CN115197303A - 一种s蛋白的受体结合结构域的突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及病毒学和免疫学领域。特别地，本申请涉及一种S蛋白的受体结合结构域(RBD)突变体及其应用。此外，本申请还涉及，包含所述突变体的药物组合物(例如疫苗)，制备所述突变体的方法。本申请提供了一种S蛋白的RBD的突变体，其能够诱发抗不同冠状病毒(例如，SARS‑CoV‑2，SARS‑CoV‑1)的保护性抗体，实现抗不同亚型的冠状病毒的保护作用。

Description

一种S蛋白的受体结合结构域的突变体及其应用
技术领域
本申请涉及病毒学和免疫学领域。特别地，本申请涉及一种S蛋白的受体结合结构域(RBD)的突变体及其应用。此外，本申请还涉及，包含所述突变体的药物组合物(例如疫苗)，制备所述突变体的方法，以及使用所述突变体来预防和/或治疗冠状病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)的方法。
背景技术
冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎，威胁人类生命健康。严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)属于冠状病毒，其感染宿主能够导致冠状病毒病肺炎(COVID-19)。
感染人类的冠状病毒(HCoV)有HCoV-OC43，HCoV-HKU1，HCoV-229E和HCoV-NL63以及高致病性MERS-CoV，SARS-CoV和SARS-CoV-2组成。进化树分析中，SARS-CoV-2与SARS-CoV序列高度相似，与高致病性的MERS-CoV以及导致地方性流行的HCoV-OC43和HCoV-HKU1同属于Beta冠状病毒属。目前，已经发生了三起导致严重综合症的HCoV感染(SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2)。并且，SARS-CoV-2在世界范围内出现了多种变体。尽管S蛋白中的D614G突变在易感细胞中显著促进了相应的变体感染性，但这种残基取代未能引起免疫逃逸。此外，许多结果表明，南非的主要SARS-CoV-2变异株B.1.351在RBD中具有许多关键的突变(包括K417N，E484K和N501Y)，会降低中和抗体的治疗效果，甚至导致基于原始SARS-CoV-2序列设计的SARS-CoV-2疫苗预防SARS-CoV-2变异株感染的能力显著降低。
SARS-CoV-2是一个含包膜的单链正义RNA病毒，基因组与SARS-CoV和一些蝙蝠冠状病毒高度同源。SARS-CoV-2含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。因此，通过干扰S蛋白与ACE2的结合就能中和病毒的感染。所以，S蛋白尤其是RBD区域是冠状病毒中和抗体的主要来源和识别区域，RBD蛋白是制备SARS-CoV-2疫苗的理想抗原。由于SARS-CoV-2RBD和SARS-CoV RBD表现出较高的氨基酸序列相似性，有理由推测两者之间存在保守性中和表位，并且得到多项研究的证明。
因此，基于SARS-CoV-2与SARS-CoV保守性抗原表位的通用型SARS-CoV-2疫苗，不仅可以提高我们对将来可能发生的冠状病毒大流风险的防范能力，也具有预防高致病性SARS-CoV-2变异株感染的潜力。
发明内容
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，通过对S蛋白的野生型RBD进行改造，使其具有N-连接的糖基链，获得的RBD突变体能够增强RBD蛋白诱发广谱的保护性抗体的能力，所诱发的保护性抗体能够识别多种冠状病毒(例如，SARS-CoV-2，SARS-CoV)，具有更加广谱的保护作用。基于此，本申请的发明人开发了一种RBD，其含有N-连接的糖基化基序(例如包含特征序列N-X-(S或T))，能够在体内诱导广谱的抗冠状病毒保护性抗体，能够在体内提供广谱的抗冠状病毒保护作用。
因此，在第一方面，本申请提供了一种S蛋白的受体结合结构域(Receptorbinding domain,RBD)的突变体，其具有N-糖基化基序。
在某些实施方案中，所述S蛋白的RBD的突变体与野生的S蛋白的RBD相比，具有一个或多个(例如，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，或更多个)N-糖基化基序(N-X-(S或T))；其中，N代表天冬酰胺，X代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸。
N-糖基化(N-linked glycosylation)是一种多肽的翻译后修饰，其是指，糖基链与多肽链中的特定天冬酰胺残基上的自由-NH2基相连接。N-糖基化过程通常在内质网(Endoplasmic reticulum，ER)和高尔基体(Golgi apparatus，GA)中进行。蛋白质/多肽的N-糖基化的方法是本领域常见的，可以参见，例如，Coligan等，(2000)Current Protocolsin Protein Science，第1-2卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY中描述的方法。
在某些实施方案中，所述RBD的突变体所具有的N-糖基化基序位于野生的RBD的第140位氨基酸残基、第157位氨基酸残基、第99位氨基酸残基、第103位氨基酸残基、第137位氨基酸残基、第169位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第172位氨基酸残基和/或第175位氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述RBD的突变体所具有的N-糖基化基序通过插入和/或置换的方式引入。在所述RBD的突变体中，发生N-连接的糖基化的氨基酸通常为特征序列N-X-(S或T)中的天冬酰胺(N)，其中N代表天冬酰胺，X代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸。因此，在某些优选的实施方案中，所述突变体与所述野生的RBD的区别至少在于，所述突变体包含特征序列N-X-(S或T)；其中，N代表天冬酰胺，X代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有以下突变：天冬酰胺插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第140位氨基酸残基，第157位氨基酸残基，第99位氨基酸残基、第103位氨基酸残基、第137位氨基酸残基、第169位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第172位氨基酸残基和/或第175位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有以下突变：用丝氨酸插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第142位氨基酸残基，第159氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有以下突变：用苏氨酸插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第142位氨基酸残基，第159位氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有以下突变：用N-X-S糖基化基序插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第140位氨基酸残基，第157位氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有以下突变：用N-X-T糖基化基序插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第140位氨基酸残基，第157位氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基。
在本文中，提及第140位氨基酸残基，其是指野生的RBD的第140位氨基酸残基，同理，提及第157位氨基酸残基，其是指野生的RBD的第157位氨基酸残基。因此，当糖基化基序同时插入第140位氨基酸残基以及第157位氨基酸残基时，仍以野生的RBD的第140位氨基酸残基和第157位氨基酸残基作为插入的位置。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第140位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第142位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第157位氨基酸残基；任选地，用苏氨酸置换野生的RBD的第159位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第99位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第101位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第103位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第105位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第137位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第139位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用苏氨酸置换野生的RBD的第171位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第171位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第173位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第172位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第174位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有下列突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第175位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第177位氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述RBD的突变体具有以下突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第140位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第142位氨基酸残基；以及，用天冬酰胺置换野生的RBD第157位氨基酸残基；任选地，用苏氨酸置换野生的RBD的第159位氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述置换为保守置换。本领域技术人员已知，可对蛋白质或多肽进行保守置换，而不显著影响或改变所述蛋白质或多肽的功能和性质。
将蛋白/多肽链中的某一氨基酸残基插入或置换为其他氨基酸残基的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变来对蛋白/多肽链中的任意氨基酸残基进行改造(例如，插入或置换)。
在某些优选的实施方案中，用于插入和/或置换野生的RBD的N-X-T和N-X-S糖基化基序的X可以为选自下列的一个或多个氨基酸残基：丙氨酸，甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，丝氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸和组氨酸。
在某些实施方案中，所述野生的RBD为野生的SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。
