JP2015512394A - Hiv−1gp41プレヘアピン中間体の安定なペプチド模倣体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、gp41提示を模倣するようにN−ペプチドを三量体コイルドコイルへとコンホメーション的に拘束する化学的スカフォールド上に3個のgp41 N−ペプチドを有するgp41三価ペプチド模倣体に関する。本発明はまた、gp41ペプチド模倣体を形成しうる、HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復全領域を有するN−ペプチドに関する。HIV−1 gp41プレヘアピン中間体のそのようなペプチド模倣体は、中和抗体を惹起することにより、HIV−1感染の治療または予防のためのワクチンにおいて使用されうる。
Description
本発明は、コンホメーション的に制限された三価gp41ペプチド模倣体、およびHIVに対する中和抗体を惹起するための免疫原としてのその用途に関する。本発明はまた、gp41ペプチド模倣体を形成しうる、HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復全領域またはその修飾形態を有するN−ペプチドに関する。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は後天性免疫不全症候群(エイズ)および関連障害の病原体である。エイズに対する有効な治療が利用可能であるが、HIV−1感染の予防に有効な予防用ワクチンの開発は、ウイルスの侵入を妨げる、広く中和する抗体を誘導しうる免疫原を特定し最適化することができないことにより妨げられている。
免疫原としてのHIV−1エンベロープ糖タンパク質の使用の評価において、かなり多くの研究が行われている。HIV−1エンベロープ糖タンパク質は160kDaの前駆体として合成され、これは宿主細胞プロテアーゼにより120kDaの受容体結合性サブユニット(gp120)および41kDaの膜アンカーサブユニット(gp41)へと切断される。許容細胞上のCD4および関連CXCR4またはCCR5ケモカイン補助受容体へのgp120の逐次的結合に際して、エンベロープ糖タンパク質サブユニットにおいて大きなコンホメーション変化が生じて、それまで埋もれていた三量体gp41コアが一時的に露出し、最終的に、ウイルス膜および細胞膜の融合ならびに宿主細胞の細胞質内へのウイルス内容物の挿入が生じる。
標的宿主細胞膜内へのgp41の挿入の後に、該三量体のN末端7アミノ酸反復(NHR)部分により形成された疎水性ポケット内にgp41の両親媒性C末端7アミノ酸反復(CHR)領域が逆平行様態で詰め込まれる広範な再構成が生じて、6−ヘリックス「ヘアピン三量体」構造を形成する。該ヘアピン三量体構造は6個のα−ヘリックス[中央の三重螺旋コイルドコイル(3個のgp41エクトドメインからのN−ヘリックス領域により形成されたもの)に対して逆平行様態で詰め込まれた3個のα−ヘリックス(3個のgp41エクトドメインからのC−ヘリックス領域により形成されたもの)]の束である。この再構成は、ウイルス膜および細胞膜を並置させ次いで脂質混合および膜融合を生じさせるための必須の幾何構造およびエネルギーを与える。
合成NHRおよびCHRペプチドは強力な抗ウイルス活性を示すことが判明しており、それらは新生融合中間体に結合し融合活性6−ヘリックス束の形成を阻止するドミナントネガティブメカニズムにより機能すると考えられている。プレヘアピン中間体の可溶性三量体ペプチド模倣体が、酵母転写因子GCN4に由来する異種三量体化ドメインを種々の残基長のgp41 NHRに融合させることにより製造されている。そのような構築物は米国特許第7,960,504号および第7,811,577号ならびに米国特許出願公開第20100092505号に記載されている。同様に、細菌内の組換え発現により製造された短いリンカーにより隔てられた交互に存在するNHR配列およびCHR配列からなる一本鎖ポリペプチドである組換え5−ヘリックスペプチドが米国特許第7,053,179号および第7,504,224号に記載されている。これらのペプチドを安定化させるために用いられた1つのアプローチはシステイン残基の使用によるものである。米国特許第7,811,577号;Bianchiら,2009,Adv Exp Med Biol 611:121−3;Bianchiら,2010,Proc Natl Acad Sci USA 107:10655−10660;およびBianchiら,2005,Proc Natl Acad Sci USA 120:12903−12908を参照されたい。gp41ペプチドを安定化させるための他のアプローチには、米国特許第7,728,106号および第7,604,804号に記載されているものが含まれる。
発明の概括
本発明は、コンホメーション的に制限(拘束)された三価gp41ペプチド模倣体、およびHIVに対する中和抗体を惹起するための免疫原としてのその用途に関する。該gp41ペプチド模倣体は、HIV−1ウイルスを中和しうる免疫応答を惹起する、天然プレヘアピン融合中間体を模倣した構造的に安定化した形態で、完全なHIV−1 gp41 N−7アミノ酸反復(NHR)領域の全部または一部を有する。
本発明は、コンホメーション的に制限(拘束)された三価gp41ペプチド模倣体、およびHIVに対する中和抗体を惹起するための免疫原としてのその用途に関する。該gp41ペプチド模倣体は、HIV−1ウイルスを中和しうる免疫応答を惹起する、天然プレヘアピン融合中間体を模倣した構造的に安定化した形態で、完全なHIV−1 gp41 N−7アミノ酸反復(NHR)領域の全部または一部を有する。
したがって、本発明は、3個のN−ペプチドに連結されたスカフォールド(骨格)コアを含むgp41ペプチド模倣体に関するものであり、ここで、各N−ペプチドは、N36(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL;配列番号1)またはその修飾形態を含むアミノ酸配列を含み、前記の3個のN−ペプチドは互いに相互作用して、HIV gp41のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成しており、ただし、該gp41ペプチド模倣体は(CCIZN36)3ではない。特定の実施形態においては、前記の3個のペプチドのそれぞれは、異なる結合点において該スカフォールドコアに共有結合している。
ある実施形態においては、該gp41ペプチド模倣体は、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセタート、トリス−(2−マレイミドエチル)アミン、KTA−ブロミドまたはコール酸を含むスカフォールドコアを含む。特定の実施形態において、スカフォールドコアは、KTA−ブロミドまたはコール酸である。
他の実施形態においては、該gp41ペプチド模倣体は、3個のN−ペプチドの結合を可能にする3個の官能基化残基を含む直鎖状ポリペプチド鎖であるスカフォールドコアを含む。特定の実施形態においては、該スカフォールドコアは、
a)CH3CO−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−NH2(配列番号41);
b)CH3CO−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2(配列番号42);
c)CH3CO−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2(配列番号43);
d)CH3CO−Cys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2(配列番号44);または
e)CH3CO−Cys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2(配列番号45)を含む。
a)CH3CO−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−NH2(配列番号41);
b)CH3CO−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2(配列番号42);
c)CH3CO−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2(配列番号43);
d)CH3CO−Cys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2(配列番号44);または
e)CH3CO−Cys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2(配列番号45)を含む。
更に他の実施形態においては、該gp41ペプチド模倣体は、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタンを含む炭素環式スカフォールドであるスカフォールドコアを含む。更に他の実施形態においては、該gp41ペプチド模倣体は、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、オキサン、チアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ピペラジン、モルホリンまたはチオモルホリンを含む複素環式スカフォールドであるスカフォールドコアを含む。
本発明の或る実施形態においては、該N−ペプチドはN51(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号4);N51−2B(QIRELISKIVEQINNILRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号8)またはN51−3B(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号9)を含む。特定の実施形態においては、該N−ペプチドはN51(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号4)からなる。
ある実施形態においては、該N−ペプチドは、同じ又は異なるアミノ酸配列を含みうる。特定の実施形態においては、該N−ペプチドは、同じアミノ酸配列からなる。
ある実施形態においては、1以上のN−ペプチドは、
a)三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分と、
b)HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復領域の全部または一部を含むN−ペプチド部分とを含むキメラN−ペプチドであり、ここで、該スカフォールド部分はヘリックス相(helical phase)で該N−ペプチド部分に融合してα−ヘリックスドメインを形成しており、前記の3個のN−ペプチドは互いに相互作用して三量体コイルドコイルを形成している。この実施形態の或る態様においては、該キメラN−ペプチドのN−ペプチド部分はヘリックス相で該キメラN−ペプチドのスカフォールド部分のCOOH末端に融合している。この実施形態の特定の態様においては、該キメラN−ペプチドのスカフォールド部分は、
a)スズキ(Suzuki)−IZコイルドコイルモチーフ(YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(配列番号31)、
b)IZコイルドコイルモチーフ(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK(配列番号34)、または
c)EZコイルドコイルモチーフ(IEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEK(配列番号37)を含む。
a)三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分と、
b)HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復領域の全部または一部を含むN−ペプチド部分とを含むキメラN−ペプチドであり、ここで、該スカフォールド部分はヘリックス相(helical phase)で該N−ペプチド部分に融合してα−ヘリックスドメインを形成しており、前記の3個のN−ペプチドは互いに相互作用して三量体コイルドコイルを形成している。この実施形態の或る態様においては、該キメラN−ペプチドのN−ペプチド部分はヘリックス相で該キメラN−ペプチドのスカフォールド部分のCOOH末端に融合している。この実施形態の特定の態様においては、該キメラN−ペプチドのスカフォールド部分は、
a)スズキ(Suzuki)−IZコイルドコイルモチーフ(YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(配列番号31)、
b)IZコイルドコイルモチーフ(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK(配列番号34)、または
c)EZコイルドコイルモチーフ(IEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEK(配列番号37)を含む。
