CN106544354A - 一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用 - Google Patents

一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106544354A
CN106544354A CN201611119480.9A CN201611119480A CN106544354A CN 106544354 A CN106544354 A CN 106544354A CN 201611119480 A CN201611119480 A CN 201611119480A CN 106544354 A CN106544354 A CN 106544354A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sahh
ppic9k
preparation
inhibitor
people source
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611119480.9A
Other languages
English (en)
Inventor
谷劲松
李艳华
单秋丽
韩甜
贺盛
郝委委
谭晓军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Jinan
Original Assignee
University of Jinan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Jinan filed Critical University of Jinan
Priority to CN201611119480.9A priority Critical patent/CN106544354A/zh
Publication of CN106544354A publication Critical patent/CN106544354A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/075—Ethers or acetals
    • A61K31/085—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y303/00—Hydrolases acting on ether bonds (3.3)
    • C12Y303/01—Thioether and trialkylsulfonium hydrolases (3.3.1)
    • C12Y303/01001—Adenosylhomocysteinase (3.3.1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用，通过制备一种人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)，利用该人源S‑腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)来筛选SAHH抑制剂，所得到的抑制剂可以用于去制备一种新型的治疗阿尔兹海默症的药物。包括以下步骤：提供编码人源的sahh基因序列；构建pPIC9K‑sahh重组质粒；将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，纯化，制备的水解酶具有高产量、高纯度，以及更高的活性，更好的稳定性，并筛选得到一种新型抑制剂4‑(3‑Hydroxyprop‑1‑en‑1‑yl)‑2‑methoxyphenol(CAS:458‑35‑5，ZINC：12359045)，从而用于制备治疗阿兹海默症的药物。

Description

一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的 抑制剂及应用
技术领域：
本发明涉及生物工程和生化制药领域，具体涉及一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用，通过制备一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)，利用该人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)来筛选SAHH抑制剂，所得到的抑制剂可以用于去制备一种新型的治疗阿尔兹海默症的药物。
背景技术：
同型高半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物。血液中Hcy含量的异常升高会引起同型高半胱氨酸血症。阿尔兹海默病(AD)是一种神经系统退行性疾病，其病理特征主要表现为老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFT)。老年人口血浆Hcy的稳定提高是AD的潜在危险因子。Hcy水平升高，引起氧化应激反应，降低抗氧化反应能力，导致神经细胞功能障碍；Hcy水平升高损害DNA修复机制，诱导细胞凋亡。基于AD患者Hcy异常升高的原因，而人体内Hcy的生成是由SAHH催化SAH可逆水解生成Ado和Hcy。通过抑制SAHH的活性来降低Hcy的浓度，因此我们可以筛选人源SAHH的抑制剂，从而用于制备治疗AD的药物。
目前，国内外把检测Hcy的含量作为诊断是否患有同型高半胱氨酸血症的一个重要指标。Hcy的检测方法主要有四种:免疫学检测、色谱检测、同位素检测法和酶法。其中免疫学检测自动化程度高，适合大多数临床实验室应用；同位素检测法操作繁琐且有放射污染，虽然经过改良也未能推广使用；酶法与HPLC法相关性良好，无需样本预处理，正被广泛的使用。酶法中，涉及到的最重要的酶中就包括SAHH。通用甲基供体：S-腺苷甲硫氨酸(S-AdenosyLmethionine，AdoMet，SAM)受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyLhomocystein，SAH)，SAHH催化SAH可逆水解生成Ado和Hcy，形成的Hcy可以循环的加入反应，从而放大检测信号。这些反应可以用来研发同型高半胱氨酸检测试剂盒。
