KR20140135771A

KR20140135771A - Hiv-1 gp41 프리-헤어핀 중간체의 안정한 펩티드 모방체

Info

Publication number: KR20140135771A
Application number: KR20147026212A
Authority: KR
Inventors: 조셉 쥐. 조이스; 청웨이 우; 엘리자베스 에이. 오팅거; 빅터 가스키
Original assignee: 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2014-11-26
Also published as: CN104203276A; JP2015512394A; AR090365A1; US20150071954A1; CA2867034A1; AU2013235442A8; EP2827896A1; AU2013235442A1; BR112014022958A2; EP2827896A4; MX2014011312A; TW201343670A; WO2013142298A1; RU2014141896A

Abstract

본 발명은 N-펩티드를 삼량체 코일드-코일로 입체형태적으로 제약하여 gp41 제시를 모방하는, 화학적 스캐폴드 상에 3개의 gp41 N-펩티드를 갖는 gp41 3가 펩티드 모방체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 전체 HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 영역을 가지며 gp41 펩티드 모방체를 형성할 수 있는 N-펩티드에 관한 것이다. HIV-1 gp41 프리-헤어핀 중간체의 이러한 펩티드 모방체는 중화 항체의 도출을 통한 HIV-1 감염의 치료 또는 예방을 위한 백신에서 활용될 수 있다.

Description

HIV-1 GP41 프리-헤어핀 중간체의 안정한 펩티드 모방체 {STABLE PEPTIDE MIMETICS OF THE HIV-1 GP41 PRE-HAIRPIN INTERMEDIATE}

본 발명은 입체형태적으로 제약된 3가 gp41 펩티드 모방체, 및 HIV에 대한 중화 항체를 도출하기 위한 면역원으로서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 전체 HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 영역 또는 그의 변형된 버전을 가지며 gp41 펩티드 모방체를 형성할 수 있는 N-펩티드에 관한 것이다.

인간 면역결핍 바이러스 (HIV)는 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 및 관련 장애의 병인체이다. AIDS에 대해 유효한 치료가 이용가능하지만, HIV-1 감염의 예방을 위한 효능 있는 예방 백신의 개발은 광범위 중화 항체를 유도하여 바이러스 진입을 예방할 수 있는 면역원을 확인하고 최적화할 수 없는 문제로 방해받아왔다.

면역원으로서의 HIV-1 외피 당단백질의 사용을 평가함에 있어서 상당한 양의 연구가 수행된 바 있다. HIV-1 외피 당단백질은 160 kDa 전구체로서 합성되고, 이는 숙주 세포 프로테아제에 의해 120 kDa 수용체-결합 서브유닛 (gp120) 및 41 kDa 막-고정 서브유닛 (gp41)으로 절단된다. 허용가능한 세포 상의 CD4 및 연관된 CXCR4 또는 CCR5 케모카인 보조-수용체에 대한 gp120의 순차적 결합시, 광범위한 입체형태 변화가 외피 당단백질 서브유닛에서 일어남으로써 이전에 묻혀있던 삼량체 gp41 코어가 일시적으로 노출되고, 궁극적으로는 바이러스 막 및 세포 막의 융합, 및 숙주 세포의 세포질 내로의 바이러스 내용물의 삽입을 일으킨다.

표적 숙주 세포 막 내로의 gp41의 삽입은, gp41의 양친매성 C-말단 칠원체 반복 (CHR) 영역이 삼량체의 N-말단 칠원체 반복 (NHR) 부분에 의해 형성된 소수성 포켓 내로 역평행 방식으로 패킹되어 6-나선 "헤어핀 삼량체" 구조를 형성하는 광범위한 재배열로 이어진다. 헤어핀-삼량체 구조는 6개의 α-나선의 다발이다: 중심 3-가닥 코일드-코일 (3개의 gp41 엑토도메인으로부터의 N-나선 영역에 의해 형성됨)에 대해 역평행 방식으로 패킹된 3개의 α-나선 (3개의 gp41 엑토도메인으로부터의 C-나선 영역에 의해 형성됨). 상기 재배열은 바이러스 막 및 세포 막을, 지질 혼합 및 막 융합으로 이어지는 접합으로 이끌기 위해 필수적인 기하구조 및 에너지를 제공한다.

합성 NHR 및 CHR 펩티드는 강력한 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 밝혀진 바 있고, 신생 융합 중간체에 결합하여 융합-활성 6-나선 다발의 형성을 차단하는 우성 음성 메카니즘을 통해 기능하는 것으로 여겨진다. 프리-헤어핀 중간체의 가용성 삼량체 펩티드 모방체는, 효모 전사 인자 GCN4로부터 유도된 이종 삼량체화 도메인을 다양한 잔기 길이의 gp41 NHR에 융합시킴으로써 제조되었다. 이러한 구축물은 미국 특허 번호 7,960,504 및 7,811,577, 및 미국 특허 출원 공개 번호 20100092505에 기재되어 있다. 유사하게, 박테리아에서 재조합 발현에 의해 생산된 짧은 링커에 의해 분리된 교호 NHR 및 CHR 서열로 이루어지는 단일 쇄 폴리펩티드인 재조합 5-나선 펩티드가 미국 특허 번호 7,053,179 및 7,504,224에 기재되어 있다. 이들 펩티드를 안정화시키는데 사용된 한가지 접근법은 시스테인 잔기의 사용을 통한 것이었다. 미국 특허 번호 7,811,577; 문헌 [Bianchi et al., 2009, Adv Exp Med Biol 611:121-3; Bianchi et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107:10655-10660; 및 Bianchi et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 120:12903-12908]을 참조한다. gp41 펩티드를 안정화시키기 위한 다른 접근법은 미국 특허 번호 7,728,106 및 7,604,804에 기재된 것들을 포함한다.

발명의 개요

본 발명은 입체형태적으로 제약된 3가 gp41 펩티드 모방체, 및 HIV에 대한 중화 항체를 도출하기 위한 면역원으로서의 그의 용도에 관한 것이다. gp41 펩티드 모방체는, 천연 프리-헤어핀 융합 중간체를 모방하여 HIV-1 바이러스를 중화시킬 수 있는 면역 반응을 도출하는 구조적으로 안정화된 형태의 완전 HIV-1 gp41 N-칠원체 반복 (NHR) 영역의 전부 또는 일부를 제공한다.

따라서, 본 발명은 3개의 N-펩티드에 연결되어 있는 스캐폴드 코어를 포함하며, 여기서 각각의 N-펩티드는 N36 (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL; 서열 1) 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 3개의 N-펩티드는 서로 상호작용하여 HIV gp41의 프리-헤어핀 입체형태를 모방하는 삼량체 코일드-코일을 형성하는 것인, (CCIZN36)₃이 아닌 gp41 펩티드 모방체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 3개의 펩티드 각각은 상이한 부착 지점에서 스캐폴드 코어에 공유 연결되어 있다.

특정 실시양태에서, gp41 펩티드 모방체는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트; 트리스-(2-말레이미도에틸)아민; KTA-브로마이드 또는 콜산을 포함하는 스캐폴드 코어를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 스캐폴드 코어는 KTA-브로마이드 또는 콜산이다.

다른 실시양태에서, gp41 펩티드 모방체는 3개의 N-펩티드의 부착을 허용하는 3개의 관능화 잔기를 포함하는 선형 폴리펩티드 쇄인 스캐폴드 코어를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 스캐폴드 코어는

a) CH₃CO-Ava-Lys-Ava-Lys-Ava-Lys-Ava-NH₂ (서열 41);

b) CH₃CO-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH₂ (서열 42);

c) CH₃CO-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-NH₂ (서열 43);

d) CH₃CO-Cys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH₂ (서열 44); 또는

e) CH₃CO-Cys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-NH₂ (서열 45)

를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, gp41 펩티드 모방체는 시클로헥산, 시클로헵탄 또는 시클로옥탄을 포함하는 카르보시클릭 스캐폴드인 스캐폴드 코어를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, gp41 펩티드 모방체는 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 피페리딘, 옥산, 티안, 아제판, 옥세판, 티에판, 피페라진, 모르폴린 또는 티오모르폴린을 포함하는 헤테로시클릭 스캐폴드인 스캐폴드 코어를 포함한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, N-펩티드는 N51 (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 4)); N51-2B (QIRELISKIVEQINNILRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 8)) 또는 N51-3B (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 9))를 포함한다. 특정한 실시양태에서, N-펩티드는 N51 (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 4))로 이루어진다.

특정 실시양태에서, N-펩티드는 동일하거나 또는 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, N-펩티드는 동일한 아미노산 서열로 이루어진다.

특정 실시양태에서, 1개 이상의 N-펩티드는

a) 삼량체 코일드-코일을 형성할 수 있는 가용성 α-나선 영역을 포함하는 스캐폴드 부분; 및

b) HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 N-펩티드 부분

을 포함하는 키메라 N-펩티드이며,

여기서 스캐폴드 부분은 나선 상으로 N-펩티드 부분에 융합되어 α-나선 도메인을 형성하고, 3개의 N-펩티드는 서로 상호작용하여 삼량체 코일드-코일을 형성한다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, 키메라 N-펩티드의 N-펩티드 부분은 나선 상으로 키메라 N-펩티드의 스캐폴드 부분의 COOH-말단에 융합되어 있다. 이러한 실시양태의 특정한 측면에서, 키메라 N-펩티드의 스캐폴드 부분은

a) 스즈키-IZ 코일드-코일 모티프 (YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (서열 31));

b) IZ 코일드-코일 모티프 (IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK (서열 34)); 또는

c) EZ 코일드-코일 모티프 (IEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEK (서열 37))

를 포함한다.

본 발명은 또한,

a) KTA(N51)₃;

b) KTA(N51-2B)₃;

c) KTA(N51-3B)₃;

d) chA(N51)₃;

e) (CCIZN51)₃ 또는

f) SZN51

인 gp41 펩티드 모방체에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, gp41 펩티드 모방체는 KTA(N51)₃이다.

본 발명은 또한 본 발명의 gp41 펩티드 모방체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 포유동물 숙주 내로 예방 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 도입시키는 것을 포함하는, 포유동물 숙주에서 면역 반응을 도출하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 포유동물 숙주는 인간이다.

도 1a-b. HIV-1 gp41 펩티드 모방체의 다이어그램 표시: a) 양친매성 코일드-코일 나선 HIV-1 N-펩티드 및 SZ 또는 IZ 삼량체화 도메인이 상이한 음영의 원기둥으로서 도시되어 있는 개략적 구조. 다양한 화학적 스캐폴드 코어의 구조가 도시되어 있다; b) CCIZ, KTA 및 콜산 스캐폴드에 기반한 삼량체화 전략을 도시하고 펩티드 서열의 부착을 보여주는 화학 구조.
도 2. 기니 피그 연구 HIV-350 및 HIV-365에서의 개별 동물에 대한 중화 항체 역가. 검정은 바이러스 균주 V570A를 사용하여 시험된 p4/2R5이다. 결과는 사전-채혈 (T=0)에 대해 ○로서, 투여 3-후 채혈 (T= 11주)에 대해 ●로서 나타내었다. 군 기하평균 값은 가로 막대에 의해 표시하였다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다.
도 3. NHP 연구 HIV-360에 대한 개별 동물에 의한 ELISA 반응. 화살표는 0, 4, 8 및 34주의 (CCIZN36)₃으로의 상응하는 면역화 및 62 및 66주의 동종 또는 이종 항원으로의 상응하는 면역화 후의 채혈 날짜를 표시한다. 곡선은 ●, (CCIZN36)₃ 동종; ○, (CCIZN36)₃, / KTA(N51)₃ / 5-나선; ▲, (CCIZN36)₃, / 5-나선 / KTA(N51)₃이다.
도 4. NHP 연구 HIV-360에 대한 개별 동물에 의한 DCBA 반응. 화살표는 0, 4, 8 및 34주의 (CCIZN36)₃으로의 상응하는 면역화 및 62 및 66주의 동종 또는 이종 항원으로의 상응하는 면역화 후의 채혈 날짜를 표시한다. 곡선은 ●, (CCIZN36)₃ 동종; ○, (CCIZN36)₃, / KTA(N51)₃ / 5-나선; ▲, (CCIZN36)₃, / 5-나선 / KTA(N51)₃이다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다.
도 5a-b. NHP 연구 HIV-360에서의 개별 동물에 대한 중화 항체 역가. 결과는 최종 면역화 2주 후 (T=68주)에 수집된 혈액에 대해 시험된 중화 검정 및 바이러스에 의해 나타내었다. 패널 a, 바이러스 V570A 및 HXB2를 사용한 P4/2R5 검정. 패널 b, 바이러스 9020.A13 및 SC22.3C2를 사용한 A3R5 검정. 군 기하평균 값은 실선 가로-막대에 의해 표시하였다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다. 브래킷은 터키 검정에 의한 군 사이의 유의성을 표시한다. 축 표지를 단순화하기 위해, 면역원은 "N36", (CCIZN36)₃; "N51", KTA(N51)₃; 및 "5H", 5-나선으로 축약하였다.
도 6. NHP 연구 HIV-360에서의 개별 동물에 대한 중화 항체 폭. 결과는 최종 면역화 2주 후 (T=68주)에 수집된 혈액에 대해 개별 동물 및 군에 의해 나타내었다. 모든 결과는 A3R5 검정으로부터의 것이다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다. 바이러스 클레이드 및 티어 명칭은 범례에 표시하였다. 축 표지를 단순화하기 위해, 면역원은 "N36", (CCIZN36)₃; "N51", KTA(N51)₃; 및 "5H", 5-나선으로 축약하였다.
도 7a-b. NHP 연구 HIV-360에서의 연구 상에 의한 개별 동물에 대한 비교 중화 항체 역가. 결과는 개별 동물 및 군에 의해 연구의 1상 (패널 a: 동종 (CCIZN36)₃ 투여 요법) 및 2상 (패널 b: 이종 항원 투여) 아암에 대해 나타내었다. 모든 결과는 P4/2R5 검정으로부터의 것이다. T=36 또는 T=68주에서의 군 기하평균 값은 가로-막대에 의해 표시하였다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다. 패널 a, 1상의 종료까지의 중화 결과. T=0, 사전-채혈; T=13, 투여 3 5주 후; T=36, 투여 4 2주 후; 패널 b, 2상의 종료까지의 중화 결과. T=62, 동종 대 이종 비교의 개시 전에 수집된 혈액; T=68, 최종 투여 2주 후.
도 8a-b. NHP 연구 HIV-366에서 최종 면역화 2주 후 (T=38주)에 수집된 혈액에 대한 P4/2R5 및 TZM-bl 검정에 의해 결정된 개별 동물에 대한 중화 항체 역가. 결과는 군별로 개별 동물에 대해 나타내었다. 모든 결과는 패널 a, P4/2R5 검정 또는 패널 b, TZM-bl 검정에서 바이러스 V570A_HXB2 바이러스를 사용하여 측정하였다. 군 기하평균 값은 실선 가로-막대에 의해 표시하였다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다. 브래킷은 터키 검정에 의한 군 사이의 유의성을 표시한다. 축 표지를 단순화하기 위해, 면역원은 "N36", (CCIZN36)₃; "N51", KTA(N51)₃; 및 "5H", 5-나선으로 축약하였다.
도 9a-b. A3R5 검정에 의해 결정된 개별 동물에 대한 중화 항체 역가. 패널 a, 바이러스 Ce0393에 대해 시험된 최종 면역화 2주 후 (T=38주)의 채혈. 패널 b, 바이러스 MW965에 대해 시험된 제3 투여 면역화 2주 후 (T=26주)의 채혈. 군 기하평균 값은 실선 가로-막대에 의해 표시하였다. 정량화의 검정 한계는 점선에 의해 나타내었다. 브래킷은 터키 검정에 의한 군 사이의 유의성을 표시한다. 축 표지를 단순화하기 위해, 면역원은 "N36", (CCIZN36)₃; "N51", KTA(N51)₃; 및 "5H", 5-나선으로 축약하였다.

한 측면에서, 본 발명은 스캐폴드에 의해 삼량체 코일드-코일로 입체형태적으로 제약된 3개의 gp41 펩티드를 포함하는 gp41 펩티드 모방체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 이러한 측면은 3개의 N-펩티드에 연결되어 있는 스캐폴드 코어를 포함하며, 여기서 각각의 N-펩티드는 N36 (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL (서열 1)) 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 N-펩티드 부분을 포함하고, 3개의 N-펩티드는 서로 상호작용하여 HIV gp41의 프리-헤어핀 입체형태를 모방하는 삼량체 코일드-코일을 형성하는 것인 gp41 펩티드 모방체에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 전체 HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 영역, 즉 N51 (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 4)) 또는 그의 변형된 버전을 가지며 gp41 펩티드 모방체를 형성할 수 있는 N-펩티드, 및 그로부터 형성된 gp41 펩티드 모방체에 관한 것이다.

본 발명은 부분적으로, 실시예에 예시된 바와 같이, 설치류, 기니 피그 및 비-인간 영장류 면역원성 연구에서, 바이러스 분리주의 패널에 대한 중화 항체 반응을 도출하는데 있어서 입체형태적으로 제약된 KTA(N51)₃이 재조합 5-나선 펩티드 및 (CCIZN36)₃에 비해 탁월하였다는 출원인의 관찰에 기반한 것이다.

어떠한 이론에도 얽매이기를 원치는 않지만, 본 발명은 백신접종된 포유동물의 면역 반응이 특정 D5-에피토프 중화 성분을 함유하는 고도로 보존된 gp41 프리-헤어핀 입체형태 중간체에 집중하도록 지시하는 것으로 여겨진다. 이는 삼량체 코일드 코일에서의 중화 에피토프의 제시를 안정화시키기 위해 스캐폴드 코어를 갖는 gp41 펩티드 모방체를 입체형태적으로 제약하는 것을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, 이들 안정하고 가용성인 입체형태적 gp41 펩티드 모방체는 잠재적으로 D5 에피토프와 구별되는 추가의 중화 에피토프를 제공한다.

본원에 사용된 "키메라 N-펩티드" 또는 "키메라 펩티드"는, 삼량체 코일드-코일 입체형태를 획득할 수 있는 α-나선 스캐폴드 단백질에 융합된, gp41의 NH₂-말단 칠원체 반복 도메인 (NHR)의 전부 또는 일부 (일반적으로, 적어도 N17 또는 N36) 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 펩티드로서 정의된다. 스캐폴드 단백질은 비-HIV 서열이다.

본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들로 이루어지고, 통상적으로 특정 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는 것으로 널리 공지되어 있다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는, 전자의 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자의 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

본원에 사용된, N-펩티드 구축물과 관련한 "이종"은 (1) gp41 서열 (길이 및/또는 변형) 또는 (2) 임의의 스캐폴드 도메인 (예를 들어, IZ, EZ, SZ)의 정체 또는 길이에 있어서 상이한 N-펩티드 구축물을 의미한다.

본원에 사용된 "HIV"는 HIV-1, HIV-2, 또는 HIV-1 및/또는 HIV-2를 나타내도록 의도된다.

본원에 사용된 "N-펩티드"는, gp41의 NH₂-말단 칠원체 반복 도메인 (NHR)의 전부 또는 일부 (일반적으로, 적어도 N17 또는 N36) 또는 그의 변형된 버전을 포함하며, 단독으로든 스캐폴드 도메인의 사용을 통해서든 관계없이 삼량체 코일드-코일 입체형태를 획득할 수 있는 펩티드로서 정의된다.

본원에 사용된 "중화"는, 시험관내 세포/바이러스-기반 검정, 예컨대 실시예 1 및 2에 기재된 것들에서 바이러스 감염을 예방하거나 또는 감소시키는 항체의 능력을 표시하기 위해 당업계에서와 같이 사용된다. 중화 활성은 그 특정 항체에 대한 IC₅₀ 값으로서 정량적으로 측정될 수 있다. "중화 항체" 또는 "HIV 중화 항체"는 당업계에 용인된 감염성 검정에서 적어도 하나의 HIV 분리주를 중화하는 것으로 나타난다.

본원에 사용된 "스캐폴드 코어"는, 그 각각이 직접적으로 또는 링커를 통해 gp41 N-펩티드에 부착될 수 있는 적어도 3개의 모이어티를 갖는 고리형 또는 선형 화학적 화합물인, 본원에 개시되고/거나 기재된 바와 같은 화학 구조에 관한 것이다.

본 발명의 gp41 펩티드 모방체는 외피 바이러스 막-융합 단백질의 융합생성 입체형태 내부에 함유된 내부 삼량체 코일드-코일 모티프, 특히 HIV gp41 엑토도메인의 내부 코일드-코일 도메인을 모방한다. 이들 모방체는 함께 gp41 전-융합 중간체의 삼량체 코일드-코일 특징을 형성하는 키메라 N-펩티드일 수 있는 3개의 N-펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, N-펩티드는 나선 상으로 HIV gp41의 N-나선 또는 그의 변형된 버전의 전부 또는 일부에 융합된 비-HIV 가용성 삼량체 형태의 코일드-코일을 포함하는 키메라 N-펩티드이다. 본 발명의 특정 측면에서, 3개의 N-펩티드는 N-펩티드를 입체형태적으로 제약하는 스캐폴드 코어의 사용을 통해 동종삼량체 또는 이종삼량체 코일드-코일 구조로 공유-안정화된다.