在某些实施方案中，所述野生的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述突变的RBD具有如SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8或9所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述突变的RBD具有一个或多个化学修饰或额外突变。
在某些实施方案中，如上所述的RBD突变体与野生的RBD相比，具有增加的分子量，可以通过本领域熟知的方法，例如，SDS-PAGE或质谱法，测定分子量的增加。
在某些实施方案中，这样的分子量增加是由于N-糖基化位点的利用，例如N-聚糖向RBD的添加。通过使用真核细胞或者改造的原核细胞表达系统可以实现蛋白/多肽链的N-聚糖的添加与修饰。
在第二方面，本申请提供了一种重组蛋白，其包含如前所述的RBD的突变体，以及额外的肽段，所述额外的肽段连接至所述突变体。
在某些实施方案中，所述额外的肽段直接与所述突变体连接，或者通过接头连接至所述突变体。在某些优选的实施方案中，所述额外的肽段通过接头连接至所述突变体。合适的现有技术接头可以由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。此外，还可使用其他接头，例如Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731；Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106；Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061；Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.中描述的接头。
在某些实施方案中，所述额外的肽段连接至所述突变体的N端或C端。
在某些实施方案中，所述重组蛋白包含至少1个，至少2个，至少3个，至少5个或更多个额外的肽段。
易于理解的是，这些肽段各自独立地可以以各种方式连接至所述突变体的任一末端(N端或C端)。例如，在某些优选的实施方案中，本发明的重组蛋白可以包含两个额外的肽段，其中，一个额外的肽段通过接头或者不通过接头连接至所述突变体的N端，并且，另一个额外的肽段通过接头或者不通过接头连接至所述突变体的C端。在某些优选的实施方案中，本发明的重组蛋白可以包含两个或者更多个额外的肽段，其中，所述两个或者更多个额外的肽段各自独立地通过接头或者不通过接头连接至所述突变体的N端或C端。在某些优选的实施方案中，当两个或者更多个额外的肽段连接至突变体的N端时，所述两个或者更多个额外的肽段可以以任何顺序串联，然后通过接头或者不通过接头连接至所述突变体的N端。类似地，在某些优选的实施方案中，当两个或者更多个额外的肽段连接至突变体的C端时，所述两个或者更多个额外的肽段可以以任何顺序串联，然后通过接头或者不通过接头连接至所述突变体的C端。
可根据实际需要来选择合适的额外的肽段。例如，在某些优选的实施方案中，额外的肽段可以为信号肽(例如，如SEQ ID NO:4所示的信号肽)。不受任何理论约束，通常认为，信号肽的使用可以促进重组蛋白的分泌，从而便于重组蛋白的回收。通常，此类信号肽可连接至突变体的N端。此外，在分泌过程中或者分泌之后，信号肽可被切除，产生期望的突变体或重组蛋白。
在某些实施方案中，所述额外的肽段选自信号肽，标签肽，折叠基序，可检测标记，以及其任何组合。
在某些实施方案中，所述信号肽连接至所述突变体的N端。在某些实施方案中，所述信号肽具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述折叠基序连接至所述突变体的C端。在某些实施方案中，所述折叠基序具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本申请涉及一种核酸分子，其包含或者由编码本发明的突变体或本发明的重组蛋白的核苷酸序列组成。在某些优选的实施方案中，本发明的核酸分子是分离的或经纯化的。
在另一个方面，本申请涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，转移载体，或表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。在一个优选实施方案中，所述载体能够在真核细胞(例如昆虫细胞)中表达本发明的突变体或本发明的重组蛋白。在一个优选实施方案中，所述载体为杆状病毒的转移载体，其能够与杆状病毒基因组DNA一起使用，实现本发明的突变体或本发明的重组蛋白在昆虫细胞中的表达。
在另一个方面，本发明还涉及包含如上所述的核酸分子或载体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是能够进行N-糖基化的细胞。N-糖基化是糖部分向N-X-S/T基序中的天冬酰胺残基上添加。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。不受任何理论约束，通常认为，真核细胞的使用有助于维持蛋白的正确构象，促进蛋白的折叠。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是真核细胞例如昆虫细胞。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是昆虫细胞，其包含含有上述核酸分子的杆状病毒转移载体，以及杆状病毒基因组DNA。
在另一个方面，本发明还涉及包含如上所述的核酸分子或载体的病毒(例如杆状病毒)。在某些优选的实施方案中，所述病毒为杆状病毒。
在另一个方面，本申请涉及一种多聚体，其包含多个本发明的突变体或者多个本发明的重组蛋白，或者由多个本发明的突变体或者多个本发明的重组蛋白组成。在某些优选的实施方案中，所述多聚体为三聚体。
在另一个方面，本申请还涉及包含上述突变体，或上述重组蛋白，或上述核酸分子，或上述载体，或上述宿主细胞，或上述病毒，或上述多聚体的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变体或重组蛋白。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的多聚体。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含野生的S蛋白的RBD。在某些优选的实施方案中，所述野生的S蛋白的RBD为野生的SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。在某些优选的实施方案中，所述野生的S蛋白的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物(例如疫苗)，其包含本发明的突变体或重组蛋白或者多聚体，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物(例如疫苗)可以用于预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病例如新型冠状病毒肺炎等。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含野生的S蛋白的RBD。在某些优选的实施方案中，所述野生的S蛋白的RBD为野生的SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。在某些优选的实施方案中，所述野生的S蛋白的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的突变体或重组蛋白或者多聚体以预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)还包含另外的活性成分。在某些优选的实施方案中，所述另外的活性成分能够预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)还包含佐剂，例如铝佐剂。在某些优选的实施方案中，所述方法还包括将野生的S蛋白的RBD与如前所述的突变体共同施用给所述受试者。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还包含药学可接受的载体，赋形剂，稳定剂或能够为所述药物组合物的施用(例如施用给人受试者)提供有利性质的其他试剂。合适的药物载体包括例如，无菌水，盐水，葡萄糖，蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物，液体酸，低级醇(例如C1-4醇)，油(例如玉米油，花生油，芝麻油；其任选还包含乳化剂例如脂肪酸的单-或二-甘油酯或磷脂例如卵磷脂)，乙二醇，聚亚烷基二醇，藻酸钠，聚(乙烯基吡咯烷酮)等等。所述载体任选地还可包含佐剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，渗透增强剂等。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物是无菌的。此外，所述药物组合的粘度可通过选择合适的溶剂或赋形剂来控制和维持。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物经配制具有4.5-9.0，5.0-8.0，6.5-7.5，或6.5-7.0的pH。
本发明的药物组合物(例如疫苗)可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)以单位剂量形式进行施用。
预防或治疗特定病况所需的本发明药物组合物(例如疫苗)的量将取决于施用途径、待治疗的病况的严重程度、患者的性别、年龄、体重和总体健康情况等等，其可由医生根据实际情况合理确定。
在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物(例如疫苗)还包含野生的RBD。在某些优选的实施方案中，所述野生的RBD为野生的SARS-CoV-2RBD。在某些优选的实施方案中，所述野生的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及一种在受试者中预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的方法，其包括将预防或治疗有效量的根据本发明的突变体或重组蛋白或者多聚体或者本发明的药物组合物施用给所述受试者。在某些优选的实施方案中，所述由冠状病毒感染所导致的疾病为新型冠状病毒肺炎。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。
在某些优选的实施方案中，所述冠状病毒选自人冠状病毒OC43株(HCoV-OC43)，人冠状病毒HKU1株(HCoV-HKU1)，人冠状病毒229E株(HCoV-229E)，人冠状病毒NL63株(HCoV-NL63)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法可用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒和SARS-CoV病毒的感染，以及与之相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
在另一个方面，本发明还涉及本发明的突变体或重组蛋白或者多聚体在制备药物组合物(例如疫苗)中的用途，所述药物组合物(例如疫苗)用于在受试者中预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病。在某些优选的实施方案中，所述冠状病毒选自人冠状病毒OC43株(HCoV-OC43)，人冠状病毒HKU1株(HCoV-HKU1)，人冠状病毒229E株(HCoV-229E)，人冠状病毒NL63株(HCoV-NL63)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在某些优选的实施方案中，所述由冠状病毒感染所导致的疾病为新型冠状病毒肺炎。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。
在另一个方面，本发明还涉及上述的突变体或重组蛋白或者多聚体，其用于在受试者中预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病。在某些优选的实施方案中，所述由冠状病毒感染所导致的疾病为新型冠状病毒肺炎。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。在某些优选的实施方案中，所述突变体或重组蛋白或多聚体用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒和SARS-CoV病毒的感染以及与之相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