目前，基因重组的方法制备SAHH已屡见不鲜，但是针对人源sahh基因在酵母菌表达系统还没有出现。我们通过制备人源的SAHH来筛选抑制剂，筛选到的抑制剂可以用来制备治疗人类的阿尔兹海默症的药物。
发明内容
本发明的目的在于筛选一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用。通过提供一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的制备方法，来制备高纯度，高活性的人源的SAHH，然后以此酶为基础来筛选SAHH抑制剂，以至可以将筛选到的SAHH抑制剂用于制备治疗人类的阿尔兹海默症的药物。
本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。
为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种人源SAHH的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒；
(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；
(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；
(5)诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，纯化。
优选地，sahh基因是全基因合成。全基因合成的引物为：
上游引物5’AOX：G A C T G G T T C C A A T T G A C A A G C，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；
下游引物3’AOX：G G C A A A T G G C A T T C T G A C A T C C T，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述步骤(5)中诱导毕赤酵母表达人源SAHH的发酵条件为：发酵温度为22℃，pH为6.0-7.0，连续发酵4天以上，优选为4-6天。诱导时加入甲醇，终浓度为总培养基体积的0.1％-0.4％。当加入的甲醇的量大于0.5％时，其蛋白浓度会降低2％-10％，酶活会降低1％-5％。
本发明提供该水解酶的应用，人源SAHH能可逆性地催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)分解为腺苷(Ado)、高半胱氨酸(Hcy),SAH的分子结构如图7所示，根据竞争性抑制剂的结构特征，我们通过ChemMapper寻找SAH底物腺苷类似物，然后通过ZINC和SciFinder进行初步筛序，从338种小分子化合物中筛选到20种SAH底物腺苷类似物，最后通过将所筛选到的这20种SAH底物腺苷类似物抑制剂加入SAHH和SAH的混合体系中，通过用Ellman试剂和酶标仪在紫外412nm下检测Hcy的吸光度来计算酶活的大小，通过分析酶活的降低比例来筛选抑制率高、无细胞毒性的SAHH抑制剂。具体的筛选步骤为：所述的人源SAHH筛选抑制剂的方法为：将SAH底物腺苷类似物抑制剂加入SAHH酶中，通过用Ellman试剂和酶标仪在紫外412nm下检测Hcy的吸光度来计算酶活的大小，分析酶活的降低比例，再进行细胞毒性试验来筛选抑制率高、无细胞毒性的SAHH抑制剂。经过筛选，得到了一种新型的SAHH抑制剂—4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol,其结构式如图8，其功能为可以抑制人源SAHH的活性，从而可以应用到制备治疗阿兹海默症药物中。
所述的抑制剂与SAHH酶的物质的量的比为1:500。
与现有技术相比，本发明具有以下有益成果：
1.通过全基因组合成技术获得的人源sahh基因，同时进行了高通量测序，通过Blast比对，与人源的相似度为百分之百。sahh基因表达的蛋白是合成新型抗生素药物的一个必要环节，为提高安全性，不能用其他物种的基因表达的蛋白替代。
2.诱导表达sahh基因时，发酵的温度对生成的酶的活性和浓度至关重要，温度为22℃时，酶的活性最高，表达量也显著提高。
3.本发明采用毕赤酵母来表达蛋白，因毕赤酵母是真菌，有细胞器可以对合成的蛋白进行后期的折叠和甲基化修饰。
4. 4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol，是一种新型的抑制剂，其IC50＝36nM，抑制率相对较高。
5.将毕赤酵母表达系统优化后可得高活性、高浓度、高稳定性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶，并且成本低，实验周期短，完全可以用于大规模的生产，从而可以降低检测心血管疾病的同型高半胱氨酸检测试剂盒的成本。
6.本发明的制备方法，通过优化各个步骤、参数、所用试剂等一系列改变，提供了一种高效的制备方法，成本低，实验周期短，制备的水解酶具有高产量、高纯度，以及更高的活性，更好的稳定性，为后续应用提供了非常有利的条件。
本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。
附图说明
图1：pPIC9K-sahh NotI和EcoRI双酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳图；
图2：pPIC9K-sahh和pPIC9K质粒线性化后1％琼脂糖凝胶电泳图；
图3：1.5mg/mL G418的YPD固体平板上菌体PCR后琼脂糖电泳图；
图4：10％SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化SAHH；
图5：酶活标准曲线；
图6：米氏方程双倒数曲线。
图7：SAH的结构图。
图8：4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol结构图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
材料
