CN107630052A - L‑草铵膦的生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑草铵膦的生物转化方法，包括：以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶、添加剂和铵盐进行生物转化反应，得到含有L‑草铵膦的转化液。生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞；所述辅酶为NADP+，铵盐为甲酸铵。其工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。利用HPLC‑MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
Description
技术领域
本发明涉及农药的制备方法，具体地指一种L-草铵膦的生物转化方法。
背景技术
草铵膦，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，由赫斯特公司(现德国拜耳公司)于上个世纪80年代开发生产，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，非选择性触杀型除草剂，其作为除草剂获得登记使用是1984年。2004年我国才有草铵膦原药登记，2005年我国才有产品登记。
草甘膦自广泛应用以来，抗草甘膦杂草不断增加，危害逐步加重。百草枯是一种强烈的杀灭杂草除莠剂，对人畜有很强的毒性作用。2014年7月1日，我国撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。草铵膦是世界大吨位农药品种，也是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦毒性低，较为安全，在土壤中易于降解，对作物安全，不易飘移，除草谱广，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速，能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草，可用水做基剂，使用安全方便，这些是该品优于其他除草剂的特点，所以这个产品在出现了众多高效超高效的产品后，依然可以畅销。
目前国内外草铵膦的合成技术路线较多，严海昌等(《农药》，2002，41(9)，46-48)做过综述报道，但各路线普遍存在反应步骤多，生产成本高的问题。拜尔公司在专利US4521348及US6359162中提出了以合成二氯甲基膦再合成甲基亚磷酸酯，经过一系列反应合成草铵膦的方法。该路线收率高、成本低，但起始路线二氯甲基膦合成原料、产物物化性质活泼，易燃易爆。合成过程处于500～600℃，如控制不稳定，容易产生极易自然的黄磷和磷化氢，危险性很大。另外，物料具有强腐蚀性，对反应设备材质选择及其加工制造工艺要求苛刻，目前国内加工制造水平难以满足生产要求。
这些方法都是制备草铵膦的方法，草铵膦为L/D混合型，其中起主要作用的是L型，D型作用仅为L型的1/8；L-草铵膦可在土壤中经微生物降解，而D-型草铵膦较难降解，最终可导致土壤板结。因此，L-草铵膦比较传统草铵膦更加高效、更低成本、更加安全。
因此，研发一种能提高原料利用率、降低生产成本同时避免工业化过程中的危险性的L-草铵膦的生物转化方法显得十分必要。
发明内容
本发明所要解决的问题就是要提供一种L-草铵膦的生物转化方法，该方法在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，能有效提高底物浓度，减少辅酶投入，简化生产工艺和降低生产成本。
为解决上述技术问题，本发明所提供的L-草铵膦的生物转化方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶、添加剂和铵盐进行生物转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。
优选地，生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞；所述辅酶为NADP+，所述铵盐为甲酸铵。
进一步地，来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candidaboidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源草铵膦脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
进一步地，溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
进一步地，添加剂为苹果提取粉和螺旋藻粉按重量比为2-5:1组成的混合物。
更进一步地，苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。
更进一步地，转化体系的pH值控制为6.5-10，优选为6.5-7；转化体系的温度控制为20-60℃，优选为20-40℃；转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150-250r/min，优选为180-220r/min。
再更进一步地，生物催化剂的浓度控制为10-30g/L，优选为20-25g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％，优选为2.5-5％。
生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞，具体制备方法是：选择来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的草铵膦脱氢酶编码基因经NcoI和BamHI双酶切后克隆入表达载体pETDuet-1的多克隆位点1，得到重组质粒1，选择来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的甲酸脱氢酶经NdeI和XhoI双酶切后克隆入重组质粒1的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)，置于氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含氨苄青霉素的TB培养基中，接种量为含氨苄青霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞。
本发明在生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；
其二，本发明L-草铵膦的转化率达85％以上，纯化后L-草铵膦晶体纯度达到98％以上，光学纯度为99％以上；
其三，本发明生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞，催化效果好，用量少，专一高效；
其四，本发明苹果提取粉和螺旋藻粉复配作为添加剂，苹果含丰富糖类，蛋白质，脂肪，维生素C，果胶，单宁酸，有机酸以及钙，磷，铁，钾等矿物质，螺旋藻粉具有抗氧化功能，苹果提取粉和螺旋藻粉复配可以缩短转化时间明显，提升L-草铵膦的收率也显著提升。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
L-草铵膦的生物转化方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶、添加剂和铵盐进行生物转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。
优选地，生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞；所述辅酶为NADP+，所述铵盐为甲酸铵。
进一步地，来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candidaboidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源草铵膦脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
进一步地，溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
进一步地，添加剂为苹果提取粉和螺旋藻粉按重量比为2-5:1组成的混合物。
更进一步地，苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。
更进一步地，转化体系的pH值控制为6.5-10，优选为6.5-7；转化体系的温度控制为20-60℃，优选为20-40℃；转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150-250r/min，优选为180-220r/min。
再更进一步地，生物催化剂的浓度控制为10-30g/L，优选为20-25g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％，优选为2.5-5％。
生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞，具体制备方法是：选择来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的草铵膦脱氢酶编码基因经NcoI和BamHI双酶切后克隆入表达载体pETDuet-1的多克隆位点1，得到重组质粒1，选择来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的甲酸脱氢酶经NdeI和XhoI双酶切后克隆入重组质粒1的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)，置于氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含氨苄青霉素的TB培养基中，接种量为含氨苄青霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞。
实施例1
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以22g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.165g添加剂进行转化反应，加入得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.1238g的苹果提取粉和0.0412g的螺旋藻粉组成的混合物。苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为16.8h，所制备的L-草铵膦的收率为95.8％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到99.4％，光学纯度为99.7％。