在另一个方面，本发明涉及一种制备上述突变体或重组蛋白的方法，其包括，在允许所述突变体或重组蛋白表达的条件下，培养本发明的宿主细胞或病毒；和，回收所表达的突变体或重组蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括：将本发明的载体(例如表达载体)导入宿主细胞(例如真核细胞)，从而在宿主细胞中表达所述突变体或重组蛋白；以及，回收所表达的突变体或重组蛋白。在某些优选的实施方案中，所述方法包括：将含有上述核酸分子的杆状病毒转移载体以及杆状病毒基因组DNA导入昆虫细胞，从而在昆虫细胞中表达所述突变体或重组蛋白；以及，回收所表达的突变体或重组蛋白。
在另一个方面，本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的突变体或重组蛋白或者多聚体与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合佐剂例如铝佐剂，和/或另外的活性成分，例如能够预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的另外的活性成分。在某些优选的实施方案中，所述制备疫苗的方法包括下述步骤：将本发明的突变体或重组蛋白或者多聚体与佐剂(例如铝佐剂)混合。
如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病例如新型冠状病毒肺炎。
在另一个方面，本发明还涉及N-糖基化的RBD突变体，其包含如前所述的突变体或如前所述的重组蛋白，其已经被一个或多个N-聚糖糖基化，其中，所述N-聚糖已经连接到所述人RBD突变体中的一个或多个N-糖基化基序上。
在另一个方面，本发明还涉及一种制备如前所述的突变体的方法，所述方法包括，在允许所述突变体表达的条件下，将编码如前所述的突变体的核酸转染入能进行N-糖基化的细胞，和，回收所表达的突变体。
在另一个方面，本发明还涉及制备如前所述的药物组合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在能进行N-糖基化的宿主细胞中表达如前所述的核酸分子或如前所述的载体；
(b)纯化N-糖基化的S蛋白的RBD突变体；
在某些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：
(c)在宿主细胞中表达编码野生的S蛋白的RBD的核苷酸序列；
(d)纯化所述野生的S蛋白的RBD；
(e)混合步骤(b)的产物和步骤(d)的产物；
任选地，制备药学上可接受的载体和/或赋形剂，并与步骤(e)获得的产物混合。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“天然的RBD”、“野生的RBD”“野生的S蛋白的RBD”是指具有生物学活性的、天然存在的S蛋白的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)，它们具有相同的含义，且可互换使用。可方便地从各种公共数据库(例如，GenBank数据库)获得天然S蛋白的RBD或野生的S蛋白的RBD的氨基酸序列。
如本文中所使用的，当提及野生的RBD的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生的RBD的第140位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：1所示的第140位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生的RBD可具有多种版本，它们具有基本上相同的一级结构(即，氨基酸序列)和高级结构(即，空间结构)，以及基本上相同的生物学功能，但是它们彼此之间在氨基酸序列上仍然可以存在微小差异。因此，在本申请中，野生的RBD并不局限于SEQ ID NO：1所示的蛋白，而意欲涵盖所有已知的野生的RBD。因此，在本申请中，术语“野生的RBD”应包括各种天然存在的、具有生物学功能的RBD，包括例如SEQ ID NO：1所示的野生的RBD以及其天然存在的变体。并且，当描述RBD的氨基酸位置时，其不仅包括SEQ ID NO：1中的特定氨基酸位置，还包括其天然变体中与所述特定氨基酸位置对应的氨基酸位置。例如，表述“野生的RBD的第140位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第140位氨基酸残基，以及其天然变体中的相应氨基酸位置。根据本申请，表述“相应氨基酸位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的氨基酸位置。类似地，表述“对应于SEQ ID NO:1的第140位的位置”是指，当对某一序列与SEQ ID NO:1进行最优比对时，即当某一序列与SEQ ID NO:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的该序列中位于与SEQ ID NO:1的第140位等同位置的氨基酸位置。
在某些优选的实施方案中，野生的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，野生的RBD是天然存在的、具有生物学功能的受体结合结构域，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同一性。在某些优选的实施方案中，野生的RBD是天然存在的、具有生物学功能的受体结合结构域，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的，术语“表面刺突蛋白”、“S蛋白”和“Spike蛋白”具有相同的含义，可互换使用。其是指一种病毒膜融合蛋白。冠状病毒的S蛋白能够组合成一个三聚体，约含有1300个氨基酸。S蛋白含有两个亚基(subunit)，S1和S2。其中，S1主要包含有受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见各类公开的数据库，例如NCBI数据库。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文中所使用的，术语“严重急性呼吸综合征冠状病毒1(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 1，SARS-CoV-1)”，也称为SARS-CoV，其属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-1的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：ABF65836.1。由SARS-CoV-1所导致的肺炎被称为SARS。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“多聚体”是指，以多肽分子(例如，本发明的突变体或重组蛋白)为单体构成的聚合体，其通常可包含至少2个(例如，3个，4个，5个或更多个)多肽单体(例如，本发明的突变体或重组蛋白)。在此类多聚体中，单体分子通过分子间相互作用(例如氢键、范德华力、疏水相互作用)而聚合形成多聚体。在本发明的某些实施方案中，多聚体是包含3个单体的三聚体。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“N-糖基化基序”是指，能够发生N-连接的糖基化的特征性基序N-X-(S或T)，其中，N代表天冬酰胺，X代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸。
如本文中所使用的，术语“保护性抗体”是指，具有抵抗病毒的保护性作用的抗体。保护性抗体包括但不限于，能够中和病毒毒力的抗体，能够抑制病毒识别并结合宿主细胞的抗体，以及能够抑制病毒与宿主细胞融合的抗体。
如本文中所使用的，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。在本发明中，特别优选地，佐剂为铝佐剂。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防或治疗疾病(例如冠状病毒感染)有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟疾病(例如冠状病毒感染)的发生、或缓解、减轻或治疗已有的疾病(例如由冠状病毒感染所导致的疾病)的严重程度的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
如本文中所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，“受试者”是指动物，例如脊椎动物。在某些实施方案中，受试者为哺乳动物，例如人，牛科动物，马科动物，猫科动物，犬科动物，啮齿类动物或灵长类动物。特别优选地，受试者为人。在本文中，该术语可以与“患者”互换使用。
如本文中所使用的，“N-糖基化的RBD突变体”是指具有一个或多个共价附接的聚糖部分的RBD突变体。如本文中所使用的，“聚糖”或“聚糖部分”是指糖苷连接的单糖。聚糖通常通过与天冬酰胺的自由的NH2基连接于突变体上。蛋白质的N-糖基化的方法是本领域常见的，可以参见，例如，Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science，第1-2卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY。
发明的有益效果
本申请提供了一种S蛋白的RBD的突变体，其能够诱发抗不同冠状病毒(例如，SARS-CoV-2，SARS-CoV-1)的保护性抗体，实现抗不同亚型的冠状病毒的保护作用，并因此可用作能够抗多种(例如2种、3种或更多种亚型)冠状病毒的广谱疫苗，用于预防和/或治疗多种(例如2种、3种或更多种亚型)冠状病毒的感染以及与所述感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。并且，本申请的S蛋白的RBD的突变体与野生型S蛋白的RBD相比，其诱发产生的抗不同冠状病毒(例如，SARS-CoV-2，SARS-CoV-1)的保护性抗体的概率大大提高。
由此，本申请提供了一种广谱冠状病毒疫苗，其能够提供针对多种冠状病毒(例如，SARS-CoV-2，SARS-CoV-1)的交叉保护作用，并且免疫效果理想，不易由于冠状病毒变异而快速失效，从而克服了现有冠状病毒疫苗因病毒频繁变异而导致的免疫效力丧失、免疫效果不理想等缺点。因此，本申请的广谱冠状病毒疫苗与现有的疫苗相比，具有特别显著的优势。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了野生的SARS-CoV-2RBD(RBDwt)和突变的SARS-CoV-2RBD(RBDGlycan458,475)的结构示意图，其中，458为RBDGlycan458,475上第140位氨基酸残基的糖基化修饰位点，475为RBDGlycan458,475上第157位氨基酸残基的糖基化修饰位点。
图2显示了两种重组蛋白的构建示意图，其中，重组RBDwt蛋白包括信号肽，RBDwt，连接序列(GSGS)和小鼠IgG2a亚型抗体重链CH2-3；重组RBDGlycan458,475蛋白包括信号肽，RBDGlycan458,475，连接序列(GSGS)和小鼠IgG2a亚型抗体重链CH2-3。
图3显示了RBDwt和RBDGlycan458,475的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中，第一泳道为marker，第二泳道为RBDwt，第三泳道为RBDGlycan458,475。
图4显示了7种SARS-CoV-2抗体分别与RBDwt和RBDGlycan458,475的结合情况。
图5显示了RBDwt和RBDGlycan458,475免疫小鼠后血清中产生的抗体的滴度，其中，图5A为抗体和SARS-CoV的S蛋白以及SARS-CoV-2的S蛋白的滴度，图5B为RBDwt和RBDGlycan458,475免疫小鼠后产生的交叉抗体(即，能够同时结合SARS-CoV和SARS-CoV-2的抗体)的概率。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0003578029830000221
Figure BDA0003578029830000231
Figure BDA0003578029830000241
Figure BDA0003578029830000251
Figure BDA0003578029830000261
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.糖基化修饰的SARS-CoV-2RBD蛋白的制备
1.分子克隆设计