大肠杆菌DH5α；毕赤酵母菌GS115；英杰公司所提供的毕赤酵母表达工具中的YPD平板、YPD液体培养基、BMGY液体培养基、BMMY液体培养基、MD平板；其他化学试剂均为分析纯。提供编码人源的sahh基因序列，如：SEQ ID NO.1，共1299个碱基对。
实施例1
1.构建pPIC9K-sahh重组质粒
1.1 sahh全基因合成
(1)全基因合成时考虑到后期纯化的需要，在DNA链末端插入了6个组氨酸标签。通过全基因合成技术合成拥有完整编码框的sahh基因：该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)以上述合成的碱基序列做为模板，以设计的引物为上下游引物，进行PCR扩增：
引物：上游引物5’AOX：G A C T G G T T C C A A T T G A C A A G C，该基因的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物为3’AOX：G G C A A A T G G C A T T C T G A C A TC C T，该基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
PCR扩增的反应体系：
组分 体积
ddH2O 9.2μL
10×PCR buffer 1.25μL
基因组DNA 2μL
dNTP 1μL
5’AOX引物 0.25μL
3’AOX引物 0.25μL
Taq酶 0.1μL
条件
体系 温度 时间 循环
热启动 94℃ 15min 1
变性 94℃ 1min
退火 55℃ 1min 35
延伸 72℃ 90s
最终延伸 72℃ 10min 1
1.2连接pPic9k-sahh
(1)取一支1.5mL Ep管按如下加样后混匀：
(2)用微量离心机甩一下，使溶液集中到底部。
(3)16℃恒温连接过夜后，用于转化感受态细胞。
1.3 BL21感受态细胞的制备
(1)从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌BL21单菌落，接种于20mL LB培养基中，37℃恒温振荡培养过夜，至对数生长期。
(2)灭菌离心管收菌，4℃条件下3000r/min离心10min，弃去上清液。
(3)加2mL预冷的CaCL2溶液，用枪轻轻吹打。
(4)分装，每个Ep管200μL，-80℃冰箱保藏备用。
1.4表达载体转化
(1)取一管100μL的大肠杆菌BL21感受态细胞，加入步骤1.2中的重组的连接产物10μL，轻轻用枪吹打混匀，以上均在冰上操作。另做一个宿主菌的阴性对照，即100μL的感受态细胞，加10μL无菌水混匀，轻轻用枪吹打混匀，以上均在冰上操作。
(2)将上述反应体系冰浴20min。
(3)将冰浴后的体系在42℃温度条件下热激90s，然后迅速放入冰上再冰浴3min。
(4)取300μL的灭菌LB培养基加入到上述反应体系中混匀，在37℃条件下150r/min恒温振荡培养45min，使细胞恢复正常生长状态。
(5)将上述菌液摇匀后，吸取100μL分别在含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB固体平板上涂布均匀。编号为1(pPic9k-sahh)、2(pPic9k质粒)、3(无菌水)检测转化是否成功。
(6)将上述涂布平板在37℃恒温培养箱中倒置培养24h，并观察菌斑的出现效果。
1.5阳性重组子的鉴定
(1)挑取卡那霉素平板上的单菌落，接种到10mL LB液体培养基(含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素)中，在37℃条件下150r/min恒温震荡培养16h。
(2)吸取2mL过夜菌液至离心管中，在10000×g下离心1min，弃去上清液。
(3)用250μL的SoLutionⅠ(已加入RnaseA)的重悬菌液，震荡均匀至完全重悬菌液至没有肉眼可见的细胞团块。
(4)加入250μL SoLutionⅡ，并轻柔倒转离心管混合均匀，至溶液澄清。室温放置2min。
(5)加入350μL SoLutionⅢ，立刻轻柔倒转离心管混合，直至出现白色絮状沉淀。
(6)转速13000×g室温下离心10min，取出后出现结实的白色沉淀块，立即进入下一步。
(7)小心吸取上清液加入到与2mL的收集离心管组装在一起的HB过滤小柱中。HB过滤小柱和收集离心管10000×g室温下离心1min，使得溶菌产物通过过滤柱。
(8)弃去收集离心管中溶液。向HB过滤小柱中加入500μL Buffer HB洗过滤小柱。10000×g室温下离心1min，使溶液通过过滤柱。
(9)弃去收集离心管中的液体，向HB过滤小柱中加入700μL已用纯乙醇稀释的DNAWash Buffer来洗过滤柱。10000×g室温下离心1min，使溶液通过过滤柱，并弃去收集离心管中的液体。
(10)空的离心柱13000×g室温下离心2min，干燥过滤小柱中的滤膜。
(11)将HB过滤小柱放入洁净的1.5mL离心管中。向HB过滤小柱的滤膜上加入40μL的ELution Buffer(10mM Tris-HCL，pH8.5)室温竖直静置2min。13000×g室温下离心2min，洗脱出DNA。
(12)取适量用于DNA琼脂糖凝胶电泳。
(13)双酶切反应体系(10μL)：
37℃酶切2h进行1％琼脂糖凝胶电泳。
(14)双酶切鉴定成功后送由青岛华大基因公司测序，选出测序结果正确的pPic9k-sahh重组质粒。
2.将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体
将构建的重组质粒pPIC9K–sahh转化大肠杆菌，37℃培养4h，提取质粒，用Not I和EcoR I进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证图1。图1为pPIC9K-sahh Not I和EcoR I双酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA Marker；泳道1为克隆质粒pPIC9K-sahh双酶切产物；泳道2为空质粒pPIC9K双酶切产物；泳道3为质粒pPIC9K-sahh。
3.提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组上。