특정 실시양태에서, N-펩티드는 HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 도메인 또는 그의 변형된 버전의 전부 또는 일부를 포함한다. N-펩티드는, 예를 들어 N17, N36, N38, N44 또는 N51을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, N-펩티드는 1) 삼량체 코일드-코일을 형성할 수 있는 가용성 α-나선 영역을 포함하는 스캐폴드 부분; 및 2) HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 영역의 전부 또는 일부 (예를 들어, N17, N36 또는 N51)를 포함하는 N-펩티드 부분, 및 임의로 3) 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 시스테인 부분을 포함하는 키메라 펩티드이고, 여기서 스캐폴드 부분은 나선 상으로 N-펩티드 부분에 융합되어 a-나선 도메인을 형성하고, 상기 시스테인 부분은 존재하는 경우에 상기 α-나선 도메인 외부의 NH₂- 또는 COOH-말단에 위치한다. 시스테인 부분의 존재는 키메라 펩티드를 삼량체 형태로 공유적으로 제약하는데 도움을 준다. 이들 N-펩티드의 공유-안정화는 HIV gp41의 중심 삼량체 N-나선 코일드-코일의 안정하고 노출된 부분의 제시를 허용한다.

gp41 펩티드 모방체는 HIV-1 gp41로부터 유도된 N-칠원체 반복 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 N-펩티드를 포함한다. HIV-1 gp41 엑토도메인은 참조 균주 HXB2의 HIV-1 gp160 외피 단백질에서의 그의 위치에 따라 넘버링시 잔기 512-681인 대략 169개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 상기 엑토도메인 내부에는 α-나선을 형성할 것으로 예상되는 엑토도메인의 NH₂-말단 부분에 인접하여 위치한 4-3 칠원체 반복 영역이 있다. 상기 N-칠원체 반복은 대략 각각 gp160의 아미노산 위치 541-592로부터 위치한다 (예를 들어, 문헌 [Caffrey et al., 1998, EMBO J. 17:4572-4584] 참조).

본 발명의 상기 펩티드 모방체의 N-펩티드 도메인은 당단백질의 C-나선 도메인에 의해 형성된 α-나선에 결합하기에 충분한 양의 gp41의 N-나선 영역을 포함한다. 전형적으로, N-나선 도메인으로부터의 17개 이상 또는 36개 이상의 아미노산 잔기, 상기 도메인의 모든 51개 이하의 잔기는 N-펩티드의 HIV gp41 성분을 포함할 수 있다. 에피토프를 제공하는 한, N-펩티드 영역 내부의 임의의 서열이 이용될 수 있다. 그러나, 약 36, 40, 45 또는 50개 아미노산보다 짧은 서열은 하기에 보다 상세하게 논의될 스캐폴드 도메인을 제공하는 추가의 펩티드 서열을 요구할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 N-펩티드는 gp160 서열의 잔기 546 내지 581 (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL (이하에서 "N36"으로 지칭됨; 서열 1))에 상응하는 HIV-1 gp41의 NHR의 COOH-말단 절반에 위치한 적어도 36개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, N-펩티드는 gp41 잔기 546 내지 583 (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAG (이하에서 "N38"로 지칭됨; 서열 2))을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, N-펩티드는 NH₂-말단에 부가된 6개의 아미노산을 갖는 gp41 잔기 546 내지 583 (RGRGRGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAG (이하에서 "N44"로 지칭됨; 서열 3))을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, N-펩티드는 gp41 잔기 540 내지 590 (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (이하에서 "N51"로 지칭됨; 서열 4))을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 이러한 펩티드는 HIV-1 gp41 N-칠원체 반복 영역, 및 N-말단 극성 도메인의 일부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, N-펩티드는 공유-안정화된 입체형태적으로 제약된 삼량체와 관련하여 전장 NHR의 제시를 허용하도록 설계되었다. 추가의 N-펩티드는 N36 내지 N51의 임의의 서열을 포함할 수 있다. HIV gp160 서열을 지칭하는 명세서 전반에 걸친 모든 넘버링은 HIV-1 분리주 HXB2에 기반한 것이다.

다른 실시양태에서, N-펩티드는 gp41 단백질 내부의 NHR의 바로 상류 또는 바로 하류의 서열로부터 유도된 추가의 HIV 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 펩티드는 gp41 잔기 528 내지 590 (이하에서 "N63"으로 지칭됨 STMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 5))을 포함할 수 있다.

N-펩티드는 또한 야생형 HIV N-나선 칠원체 도메인의 변형된 버전일 수 있되, 단 생성된 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 포유동물 세포의 HIV 감염의 억제제이고/거나 융합 중간체의 입체형태적 에피토프를 표적으로 하는 중화 항체를 생성할 수 있다. 천연 NHR에서 생성된 변형을 갖는 N-펩티드는 HIV N-펩티드 도메인의 삼량체화 능력 및 표면 구조를 유지하여야 한다. 예를 들어, N-펩티드를 생성하는데 사용된 N-펩티드 서열 내부에 비-중화 면역우성 영역 (즉, 면역계에 의해 가장 쉽게 인식되고 이에 따라 유도된 항체의 특이성에 가장 영향을 미치는 항원 결정인자의 서브유닛)이 존재할 수 있다. NHR의 변형된 버전 (적용가능한 것으로서, N36 또는 N51)은 HIV 균주 HXB2로부터의 천연 gp160 서열로부터의 1개의 아미노산 변화, 2개 이하의 아미노산 변화, 3개 이하의 아미노산 변화, 4개 이하의 아미노산 변화, 5개 이하의 아미노산 변화, 6개 이하의 아미노산 변화, 7개 이하의 아미노산 변화 또는 8개 이하의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 변형은 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 그러나 일반적으로, 적절한 위치설정을 유지하기 위해, 변형은 치환이다.

NHR의 알라닌 스캐닝으로 면역우성 영역을 확인하였다. 비-중화 항체를 생성하는 상기 면역우성 영역은 COOH-말단 부분의 극단에 위치한다. 아미노산 잔기 아르기닌-579 (R579)는 비-중화 모노클로날 항체의 결합에 결정적인 것으로 보이고; 잔기 글루타민-577 (Q577) 및 류신-581 (L581)도 또한 결합에 참여하지만, 시험된 모노클로날에 좌우되는 가변적 기여를 나타낸다. 마우스 모노클로날 항체 결합에 관여하는 이들 잔기는, NHR에서 면역우성 에피토프를 제시할 가능성이 있는 분자의 바닥에서 고리를 형성한다. 흥미롭게도, 삼량체 N-나선 코일드-코일의 소수성 포켓을 따라 늘어선 아미노산 잔기는 추가로 상기 추정 면역우성 에피토프의 NH₂-말단에 위치한다. 소수성 포켓은 최근에 확인된 HIV-중화 항체 D5 IgG에 결합하는 도메인을 포함하는 것으로 확인된 바 있고; 따라서, 소수성 포켓은 추정 중화 입체형태적 에피토프를 함유하는 것으로 여겨진다 (미국 특허 번호 7,744,887 참조). 따라서, N-펩티드를 생성하는데 사용된 N-펩티드 도메인은 면역 반응을 소수성 포켓 내부의 추정 중화 에피토프에 집중시키면서, 상기 확인된 비-중화 면역우성 도메인의 항원 반응을 최소화하기 위한 시도로 변형되거나 또는 단축될 수 있다. 예를 들어, N36 또는 N51의 변형된 버전에서, N36의 COOH-말단 부분 극단은 하기 잔기 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이될 수 있다: 류신-581 (L581), 아르기닌-579 (R579), 글루타민-577 (Q577) 및/또는 글루타민-575 (Q575). 각각의 잔기가 알라닌 (A) 아미노산으로 돌연변이되는 것이 바람직한데, 이는 알라닌이 α-나선 형성에 참여할 수 있고, 따라서 펩티드의 코일드-코일 구조를 파괴하지 않을 것이기 때문이다. 추가로, 알라닌은 작은 측쇄를 갖고, 따라서 항체에 대해 가장 작은 가능한 결합 표면을 나타낼 것이다. 글리신 또는 프롤린 잔기는 측쇄를 전혀 갖지 않고, 이들 돌연변이에 대한 더 우수한 선택인 것으로 간주될 수 있지만; 상기 아미노산은 α-나선 입체형태를 파괴하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, N-펩티드는 하기 서열: LLQLTVWGIKALAAAIA (서열 6)를 갖는 "N17Ala4"로 표시되는 N-펩티드 도메인을 형성하는, 인용된 잔기 중 4개 전부에서 돌연변이 (L581A, R579A, Q577A 및 Q575A)되어 있는 서열을 포함한다. 돌연변이된 아미노산은 밑줄표시되어 있다.

N-펩티드의 N-펩티드 부분은 또한 펩티드를 전체적으로 추가로 안정화시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, N-펩티드 도메인은 추가의 안정화 이소류신 잔기를 서열 내로 혼입시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, N-펩티드는 하기와 같이 상기 이소류신 잔기를 혼입시키기 위해 "a" 및 "d" 패킹 위치에서 돌연변이될 수 있다: LIQLIWGIKQIQARIL (서열 7; "N17Ile"로 표시됨; 돌연변이된 잔기는 밑줄표시됨).

삼량체 안정화에 관한 이점 및/또는 소수성 포켓 및/또는 D5 에피토프의 제시를 추구하기 위해 N-펩티드 서열에서 다른 변형이 이루어질 수 있다.

생성된 삼량체의 용해도를 증가시키고/거나 응집 성향을 감소시키기 위해 N51 서열의 변형된 버전이 생성되었다. 이러한 펩티드의 예는 N51-2B 및 N51-3B를 포함한다. N51-2B는 하기 서열: Q I R E L I S K IV E Q I NN I LRAIEAQQH A LQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 8)를 갖는다. N51-3B는 하기 서열: QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQH A LQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 9)를 갖는다.

N51 변형된 버전의 다른 예는 표 1의 펩티드를 포함한다.

표 1: N51 변형된 버전

N51 서열에 예시된 것과 동일한 이들 변형은 보다 짧은 서열에도 마찬가지로 적용될 수 있는 것으로 이해된다.

따라서, 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 특정 변형은 하기 위치 (모두 HXB2에서의 위치를 지칭함): Q540, A541, Q543, L545, G547, Q550, Q552, L555, L565, T569, I573, L576, I580, V583, L587 또는 Q590에서의 치환을 포함한다. 특정 변형은 하기 치환: Q540N, A541I, Q543E, L545I, G547A, G547K, Q550E, Q552I, L555I, L565A, L566I, T569V, T569I, I573V, I573N, Q575A, L576I, Q577A, R579A, I580V, L581A, V583I, L587I 또는 Q590I를 포함한다.

N-펩티드를 생성하는데 사용된 HIV gp41의 N-나선 부분은 HIV-1, HIV-2, 또 다른 HIV 균주, 또는 또 다른 렌티바이러스 종 (예를 들어, 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV) 또는 비스나(Visna) 바이러스)으로부터의 균주로부터 분리될 수 있다. 유사한 HIV 균주 및/또는 다른 종의 면역결핍 바이러스에서의 상응하는 N-펩티드 서열은 쉽게 확인될 수 있고, 당업계에 공지되어 있다. 추가로, α-나선 코일드-코일 도메인이 다른 외피 바이러스의 막-융합 단백질에서 확인된 바 있다 (문헌 [Singh et al., 1999, J Mol Biol. 290:1031-41] 참조).

추가로, 본원에 기재된 펩티드 서열 각각에 대해, N-펩티드 도메인은 gp41 서열의 일부가 아닌 1 내지 12개의 아미노산에 의해 연장될 수 있다. 예를 들어, 바이센홈(Weissenhom) 등 (문헌 [1997, Nature 387:426-430])은 N36 펩티드 서열: ARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK (서열 25)의 NH₂-말단에서 5개의 아미노산 잔기에 의해, COOH-말단에서 7개의 아미노산 잔기에 의해 N36 펩티드를 연장시킨다. 따라서, N-펩티드는 N36 펩티드 도메인의 전부 또는 COOH-말단 부분의 COOH-말단에 위치한 7개의 추가의 아미노산, 구체적으로 AVERYLK (서열 26)의 전부 또는 일부를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, N-펩티드는 "N17+7" (LLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK (서열 27)), "N23+7" (IEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK (서열 28)) 또는 "N36+7" (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK (서열 29))로 표시되는 N-펩티드 도메인을 포함한다. 추가로, N-펩티드는 N36 펩티드 서열의 전부 또는 NH₂-말단 부분 + N-펩티드 영역을 추가로 NH₂-말단 영역 내로 연장시키는 상기 N-펩티드의 NH₂-말단에 위치한 추가의 5개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, N-펩티드는 N36 펩티드의 NH₂-말단에 위치한 5개의 아미노산, 구체적으로 ASQLL (서열 30)의 전부 또는 일부를 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 펩티드-기반 스캐폴드 도메인은 N-펩티드 영역의 입체형태를 유지하도록 요구될 수 있다. 스캐폴드 도메인은 비-HIV 아미노산 서열이므로, 생성된 N-펩티드는 키메라 N-펩티드이다. 스캐폴드 도메인은 삼량체 코일드-코일을 형성할 수 있는 가용성 α-나선 도메인을 포함하고, 나선 상으로 N-펩티드에 융합되어 연속적인 코일드-코일을 생성한다.

코일드-코일은 초나선 꼬임에 의해 서로의 주위를 감싼 2개 이상의 α-나선으로 이루어진 단백질 구조적 모티프이다. 아미노산 잔기의 단순 패턴은 문자 "a" 내지 "g"에 의해 표시되는 아미노산의 특징적인 칠원체 반복으로 이루어진 코일드-코일의 배수를 결정한다. 칠원체 반복의 제1 및 제4 위치, 각각 "a" 및 "d" 위치는 코일드-코일의 상호작용하는 가닥의 내부를 형성하고, 일반적으로 소수성인 것으로 결정된 바 있다. 키메라 N-펩티드 내부에 함유된 스캐폴드 도메인은, 3개의 gp41 엑토도메인의 N-나선에 의해 형성된 프리-헤어핀 및 헤어핀-삼량체 구조에 존재하는 내부 삼량체 코일드-코일을 모방하도록 본 발명의 gp41 펩티드 모방체 내부에 삼량체 코일드-코일 구조를 형성한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 스캐폴드 도메인은 N-펩티드 영역의 NH₂-말단에 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 스캐폴드 도메인은 N-펩티드 영역의 COOH-말단에 융합된다. 추가 실시양태에서, 스캐폴드 도메인은 상기 도메인의 일부가 N-펩티드 영역의 NH₂- 및 COOH-말단 둘 다에 위치하도록 분할될 수 있다.

삼량체화되는 것으로 알려져 있는 임의의 코일드 코일 모티프를 이용하여 gp41 삼량체를 안정화시킬 수 있다. 코일드-코일 모티프는 다양한 공급원으로부터 선택될 수 있다. 본원에 기재된 키메라 N-펩티드 내부의 스캐폴드 도메인은 특히 스즈키(Suzuki) 등에 의해 개시된 이소류신 지퍼 모티프 (문헌 [1998, Protein Eng. 11: 1051-1055]; 이하에서 "스즈키-IZ") 및 에케르트(Eckert) 등에 의해 개시된 GCN4-pI_QI 코일드-코일 모티프 (문헌 [1998, J. Mol. Biol. 284:859-865] 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO02/024735), 및 그의 말단절단되고/거나 변형된 버전을 포함한다.

스즈키-IZ 코일드-코일 모티프는 하기 아미노산 서열: YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (서열 31)를 갖는다. 스즈키-IZ 모티프를 포함하는 칠원체 반복 ([(IEKKIEA)_n; (서열 32)]_n)의 "a" 위치는 밑줄표시되어 있다.

GCN4-pI_QI 코일드-코일 모티프는 하기 아미노산 서열: RMKQIEDKIEEILSKQYHIENEIARIKKLIGER (서열 33)을 갖는다. 상기 나선 모티프의 "a" 위치도 또한 밑줄표시되어 있다.

IZ 도메인 (IKKEIEAIKKEOEAIKKKIEAIEK (서열 34))은, 용액 중에서 나선 및 삼량체인, 스즈키 등 (문헌 [1998, Protein Eng. 11: 1051-1055])에 의해 기재된 설계에 기반한 변형된 이소류신 지퍼이다.

스즈키-IZ, GCN4-pI_QI 및 다른 스캐폴드 도메인은 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 변형 및/또는 결실에 의해 변화될 수 있다. "스즈키-IZ-유사" 및 "GCN4-pI_QI-유사" 스캐폴드 도메인은 각각 "스즈키-IZ" 또는 "GCN4-pI_QI" 코일드-코일의 일부 또는 상기 각각의 코일드-코일의 전부 또는 일부의 변형된 버전을 포함하는 코일드-코일 모티프로서 본원에서 정의된다. 스즈키-IZ-유사 및 GCN4-pI_QI-유사 스캐폴드 도메인은, 이들이 가용성 삼량체 (나선) 코일드-코일을 형성하도록 각각 스즈키-IZ 및 GCN4-pI_QI 삼량체 코일드-코일 도메인의 충분한 일부 (즉, 충분한 길이) 또는 그의 변형된 버전으로 이루어져야 한다. 스캐폴드 단백질의 아미노산 서열의 변화에 대한 허용성은 변화된 아미노산이 구조적 및/또는 기능적 역할을 하는지의 여부에 좌우될 것이다. 따라서, 본원에 사용된 돌연변이 또는 변형된 스캐폴드 단백질은 삼량체 코일드-코일을 형성하는 능력을 유지하여야 한다. 추가로, 3개의 N-펩티드 (이들 중 적어도 1개는 돌연변이/변형된 스캐폴드 도메인으로 생성됨)로 구성된 본 발명의 gp41 펩티드 모방체는, 예를 들어 적어도 저 나노몰 농도 범위, 예를 들어 1-5 nM의 효력으로 HIV 감염성을 억제하는 능력, 또는 N-나선 코일드-코일에 위치한 입체형태적 에피토프를 인식하는 gp41-특이적 항체에 결합하는 능력을 유지하여야 한다. 스캐폴드 단백질의 변형은 여러 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 펩티드의 외부 표면은 생체이용률을 증진 (예를 들어, 펩티드의 용해도를 증가)시키고, 독성을 감소시키고, 면역 클리어런스를 회피하기 위해 변화될 수 있다. 대안적 스캐폴드를 포함하는 본 발명의 키메라 펩티드의 다중 버전의 유용성은 기존 항체를 피함으로써 상기 문제를 회피하도록 도울 것이다. 스캐폴드 단백질은 또한, 예를 들어 키메라 펩티드의 스캐폴드 도메인의 외부 표면에 글리코실화 또는 PEG화 부위를 도입함으로써 이것을 덜 면역원성으로 만들기 위한 시도로 변형될 수 있다. 추가로, 스캐폴드 도메인은 면역원성 담체 또는 친화성 수지에 대한 상기 펩티드 모방체의 접합을 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다.

상기 기재된 IZ 스캐폴드 모티프는 "e" 및 "g" 위치에서 유의하게 변경되어 있고 "a" 위치에 이소류신에서 글루타민으로의 (I→Q) 치환을 갖는 스즈키-IZ 코일드-코일 모티프의 일부를 나타낸다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO02/024735 참조). "IZ" 스캐폴드 도메인의 아미노산 서열은 IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK (서열 34; "a" 위치는 밑줄표시됨)이고, 여기서 NH₂-말단은 아세틸화되어 있고, COOH-말단은 아미드화되어 있다.

펩티드 모방체로의 혼입을 위해 IZ 스캐폴드 도메인의 단축된 버전도 또한 생성될 수 있다. 단축된 IZ-유사 도메인의 구체적 예는 IZ 스캐폴드의 17개 아미노산: IKKEIEAIKKEQEAIKK (서열 35; "IZ17"로 표시됨; "a" 위치는 밑줄표시됨)를 나타낸다.

