CN112961873B - 一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，该方法以BL21DE3为出发菌株，在出发菌株基础上分别过表达了来源于黑熊中编码L‑苏氨酸醛缩酶的S‑TA基因和短乳杆菌中编码酪氨酸脱羧酶的TDC基因，通过上述操作得到两株工程菌，通过细胞破碎得到的粗酶液，以3,4‑二羟基苯甲醛为底物，甘氨酸为辅底物，5‑磷酸吡哆醛为辅因子进行反应后得到去甲肾上腺素的产量为6.3g/L。与现有技术相比，本发明方法生物合成法有着绿色，高产，条件温和等优点，尤其是副产物少，对环境友好度高，且所需生产设备成本大大降低。
Description
技术领域
本发明属于去甲肾上腺素的制备技术领域，具体涉及一种双酶耦合合成去甲 肾上腺素的方法。
背景技术
去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)是一种主要由交感节后神经元和脑内 肾上腺素能神经末梢合成和分泌的神经递质，血液中的NE主要来自肾上腺髓质。 人工合成NE是一种升压药物，可有效用于多种危重患者的循环功能支持，目前 NE常作为感染性休克患者血压维持的一线治疗药物。临床上用药形式为左旋异构体，常用其重酒石酸盐，即重酒石酸去甲肾上腺素。主要用于治疗急性低血压 和周围血管扩张所引起的休克等。
目前文献报道的合成路线中均采用催化氢化还原法得到NE，该反应在加压条 件下进行，反应危险性较大，对生产设备要求高，需要专门的氢化车间。因此必 须加强对NE作用机理、合成途径的研究，寻找相对安全、廉价、高效的合成途 径。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法， 该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，避免了化学合成过程中副产物多、拆 分成本高的问题，降低其制备成本。
一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，包括以下步骤：
步骤1，构建表达S-TA的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA
根据已报导的黑熊来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，委 托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体 pGEX-6p-1上，获得重组质粒pGEX-6p-1-S-TA，将构建好的重组质粒 pGEX-6p-1-S-TA用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到表达 L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA；
步骤2，构建表达TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC
根据已报导的短乳杆菌来源酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后， 委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体 pCDF-duet上，获得重组质粒pCDF-duet-TDC，将构建好的重组质粒 pCDF-duet-TDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到表达 L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC；
步骤3，培养S-TA的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA
挑取表达S-TA的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA的单菌落，接种 于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6-0.8，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃ 培养12-18小时，离心收集表达L-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌BL21(DE3)/ pGEX-6p-1-S-TA；
步骤4，培养TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC
挑取表达TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC的单菌落，接种于 LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃ 培养12-18小时，离心收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC；
步骤5，收集表达L-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA， 用pH 6-11的PBS缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得L-苏氨酸醛缩酶粗酶液，并用 酶标仪测定蛋白浓度；
步骤6，收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC， 用pH6-11的PBS缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎 完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得酪氨酸脱羧酶粗酶液，并用酶 标仪测定蛋白浓度；
步骤7，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛 为辅因子，加入S-TA、TDC粗酶液，再添加PBS缓冲溶液调节反应体系的pH至 6-11后，20-60℃反应0.5-24h；
步骤8，完成催化反应，加入等体积比1N稀盐酸，12000rpm离心2min，采 用1ml注射器吸取离心得到的上清液，并用0.22μm滤膜除去杂质，将去除杂 质的反应液注入1.5ml液相小瓶中，检测产物生成情况。
作为改进的是，步骤3中所述产酶条件为：加入IPTG的量为0.5mM/L，诱 导温度为18-30℃。
作为改进的是，步骤4中所述产酶条件为：加入IPTG的量为0.5mM/L，诱 导温度为20-33℃
作为改进的是，步骤5和步骤6中PBS缓冲液主要成分为磷酸二氢钠和磷酸 氢二钠。
