CN105671016A - 提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白 - Google Patents

提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白 Download PDF

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Abstract

提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白，涉及蛋白免疫原性领域，其目的是为了给布鲁氏菌提供更好的疫苗候选抗原。该方法为：4℃将六糖与高碘酸钠按摩尔比1:1混合在pH？6.0的PBS中反应1h；室温将EDC与NHS按摩尔比1:1加入上述体系中反应6h；室温将ahcy蛋白按ahcy蛋白与六糖摩尔比1:1000加入上述体系中过夜反应；4℃在50mmol/L、pH8.0～9.6的碳酸盐溶液中透析5h，再在50mmol/L、pH7.0～8.0的PBS中透析一天。获得的六糖修饰ahcy蛋白的刺激增殖指数、抗体效价、刺激小鼠脾淋巴细胞后产生的IFN-γ和IL-2的量都大大提高。

Description

提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白
技术领域
本发明涉及蛋白质的免疫原性技术领域，具体涉及一种提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白。
背景技术
S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteinehydrolase，ahcy)是布鲁氏菌免疫原性蛋白，是预防布鲁氏菌的亚单位疫苗的候选抗原，对布鲁氏菌具有较好的免疫保护。
布鲁氏菌属于胞内寄生菌，目前还没有理想的治疗手段和药物，疫苗预防是防控该病的唯一有效手段。布鲁氏菌的免疫机制目前还没有完全清楚，但是无论是体液免疫反应还是细胞免疫反应对布鲁氏菌的清除都是起作用的，但是细胞免疫反应是排除胞内寄生菌最主要的免疫机制。布鲁氏菌活的弱毒疫苗以及一些保护性抗原配合佐剂都能够诱导很强的细胞免疫反应。目前布鲁菌病疫苗的种类较多，世界大约有200多种布鲁氏菌疫苗，主要包括弱毒活菌苗，灭活疫苗，突变株疫苗，基因工程苗和抗独特型抗体苗等。由于一些弱毒疫苗，灭活疫苗都存在着一些缺陷以及一些新疫苗的研制又都处于实验室阶段，致使目前还没有更加理想的布鲁氏菌疫苗用于控制人畜布病。所以当前布鲁氏菌疫苗的研究也主要集中在筛选弱毒株，构建突变株以及寻找亚单位疫苗等方面。
发明内容
本发明的目的是为了给布鲁氏菌提供更好的疫苗候选抗原，提供一种提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，包括以下步骤：
步骤一、4℃下，将六糖与高碘酸钠按摩尔比为1:1的比例混合，在pH6.0的PBS中反应1h；
步骤二、室温下，按EDC与NHS的摩尔比为1:1的比例，向步骤一所得反应体系中加入EDC和NHS，反应6h；
步骤三、室温下，按ahcy蛋白与六糖的摩尔比为1:1000的比例，向步骤二所得反应体系中加入ahcy蛋白，过夜反应；
步骤四、4℃下，在50mmol/L、pH8.0～9.6的碳酸盐溶液中透析5h；
步骤五、4℃下，在50mmol/L、pH7.0～8.0的PBS中透析一天。
进一步的，所述ahcy蛋白通过以下方法制备：
步骤一、将大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)制备成感受态细胞后，转化重组质粒pET28a-ahcy构建pET-28a-ahcy/BL21表达菌株，pET-28a-ahcy/BL21表达菌株用终浓度1mmol/L的IPTG诱导6h表达蛋白；
步骤二、离心收集E.coliBL21细胞，用PBS洗涤2次，5000rmp/min，离心15min，收集菌液；
步骤三、加入冰预冷的50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl和2mmol/L的EDTA，洗涤菌液一次，所加入的Tris-HCl和EDTA的总体积为菌液体积的1/5；
步骤四、离心收集菌液，重悬于冰预冷的10mmol/L、pH8.0的Tris-HCl中，Tris-HCl的体积为菌液体积的1/10，加入溶菌酶至0.1mg/ml，再加入1％的TritonX-100，37℃孵育15min；
步骤五、加入终浓度为1mmol/L的PMSF，置冰浴中超声裂解菌体，超声10sec，间歇10sec，最大功率300W、超声30min，超声破碎直至溶液不再粘稠且呈现透明状态；
步骤六、12000rpm，4℃离心30min，取离心上清液用0.45μm滤膜过滤，对过滤后的上清液进行SDS-PAGE验证分析，结果目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
步骤七、HisTrapFF亲合层析柱纯化目的蛋白：
(1)5个柱体积的馏水洗涤柱；
(2)5个柱体积的Elutionbuffer洗涤柱；
(3)5个柱体积的馏水洗涤柱；
(4)10个柱体积的Bindingbuffer平衡柱；
(5)上样，过柱，要注意液体过柱的流速，控制在1ml/min；
(6)5个柱体积的Bindingbuffer洗脱杂蛋白；
(7)5～10个柱体积的Elutionbuffer洗脱目的蛋白，并回收至新的EP管里，对纯化后的ahcy蛋白进行SDS-PAGE验证分析，结果纯化后的目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
