch GC (Chiraldex GTA) analysiert. Die Butinol I Esterase konnte durch Membranfiltration aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden.
Mit steigender Anreicherung des weniger bevorzugten Esterenantiomers, wurde dieses in steigendem Maße umgesetzt. Dies führte nach etwa 45 Minuten zu einem Absinken des ee-Wertes von S-Butinol im Reaktionsgemisch. Der ee-Wert des Produkts erreichte sein Maximum nach ca. 30 bis 40 min mit 84% (83-97,9%). Der ee-Wert des Eduktes stieg im Verlauf von 90 Minuten auf über 99%. Der ee-Wert (Enantiomerenüberschuß) ist definiert als die Menge des bevorzugt umgesetzten Enantiomers in Prozent abzüglich der Menge des weniger bevorzugt umgesetzten Enantiomers in Prozent. Dieser Wert entspricht in den meisten Fällen der optischen Reinheit. Der pH- Abfall bis zum Zeitpunkt 30 Minuten verlief linear. Ab ca. 100 Minuten war die pH-Wert Änderung vernachlässigbar.
Die Restaktivität der Esterase in der wässrigen Phase betrug nach dem Ausschütteln noch ca 50%. Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt den Enantiomerenüberschuß bei der Umsetzung von Butinol-butyrat mit der Butinol I Esterase in Abhängigkeit von der Zeit. R- und S-Konfiguration definieren, nach der R/S-Nomenklatur von Cahn, Prelog und Ingold, die beiden Enantiomeren eines chiralen Moleküls. Der Umsatz ist der Anteil des umgesetzten Esters im Reaktionsgemisch.

Beispiel 6

Abhängigkeit der Spezifität der Butinol I Esterase von der Größe und Hydrophobizität/Ladung des Säureteils des Esters

Standardansatz

100 Units Butinol I Esterase wurden mit 20 mMol Butinolester in Phosphatpuffer (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) unter Rühren umgesetzt. Der pH-Wert wurde kontinuierlich gemessen und durch kontinuierliche Titration auf pH 7,0 gehalten. Entnommene Proben wurden mit Methyl-tertiär-butylether (MTBE) zweimal ausgeschüttelt und die organische Phase durch GC (Chiraldex GTA) analysiert.

Ergebnis

Die Qualität der Racematspaltung und die Reaktionsgeschwindigkeit waren von Größe und Hydrophobizität des Säureteils abhängig. Die besten Substrate für die Butinolesterase waren die Buttersäure- und Methylbuttersäure-butinolester. Lipasen sind gegenüber diesen Substraten inaktiv. Dies gilt auch für langkettige Ester wie n- Decansäurebutinylester. Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt den Enantiomerenüberschuß bei der Umsetzung von Estern mit der Butinol I Esterase in Abhängigkeit vom Säureteil des umgesetzten Esters

Beispiel 7

Umesterung in organischem Medium unter Verwendung der Butinol I Esterase

10 mmol rac.-Butinol und 5 mmol Buttersäurevinylester wurden in 50 ml Methyl-tertiär-butylether (MTBE) gelöst und mit 9 Units Butinol I Esterase (3,3 g) geträgert auf Kieselgur versetzt und für 24 h bei RT geschüttelt. Nach Filtration wurde das Lösungsmittel entfernt und das Produktgemisch per GC charakterisiert.
Zurück blieb bei 47% Umsatz (R)-Butinol (18% ee) und das Butyrat des (S)-Butinols (45% ee).
In Methylisobutylketon wurde bei 43% Umsatz (R)-Butinol mit 16% ee und das Butyrat des (S)-Butinols mit 52% ee erhalten.
Tabelle 3 zeigt den Enantiomerenüberschuß bei der Umsetzung von Estern mit der Butinol I Esterase in Abhängigkeit vom Säureteil des umgesetzten Esters.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, sowie funktionale Äquivalente dieses Proteins.

2. Protein nach Anspruch 1, wobei das funktionale Äquivalent wenigstens eine Teilsequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst.

3. Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 41300 Da.

4. Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Pseudomonas glumae Lu 2023 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176 erhältlich ist.

5. Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden Reaktionen katalysiert:

a) enantioselektive Hydrolyse optisch aktiver Ester der Formel I

R¹-COO-R² (I),

worin R¹ für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀- Alkinyl und R² für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiertes C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl, C₇-C₁₅-Aralkyl oder für einen ein- oder mehrkernigen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten aromatischen Rest steht,
R¹ und/oder R² wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstoffatom umfasst; und

b) enantioselektive Umesterung eines Esters der Formel I mit einem optisch aktiven Alkohol der Formel II

R²-OH (II),

worin R² eine der obenstehenden Bedeutungen besitzt, und gegebenenfalls wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstoffatom aufweist.

6. Polynukleotid, das für ein Protein gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert, sowie dessen funktionale Äquivalente, dazu komplementäre Polynukleotide, und die damit hybridisierbaren Nukleinsäuresequenzen.

7. Polynukleotid nach Anspruch 6, umfassend eine Nukleotidsequenz von wenigstens 30 aufeinanderfolgenden Nukleotidresten in einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.

8. Expressionskassette, wenigstens ein Polynukleotid gemäß Anspruch 6 oder 7 umfassend operativ verknüpft mit wenigstens einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz.

9. Rekombinanter Vektor zur Transformation eines eukaryontischen oder prokaryontischen Wirts, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 6 oder 7, oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 8.

10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei man einen Mikroorganismus, welcher das Protein endogen produziert, oder einen mit einem Vektor gemäß Anspruch 9 transformierten Mikroorganismus kultiviert und das Protein aus der Kultur isoliert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Mikroorganismus Pseudomonas glumae Lu 2023 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176 ist.

12. Protein, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11.

13. Pseudomonas glumae Lu 2023 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176 und Varianten und Mutanten davon.

14. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Vektor gemäß Anspruch 9 trägt.

15. Verfahren zur enantioselektiven Esterhydrolyse unter Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei

a) das Protein mit einem Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I in Kontakt gebracht wird; und

b) die bei der stereoselektiven Hydrolyse eines der Stereoisomeren anfallenden optisch aktiven Verbindungen und/oder das nicht hydrolysierte Esterenantiomer aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.

16. Verfahren zur enantioselektiven Umesterung, wobei

a) ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Alkohols der Formel II mit einem Ester der Formel I in Gegenwart eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kontakt gebracht wird und das nicht umgesetzte Alkoholstereoisomer aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird; oder

b) ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I mit einem Alkohol der Formel II in Gegenwart eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kontakt gebracht wird und ein Stereoisomer des im Ester enthaltenen optisch aktiven Alkohols aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei man zur Umesterung einen Vinylester als Acylierungsmittel für einen optisch aktiven Alkohol verwendet.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15, 16 oder 17, wobei als Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel verwendet wird.

19. Optisch aktive Alkohole, Carbonsäuren oder Ester, hergestellt unter Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5.