보다 긴 HIV 서열 절편을 갖는 대안적 펩티드 모방체를 생성할 때 적절한 나선 구조를 유지하기 위해, 상기 "IZ" 스캐폴드는 1개 내지 수개의 아미노산에 의해 연장되어 "IZ-유사" 스캐폴드 도메인을 생성할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, IZN23 및 IZN36은 문헌 [Eckert et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11187-11192]에도 또한 개시되어 있는 키메라 N-펩티드이다. IZN36의 아미노산 서열은 각각 IKKE IEAIKKE QEAIKKK IEAIEKE ISGIVQQ QNNLLRA IEAQQHL LQLTVWG IKQLQAR IL (서열 36)이다. 펩티드의 "a" 위치는 밑줄표시되어 있다. 예를 들어, IZN36의 IZ-유사 스캐폴드 도메인은 1개 또는 바람직하게는 2개의 아미노산에 의해 연장될 수 있다. 이는 적절한 "a" 내지 "g" 간격을 유지하고 이에 따라 α-나선 입체형태의 생성을 용이하게 하기 위해 요구될 수 있다. 상기 방식으로 스캐폴드 도메인을 연장시키도록 선택된 아미노산은 인접한 나선 사이의 정전기적 상호작용을 가능하게 하여야 한다 (문헌 [Suzuki et al., 1998, Protein Eng. 11: 1051-1055] 참조). 안정화될 키메라 N-펩티드를 생성할 때, 당업자는 생성된 펩티드의 나선 입체형태를 유지하기 위해, 스캐폴드 도메인이 IZN36에 의해 보여진 바와 같이 최소한으로 변경될 필요가 있을 수 있음을 인지할 것이다. 다른 스캐폴드로 유사한 변화가 생성될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 스캐폴드 도메인은 하기 아미노산 서열: IKK IEEIEKK IEEIEKK IEEIEK (서열 37; "a" 위치는 밑줄표시됨)를 갖는, "EZ" 스캐폴드로 표시되는 변형된 스즈키-IZ-유사 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 박테리오파지 T4 피브리틴 삼량체 (FT) 서열의 26개 아미노산 삼량체 모티프 YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (서열 38)이 스캐폴드 도메인으로서 이용된다. 피브리틴에 기반한 유사한 모티프가 당업계에 공지되어 있다.

바람직한 키메라 N-펩티드의 한 예는 SZN51 IEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 39)이다.

상기 기재된 바와 같이, 펩티드 모방체의 스캐폴드 도메인의 아미노산 서열은 변형되고/거나 단축될 수 있지만; 그렇게 함에 있어서, 생성된 키메라 펩티드는 gp41의 내부 N-나선 코일드-코일의 안정하고 충실한 모방체를 나타내는 삼량체 코일드-코일을 형성하는 능력을 유지하여야 한다.

특정 실시양태에서, 키메라 N-펩티드는 공유-안정화된다. 펩티드 모방체는 나선 상으로 스캐폴드 도메인에 융합된 N-펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 펩티드 서열은 임의로 NH₂ 또는 COOH-말단, 바람직하게는 키메라 펩티드의 코어 나선 영역의 외부에 위치한 적어도 2개의 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 이들 펩티드는 CC-키메라 N-펩티드로 지칭된다. 이러한 한 실시양태에서, 3개의 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 시스테인-함유 키메라 펩티드는 이어서, 근접하여 회합된 키메라 펩티드 쇄 상의 병치된 시스테인 잔기 사이에 산화 조건 하에 형성된 분자간 디술피드 결합을 통해 동종삼량체 또는 이종삼량체 분자로 공유-안정화된다. 공유-안정화된 동종삼량체 또는 이종삼량체 코일드-코일은 사전-형성된 삼량체 코일드-코일을 산화 조건에 노출시킴으로써, 또는 산화 조건 하에 코일드-코일 입체형태로의 개별 펩티드 쇄의 회합을 촉진시킴으로써 형성된다. 부가된 시스테인 잔기는 고도의 입체형태적 자유를 보장하는 키메라 펩티드의 α-나선 도메인의 외부에 위치하고, 임의로 링커 또는 스페이서 영역에 의해 코어 키메라 펩티드 서열로부터 분리된다. 미국 특허 번호 7,811,577을 참조한다.

본원에 기재된 CC-키메라 N-펩티드에 존재하는 시스테인 잔기는 연속적 아미노산 잔기이다. 따라서, 본원에 기재된 CC-키메라 N-펩티드는, 키메라 펩티드의 코어 α-나선 도메인 외부의 펩티드의 NH₂- 또는 COOH-말단 끝에 위치하고, 임의로는 스페이스/링커 영역에 의해 코어 α-나선 도메인으로부터 분리된 적어도 2개의 연속적 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 CC-키메라 N-펩티드는 또한, 키메라 펩티드의 코어 α-나선 도메인 외부의 펩티드의 NH₂- 또는 COOH-말단 끝에 있고, 임의로는 스페이스/링커 영역에 의해 코어 α-나선 도메인으로부터 분리된 정확히 2개의 연속적 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 당업자는 또한 본원에 기재된 시스테인 잔기가 반드시 연속적 잔기일 필요는 없고, 따라서 상기 시스테인 잔기 사이에 최소한의 개수의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 가능할 수 있음을 상상할 수 있다. 그러나, 동일한 폴리펩티드 쇄 상의 시스테인 잔기 사이의 분자내 디술피드 결합의 생성을 가능하게 하여 이들을 삼량체 코일드-코일 입체형태에서 개별 CC-키메라 N-펩티드 사이에 분자간 디술피드 결합을 형성할 수 없는 채로 남겨둘 정도로 시스테인 잔기가 충분히 멀리 떨어진 간격을 두지는 않는 것이 중요하다.

2개의 연속적 시스테인 잔기는 펩티드의 산화시 형성되는 근접하여 회합된 CC-키메라 N-펩티드 상의 병치된 시스테인 잔기에 의한 디술피드 결합 연결에 참여한다. 실시양태에서, 2개의 연속적 글리신 잔기가 존재하는 경우에, 글리신 잔기는 시스테인 잔기를 코어 키메라 펩티드 서열의 α-나선 도메인으로부터 분리하는 스페이서 영역을 나타낸다. 글리신 스페이서 영역은 시스테인 잔기가 코어 펩티드 서열의 나선 2차 구조에 휩쓸리지 않도록 보장함으로써 상기 시스테인을 자유롭게 하여 디술피드 연결에 참여하도록 돕는다. 개별 단백질 사이의 (즉, 분자간) 또는 단일 폴리펩티드 쇄 내의 (즉, 분자내) 공유 가교는 시스테인 잔기의 산화에 의해 형성될 수 있다. 디술피드 결합은 시스테인 잔기에서 티올 (-SH) 기의 산화에 의해 형성된다. 분자내 디술피드 결합은 단백질의 3차 구조를 안정화시키는 반면, 분자간에 발생한 것들은 1개 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 구조를 안정화시키는 것에 관여한다. 개별 펩티드/단백질 사이의 공유 가교는 또한, 공유연결될 상기 펩티드/단백질 내로 특유의 상호 반응성 기 - 결합될 각각의 절편 내의 것을 혼입시킴으로써 강요되는 화학선택적 반응 (예를 들어, 티오에테르 결합의 형성)에 의해 형성될 수 있다 (문헌 [Lemieux G. A. and Bertozzi C. R., 1998, Trends Biotechnol. 16:506-513; 및 Borgia, J. A. and Fields G. B., 2000, Trends Biotechnol. 15:243-251]에서 리뷰됨). 키메라 펩티드의 코어 α-나선 도메인에 부가되는 시스테인 잔기는 산화시 디술피드 결합을 생성하여 3개의 동일한 CC-키메라 N-펩티드에 의해 형성된 삼량체 구조를 공유-안정화시킨다.

본원에 기재된 시스테인 잔기는 코어 키메라 N-펩티드의 NH₂-말단 또는 COOH-말단에 부가되어 CC-키메라 N-펩티드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 2개의 시스테인 잔기는 CC-키메라 N-펩티드의 NH₂-말단에서 처음 2개의 아미노산 잔기를 점유하도록 조작될 수 있고, 여기서 스캐폴드 코일드-코일 도메인은 키메라 펩티드의 NH₂-말단 절반에 위치한다. 상기 배열은 2개의 조작된 시스테인 잔기가 키메라 펩티드의 N-펩티드 부분의 α-나선 구조 및/또는 상기 HIV 도메인의, 예를 들어 C-나선과 상호작용하는 기능성을 방해할 가능성이 거의 없음을 보장한다. 다르게는, 2개의 시스테인 아미노산 잔기는 CC-키메라 N-펩티드의 COOH-말단에서 마지막 2개의 아미노산 잔기를 점유하도록 조작될 수 있고, 여기서 스캐폴드; 코일드-코일 도메인은 키메라 펩티드의 NH₂-말단 절반에 위치한다. 이는, 예를 들어 스캐폴드 도메인에 인접하여 위치한 Cys-Cys 서열의 존재로 인해 CC-키메라 N-펩티드를 키메라 펩티드의 비-HIV 스캐폴드 부분을 통해 면역원성 담체 또는 친화성 수지에 접합시키는데 어려움이 있는 경우에 필요할 수 있다. 2개의 시스테인 잔기는 또한 CC-키메라 N-펩티드의 NH₂-말단에서 처음 2개의 아미노산 잔기를 점유하도록 조작될 수 있고, 여기서 N-펩티드 도메인은 키메라 펩티드의 NH₂-말단 절반에 위치한다. 2개의 시스테인 잔기는 CC-키메라 N-펩티드의 COOH-말단에서 마지막 2개의 아미노산 잔기를 점유하도록 조작될 수 있고, 여기서 N-펩티드 도메인은 키메라 펩티드의 NH₂-말단 절반에 위치한다. N-펩티드 및 스캐폴드 도메인의 배향을 스위칭하는 것은 바이러스-숙주 세포 막 융합을 억제하는 생성된 CC-키메라 N-펩티드의 능력에 영향을 미칠 수 있다.

바람직한 CC-키메라 N-펩티드는 CCIZN51: CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 40)이다.

대안적 실시양태에서, 안정화는 상기 펩티드 사이의 디술피드 및/또는 티오에테르 결합 각각을 안정화시키는데 참여하기 위한 코어 키메라 펩티드의 어느 하나의 말단으로의 친전자성 모이어티의 혼입을 통해 발생한다. 상기 친전자성 모이어티는 임의로는 링커 또는 스페이서 영역에 의해 키메라 펩티드의 α-나선 도메인으로부터 분리된다. 따라서, 상기 구조는 각각 친전자성 모이어티를 갖는 2개의 유도체화-키메라 N-펩티드에 의한 단일 CC-키메라 N-펩티드의 삼량체화 및 공유-안정화에 의해 이루어질 수 있고, 여기서 티오에테르 결합은 CC-키메라 N-펩티드의 조작된 시스테인 잔기 및 각각의 유도체화-키메라 N-펩티드의 친전자성 모이어티 (예를 들어, 알킬 할라이드 모이어티 또는 마이클(Michael) 수용자)에 존재하는 각각의 티올-반응성 관능기 사이에 형성된다. 키메라 펩티드 사이의 디술피드 또는 화학선택적 공유 결합 연결은 펩티드 단량체 (즉, 동종삼량체 또는 이종삼량체 코일드-코일 구조의 단일 키메라 펩티드 서브유닛)가 심지어 매우 낮은 농도에서도 해리되지 않음을 보장한다.

특정 실시양태에서, 안정화는 상기 펩티드 사이의 공유 결합을 안정화시키는데 참여하기 위한 코어 키메라 펩티드의 어느 하나의 말단에 대한 "클릭(click)" 화학 커플링을 매개할 수 있는 관능기의 혼입을 통해 발생한다. 상기 "클릭" 모이어티는 임의로는 링커 또는 스페이서 영역에 의해 키메라 펩티드의 α-나선 도메인으로부터 분리된다. 이러한 한 실시양태에서, 안정화된 삼량체는 단일 XX-키메라 N-펩티드와 2개의 Y-유도체화-키메라 N-펩티드의 반응에 의해 형성될 수 있고, 여기서 "X" 및 "Y"는 각각의 유도체화-키메라 N-펩티드의 "클릭" 반응 쌍의 동족 모이어티 (예를 들어, "X"가 알킨 모이어티를 구성하고 "Y"가 아지드 모이어티를 구성하는 휘스겐(Huisgen) 1,3 쌍극 고리화첨가)를 나타낸다. 키메라 펩티드 사이의 화학선택적 공유 결합 연결은 펩티드 단량체 (즉, 동종삼량체 또는 이종삼량체 코일드-코일 구조의 단일 키메라 펩티드 서브유닛)가 심지어 매우 낮은 농도에서도 해리되지 않음을 보장한다.

gp41 엑토도메인의 내부 삼량체 코일드-코일을 생성하기 위해 루이스(Louis) 등 (문헌 [2001, J. Biol. Chem. 276:29485-29489])에 의해 이용된 대안적 전략은 분자간 디술피드 가교에 의해 안정화시키기 위해 N-나선 도메인 내부의 실제 잔기를 시스테인 잔기로 돌연변이시켰다. 디술피드 결합은 N-나선 영역 내부에 위치한 gp41 엑토도메인의 잔기 576-578을 시스테인-시스테인-글리신 (Cys-Cys-Gly)으로 돌연변이시킴으로써 6-나선 다발 내로 혼입되는 시스테인 잔기 사이에 생성된다. 상기 돌연변이된 아미노산 잔기 중 1개는, 코일드-코일의 상호작용하는 가닥의 내부를 형성하는 칠원체 반복의 2개의 위치 중 1개이고 또한 HIV-1 클레이드 사이에 고도로 보존되어 있는 것으로 알려진 α-나선 도메인의 "d" 위치에 위치하였다 (문헌 [Dong et al., 2001, Immunol. Lett. 75:215-220]).

본원에 기재된 CC-키메라 N-펩티드를 안정화시키는 대안적 방법은 펩티드의 반대편 말단에 시스테인 잔기를 부가하는 것이다. 따라서, 처음에, CC-키메라 N-펩티드의 한 말단에 있는 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합을 통해 안정화된 상기 펩티드로 형성된 삼량체 코일드-코일이 높은 효력으로 HIV 감염성을 억제하는 능력 또는 N-나선 도메인에 위치한 입체형태적 에피토프를 인식하는 항체에 결합하는 능력을 나타내지 않는 경우에, 당업자는 CC-키메라 N-펩티드의 반대편 말단에 위치한 안정화 시스테인 잔기를 갖는 유사한 공유-안정화된 삼량체 코일드-코일을 생성할 수 있다.

상기 기재된 임의의 방법을 통해 본 발명의 삼량체 코일드-코일을 안정화시킬 때, 2개의 유도체화-키메라 N-펩티드 내부에 혼입된 모이어티가 상기 펩티드의 동일한 말단에 위치하는 것이 중요하다. 이어서, 안정화 메카니즘의 위치가 공유-안정화된 키메라 펩티드의 기능성에 영향을 미치는지 결정할 수 있다. 안정화 메카니즘을 반대편 말단으로 이동시키는 것은, 유닛이 부가되는 말단이 펩티드의 반대편 말단보다 덜 안정한 경우에 추가의 안정화 영향을 가질 수 있다. 종종, 본원에 기재된 키메라 N-펩티드의 N-펩티드 부분은 펩티드의 스캐폴드 부분보다 덜 안정하다. 따라서, 안정화 유닛을 펩티드의 스캐폴드 말단에서 N-펩티드 말단으로 이동시키는 것은 생성된 삼량체 코일드-코일의 안정성을 증가시킬 수 있다.

D5 에피토프의 3차원 구조는 본원에 기재된 바와 같은 3개의 N-펩티드에 의해 형성된 삼량체 코일드-코일의 입체형태를 제한함으로써 모방 및 안정화된다. CCIZ 접근법에 대한 대안적 전략에서, 스캐폴드 코어는 수반되는 삼량체 코일드-코일의 형성에 의한 자가-응집에 대해 자유로운 방식으로 N-펩티드를 위치시키도록 그의 커플링 및 위치설정에 사용된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 스캐폴드 코어는 2개의 인접한 시스테인 잔기 (즉, CC)를 포함하지 않는다. 스캐폴드 코어는 N-펩티드의 공유 부착을 위한 최소 3개의 위치를 함유한다. 상기 부착 위치는 삼량체 코일드-코일을 형성하기 위한 N-펩티드의 자가-회합을 용이하게 하기 위해 스캐폴드 코어의 다른 구조적 요소로부터의 최적 간격 및 거리로 유지된다. 스캐폴드 코어는 펩티드가 공유 부착될 수 있는 3개 이상의 반응성 기를 포함하는 선형 또는 시클릭 화합물로서 존재한다. 따라서, 본원에 사용된 다가 또는 보다 구체적으로는 3가 펩티드는 스캐폴드 코어에 공유 부착된 3개의 펩티드를 포함하는 화합물이다. 스캐폴드를 갖는 3가 펩티드의 일반적 구조는 다음과 같이 나타내어진다:

스캐폴드를 갖는 펩티드의 구체적 예는 스캐폴드 상의 하나 이상의 부착 지점에 존재하는 브로마이드 또는 말레이미드 모이어티와 반응하여 후속적으로 공유 티오에테르 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 함유하는 임의의 N-펩티드일 것이다.

적어도 3개의 연결의 위치는 gp41 펩티드 모방체에서의 D5 에피토프의 생성된 입체형태가 gp41에서의 상기 에피토프의 천연 입체형태를 닮도록 선택된다. 본 발명의 gp41 펩티드 모방체는 사용되는 스캐폴드의 유형, 즉 그의 구조에 의해 영향을 받는데, 이는 스캐폴드의 크기 및 형상이 펩티드 모방체의 전체적 구조에 영향을 미칠 것이기 때문이다. 본원에 제공된 안내에 기반하여, 당업자는 gp41의 D5 에피토프의 천연 입체형태에 근접하게 닮은 입체형태를 갖는 본 발명의 펩티드 모방체를 잘 설계할 수 있다. N-펩티드에 대한 스캐폴드의 부착 지점은 바람직하게는 D5 에피토프 내에 위치하지 않는데, 이는 이러한 연결이 에피토프의 입체형태 및/또는 접근성을 방해할 것이기 때문이다. 예를 들어, 다양한 위치에서의 연결을 갖는 여러 화합물을 생성하고, 적절한 에피토프 제시의 척도로서 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, DCBA)에서 D5에 결합하고/거나 D5 결합을 억제하는 상기 화합물의 능력을 실험적으로 결정하는 것이 가능하다. 유사하게, 적절한 코일드-코일 입체형태에서의 NHR의 제시는 바이러스 진입 억제-기반 검정에서 상기 화합물의 효력에 의해 평가될 수 있다.

바람직하게는, NHR 입체형태 및/또는 D5 에피토프의 최적 제시를 갖는 화합물이 선택된다. 또한, 아미노산 서열의 동일하거나 또는 상이한 위치에 연결된 다양한 종류의 스캐폴드를 갖는 여러 화합물을 생성하고, 생성된 화합물의 NHR 입체형태 및/또는 D5 에피토프의 제시를 실험적으로 결정하는 것이 가능하다.

따라서, N-펩티드는 링커를 통해, 및 상기 아미노산 서열 내부의 적어도 1개의 결합의 형성에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 스캐폴드에 부착된다.

적합한 분자 스캐폴드 코어는 10개 이하의 탄소의 개별 고리 구조를 갖는 모노- 및 폴리- 카르보시클릭 화합물, 또는 고리 구조 내에 탄소 이외의 1개 이상의 원자, 가장 통상적으로는 질소, 산소 또는 황을 갖는 헤테로시클릭 화합물을 포함한다. 예는 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로헥산, 시클로옥탄, 피란, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 피페리딘, 옥산, 티안, 아제판, 옥세판, 티에판, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 및 그의 유도체를 포함한다.

카르보시클릭 화학적 스캐폴드의 한 예는 수(Xu) 등 (문헌 [Xu, W. et al., 2007 Chem Biol Drug Des 70: 319-328])에 의해 기재된 바와 같은, 디아미노에탄으로의 카르복실산 관능기의 유도체화에 이어서 티올-반응성 브로모아세틸 기가 도입된 시스,시스-1,3,5-트리메틸 시클로헥산-1,3,5-트리카르복실산 (켐프(Kemp) 산)이다. 켐프 산은 시클로헥산 고리 상의 3개의 카르복실이 축방향 위치를 점유하고 이에 따라 N-펩티드를 조립하기에 유리한 3축 배향을 제공하는 유리한 의자형 입체형태를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, N-펩티드는 다중 융합 고리 구조에 기반하거나 또는 이로 이루어진 스캐폴드에 커플링된다. 탄소-탄소 결합을 공유하는 2개의 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리는 융합된 것으로 말해진다. 적합한 스캐폴드는 본원에 기재된 선행 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 화합물 중 임의의 것의 융합 고리 유도체를 포함할 수 있다. 구체적 예는 콜레스테롤, 콜산, 및 그의 유도체, 및 미국 특허 번호 7,312,246에 개시된 바와 같은 터페닐을 포함한다.