通过同尾酶BgL II将pPIC9K-sahh质粒线性化图2，图2为pPIC9K-sahh和pPIC9K质粒线性化后1％琼脂糖凝胶电泳图，图中，M为DNA Marker；泳道1为pPIC9K-sahh线性化产物；泳道2为pPIC9K-sahh质粒；泳道3为pPIC9K线性化产物；泳道4为pPIC9K。
通过电转化将其含有目的基因的片段整合到毕赤酵母GS115基因组中涂MD平板28℃培养2-3d，用0.25mg/mL遗传霉素G418 YPD液体培养基筛选阳性菌株。为筛选到高拷贝转化子，采用浓度梯度为0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL的遗传霉素G418 YPD平板筛选生长较好的单菌落。在浓度为1.5mg/mL的平板上挑取单菌落进行菌体PCR验证的效果最好，如图3。因此确定电转化实验中将目的基因整合到了毕赤酵母菌GS115基因组上并筛选到高抗性的含目的基因sahh的GS115菌株。
4.诱导毕赤酵母表达人源SAHH，纯化。
(1)将筛选到的阳性转化子接种到BMGY液体培养基中，培养条件是30℃，280rpm，直到菌体长到指数期(OD＝2-6)。然后离心收集菌体，将菌体转移至BMMY液体培养基中发酵，诱导蛋白表达。发酵温度为22℃，pH为6-7，连续发酵4天以上，每隔24小时加一定量的甲醇，其终浓度为总培养基体积的0.1％-0.4％。发酵结束后离心收集上清液，得到的上清即为所需蛋白酶液。
(2)亲和层析纯化蛋白
将发酵后的酶液进行亲和层析，然后用含有100mM咪唑的缓冲液进行冲洗，收集洗脱液获得较纯的人源SAHH。纯化后的产物进行10％SDS-PAGE凝胶电泳验证图4，泳道M表示Mark，泳道1，2表示实验组。通过计算可以得出目的蛋白为47.5KDa，从图中我们可以清楚的看到，泳道1和2在51kDa的下方只要一条目的条带，其他位置没有条带。因此得到了表达了高纯度的目的蛋白SAHH。通过考马斯亮蓝测得此酶的蛋白浓度，分别取20μg/μL、40μg/μL、60μg/μL、80μg/μL、100μg/μL为标准蛋白浓度,测其595nm下吸光度并绘制标准曲线。计算SAHH酶蛋白浓度为C＝14.2μg/μL。
其他条件不变，当发酵温度为29-30℃时，发酵所得的蛋白浓度由14.2μg/μL降低到7.3μg/μL。当甲醇加入量大于0.5％时，发酵所得的蛋白浓度由14.2μg/μL降低到5.6μg/μL。
5.SAHH酶活测定
SAH可以被SAHH水解成Hcy和Ado。Hcy可以直接通过DTNB(Ellman试剂)检测。绘制Hcy-A412标准曲线，根据标准曲线计算酶活。具体的实验方法如下：(1)25℃条件下，用0.05mM的Tris-HCL缓冲液稀释0.1mM Hcy标准液，配成梯度的稀释液，其浓度分别为0.00μM，5μM and 10μM，15μM，20μM and 25μM。取上述各浓度溶液30uL，分别与150uL的预先恒温于25℃水中的DTNB反应。静止10min后，立即于波长412nm处测定吸光度。得出数据绘制标准曲线(图5)。此标准曲线线性关系良好，所以我们可以此根据此标准曲线计算酶活。(2)根据(1)所述的实验方法，首先将20μM的SAH，0.05mM的Tris-HCL，发酵得到的SAHH在40℃下预热10分钟，然后启动此水解反应。每隔一分钟取样分别与DTNB发生反应，在412nm下测吸光度。得出的数据根据标准曲线计算酶活，定义40℃、pH＝6.5条件下每分钟催化1μmoL底物的酶的量为一个酶活力单位。计算出目的蛋白SAHH的酶活大约为11.1μmoL/min。
其他条件不变，当发酵温度为29-30℃时，SAHH的酶活由11.1μmoL/min降低到8.2μmoL/min。当甲醇加入量大于0.5％时，其酶活也会从11.1μmoL/min降低到8.2μmoL/min。
6.实施例1表达的SAHH酶促反应动力学
在酶浓度不变的情况下，改变底物的浓度，我们将底物的浓度分别设置为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、20μM。底物浓度与反应速度呈现矩形双曲线。随着反应时间的增长，酶促反应的反应速率逐渐降低，单位时间内所产生的Hcy的量也逐渐降低，直到产物的量不在改变为止，此时酶被底物所饱和。SAHH酶促反应过程具有典型的酶促反应动力学特征。绘制米氏方程双倒数曲线图6根据此双倒数曲线计算得Vmax＝22.7μM/min,Km＝21.8μM，Kcat＝1.28S-1。
7.实施例1表达的SAHH酶促反应的最适反应条件分析
在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、pH有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、pH值称为该酶的最适温度、最适pH。分别将S1-S7置于恒温水浴锅中,孵育10计时，开始反应。温度分别设置为：0℃、4℃、25℃、37℃、40℃、70℃、100℃。每隔一分钟，从每一个反应体系中取出30μL加入到96孔板中，每个孔中提前加入150μL DTNB。做四组平行实验，三个实验组，一个对照组。对照组中不加SAHH，而是用Tris-HCL代替SAHH。然后412nm下测其吸光度。由实验结果可知：酶促反应的最适反应温度为40℃，在最适温度酶促反应最快，温度向两侧偏移反应变慢，高温使酶失活，所以往高温时移动曲线降到零，低温时趋近于零；酶促反应的最适pH为6.5，在最适pH酶促反应最快，pH向两侧偏移反应变慢，且偏酸性条件下酶促反应初始速率下降较缓慢，强酸强碱条件下使酶失活导致曲线降到零。
8实施例1表达的SAHH稳定性测验
将优化毕赤酵母表达系统后发酵所得的SAHH在37℃条件下存放7天后测其酶活。存放七天后测得的酶活为11.08μmoL/min，实验结果表明，此酶蛋白的稳定性相对较高。
9.将同型高半胱氨酸试剂盒中的SAHH的酶活与实施例1及对比例表达的SAHH进行比较
首先用已知试剂盒来检测校准品中Hcy的含量，记录实验结果。已知试剂盒为北京九强生物技术股份有限公司生产，成分如下：
用本发明实施例1已纯化好的目的蛋白SAHH(实验组1)和利用CN103881990专利的方法纯化的SAHH(对照组1-2)与已知的ADA按一定比例配置成试剂3，来取代试剂盒中的试剂3,检测校准品中Hcy的含量。
实验组的试剂3的成分：SAHH 2mg/mL+腺苷脱氨酶(ADA)5.0KU/L；