本発明はまた、
a)KTA(N51)3、
b)KTA(N51−2B)3、
c)KTA(N51−3B)3、
d)chA(N51)3、
e)(CCIZN51)3または
f)SZN51であるgp41ペプチド模倣体に関する。
a)KTA(N51)3、
b)KTA(N51−2B)3、
c)KTA(N51−3B)3、
d)chA(N51)3、
e)(CCIZN51)3または
f)SZN51であるgp41ペプチド模倣体に関する。
特定の実施形態においては、gp41ペプチド模倣体はKTA(N51)3である。
本発明はまた、本発明のgp41ペプチド模倣体と医薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物に関する。
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物の予防的有効量を哺乳類宿主内に導入することを含む、哺乳類宿主において免疫応答を惹起する方法に関する。ある実施形態においては、該哺乳類宿主はヒトである。
発明の詳細な説明
1つの態様においては、本発明は、スカフォールド(骨格)により三量体コイルドコイルへとコンホメーション的に制限された3個のgp41ペプチドを含むgp41ペプチド模倣体に関する。特に、本発明のこの態様は、3個のN−ペプチドに連結されたスカフォールドコアを含むgp41ペプチド模倣体に関するものであり、ここで、各N−ペプチドは、N36(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号1)またはその修飾形態を含むN−ペプチド部分を含み、ここで、前記の3個のN−ペプチドは互いに相互作用して、HIV gp41のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成している。
1つの態様においては、本発明は、スカフォールド(骨格)により三量体コイルドコイルへとコンホメーション的に制限された3個のgp41ペプチドを含むgp41ペプチド模倣体に関する。特に、本発明のこの態様は、3個のN−ペプチドに連結されたスカフォールドコアを含むgp41ペプチド模倣体に関するものであり、ここで、各N−ペプチドは、N36(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号1)またはその修飾形態を含むN−ペプチド部分を含み、ここで、前記の3個のN−ペプチドは互いに相互作用して、HIV gp41のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成している。
もう1つの実施形態においては、本発明は、HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復全領域、すなわち、N51(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号4))またはその修飾形態を有し、gp41ペプチド模倣体を形成しうるN−ペプチド、およびそれから形成されたgp41ペプチド模倣体に関する。
本発明は、げっ歯類、モルモットおよび非ヒト霊長類免疫原性研究において、実施例に例示されているとおり、コンホメーション的に制限されたKTA(N51)3がウイルス分離体のパネルに対する中和抗体応答の惹起において組換え5−ヘリックスペプチドおよび(CCIZN36)3より優れていたという本出願人の観察に部分的に基づいている。
いずれの理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明は、ワクチン接種された哺乳動物における免疫応答を、特定のD5−エピトープ中和成分を含有する高度に保存されたgp41プレヘアピンコンホメーション中間体に集中させると考えられる。これは、三量体コイルドコイルにおける中和エピトープの提示を安定化させるために、スカフォールドコアでgp41ペプチド模倣体をコンホメーション的に制限することにより達成される。幾つかの実施形態においては、これらの安定な可溶性コンホメーションgp41ペプチド模倣体は、D5エピトープとは異なる追加的な中和エピトープを潜在的に提供する。
本明細書中で用いる「キメラN−ペプチド」または「キメラペプチド」は、三量体コイルドコイルコンホメーションをとりうるα−ヘリックススカフォールドタンパク質に融合した、gp41のNH2末端7アミノ酸反復ドメイン(NHR)の全部もしくは一部(一般には少なくともN17またはN36)またはその修飾形態を含むペプチドと定義される。該スカフォールドタンパク質は非HIV配列である。
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、抗体に特異的に結合しうるタンパク質抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、分子の化学的に活性な表面グループ、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特定の三次元構造的特徴および特定の電荷特性を有することが、よく知られている。コンホメーションエピトープと非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下、前者の結合は失われるが、後者の結合は失われない点で区別される。
本明細書中で用いる、N−ペプチド構築物に関する「異種」は、(1)gp41配列(長さおよび/または修飾)、または(2)いずれかのスカフォールドドメイン(例えば、IZ、EZ、SZ)の種類または長さにおいて異なっているN−ペプチド構築物に関するものである。
本明細書中で用いる「HIV」は、HIV−1、HIV−2、またはHIV−1および/もしくはHIV−2を表すと意図される。
本明細書中で用いる「N−ペプチド」は、単独で又はスカフォールドドメインの利用により三量体コイルドコイルコンホメーションをとりうる、gp41のNH2末端7アミノ酸反復ドメイン(NHR)の全部もしくは一部(一般には少なくともN17またはN36)またはその修飾形態を含むペプチドと定義される。
本明細書中で用いる「中和」は、例えば実施例1および2に記載されているもののような、インビトロの細胞/ウイルスに基づくアッセイにおいて、ウイルス感染を抗体が妨げ又は低減しうることを示すために、当技術分野における場合と同様に用いられる。中和活性はその特定の抗体に関するIC50値として定量的に測定されうる。「中和抗体」または「HIV中和抗体」は少なくとも1つのHIV分離体を中和することが、当技術分野で受け入れられている感染性アッセイにおいて示されている。
本明細書中で用いる「スカフォールドコア」は、gp41 N−ペプチドに直接的に又はリンカーを介してそれぞれが結合可能である少なくとも3個の部分を有する円筒状または直線状化合物である、本明細書に開示および/または記載されている化学的構造体を意味する。
本発明のgp41ペプチド模倣体は、包膜ウイルス膜−融合タンパク質の融合誘導性コンホメーション内に含有される内部三量体コイルドコイルモチーフ、特に、HIV gp41エクトドメインの内部コイルドコイルドメインを模倣したものである。これらの模倣体は3個のN−ペプチドを含み、これらは、一緒になって、gp41融合前中間体に特徴的な三量体コイルドコイルを形成するキメラN−ペプチドでありうる。幾つかの実施形態においては、該N−ペプチドは、HIV gp41のN−ヘリックスの全部もしくは一部またはその修飾形態にヘリックス相で融合したコイルドコイルの非HIV可溶性三量体形態を含むキメラN−ペプチドである。本発明の或る態様においては、前記の3個のN−ペプチドは、該N−ペプチドをコンホメーション的に制限するスカフォールドコアの使用によりホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造において共有結合的に安定化されている。
ある実施形態においては、該N−ペプチドは、HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復ドメインの全部もしくは一部またはその修飾形態を含む。該N−ペプチドは、例えば、N17、N36、N38、N44またはN51を含みうる。他の実施形態においては、該N−ペプチドは、1)三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分、および2)HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復領域(例えば、N17、N36またはN51)の全部または一部を含むN−ペプチド部分を含むキメラペプチドであり、3)少なくとも2つのシステイン残基を含むシステイン部分を含んでもよく、ここで、該スカフォールド部分はヘリックス相で該N−ペプチド部分に融合してa−ヘリックスドメインを形成しており、該システイン部分は、存在する場合には、NH2またはCOOH末端のいずれかにおける該α−ヘリックスドメインの外側に位置する。該システイン部分の存在は該キメラペプチドを三量体形態に共有結合的に制限(拘束)することを補助する。これらのN−ペプチドの共有結合安定化は、HIV gp41の中央の三量体N−ヘリックスコイルドコイルの、安定な露出部分の提示を可能にする。
該gp41ペプチド模倣体は、HIV−1 gp41に由来する該N−7アミノ酸反復領域の全部または一部を含むN−ペプチドを含む。HIV−1 gp41エクトドメインは、約169アミノ酸の残基、すなわち、参考株HXB2のHIV−1 gp160エンベロープタンパク質における残基位置による番号付けで残基512−681に相当する。このエクトドメイン内に、α−ヘリックスを形成すると推定される該エクトドメインのNH2末端部分に隣接して位置する4−3 7アミノ酸反復領域が存在する。このN−7アミノ酸反復は、それぞれ、gp160のアミノ酸位置約541−592に位置する(例えば、Caffreyら,1998,EMBO J.17:4572−4584を参照されたい)。
本発明のペプチド模倣体のN−ペプチドドメインは、該糖タンパク質のC−ヘリックスドメインにより形成されるα−ヘリックスに結合するための十分な量のgp41のN−ヘリックス領域を含む。典型的には、該N−ヘリックスドメインからの17個以上または36個以上で、全51個まで(51個を含む)の該ドメインのアミノ酸残基が、該N−ペプチドのHIV gp41成分を構成しうる。該N−ペプチド領域内の任意の配列が、それがエピトープを提示する限り、使用可能である。しかし、約36、40、45または50アミノ酸より短い配列は、スカフォールドドメインを与える追加的なペプチド配列を要しうるが、これは後記で更に詳しく説明される。
本発明の1つの実施形態においては、本明細書に記載されているN−ペプチドは、少なくとも、gp160配列の残基546−581に対応する、HIV−1 gp41のNHRのCOOH末端半分に位置する36アミノ酸(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(本明細書においては以下、「N36」;配列番号1と称される))を含む。ある実施形態においては、N−ペプチドは、gp41残基546−583(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAG(本明細書においては以下、「N38」;配列番号2と称される))を含む又はそれから実質的になる又はそれからなる。ある実施形態においては、N−ペプチドは、NH2末端に付加された6個のアミノ酸残基を伴うgp41残基546−583(RGRGRGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAG(本明細書においては以下、「N44」;配列番号3と称される))を含む又はそれから実質的になる又はそれからなる。ある実施形態においては、N−ペプチドは、gp41残基540−590(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(本明細書においては以下、「N51」;配列番号4と称される))を含む又はそれから実質的になる又はそれからなる。そのようなペプチドはHIV−1 gp41 N−7アミノ酸反復領域と、N末端極性ドメインの部分とを含む。これらの実施形態においては、該N−ペプチドは、共有結合により安定化されたコンホメーション的に制限された三量体の状況において完全長NHRの提示を可能にするように設計された。追加的なN−ペプチドはN36とN51との間の任意の配列を含みうる。HIV gp160配列に関する本明細書の全体における全ての番号付けはHIV−1分離体HXB2に基づくものである。
他の実施形態においては、該N−ペプチドは、gp41タンパク質内のNHRの直上流または直下流の配列に由来する追加的なHIV配列を含みうる。例えば、キメラペプチドは、gp41残基528−590(本明細書においては以下、「N63」(STMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号5))と称される)を含みうる。