화학적 스캐폴드의 다른 예는 다가 펩티드 및 단백질 조립에 유용한, 미국 특허 번호 7,524,821에 기재된 바와 같은 탄수화물-기반의 스캐폴드를 갖는 말레이미드 클러스터를 포함한다. 이러한 말레이미드 클러스터는 친전자성 모이어티에 대한 티올 기의 널리 확립된 고도로 효율적인 마이클 첨가를 이용한다 (문헌 [Kitagawa et al., 1976, J. Biochem. (Tokyo). 79:233-6; Peeters et al., 1989, J. Immunol. Methods. 120:133-43]). 따라서, 다가 펩티드의 위상은 단단한 스캐폴드 코어 상의 말레이미드 관능기의 한정된 공간 배향에 의해 제어될 수 있다. 말레이미드 대신 치환될 수 있는 대안적 티올 반응성 화합물은 아이오도아세트산, 브로모아세트산, 아이오도아세트아미드 및 피리딜 디술피드이다. 피리딜 디술피드로 형성된 디술피드 연결은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 절단가능하다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 3개 이상의 말레이미드가 각각 코어에 부착되어 있는 코어 분자를 포함하는 말레이미드 클러스터이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 3개의 말레이미드가 각각 코어에 부착되어 있는 탄수화물 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 3, 4, 5 또는 6개의 말레이미드가 각각 링커에 의해 코어에 부착되어 있는 탄수화물 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 3, 4, 5개 또는 그 초과의 말레이미드가 각각 코어에 부착되어 있는 콜산 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 3, 4, 5개 또는 그 초과의 말레이미드가 각각 링커에 의해 코어에 부착되어 있는 콜산 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 3개 이상의 말레이미드가 각각 링커에 의해 시클로덱스트린에 부착되어 있는 시클로덱스트린을 포함하는 말레이미드 클러스터이다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 각각의 코어가 1개 이상의 말레이미드를 함유하는 적어도 2개의 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 3개 이상의 말레이미드가 각각 코어에 부착되어 있는 폴리올 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 3개 이상의 말레이미드가 각각 링커에 의해 코어에 부착되어 있는 폴리올 코어를 포함하는 말레이미드 클러스터이다.

스캐폴드는 또한 모노사카라이드, 폴리올 및 올리고사카라이드일 수 있다. 본 발명의 스캐폴드의 역할을 할 수 있는 모노사카라이드는 디히드록시아세톤, 글리세르알데히드의 R 및 L 거울상이성질체 및 아노머 형태, 트레오스, 에리트로스, 에리트룰로스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 리불로스, 크실룰롤스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 프시코스, 프룩토스, 소르보스 및 타가토스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 스캐폴드 화합물의 역할을 할 수 있는 폴리올 또는 폴리알콜은 글리세리톨, 트레이톨, 에리트리톨, 리비톨, 아라비니톨, 크실리톨, 릭시톨, 알리톨, 알트리톨, 글루시톨, 만니톨, 갈락티톨, 탈리톨, 굴리톨, 이디톨, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 이노시톨, 말티톨, 락티톨, 둘시톨 및 아도니톨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 스캐폴드 화합물의 역할을 할 수 있는 올리고사카라이드는 상기 기재된 모노사카라이드의 임의의 조합을 포함하는 디사카라이드, 및 상기 기재된 모노사카라이드를 포함하는 시클릭 올리고사카라이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로덱스트린 및 시클로프룩틴은 본 발명의 스캐폴드에 사용될 수 있는 시클릭 올리고사카라이드의 예이다. 시클로덱스트린은 시클릭 (α-1,4)-연결된 올리고사카라이드이고, 이는 5-13 α-D-글루코-피라노스, 시클로만닌, 시클로알트린 및 시클로갈락틴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로덱스트린은 운반 화합물일 수 있는 소수성 코어를 포함한다. 말레이미드 클러스터는 반응성 말레이미드 모이어티를 포함하는 여러 연결된 코어 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 화학적 스캐폴드 코어는 또한 콜산, 콜레스테롤, 시클릭 펩티드, 포르피린 및 칼릭스 [4] 아렌, 탄수화물 및 폴리아민에 기반한 것일 수 있다. 구체적 폴리아민은 트리아민, 예를 들어 디에틸렌 트리아민 펜타-아세트산, 펜타메틸디에틸렌 트리아민, 트리스-2 아미노에틸 아민, 디프로필렌트리아민 등이어야 한다.

스캐폴드는 또한 N-펩티드의 부착 지점의 역할을 할 수 있는 최소 3개의 관능기를 함유하는 비-시클릭 또는 선형 분자일 수 있다. 이러한 부류의 스캐폴드의 예는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트; 트리스-(2-말레이미도에틸)아민; TRIS (Boc-β-Ala-TRIS-(OH)₃); 및 TREN (트리스(2-아미노에틸)아민)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TRIS 스캐폴드는 문헌 [Cai et al., 2007, Bioorganic Chemistry 35:327-337]에 기재되어 있다. TREN (트리스(2-아미노에틸)아민)은 문헌 [Kwak et al., 2002, J. Am. Chem. Soc. 124:14085-14091]에 기재되어 있다. 스캐폴드 코어로서 적합한 추가의 구조는 미국 특허 번호 7,604,804 (그 전문이 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, N-펩티드는 활성화된 N-펩티드에 대한 부착을 위해 유도체화될 수 있는 측쇄를 함유하는 아미노산에 기반하거나 또는 이를 포함하는 선형 스캐폴드에 커플링된다. 상기 아미노산 잔기는 Lys, Arg, His, Glu, Asp, Cys, Sec 및 그의 유도체를 포함한다. 상기 아미노산 잔기는, 반응성 기 사이의 간격이 삼량체 코일드-코일을 형성하는 N-펩티드의 입체형태를 최적으로 제한하기에 적합한 적어도 3개의 반응성 기를 함유하는 폴리펩티드 쇄의 일부일 수 있다.

선형 스캐폴드의 한 예는, 3개의 동종 또는 이종 N-펩티드가 리신 잔기의 ε-아미노 측쇄 (RNH₂)에 부착될 수 있으며 X는 N-펩티드의 적절한 배향을 위한 충분한 간격을 제공하거나 또는 전하, 소수성 또는 스캐폴드의 다른 물리적 파라미터를 변형시키는 임의의 아미노산일 수 있는 것인 펩티드 Ac-X-Lys-X-Lys-X-Lys-X-NH₂를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, X는 5-아미노펜탄산이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, X는 Arg 또는 Glu이다.

선형 스캐폴드에 의해 제약되는 펩티드의 구체적 예는

Ac-Ava-Lys(N44)-Ava-Lys(N44)-Ava-Lys(N44)-Ava-NH₂

Ac-Ava-Lys(N38)-Ava-Lys(N38)-Ava-Lys(N38)-Ava-NH₂

Ac-Cys-Arg-Lys(N38)-Arg-Lys(N38)-Arg-Lys(N38)-Arg-NH₂

Ac-Cys-Glu-Lys(N38)-Glu-Lys(N38)-Glu-Lys(N38)-Glu-NH₂

(여기서, Ava는 δ-아미노 발레르산을 나타냄)

를 포함한다.

선형 스캐폴드의 예는

CH₃CO-Ava-Lys-Ava-Lys-Ava-Lys-Ava-NH₂; 서열 41

CH₃CO-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH₂; 서열 42

CH₃CO-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-NH₂; 서열 43

CH₃CO-Cys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH₂; 서열 44 또는

CH₃CO-Cys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-NH₂; 서열 45

를 포함한다.

당업자는 다양한 화학을 이용하여 N-펩티드를 스캐폴드 코어 상의 반응성 관능기에 공유 부착시킬 수 있음을 인지할 것이다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 부착은 N-펩티드 상의 티올 기와 스캐폴드 상의 친전자성 모이어티 사이의 티오에테르 결합을 포함하는데, 이는 상기 결합이 중성 또는 약간 염기성인 pH에서 수용액 중에서 용이하게 형성되고 N-펩티드 상의 티올 관능기가 펩티드의 어느 하나의 말단 상에 시스테인 잔기 또는 티올 유도체로서 제공될 수 있기 때문이다. 아미노산 서열 내부의 티오에테르 결합의 위치는 유리 시스테인 잔기의 위치를 조절함으로써 쉽게 조절될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 티올 관능기의 전구체의 역할을 하는 티오아세틸 관능기는 아미노산 서열의 입체형태를 최적으로 제한하기 위해 아미노산 서열의 처음 아미노산 위치의 N-말단 또는 마지막 아미노산 위치의 C-말단에 위치한다.

다른 종류의 결합이 또한 본 발명의 면역원성 화합물의 입체형태를 제한하는데 적합하다. 예를 들어, 디술피드 결합 (또한 SS-가교로도 불림)은 다른 아미노산 측쇄를 보호할 필요 없이 유리 시스테인 잔기 사이에 선택적으로 형성될 수 있다. 추가로, 디술피드 결합은 염기성 환경에서 인큐베이션함으로써 쉽게 형성된다. 바람직하게는, 디술피드 결합은 2개의 시스테인 잔기 사이에 형성되는데, 이는 그의 술프히드릴 기가 결합을 위해 용이하게 이용가능하기 때문이다. 아미노산 서열 내부의 SS-가교의 위치는 유리 시스테인 잔기의 위치를 조절함으로써 쉽게 조절된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 시스테인은 아미노산 서열의 입체형태를 최적으로 제한하기 위해 아미노산 서열의 처음 및 마지막 아미노산 위치 주변에 위치한다.

또 다른 실시양태에서, Se--Se 디셀레늄 결합이 이용될 수 있다. 디셀레늄 결합의 이점은 이들 결합이 환원에 무감각하다는 사실이다. 따라서, 디셀레늄 결합을 포함하는 펩티드 모방체는, 예를 들어 동물 신체 내부에 존재하는 환원 환경 하에 그의 입체형태를 유지할 수 있다는 점에서 더 우수하다. 추가로, 디셀레늄 결합은, 예를 들어 담체에 대한 후속 커플링 반응에 사용되는 유리 SH-기가 펩티드 모방체 내부에 존재하는 경우에 바람직하다. 이러한 유리 SH-기는 디셀레늄 결합과 반응할 수 없다.

또 다른 실시양태에서, 상기 결합을 형성하기 위해 복분해 반응이 이용된다. 복분해 반응에서 2개의 말단 CC-이중 결합 또는 삼중 결합은 금속-촉매화 재배열 반응에 의해 연결된다. 허용되는 촉매는 쉬록(Schrock) 몰리브데넘(VI) 또는 텅스텐(VI) 알킬리덴 또는 그럽스(Grubbs) 루테늄 카르베노이드이다. 상기 반응에 요구되는 말단 CC-이중 또는 CC-삼중 결합은, 예를 들어 알릴 브로마이드 또는 프로파르길 브로마이드에 의한 펩티드 NH-기의 알킬화를 통해, 또는 알케닐- 또는 알키닐-함유 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산의 펩티드 내로의 혼입을 통해 펩티드 내로 도입된다.

바람직한 실시양태에서, N-펩티드와 스캐폴드 코어 사이의 결합은 브로민-티올 커플링을 이용하여 형성된다. 예를 들어, 스캐폴드 코어 상의 브로모아세틸 모이어티는, 바람직하게는 펩티드의 N-말단에 존재하는 유리 시스테인의 술프히드릴 모이어티에 커플링된다. 다르게는, 스캐폴드 코어 상의 티올 모이어티는 펩티드의 NH₂ 말단 상에 또는 바람직하게는 펩티드의 N-말단에 존재하는 리신 잔기의 ε-아미노 측쇄 (RNH₂) 상에 도입된 브로모아세틸 모이어티에 커플링될 수 있다.

추가 실시양태에서, 아스파르테이트 또는 글루타메이트 잔기의 CO₂H-측쇄는 아민 관능기에 커플링되어 아미드 결합을 형성한다. 유리 아민이 다수의 방식으로 스캐폴드 코어 내로 도입될 수 있음을 인지하여야 한다. 예를 들어, 아민 관능기는 선형 폴리펩티드 스캐폴드 내부에서 리신 잔기의 ε-NH₂-측쇄를 구성할 수 있다. 다르게는, 펩티드의 유리 CO₂H-말단은 아민 관능기, 예를 들어 펩티드 스캐폴드의 유리 NH₂-말단에 커플링될 수 있다. N-펩티드의 아미노산 서열 내부에 아미드 결합을 형성하기 위한 대안적 방법이 이용가능하고, 상기 방법은 당업계에 공지되어 있다.

원칙적으로, 관심 에피토프의 1차, 2차 및 3차 서열이 본질적으로 유지되는 한, N-펩티드와 스캐폴드 코어 사이의 결합은 면역원성 N-펩티드 아미노산 서열 내부의 어느 곳에든 형성될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 연결은 아미노산 서열의 10개의 N-말단 및 10개의 C-말단 아미노산 잔기 중 임의의 하나 사이에 형성된다. 바람직하게는, 연결은 아미노산 서열의 6개의 N-말단 및 6개의 C-말단 아미노산 잔기 중 임의의 하나 사이에, 바람직하게는 4개의 N-말단 및 4개의 C-말단 아미노산 잔기 중 임의의 하나 사이에 형성된다. 물론, 내부 결합의 형성에 적합한 부위는 관심 에피토프(들)의 위치에 좌우된다. 한 바람직한 실시양태에서, 연결은 면역원성 아미노산 서열의 처음 및 마지막 아미노산 잔기 사이에 형성된다.

상기 언급된 삼량체 형성을 허용하기 위한 N-펩티드 구성성분의 최적 간격 유지의 중요성을 전제로 하여, 스캐폴드에 대한 부착 지점은 직접적일 수 있거나, 또는 N-펩티드와 스캐폴드의 코어 구성성분 사이의 거리를 증가시키는 링커 분자의 부가에 의해 변형될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 링커는 50개 이하의 원자의 길이로 탄소, 질소, 산소, 인 및 황을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 원자의 임의의 조합을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 스페이서/링커는 충분한 거리에서 3개의 N-펩티드에 결합하고 그를 위치시켜 N-펩티드의 삼량체화를 허용함으로써 gp41 프리헤어핀 중간체의 입체형태적으로 정확한 모방체를 제공하고 D5 중화 에피토프를 그의 천연 입체형태로 제공할 수 있는 임의의 분자를 포함할 수 있다.

링커는 동일한 반응성 관능기가 분자의 양쪽 말단에 존재하는 동종이관능성일 수 있다. 예는 1,2 디아미노에탄; 1,3 디아미노프로판; 푸트레신; 카다베린; 옥살산, 말론산, 숙신산, 아디프산, 3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트); 디숙신이미딜 수베레이트; 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트); 디메틸 아디프이미데이트; 비스말레이미도헥산; 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠; 아디프산 디히드라지드; 카르보히드라지드; 및 N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 켐프 3가산 스캐폴드의 카르복실산 관능기는 시클로헥산 고리 및 N-펩티드로부터의 거리를 증가시키기 위해 동종이관능성 분자 디아미노에탄과의 반응에 의해 변형된다.

다르게는, 링커는 상이한 반응성 관능기가 분자의 어느 하나의 말단에 존재하는 이종이관능성일 수 있다. 매우 다양한 이러한 분자가 용이하게 이용가능하고, 그의 부류는 아민/술프히드릴-반응성, 카르보닐/술프히드릴-반응성, 아민/광-반응성, 술프히드릴/광-반응성, 카르보닐/광-반응성 등을 포함한다. 구체적 예는 술포숙신이미딜 4-(N-말레이도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트; 4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔; m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙시니드 에스테르; 술포숙신이미딜(4-아이오도아세틸)-아미노벤조에이트; 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트; 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드; N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산; 벤조페논-4-아이오도아세트아미드; p-아지도벤조일 히드라지드; 및 5-아미노펜틸말레이미드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 길이의 이종이관능성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커가 또한 사용될 수 있고, 구체적 부류의 예는 N-히드록시숙신이미딜-PEG_(n)-말레이미드; N-히드록시숙신이미딜-PEG_(n)-아지드; 및 N-히드록시숙신이미딜-PEG_(n)-프로파르길을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 콜산의 알릴-유도체를 2-아미노에탄티올과 반응시키고, 후속적으로 γ-말레이미도부티르산과 반응시켜 콜레스테롤 고리 및 N-펩티드로부터의 거리를 증가시킨다.

본원에 기재된 펩티드 모방체의 N-펩티드 부분은 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들은 화학적으로 합성될 수 있다. 긴 펩티드는 문헌 [Kent et al., 1985, "Modern Methods for the Chemical Synthesis of Biologically Active Peptides," Alitalo et al. (Eds.), Synthetic Peptides in Biology and Medicine, Elsevier pp. 29-57]에 기재된 바와 같이 자동화 펩티드 합성기를 사용하여 고체-상 지지체 상에서 합성될 수 있다. 수동 고체-상 합성은, 예를 들어 문헌 [Merrifield, 1963, Am. Chem. Soc. 85:2149] 또는 그의 공지된 개선에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 고체-상 펩티드 합성은 또한, 매우 묽은 염기를 사용하여 Fmoc 보호기를 제거하는 Fmoc 방법에 의해 수행될 수 있다. 용액-상 합성은 통상적으로 단지 선택된 보다 작은 펩티드에 대해서만 실현가능하다. 밀접하게 관련된 펩티드의 칵테일 제조에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Houghton, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1242-1246]을 참조한다. 펩티드 모방체는 연속적 펩티드로서, 또는 형성된 후에 결합되거나 또는 연결되는 성분으로서 생성될 수 있다.

다르게는, 본원에 기재된 펩티드는 공지된 방법 및 발현 시스템을 이용하여 전체 키메라 펩티드를 코딩하는 단일 DNA일 수 있는 키메라 펩티드-코딩 DNA를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 키메라 펩티드 유전자는 적합한 프로모터 및 다른 적절한 전사 조절 요소를 함유하는 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3.neo, pcDNA3.1, pCR2.1, pBlueBacHis2 또는 pLITMUS28) 내로의 분자 클로닝에 의해 재조합적으로 발현될 수 있고, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 이동되어 키메라 펩티드를 생산할 수 있다. 발현 벡터는 본원에서 적절한 숙주에서의 클로닝된 DNA의 전사 및 그의 mRNA의 번역에 요구되는 DNA 서열로 정의된다. 이러한 벡터는 다양한 재조합 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모, 남조류, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포에서 재조합 DNA를 발현시키는데 사용될 수 있다. 적절하게 구축된 발현 벡터는 하기 성분: 숙주 세포에서의 자율적 복제를 위한 복제 기점; 선택 마커; 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위; 및 활성 프로모터를 함유하여야 한다. 발현 벡터는 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터, 특이적으로 설계된 플라스미드 또는 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상업적으로 입수가능한 포유동물 발현 벡터가 재조합 펩티드 발현에 적합할 수 있다. 또한, 다양한 상업적으로 입수가능한 박테리아, 진균 세포 및 곤충 세포 발현 벡터가 각각의 세포 유형에서 재조합 미모토프를 발현하는데 사용될 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 DNA에 결합하고 RNA 합성을 개시하도록 지시하는 DNA 서열로 정의된다. 강력한 프로모터는 mRNA가 높은 빈도로 개시되도록 유도하는 것이다. 이러한 조작을 위한 기술은 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]에서 찾아볼 수 있고, 당업자에게 널리 공지되어 있고 이용가능하다. N-펩티드에 대한 적절한 유전자 코딩을 함유하는 발현 벡터는 형질전환, 형질감염, 원형질체 융합 및 전기천공을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 기술 중 임의의 하나를 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 발현 벡터-함유 세포는 이것이 관심 펩티드를 생산하는지의 여부를 결정하기 위해 개별적으로 분석된다. 펩티드-발현 세포의 확인은 항-HIV 펩티드 항체와의 면역 반응성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 수단에 의해 수행될 수 있다. 재조합 펩티드는 동일한 유기 합성된 펩티드와 공유되지 않는 추가의 바람직한 구조적 변형, 예컨대 아데닐화, 카르복실화, 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 인산화 또는 미리스토일화를 보유할 수 있다. 이들 추가된 특징은 경우에 따라서는 재조합 발현 시스템의 적절한 선택에 의해 선택되거나 또는 선호될 수 있다.

숙주 세포에서의 N-펩티드 유전자의 발현에 이어서, N-펩티드를 회수할 수 있다. 염 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 흡착 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 다양한 조합 또는 개별 적용에 의한 세포 용해물 및 추출물 또는 조건화 배양 배지로부터의 정제를 비롯한 여러 단백질 정제 절차가 이용가능하고 사용하기에 적합하다. 또한 펩티드는 그 펩티드에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 제조된 면역친화성 칼럼의 사용에 의해 다른 세포성 단백질로부터 분리될 수 있다.