通过上述的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法获得的六糖修饰ahcy蛋白，其刺激增殖指数IS是ahcy蛋白的2.77倍，抗体效价IgG较ahcy蛋白在4～5周时提高1倍，刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量是ahcy蛋白的6.86倍，刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种提高ahcy蛋白免疫原性的方法，是一种布鲁氏菌提供新的亚单位疫苗的制备方法，进一步提高该蛋白诱导细胞免疫和体液免疫水平。本发明使用化学合成方法对ahcy蛋白进行甘露寡糖修饰，实验找出稳定的寡糖修饰方法，得到的糖蛋白免疫小鼠检测小鼠脾细胞淋巴细胞增殖、血清中抗体消长、脾细胞原代培养液中细胞因子的含量，筛选出对蛋白免疫原性改变较大的寡糖修饰蛋白。
ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞的IS(刺激增殖指数)分别为1.63和4.52，六糖修饰蛋白(ahcymhe)的IS是ahcy蛋白的2.77倍。
ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)的抗体效价IgG分别为1:64000和1:128000，六糖修饰蛋白(ahcymhe)抗体效价IgG较ahcy蛋白在4～5周时提高1倍。
ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量分别为902.27pg/ml和6192.045pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量是ahcy蛋白的6.86倍。
ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量分别为43.23pg/ml和166.76pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
附图说明
图1为ahcy蛋白诱导表达的SDS-PAGE结果。图中：泳道1为未诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液；泳道2为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液；泳道3为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液上清；泳道4为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液沉淀；泳道5为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液上清；泳道6为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液沉淀。
图2为纯化的ahcy蛋白的SDS-PAGE结果。图中：泳道1为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液；泳道2和泳道3均为纯化后洗脱的ahcy蛋白。
图3为小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果。图中：ahcym表示单糖修饰ahcy蛋白，ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymtr表示三糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
图4为免疫小鼠后测定小鼠抗体效价增长曲线。图中：ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
图5为细胞因子INF-γ含量检测结果。图中：ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
图6为细胞因子IL-2含量检测结果。图中：ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
图7为细胞因子IL-10含量检测结果。图中：ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1ahcy蛋白的制备及纯化
1、ahcy蛋白的制备
(1)将大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)制备成感受态细胞后，转化重组质粒pET28a-ahcy构建pET-28a-ahcy/BL21表达菌株，pET-28a-ahcy/BL21表达菌株用终浓度1mmol/L的IPTG诱导6h表达蛋白；
(2)离心收集E.coliBL21细胞，用PBS洗涤2次，5000rmp/min，离心15min，收集菌液；
(3)加入冰预冷的50mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)和2mmol/L的EDTA，洗涤菌液一次，所加入的Tris-HCl和EDTA的总体积为菌液体积的1/5；
(4)离心收集菌液，重悬于冰预冷的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)中，Tris-HCl的体积为菌液体积的1/10，加入溶菌酶至0.1mg/ml，再加入1％的TritonX-100，37℃孵育15min；
(5)加入终浓度为1mmol/L的PMSF，置冰浴中超声裂解菌体，超声10sec，间歇10sec，最大功率300W、超声30min，超声破碎直至溶液不再粘稠且呈现透明状态；
(6)12000rpm，4℃离心30min，取离心上清液用0.45μm滤膜过滤，过滤后上清液经SDS-PAGE验证后用于目的蛋白纯化。
ahcy蛋白经SDS-PAGE验证分析后的结果如图1所示，目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
2、HisTrapFF亲合层析柱纯化目的蛋白
(1)5个柱体积的馏水洗涤柱；
(2)5个柱体积的Elutionbuffer洗涤柱；
(3)5个柱体积的馏水洗涤柱；
(4)10个柱体积的Bindingbuffer平衡柱；
(5)上样，过柱，要注意液体过柱的流速，控制在1ml/min；
(6)5个柱体积的Bindingbuffer洗脱杂蛋白；