N−ペプチドは、野生型HIV N−ヘリックス7アミノ酸ドメインの修飾形態でありうる。ただし、生じるペプチドは、本明細書に記載されているとおり哺乳類細胞のHIV感染のインヒビターでなければならず、および/または、融合中間体のコンホメーションエピトープを標的化する中和抗体を産生しうるものでなければならない。天然NHR内に施された修飾を有するN−ペプチドはHIV N−ペプチドドメインの三量体化能および表面構造を維持していなければならない。例えば、該N−ペプチドを得るために使用されるN−ペプチド配列内に非中和性免疫優性領域(すなわち、免疫系により最も容易に認識され、誘導抗体の特異性に最も影響を及ぼす抗原決定基のサブユニット)が存在しうる。該NHR(適用可能な場合にはN36またはN51)の修飾形態はHIV株HXB2由来の天然gp160配列からの1個のアミノ酸変化から、2個までのアミノ酸変化、3個までのアミノ酸変化、4個までのアミノ酸変化、5個までのアミノ酸変化、6個までのアミノ酸変化、7個までのアミノ酸変化または8個までのアミノ酸変化を有しうる。修飾はアミノ酸の挿入、欠失および/または置換を含みうる。尤も、一般には、適切な配置を維持するためには、修飾は置換である。
該NHRのアラニンスキャニングにより、免疫優性領域が特定されている。非中和性抗体を産生するこの免疫優性領域は、最端COOH末端部分に位置する。アミノ酸残基アルギニン−579(R579)は該非中和性モノクローナル抗体の結合に決定的に重要であり、残基グルタミン−577(Q577)およびロイシン−581(L581)も該結合に関与するが、試験されるモノクローナル抗体に応じて様々な寄与を示す。マウスモノクローナル抗体の結合に関与するこれらの残基は、該NHR内の免疫優性エピトープに相当すると考えられる該分子の底部における環を形成する。興味深いことに、該三量体N−ヘリックスコイルドコイルの疎水性ポケットに沿って並ぶアミノ酸残基はこの推定免疫優性エピトープの更にNH2末端に位置する。該疎水性ポケットは、新たに特定されたHIV中和性抗体D5 IgGに結合するドメインを含むことが確認されている。したがって、該疎水性ポケットは推定中和性コンホメーションエピトープを含有すると考えられている(米国特許第7,744,887号を参照されたい)。したがって、該N−ペプチドを産生させるために使用されるN−ペプチドドメインは、前記の特定された非中和性免疫優性ドメインの抗原応答を最小にして該疎水性ポケット内の推定中和性エピトープに免疫応答を集中させるにするために、修飾または短縮化されうる。例えば、N36またはN51の修飾形態においては、N36の最端COOH末端部分は以下の残基のいずれかの1以上において突然変異されうる:ロイシン−581(L581)、アルギニン−579(R579)、グルタミン−577(Q577)および/またはグルタミン−575(Q575)。各残基はアラニン(A)アミノ酸に突然変異されることが好ましい。なぜなら、アラニンはα−ヘリックス形成に関与することが可能であり、したがって、該ペプチドのコイルドコイル構造を破壊しないからである。また、アラニンは小さな側鎖を有し、したがって、抗体に対して可能な限り小さな結合表面を提示する。グリシンまたはプロリン残基は側鎖を有さず、この突然変異のための、より良好な選択肢であるとみなされうるが、該アミノ酸はα−ヘリックスコンホメーションを破壊することが公知である。本発明の1つの実施形態においては、該N−ペプチドは、挙げられている残基の全4個(L581A、R579A、Q577AおよびQ575A)において突然変異した配列を含み、配列LLQLTVWGIKALAAAIA(配列番号6)を有する「N17Ala4」と称されるN−ペプチドドメインを形成する。突然変異アミノ酸は下線で示されている。
また、該N−ペプチドのN−ペプチド部分は、該ペプチド全体を更に安定化させるために修飾されうる。例えば、該N−ペプチドドメインは、より安定化するイソロイシン残基を該配列内に組込むために修飾されうる。したがって、例えば、本発明の1つの実施形態においては、N−ペプチドは、以下のとおりにイソロイシン残基を組込むために「a」および「d」パッキング位置において突然変異されうる:LIQLIWGIKQIQARIL(配列番号7;「N17Ile」と称される;突然変異残基が下線で示されている)。
三量体の安定化ならびに/または疎水性ポケットおよび/もしくはD5エピトープの提示に関する利点を得るために、該N−ペプチド配列において他の修飾が施されうる。
生じる三量体の溶解度を増加させ、および/または凝集傾向を低減するために、N51配列の修飾形態が作られている。そのようなペプチドの例には、N51−2BおよびN51−3Bが含まれる。N51−2Bは以下の配列を有する:QIRELISKIVEQINNILRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号8)。N51−3Bは以下の配列を有する:QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号9)。
N51配列に例示されているのと同じこれらの修飾はより短い配列にも適用されうる。
したがって、本発明の組成物のための使用に適した具体的な修飾には以下の位置における置換が含まれる(全てHXB2における位置で示す。):Q540,A541,Q543,L545,G547,Q550,Q552,L555,L565,T569,I573,L576,I580,V583,L587またはQ590。具体的な修飾には以下の置換が含まれる:Q540N,A541I,Q543E,L545I,G547A,G547K,Q550E,Q552I,L555I,L565A,L566I,T569V,T569I,I573V,I573N,Q575A,L576I,Q577A,R579A,I580V,L581A,V583I,L587IまたはQ590I。
N−ペプチドを得るために使用されるHIV gp41のN−ヘリックス部分はHIV−1、HIV−2、他のHIV株、または他のレンチウイルス種(例えば、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)またはビスナウイルス)からの株から単離されうる。類似HIV株および/または他の種の免疫不全ウイルスにおける対応N−ペプチド配列は容易に特定可能であり、当技術分野で公知である。また、α−ヘリックスコイルドコイルドメインは他の包膜ウイルスの膜融合タンパク質において特定されている(Singhら,1999,J Mol Biol.290:1031−41を参照されたい)。
更に、本明細書に記載されているペプチド配列のそれぞれに関して、該N−ペプチドドメインは、gp41配列の一部ではない1〜12個のアミノ酸により伸長されうる。例えば、Weissenhomら(1997,Nature 387:426−430)は、NH2末端における5個のアミノ酸残基により、およびN36ペプチド配列のCOOH末端における7個のアミノ酸残基によりN36ペプチドを伸長している:ARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK(配列番号25)。したがって、該N−ペプチドは更に、N36ペプチドドメインの全部またはCOOH末端部分のCOOH末端に位置する7個の追加的アミノ酸、特にAVERYLK(配列番号26)の全部または一部を含みうる。したがって、1つの実施形態においては、N−ペプチドは、「N17+7」(LLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK(配列番号27))、「N23+7」(IEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK(配列番号28))または「N36+7」(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLK(配列番号29))と称されるN−ペプチドドメインを含む。また、該N−ペプチドは、N36ペプチド配列の全部またはNH2末端部分、そしてそれに加えて更に、N−ペプチド領域を更にNH2末端領域内へと伸長させる、該N−ペプチドのNH2末端に位置する5個までのアミノ酸を含みうる。したがって、該N−ペプチドは更に、N36ペプチドのNH2末端に位置する5個のアミノ酸、特にASQLL(配列番号30)の全部または一部を含みうる。
ある実施形態においては、該N−ペプチド領域のコンホメーションを維持するために、ペプチドに基づくスカフォールドドメインが必要でありうる。該スカフォールドドメインは非HIVアミノ酸配列であり、したがって、生じるN−ペプチドはキメラN−ペプチドである。該スカフォールドドメインは、三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックスドメインを含み、該N−ペプチドにヘリックス相で融合して、連続的コイルドコイルを生成している。
コイルドコイルは、超螺旋ねじれで互いに巻きついた2以上のα−ヘリックスからなるタンパク質構造モチーフである。アミノ酸残基の単純パターンが、文字「a」〜「g」により示されるアミノ酸の特徴的7アミノ酸反復からなるコイルドコイルのフォールドを決定する。該7アミノ酸反復の第1位および第4位、すなわち、それぞれ「a」位および「d」位がコイルドコイルの相互作用性鎖の内部を形成し、一般に疎水性であることが確認されている。3個のgp41エクトドメインのN−ヘリックスにより形成されるプレヘアピンおよびヘアピン三量体構造内に存在する内部三量体コイルドコイルを模倣するように、該キメラN−ペプチド内のスカフォールドドメインは、本発明のgp41ペプチド模倣体内に三量体コイルドコイル構造を形成する。
本発明の1つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは該N−ペプチド領域のNH2末端に融合している。もう1つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは該N−ペプチド領域のCOOH末端に融合している。更にもう1つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは、該ドメインの部分が該N−ペプチド領域のNH2およびCOOHの両末端に位置するように分割されうる。
gp41三量体を安定化するように三量体化することが知られているいずれかのコイルドコイルモチーフを使用することが可能である。コイルドコイルモチーフは種々の起源から選択されうる。本明細書に記載されているキメラN−ペプチド内のスカフォールドドメインは、特に、Suzuki(スズキ)ら(1998,Protein Eng.11:1051−1055)において開示されているイソロイシンジッパーモチーフ(以下、「スズキ−IZ」)およびEckertら(1998,J.Mol.Biol.284:859−865および国際特許出願公開番号WO02/024735)において開示されているGCN4−pIQIコイルドコイルモチーフ、ならびにそれらのトランケート化および/または修飾形態を含む。
スズキ−IZコイルドコイルモチーフは以下のアミノ酸配列を有する:YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(配列番号31)。該スズキ−IZモチーフを構成する7アミノ酸反復([(IEKKIEA)n;(配列番号32)n])の「a」位が下線で示されている。
GCN4−pIQIコイルドコイルは以下のアミノ酸配列を有する:RMKQIEDKIEEILSKQYHIENEIARIKKLIGER(配列番号33)。このヘリックスモチーフの「a」位も下線で示されている。
IZドメイン(IKKEIEAIKKEOEAIKKKIEAIEK(配列番号34))は、Suzukiら(1998,Protein Eng.11:1051−1055)により記載されている設計に基づく修飾イソロイシンジッパーであり、溶液中で螺旋状であり三量体である。
Suzuki−IZ、GCN4−pIQIおよび他のスカフォールドドメインは、1以上のアミノ酸残基の付加、置換、修飾および/または欠失により変化されうる。「スズキ−IZ様」および「GCN4−pIQI様」スカフォールドドメインは、本明細書においては、それぞれ「スズキ−IZ」または「GCN4−pIQI」コイルドコイルの一部を含むコイルドコイルモチーフ、あるいは前記のそれぞれのコイルドコイルの全部または一部の修飾形態と定義される。スズキ−IZ様およびGCN4−pIQI様スカフォールドドメインは、それぞれ、スズキ−IZおよびGCN4−pIQI三量体コイルドコイルドメインまたはそれらの修飾形態の十分な部分(すなわち、十分な長さ)からなっていて、それらが可溶性三量体(ヘリックス)コイルドコイルを形成するものでなければならない。スカフォールドタンパク質のアミノ酸配列における変化の許容範囲は、変化したアミノ酸が構造的および/または機能的役割を果たすかどうかに左右されるであろう。したがって、本発明において使用される突然変異または修飾スカフォールドタンパク質は、三量体コイルドコイルを形成する能力を保有していなければならない。また、3個のN−ペプチド(その少なくとも1つは、突然変異/修飾スカフォールドドメインを使用して得られる)から構成される本発明のgp41ペプチド模倣体は、例えば少なくとも低ナノモル濃度範囲、例えば1〜5nMにおける効力でHIV感染性を抑制する能力、またはN−ヘリックスコイルドコイル内に位置するコンホメーションエピトープを認識するgp41特異的抗体に結合する能力を保有していなければならない。該スカフォールドタンパク質の修飾は幾つかの利点をもたらしうる。例えば、本発明のキメラペプチドの外部表面は、バイオアベイラビリティ(例えば、該ペプチドの溶解度の増加)を増強するため、毒性を低減するため、および免疫クリアランスを回避するために改変されうる。代替的スカフォールドを含む本発明のキメラペプチドの複数の形態の利用可能性は、既存抗体から逃れることにより、この問題を回避することを助けるであろう。また、該キメラペプチドのスカフォールドドメインを、例えば、その外部表面上にグリコシル化またはペグ化(PEG化)部位を導入することにより、より低い免疫原性にするために、該スカフォールドタンパク質は修飾されうる。更に、該スカフォールドドメインは、免疫原性担体またはアフィニティ樹脂への該ペプチド模倣体のコンジュゲート化を促進するために修飾されうる。