自GeneBank数据库获得SARS-CoV-2 Spike蛋白氨基酸序列(GenBank ID:MN908947.3)，该氨基酸序列中R319-L518区段为本研究中的SARS-CoV-2RBD蛋白氨基酸序列(简称RBDwt)，RBDwt的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。糖基化的氨基酸特征序列为，N-X-S或T(其中，N为天冬酰胺Asn，X代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸，S为丝氨酸Ser，T为苏氨酸Thr)。对RBDwt蛋白分别进行突变，共制备了8种突变体，具体如下：
(1)将SEQ ID NO:1的第140位氨基酸K突变为N，第142位氨基酸N突变为T，第157位氨基酸A突变为N，第159位氨基酸S突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan458,475(简称RBDGlycan458,475)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。相较于RBDwt，RBDGlycan458,475会在第140位和157位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(2)将SEQ ID NO:1的第99位氨基酸K突变为N，第101位氨基酸A突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan417(简称RBDGlycan417)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。相较于RBDwt，RBDGlycan417会在第99位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(3)将SEQ ID NO:1的第103位氨基酸Y突变为N，第105位氨基酸Y突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan421(简称RBDGlycan421)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。相较于RBDwt，RBDGlycan421会在第103位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(4)将SEQ ID NO:1的第137位氨基酸L突变为N，第139位氨基酸R突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan455(简称RBDGlycan455)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。相较于RBDwt，RBDGlycan455会在第137位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(5)将SEQ ID NO:1的第171位氨基酸Y突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan487(简称RBDGlycan487)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。相较于RBDwt，RBDGlycan487会在第169位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(6)将SEQ ID NO:1的第171位氨基酸Y突变为N，第173位氨基酸P突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan489(简称RBDGlycan489)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。相较于RBDwt，RBDGlycan489会在第171位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(7)将SEQ ID NO:1的第172位氨基酸F突变为N，第174位氨基酸L突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan490(简称RBDGlycan490)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。相较于RBDwt，RBDGlycan490会在第172位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位；
(8)将SEQ ID NO:1的第175位氨基酸Q突变为N，第177位氨基酸Y突变为T，突变后的蛋白命名为SARS-CoV-2RBDGlycan493(简称RBDGlycan493)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。相较于RBDwt，RBDGlycan493会在第175位天冬酰胺处进行糖基化修饰，遮蔽相应关键表位。
2.蛋白表达克隆的构建
通过编码GSGS氨基酸的核苷酸序列分别将编码9种RBD蛋白(RBDwt和上述8种突变体)的核苷酸序列与编码小鼠IgG2a亚型抗体重链CH2-3(氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)的核苷酸序列进行连接，并且，分别在编码RBDwt和上述8种突变体的核苷酸序列的5’端引入编码信号肽(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列，以构建融合表达基因。其中，图2显示了RBDwt和RBDGlycan458,475的连接示意图。通过通用生物系统(安徽)有限公司的技术服务，把所述基因合成至真核表达载体pTT5的多克隆位点上。带有目的基因的载体粉末用50μl双蒸水溶解，取1μl加入100μl TOP10感受态细胞中(大肠杆菌)。样品冰上孵育30min，42℃热击30sec，冰上孵育2min。然后把反应后的大肠杆菌加入LB培养基中，并铺到含有氨苄抗性的琼脂糖培养基平板中进行培养。待菌落长出后，挑取单克隆菌落，质粒用GenEluteTM质粒小量制备试剂盒(厂家：Sigma；目录号：PLN350-1KT)提取备用。
3.蛋白的表达和纯化
准备处于对数生长期的悬浮细胞ExpiCHOTM，将其置于125rpm，37℃，8％CO2的细胞摇床进行培养，至密度为6×106个/mL，活细胞率>98％。取25mL细胞置于新的细胞培养瓶中，作为一个转染体系。A管：1mL ExpiCHOTM Expresssion Medium中包含25μg质粒，B管：1mLExpiCHOTM Expresssion Medium中包含80μL ExpiFectamine TM CHO Transfection Kit(厂家：Thermo Scientific；目录号：A29129)中的转染试剂。将A管与B管混合，室温静置2min，2min后将混合液倒入25mL准备好的转染细胞体系中。置于125rpm，37℃，8％CO2细胞摇床进行培养18-22h。每瓶加入ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit中的150μL增强剂以及4mL辅料，置于125rpm，32℃，5％CO2的细胞摇床培养8-15d。培养完成后，4℃，4000rpm离心10min，收集细胞上清。
用0.22μm滤器过滤上述上清。打开AKTA仪器，先分别用A液(200mM十二水合磷酸氢二钠)和B液(100mM一水柠檬酸)冲洗A管道和B管道，装上protein A柱子。用A液以8mL/min的流速平衡protein A柱子15min以上，待仪器检测的UV值、pH值和电导率稳定后进行下一步。以6-10ml/min流速上样，随后UV值会上升，该峰为穿透峰，并继续用A液洗柱，同时收集穿透峰样品待检测。待pH值不再变化后用B液以6-10ml/min流速进液，随后pH值下降，UV值上升，该峰为洗脱峰，抗体主要存在于洗脱峰中。收取洗脱峰样品待检测。用A液平衡柱子，再用20％乙醇充满管道和protein A柱子，取下柱子，4℃保存。将穿透峰和洗脱峰的样品进行纯化，并进行SDS–PAGE鉴定(对样品进行沸水煮5min，可以使抗体重链和轻链间的二硫键打开，见《分子克隆实验指南》第二版)。纯化的单克隆抗体用20mM PBS缓冲液透析过夜，并采用紫外分光或者BCA测取浓度，分装至1.5ml管中，存放于-20℃备用。
实施例2.聚丙烯酰氨凝胶电泳分析
聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)实验用来分析本专利中的SARS-CoV-2RBDwt和上述8种突变体的分子质量。上层胶为5％的浓缩胶(3.4ml水，加入830μl 30％的丙烯酰胺，加入630μl 1M Tris(pH6.8)，加入50μl 10％的SDS，加入50μl 10％的过硫酸铵和5μlTEMED)。下层胶为12％的分离胶(3.3ml水，加入4ml 30％丙烯酰胺，加入2.5ml 1M Tris(pH8.8)，加入100μl 10％SDS,加入100μl10％的过硫酸铵和10μl TEMED)。样品在150V电压下进行电泳2小时。电泳后，SDS-PAGE凝胶用0.25％的考马斯亮蓝(Sigma)染色过夜。之后，用脱色缓冲液进行脱色(300ml甲醇，100ml乙酸和600ml双蒸水)。
结果分析：糖基化修饰后的8种突变体(RBDGlycan458,475、RBDGlycan417、RBDGlycan421、RBDGlycan455、RBDGlycan487、RBDGlycan489、RBDGlycan490和RBDGlycan493)的分子量均大于RBDwt蛋白。其中，图3显示了RBDwt和RBDGlycan458,475的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
实施例3.糖基化修饰的突变体的表位特征分析
将RBDwt和8种突变体用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释制备包被液，终浓度为0.5μg/mL。在96孔酶标板的每孔中加入100μL的包被液，4℃包被16小时后，再37℃包被2小时。用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，37℃条件下封闭2小时，弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋4℃保存备用。
取识别不同表位的人源SARS-CoV-2RBD特异的单克隆抗体3C11、5C4、6G3、6H7、4D10、6G9及5C6(其中，7种抗体的VH和VL序列分别如表1中的SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:30所示，7种抗体具有相同的重链恒定区，具体序列如SEQ ID NO:31所示，7种抗体具有相同的轻链恒定区，具体序列如SEQ ID NO:32所示)。以PBS溶液从100μg/ml为起始浓度开始5倍梯度稀释，共稀释8个梯度。取已包被的酶标板，每孔加入100μl已稀释的抗体样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入50μl TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入50μl终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。
结果分析：检测结果显示，经糖基化修饰的8种突变体与部分单克隆抗体的结合能力下降，证明这些突变体中糖基化修饰的位点能够有效的遮蔽部分单克隆抗体所识别的SARS-CoV-2特异性表位。
图4显示的是7种SARS-CoV-2抗体分别与RBDwt和RBDGlycan458,475的结合情况。其中，6G3、4D10、5C6、6G9和6H7的结合活性并未受到糖基化修饰的显著影响。然而，其与3C11和5C4的结合能力显著下降，不足1％。该结果说明RBDwt蛋白的第140位和第150位氨基酸残基的糖基化修饰能够有效的遮蔽单克隆抗体3C11和5C4所识别的SARS-CoV-2特异性表位。
实施例4.糖基化修饰的突变体的诱导交叉结合抗体应答能力分析
1.小鼠免疫实验
6周龄雌性Balb/C小鼠由厦门大学实验动物中心提供，体重约为20g。免疫方案为将RBDwt和8种突变体分别与铝佐剂按1:1的体积比混合，用于免疫小鼠。每组为3只小鼠，免疫方式为肌肉注射，免疫剂量为20μg蛋白/只小鼠，免疫一针，免疫14天后，采集小鼠血清，血清样本在56℃下灭活30分钟，放置于-20℃保存备用。