对照组1的试剂3的成分：SAHH 2mg/mL+腺苷脱氨酶(ADA)5.0KU/L；
对照组2的试剂3的成分：SAHH 4mg/mL+腺苷脱氨酶(ADA)5.0KU/L；
记录实验结果。
10.筛选SAHH的抑制剂
SAHH是大多数病毒复制所依赖的细胞酶，它作为广谱抗病毒药物设计的重要靶点，引起科学家们的广泛关注，其抑制剂的开发目前主要围绕对腺苷类似物的结构改造，以获得高活性、低毒性的抗病毒新药。将毕赤酵母表达系统优化后可得高活性、高浓度、高稳定性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶，因此可以通过检测酶活的变化来筛选高效的抑制剂。
我们通过ChemMapper寻找SAH底物腺苷类似物，然后通过ZINC和SciFinder进行初步筛序，从338种小分子化合物中筛选到20种SAH底物腺苷类似物，最后通过将所筛选到的这20种SAH底物腺苷类似物抑制剂加入SAHH和SAH的混合体系中，其中抑制剂与底物物质的量的比为1：500。然后，通过用Ellman试剂和酶标仪在紫外412nm下检测Hcy的吸光度来计算酶活的大小，通过分析酶活的降低比例来筛选抑制率高、无细胞毒性的SAHH抑制剂。
加入此抑制剂后其酶活降低50％时IC50＝36nM，Ki＝19nM。所以经过初步筛选后得到的4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol的抑制率相对较好，具体名称为松柏醇。
经优化后的毕赤酵母表达系统所表达的人源SAHH酶蛋白，其产量高，酶活相对稳定，可高效的筛选出抑制率高、无细胞毒性的SAHH抑制剂，以至可以尽快的应用到阿尔兹海默症的临床治疗中。
上述结果表明
毕赤酵母表达系统经优化后可以表达高活性，高浓度的SAHH，当发酵温度为29-30℃时，发酵所得的蛋白浓度大约7.3μg/μL，而当发酵温度为22℃发酵所得的蛋白浓度为14.2μg/μL。酶活也由8.2μmoL/min提高到11.1μmoL/min。此技术成本低，实验周期短，完全可以用于大规模的生产。从而可以降低检测心血管疾病的同型高半胱氨酸检测试剂盒的成本；可以高效的筛选SAHH的抑制剂，新型抑制剂4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol为阿尔兹海默症的治疗以提供可靠的基础。
本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。
<110> 济南大学
<120> 一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用
<130> 201601
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1299bp
<212> DNA
<213> 人源基因
<400> 1
atgtctgaca aactgcccta caaagtcgcc gacatcggcc tggctgcctg gggacgcaag 60
gccctggaca ttgctgagaa cgagatgccg ggcctgatgc gtatgcggga gcggtactcg 120
gcctccaagc cactgaaggg cgcccgcatc gctggctgcc tgcacatgac cgtggagacg 180
gccgtcctca ttgagaccct cgtcaccctg ggtgctgagg tgcagtggtc cagctgcaac 240
atcttctcca cccaggacca tgcggcggct gccattgcca aggctggcat tccggtgtat 300
gcctggaagg gcgaaacgga cgaggagtac ctgtggtgca ttgagcagac cctgtacttc 360
aaggacgggc ccctcaacat gattctggac gacgggggcg acctcaccaa cctcatccac 420
accaagtacc cgcagcttct gccaggcatc cgaggcatct ctgaggagac cacgactggg 480
gtccacaacc tctacaagat gatggccaat gggatcctca aggtgcctgc catcaatgtc 540
aatgactccg tcaccaagag caagtttgac aacctctatg gctgccggga gtccctcata 600
gatggcatca agcgggccac agatgtgatg attgccggca aggtagcggt ggtagcaggc 660
tatggtgatg tgggcaaggg ctgtgcccag gccctgcggg gtttcggagc ccgcgtcatc 720
atcaccgaga ttgaccccat caacgcactg caggctgcca tggagggcta tgaggtgacc 780
accatggatg aggcctgtca ggagggcaac atctttgtca ccaccacagg ctgtattgac 840
atcatccttg gccggcactt tgagcagatg aaggatgatg ccattgtgtg taacattgga 900
cactttgacg tggagatcga tgtcaagtgg ctcaacgaga acgccgtgga gaaggtgaac 960
atcaagccgc aggtggaccg gtatcggttg aagaatgggc gccgcatcat cctgctggcc 1020
gagggtcggc tggtcaacct gggttgtgcc atgggccacc ccagcttcgt gatgagtaac 1080
tccttcacca accaggtgat ggcgcagatc gagctgtgga cccatccaga caagtacccc 1140
gttggggttc atttcctgcc caagaagctg gatgaggcag tggctgaagc ccacctgggc 1200
aagctgaatg tgaagttgac caagctaact gagaagcaag cccagtacct gggcatgtcc 1260