前記のIZスカフォールドモチーフは、「e」および「g」位において顕著に改変されており「a」位にイソロイシンからグルタミンへの(I→Q)置換を有するスズキ−IZコイルドコイルモチーフの一部を表す(国際特許出願公開番号WO02/024735を参照されたい)。「IZ」スカフォールドドメインのアミノ酸配列はIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK(配列番号34;「a」位が下線で示されている)であり、ここで、NH2末端はアセチル化されており、COOH末端はアミド化されている。
ペプチド模倣体内への組込みのために、IZスカフォールドドメインの短縮化形態も製造されうる。短縮化IZ様ドメインの具体例はIZスカフォールドの17アミノ酸である:IKKEIEAIKKEQEAIKK(配列番号35;「IZ17」と称される;「a」位が下線で示されている)。
より長いHIV配列断片を有する代替的ペプチド模倣体を製造する際に適切なヘリックス構造を維持するために、この「IZ」スカフォールドは、「IZ様」スカフォールドドメインが得られるように1個〜数個のアミノ酸により伸長される必要があるかもしれない。例えば、IZN23およびIZN36は、Eckertら,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11187−11192にも開示されているキメラN−ペプチドである。IZN36のアミノ酸配列は、それぞれ、IKKE IEAIKKE QEAIKKK IEAIEKE ISGIVQQ QNNLLRA IEAQQHL LQLTVWG IKQLQAR IL(配列番号36)である。該ペプチドの「a」位が下線で示されている。例えば、IZN36のIZ様スカフォールドドメインは1個または好ましくは2個のアミノ酸により伸長されうる。これは、適切な「a」から「g」までの間隔を維持するために必要とされる可能性があり、α−ヘリックスコンホメーションの生成を促進する。このようにして該スカフォールドドメインを伸長させるために選択されるアミノ酸は隣接ヘリックス間の静電的相互作用を可能にするものであるべきである(Suzukiら,1998,Protein Eng.11:1051−1055を参照されたい)。安定化されるキメラN−ペプチドを得るためには、IZN36で見られるとおり、生じるペプチドのヘリックスコンホメーションを維持するために、スカフォールドドメインは最小限度に改変される必要がある、と当業者は理解するであろう。他のスカフォールドで類似変化が施されうる。
もう1つの実施形態においては、該スカフォールドドメインは、以下のアミノ酸配列を有する、「EZ」スカフォールドと称される修飾スズキ−IZ様ドメインを含む:IKK IEEIEKK IEEIEKK IEEIEK(配列番号37;「a」位が下線で示されている)。
もう1つの実施形態においては、バクテリオファージT4フィブリチン三量体(FT)配列の26アミノ酸三量体モチーフ:YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(配列番号38)がスカフォールドドメインとして使用される。フィブリチンに基づく類似モチーフが当技術分野で公知である。
好ましいキメラN−ペプチドの一例はSZN51 IEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号39)である。
前記のとおり、該ペプチド模倣体のスカフォールドドメインのアミノ酸配列は修飾および/または短縮化されうるが、そうする際には、生じるキメラペプチドは、gp41の内部N−ヘリックスコイルドコイルの安定な忠実な模倣体を表す三量体コイルドコイルを形成する能力を保有していなければならない。
ある実施形態においては、該キメラN−ペプチドは共有結合的に安定化される。ペプチド模倣体は、スカフォールドドメインにヘリック相で融合したN−ペプチドを含むことが可能であり、ここで、該ペプチド配列は、所望により、該キメラペプチドのNH2またはCOOH末端および好ましくはコアヘリックス領域の外部に位置する少なくとも2つのシステイン残基を更に含んでいてもよい。これらのペプチドはCC−キメラN−ペプチドと称される。そのような実施形態においては、ホモ三量体またはヘテロ三量体分子において、3個の同一の又は実質的に類似したシステイン含有キメラペプチドは次いで、密接に会合したキメラペプチド鎖上の並置システイン残基間で酸化条件下で形成される分子間ジスルフィド結合により、共有結合的に安定化される。共有結合的に安定化されたホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルは、予め形成された三量体コイルドコイルを酸化環境にさらすことにより、または酸化条件下において、個々のペプチド鎖の、コイルドコイルコンホメーションへの会合を促進させることにより形成される。該付加システイン残基は、高いコンホメーション自由度が確保されるようにキメラペプチドのα−ヘリックスドメインの外部に位置しており、所望により、リンカーまたはスペーサー領域によりコアキメラペプチド配列から隔てられていてもよい。米国特許第7,811,577号を参照されたい。
本明細書に記載されているCC−キメラN−ペプチド内に存在するシステイン残基は連続的アミノ酸残基である。したがって、本明細書に記載されているCC−キメラN−ペプチドは、該キメラペプチドのコアα−ヘリックスドメインの外部、該ペプチドのNH2またはCOOH末端に位置し、所望によりスペーサー/リンカー領域により該コアα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよい、少なくとも2個の連続的システイン残基を含みうる。本明細書に記載されているCC−キメラN−ペプチドはまた、該キメラペプチドのコアα−ヘリックスドメインの外部、該ペプチドのNH2またはCOOH末端に位置し所望によりスペーサー/リンカー領域により該コアα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよいちょうど2個の連続的システイン残基を含みうる。また、本明細書に記載されているシステイン残基は連続的残基である必要は必ずしもなく、したがって、それらのシステイン残基間に最小数のアミノ酸残基を含むことが可能でありうる、と当業者は予想しうる。しかし、同一ポリペプチド鎖上のシステイン残基間の分子内ジスルフィド結合の生成が可能となるまでシステイン残基が遠く隔てられてしまい、三量体コイルドコイルコンホメーションにおいて、該システイン残基が個々のCC−キメラN−ペプチド間で分子間ジスルフィド結合を形成不可能とならないようにすることが重要である。
それらの2個の連続的システイン残基は、該ペプチドの酸化に際して形成される密接に会合したCC−キメラN−ペプチド上の並置システイン残基とのジスルフィド結合連結に関与する。2個の連続的グリシン残基が存在する実施形態においては、該グリシン残基は、コアキメラペプチド配列のα−ヘリックスドメインから該システイン残基を分離するスペーサー領域の一例である。該グリシンスペーサー領域は、該システイン残基がコアペプチド配列のヘリックス二次構造に関与しないことを保証し、該システインを自由にして、ジスルフィド結合に関与することを助ける。個々のタンパク質間(すなわち、分子間)または単一のポリペプチド鎖内(すなわち、分子内)の共有結合性架橋はシステイン残基の酸化により形成されうる。ジスルフィド結合はシステイン残基におけるチオール(−SH)基の酸化により形成される。分子内ジスルフィド結合はタンパク質の三次構造を安定化し、一方、分子間で生じるジスルフィド結合は、1以上のポリペプチドが関わるタンパク質構造の安定化に関与する。個々のペプチド/タンパク質間の共有結合性架橋は、共有結合により連結されるべきペプチド/タンパク質内への特有の互いに反応性の基(連結されるべき各断片内のもの)の組込みによりもたらされる化学選択的反応(例えば、チオエーテル結合の形成)によっても形成されうる(Lemieux G.A.およびBertozzi C.R.,1998,Trends Biotechnol.16:506−513;ならびにBorgia,J.A.およびFields G.B.,2000,Trends Biotechnol.15:243−251において概説されている)。キメラペプチドのコアα−ヘリックスドメインに付加されたシステイン残基は、酸化されるとジスルフィド結合を生成して、3個の同一CC−キメラN−ペプチドにより形成された三量体構造を共有結合的に安定化する。
本明細書に記載されているシステイン残基は、CC−キメラN−ペプチドを生成させるために、コアキメラN−ペプチドのNH2末端またはCOOH末端に付加されうる。例えば、スカフォールドコイルドコイルドメインが該キメラペプチドのNH2末端半分に位置する場合、2個のシステイン残基は、CC−キメラN−ペプチドのNH2末端における最初の2個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。この配置は、それらの2個の操作システイン残基が該キメラペプチドのN−ペプチド部分のα−ヘリックス構造および/または該HIVドメインの機能を妨げる(例えば、C−ヘリックスと相互作用する)可能性を最小にすることを保証する。あるいは、スカフォールドコイルドコイルドメインが該キメラペプチドのNH2末端半分に位置する場合に、2個のシステインアミノ酸残基は、CC−キメラN−ペプチドのCOOH末端における最後の2個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。これは、例えば、該スカフォールドドメインに隣接して位置するCys−Cys配列の存在ゆえに、CC−キメラN−ペプチドを該キメラペプチドの非HIVスカフォールド部分を介して免疫原性担体またはアフィニティ樹脂にコンジュゲート化させるのが困難な場合に必要でありうる。また、N−ペプチドドメインが該キメラペプチドのNH2末端半分に位置する場合、2個のシステイン残基は、CC−キメラN−ペプチドのNH2末端における最初の2個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。N−ペプチドドメインが該キメラペプチドのNH2末端半分に位置する場合、2個のシステイン残基は、C−CキメラN−ペプチドのCOOH末端における最後の2個のアミノ酸残基を占拠するように操作されうる。該N−ペプチドおよびスカフォールドドメインの配置を変化させることは、生じるCC−キメラN−ペプチドがウイルス−宿主細胞膜融合を抑制する能力に影響を及ぼしうる。
好ましいCC−キメラN−ペプチドはCCIZN51:CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号40)である。
代替的実施形態においては、該コアキメラペプチドのいずれかの末端に求電子部分を組込みこんで、該ペプチド間のそれぞれジスルフィドおよび/またはチオエーテル結合の安定化に関与させることにより、安定化が生じる。該求電子部分は、所望により、リンカーまたはスペーサー領域により該キメラペプチドのα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよい。したがって、該構造は、求電子部分をそれぞれが有する2個の誘導体化キメラN−ペプチドとの単一CC−キメラN−ペプチドの三量体化および共有結合性安定化により得られることが可能であり、ここで、チオエーテル結合は、該CC−キメラN−ペプチドの操作システイン残基に存在する各チオール反応性官能基と各誘導体化キメラN−ペプチドの求電子部分(例えば、ハロゲン化アルキル部分またはマイケルアクセプター)との間で形成される。該キメラペプチド間のジスルフィドまたは化学選択的共有結合連結は、非常に低い濃度においてさえもペプチド単量体(すなわち、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の単一キメラペプチドサブユニット)が解離しないことを保証する。
ある実施形態においては、「クリック」化学カップリングを引き起こしうる官能性を該コアキメラペプチドの末端に組込んで、該ペプチド間の共有結合の安定化に関与させることにより、安定化が生じる。該「クリック」部分は、所望により、リンカーまたはスペーサー領域により該キメラペプチドのα−ヘリックスドメインから隔てられていてもよい。そのような実施形態においては、該安定化三量体は、2個のY−誘導体化キメラN−ペプチドとの単一のXX−キメラN−ペプチドの反応により形成されることが可能であり、ここで、「X」および「Y」は、各誘導体化キメラN−ペプチドの「クリック」反応ペアの同系(cognate)部分(例えば、ヒュスゲン1,3双極子環化付加においては、「X」はアルキレン部分であり、「Y」はアジド部分である)を表す。該キメラペプチド間の化学選択的共有結合連結は、非常に低い濃度においてさえもペプチド単量体(すなわち、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の単一キメラペプチドサブユニット)が解離しないことを保証する。