2.血清中SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白特异性抗体滴度评估
参考SARS-CoV-2和SARS-CoV的序列(Genbank ID:MN908947.3和ABF65836.1)，选取编码S蛋白的第15位至第1213位氨基酸的核苷酸序列(SARS-CoV-2 S蛋白的胞外段第15-1213位氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，SARS-CoV S蛋白的胞外段第15-1213位氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)，然后，分别在SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的C端添加包含凝血酶折叠序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，T4三聚化原件(氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)和His纯化标签的(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)肽段。并且，将SARS-CoV-2 S蛋白(GenBank ID:MN908947.3)的第682位氨基酸至第685位氨基酸替换为“AGAG”，第986位氨基酸至第987位氨基酸用替换为“PP”。将编码上述两种蛋白的核苷酸序列克隆至杆状病毒昆虫表达载体pAcgp67B上，进行重组杆状病毒制备，利用载体上的信号肽在昆虫细胞中进行分泌表达，利用亲和层析纯化获得改造的SARS-CoV-2 S蛋白和SARS-CoV S蛋白。
将改造的SARS-CoV-2 S蛋白和SARS-CoV S蛋白用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为0.5μg/ml。在96孔酶标板的每孔中加入100μl的包被液，4℃包被16小时后，再在37℃包被2小时。用PBST洗涤液(20mMPB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时，弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋4℃保存备用。
对待检测血清进行2倍梯度稀释，共稀释12个梯度。取已包被SARS-CoV-2 S蛋白或SARS-CoV S蛋白的酶标板，每孔加入100μl已稀释的血清样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入50μl TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入50μl终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值，计算血清SARS-CoV-2 S蛋白或SARS-CoV S蛋白特异性抗体滴度。
结果分析：RBDwt和8种突变体免疫后均可诱导小鼠体内特异性抗体应答，在免疫后两周均出现血清SARS-CoV-2 S蛋白和SARS-CoV S蛋白特异性抗体阳转。并且，8种突变体诱导的血清SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体滴度较高，与RBDwt无显著差异，血清SARS-CoV S蛋白特异性抗体滴度也较高，与RBDwt无显著差异。根据公式：(SARS-CoV S蛋白特异性抗体滴度/SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体滴度)×100％；对血清交叉结合抗体比例进行分析。分析结果显示，8种突变体诱导产生的特异性抗体中交叉结合抗体的概率均远高于RBDwt的3.65％。说明改造后具有糖基化修饰的突变体具有更强的诱导广谱抗体产生的能力。由此可见，这8种突变体特别适合用作广谱疫苗，用于在体内诱发具有广谱中和活性的保护性抗体。
图5A显示了RBDwt和RBDGlycan458,475免疫小鼠后血清中产生的抗体的滴度，RBDGlycan458,475诱导的血清SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体滴度较高，与RBDwt无显著差异，RBDGlycan458,475诱导的血清SARS-CoV S蛋白特异性抗体滴度也较高，与RBDwt无显著差异。通过公式计算得出，SARS-CoV-2RBDGlycan458,475诱导产生的特异性抗体中33.33％为交叉结合抗体，远高于RBDwt的3.65％(图5B)，说明改造后具有糖基化修饰的RBDGlycan458,475蛋白具有更强的诱导广谱抗体产生的能力。由此可见，RBDGlycan458,475特别适合用作广谱疫苗，用于在体内诱发具有广谱中和活性的保护性抗体。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学；厦门万泰沧海生物技术有限公司
<120> 一种S蛋白的受体结合结构域的突变体及其应用
<130> IDC220138
<150> 202110363090.0
<151> 2021-04-02
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
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Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Thr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
195 200
<210> 7
<211> 200
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBDGlycan489的氨基酸序列
<400> 7
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Asn Phe Thr Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
195 200
<210> 8
<211> 200
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBDGlycan490的氨基酸序列
<400> 8
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Asn Pro Thr Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
195 200
<210> 9
<211> 200
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBDGlycan493的氨基酸序列
<400> 9
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Asn Ser
165 170 175
Thr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
195 200
<210> 10
<211> 235
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 小鼠IgG2a亚型抗体重链CH2-3序列
<400> 10
Ser Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser
50 55 60
Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His
65 70 75 80
Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile
85 90 95
Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
100 105 110
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
115 120 125
Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu
130 135 140
Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
145 150 155 160
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
165 170 175
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
180 185 190
Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg
195 200 205
Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His
210 215 220
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 信号肽的氨基酸序列
<400> 11
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 12
<211> 1199
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S蛋白的胞外段第15-1213位氨基酸序列
<400> 12
Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn
1 5 10 15
Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser
20 25 30
Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val
35 40 45
Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg
50 55 60
Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser
65 70 75 80
Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu
85 90 95
Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val
100 105 110
Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly
115 120 125
Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro
145 150 155 160
Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg
165 170 175
Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys
180 185 190
His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala
195 200 205
Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe
210 215 220
Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu
245 250 255
Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr
260 265 270
Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr
275 280 285
Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe
290 295 300
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
305 310 315 320
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
325 330 335
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