(CCIZN36)₃ 및 5-나선을 비롯한 본원에 기재된 특정 펩티드들은 공개되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Root et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:5016-5021; Root et al., 2001, Science 291:884-888; Steger et al., 2006, Journal Biol Chem 281:25813-25821; Wang et al., 2009, Sheng wu gong cheng xue bao = Chinese journal of biotechnology 25:435-440; Bianchi et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102:12903-12908; Bianchi et al., 2009, Advances in experimental medicine and biology 611:121-123; Bianchi et al., Proc Natl Acad Sci USA 107:10655-10660; Eckert et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11187-11192; Eckert et al., 2001, Annual review of biochemistry 70:777-810; Eckert et al., 1999, Cell 99:103-115; Hrin et al., 2008, AIDS research and human retroviruses 24:1537-1544; Luftig et al., 2006, Nature structural & molecular biology 13:740-747; 및 Montgomery et al., 2009, mAbs 1:462-474]을 참조한다. 역-조작된 백신을 기초로 하여 NHR-기반 펩티드를 제약하기 위한 대안적 방식을 기재하는 다수의 공개문헌이 확인된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Bomsel et al., Immunity 34:269-280; Chen et al., J Biol Chem 285:25506-25515; Corti et al., PloS one 5:e8805; de Rosny et al., J Virol 75:8859-8863; Dwyer et al., 2008, Protein Sci 17:633-643; Gokulan et al., 1999, DNA and cell biology 18:623-630; Korazim et al., 2006, J Molec Biol 364:1103-1117; Li et al., 2009, Immunobiology 214:51-60; Louis et al., 2001; J Biol Chem 276:29485-29489; Lu et al., J Pept Sci 16:465-472; Nelson et al., 2008, Virology 377:170-183; Pan et al., Journal of the Formosan Medical Association = Taiwan yi zhi 109:94-105; Qi et al., Biochem Biophys Res Comm 398:506-512; Qiao et al., 2005, J Biol Chem 280:23138-23146; Sabin et al., PLoS pathogens 6:e1001195; Sadler et al., 2008, Biopolymers 90:320-329; Schuy et al., 2009, J Structural Biol 168:125-136; Wexler-Cohen et al., 2009, PLoS pathogens 5:e1000509; Zhang et al., 2009, Vaccine 27:857-863]을 참조한다.

본원에 기재된 방법에 의해 생성된 입체형태적으로 제약된 코일드-코일 구조는 동종삼량체 코일드-코일 구조 (즉, 3개의 동일한 N-펩티드로 구성됨) 또는 이종삼량체 코일드-코일 구조 (즉, 실질적으로 유사하더라도 동일하지는 않은 3개의 N-펩티드로 구성됨)를 둘 다 포함하는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 모방체의 이종삼량체 코일드-코일 구조의 이종성은 코일드-코일 구조를 포함하는 개별 N-펩티드의 안정화 영역에 존재하는 아미노산 차이로부터 유래할 수 있다. 본원에 기재된 펩티드 모방체의 이종삼량체 코일드-코일 구조의 이종성은 코일드-코일 내부에 포함된 개별 N-펩티드 내부에 존재하는 아미노산 차이로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 이종삼량체 코일드-코일 구조는, 펩티드의 삼량체화 능력에 중요한 각각의 개별 펩티드의 칠원체 반복의 "a" 및 "d" 아미노산 위치가 동일한 반면에 소수성 영역 외부의 아미노산 위치 (예를 들어, 위치 "f")가 삼량체 코일드-코일의 개별 펩티드 사이에 상이한 3개의 N-펩티드로 구성될 수 있다. 중요하게는, 이러한 이종삼량체 구조는 여전히 HIV gp41 융합 중간체의 충실한 모방체로서 확인될 수 있는데, 이는 코일드-코일의 기능이 야생형 구조의 것과 유사하기 때문이다 (예를 들어, 항바이러스 활성 및/또는 충실한 입체형태 에피토프의 생성).

대표적인 gp41 펩티드 모방체의 삼량체 구조를 도 1a-b에 개략적으로 나타내었다.

당업자는 생성된 CC-키메라 N-펩티드가 그의 삼량체 공유-안정화된 입체형태에서 N-펩티드 도메인을 충실하게 나타내는지의 여부를, 예를 들어 높은 효력으로 HIV 감염성을 억제하는 그의 능력 또는 gp41의 N-나선 영역에 위치한 입체형태적 에피토프를 인식하는 항체에 결합하는 그의 능력을 시험함으로써 쉽게 결정할 수 있다. gp41 펩티드 모방체가 상기 내부 코일드-코일의 안정하고 충실한 모방체를 형성할 수 있는지 아닌지의 여부를 결정하기 위해 다수의 다양한 실험 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, HIV 입자의 감염성을 억제하는 입체형태적으로 제약된 gp41 펩티드 모방체의 능력을 측정하도록 설계된 검정을 수행할 수 있다. 한 이러한 검정에서, 인간 CD4 및 CCR5 수용체를 안정하게 발현하고 HIV-2 LTR의 tat-반응성 단편에 의해 가동되는 β-갈락토시다제 리포터 유전자를 보유하는 HeLa 세포를, 다양한 농도에서 gp41 펩티드 모방체의 존재 하에 다양한 균주의 HIV-1로 감염시킨다. 상기 세포를 특정 기간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 용해시키고, β-갈락토시다제 활성을 정량화한다. gp41 펩티드 모방체가 gp41 융합 중간체를 방해함으로써 HIV 감염성을 억제하는 능력을 유지하는 경우에, 낮은 β-갈락토시다제 활성이 기록된다.

본원에 기재된 gp41 펩티드 모방체는 gp41의 내부 N-나선 코일드-코일의 안정하고 충실한 모방체를 나타내기 때문에, 이들은 HIV 융합 중간체를 표적으로 하는 중화 항체 반응을 상승시키기 위한 면역원으로서 유용한 것으로 여겨진다. gp41 펩티드 모방체는, 투여되는 경우에, 이전에 감염되지 않은 개체에 예방적 이점을 제공하고/거나 감염된 개체 내부의 바이러스 로드 수준을 감소시키고 이에 따라 HIV 감염의 무증상기를 연장시킴으로써 치료 효과를 제공할 가능성이 있다.

본원에 기재된 펩티드 모방체는 다양한 경로(들), 예컨대 비강내, 복강내, 근육내, 정맥내, 질내 또는 직장내 중 하나 이상에 의해 투여될 수 있다. 각각의 실시양태에서, 펩티드 모방체는 적절한 담체 중에서 또는 면역원성 조성물로서 제공된다. 예를 들어, 펩티드 모방체는 적절한 완충제, 염수, 물, 겔, 발포체, 크림 또는 다른 적절한 담체 중에서 투여될 수 있다. 펩티드 모방체, 및 일반적으로 적절한 담체 및 임의적인 성분, 예컨대 안정화제, 흡수 또는 섭취 증진제, 및/또는 유화제를 포함하는 면역원성 조성물은 (HIV에 감염되지 않거나 또는 감염된) 개체에 대한 예방 유효 용량(들)으로 제제화되고 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 펩티드 모방체는 살미생물제로서 투여 (또는 도포)되어 세포 내로의 바이러스 진입을 방해할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 모방체는 점막 표면, 예컨대 질, 직장 또는 구강 점막에 도포되거나 또는 그와 접촉되는 조성물 중에 포함될 수 있다. 조성물은 펩티드 모방체 이외에도, 점막 표면 또는 피임 장치 (예를 들어, 콘돔, 자궁경부 캡, 다이어프램)의 표면에 도포하기에 적절한 담체 또는 베이스 (예를 들어, 크림, 폼, 겔, 펩티드 모방체를 유지하기에 충분히 점성인 다른 물질, 물, 완충제)를 포함한다. 펩티드 모방체는, 예컨대 펩티드 모방체를 함유하는 폼, 겔, 크림, 물 또는 다른 담체의 도포에 의해 점막 표면에 도포될 수 있다. 다르게는, 이것은 펩티드 모방체를 함유하고 사용 조건 (예를 들어, 질 또는 직장 온도, pH, 수분 조건) 하에 (예를 들어, 분해, 용해, 다른 방출 수단에 의해) 펩티드 모방체를 방출하거나 또는 전달하는 물질로 제조된 담체 또는 베이스인 질 또는 직장 좌제에 의해 도포될 수 있다. 모든 실시양태에서, 펩티드 모방체의 제어 또는 시간 방출 (점진적 방출, 투여 또는 삽입 후 특정한 시간의 방출)은, 예를 들어 약물을 점진적으로 또는 규정된 기간 후에 방출하는 조성물 내로 펩티드 모방체를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 다르게는, 펩티드 모방체는 (예를 들어, 질 또는 직장 내로의) 그의 투여 또는 도포 즉시 또는 직후에 펩티드 모방체를 방출하는 조성물 중에 혼입될 수 있다. 복합 방출 (예를 들어, 삽입 즉시 또는 직후, 및 시간이 경과함에 따라 또는 삽입 후 특정한 시간의 약물의 일부의 방출)이 또한 유효할 수 있다 (예를 들어, 2종 이상의 물질: 방출 또는 전달이 삽입 즉시 또는 직후에 발생하는 것 및/또는 방출 또는 전달이 점진적인 것 및/또는 방출이 특정된 기간 후에 발생하는 것으로 구성된 조성물을 생성함으로써). 예를 들어, 펩티드 모방체는 미국 특허 번호 4,707,362에 교시된 바와 같은 지속 방출 조성물 내로 혼입될 수 있다. 크림, 폼, 겔 또는 좌제는 또한 산아 제한 목적으로 사용되는 것 (예를 들어, 살정자제 또는 다른 피임제 함유)일 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다 (예를 들어, 이는 단독으로 또는 또 다른 비-피임제, 예컨대 항박테리아 또는 항진균 약물 또는 윤활제와 조합하여 펩티드 모방체를 전달하기 위해 유일하게 사용될 수 있음). 본 발명의 펩티드 모방체는 또한 사용 조건 하에 펩티드 모방체를 방출하도록 허용하는 방식으로 코팅되거나 혼입된 피임 장치 (예를 들어, 콘돔, 자궁경부 캡, 다이어프램)의 사용을 통해 개체에 투여될 수 있다. 펩티드 모방체의 방출은 상기 기재된 바와 같이 즉시, 점진적으로 또는 특정된 시간에 발생할 수 있다. 그 결과로, 이들은 HIV와 접촉하고 그에 결합하여 세포 내로의 바이러스 진입을 감소시키거나 또는 예방한다.

일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물의 성분에 대한 적절한 "유효량" 또는 투여량의 선택은 또한, 사용된 면역원성 조성물(들) 중의 펩티드 모방체의 정체, 뿐만 아니라 가장 특히 면역화되는 대상체의 전반적 건강, 연령 및 체중을 비롯한 대상체의 물리적 상태에 기반할 것이다. 투여 방법 및 경로, 및 면역원성 조성물 중의 추가의 성분의 존재는 또한 조성물의 투여량 및 양에 영향을 미칠 수 있다. 유효 용량의 이러한 선택 및 상향 또는 하향 조정은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 면역 반응, 바람직하게는 보호적 반응을 유도하거나 또는 유의한 유해 부작용 없이 대상체에서 외인성 효과를 생성하기 위해 요구되는 조성물의 양은 이들 인자에 따라 달라진다. 본원에 기재된 면역원성 조성물의 적합한 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. HIV 감염을 감소시키기에 충분한 gp41 펩티드 모방체의 용량 ("유효 용량")은 이것이 세포 내로의 HIV 진입을 완전히 또는 부분적으로 억제하는 방식으로 (예를 들어, 주사, 국소 투여에 의해, 정맥내로) 투여된다. gp41 펩티드 모방체 10 μg 내지 1000 μg, 바람직하게는 펩티드 모방체 50 μg 내지 300 μg의 투여량이, 항-HIV 또는 HIV-중화 면역 반응을 유도하기 위해 포유동물에 투여된다. 한 실시양태에서, 펩티드 모방체는 10 μg/ml 내지 1 mg/ml, 바람직하게는 50 내지 500 μg/ml의 농도에서 면역 효능에 요구되는 총량을 구성하기에 충분한 부피로 근육내로 제공되어야 한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 모방체는 프라임 부스트 요법에 사용될 수 있다. 이러한 접근법을 위한 프라이밍 성분은 DNA, 유전자 벡터, 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한될 필요는 없다. 이러한 요법은 동종 또는 이종일 수 있다. 예를 들어, 초기 투여 약 2 내지 4주 후, 부스터 용량 (동종이든 또는 이종이든 관계없이)을 투여할 수 있고, 이어서 혈청 항체 역가가 감소할 때마다 다시 투여할 수 있다. 다중 프라임 투여가 또한 이용될 수 있고, 2 내지 4주 후에 최종 프라임 투여가 이어질 수 있다. 이종 부스트는 프라임에 사용된 펩티드 모방체와 상이한 펩티드 모방체를 포함할 수 있다. 이종 부스트는 또한 당업계에 공지된 다른 HIV 예방제, 예컨대 DNA 또는 단백질 성분으로서 투여되는 재조합 gp120, gp140 및 gp160 분자를 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 모방체는, 예를 들어 펩티드 모방체에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 면역원성 운반 단백질에 공유 접합될 수 있다. 이러한 생접합 접근법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 다양한 운반 단백질 및 접합 화학이 이용될 수 있음이 인지될 것이다.

환자 투여에 적합한 면역원성 조성물은 생물학적 활성을 유지하면서 또한 허용되는 온도 범위 내의 저장 동안 최대 안정성을 촉진시키는 제제 중에 유효량의 펩티드 모방체를 함유할 것이다. 본 발명에 따른 프라이밍 또는 부스팅 용량의 펩티드 모방체를 포함하는 면역원성 조성물은 생리학상 허용되는 성분, 예컨대 완충제, 생리 염수 또는 포스페이트 완충 염수, 수크로스, 다른 염 및 폴리소르베이트를 함유할 수 있다. 당업자는 다른 통상의 백신 부형제도 또한 제제를 제조하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

아주반트는 본원에 기재된 펩티드 모방체를 함유하는 면역원성 조성물의 제조 동안 첨가될 수도 있고 첨가되지 않을 수도 있다. 예를 들어, 특히 요변성 점성 균질 수산화알루미늄 겔 형태의 명반은 인간 백신에서의 전형적이고 바람직한 아주반트이다.

이들 펩티드 모방체는 HIV 복제 및/또는 다른 HIV 단백질을 억제하기 위해 다양한 항레트로바이러스제와 조합되어 사용될 수 있다. 펩티드 모방체-기반 조성물과 함께 사용될 수 있는 항레트로바이러스제의 부류는 뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NRTI), 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI) 및 프로테아제 억제제 (PI)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 HIV 단백질은 gp120, gp140 및 gp160을 포함한다. HIV 단백질을 코딩하는 DNA 벡터가 또한 적합하고, 이것은 gp120, gp140 및 gp160분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 HIV 단백질을 코딩할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 요법의 투여를 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 포유동물 또는 척추동물 대상체에서 면역원성 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위해 설계된다. 키트는 본 발명의 gp41 펩티드 모방체를 포함하는 면역원성 조성물을 함유한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물의 다중 사전포장 투여량이 다중 투여를 위한 키트에서 제공된다.

키트는 또한 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물의 사용에 대한 지침서를 함유한다. 키트는 또한 특정 검정을 수행하기 위한 지침서, 상기 기재된 다양한 담체, 부형제, 희석제, 아주반트 등, 뿐만 아니라 조성물의 투여를 위한 장치, 예컨대 시린지, 스프레이 장치 등을 포함할 수 있다. 다른 성분은 다른 조성물 중에서도 일회용 글로브, 제염 지침서, 어플리케이터 스틱 또는 용기를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태를 첨부 도면과 관련하여 기재하였지만, 본 발명이 정확하게 그 실시양태에 제한되지는 않으며, 첨부된 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 또는 취지를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 당업자에 의해 달성될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

하기 비제한적 실시예는 본 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공된다.

실시예 1

면역원 제조 및 특성화

면역원 제조: 합성 펩티드

1. (CCIZN36)₃

자동화 펩티드 합성기 상에서 고체 상 Fmoc/t-Bu 화학을 이용하여 펩티드 단량체 CCIZN36 (CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL (서열 46))을 합성하였다. 사용된 수지는 H-링크 아미드 켐매트릭스(H-Rink Amide ChemMatrix; 매트릭스-이노베이션 인크.(Matrix-Innovation Inc.), 캐나다 퀘벡주 세인트 후버트)였다. 수지 유리 아미노 기에 비해 5-10배 과량의 아미노산을 사용하여 각 사이클 당 30분의 이중 커플링으로 아실화를 수행하였다. 아미노산을 등몰량의 HATU [2-(1H-9-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-아미늄 헥사플루오로포스페이트] 및 2배 몰 과량의 DIEA (N,N-디이소프로필에틸아민)로 활성화시켰다. 사용된 측쇄 보호기는 하기와 같았다: 시스테인, 글루타민, 아스파라긴 및 히스티딘에 대해 트리틸; 리신 및 트립토판에 대해 tert-부톡시-카르보닐; 글루탐산, 트레오닌 및 세린에 대해 tert-부틸; 및 아르기닌에 대해 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐. 합성 종료시에, 펩티드를 90% 트리플루오로아세트산, 5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물 및 2.5% 3,6-디옥사-1,8-옥탄-디티올로 3시간 동안 실온에서 처리하여 수지로부터 절단하였다. 펩티드 용액을 여과하고, 차가운 디에틸 에테르에 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 원심분리에 의해 펠릿화시킨 다음, 펠릿을 차가운 디에틸 에테르로 2회 세척하여 유기 스캐빈저를 제거하였다. 최종 펠릿을 건조시키고, 물 중 25% 아세트산 중에 재현탁시키고, 동결건조시켰다.

0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배로 주피터(Jupiter) C18 칼럼 (250 x 30 mm, 10μ, 300A, 페노메넥스, 인크.(Phenomenex, Inc.), 캘리포니아주 토런스)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 조 펩티드를 정제하였다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. 정제된 펩티드에 대해 결정된 단일동위원소 질량은 7541.22 Da이었다 (서열-예측된 질량은 7542.24 Da임).

1 N 구아니딘, 0.2M HEPES, 1 mM EDTA, 1.5 mM 환원된 글루타티온 및 0.75 mM 산화된 글루타티온을 함유하는 완충제 (pH 7.5) 30 ml 중에 정제된 CCIZN36 (35 mg)을 용해시켰다. 이들 조건 하에, CCIZN36을 분자의 공유 삼량체 형태 (CCIZN36)₃으로 천천히 산화시켰다. 산화 반응의 진행을 HPLC에 의해 모니터링하고, 24시간 후, 트리플루오로아세트산 500 μl를 반응 혼합물에 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 이를 비닥(Vydac)® 디페닐 칼럼 (22 x 250 mm, 10-15μ, 그레이스(Grace), 일리노이주 디어필드) 상에 직접 로딩하고, 20 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분획을 RP HPLC/질량 분광측정법에 의해 분석하였다. 공유 삼량체에 해당하는 분획을 추가의 사용을 위해 풀링하였다. 정제된 삼량체에 대해 결정된 단일동위원소 질량은 22620.58Da이었다 (서열-예측된 질량은 22620.681 Da임).

2. KTA(N51)₃

3가 브로마이드 스캐폴드 KTA-Br 상에서의 3개의 티올 태그부착된 단량체 N51 펩티드 S-아세틸글리콜산-N51의 라이게이션을 통해 삼량체 펩티드 복합체를 합성하였다.

KTA-Br은 켐프 3가산-중심화된 대칭 3가 스캐폴드이다. 이것은 문헌 [Xu et al., 2007, Chem Bio Drug Des 70:319-328]에 기재된 프로토콜에 따라, 최종 아실화 단계 동안 브로모아세트산 무수물을 사용하는 변형에 의해 합성하였다.

자동화 펩티드 합성기 상에서 Fmoc/t-Bu 화학을 이용하여 고체 상에 의해 펩티드 N51을 합성하였다. 사용된 수지는 100% PEG 수지인 H-링크 아미드 켐매트릭스 (매트릭스-이노베이션 인크.)였다. 수지 유리 아미노 기에 비해 5-10배 과량의 아미노산을 사용하여 30분 동안의 이중 커플링으로 아실화를 수행하였다. 아미노산을 등몰량의 HATU [2-(1H-9-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-아미늄 헥사플루오로포스페이트] 및 2배 몰 과량의 DIEA (N,N-디이소프로필에틸아민)로 활성화시켰다. 측쇄 보호기는 하기와 같았다: 글루타민, 아스파라긴 및 히스티딘에 대해 트리틸; 리신 및 트립토판에 대해 tert-부톡시-카르보닐; 글루탐산, 트레오닌 및 세린에 대해 tert-부틸; 및 아르기닌에 대해 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐. 서열 조립 종료시에, 보호된 티올 기를 동일한 양의 N-히드록시벤조트리아졸의 존재 하에 S-아세틸티오글리콜산 펜타플루오로페닐 에스테르 (SAMA-OPfp)의 수동 커플링에 의해 펩티드 N 말단에 도입시켰다. 티올을 보호하는 아세틸 기는 다음 라이게이션 단계 동안 히드록실아민에 의해 쉽게 제거될 수 있다. 합성 종료시에, 건조 펩티드 수지를 절단 혼합물 (95% 트리플루오로아세트산, 2.5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물)로 3시간 동안 실온에서 처리하였다. 수지를 여과하고, 펩티드를 침전시키기 위해 용액을 차가운 디에틸 에테르에 첨가하였다. 원심분리한 후, 펩티드 펠릿을 차가운 디에틸 에테르로 2회 세척하여 유기 스캐빈저를 제거하였다. 최종 펠릿을 건조시키고, 물 중 25% 아세트산 중에 재현탁시키고, 동결건조시켰다.

40 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배 및 주피터 C18 칼럼 (250 x 30 mm, 10μ, 300A)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 조 펩티드를 정제하였다. 분석용 HPLC를 주피터 C18 칼럼 (150 x 4.6 mm, 5 μ, 300 A) 상에서 수행하였다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +4 내지 +7의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 6051.6 Da이었다 (서열-예측된 질량은 6051 Da임).