gp41エクトドメインの内部三量体コイルドコイルを生成させるためにLouisら(2001,J.Biol.Chem.276:29485−29489)が用いた代替的方法は、分子間ジスルフィド架橋により安定化させるためにN−ヘリックスドメイン内の実際の残基をシステイン残基へと突然変異させるものであった。該ジスルフィド結合は、N−ヘリックス領域内に位置するgp41エクトドメインの残基576−578をシステイン−システイン−グリシン(Cys−Cys−Gly)へと突然変異させることにより6ヘリックス束内に組込まれたシステイン残基間で生じる。該突然変異アミノ酸残基の1つは、α−ヘリックスドメインの「d」位に位置しており、当該位置は、コイルドコイルの相互作用性鎖の内部を形成する7アミノ酸反復の2つの位置の1つであり、HIV−1クレードにおいて高度に保存されていることも知られている(Dongら,2001,Immunol.Lett.75:215−220)。
本明細書に記載されているCC−キメラN−ペプチドを安定化させるもう1つの方法は、該ペプチドの逆末端にシステイン残基を付加することである。したがって、まず、該ペプチドの一方の末端に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合により安定化されたCC−キメラN−ペプチドで形成された三量体コイルドコイルが、高い効力でHIV感染性を抑制する能力も、N−ヘリックスドメイン内に位置するコンホメーションエピトープを認識する抗体に結合する能力も示さない場合、該CC−キメラN−ペプチドの逆末端に位置する安定化性システイン残基を有する、共有結合により安定化される類似した三量体コイルドコイルを、当業者は作製可能である。
前記方法のいずれかにより本発明の三量体コイルドコイルを安定化させる場合、前記の2個の誘導体化キメラN−ペプチド内に組込まれる部分が該ペプチドの同一末端に位置することが重要である。したがって、該安定化手段の位置が、共有結合により安定化されたキメラペプチドの機能に影響を及ぼすかどうかが判定されうる。該単位が付加される末端が該ペプチドの逆末端より不安定である場合には、該安定化手段を逆末端に移動させると、更なる安定化効果が得られうる。しばしば、本明細書に記載されているキメラN−ペプチドのN−ペプチド部分は該ペプチドのスカフォールド部分より不安定である。したがって、該安定化単位を該ペプチドのスカフォールド末端からN−ペプチド末端に移動させると、生じる三量体コイルドコイルの安定性が増強されうる。
D5エピトープの三次元構造は、本明細書に記載されているとおり、3個のN−ペプチドにより形成された三量体コイルドコイルのコンホメーションを制限することにより模倣され、安定化される。CCIZアプローチの代替方法においては、N−ペプチドのカップリングおよび配置のためにスカフォールドコアが利用され、それにより、該三量体コイルドコイルの随伴的形成を伴ってそれらが自由に自己会合する様態で、それらは配置される。したがって、ある実施形態においては、該スカフォールドコアは2個の隣接システイン残基(すなわち、CC)を含まない。該スカフォールドコアは該N−ペプチドの共有結合のための少なくとも3個の位置を含有する。該N−ペプチドの自己会合を促進し、三量体コイルドコイルを形成させるために、該結合位置は該スカフォールドコアの他の構造要素からの最適な距離および間隔で維持される。スカフォールドコアは、ペプチドが共有結合することを可能にする3個以上の反応性基を含む直鎖状または環状化合物のようなものである。したがって、本明細書中で用いる多価ペプチド、より厳密には三価ペプチドは、スカフォールドコアに共有結合した3個のペプチドを含む化合物である。スカフォールド三価ペプチドの一般構造は以下のとおりに表される。
スカフォールドペプチドの具体例としては、スカフォールド上の1以上の結合点に存在するブロミドまたはマレイミド部分と反応し次いでチオエーテル共有結合を形成しうるシステイン残基を含有するいずれかのN−ペプチドが挙げられるであろう。
該gp41ペプチド模倣体におけるD5エピトープの生じるコンホメーションがgp41における該エピトープの天然コンホメーションに類似したものとなるように、少なくとも3個の連結の位置が選択される。本発明のgp41ペプチド模倣体は、使用されるスカフォールドのタイプ、すなわち、その構造により影響される。なぜなら、該スカフォールドのサイズおよび形状は該ペプチド模倣体の全体的構造に影響を及ぼすからである。本明細書に記載されている指針に基づいて、当業者は、gp41のD5エピトープの天然コンホメーションに酷似したコンホメーションを有する本発明のペプチド模倣体を設計することが十分に可能である。N−ペプチドへのスカフォールドの結合点は、好ましくは、D5エピトープ内に位置しない。なぜなら、そのような連結は該エピトープのコンホメーションおよび/または接近性を損なうからである。例えば、異なる位置における連結を有する幾つかの化合物を製造すること、ならびに該化合物がD5に結合する、および/またはD5結合を抑制する能力を適切なエピトープ提示の尺度として競合結合アッセイ(例えば、DCBA)において実験的に決定することが可能である。同様に、適当なコイルドコイルコンホメーションにおけるNHRの提示は、ウイルス侵入抑制に基づくアッセイにおける該化合物の効力により評価されうる。
好ましくは、NHRコンホメーションおよび/またはD5エピトープの最適提示を示す化合物が選択される。また、アミノ酸配列の同一の又は異なる位置において連結した異なる種類のスカフォールドを有する幾つかの化合物を製造すること、ならびに生じる化合物のNHRコンホメーションおよび/またはD5エピトープの提示を実験的に決定することが可能である。
したがって、該N−ペプチドは、直接的に、またはリンカーを介して間接的に、そして該アミノ酸配列内の少なくとも1つの結合の形成により、スカフォールドに結合される。
適当な分子スカフォールドコアは、10個までの炭素の個々の環構造を有するモノ−およびポリ−炭素環式化合物、あるいは環構造内に炭素以外の少なくとも1つの原子、最も一般的には窒素、酸素または硫黄を有する複素環式化合物を含む。具体例には、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン、ピラン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、オキサン、チアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンおよびそれらの誘導体が含まれる。
炭素環式化学スカフォールドの一例としては、シス,シス−1,3,5−トリメチル−シクロヘキサン−1,3,5−トリカルボン酸(ケンプ(Kemp)酸)が挙げられ、ここで、Xuら(Xu,W.ら,2007 Chem Biol Drug Des 70:319−328)に記載されているとおりにジアミノエタンでのカルボン酸官能基の誘導体化の後でチオール反応性ブロモアセチル基が導入される。ケンプ酸は有利な椅子形コンホメーションを示し、この場合、シクロヘキサン環上の3個のカルボキシルがアキシアル位を占めており、したがって、N−ペプチドを集合させる有利なトリアキシアル配向をもたらす。
もう1つの実施形態においては、該N−ペプチドは、複数の縮合環構造に基づく又はそれらからなるスカフォールドにカップリングされる。炭素−炭素結合を共有している2個の炭素環式または複素環式環は縮合していると称される。適当なスカフォールドは、本明細書に記載されている前記炭素環式または複素環式化合物のいずれかの縮合環誘導体を含みうる。具体例には、コレステロール、コール酸およびそれらの誘導体およびテルフェニル(米国特許第7,312,246号に開示されている)が含まれる。
化学的スカフォールドの他の例には、米国特許第7,524,821号に記載されている、炭水化物に基づく及びスカフォールド化マレイミドクラスターが含まれ、これは多価ペプチドおよびタンパク質の集合に有用である。そのようなマレイミドクラスターは求電子部分へのチオール基の十分に確立された高効率マイケル付加を利用する(Kitagawaら,1976,J.Biochem.(Tokyo).79:233−6;Peetersら,1989,J.Immunol.Methods.120:133−43)。したがって、該多価ペプチドのトポロジーは強固なスカフォールドコア上のマレイミド官能性の一定の空間的配向により制御されうる。マレイミドの代わりに使用されうる代替的チオール反応性化合物としては、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、ヨードアセトアミドおよびピリジルジスルフィドが挙げられる。ピリジルジスルフィドで形成されるジスルフィド連結は、当技術分野でよく知られた方法により切断可能である。
本発明の好ましい実施形態は、3個以上のマレイミドがそれぞれコアに結合している、コア分子を含むマレイミドクラスターである。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、3個のマレイミドがそれぞれコアに結合している、炭水化物コアを含むマレイミドクラスターである。本発明の更にもう1つの好ましい実施形態は、3個、4個、5個または6個のマレイミドがリンカーによりそれぞれコアに結合している、炭水化物コアを含むマレイミドクラスターである。
本発明の好ましい実施形態は、3個、4個、5個またはそれ以上のマレイミドがそれぞれコアに結合している、コール酸コアを含むマレイミドクラスターである。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、3個、4個、5個またはそれ以上のマレイミドがリンカーによりそれぞれコアに結合している、コール酸コアを含むマレイミドクラスターである。
本発明の好ましい実施形態は、3個以上のマレイミドがリンカーによりそれぞれシクロデキストリンに結合している、シクロデキストリンを含むマレイミドクラスタである。本発明の好ましい実施形態は、各コアが1以上のマレイミドを含有する、少なくとも2個のコアを含むマレイミドクラスターである。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、3個以上のマレイミドがそれぞれコアに結合している、ポリオールコアを含むマレイミドクラスターである。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、3個以上のマレイミドがリンカーによりそれぞれコアに結合している、ポリオールコアを含むマレイミドクラスターである。
スカフォールドはまた、単糖、ポリオールおよびオリゴ糖でありうる。本発明のスカフォールドとして働きうる単糖には、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、トレオース、エリトロース、エリトルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロルス、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースのRおよびLエナンチオマーならびにアノマー形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。スカフォールド化合物として働きうるポリオールまたはポリアルコールには、グリセリトール、トレイトール、エリトリトール、リビトール、アラビニトール、キシリトール、リキシトール、アリトール、アルトリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、タリトール、グリトール、イジトール、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、イノシトール、マルチトール、ラクチトール、ズルシトールおよびアドニトールが含まれるが、これらに限定されるものではない。スカフォールド化合物として働きうるオリゴ糖には、前記単糖のいずれかの組合せを含む二糖、および前記単糖を含む環状オリゴ糖が含まれるが、これらに限定されるものではない。シクロデキストリンおよびシクロフルクチンは、本発明のスカフォールドにおいて使用されうる環状オリゴ糖の例である。シクロデキストリンは、環状(α−1,4)結合オリゴ糖であり、5−13 α−D−グルコ−ピラノース、シクロマンニン、シクロアルトリンおよびシクロガラクチンを包含するが、これらに限定されるものではない。シクロデキストリンは、化合物を運搬しうる疎水性コアを含む。マレイミドクラスターは、反応性マレイミド部分を含む幾つかの連結コア化合物を更に含みうる。化学的スカフォールドコアはまた、コール酸、コレステロール、環状ペプチド、ポルフィリンおよびカリックス[4]アレーン、炭水化物およびポリアミンに基づくものでありうる。具体的なポリアミンは、トリアミン、例えば、ジエチレントリアミンペンタ−酢酸、ペンタメチルジエチレントリアミン、トリス−2 アミノエチルアミン、ジプロピレントリアミンなどであるべきである。