tgtgatggcc ccttcaagcc ggatcactac cgctactag 1299
<210> 2
<211> 428aa
<212> 氨基酸
<213> 人源基因
<400> 2
Met Ser Asp Lys Leu Pro Tyr Lys Val Ala Asp Ile Gly Leu Ala Ala Trp Gly Arg
1 5 10 15
Lys Ala Leu Asp Ile Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly Leu Met Arg Met Arg Glu
20 25 30 35
Arg Tyr Ser Ala Ser Lys Pro Leu Lys Gly Ala Arg Ile Ala Gly Cys Leu His
40 45 50 55
Met Thr Val Glu Thr Ala Val Leu Ile Glu Tha Leu Val Tha Leu Gly Ala Glu Val
60 65 70
Gln Trp Ser Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Ala
75 80 85 90
Lys Ala Gly Ile Pro Val Tyr Glu Thr Asp Glu Glu Tyr Leu Trp Cys Ile Glu Gln
95 100 105 110
Thr Leu Tyr Phe Lys Asp Gly Pro Leu Asn Met Ile Leu Asp Asp Gly Gly Asp
115 120 125 130
Leu Thr Asn Leu Ile His Thr Lys Tyr Pro Gln Leu Leu Pro Gly Ile Arg Gly Ile
135 140 145
Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly Val His Asn Leu Tyr Lys Met Met Ala Asn Gly Ile
150 155 160 165
Leu Lys Val Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp
170 175 180 185
Asn Leu Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Ile Asp Gly Ile Lys Arg Ala Thr Asp
190 195 200
Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp Val Gly Lys Gly
205 210 215 220
Cys Ala Gln Ala Leu Arg Gly Phe Gly Ala Arg Val Ile Ile Thr Glu Ile Asp Pro
225 230 235 240
Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala Met Glu Gly Thr Glu Val Thr Thr Met Asp Glu
245 250 255 260
Ala Cys Gln Glu Gly Asn Ile Lys Val Thr Thr Thr Gly Cys Ile Asp Ile Ile Leu Gly
265 270 275 280
Arg His Phe Glu Gln Met Lys Asp Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp Val
285 290 295 300
Glu Ile Asp Val Lys Trp Leu Asn Glu Asn Ala Val Glu Lys Val Asn Ile Lys Pro Gln
305 310 315 320
Val Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn Gly Arg Arg Ile Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu
325 330 335 340
Val Asn Leu Gly Cys Ala Met Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Asn Ser Phe Thr Asn
345 350 355 360
Gln Val Met Ala Gln Ile Glu Leu Trp Thr His Pro Asp Lys Tyr Pro Val Gly Val His
365 370 375 380
Phe Leu Pro Lys Lys Leu Asp Glu Ala Val Ala Glu Ala His Leu Gly Lys Leu Asn
385 390 395
Val Lys Leu Thr Lys Leu Thr Glu Lys Gln Ala Gln Tyr Leu Gly Met Ser Cys Asp
400 405 410 415
Gly Pro Phe Lys Pro Asp His Tyr Arg Tyr
420 425 428
<210> 3
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人源基因
<400> 3
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 4
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人源基因
<400> 4
ggcaaatggc attctgacat cct 23

Claims (10)

1.一种人源S-腺苷高半胱氨酸水解酶SAHH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒；
(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；
(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；