6 N 구아니딘, 0.1 N 아세트산암모늄 및 0.5 N 히드록실아민을 함유하는 pH 7-7.5 완충제 8 ml 중에 정제된 펩티드 전구체 S-아세틸글리콜산-N51 (60 mg)을 용해시켰다. KTA-Br₃ 1.7 mg을 트리플루오로에탄올 1 ml 중에 용해시킨 다음, 펩티드 용액에 적가하였다. 반응을 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 5시간 후, TFA 500 μl를 용액에 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 용액을 비닥® 디페닐 칼럼 (22 x 250 mm, 10-15μ) 상에 직접 로딩하고, 20 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 공유 삼량체에 해당하는 풀링된 분획을 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. ESI 스펙트럼은 +14 내지 +18의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 18532.8Da이었다 (서열-예측된 질량은 18532 Da임).

3. KTA(N51-2B)₃

KTA(N51)₃의 합성에 대해 기재된 것과 동일한 프로토콜을 따름으로써, 3가 브로마이드 스캐폴드 KTA-Br 상에서의 3개의 티올 태그부착된 단량체 N51-2B 펩티드 S-아세틸글리콜산-(N51-2B)의 라이게이션을 통해 삼량체 펩티드 복합체를 합성하였다.

보다 가용성이고 안정화된 N51 삼량체를 생성하기 위한 시도로 N51-2B 서열을 설계하였다. Ile 잔기를 "a" 및 "d" 위치에 부가하여 삼량체 형성을 최적화하고, 다른 치환을 펩티드의 N 말단 부분에서 "f" 및 "c" 위치에 생성하여 가용성을 보조하였다. 소수성 포켓 근처의 1개의 Leu 잔기를 Ala 잔기로 변화시켰지만, 소수성 포켓의 일부인 Leu는 유지하였다.

자동화 펩티드 합성기 상에서 Fmoc/t-Bu 화학을 이용하여 고체 상에 의해 펩티드 N51-2B를 합성하였다. 사용된 수지는 H-링크 아미드 MBHA 수지 LL (100-200 메쉬, 0.36 mmol/g) (EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences), 캘리포니아주 샌디에고)이었다. S-아세틸글리콜산-N51-2B의 합성, 절단 및 정제는 S-아세틸글리콜산-N51에 대해 기재된 것과 동일한 프로토콜을 따랐다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +4 내지 +7의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 6109 Da이었다 (서열-예측된 질량은 6109 Da임).

6N 구아니딘, 0.1 N 아세트산암모늄 및 0.5 N 히드록실아민을 함유하는 pH 7.3 완충제 1ml 중에 정제된 펩티드 전구체 S-아세틸글리콜산-N51 (10 mg)을 용해시켰다. 약 0.25 당량의 KTA-Br₃을 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 펩티드 용액에 적가하였다. 반응을 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 4시간 후, 반응을 종결시키고, 용액을 비닥® C18 칼럼 (10 x 250 mm, 5μ) 상에 직접 로딩하고, 5 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 공유 삼량체에 해당하는 풀링된 분획을 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. ESI 스펙트럼은 +14 내지 +18의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 18708.8Da이었다 (서열-예측된 질량은 18709 Da임).

4. KTA (N51-3B)₃

KTA(N51)₃의 합성에 대해 기재된 것과 동일한 프로토콜을 따름으로써, 3가 브로마이드 스캐폴드 KTA-Br 상에서의 3개의 티올 태그부착된 단량체 N51-3B 펩티드 S-아세틸글리콜산-(N51-3B)의 라이게이션을 통해 삼량체 펩티드 복합체를 합성하였다.

보다 가용성이고 안정화된 N51 삼량체를 생성하기 위한 시도로 N51-3B 서열을 설계하였다. 서열은 본래의 N51에서의 Ala로의 단일 변화이다.

자동화 펩티드 합성기 상에서 Fmoc/t-Bu 화학을 이용하여 고체 상에 의해 펩티드 N51-3B를 합성하였다. 사용된 수지는 H-링크 아미드 MBHA 수지 LL (100-200 메쉬, 0.36 mmol/g) (EMD 바이오사이언시스)이었다. S-아세틸글리콜산-N51-3B의 합성, 절단 및 정제는 S-아세틸글리콜산-N51에 대해 기재된 것과 동일한 프로토콜을 따랐다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +4 내지 +7의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 6007.8 Da이었다 (서열-예측된 질량은 6010 Da임).

6 N 구아니딘, 0.1 N 아세트산암모늄 및 0.5 N 히드록실아민을 함유하는 pH 7.3 완충제 1 ml 중에 정제된 펩티드 전구체 S-아세틸글리콜산-N51 (5 mg)을 용해시켰다. 약 0.25 당량의 KTA-Br₃을 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 펩티드 용액에 적가하였다. 반응을 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 4시간 후, 반응을 종결시키고, 용액을 비닥® C4 칼럼 (10 x 250 mm, 5μ) 상에 직접 로딩하고, 5 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 공유 삼량체에 해당하는 풀링된 분획을 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. ESI 스펙트럼은 +14 내지 +18의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 18405.4Da이었다 (서열-예측된 질량은 18406 Da임).

5. 콜산 (N51)₃

3가 트리말레이미도 콜산 주형 상에서의 3개의 티올 태그부착된 단량체 N51 펩티드 S-아세틸글리콜산-N51의 라이게이션을 통해 삼량체 펩티드 복합체를 합성하였다.

콜산 소듐 1 (2 g, 4.65 mmol)을 THF (테트라히드로푸란) 25 ml 중에 현탁시켰다. 알릴 아이오다이드 (3.8 ml, 1 당량)를 혼합물에 첨가하고, 이어서 수소화나트륨 (60%) 2.2 g을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 70℃에서 밤새 교반하고, TLC 및 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 이어서, 물을 반응 혼합물, 및 에틸아세테이트/1 N HCl에 첨가하였다. 생성물을 유기 층 내로 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 생성된 조 생성물을 LC-MS에 의해 특성화하여, 주요 성분이 528.7 Da의 분자량을 갖는 3가 알릴 콜산 2임을 확인하였다.

알릴 콜산 2 (300 mg, 0.8 mmol), 시스테아민 히드로클로라이드 및 아조비스이소부티로니트릴 (AIBN) (라디칼 개시제로서의 것)을 광 반응기 내에서 메탄올 (5 ml, 질소로 탈기함)과 혼합하였다. 혼합물을 UV 램프로 254 nm 파장에서 조사하고, 실온에서 3일에 걸쳐 교반하였다. 반응을 LC-MS 및 TLC에 의해 모니터링하였다. 화합물 3 (C₃₉H₇₃N₃O₅S₃, MW=760.29)의 생성물, 및 그의 메틸 에스테르 4 (C₄₀H₇₅N₃O₅S₃ MW=774.25)를 1:1 비로 수득하였다.

화합물 4 (10 mg, 1 당량)를 DMF 1 ml 중에 용해시킨 다음, γ-말레이미도부티르산 (3.6 당량), HATU (1 당량) 및 트리에틸아민 (2 당량)을 첨가하였다. 반응이 완결될 때까지 2시간 동안 교반하였다. 증발시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트/ 1 N HCl, NaHCO₃ 및 염수에 의해 추출하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 농축시킨 다음, 정제하여 1269.6 Da의 분자량을 갖는 화합물 5를 수득하였고; 반면에 발견된 (M⁺Na⁺) 피크는 1292.26 Da이었다.

정제된 펩티드 전구체 S-아세틸글리콜산-N51 (4.8 mg)을 20 mM 트리스 및 0.5 N 히드록실아민을 함유하는 pH 7 완충제 0.2 ml 중에 용해시켰다. 트리말레이미도 콜산 50 μg을 DMF/TFE 50 μl 중에 용해시키고, 펩티드 용액에 적가하였다. 반응을 LC-MS에 의해 모니터링하였다. 2시간 후, 반응이 완결되었고, 혼합물을 주피터 C18 칼럼 (10 x 250 mm, 10 μ) 상에 직접 로딩하고, 5 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 공유 삼량체 화합물 6 콜산 (N51)₃ (ChA-(N51)₃)에 해당하는 풀링된 분획을 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. 이론적 평균 분자량은 19296 Da였고, 반면에 발견된 단일동위원소 피크는 19289.6 Da이었다.

6. 접합을 위한 티올을 갖는 콜산 (N51)₃

차폐된 티올 기를 갖는 트리말레이미도 콜산 주형 상에서의 3개의 티올 태그부착된 단량체 N51 펩티드 티오프로판산 아실-N51의 라이게이션을 통해 삼량체 펩티드 복합체를 합성하였다. 라이게이션한 후, 차폐된 티올을 제거하여 접합가능한 콜산-(N51)₃을 형성하였다.

시스테아민 (1.15 g) 및 아세트아미드메탄올 (1 g)의 혼합물을 TFA (트리플루오로아세트산) 중에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 교반하여 148 Da의 분자량을 갖는 (S-아세트아미도메틸) 시스테아민 7을 수득하였고; 반면에 발견된 (M+H) 이온 피크는 149 Da이었다.

알릴 콜산 2 (100 mg)를 DCM (디클로로메탄) 중 EDC (에틸렌 디클로라이드), DIEPA (N,N-디이소프로필에틸아민)와 혼합하고, 이어서 DCM 중에 용해된 화합물 7 (56 mg)을 첨가하였다. 반응을 TLC에 의해 모니터링하였고, 2시간 내로 완결되는 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석한 후, 1 N HCl을 첨가하고, 화합물을 유기 층 내로 추출하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 658.97 Da의 분자량을 갖는 화합물 8을 수득하였고; 반면에 발견된 (M+H) 이온 피크는 659 Da이었다.

화합물 8 (500 mg), 시스테아민 히드로클로라이드 및 아조비스이소부티로니트릴 (AIBN)을 광 반응기 내에서 메탄올 (5 ml, 질소로 탈기함)과 혼합하였다. 혼합물을 UV 램프로 254 nm에서 조사하고, 실온에서 3일에 걸쳐 교반하였다. 반응 진행을 LC-MS 및 TLC에 의해 모니터링하였다. 반응의 완결시, 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 에틸아세테이트/1 N HCl (1:1)을 첨가하여, 889.5 Da의 이론적 분자량; 및 890 Da의 관찰된 분자량 ((M+H) 이온 피크)을 갖는 생성물 트리아미노콜산 (화합물 9)을 수득하였다.

화합물 9 (50 mg, 1 당량)를 DMF 2 ml 중에 용해시킨 다음, γ-말레이미도부티르산 (4.5 당량), HATU (4.5 당량) 및 트리에틸아민 (9 당량)을 첨가하였다. 반응이 완결될 때까지 2시간 동안 교반하였다. 증발시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트/ 1 N HCl, NaHCO₃ 및 염수로 추출하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 다음, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 정제하여 이론적 분자량 1384.66 Da의 화합물 10을 수득하였고; 발견된 (M+H) 이온 피크는 1385.6 Da이었다.

자동화 펩티드 합성기 상에서 Fmoc/t-Bu 화학을 이용하여 고체 상에 의해 펩티드 N51을 합성하였다. 사용된 수지는 H-링크 아미드 켐매트릭스 (매트릭스-이노베이션 인크.)였다. 수지 유리 아미노 기에 비해 5-10배 과량의 아미노산을 사용하여 30분 동안의 이중 커플링으로 아실화를 수행하였다. 아미노산을 등몰량의 HATU [2-(1H-9-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-아미늄 헥사플루오로포스페이트] 및 2배 몰 과량의 DIEA (N,N-디이소프로필에틸아민)로 활성화시켰다. 측쇄 보호기는 하기와 같았다: 글루타민, 아스파라긴 및 히스티딘에 대해 트리틸; 리신 및 트립토판에 대해 tert-부톡시-카르보닐; 글루탐산, 트레오닌 및 세린에 대해 tert-부틸; 및 아르기닌에 대해 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐. 서열 조립 후, 펩티드 수지 상의 N-말단 아미노 기를 HATU 및 트리에틸아민의 존재 하에 DMF 중 3-(트리틸티오) 프로피온산에 커플링시켰다. 합성 종료시에, 건조 펩티드 수지를 절단 혼합물 (92.5% 트리플루오로아세트산, 2.5% 트리이소프로필실란, 2.5% 물 및 2.5% 3,6-디옥사-1,8-옥탄-디티올)로 2시간 동안 실온에서 처리하였다. 수지를 여과하고, 펩티드를 침전시키기 위해 용액을 차가운 디에틸 에테르에 첨가하였다. 원심분리한 후, 펩티드 펠릿을 차가운 디에틸 에테르로 2회 세척하여 유기 스캐빈저를 제거하였다. 최종 펠릿을 건조시키고, 물 중 25% 아세트산 중에 재현탁시키고, 동결건조시켰다.

40 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/아세토니트릴 구배 및 주피터 C18 칼럼 (250 x 30 mm, 10μ, 300A)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 조 펩티드를 정제하였다. 분석용 HPLC를 주피터 C18 칼럼 (150 x 4.6 mm, 5 μ, 300 A) 상에서 수행하였다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +4 내지 +7의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 6022 Da이었다 (서열-예측된 질량은 6023 Da임).

정제된 펩티드 티오프로피온산 N51 (15 mg)을 20 mM 트리스 완충제 (pH 7.0) 5 ml 중에 용해시켰다. 아세토니트릴 용액 2 ml 중에 용해된 주형 화합물 10 (1.05 mg)을 펩티드 용액에 첨가하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 1시간 후, 생성된 혼합물을 C18 칼럼 상에 직접 로딩하고, 정제하여 19455 Da의 이론적 평균 분자량을 갖는 생성물 11을 수득하였다. ESI 스펙트럼은 +13 내지 +18의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 19451.5 Da이었다.

화합물 11 (5 mg)을 아세트산을 함유하는 pH 4 수성 완충제 5 ml 중에 용해시켰다. 아세트산수은 (2.1 mg)을 아세토니트릴 2 ml 중에 용해시키고, 펩티드 용액에 적가하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 1시간 후, 2-메르캅토에탄올 12 μl를 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 가열하고, 이어서 용리액으로서의 5% 아세트산과 PD10 탈염 칼럼 (지이 헬스케어 라이프사이언시스(GE Healthcare Lifesciences), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 정제하였다. ESI 스펙트럼은 +13 내지 +19의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 19384 Da이었다 (서열-예측된 질량은 19384 Da임).

면역원 제조: 재조합 펩티드

1. 재조합 (CCIZN36)₃

하기 열거된 펩티드 서열을 코딩하는 합성 유전자를 진아트(GeneArt)® (라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation), 캘리포니아주 칼스배드)에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및/또는 PCR 생성물로부터 조립하였다. 단편을 NdeI 및 BamHI 클로닝 부위를 이용하여 pET20b_A092 (EMD 바이오사이언시스, 뉴저지주 깁스타운) 내로 클로닝하였다. 플라스미드를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, UV 분광분석법에 의해 농도를 결정하였다. 최종 구축물을 서열분석에 의해 검증하였다. 사용된 제한 부위 내에서의 서열 일치율은 100%였다. 플라스미드를 사용 전까지 동결건조시켰다.

CCIZN36:

CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL (서열 46)

BL21(DE3)pLysS 적격 세포 (인비트로젠(Invitrogen)™, 라이프 테크놀로지스 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드)를 제조업체의 지시에 따라 CCIZN36에 대한 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 50 μg/mL 암피실린 및 34 μg/mL 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니(Luria-Bertani; LB) 한천 상에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 성장시켰다. 여러 개의 콜로니를 플레이트로부터 피킹하고, 항생제를 함유하는 LB 배지에 단일 콜로니를 접종하고, 밤새 37℃에서 225 rpm으로 진탕시키면서 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물로부터 각각의 콜로니에 대해 글리세롤 스톡을 또한 제조하고, 글리세롤 스톡을 추후의 대규모 발현 실험을 위한 출발 물질로서 사용하였다. 항생제를 함유하는 신선한 LB 배지에 밤새 배양한 전배양물의 1:40 희석물을 접종하고, 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 성장시켰다. 이어서, 0.5 mM 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 추가로 3 내지 4시간 동안 37℃에서 성장시킨 다음, 10,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 수확하였다. 세포 펠릿을 -20℃에 저장하였다.

세포를 용해 완충제 (50 mM 트리스, pH 8.0, 2 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 70 U/mL 벤조나제(Benzonase)® (EMD 바이오사이언시스, 뉴저지주 깁스타운), 1X 로슈 컴플리트(Roche Complete)™ 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corp.), 인디애나주 인디아노폴리스)) 중에 재현탁시키고, 마이크로플루다이저를 통해 3회 통과시킴으로써 용해시켰다. 이어서, 용해물을 원심분리에 의해 투명화시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 CCIZN36 생성물의 대부분이 불용성 분획에서 검출되었음을 확인시켰다. 따라서, 불용성 분획으로부터 반복적인 균질화 및 원심분리 단계에 의해, 세척된 봉입체를 제조하였다. 최종 세척된 봉입체를 원심분리에 의해 펠릿화시키고, -70℃에서 동결시켰다.

정제된 봉입체 (2 g)를 TCEP [(트리스(2-카르복시에틸) 포스핀] 200 mg과 함께 0.1% TFA를 함유하는 물 중 50% 아세토니트릴 중에 용해시켰다. 용액을 실온에서 밤새 유지하였다. 다음날 아침, 생성물을 원심분리에 의해 투명화시켰다. 재조합 펩티드를 함유하는 상청액을 주피터 C18 칼럼 (250 x 30 mm, 10μ, 300A) 상에 로딩하고, 40 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/ 아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분석용 HPLC를 비닥® 디페닐 칼럼 (150 x 4.6 mm) 상에서 수행하고, 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +4 내지 +11의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 7510.1 Da이었다 (서열-예측된 질량은 7506 Da임).

정제된 펩티드 전구체 (60 mg)를 1 N 구아니딘, 0.2 M HEPES, 1 mM EDTA, 1.5 mM의 환원된 형태 글루타티온 및 0.75 mM의 산화된 형태 글루타티온을 함유하는 완충제 (pH 7.5) 80 ml 중에 용해시켰다. 산화 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 다음날, TFA 500 μl를 용액에 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 용액을 비닥® 디페닐 칼럼 (22 x 250 mm, 10-15μ) 상에 직접 로딩하고, 20 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/ 아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분석용 HPLC 분석은 상기 기재된 것과 동일하였다. 공유 삼량체에 해당하는 풀링된 분획을 고해상도 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. ESI 스펙트럼은 +12 내지 +27의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 22524 Da이었다 (서열-예측된 질량은 22511 Da임).

2. 재조합 (CCIZN51)₃

하기 열거된 펩티드 서열을 코딩하는 합성 유전자를 진아트®에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및/또는 PCR 생성물로부터 조립하였다. 단편을 NdeI 및 BamHI 클로닝 부위를 이용하여 pET20b_A092 내로 클로닝하였다. 플라스미드를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, UV 분광분석법에 의해 농도를 결정하였다. 최종 구축물을 서열분석에 의해 검증하였다. 사용된 제한 부위 내에서의 서열 일치율은 100%였다. 플라스미드를 사용 전까지 동결건조시켰다.

CCIZN51:

CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 40)

BL21(DE3)pLysS 적격 세포 (인비트로젠™)를 제조업체의 지시에 따라 CCIZN51에 대한 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 50 μg/mL 암피실린 및 34 μg/mL 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니 (LB) 한천 상에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 성장시켰다. 여러 개의 콜로니를 플레이트로부터 피킹하고, 항생제를 함유하는 LB 배지에 단일 콜로니를 접종하고, 밤새 37℃에서 225 rpm으로 진탕시키면서 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물로부터 각각의 콜로니에 대해 글리세롤 스톡을 또한 제조하고, 글리세롤 스톡을 추후의 대규모 발현 실험을 위한 출발 물질로서 사용하였다. 항생제를 함유하는 신선한 LB 배지에 밤새 배양한 전배양물의 1:40 희석물을 접종하고, 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 성장시켰다. 이어서, 0.5 mM 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 추가로 3 내지 4시간 동안 37℃에서 성장시킨 다음, 10,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 수확하였다. 세포 펠릿을 -20℃에 저장하였다.

세포를 용해 완충제 중에 재현탁시키고, 마이크로플루다이저를 통해 3회 통과시킴으로써 용해시켰다. 이어서, 용해물을 원심분리에 의해 투명화시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 CCIZN51 생성물의 대부분이 불용성 분획에서 검출되었음을 확인시켰다. 따라서, 불용성 분획으로부터 반복적인 균질화 및 원심분리 단계에 의해, 세척된 봉입체를 제조하였다. 최종 세척된 봉입체를 원심분리에 의해 펠릿화시키고, -70℃에서 동결시켰다.