スカフォールドはまた、N−ペプチドのための結合点として働きうる少なくとも3個の官能基を含有する非環状または直鎖状分子でありうる。このクラスのスカフォールドの例には、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、トリス−スクシンイミジルアミノトリ酢酸、トリス−(2−マレイミドエチル)アミン、TRIS(Boc−β−Ala−TRIS−(OH)3)およびTREN(トリス(2−アミノエチル)アミン)が含まれるが、これらに限定されるものではない。TRISスカフォールドは、Caiら,2007,Bioorganic Chemistry 35:327−337に記載されている。TREN(トリス(2−アミノエチル)アミン)はKwakら,2002,J.Am.Chem.Soc.124:14085−14091に記載されている。スカフォールドコアとして適した追加的な構造体は米国特許第7,604,804号(その全体を参照により本明細書に組み入れることとする)において見出されうる。
本発明のもう1つの実施形態においては、該N−ペプチドは、活性化N−ペプチドへの結合のために誘導体化されうる側鎖を含有するアミノ酸に基づく又はそれを含む直鎖状スカフォールドにカップリングされる。該アミノ酸残基には、Lys、Arg、His、Glu、Asp、Cys、Secおよびそれらの誘導体が含まれる。該アミノ酸残基は、該三量体コイルドコイルを形成するN−ペプチドのコンホメーションを最適に制限するのに反応性基間の間隔が適したものである、少なくとも3個の反応性基を含有するポリペプチド鎖の一部でありうる。
直鎖状スカフォールドの一例は、ペプチドAc−X−Lys−X−Lys−X−Lys−X−NH2を含み、ここで、3個の同種または異種N−ペプチドがリジン残基のε−アミノ側鎖(RNH2)に結合されることが可能であり、Xは、該N−ペプチドの適切な配向のための十分な間隔をもたらす、又は該スカフォールドの電荷、疎水性もしくは他の物理的パラメータを修飾する任意のアミノ酸でありうる。本発明の好ましい実施形態においては、Xは5−アミノペンタン酸である。もう1つの好ましい実施形態においては、XはArgまたはGluである。
直鎖状スカフォールドにより制限(拘束)されるペプチドの具体例には、
Ac−Ava−Lys(N44)−Ava−Lys(N44)−Ava−Lys(N44)−Ava−NH2;
Ac−Ava−Lys(N38)−Ava−Lys(N38)−Ava−Lys(N38)−Ava−NH2:
Ac−Cys−Arg−Lys(N38)−Arg−Lys(N38)−Arg−Lys(N38)−Arg−NH2;
Ac−Cys−Glu−Lys(N38)−Glu−Lys(N38)−Glu−Lys(N38)−Glu−NH2が含まれ、ここで、Avaはδ−アミノ吉草酸を表す。
Ac−Ava−Lys(N44)−Ava−Lys(N44)−Ava−Lys(N44)−Ava−NH2;
Ac−Ava−Lys(N38)−Ava−Lys(N38)−Ava−Lys(N38)−Ava−NH2:
Ac−Cys−Arg−Lys(N38)−Arg−Lys(N38)−Arg−Lys(N38)−Arg−NH2;
Ac−Cys−Glu−Lys(N38)−Glu−Lys(N38)−Glu−Lys(N38)−Glu−NH2が含まれ、ここで、Avaはδ−アミノ吉草酸を表す。
該直鎖状スカフォールドの例には、
CH3CO−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−NH2;配列番号41、
CH3CO−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2;配列番号42、
CH3CO−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2;配列番号43、
CH3CO−Cys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2;配列番号44、または
CH3CO−Cys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2;配列番号45が含まれる。
CH3CO−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−NH2;配列番号41、
CH3CO−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2;配列番号42、
CH3CO−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2;配列番号43、
CH3CO−Cys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2;配列番号44、または
CH3CO−Cys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2;配列番号45が含まれる。
該スカフォールドコア上の反応性官能基に該N−ペプチドを共有結合させるために種々の化学が用いられ得ることが、当業者により認識されるであろう。1つの好ましい実施形態においては、この結合は、該N−ペプチド上のチオール基と該スカフォールド上の求電子部分と間のチオエーテル結合を含む。なぜなら、該結合は中性または弱塩基性pHで水溶液中で容易に形成されるからであり、また、該N−ペプチド上のチオール官能基はシステイン残基として又は該ペプチドの末端上のチオール誘導体として提供されうるからである。アミノ酸配列の内部のチオエーテル結合の位置は、遊離システイン残基の位置を調節することにより、容易に調節されうる。特に好ましい実施形態においては、該アミノ酸配列のコンホメーションを最適に制限するために、チオール官能基の前駆体として働くチオアセチル官能基は該アミノ酸配列の最初のアミノ酸位置のN末端または最後のアミノ酸位置のC末端に位置する。
他の種類の結合も、本発明の免疫原性化合物のコンホメーションを制限するのに適している。例えば、ジスルフィド結合(SS−架橋とも称される)は、他のアミノ酸側鎖を保護する必要性を伴うことなく、遊離システイン残基間で選択的に形成されうる。更に、ジスルフィド結合は、塩基性条件中でインキュベートすることにより、容易に形成される。好ましくは、ジスルフィド結合は2個のシステイン残基間で形成される。なぜなら、それらのスルフヒドリル基は結合のために容易に利用可能だからである。アミノ酸配列内のSS−架橋の位置は、遊離システイン残基の位置を調節することにより、容易に調節される。特に好ましい実施形態においては、該アミノ酸配列のコンホメーションを最適に制限するために、該システインは該アミノ酸配列の最初および最後のアミノ酸位置の周囲に位置する。
もう1つの実施形態においては、Se−−Seジセレン結合が用いられうる。ジセレン結合の利点は、これらの結合が還元に不感受性であることである。したがって、ジセレン結合を含むペプチド模倣体は、例えば動物の体内に存在する還元状況下で、それらのコンホメーションをより良好に維持しうる。更に、遊離SH基(このSH基は、例えば、担体への後続のカップリング反応に用いられる)が該ペプチド模倣体内に存在する場合、ジセレン結合が好ましい。そのような遊離SH基はジセレン結合と反応し得ない。
もう1つの実施形態においては、該結合を形成させるために、メタセシス反応が用いられる。メタセシス反応においては、2個の末端CC−二重結合または三重結合は金属触媒転位反応により連結される。許容されうる触媒はシュロック(Shrock)モリブデン(VI)またはタングステン(VI)アルキリデンまたはグルブス(Grubbs)ルテニウムカルベノイドである。この反応に要求される末端CC−二重またはCC−三重結合は、例えば臭化アリルまたは臭化プロパルギルでのペプチドNH基のアルキル化により、またはアルケニルもしくはアルキニル含有側鎖を有する非天然アミノ酸を該ペプチド内に組込むことにより、ペプチド内に導入される。
好ましい実施形態においては、N−ペプチドとスカフォールドコアとの間の結合は、ブロミド−チオールカップリングを用いて形成される。例えば、該スカフォールドコア上のブロモアセチル部分は、好ましくは該ペプチドのN−末端上に存在する遊離システインのスルフヒドリル部分にカップリングされる。あるいは、該スカフォールドコア上のチオール部分は、好ましくは該ペプチドのN末端に存在するリジン残基のε−アミノ側鎖(RNH2)上または該ペプチドのNH2末端に導入されたブロモアセチル部分にカップリングされうる。
もう1つの実施形態においては、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のCO2H側鎖がアミン官能性にカップリングされてアミド結合を形成する。遊離アミンはスカフォールドコア内に多数の方法で導入されうると認識されるべきである。例えば、該アミン官能性は直鎖状ポリペプチドスカフォールドのリジン残基のε−NH2側鎖でありうる。あるいは、ペプチドの遊離CO2H末端は、アミン官能性、例えば、ペプチドスカフォールドの遊離NH2末端にカップリングされうる。N−ペプチドのアミノ酸配列内にアミド結合を形成させるための代替方法が利用可能であり、そのような方法は当技術分野で公知である。
原則として、N−ペプチドとスカフォールドコアとの間の結合は、関心のあるエピトープの一次、二次および三次配列が実質的に維持される限り、免疫原性N−ペプチドアミノ酸配列の任意の位置で形成されうる。1つの好ましい実施形態においては、連結は該アミノ酸配列の10個のN末端および10個のC末端アミノ酸残基のいずれかの間で形成される。好ましくは、連結は、該アミノ酸配列の6個のN末端および6個のC末端アミノ酸残基のいずれかの間、好ましくは、4個のN末端および4個のC末端アミノ酸残基のいずれかの間で形成される。勿論、内部結合の形成に適した部位は、関心のあるエピトープの位置に左右される。1つの好ましい実施形態においては、連結は免疫原性アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基との間で形成される。
三量体形成を可能にするためにN−ペプチド構成成分の最適な間隔を維持する前記の重要性を考慮して、スカフォールドへの結合点は直接的なものであることが可能であり、あるいは、該N−ペプチドと該スカフォールドのコア構成成分との間の距離を増加させるリンカー分子の付加により修飾されることが可能であると認識されるであろう。リンカーは、50個までの原子の長さを有する、炭素、窒素、酸素、リンおよび硫黄(これらに限定されるものではない)を含みうる原子のいずれかの組合せを含む。一般に、D5中和エピトープをその天然コンホメーションにおいて提示し、gp41プレヘアピン中間体のコンホメーション的に適切な模倣体を与えるように十分な距離で3個のN−ペプチドに結合し、それを配置して該N−ペプチドの三量体化を可能にしうるいずれかの分子を、本発明のスペーサー/リンカーは含みうる。
リンカーはホモ二官能性であることが可能であり、この場合、該分子の両末端に同じ反応性官能基が存在する。具体例には、1,2 ジアミノエタン;1,3 ジアミノプロパン;プトレシン;カダベリン;シュウ酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート);ジスクシンイミジルスベラート;エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート);ジメチルアジピミダート;ビスマレイミドヘキサン;1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン;アジピン酸ジヒドラジド;カルボヒドラジド;およびN,N’−エチレン−ビス(ヨードアセトアミド)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態においては、ケンプ(Kemp)の三酸スカフォールドのカルボン酸官能性は、シクロヘキサン環およびN−ペプチドからの距離を増加させるために、ホモ二官能性分子ジアミノエタンとの反応により修飾される。
あるいは、リンカーはヘテロ二官能性であることが可能であり、この場合、該分子の末端のおのおのに異なる反応性官能基が存在する。多種多様なそのような分子が容易に入手可能であり、それらのクラスには、アミン/スルフヒドリル反応性、カルボニル/スルフヒドリル反応性、アミン/光反応性、スルフヒドリル/光反応性、カルボニル/光反応性などが含まれる。具体例には、スルホスクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシラート、4−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)−アミノベンゾアート、スクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート、3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド、N−ヒドロキシスクシンイミジル−4−アジドサリチル酸、ベンゾフェノン−4−ヨードアセトアミド、p−アジドベンゾイルヒドラジドおよび5−アミノペンチルマレイミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。種々の長さのヘテロ二官能性ポリエチレングリコール(PEG)リンカーも使用可能であり、具体的なクラスの例には、N−ヒドロキシスクシンイミジル−PEG(n)−マレイミド、N−ヒドロキシスクシンイミジル−PEG(n)−アジドおよびN−ヒドロキシスクシンイミジル−PEG(n)−プロパルジルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態においては、コール酸のアリル誘導体を2−アミノエタンチオールと反応させ、ついでγ−マレイミド酪酸と反応させて、コレステロール環およびN−ペプチドからの距離を増加させる。