340 345 350
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
355 360 365
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
370 375 380
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
385 390 395 400
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
405 410 415
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
420 425 430
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
435 440 445
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
450 455 460
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
465 470 475 480
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
485 490 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
500 505 510
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
515 520 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
530 535 540
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
545 550 555 560
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
565 570 575
Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn
580 585 590
Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val
595 600 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr
610 615 620
Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625 630 635 640
His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
645 650 655
Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser
660 665 670
Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu
675 680 685
Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe
690 695 700
Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr
705 710 715 720
Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser
725 730 735
Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala
740 745 750
Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe
755 760 765
Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly
770 775 780
Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys
785 790 795 800
Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp
805 810 815
Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala
820 825 830
Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro
835 840 845
Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu
850 855 860
Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu
865 870 875 880
Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly
885 890 895
Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln
900 905 910
Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala
915 920 925
Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala
930 935 940
Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser
945 950 955 960
Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu
965 970 975
Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr
980 985 990
Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala
995 1000 1005
Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
1010 1015 1020
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe
1025 1030 1035
Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr
1040 1045 1050
Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys
1055 1060 1065
His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser
1070 1075 1080
Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro
1085 1090 1095
Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp
1100 1105 1110
Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln
1115 1120 1125
Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys
1130 1135 1140
Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile
1145 1150 1155
Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn
1160 1165 1170
Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
1175 1180 1185
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
1190 1195
<210> 13
<211> 1199
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> SARS-CoV S蛋白的胞外段第15-1213位氨基酸序列
<400> 13
Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile
20 25 30
Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn
50 55 60
Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys
85 90 95
Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg
100 105 110
Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys
115 120 125
Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn
130 135 140
Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu
145 150 155 160
Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys
165 170 175
Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val
180 185 190
Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu
195 200 205
Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe
210 215 220
Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val
225 230 235 240
Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly
245 250 255
Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu
260 265 270
Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr
275 280 285
Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn
290 295 300
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe
305 310 315 320
Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala
325 330 335
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys
340 345 350
Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val
355 360 365
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala
370 375 380
Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
385 390 395 400
Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala
405 410 415
Thr Ser Thr Gly Asn His Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly
420 425 430
Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro
435 440 445
Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu
450 455 460
Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr
465 470 475 480
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val
485 490 495
Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn
500 505 510
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser
515 520 525
Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe
530 535 540
Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser
545 550 555 560
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala
565 570 575
Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val
580 585 590
Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr
595 600 605
Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly
610 615 620
Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
625 630 635 640
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser
645 650 655
Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser
660 665 670
Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile
675 680 685
Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val
690 695 700
Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu
705 710 715 720
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser
725 730 735
Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln
740 745 750
Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe
755 760 765
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser
770 775 780
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
785 790 795 800
Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp
805 810 815
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
820 825 830
Leu Thr Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly
835 840 845
Thr Ala Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
850 855 860
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
865 870 875 880
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn
885 890 895
Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala
900 905 910
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
915 920 925
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
930 935 940
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
945 950 955 960
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
965 970 975
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
980 985 990
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
995 1000 1005
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala
1010 1015 1020
Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser
1025 1030 1035
Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly
1040 1045 1050
Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr
1055 1060 1065
Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile
1070 1075 1080
Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile
1085 1090 1095
Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu
1100 1105 1110
Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr
1115 1120 1125
Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser
1130 1135 1140
Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala
1145 1150 1155
Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys
1160 1165 1170
Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe
1175 1180 1185
Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr
1190 1195
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 包含凝血酶折叠序列
<400> 14
Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 15
<211> 29
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> T4三聚化原件
<400> 15
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Ser
20 25
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> His纯化标签的肽段
<400> 16
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11 VH
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Val Ala Ser Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 3C11 VL
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C4 VH
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Val Val Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C4 VL
<400> 20
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Asp Ser Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 129
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G3 VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ile Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asn Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Tyr Val Gly Gly Val Cys Ser Gly Gly Arg Cys Tyr Asp
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G3 VL
<400> 22
His Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Val Pro Ile Ser Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Thr Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 23
<211> 123
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 4D10 VH
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Leu Trp Phe Gly Glu Phe Ser Glu Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 4D10 VL
<400> 24
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Arg Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 25
<211> 123
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6H7 VH
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Tyr Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro His Asn Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6H7 VL
<400> 26
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 27
<211> 127
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9 VH
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ile Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Pro Tyr Asn Trp Asn Gly Pro Leu Arg Ser Gln
100 105 110
Arg Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 6G9 VL
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6 VH