作为改进的是，步骤7中3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-100mM/L、甘氨 酸的终浓度为0.1-5M/L、5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-100μm/L，S-TA粗酶液的 蛋白浓度为0.1-10g/L，TDC粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/L。
进一步改进的是，步骤7中3,4-二羟基苯甲醛终浓度为60mM/L，甘氨酸终 浓度为1M/L，5-磷酸吡哆醛终浓度为20μm/L。
进一步改进的是，步骤7中所加入S-TA粗酶液蛋白浓度为1g/L，加入TDC 粗酶液蛋白浓度为6g/L。
进一步改进的是，步骤7中该反应体系的反应温度30℃，反应pH为7.5。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法具有如下优 势：该方法是首次系统的做出从3,4-二羟基苯甲醛到去甲肾上腺素的酶催化生 产工艺，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很 好的工业化生产前景。
附图说明
图1为本发明产物去甲肾上腺素标准品的高效液相色谱图；
图2为本发明产物去甲肾上腺素的定量标准曲线图；
图3为本发明底物3,4-二羟基苯甲醛标准品的高效液相色谱图；
图4为本发明反应液中产物以及底物的高效液相色谱图；
图5.反应液中产物去甲肾上腺素高分辨质谱图。
具体实施方案
以下实施例中，LB培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化 钠；实施例中所采用的试剂均为常规试剂。
实施例1
步骤1，构建表达S-TA的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA
根据已报导的黑熊来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，序 列如SEQ NO.1所示，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后的 序列，亚克隆到载体pGEX-6p-1上，获得重组质粒pGEX-6p-1-S-TA，将构建好 的重组质粒pGEX-6p-1-S-TA用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)， 得到表达L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA；
步骤2，构建表达TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC
根据已报导的短乳杆菌来源酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后， 序列如SEQ NO.2所示，委托擎科生物科技有限公司(南京)全基因合成优化后 的序列，亚克隆到载体pCDF-duet上，获得重组质粒pCDF-duet-TDC，将构建好 的重组质粒pCDF-duet-TDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)， 得到表达L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC；
步骤3，培养S-TA的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA
挑取表达S-TA的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA的单菌落，接 种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6-0.8，再加入0.25mM-1mM的IPTG， 15-30℃培养12-18小时，离心收集表达L-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌BL21(DE3) /pGEX-6p-1-S-TA；
步骤4，培养TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC
挑取表达TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC的单菌落，接种 于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃ 培养12-18小时，离心收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC；
步骤5，收集表达L-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-6p-1-S-TA， 用pH6-11的PBS缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得L-苏氨酸醛缩酶粗酶液，并用 酶标仪测定蛋白浓度；
步骤6，收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌BL21(DE3)/pCDF-duet-TDC， 用pH6-11的PBS缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪破碎重悬后的基因工程菌，破碎 完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得酪氨酸脱羧酶粗酶液，并用酶 标仪测定蛋白浓度；
步骤7，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛 为辅因子，加入S-TA、TDC粗酶液，再添加PBS缓冲溶液调节反应体系至1ml， pH为6-11，20-60℃反应0.5h-24h；
步骤8，完成催化反应，加入等体积比1N稀盐酸，12000rpm离心2min，取 上清液检测产物生成情况。
实施例2
催化产去甲肾上腺素，具体操作步骤为反应体系为1ml，取3,4-二羟基苯甲 醛终浓度为60mM/L、甘氨酸终浓度为1M/L，5-磷酸吡哆醛终浓度为20μm/L， 再加入1g/L S-TA、6g/L TDC，用PBS缓冲液调节体系至1ml，pH 7.5，30℃反 应2-12h。
反应结束后，利用高效液相色谱法，XSelect HSS T3型色谱柱(4.6×250mm， 5μm)，流动相为23.3g氯化钠(上海迈瑞尔化学技术有限公司)、1ml冰乙酸， 用水稀释到1L，混2％的纯乙腈(分析纯)溶液，柱温30℃，紫外检测波长280 nm，流速5ml/min。
采取梯度洗脱法：
经高效液相色谱方法检测后，得到如图4所示结果图，其中7.353min处出 峰为产物去甲肾上腺素的检测峰，经计算得到产物量为6.3g/L。