本明細書に記載されているペプチド模倣体のN−ペプチド部分は種々の方法により製造されうる。例えば、それらは化学合成されうる。Kentら,1985,“Modern Methods for the Chemical Synthesis of Biologically Active Peptides”,Alitaloら(編),Synthetic Peptides in Biology and Medicine,Elsevier pp.29−57に記載されているとおり、長いペプチドは、自動ペプチド合成装置を使用して固相支持体上で合成されうる。手動の固相合成は、例えば、Merrifield,1963,Am.Chem.Soc.85:2149に記載されているとおりに又はその公知改良法により行われうる。固相ペプチド合成はFmoc法によっても実施可能であり、該方法は、Fmoc保護基を除去するために非常に希薄な塩基を使用する。液相合成は通常、選択された、より小さなペプチドに関してのみ、実施可能である。密接に関連したペプチドの混合物の製造に関しては、例えば、Houghton,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1242−1246を参照されたい。該ペプチド模倣体は、連続的ペプチドとして、またはそれが形成された後に結合または連結される成分として製造されうる。
あるいは、本明細書に記載されているペプチドは、キメラペプチド全体をコードする単一DNAでありうる、キメラペプチドをコードするDNAを発現させることにより、公知方法および発現系を使用して製造されうる。該キメラペプチド遺伝子は、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節要素を含有する発現ベクター(例えば、pcDNA3.neo、pcDNA3.1、pCR2.1、pBlueBacHis2またはpLITMUS28)内への分子クローニングにより組換え発現され、原核または真核宿主細胞内に導入されて、該キメラペプチドを産生しうる。発現ベクターは、本明細書においては、適当な宿主におけるクローン化DNAの転写およびそのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列と定義される。そのようなベクターは、細菌、酵母、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞のような種々の組換え宿主細胞において組換えDNAを発現させるために使用されうる。適当に構築された発現ベクターは以下の成分を含有しうる:宿主細胞内の自律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および活性プロモーター。発現ベクターには、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれうるが、これらに限定されるものではない。商業的に入手可能な哺乳類発現ベクターは組換えペプチド発現に好適でありうる。また、種々の商業的に入手可能な細菌、真菌細胞および昆虫細胞発現ベクターが、それぞれの細胞型において組換えミモトープ(mimotope)を発現させるために使用されうる。プロモーターは、RNAポリメラーゼがDNAに結合しRNA合成を開始するように導くDNA配列と定義される。強力なプロモーターは、mRNAを高頻度で生じさせるプロモーターである。そのような操作のための技術はSambrookら,1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.において見出されることが可能であり、当業者によく知られており、利用可能である。N−ペプチドをコードする適当な遺伝子を含有する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーション(これらに限定されるものではない)を含む多数の技術のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。該発現ベクター含有細胞は、関心のあるペプチドをそれが産生するかどうかを判定するために個々に分析される。ペプチド発現細胞の特定は、抗HIVペプチド抗体に対する免疫反応性(これに限定されるものではない)を含む幾つかの手段により行われうる。組換えペプチドは、同じ有機合成ペプチドとは共有されない追加的な望ましい構造的修飾、例えばアデニル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリストイル化を有しうる。これらの追加的特徴は、組換え発現系の適当な選択により、場合に応じて選択され又は好まれうる。
宿主細胞内でのN−ペプチド遺伝子の発現の後、N−ペプチドは回収されうる。塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は個々の適用による細胞ライセートおよび抽出物からの又は調整された培地からの精製を含む幾つかのタンパク質精製方法が利用可能であり、使用に適している。また、ペプチドは、該ペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して調製された免疫アフィニティカラムの使用により他の細胞タンパク質から分離されうる。
(CCIZN36)3および5−ヘリックスを含む本明細書に記載されている或るペプチドは公開されている。例えば、Rootら,2003,Proc Natl Acad Sci USA 100:5016−5021;Rootら,2001,Science 291:884−888;Stegerら,2006,Journal Biol Chem 281:25813−25821;Wangら,2009,Sheng wu gong cheng xue bao=Chinese journal of biotechnology 25:435−440;Bianchiら,2005,Proc Natl Acad Sci USA 102:12903−12908;Bianchiら,2009,Advances in experimental medicine and biology 611:121−123;Bianchiら,Proc Natl Acad Sci USA 107:10655−10660;Eckertら,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11187−11192;Eckertら,2001,Annual review of biochemistry 70:777−810;Eckertら,1999,Cell 99:103−115;Hrinら,2008,AIDS research and human retroviruses 24:1537−1544;Luftigら,2006,Nature structural & molecular biology 13:740−747;およびMontgomeryら,2009,mAbs 1:462−474を参照されたい。逆操作(reverse−engineered)ワクチンの基礎としてNHRに基づくペプチドを拘束する代替法を記載している幾つかの刊行物が確認されている。例えば、Bomselら,Immunity 34:269−280;Chenら,J Biol Chem 285:25506−25515;Cortiら,PloS one 5:e8805;de Rosnyら,J Virol 75:8859−8863;Dwyerら,2008,Protein Sci 17:633−643;Gokulanら,1999,DNA and cell biology 18:623−630;Korazimら,2006,J Molec Biol 364:1103−1117;Liら,2009,Immunobiology 214:51−60;Louisら,2001;J Biol Chem 276:29485−29489;Luら,J Pept Sci 16:465−472;Nelsonら,2008,Virology 377:170−183;Panら,Journal of the Formosan Medical Association=Taiwan yi zhi 109:94−105;Qiら,Biochem Biophys Res Comm 398:506−512;Qiaoら,2005,J Biol Chem 280:23138−23146;Sabinら,PLoS pathogens 6:el001195;Sadlerら,2008,Biopolymers 90:320−329;Schuyら,2009,J Structural Biol 168:125−136;Wexler−Cohenら,2009,PLoS pathogens 5:el000509;Zhangら,2009,Vaccine 27:857−863を参照されたい。
本明細書に記載されている方法により得られるコンホメーション的に制限されたコイルドコイル構造は、ホモ三量体コイルドコイル構造(すなわち、3個の同一N−ペプチドから構成されるもの)またはヘテロ三量体コイルドコイル構造(すなわち、実質的に類似しているが同一ではない3個のN−ペプチドから構成されるもの)を含むと想定される。1つの実施形態においては、本明細書に記載されているペプチド模倣体のヘテロ三量体コイルドコイル構造の不均一性は、該コイルドコイル構造を構成する個々のN−ペプチドの安定化領域内に存在するアミノ酸の相違から生じうる。本明細書に記載されているペプチド模倣体のヘテロ三量体コイルドコイル構造の不均一性は、該コイルドコイル内に含まれる個々のN−ペプチド内に存在するアミノ酸の相違から生じうる。例えば、該ペプチドの三量体化能に重要である各ペプチドの7アミノ酸反復の「a」および「d」アミノ酸位置は同一であるが、疎水性領域外のアミノ酸位置(例えば、「f」位)は該三量体コイルドコイルの個々のペプチド間で異なっている3個のN−ペプチドから、該ヘテロ三量体コイルドコイル構造は構成されうる。重要なことに、そのようなヘテロ三量体構造もまた、HIV gp41融合中間体の忠実な模倣体として特定されうるであろう。なぜなら、該コイルドコイルの機能は野生型構造のもの(例えば、抗ウイルス活性および/または忠実なコンホメーションエピトープの生成)に類似しているからである。
代表的なgp41ペプチド模倣体の三量体構造は図1A〜Bに図示されている。
生じたC−キメラN−ペプチドが、その三量体共有結合安定化コンホメーションにおいて、N−ペプチドドメインを忠実に提示するかどうかを、例えば、高い効力でHIV感染性を抑制するその能力、またはgp41のN−ヘリックス領域内に位置するコンホメーションエピトープを認識する抗体へのその結合能を試験することにより、当業者は容易に決定することが可能である。gp41ペプチド模倣体が該内部コイルドコイルの安定な忠実な模倣体を形成しうるか否かを決定するために、多数の種々の実験方法が用いられうる。例えば、コンホメーション的に制限されたgp41ペプチド模倣体がHIV粒子の感染性を抑制する能力を測定するように設計されたアッセイが行われうる。1つのそのようなアッセイにおいては、ヒトCD4およびCCR5受容体を安定に発現し、HIV−2 LTRのtat応答性断片により駆動されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含有するHeLa細胞に、種々の濃度のgp41ペプチド模倣体の存在下、種々の株のHIV−1を感染させる。該細胞を一定時間インキュベートした後、該細胞を細胞溶解させ、β−ガラクトシダーゼ活性を定量する。gp41ペプチド模倣体が、gp41融合中間体を妨げることにより、HIV感染性を抑制する能力を保有する場合には、低いβ−ガラクトシダーゼ活性が記録される。
本明細書に記載されているgp41ペプチド模倣体はgp41の内部N−ヘリックスコイルドコイルの安定で忠実な模倣体に相当するため、それらは、HIV融合中間体を標的化する中和抗体応答を惹起するための免疫原として有用だと考えられている。該gp41ペプチド模倣体は、投与されると、それまでに未感染の個体に予防的利点をもたらし、および/または感染個体内のウイルス負荷レベルを低減してHIV感染の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらしうるであるであろう。