봉입체를 4 M 우레아, 20 mM HEPES 및 20 mM의 TCEP를 함유하는 완충제 중에 용해시켰다. 용액을 실온에서 밤새 유지하였다. 원심분리한 후, 상청액을 비닥® 디페닐 칼럼 (22 x 250 mm, 10-15μ) 상에 직접 로딩하고, 20 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/ 아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분석용 HPLC를 비닥® 디페닐 칼럼 (150 x 4.6 mm) 상에서 수행하였다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +6 내지 +11의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 9419.4 Da이었다 (서열-예측된 질량은 9417 Da임).

정제된 펩티드 전구체 (20 mg)를 1 N 구아니딘, 0.2 M HEPES, 1 mM EDTA, 1.5 mM의 환원된 형태 글루타티온 및 0.75 mM의 산화된 형태 글루타티온을 함유하는 완충제 (pH 7.5) 40 ml 중에 용해시켰다. 산화 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 다음날, TFA 500 μl를 용액에 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 용액을 비닥® 디페닐 칼럼 (22 x 250 mm, 10-15μ) 상에 직접 로딩하고, 20 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/ 아세토니트릴 구배를 이용하여 RP HPLC에 의해 정제하였다. 분석용 HPLC 분석은 상기 기재된 것과 동일하였다. 공유 삼량체에 해당하는 풀링된 분획을 고해상도 질량 분광측정법에 의해 추가로 분석하였다. ESI 스펙트럼은 +20 내지 +27의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 28241.6 Da이었다 (서열-예측된 질량은 28248 Da임).

3. 재조합 SZN51

BL21(DE3)pLysS 적격 세포 (인비트로젠)를 제조업체의 지시에 따라 SZN51에 대한 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 50 μg/mL 암피실린 및 34 μg/mL 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니 (LB) 한천 상에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 성장시켰다. 여러 개의 콜로니를 플레이트로부터 피킹하고, 항생제를 함유하는 LB 배지에 단일 콜로니를 접종하고, 밤새 37℃에서 225 rpm으로 진탕시키면서 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물로부터 각각의 콜로니에 대해 글리세롤 스톡을 또한 제조하고, 글리세롤 스톡을 추후의 대규모 발현 실험을 위한 출발 물질로서 사용하였다. 항생제를 함유하는 신선한 LB 배지에 밤새 배양한 전배양물의 1:40 희석물을 접종하고, 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 성장시켰다. 이어서, 0.5 mM 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 추가로 3 내지 4시간 동안 37℃에서 성장시킨 다음, 10,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 수확하였다. 세포 펠릿을 -20℃에 저장하였다.

세포를 용해 완충제 중에 재현탁시키고, 마이크로플루다이저를 통해 3회 통과시킴으로써 용해시켰다. 이어서, 용해물을 원심분리에 의해 투명화시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 SZN51 생성물의 대부분이 불용성 분획에서 검출되었음을 확인시켰다. 따라서, 불용성 분획으로부터 반복적인 균질화 및 원심분리 단계에 의해, 세척된 봉입체를 제조하였다. 최종 세척된 봉입체를 원심분리에 의해 펠릿화시키고, -70℃에서 동결시켰다.

세척된 봉입체 (0.2 g)를 0.1%의 TFA를 함유하는 15% 아세토니트릴/물 20 ml 중에 용해시켰다. 0.45um PVDF 디스크 (와트만(Whatman))를 통해 여과한 후, 용액을 비닥® C4 칼럼 (22 x 250 mm, 300Å) 상에 직접 로딩하고, 15 ml/분의 유량으로 0.1% 트리플루오로아세트산의 존재 하에 물/ 아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분석용 HPLC를 비닥® C4 칼럼 (150 x 4.6 mm) 상에서 수행하였다. 정제된 펩티드를 전기분무 질량 분광측정법에 의해 특성화하였다. ESI 스펙트럼은 +5 내지 +12의 전하 상태를 나타내었다. 디컨볼루션된 질량은 9249.4 Da이었다 (서열-예측치 = 9243 Da).

4. 재조합 5-나선

C-말단 히스티딘-태그부착된 5-나선 펩티드를 발현하는 동결된 재조합 이. 콜라이(E. coli) 세포를 해동시키고, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0 및 0.3 M NaCl 중에 재현탁시켰다. 용해물을 마이크로플루이다이저로 제조하였다 (~18,000 psi에서 2회 통과시킴). 불용성 분획을 원심분리에 의해 수집하고, 상청액을 폐기하였다. 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.3M NaCl 및 0.05% 트리톤(Triton) X-100을 사용하여 다중 라운드의 재현탁 및 원심분리에 의해 불용성 분획을 세척하였다. 세척된 불용성 분획을 8 M 구아니딘 히드로클로라이드 (Gd-HCl) 중에 용해시켰다. 구아니딘-가용성 추출물을 IMAC 수지의 슬러리와 혼합하고, 65℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 슬러리를 냉각되도록 하고, 수지를 중력에 의해 침강되도록 하였다. 냉각된 수지를 유리 크로마토그래피 칼럼으로 옮기고, 칼럼을 50 mM 인산나트륨, 20 mM 이미다졸, 0.3 M 염화나트륨 및 8 M Gd-HCl, pH 8.0으로 세척하였다. 5-나선 펩티드를 50 mM 인산나트륨, 300 mM 이미다졸, 0.3 M 염화나트륨 및 8 M Gd-HCl, pH 8.0으로 칼럼으로부터 용리시켰다. IMAC 생성물을 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 아세토니트릴 (ACN)로 각각 0.1% 및 5%까지 스파이킹하고, 역상 크로마토그래피에 의해 50℃에서 정제하였다. 5-나선 펩티드를 0.1% TFA 중 5% → 80% ACN의 선형 구배로 칼럼으로부터 용리시켰다. 펩티드-함유 분획을 풀링하고, ACN을 질소 기체의 스트림 하의 증발에 의해 제거하였다. 5-나선 펩티드를 러닝 완충제로서의 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0 및 150 mM NaCl과 슈퍼덱스(Superdex)® 200 칼럼을 사용하여 정제용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 단량체 5-나선 펩티드를 함유하는 분획을 풀링하고, 멸균-여과하고, -70℃에서의 장기간 저장을 위해 액체 질소 중에서 소량의 분취액으로 급속-동결시켰다.

펩티드 특성화

1. 원편광 이색성

모든 측정은 0.1 cm 경로 길이의 직사각형 석영 셀을 사용하여 20℃에서 J-810 분광편광계 (자스코, 인크.(Jasco, Inc.), 메릴랜드주 이스톤) 상에서 수행하였다. 스펙트럼은 1초 시간 반응 및 100 nm/분 스캔 속도를 이용하여 획득하고, 5회의 획득에 대해 평균을 내었다. 원액 농도는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하였다. 표준 측정은 아세트산나트륨 (25 내지 50 mM), NaCl (50 내지 150 mM), pH 4 내지 4.5 중 펩티드의 용액 상에서 수행하였다. α-나선의 백분율은 문헌 [Chen et al., 1974, Biochemistry 13:3350-3359]에 따라 222 nm에서의 몰 타원율에 기반하여 계산하였다. 열 안정성은 온도의 함수로서 2℃/분 증가를 이용하여 222 nm에서의 CD 신호의 변화를 모니터링함으로써 결정하였다. 용융 온도 (T_m)는 협동성 열 언폴딩 전이의 중간점으로부터 결정하였다. 90℃ 초과의 T_m을 갖는 펩티드에 대해, 열 변성 실험을 또한 2 M 구아니딘 히드로클로라이드의 존재 하에 수행하였다.

2. 분석용 초원심분리

모든 분석용 초원심분리 (AU) 실험은 20℃에서 XL-I 분석용 초원심분리기 (베크만 쿨터, 인크.(Beckman Coulter, Inc.), 인디애나주 인디아노폴리스)로 수행하였다. 침강 속도 분석을 위해, 샘플을 대략 매 4분마다 방사상 흡광도 스캔하면서 48,000 rpm으로 20℃에서 5시간 동안 원심분리하였다. g*(s) 분석은 프로그램 DCDT+, 버전 2.2.1 (존 필로(John Philo), 캘리포니아주 싸우전드 오크스) 또는 옵티마(Optima) XL-I 데이터 분석 소프트웨어 (베크만 쿨터, 인크.)로 수행하였다. 침강 평형 실험은 3가지 상이한 로딩 농도 및 3가지 상이한 로터 속도 (16,000, 20,000 및 30,000)에서 수행하였다. 분자량은 옵티마 XL-I 데이터 분석 소프트웨어를 사용하거나 또는 헤테로아날리시스(Heteroanalysis) 버전 1.1.33 (코네티컷 대학교 생명공학 및 생물지원 센터의 분석용 초원심분리 설비로부터의 것)을 사용하여 계산하였다.

3. D5 / 5-나선 경쟁적 결합 검정 (DCBA)

형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 기반한 시험관내 결합 검정은 이전에 문헌 [Caulfield et al., 2010, J Biol Chem 285:40604-40611]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 검정은 유로퓸 크립테이트 (Eu-D5)에 접합된 D5 IgG (미국 특허 번호 7,744,887 참조) 및 재조합 gp41 모방체 5-나선 (5H)의 비오티닐화 유도체를 사용한다. 비오틴-5H는 스트렙타비딘-접합된 알로피코시아닌 (APC) 기질에 결합하여 5H-SA-APC 복합체를 형성한다. 5H에 대한 Eu-D5의 결합은 Eu에서 APC로의 FRET를 일으킨다. 반응계가 340 nm의 파장에서 여기될 때, 결합된 Eu-D5의 양은 665 nm의 방출 파장에서 측정되고, 전체 Eu는 620 nm의 방출 파장에서 측정된다. 데이터는 10000 x 665 nm에서의 신호 대 620 nm에서의 신호의 비로서 기록된다. 어느 하나의 성분에 경쟁적으로 결합하는 작용제는 비 값의 감소를 유발한다.

4. p4-2R5 중화 검정

본 중화 검정은 하기 변형을 포함시켜 이전에 문헌 [Joyce et al., 2002, J Biol Chem 277:45811-45820]에 기재된 바와 같이 수행하였다: HeLa P4R5 세포를 384-웰 플레이트에 1000개 세포/웰로 시딩하고, 다음날 면역 혈청 또는 분획화된 IgG의 연속 희석물의 존재 하에 적절한 HIV-1 또는 SHIV 바이러스로 대략 0.01의 감염 다중도로 감염시키고, 감염 48시간 후에 세포를 용해시키고, 화학발광 기질 (갈스크린(GalScreen)®, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)™, 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corp.), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 정제된 IgG 분석의 경우에는, 화학발광 신호의 50% 감소를 일으키는 IgG 농도로서 정의되는 IC₅₀으로서 데이터를 표시하였다. 혈청 분석의 경우에는, IC₅₀은 50% 감소된 화학발광 신호를 생성하는 혈청 희석률의 역수로서 정의된다.

결과

펩티드 특성화는 CD 분광분석법에 의한 2차 구조 및 AUC에 의한 올리고머 상태의 생물물리학적 평가로 구성되었다. 프리-헤어핀 중간체 내부에 함유된 소수성 포켓의 적절한 제시를 측정하기 위한 DCBA 및 P4/2R5 중화 검정으로 D5 에피토프의 완전성 및 제시를 평가하였다.

표 2는 생성된 펩티드 구축물에 대한 데이터를 요약한다. 일반적으로, 펩티드의 용해도는 3 내지 5의 pH 범위에서 최적이므로, CD 및 AUC 결정은 ~3.5의 pH에서 TFA 반대-이온이 생성되는 경우에는 물 중에서 또는 아세트산나트륨 완충제 중에서 수행하였고, pH 4가 가장 믿을 만하였다. 상기 pH 범위에서, 단량체 및 삼량체 펩티드 구축물은 둘 다 높은 백분율의 α-나선 구조를 나타내었고, 이는 예측과 일치한다. NHR-기반 펩티드 구축물은 pH가 증가됨에 따라, 특히 pH 6 내지 8의 범위에서 응집 및 침전을 향한 증가하는 경향성을 나타내었다. 단량체 N51, N51-2B 및 N51-3B 펩티드는 모두, 관찰된 분자량 대 예측된 분자량의 AUC 비로부터 증명된 바와 같이 자가-회합에 대한 강한 선호를 나타내었다. 그러나, 이들 구축물의 대부분은 중성 근처의 pH에서 상대적으로 불안정하였고, 유의한 응집을 나타내었다. SZ 삼량체화 도메인의 첨가에 의해 N51을 안정화시키기 위한 초기 시도는 부분적으로 성공적이었고, 용해된 상기 펩티드는 자가-조립되어 분명한 삼량체-사량체 평형을 형성하였다. 이들 펩티드의 나선성은 전장 N51 상태에서 최적이었는데, 이는 N51 및 SZN51 둘 다의 C-말단 말단절단된 Δ23 버전이 감소된 나선 함량을 나타내었기 때문이다. 다중 농도 및 다중 로터 속도에서의 침강 평형에 의한 펩티드의 N51 및 SZN51 패밀리의 AUC 분석은 상당히 다양한 계산된 분자량 값을 생성하였고, 이는 분석 모델이 모든 데이터에 정확하게 맞지는 않았음을 시사한다. 가장 그럴듯한 설명은, 이들 펩티드는 자가-회합 성향을 나타내었지만 이러한 올리고머화는 제어되지 않았고 시간이 경과함에 따라 점점 더 높은 차수의 올리고머 및 응집체가 형성되었다는 것이다. 대조적으로, 조작된 디술피드 (CCIZN51)₃의 산화를 통해 안정화되었거나 또는 화학적 스캐폴드, 예컨대 KTA(N51)₃에 의해 안정화된 삼량체 N51 펩티드는 매우 높은 정도의 2차 구조를 나타내었고, AUC는 거의 통일된 비를 갖는데, 이는 삼량체의 분명한 응집 또는 자가-회합이 거의 없음을 암시한다.

중화 모노클로날 항체 D5에 대한 입체형태적으로 정확한 결합 에피토프를 제공하는 다양한 펩티드 구축물의 능력을, DCBA 검정에서 5-나선에 대한 결합에 대해 경쟁하는 그의 능력을 측정함으로써 평가하였다. IC₅₀ 값은, N51-2B 및 N51-3B에 이용된 돌연변이가 D5 결합에 대한 분명한 부정적인 영향을 갖는 예외를 제외하고는 다양한 구축물에 걸쳐 비슷하였다. 이들 펩티드에서의 아미노산 치환 중 어느 것도 L568, W571, G572 및 K574로 규정된 결정적 D5 접촉 잔기를 변화시키지 않았지만, 공통의 돌연변이 L565A는 L568에 근접해 있고, 결합에 대한 예측되지 않은 효과를 가질 수 있다. 대조적으로, 이들 펩티드는 바이러스 진입 억제에 대해 천연 N51과 비슷한 IC₅₀ 값을 나타내는데, 이는 돌연변이가 C-칠원체 반복 펩티드에 결합하는 소수성 포켓의 능력에 불리한 영향을 미치지 않고 이에 따라 융합의 우성 음성 억제제로서 기능한다는 것을 시사한다. 일반적으로, 펩티드 시리즈에 걸쳐 관찰된 상대적으로 일정한 항바이러스 활성은 프리-헤어핀 중간체 구조의 적절한 제시가 유지된다는 정성적 증거를 제공한다. V570A에 대한 억제 효력의 대략 10배 증진이 KTA(N51)₃에서 실현된다는 것은 중요하다.

표 2. 정제된 펩티드 구축물의 생물물리학적 및 기능적 평가

실시예 2

혈청시험

1. ELISA

스트렙타비딘 코팅된 96-웰 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽, 인크.(Thermo Fisher Scientific, Inc.), 펜실베이니아주 피츠버그)에 직접 첨가된 비오티닐화 펩티드 (CCIZN17)₃에 대해 면역 혈청 샘플을 시험함으로써 혈청 종점 희석을 결정하였다. 비오티닐화 펩티드를 웰당 PBS 중 4 μg/ml의 농도로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20(Tween-20)을 함유하는 PBS (PBST)로 6회 세척하고, 3% (v/v) 탈지분유를 함유하는 PBST (PBST-우유)로 차단하였다. 시험 샘플, 면역 전 및 면역 샘플을 1:100에서 출발하여 4배, 8회 연속 희석으로 웰당 100 μl의 최종 부피로 희석하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 PBST로 6회 세척하였다. HRP-접합된 염소 항-기니 피그 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 펜실베이니아주 웨스트 그로브) 또는 염소 항-인간 (인비트로젠) 2차 항체 50 마이크로리터를 PBST-우유 중에 각각 1:5000 또는 1:2000으로 희석하고, 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 6회 세척하고, 이어서 웰당 100 μl의 기질 (TMB; 비로랩스, 인크.(Virolabs, Inc.), 버지니아주 샹틸리)을 첨가하고, 전개 3-5분 후에 TMB-정지 용액으로 정지시켰다. 접합체 대조군 웰의 평균 + 2 표준 편차를 초과하는 450 nm에서의 OD 값을 제공한 가장 높은 희석률의 역수로서 항체 역가를 결정하였다.

2. D5 / 5-나선 경쟁적 결합 검정 (DCBA)

형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 기반한 시험관내 결합 검정은 이전에 문헌 [Caulfield et al., 2010, J Biol Chem 285:40604-40611]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 검정은 유로퓸 크립테이트 (Eu-D5)에 접합된 D5 IgG 및 재조합 gp41 모방체 5-나선 (5H)의 비오티닐화 유도체를 사용한다. 비오틴-5H는 스트렙타비딘-접합된 알로피코시아닌 (APC) 기질에 결합하여 5H-SA-APC 복합체를 형성한다. 5H에 대한 Eu-D5의 결합은 Eu에서 APC로의 FRET를 일으킨다. 반응계가 340 nm의 파장에서 여기될 때, 결합된 Eu-D5의 양은 665 nm의 방출 파장에서 측정되고, 전체 Eu는 620 nm의 방출 파장에서 측정된다. 데이터는 10000 x 665 nm에서의 신호 대 620 nm에서의 신호의 비로서 기록된다. 어느 하나의 성분에 경쟁적으로 결합하는 작용제는 비 값의 감소를 유발한다.

3. 중화 검정

a. P4/2R5 검정

검정은 하기 변형을 포함시켜 이전에 문헌 [Joyce et al., 2002, J Biol Chem 277:45811-45820]에 기재된 바와 같이 수행하였다: HeLa P4R5 세포를 384-웰 플레이트에 1000개 세포/웰로 시딩하고, 다음날 면역 혈청 또는 분획화된 IgG의 연속 희석물의 존재 하에 적절한 HIV-1 또는 SHIV 바이러스로 대략 0.01의 감염 다중도로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 세포를 용해시키고, 화학발광 기질 (갈스크린, 어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 정제된 IgG 분석의 경우에는, 화학발광 신호의 50% 감소를 일으키는 IgG 농도로서 정의되는 IC₅₀으로서 데이터를 표시하였다. 혈청 분석의 경우에는, IC₅₀은 50% 감소된 화학발광 신호를 생성하는 혈청 희석률의 역수로서 정의된다.

b. TZM-bl 검정

이전에 기재된 바와 같이 TZM-bl 세포에서의 단일 라운드 감염 후의 루시페라제 리포터 유전자 발현의 감소로서 중화를 측정하였다. 문헌 [Montefiori (2004) in Current Protocols in Immunology eds Coligan et al. (John Wiley & Sons) 12.11.1-12.11.15 및 Li et al., 2005, J Virol 79:10108-10125]을 참조한다. 존 카페스(John Kappes) 및 샤오윈 우(Xiaoyun Wu)에 의해 기증된 TZM-bl 세포를 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램으로부터 입수하였다. 간략하게, 200 TCID₅₀의 바이러스를 시험 샘플의 연속 3배 희석물과 함께 2벌로 96-웰 편평-바닥 배양 플레이트에서 150 μl의 총 부피로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 새로이 트립신처리된 세포 (75 μg/ml DEAE 덱스트란을 함유하는 성장 배지 100 μl 중 10,000개의 세포)를 각 웰에 첨가하였다. 대조군 웰의 한 세트는 세포 및 바이러스를 수용하고 (바이러스 대조군), 또 다른 세트는 단지 세포만을 수용하였다 (배경 대조군). 48시간 동안 인큐베이션한 후, 브라이트라이트(Britelite) 발광 리포터 유전자 검정 시스템 (퍼킨엘머 인크.(PerkinElmer Inc.), 매사추세츠주 월섬)을 사용한 발광의 측정을 위해 세포 100 μl를 96-웰 흑색 고체 플레이트 (코스타(Costar)®)로 옮겼다. 중화 역가는 상대 발광 단위 (RLU)가 배경 RLU의 차감 후에 바이러스 대조군 웰과 비교하여 50%만큼 감소된 희석률이다. 293T 세포에서의 형질감염에 의해 분자적으로 클로닝된 Env-가성 바이러스의 검정 스톡을 제조하고, 문헌 [Li et al., 2005, J Virol 79:10108-10125]에 기재된 바와 같이 TZM-bl 세포에서 적정하였다. 클레이드 A, B 및 C 참조 Env 클론은 이전에 기재된 바 있다. 문헌 [Li et al., 2005, J Virol 79:10108-10125; Li et al., 2006, J Virol 80:11776-11790; 및 Blish et al., 2007, AIDS 21:693-702]을 참조한다.

c. A3R5 검정

본 검정은 루시페라제 리포터 유전자 발현 감소의 함수로서 96-웰 미세희석 플레이트에서의 중화를 측정한다. A3R5 세포 (A3.01/R5.6)는 미국 의학 HIV 연구 프로그램 (MHRP)에 의해 제공되었다. 이것은 자연적으로 CD4 및 CXCR4를 발현하고 CCR5를 발현하도록 MHRP에서 조작된 인간 림프모구성 세포주 CEM의 유도체이다. 문헌 [Folks et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:4539-4543]을 참조한다. 세포는 HIV-1의 대부분의 균주에 의한 감염에 대해 중간 정도로 허용성이었다. 감염성을 증진시키기 위해 중화 검정 동안 배지 중에서 DEAE 덱스트란을 사용하였다. 세포주는 리포터 유전자를 함유하지 않기 때문에, 바이러스 게놈 내에 리포터 유전자를 보유하는 분자적으로 클로닝된 바이러스를 사용하여야 한다. 레닐라 루시페라제(Renilla Luciferase) 리포터 유전자를 보유하는 Env-발현 감염성 분자 클론 (Env.IMC.LucR 바이러스)은 중화 검정에 적합한 감염을 제공한다. 리포터 유전자의 발현은 감염 직후에 바이러스 Tat 단백질에 의해 전사 유도되었다. 루시페라제 활성을 발광에 의해 정량화하였고, 이는 초기 접종물 중에 존재하는 감염성 바이러스 입자의 수에 정비례한다. 검정은 고처리량 용량을 위해 96-웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 클론 세포 집단의 사용은 증진된 정확성 및 균일성을 제공하였다. 검정은 293T 세포에서 형질감염에 의해 생산된 Env.IMC.LucR 바이러스로의 다중 라운드 감염에 대해 표준화되어 있다.