综上所述，本发明一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法为首次系统的做出 从3,4-二羟基苯甲醛到去甲肾上腺素的酶催化生产工艺，环境友好，原料易得， 生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到 的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtatagtt ttaaaaatga ttatagtgaa ggggcacatc ctagaattct tgaaacgttg 60
ctgagaacaa atttagaaca atgtgaaggt tacggaaaag atacatactg tgaggaagct 120
gaaaacttaa taaaaaataa actaaataat gagtctattg aagtccattt catatctgga 180
ggtacacaaa ctaacttaat agcaatatct gcatttttaa ggcctcatga gggtgttata 240
tcagcagata cagggcatat atttgtaaat gaagcaggtt caatagaagc aacaggacat 300
aaggtgatat ctgttgatgt tgtggatggt aaactaagaa gagacgatat actatcagta 360
ttgagtaagt ttactaatga gcatgttgta aaaccaaagc ttgtttatat atctaactct 420
actgaaattg gaactatata taaaaaatct gaattagaag agttaagcaa agtttgtaga 480
gaaaataatt tattactatt tatggatgga gcaagattag gatctgcact ttcttgcaaa 540
gaaaatgatt tgacattaga agatataagt aaattaactg atgcttttta tatcggggga 600
actaagaatg gagctctttt aggagaagca cttgttatat gtaataaaga tttacaggaa 660
gattttagat atcacttaaa acaaaaagga gcgatgcttg ctaagggaag gttgcttgga 720
atacagttta tagaattatt taaagatgat ttattttttg aaataggaaa acatgaaaat 780
gatatggctg atatattaag ggatggaata agtaggcttg gatatgaatt tttagtagac 840
tctccatcta atcaaatatt cccagtattt aacaatgata ttataagaga attagagaaa 900
aactatggat ttaatatatg ggaaaaagta aatgaagaga aaactgcaat aagattagta 960
acatcttttg caacaaaaga agaaccttgt ctagagttta taaagttttt aagtggatta 1020
actaataaat aa 1032
<210> 2
<211> 1893
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaaaaaa gcaatcgcag cctgaaagac ctggatctga atgcactgtt tattggtgat 60
aaagccgaaa atggtcagct gtataaagac ctgctgaata aactggtgga tgaacattta 120
ggttggcgca aaaactatat tccgagcgat ccgaatatga ttggtccgga agatcagaat 180
agtccggcat tcaaaaaaac cgttggtcac atgaaaaccg ttctggatca gctgagcgaa 240
cgtattcgta ccgaaagcgt tccgtggcat agcgcaggtc gttattgggg acacatgaat 300
agcgaaaccc tgatgcctgc actgctggca tataactatg caatgctgtg gaatggtaat 360
aacgttgcct atgaaagcag tccggcaacc agccagatgg aagaagaagt tggtcaagaa 420
tttgcacgtc tgatgggtta tgattatggt tggggtcata ttgttgcaga tggtagcctg 480
gcaaatctgg aaggtctgtg gtatgcacgt aacattaaaa gcctgccgtt tgccatgaaa 540
gaagttaatc cggaactggt tgcaggtaaa agcgattggg aactgctgaa catgccgacc 600
aaagaaatta tggatctgct ggaaaatgca ggcagccaga ttgatgaagt taaaaaacgt 660
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cattatagct ggatgaaagc cgcagatatt attggtattg gcctggatca ggttgttccg 780
gttccgattg atagcaatta tcgtatggat attcaggccc tggaaagcat tattcgtaaa 840
tatgcagcag aaaaaacccc gattctgggt gttgttggtg ttgccggtag caccgaagag 900
ggtgcagttg atggtattga taaaattgtt gcactgcgtc agaaactgca gaaagaaggc 960
atttatttct atctgcatgt ggatgcagcc tatggtggtt atgcccgtgc gctgtttctg 1020
gatgaagatg atcagtttat cccgtacaaa aacctgcaaa aagtgcatgc cgaaaaccat 1080
gtttttaccg aggataaaga gtacatcaaa ccggaagttt atgccgcata taaagcattt 1140
gatcaggccg aatcaattac cattgatccg cataaaatgg gctatgttcc gtatagtgcc 1200
ggtggtattg ttattcagga tattcgtatg cgtgatacca tcagctattt tgccacctat 1260
gtgtttgaaa aaggtgcaga tattcctgcg ctgctgggtg catatattct ggaaggcagc 1320
aaagccggtg caaccgcagc aagcgtttgg gcagcacatc acaccctgcc gctgaatgtt 1380
accggttatg gtaaactgga aggtgcaagc attgaaggtg cacatcgtta ttatgacttt 1440