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Met Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Gly Ser Ser Ser Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 5C6 VL
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Tyr
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 330
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人源抗体重链恒定区氨基酸序列
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人源抗体轻链恒定区氨基酸序列
<400> 32
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (15)

1.一种S蛋白的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)的突变体，其具有N-糖基化基序；
优选地，所述S蛋白的RBD的突变体与野生的S蛋白的RBD相比，具有一个或多个(例如，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，或更多个)N-糖基化基序(N-X-(S或T))；其中，N代表天冬酰胺，X代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸；
优选地，所述RBD的突变体所具有的N-糖基化基序位于野生的RBD的第140位氨基酸残基、第157位氨基酸残基、第99位氨基酸残基、第103位氨基酸残基、第137位氨基酸残基、第169位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第172位氨基酸残基和/或第175位氨基酸残基；
优选地，所述RBD的突变体所具有的N-糖基化基序通过插入和/或置换的方式引入；
优选地，所述RBD的突变体具有选自下列的一项或多项突变：
(1)天冬酰胺插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第140位氨基酸残基，第157位氨基酸残基，第99位氨基酸残基、第103位氨基酸残基、第137位氨基酸残基、第169位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第172位氨基酸残基或第175位氨基酸残基；
(2)用苏氨酸插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第142位氨基酸残基，第159氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基；
(3)用丝氨酸插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第142位氨基酸残基，第159位氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基；
(4)用N-X-T糖基化基序插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第140位氨基酸残基，第157位氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基；
(5)用N-X-S糖基化基序插入和/或置换野生的RBD的以下氨基酸残基中的至少一个：第140位氨基酸残基，第157位氨基酸残基，第101位氨基酸残基、第105位氨基酸残基、第139位氨基酸残基、第171位氨基酸残基、第173位氨基酸残基、第174位氨基酸残基或第177位氨基酸残基；
优选地，所述RBD的突变体具有选自下列的一项或多项突变：
(1)用天冬酰胺置换野生的RBD第140位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第142位氨基酸残基；
(2)用天冬酰胺置换野生的RBD第157位氨基酸残基；任选地，用苏氨酸置换野生的RBD的第159位氨基酸残基；
(3)用天冬酰胺置换野生的RBD第99位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第101位氨基酸残基；
(4)用天冬酰胺置换野生的RBD第103位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第105位氨基酸残基；
(5)用天冬酰胺置换野生的RBD第137位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第139位氨基酸残基；
(6)用苏氨酸置换野生的RBD的第171位氨基酸残基；
(7)用天冬酰胺置换野生的RBD第171位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第173位氨基酸残基；
(8)用天冬酰胺置换野生的RBD第172位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第174位氨基酸残基；
(9)用天冬酰胺置换野生的RBD第175位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第177位氨基酸残基；
优选地，所述RBD的突变体具有以下突变：用天冬酰胺置换野生的RBD第140位氨基酸残基和用苏氨酸置换野生的RBD的第142位氨基酸残基；以及，用天冬酰胺置换野生的RBD第157位氨基酸残基；任选地，用苏氨酸置换野生的RBD的第159位氨基酸残基；
优选地，所述置换为保守置换；
优选地，所述野生的RBD为野生的SARS-CoV-2的S蛋白的RBD；
优选地，所述野生的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述突变的RBD具有如SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8或9所示的氨基酸序列；
优选地，所述突变的RBD具有一个或多个化学修饰或额外突变。
2.一种重组蛋白，其包含权利要求1的RBD的突变体，以及额外的肽段，所述额外的肽段连接至所述突变体；
优选地，所述额外的肽段直接与所述突变体连接，或者通过接头连接至所述突变体；
优选地，所述额外的肽段连接至所述突变体的N端或C端；
优选地，所述重组蛋白包含至少1个，至少2个，至少3个，至少5个或更多个额外的肽段；
优选地，所述额外的肽段选自信号肽，标签肽，折叠基序，可检测标记，以及其任何组合；
优选地，所述信号肽连接至所述突变体的N端；进一步优选地，所述信号肽具有如SEQID NO:4所示的氨基酸序列；
优选地，所述折叠基序连接至所述突变体的C端；进一步优选地，所述折叠基序具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
3.一种核酸分子，其包含或者由编码权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白的核苷酸序列组成。
4.一种载体，其包含权利要求3的核酸分子。
5.一种宿主细胞或病毒(例如冠状病毒)，其包含权利要求3的核酸分子或权利要求4的载体。
6.一种多聚体，其包含多个权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白，或者由多个权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白组成；
优选地，所述多聚体为三聚体。
7.一种组合物，其包含权利要求1的突变体，或权利要求2的重组蛋白，或权利要求3的核酸分子，或权利要求4的载体，或权利要求5的宿主细胞或病毒，或权利要求6的多聚体；
优选地，所述药物组合物还包含野生的S蛋白的RBD；
优选地，所述野生的S蛋白的RBD为野生的SARS-CoV-2的S蛋白的RBD；
优选地，所述野生的S蛋白的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
8.一种药物组合物(例如疫苗)，其包含权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白或权利要求6的多聚体，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物还包含野生的S蛋白的RBD；
优选地，所述野生的S蛋白的RBD为野生的SARS-CoV-2的S蛋白的RBD；
优选地，所述野生的S蛋白的RBD具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
9.一种在受试者中预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的方法，其包括将预防或治疗有效量的权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白或权利要求6的多聚体或者权利要求8的药物组合物施用给所述受试者；
优选地，所述冠状病毒选自人冠状病毒OC43株(HCoV-OC43)，人冠状病毒HKU1株(HCoV-HKU1)，人冠状病毒229E株(HCoV-229E)，人冠状病毒NL63株(HCoV-NL63)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)；
优选地，所述由冠状病毒感染所导致的疾病为肺炎(例如，新型冠状病毒肺炎)；
优选地，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人；
优选地，所述方法还包括将野生的S蛋白的RBD与权利要求1的突变体共同施用给所述受试者。
10.权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白或权利要求6的多聚体在制备药物组合物(例如疫苗)中的用途，所述药物组合物(例如疫苗)用于在受试者中预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病；
优选地，所述冠状病毒选自人冠状病毒OC43株(HCoV-OC43)，人冠状病毒HKU1株(HCoV-HKU1)，人冠状病毒229E株(HCoV-229E)，人冠状病毒NL63株(HCoV-NL63)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)；
优选地，所述由冠状病毒感染所导致的疾病为肺炎(例如，新型冠状病毒肺炎)；
优选地，所述受试者是哺乳动物，例如小鼠和人。
11.一种制备权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白的方法，其包括，在允许所述突变体或重组蛋白表达的条件下，培养权利要求5的宿主细胞或病毒；和，回收所表达的突变体或重组蛋白。
12.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白或权利要求6的多聚体与药学可接受的载体和/或赋形剂混合；任选地，所述方法还包括，混合佐剂例如铝佐剂，和/或另外的活性成分，例如能够预防或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的另外的活性成分。
13.N-糖基化的RBD突变体，其包含权利要求1的突变体或权利要求2的重组蛋白，其已经被一个或多个N-聚糖糖基化，其中，所述N-聚糖已经连接到所述人RBD突变体中的一个或多个N-糖基化基序上。
14.一种制备权利要求13的突变体的方法，所述方法包括，在允许所述突变体表达的条件下，将编码权利要求13的突变体的核酸转染入能进行N-糖基化的细胞，和，回收所表达的突变体。
15.制备权利要求8的药物组合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在能进行N-糖基化的宿主细胞中表达权利要求3的核酸分子或权利要求4的载体；
(b)纯化N-糖基化的S蛋白的RBD突变体；
优选地，所述方法还包括如下步骤：
(c)在宿主细胞中表达编码野生的S蛋白的RBD的核苷酸序列；
(d)纯化所述野生的S蛋白的RBD；
(e)混合步骤(b)的产物和步骤(d)的产物；
任选地，制备药学上可接受的载体和/或赋形剂，并与步骤(e)获得的产物混合。
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