(5)诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，纯化；
sahh基因是全基因合成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒，包括以下操作：2.1 sahh全基因合成，2.2连接pPic9k-sahh，2.3 BL21感受态细胞的制备，2.4表达载体转化，2.5阳性重组子的鉴定。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提供编码人源的sahh基因序列，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)构建pPIC9K-sahh重组质粒；
其中，2.1 sahh全基因合成步骤，全基因合成时考虑到后期纯化的需要，在DNA链末端插入了6个组氨酸标签，通过全基因合成技术合成拥有完整编码框的sahh基因：该基因的序列如SEQ ID NO.1所示；
(3)将重组质粒pPIC9K–sahh转化到大肠杆菌载体；
(4)提取pPIC9K–sahh质粒，酶切处理，转化整合到毕赤酵母GS115基因组；通过电转化将其含有目的基因的片段整合到毕赤酵母GS115基因组中涂MD平板28℃培养2-3d，用0.25mg/mL遗传霉素G418 YPD液体培养基筛选阳性菌株；
(5)诱导毕赤酵母表达人源SAHH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，纯化；将筛选到的阳性菌株接种到BMGY液体培养基中，培养条件是30℃，280rpm，直到菌体长到指数期(OD＝2-6)；然后离心收集菌体，将菌体转移至BMMY液体培养基中发酵，诱导蛋白表达，发酵结束后离心收集上清液，得到的上清即为所需蛋白酶液；
sahh基因是全基因合成。
4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，所述全基因合成sahh基因的引物为：
上游引物5’AOX：G A C T G G T T C C A A T T G A C A A G C，其基因序列如SEQID NO.3所示；
下游引物3’AOX：G G C A A A T G G C A T T C T G A C A T C CT，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中诱导毕赤酵母表达人源SAHH的发酵条件为：发酵温度为22℃，pH为6.0-7.0，连续发酵4天以上，优选为4-6天。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中诱导时加入甲醇，终浓度为总培养基体积的0.1％-0.4％。
7.采用权利要求1-5任一权利要求所得到水解酶在检测心血管疾病的同型高半胱氨酸检测试剂盒中的应用。
8.用根据权利要求1-5任一权利要求的水解酶筛选得到的新型抑制剂，特征在于，化学式为4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol，其IC50＝36nM。
9.如权利要求7所得到的新型抑制剂在制备治疗阿兹海默症药物中的应用。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂与SAHH酶的物质的量的比为1:500。
CN201611119480.9A 2016-12-08 2016-12-08 一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用 Pending CN106544354A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611119480.9A CN106544354A (zh) 2016-12-08 2016-12-08 一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611119480.9A CN106544354A (zh) 2016-12-08 2016-12-08 一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106544354A true CN106544354A (zh) 2017-03-29

Family

ID=58396818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611119480.9A Pending CN106544354A (zh) 2016-12-08 2016-12-08 一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106544354A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1687449A (zh) * 2005-04-05 2005-10-26 中国科学院长春应用化学研究所 腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法
CN102559572A (zh) * 2012-02-09 2012-07-11 宁波美康生物科技股份有限公司 基因工程菌、用其制备重组s-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用
CN103881990A (zh) * 2013-04-11 2014-06-25 北京爱必信生物技术有限公司 S腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahh）的制备方法
CN103966185A (zh) * 2014-05-18 2014-08-06 南京仙奕基因科技有限公司 高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的双酶体系及其应用方法
CN105671016A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 吉林农业大学 提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1687449A (zh) * 2005-04-05 2005-10-26 中国科学院长春应用化学研究所 腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法