(7)5～10个柱体积的Elutionbuffer洗脱目的蛋白，并回收至新的EP管里。
纯化后的ahcy蛋白经SDS-PAGE验证分析后的结果如图2所示，纯化后的目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
实施例2六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)的制备
步骤一、4℃下，将六糖与高碘酸钠按照摩尔比为1:1的比例混合，在pH6.0的PBS中反应1h；
步骤二、室温下，按照EDC与NHS的摩尔比为1:1的比例，向步骤一所得反应体系中加入EDC(可溶于水的碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应6h；
步骤三、室温下，按照ahcy蛋白与六糖的摩尔比为1:1000的比例，向步骤二所得反应体系中加入ahcy蛋白过夜反应；
步骤四、4℃下，在50mmol/L、pH8.0～9.6的碳酸盐溶液中透析5h；
步骤五、4℃下，在50mmol/L、pH7.0～8.0的PBS中透析一天，获得六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)。
六糖与ahcy蛋白发生反应的比例通过以下方法确认：利用BCA试剂盒测量反应产物中ahcy蛋白的含量以及确定反应蛋白的物质的量，同时利用苯酚硫酸法测量反应产物中六糖的含量以及确定反应糖的物质的量，从而确定六糖与ahcy蛋白发生反应的摩尔比为：六糖:ahcy蛋白＝1000:1(摩尔比)，反应后糖蛋白(六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe))中六糖与ahcy蛋白的摩尔比为：六糖:ahcy蛋白＝2.4:1(摩尔比)。
实施例3六种寡糖修饰蛋白的制备
按照实施例2的步骤，制备六种寡糖修饰蛋白，即单糖修饰ahcy蛋白(ahcym)，二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)，三糖修饰ahcy蛋白(ahcymtr)，四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)，五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)，六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)。
实施例4小鼠脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)
1、将制备的ahcy蛋白和六种寡糖修饰蛋白分别免疫雌性小鼠，50ug/只，免疫后2周强化免疫1次，免疫后4周，取脾，制备脾淋巴细胞，检测脾淋巴细胞增殖。
2、当脾淋巴细胞浓度为2×106个/ml时，加入96孔培养板中，2×105个细胞/100μl/孔，每组设3孔。
3、加入终浓度分别为5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml的ConA(刀豆蛋白A)，100μl/孔，作为阳性对照组。加入终浓度分别为5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml的ahcy蛋白以及六种寡糖修饰蛋白，刺激相应蛋白免疫小鼠后取得的脾淋巴细胞，作为实验组。阴性对照为RPMI-1640培养基，空白对照为不含脾淋巴细胞和寡糖修饰蛋白的RPMI-1640培养基。
37℃，5％CO2培养箱培养12h，加入20μlMTT试剂，继续培养4h，于490nm波长测OD值，从而计算得到刺激增殖指数IS。
刺激增殖指数IS＝(OD-OD1640)/(ODPBS-OD1640)，ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞的IS(刺激增殖指数)分别为1.63和4.52，六糖修饰蛋白(ahcymhe)的IS是ahcy蛋白的2.77倍。
小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果如图3所示，ahcy蛋白及六种寡糖修饰蛋白均对小鼠脾淋巴细胞有增殖作用，经过比较可知，二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)对小鼠脾淋巴细胞增殖作用较为明显。六种寡糖修饰蛋白表示为单糖修饰ahcy蛋白(ahcym)，二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)，三糖修饰ahcy蛋白(ahcymtr)，四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)，五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)，六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)。
实施例5小鼠抗体效价检测
将制备的ahcy蛋白、二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)、四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)、五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)分别免疫雌性小鼠，50ug/只，免疫后2周强化免疫1次，每周取血，检测抗体效价。
小鼠抗体效价增长曲线如图4所示，ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)的抗体效价IgG分别为1:64000和1:128000，六糖修饰蛋白(ahcymhe)抗体效价IgG较ahcy蛋白在4～5周时提高1倍，在免疫后第五周抗体水平达到峰值，并且只有一次峰值出现，证明六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)刺激机体引起了比其他蛋白较强的体液免疫。