ctgaagaacc tgaaatttga ggtggcaggt aaacgtatta gcgttcatcc gctgattagt 1500
ccggatttta acatggttga ttacgtgctg aaagaagatg gtaacgacga tctgattgaa 1560
atgaatcgtc tgaaccacgc cttttatgaa caggcaagct atgttaaagg tagcctgtat 1620
ggcaaagaat atattgtgag ccataccgat tttgcgatcc cggattatgg tgatagtccg 1680
ctggcatttg ttgaaagcct gggttttagc gaagcagaat ggcgtcatgc cggtaaagtt 1740
accattattc gcgcaagcgt tatgaccccg tatatgaatc agcgtgaaaa cttcgattat 1800
ttcgcaccgc gtatcaaaaa agccattcag gccgatctgg aaaaagtgta tgcgagcgtt 1860
aatcagaaag aacatcatca ccaccatcat taa 1893
Claims (7)
1.一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，构建表达S-TA的基因工程菌BL21（DE3）/ pGEX-6p-1-S-TA
根据已报导的黑熊来源L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pGEX-6p-1上，获得重组质粒pGEX-6p-1-S-TA，将构建好的重组质粒pGEX-6p-1-S-TA用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到表达L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21（DE3）/ pGEX-6p-1-S-TA；
步骤2，构建表达TDC的基因工程菌BL21（DE3）/ pCDF-duet-TDC
根据已报导的短乳杆菌来源酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pCDF-duet上，获得重组质粒pCDF-duet-TDC，将构建好的重组质粒pCDF-duet-TDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到表达L-苏氨酸醛缩酶菌种BL21（DE3）/ pCDF-duet-TDC；
步骤3，培养S-TA的基因工程菌BL21（DE3）/ pGEX-6p-1-S-TA
挑取表达S-TA的基因工程菌BL21（DE3）/ pGEX-6p-1-S-TA的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6-0.8，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达L-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌BL21（DE3）/ pGEX-6p-1-S-TA；
步骤4，培养TDC的基因工程菌BL21（DE3）/ pCDF-duet-TDC
挑取表达TDC的基因工程菌BL21（DE3）/pCDF-duet-TDC的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.25mM-1mM的IPTG，15-30℃培养12-18小时，离心收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/ pCDF-duet-TDC；
步骤5，收集表达L-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌BL21（DE3）/ pGEX-6p-1-S-TA，用pH 6-11的PBS缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得L-苏氨酸醛缩酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；
步骤6，收集表达酪氨酸脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/ pCDF-duet-TDC，用pH 6-11的PBS缓冲液重悬，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得酪氨酸脱羧酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；
步骤7，选取3,4-二羟基苯甲醛作为底物，甘氨酸为辅底物，5-磷酸吡哆醛为辅因子，加入S-TA粗酶液、TDC粗酶液，再添加PBS缓冲溶液调节反应体系的pH至6-11,最后20-60℃反应0.5h-24h，其中，3,4-二羟基苯甲醛的终浓度为20-100mM/L、甘氨酸的终浓度为0.1-5M/L、5-磷酸吡哆醛的终浓度为1-100μm/L，S-TA粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/L，TDC粗酶液的蛋白浓度为0.1-10g/L；
步骤8，完成催化反应，加入等体积比1N稀盐酸，12000rpm离心2min，采用1ml注射器吸取离心得到的上清液，并用0.22 μm 滤膜除去杂质，将去除杂质的反应液注入1.5ml液相小瓶中，检测产物生成情况。
2.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，步骤3中加入IPTG的量为 0.5mM/L，诱导温度为18-30℃。
3.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，步骤4中加入IPTG的量为 0.5mM/L，诱导温度为20-33℃。
4.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，步骤5和步骤6中PBS缓冲液PBS缓冲液主要成分为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
5.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，步骤7中3,4-二羟基苯甲醛终浓度为60mM/L，甘氨酸终浓度为1M/L，5-磷酸吡哆醛终浓度为20μm/L。
6.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，步骤7中所加入S-TA粗酶液蛋白浓度为1g/L，加入TDC粗酶液蛋白浓度为6g/L。
7.根据权利要求1所述的一种双酶耦合合成去甲肾上腺素的方法，其特征在于，步骤7中该反应体系的反应温度30℃，反应pH为7.5。
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