CN102559572A (zh) * 2012-02-09 2012-07-11 宁波美康生物科技股份有限公司 基因工程菌、用其制备重组s-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用
CN103881990A (zh) * 2013-04-11 2014-06-25 北京爱必信生物技术有限公司 S腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahh）的制备方法
CN103966185A (zh) * 2014-05-18 2014-08-06 南京仙奕基因科技有限公司 高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的双酶体系及其应用方法
CN105671016A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 吉林农业大学 提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANLNINE N.等: "Homo sapiens S-adenosylhomocysteine hydrolase mRNA, complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
李绍顺等: "松柏醇的合成方法改进", 《中国药物化学杂志》 *
王素芳等: "《生物药物的制备与质量控制》", 28 February 2013, 浙江大学出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zengler et al. High‐throughput cultivation of microorganisms using microcapsules
CN104774825B (zh) 腈水解酶突变体及其应用
CN107828755A (zh) 热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用
Liu et al. Identification of cordycepin biosynthesis-related genes through de novo transcriptome assembly and analysis in Cordyceps cicadae
CN108048438A (zh) 一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用
CN107177607A (zh) 枯草芽孢杆菌bs04的尿酸氧化酶基因及其用途
CN104673809B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
CN111748543A (zh) 免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程菌、构建方法与应用
CN113248574A (zh) 一种高效表达a型塞内卡病毒结构蛋白的方法
CN114807060A (zh) 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用
CN104263744A (zh) 一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用
CN106544354A (zh) 一种人源s‑腺苷高半胱氨酸水解酶的制备方法及筛选得到的抑制剂及应用
CN107586762A (zh) 一种3‑甾酮‑δ1‑脱氢酶突变体及其应用
CN104946606B (zh) 一种基因工程改造的耐热抗逆sod及其编码基因与应用
Pineda-Rodriguez et al. A new and profitable protocol to DNA extraction in Limnospira maxima
CN106544336A (zh) 一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶
He et al. Effects of an EPS biosynthesis gene cluster of Paenibacillus polymyxa WLY78 on biofilm formation and nitrogen fixation under aerobic conditions
CN108795955A (zh) 一种硝基还原酶基因cnrB及其编码的蛋白和应用
CN108265065A (zh) 一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用
CN108103050A (zh) 一种铜绿假单胞菌噬菌体裂解酶、其编码基因、重组表达载体及其制备方法和应用
Gavric et al. Optimized Method for Pseudomonas aeruginosa Integrative Filamentous Bacteriophage Propagation
CN108265068A (zh) 重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用
CN105200084B (zh) 一种昆虫细胞表达抗菌肽Cecropin DC1的方法
Kudryakova et al. The First Homologous Expression System for the β-Lytic Protease of Lysobacter capsici VKM B-2533T, a Promising Antimicrobial Agent
CN109337887A (zh) 一种Nucyep酶的编码基因、重组表达载体、重组工程菌及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170329