실시예 3

HIV 350 및 365: 기니 피그 면역원성

던컨-하틀리(Duncan-Hartley) 기니 피그 (HIV-350, 군당 n=8*)를 펩티드 면역원 100 마이크로그램으로 제0주, 제4주 및 제8주에 3회 근육내로 면역화시켰다. 20 mM Hepes 완충제, 중성 pH 중에 재구성된 펩티드를 용량당 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (머크 앤드 캄파니 인코포레이티드(Merck & Co., Inc.)) 180 μg + 이스코매트릭스 아주반트(Iscomatrix Adjuvant)™ (씨에스엘, 인크.(CSL, Inc.)) 40 μg 중에서 제제화하였다. 혈청 샘플을 각각의 동물에 대해 제7주 및 제11주에 혈청 분리기 튜브에서 전혈을 통해 수집하고, 뿐만 아니라 최초 면역화 전에도 여러 번의 혈청 수집을 수행하였다 (사전-채혈).

연구 HIV-350은 펩티드 구축물 SZN51을 시험하였다. 표 3a는 연구에서의 상기 군에 대한 면역화 프로토콜을 보여준다.

던컨-하틀리 기니 피그 (HIV-365, 군당 n=6)를 펩티드 면역원 30 μg으로 제0주, 제4주 및 제8주에 3회 근육내로 면역화시켰다. 20 mM Hepes 완충제, 중성 pH 중에 재구성된 펩티드를 용량당 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (머크 앤드 캄파니 인코포레이티드) 180 μg + 이스코매트릭스 아주반트™ (씨에스엘, 인크.) 40 μg 중에서 제제화하였다. 혈청 샘플을 각각의 동물에 대해 제3주, 제7주 및 제11주에 혈청 분리기 튜브에서 전혈을 통해 수집하였다. 혈청시험은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.

연구 HIV-365는 (1) 합성 KTA(N51)₃, KTA(N51-2B)₃, KTA(N51-3B)₃, ChA(N51)₃ 및 재조합 (CCIZN51)₃으로 이루어진 제약되고 안정화된 N51 삼량체 펩티드 시리즈; 및 (2) (CCIZN36)₃에 이은 KTA(N51)₃ 및 5-나선 요법과 비교한 동종 (CCIZN36)₃ 면역화를 평가하였다. 표 3b는 연구에 대한 면역화 프로토콜 및 군 지정을 보여준다. 혈청시험은 p4/2R5 중화 검정을 이용하고 TZM-bl 검정 (바이러스 V570A) 및 A3R5 검정을 이용하여 수행하였다.

표 3a: HIV-350에 대한 면역화 스케줄

표 3b. HIV-365에 대한 면역화 스케줄

결과

도 2는 p4/2R5 검정에서 바이러스 V570A에 대해 평가한 N51 펩티드 시리즈에 대한 중화 검정 데이터의 개요를 제공한다. 비-공유적으로 제약된 재조합 SZN51 펩티드는 중화 항체 반응을 도출하는 그의 능력의 관점에서 모든 나머지 펩티드 면역원보다 명백히 열등하다. 이는 CCIZ 또는 화학적 스캐폴드 코어로의 스캐폴딩에 의해 달성된 N-펩티드의 공유 안정화가 목적하는 기능적 면역 반응을 도출하는데 결정적임을 명확하게 입증한다.

표 4는 둘 다의 개별 동물에 대한 최종 투여 3주 후 T=11 시점에 결정된 중화 항체 역가 및 계산된 기하평균의 개요를 제공한다. 균일하게, (CCIZN36)₃ 또는 5-나선과 조합된 N51 펩티드를 함유하는 군은 시험된 모든 바이러스 균주에 걸쳐 더 높은 중화 항체 역가의 도출과 관련하여 (CCIZN36)₃ 단독에 비해 탁월하였다.

표 4. 기니 피그 연구 HIV-365에 대한 혈청시험 개요

실시예 4

HIV 360: 비-인간 영장류 면역원성

본 NHP 연구는 (1) 다중 (CCIZN36)₃ 면역화의 용량 효과를 시험하고, (2) (CCIZN36)₃으로 프라이밍된 동물에서의 이종 항원 투여의 이익을 평가하기 위한 2개의 상으로 수행하였다.

군당 3마리의 레서스 마카크 (마카카 물라타(Macaca mulatta))를 0, 1 및 2개월에 100, 300 또는 1000 μg (CCIZN36)₃으로 면역화하였다. 34주에, 모든 군을 100 마이크로그램 (CCIZN36)₃의 추가 용량으로 부스팅하였다. 부스트 면역화 7개월 후, 모든 군이 모든 용량의 (CCIZN36)₃의 동등한 대표를 갖도록 원숭이를 재그룹화하였다. 각각의 군을 하기 프로토콜로 4주 간격으로 면역화하였다: 군 1에 (CCIZN36)₃의 2회의 면역화를 제공하고; 군 2를 KTA(N51)₃ 및 5-나선으로 순차적으로 면역화하고; 군 3을 5-나선 및 KTA(N51)₃으로 순차적으로 면역화하였다. 20 mM HEPES 완충제, 중성 pH 중에 재구성된 펩티드 또는 5-나선을 용량당 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (머크 앤드 캄파니 인코포레이티드) 180 μg + 이스코매트릭스 아주반트™ (씨에스엘, 인크.) 40 μg 중에서 제제화하였다. 지정된 시점에 혈청을 위한 전혈을 수집하고, 결합 및 바이러스 중화 검정을 비롯한 혈청학 분석에 사용하였다.

표 5는 완전한 연구에 대한 프로토콜을 요약한다.

표 5. 비-인간 영장류 연구 HIV-360에 대한 면역화 프로토콜

2상 (동종 대 이종 항원 투여 비교)은 제62주 내지 제66주에 수행하였다.

결과

도 3 및 4는 전체 연구에 대한 ELISA 및 DCBA 검정 결과를 요약한다. 제11주 (투여 3 3주 후)의 ELISA 및 DCBA는 우수한 반응을 나타내었지만, p4/2R5 검정에서의 중화 항체 역가는 심지어 D5 과민성 V570A_HXB2 바이러스에 대해서도 낮았다 (데이터는 제시되지 않음). 이어서, 모든 동물에 34주에 (CCIZN36)₃ 100 μg의 제4 용량을 투여하였다. ELISA 및 DCBA 역가는 둘 다 이러한 26주의 휴지기 후에 감소하였고, 둘 다 T=36주 채혈의 분석이 보여준 바와 같이 부스팅되었다. ELISA 역가는 이전의 피크 수준 DCBA 역가에 도달하지 않았지만, 기능적 D5-유사 특이성의 측정치는 더 높은 수준에 도달하였다. 그러나, 다시 한번 p4/2R5 중화 항체 역가는, 면역화 동물이 비슷한 ELISA 및 DCBA 반응을 나타낸 이전의 기니 피그 실험으로부터의 예측치보다 더 낮았다. 이 시점에서, 임의의 가능한 편향을 제거하기 위해 각각의 군의 동물을 셔플링하고, 또 다른 휴지기 후, 3개의 연구군 중 2개에 대한 순차적 조합에서 이종 항원을 사용하였다. 이 경우에, 군 1은 2회 추가 용량의 (CCIZN36)₃을 수용한 반면, 군 2는 KTA(N51)₃에 이어서 5-나선을 수용하였고, 군 3은 5-나선에 이어서 KTA(N51)₃을 수용하였다. ELISA 및 DCBA 역가는 34 및 62주 사이의 일시적 휴지기 동안 감소하였지만, 면역화시에 부스팅되었다. 도 5a-b 및 6으로부터 명백한 바와 같이, 이종 항원을 수용한 군에서 중화 역가의 중요한 차이가 명확하게 관찰되었다. P4/2R5 및 A3R5 검정에서 측정된 중화 항체 반응의 규모 및 폭은 군 2 및 3에서 유의하게 증진되었다.

도 7a-b는 연구의 1상 및 2상 동안 결정된 P4/2R5 중화 항체 역가의 비교를 제공한다. V570A_HXB2에 대한 반응은 어떠한 상 동안에도 측정되지 않았지만, V570A에 대한 반응은 응답하는 동물의 수 및 중화 항체 역가의 규모의 관점에서 이종 군에서 명확하게 증진되었다.

실시예 5

HIV 366: 비-인간 영장류 면역원성

본 NHP 연구의 목적은 연구 HIV-360의 결과를 확장시키고, 이종 군에서 관찰된 증진이 KTA(N51)₃ 또는 5-나선의 첨가에서 기인하였는지의 여부 또는 둘 다가 요구되는지의 여부를 결정하는 것이었다.

군당 6마리의 레서스 마카크 (마카카 물라타)를 용량당 100 μg의 제제화된 항원으로 면역화하였다. 1개의 군은 항원당 100 μg의 모든 3종의 시험된 항원의 동등한 혼합물의 4회의 동종 면역화 시리즈를 수용하였다. 면역화는 0, 1, 6 및 8개월에 제공하였다. 20 mM HEPES 완충제, 중성 pH 중에 재구성된 펩티드 또는 5-나선을 용량당 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (머크 앤드 캄파니 인코포레이티드) 180 μg + 이스코매트릭스 아주반트™ (씨에스엘, 인크.) 40 μg 중에서 제제화하였다. 지정된 시점에 혈청을 위한 전혈을 수집하고, 결합 및 바이러스 중화 검정을 비롯한 혈청학 분석에 사용하였다.

표 6은 완전한 연구에 대한 프로토콜을 요약한다. 군 1 및 5는 HIV-360에서 시험된 것들과 동일한 항원 조합을 함유한다. 또한, KTA(N51)₃ 또는 5-나선 (군 2 및 3)의 동종 투여의 효능을 시험하였다. 군 4는 순차적으로 투여된 (CCIZN36)₃ 및 KTA(N51)₃의 효능을 시험한 반면, 군 6은 모든 면역원이 각각의 용량으로 동시에 투여된 다중 항원 조합을 시험하였다.

표 6. 비-인간 영장류 연구 HIV-366에 대한 면역화 프로토콜

결과

도 8a-b는 최종 면역화 2주 후에 수집된 T=38주 채혈에서의 P4/2R5 및 TZM-bl 검정에서 결정된 바이러스 V570A_HXB2에 대한 중화 항체 역가를 보여준다. 검정 둘 다에서의 가장 강력한 중화 역가는 KTA(N51)₃ 단독으로의 동종 면역화에 의해 달성되었지만, 상기 펩티드를 (CCIZN36)₃ 또는 (CCIZN36)₃ 및 5-나선 둘 다와 조합하여 함유하는 군은 (CCIZN36)₃ 단독보다 우수한 효력을 나타내는 경향이 있었다. 3종의 면역원의 조합된 혼합물은 순차적 투여와 유의하게 상이한 것으로 보이지는 않았다.

도 9a-b에 나타낸 바와 같이, V570A_HXB2에 대한 양성 중화 결과는 2종의 티어 1 클레이드 C 바이러스 분리주 Ce0393 및 MW965를 사용한 A3R5 검정에서 독립적으로 확인되었다. Ce0393에 대한 결과는 38주에 투여 4 2주 후의 채혈을 이용하여 생성하였고, Mw965에 대한 결과는 26주에 투여 3 2주 후의 채혈을 이용하여 생성하였다. V570A_HXB2 과민성 분리주에 대해 관찰된 바와 같이, 가장 강력한 중화 역가는 동종 KTA(N51)₃ 군에서 관찰된 반면, 상기 펩티드를 함유하는 다른 군은 (CCIZN36)₃ 또는 5-나선 단독에 비해 더 높은 역가를 나타내는 경향이 있었다. 실제로, 모든 검정에서, 5-나선 단독은 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 면역적으로 강력하였지만 중화 항체 역가의 도출에 있어서는 극히 불량하였다 (데이터는 제시되지 않음). 추가로, 데이터는 그의 서열이 클레이드 B 바이러스 분리주 (HXB2)로부터 유래된 것인 펩티드를 사용한 2종의 클레이드 C 바이러스의 양성 중화를 보여주기 때문에, 본 분석은 교차-클레이드 보호를 유도하는 이들 면역원의 능력에 대한 증거를 제공한다

표 7은 연구 전반에 걸쳐 수집된 다양한 혈액에서의 모든 군에 대한 중화 역가의 기하평균의 개요를 제공한다. 예상된 바와 같이, 중화 역가는 투여 3 및 4 사이의 12주 휴지의 종결시 제36주에 유의하게 감소하였다. 다른 모든 시점의 경우에, KTA(N51)₃ 군은 동종 (CCIZN36)₃ 또는 5-나선 (군 2 및 3)에 비해 가장 높은 중화 역가를 나타내었고, N51을 함유하는 군도 또한 동종 (CCIZN36)₃ 또는 5-나선보다 더 높은 경향이 있었다.

표 7. NHP 연구 HIV-366의 다양한 시점에서의 면역원 요법에 대한 중화 항체 기하평균 역가의 비교.

종합하면, 연구 HIV-366으로부터의 결과는, 연구 HIV-360에서 관찰된 증진된 중화 효력이 5-나선이 아니라 KTA(N51)₃의 첨가에 기인한다는 가설에 대한 강력한 증거를 제공하고, 제약된 삼량체 N51-기반 N-펩티드가 기능적 면역학적 관점에서 탁월하다는 주장을 직접적으로 뒷받침한다.

SEQUENCE LISTING <110> MERCK SHARP & DOHME CORP. Joseph G. JOYCE Chengwei WU Elizabeth A. OTTINGER Victor GARSKY <120> STABLE PEPTIDE MIMETICS OF THE HIV-1 GP41 PRE-HAIRPIN INTERMEDIATE <130> 23202 <150> 60/613,264 <151> 2012-03-20 <160> 46 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Immunodeficiency Virus Type I <400> 1 Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala 1 5 10 15 Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln 20 25 30 Ala Arg Ile Leu 35 <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Immunodeficiency Virus Type I <400> 2 Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp 20 25 30 Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu 35 40 45 Lys Asp Gln 50 <210> 3 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric HIV-1 N38 GP41 Sequence <400> 3 Arg Gly Arg Gly Arg Gly Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg Ala 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70 75 80 Asp Gln <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear Scaffold <221> MOD_RES <222> 1, 3, 5, 7 <223> delta-amino valeric acid <400> 41 Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear Scaffold <400> 42 Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear Scaffold <400> 43 Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu 1 5 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear Scaffold <400> 44 Cys His Cys Cys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Asn His 1 5 10 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric N-Peptide CC1ZN36 <400> 45 Cys Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu 1 5 <210> 46 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric N-Peptide CC1ZN36 <400> 46 Cys Cys Gly Gly Ile Lys Lys Glu Ile Glu Ala Ile Lys Lys Glu Gln 1 5 10 15 Glu Ala Ile Lys Lys Lys Ile Glu Ala Ile Glu Lys Glu Ile Ser Gly 20 25 30 Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln 35 40 45 His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg 50 55 60 Ile Leu 65

Claims

3개의 N-펩티드에 연결되어 있는 스캐폴드 코어를 포함하며, 여기서 각각의 N-펩티드는 N36 (SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL; 서열 1) 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 3개의 N-펩티드는 서로 상호작용하여 HIV gp41의 프리-헤어핀 입체형태를 모방하는 삼량체 코일드-코일을 형성하는 것인, (CCIZN36)₃이 아닌 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, 3개의 펩티드 각각이 상이한 부착 지점에서 스캐폴드 코어에 공유 연결되어 있는 것인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, 스캐폴드 코어가 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; 트리스-숙신이미딜 아미노트리아세테이트; 트리스-(2-말레이미도에틸)아민; KTA-브로마이드 또는 콜산을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 gp41 펩티드 모방체.
제3항에 있어서, 스캐폴드 코어가 KTA-브로마이드 또는 콜산인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, 스캐폴드 코어가 3개의 N-펩티드의 부착을 허용하는 3개의 관능화 잔기를 포함하는 선형 폴리펩티드 쇄인 gp41 펩티드 모방체.
제5항에 있어서, 스캐폴드 코어가
a) CH₃CO-Ava-Lys-Ava-Lys-Ava-Lys-Ava-NH₂ (서열 41);
b) CH₃CO-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH₂ (서열 42);
c) CH₃CO-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-NH₂ (서열 43);
d) CH₃CO-Cys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH₂ (서열 44); 또는
e) CH₃CO-Cys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-NH₂ (서열 45)
를 포함하는 것인 gp41 펩티드 모방체.
제2항에 있어서, 스캐폴드 코어가 시클로헥산, 시클로헵탄 또는 시클로옥탄을 포함하는 카르보시클릭 스캐폴드인 gp41 펩티드 모방체.
제2항에 있어서, 스캐폴드 코어가 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 피페리딘, 옥산, 티안, 아제판, 옥세판, 티에판, 피페라진, 모르폴린 또는 티오모르폴린을 포함하는 헤테로시클릭 스캐폴드인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, 1개 이상의 N-펩티드가 N51 (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 4)); N51-2B (QIRELISKIVEQINNILRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 8)) 또는 N51-3B (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 9))를 포함하는 것인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, 각각의 N-펩티드가 N51 (QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ (서열 4))로 이루어진 것인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, N-펩티드가 동일하거나 또는 상이한 아미노산 서열을 포함하는 것인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, N-펩티드가 동일한 아미노산 서열로 이루어진 것인 gp41 펩티드 모방체.
제1항에 있어서, 1개 이상의 N-펩티드가
a) 삼량체 코일드-코일을 형성할 수 있는 가용성 α-나선 영역을 포함하는 스캐폴드 부분; 및
b) HIV gp41 NH₂-말단 칠원체 반복 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 N-펩티드 부분
을 포함하는 키메라 N-펩티드이며,
여기서 스캐폴드 부분이 나선 상으로 N-펩티드 부분에 융합되어 α-나선 도메인을 형성하고, 3개의 N-펩티드가 서로 상호작용하여 삼량체 코일드-코일을 형성하는 것인,
gp41 펩티드 모방체.
제13항에 있어서, 키메라 N-펩티드의 N-펩티드 부분이 나선 상으로 키메라 N-펩티드의 스캐폴드 부분의 COOH-말단에 융합되어 있는 것인 gp41 펩티드 모방체.
제13항에 있어서, 키메라 N-펩티드의 스캐폴드 부분이
a) 스즈키-IZ 코일드-코일 모티프 (YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (서열 31));
b) IZ 코일드-코일 모티프 (IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK (서열 34)); 또는
c) EZ 코일드-코일 모티프 (IEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEK (서열 37))
를 포함하는 것인 gp41 펩티드 모방체.
a) KTA(N51)₃;
b) KTA(N51-2B)₃;
c) KTA(N51-3B)₃;
d) chA(N51)₃;
e) (CCIZN51)₃ 또는
f) SZN51
인 gp41 펩티드 모방체.
제16항에 있어서, KTA(N51)₃인 gp41 펩티드 모방체.
제1항의 gp41 펩티드 모방체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
포유동물 숙주 내로 예방 유효량의 제18항의 면역원성 조성물을 도입시키는 것을 포함하는, 포유동물 숙주에서 면역 반응을 도출하는 방법.
제19항에 있어서, 포유동물 숙주가 인간인 방법.