实施例2
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以碳酸盐缓冲溶液为溶剂，以25g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.375g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.3g的苹果提取粉和0.075g的螺旋藻粉组成的混合物。苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥8h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min。
转化时间为19.5h，所制备的L-草铵膦的收率为93.5％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到98.7％，光学纯度为99.4％。
实施例3
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以磷酸盐缓冲溶液为溶剂，以20g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.18g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.15g的苹果提取粉和0.03g的螺旋藻粉组成的混合物。苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。控制转化体系的pH值为7，控制转化体系的温度为20℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为150r/min。
转化时间为18.3h，所制备的L-草铵膦的收率为91.6％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到98.3％，光学纯度为99.2％。
实施例4
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以Tri-HCl缓冲溶液为溶剂，以10g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.03g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.02g的苹果提取粉和0.01g的螺旋藻粉组成的混合物。苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。控制转化体系的pH值为7.5，控制转化体系的温度为60℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为250r/min。
转化时间为21.3h，所制备的L-草铵膦的收率为86.9％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到98.2％，光学纯度为99.3％。
实施例5
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以硼酸盐缓冲溶液为溶剂，以30g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.18g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.14g的苹果提取粉和0.04g的螺旋藻粉组成的混合物。苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。控制转化体系的pH值为10，控制转化体系的温度为50℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为220r/min。
转化时间为20.7h，所制备的L-草铵膦的收率为89.1％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到98.0％，光学纯度为99.1％。
对比例1
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以MOPS缓冲溶液为溶剂，以22g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.165g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为苹果提取粉。苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为25.9h，所制备的L-草铵膦的收率为84.8％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到97.7％，光学纯度为99.0％。
对比例2
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以MOPS缓冲溶液为溶剂，以22g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵，适量辅酶NADP+和0.165g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为螺旋藻粉组成的混合物。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为24.7h，所制备的L-草铵膦的收率为85.5％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到97.6％，光学纯度为99.1％。
对比例3
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，以MOPS缓冲溶液为溶剂，以22g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，加入60g的甲酸铵和适量辅酶NADP+进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为26.1h，所制备的L-草铵膦的收率为82.3％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到96.8％，光学纯度为99.0％。
实施例1与对比例2对比可知，当转化体系中加入添加剂时，转化时间明显缩短，L-草铵膦的收率也显著提升，纯化后的L-草铵膦晶体的品质也显著改善。实施例1与对比例1、对比例2对比可知，添加剂为苹果提取粉和螺旋藻粉复配组成的混合物与单一添加苹果提取粉或螺旋藻粉相比，转化时间明显缩短，L-草铵膦的收率也显著提升，纯化后的L-草铵膦晶体的品质也显著改善，苹果提取粉和螺旋藻粉复配添加达到了意想不到的技术效果。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> L-草铵膦的生物转化方法
<160> 2
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<213> 人工合成
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Claims (10)
1.一种L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶、添加剂和铵盐进行生物转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。
2.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞；所述辅酶为NADP+，所述铵盐为甲酸铵。
3.根据权利要求2所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源草铵膦脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的草铵膦脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述的溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
5.根据权利要求4所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述添加剂为苹果提取粉和螺旋藻粉按重量比为2-5:1组成的混合物。
6.根据权利要求5所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述苹果提取粉的制备方法为：将鲜苹果破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到苹果取物粉。
7.根据权利要求6所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，转化体系的pH值控制为5-10，控制所述转化体系的温度为20-60℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150-250r/min。
8.根据权利要求7所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，转化体系的pH值控制为5-7，所述转化体系的温度控制为20-40℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为180-220r/min。
9.根据权利要求7所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述生物催化剂的浓度控制为10-30g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％。
10.根据权利要求9所述的L-草铵膦的生物转化方法，其特征在于，所述生物催化剂的浓度控制为20-25g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为2.5-5％。
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