实施例6细胞因子检测
参照实施例4制备和培养小鼠脾淋巴细胞，然后分别用ahcy蛋白、二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)、四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)、五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞，12小时后检测培养液上清中细胞因子INF-γ、IL-2、IL-10的含量，所用的ahcy蛋白、二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)、四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)、五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)的浓度均5μg/ml。
细胞因子的含量检测结果如图5、图6和图7所示，ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量分别为902.27pg/ml和6192.045pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量是ahcy蛋白的6.86倍；ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量分别为43.23pg/ml和166.76pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
通过上述分析可知，六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)免疫小鼠后脾淋巴细胞体外刺激产生细胞因子INF-γ、IL-2、IL-10的量相对ahcy蛋白要高很多，这说明六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)在细胞免疫上优于未修饰蛋白即ahcy蛋白。
综合以上三方面免疫评价方法，说明六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)细胞免疫和体液免疫均有提高，可为布鲁氏菌提供更好的疫苗候选抗原。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，做出相应改变和替代，而且得到与本发明具有相同步骤的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，其性能也必然相同，都应当视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、4℃下，将六糖与高碘酸钠按摩尔比为1:1的比例混合，在pH6.0的PBS中反应1h；
步骤二、室温下，按EDC与NHS的摩尔比为1:1的比例，向步骤一所得反应体系中加入EDC和NHS，反应6h；
步骤三、室温下，按ahcy蛋白与六糖的摩尔比为1:1000的比例，向步骤二所得反应体系中加入ahcy蛋白，过夜反应；
步骤四、4℃下，在50mmol/L、pH8.0～9.6的碳酸盐溶液中透析5h；
步骤五、4℃下，在50mmol/L、pH7.0～8.0的PBS中透析一天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ahcy蛋白通过以下方法制备：
步骤一、将大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)制备成感受态细胞后，转化重组质粒pET28a-ahcy构建pET-28a-ahcy/BL21表达菌株，pET-28a-ahcy/BL21表达菌株用终浓度1mmol/L的IPTG诱导6h表达蛋白；
步骤二、离心收集E.coliBL21细胞，用PBS洗涤2次，5000rmp/min，离心15min，收集菌液；
步骤三、加入冰预冷的50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl和2mmol/L的EDTA，洗涤菌液一次，所加入的Tris-HCl和EDTA的总体积为菌液体积的1/5；
步骤四、离心收集菌液，重悬于冰预冷的10mmol/L、pH8.0的Tris-HCl中，Tris-HCl的体积为菌液体积的1/10，加入溶菌酶至0.1mg/ml，再加入1％的TritonX-100，37℃孵育15min；
步骤五、加入终浓度为1mmol/L的PMSF，置冰浴中超声裂解菌体，超声10sec，间歇10sec，最大功率300W、超声30min，超声破碎直至溶液不再粘稠且呈现透明状态；
步骤六、12000rpm，4℃离心30min，取离心上清液用0.45μm滤膜过滤，对过滤后的上清液进行SDS-PAGE验证分析，结果目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤七、HisTrapFF亲合层析柱纯化目的蛋白：
(1)5个柱体积的馏水洗涤柱；
(2)5个柱体积的Elutionbuffer洗涤柱；
(3)5个柱体积的馏水洗涤柱；
(4)10个柱体积的Bindingbuffer平衡柱；
(5)上样，过柱，要注意液体过柱的流速，控制在1ml/min；
(6)5个柱体积的Bindingbuffer洗脱杂蛋白；
(7)5～10个柱体积的Elutionbuffer洗脱目的蛋白，并回收至新的EP管里，对纯化后的ahcy蛋白进行SDS-PAGE验证分析，结果纯化后的目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
4.权利要求1至3任意一项所述的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法获得的六糖修饰ahcy蛋白。
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