本明細書に記載されているペプチド模倣体は鼻腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、膣内または直腸内のような種々の経路の1以上により投与されうる。各実施形態においては、該ペプチド模倣体は適当な担体中で又は免疫原性組成物として提供される。例えば、ペプチド模倣体は適当なバッファー、生理食塩水、水、ゲル剤、泡剤(フォーム)、クリーム剤または他の適当な担体中で投与されうる。該ペプチド模倣体ならびに一般には適当な担体および任意成分、例えば安定剤、吸収もしくは取り込み促進剤および/または乳化剤を含む免疫原性組成物は製剤化され、予防的有効量で個体(HIV未感染または感染個体)に投与されうる。1つの実施形態においては、ペプチド模倣体は殺微生物剤として投与(または適用)され、細胞内へのウイルスの侵入を妨げうる。例えば、ペプチド模倣体は、膣、直腸または口腔粘膜のような粘膜表面への適用またはそれとの接触に付される組成物中に含まれうる。該組成物は、該ペプチド模倣体に加えて、粘膜表面または避妊具(例えば、コンドーム、避妊用頸部キャップ、膜状ペッサリー)の表面への適用に適した担体または基剤(例えば、クリーム剤、泡剤、ゲル剤、該ペプチド模倣体を保持させるための十分に粘性である他の物質、水、バッファー)を含む。該ペプチド模倣体は、例えば、該ペプチド模倣体を含有する泡剤、ゲル剤、クリーム剤、水または他の担体の適用により、粘膜表面に適用されうる。あるいは、それは、使用条件(例えば、膣または直腸温度、pH、水分条件)下で該ペプチド模倣体を(例えば、分解、溶解、他の放出手段により)放出または運搬する物質から構成され該ペプチド模倣体を含有する担体または基剤である膣または直腸坐剤を使用して適用されうる。全ての実施形態においては、該ペプチド模倣体の制御放出(コントロールドリリース)または時限放出(漸次放出、投与または挿入後の特定の時点での放出)は、例えば、薬物を徐々に又は一定時間後に放出する組成物中に該ペプチド模倣体を含有させることにより行われうる。あるいは、該ペプチド模倣体は、その投与または適用(例えば、膣または直腸内)の後直ちに又は間もなくペプチド模倣体を放出する組成物中に配合されうる。組合せ放出(例えば、挿入の後直ちに又は間もなくの、および挿入後の経時的な又は特定の時点での薬物の一部の放出)も[例えば、2以上の物質(そのうちの1つからの放出もしくは送達は挿入の後直ちに若しくは間もなく生じ、および/またはそのうちの1つからの放出もしくは送達は漸次的であり、および/またはそのうちの1つからの放出は一定期間後に生じる)から構成される組成物を製造することにより]行われうる。例えば、ペプチド模倣体は、例えば米国特許第4,707,362号に教示されているような徐放組成物中に配合されうる。該クリーム剤、泡剤、ゲル剤または坐剤は、(例えば、殺精子剤または他の避妊剤を含有する)産児制限をも目的として使用されるものでありうるが、そのことは必ずしも必要ではない(例えば、それは、単独で又は別の非避妊剤、例えば抗細菌もしくは抗真菌薬または潤滑剤と組合せて、専ら該ペプチド模倣体を送達するために使用されうる)。本発明のペプチド模倣体は、使用条件下で放出を可能にする様態でペプチド模倣体を含む又はペプチド模倣体でコーティングされた避妊具(例えば、コンドーム、避妊用頸部キャップ、膜状ペッサリー)の使用により、個体に投与されうる。該ペプチド模倣体の放出は、前記のとおり、即時的に、漸次的に、または一定の時点で生じうる。その結果、それらはHIVと接触し、HIVに結合し、細胞内へのウイルスの侵入を低減または防止する。
一般に、本発明の免疫原性組成物の成分に関する適当な「有効量」または投与量の選択はまた、使用される免疫原性組成物中のペプチド模倣体の種類、ならびに投与対象の身体条件、最も詳細には例えば免疫化対象の全身健康状態、年齢および体重に基づくであろう。投与の方法および経路ならびに該免疫原性組成物中の追加的成分の存在も該組成物の投与量および量に影響を及ぼしうる。有効量のそのような選択および上方または下方修正は当技術分野の技量の範囲内である。有意な副作用を伴うことなく対象において免疫応答、好ましくは防御応答を誘導するために又は外因性効果を得るために必要な量はこれらの要因に応じて変動する。本明細書に記載されている免疫原性組成物の適当な用量は当業者により容易に決定される。HIV感染を低減するのに十分なgp41ペプチド模倣体の用量(「有効量」)は、それが細胞内へのHIVの侵入を完全または部分的に抑制するような方法(例えば、注射、局所投与、静脈内)で投与される。抗HIVまたはHIV中和免疫応答を誘導するためには、10μg〜1000μgのgp41ペプチド模倣体、好ましくは50μg〜300μgのペプチド模倣体の投与量が哺乳動物に投与される。1つの実施形態においては、該ペプチド模倣体は、免疫学的効力に必要な全量を構成するのに十分な体積中、10μg/ml〜1mg/ml、好ましくは50〜500μg/mlの濃度で筋肉内投与されるべきである。
本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のペプチド模倣体は初回抗原刺激−追加抗原刺激レジメンで用いられうる。そのようなアプローチのための初回抗原刺激成分には、DNA、遺伝的ベクター、ペプチドまたはタンパク質が含まれうるが、これらに限定される必要はない。そのようなレジメンは同種または異種でありうる。例えば、初期投与の約2〜4週間後、追加用量(同種または異種)を投与することが可能であり、ついで、血清抗体価が消失するたびに、再投与することが可能である。また、複数の初回投与を行い、ついで最後の初回投与の2〜4週間後に投与を行うことが可能である。異種追加抗原刺激は、初回抗原刺激に使用されたペプチド模倣体とは異なるペプチド模倣体を含みうる。異種追加抗原刺激はまた、例えば、DNAまたはタンパク質成分として投与される組換えgp120、gp140およびgp160分子のような当技術分野で公知の他のHIV予防用物質を含みうる。
本発明の幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているペプチド模倣体は、例えば、該ペプチド模倣体に対する免疫応答を増強するために、免疫原性担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲート化されうる。そのようなバイオコンジュゲート化アプローチは当業者によく知られており、種々の担体タンパク質およびコンジュゲート化化学法が用いられうると認識されるであろう。
患者への投与に適した免疫原性組成物は、生物活性を保持すると同時に、許容される温度範囲内での貯蔵時の安定性を最大化する製剤(処方)中に、該ペプチド模倣体の有効量を含有する。本発明に従い初回抗原刺激または追加抗原刺激用量中に該ペプチド模倣体を含む免疫原性組成物は、生理的に許容される成分、例えばバッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートを含有しうる。製剤を構成する他の通常のワクチン賦形剤も使用されうる、と当業者は理解するであろう。
本明細書に記載されているペプチド模倣体を含有する免疫原性組成物の製造中に、アジュバントは添加されてもされなくてもよい。例えば、ミョウバンは、特に、チキソトロピー性、粘性および均一水酸化アルミニウムゲルの形態において、ヒト用ワクチンにおける典型的で好ましいアジュバントである。
これらのペプチド模倣体は、HIV複製および/または他のHIVタンパク質を抑制するための種々の抗レトロウイルス物質と共に使用されうるであろう。ペプチド模倣体に基づく組成物と共に使用されうる抗レトロウイルス物質のクラスには、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NNRTI)およびプロテアーゼインヒビター(PI)が含まれるが、これらに限定されるものではない。他のHIVタンパク質には、gp120、gp140およびgp160が含まれる。HIVタンパク質をコードするDNAベクターも好適であり、gp120、gp140およびgp160分子(これらに限定されるものではない)を含むHIVタンパク質をコードしうる。
ある実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されているレジメンの投与のためのキットを提供する。このキットは、哺乳動物または脊椎動物対象において免疫原性応答を誘導する方法における使用を意図している。該キットは、本発明のgp41ペプチド模倣体を含む免疫原性組成物を含有する。好ましくは、複数回の投与のために、該キットにおいて、該免疫原性組成物の予めパッケージされた複数回投与量が提供される。
該キットは、本明細書に記載されている免疫原性組成物の使用説明をも含有する。該キットは、あるアッセイを行うための説明、前記の種々の担体、賦形剤、希釈剤、アジュバントなど、ならびに該組成物を投与するための装置、例えばシリンジ、噴霧装置などをも含みうる。他の成分には、とりわけ、使い捨て手袋、除染説明、適用のための棒または容器が含まれうる。
添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの厳密な実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲において定められている範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修飾が本発明において当業者により行われうる、と理解されるべきである。
以下の非限定的な実施例は、本発明を更に例示するために記載されている。
実施例1
免疫原の製造および特徴づけ
免疫原の製造:合成ペプチド
1.(CCIZN36)3
ペプチド単量体CCIZN36(CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号46)を、自動ペプチド合成装置において固相Fmoc/t−Bu化学法を用いて合成した。使用した樹脂はH−Rink Amide ChemMatrix(Matrix−Innovation Inc.,St.Hubert,Quebec,Canada)であった。樹脂遊離アミノ基に対して5〜10倍過剰のアミノ酸を使用して、30分間の各サイクルの二重カップリングにより、アシル化を行った。等モル量のHATU[2−(1H−9−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート]および2倍モル過剰のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)でアミノ酸を活性化した。使用した側鎖保護基は以下のとおりであった:システイン、グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル;リジンおよびトリプトファンにはtert−ブトキシ−カルボニル;グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはtert−ブチル;ならびにアルギニンには2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル。合成の終了時に、90% トリフルオロ酢酸、5% トリイソプロピルシラン、2.5% 水および2.5% 3,6−ジオキサ−1,8−オクタン−ジチオールでの室温で3時間の処理により該ペプチドを該樹脂から切断した。該ペプチド溶液を濾過し、冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。該沈殿ペプチドを遠心分離によりペレット化し、ついで該ペレットを冷ジエチルエーテルで2回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の25% 酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
免疫原の製造および特徴づけ
免疫原の製造:合成ペプチド
1.(CCIZN36)3
ペプチド単量体CCIZN36(CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号46)を、自動ペプチド合成装置において固相Fmoc/t−Bu化学法を用いて合成した。使用した樹脂はH−Rink Amide ChemMatrix(Matrix−Innovation Inc.,St.Hubert,Quebec,Canada)であった。樹脂遊離アミノ基に対して5〜10倍過剰のアミノ酸を使用して、30分間の各サイクルの二重カップリングにより、アシル化を行った。等モル量のHATU[2−(1H−9−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート]および2倍モル過剰のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)でアミノ酸を活性化した。使用した側鎖保護基は以下のとおりであった:システイン、グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル;リジンおよびトリプトファンにはtert−ブトキシ−カルボニル;グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはtert−ブチル;ならびにアルギニンには2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル。合成の終了時に、90% トリフルオロ酢酸、5% トリイソプロピルシラン、2.5% 水および2.5% 3,6−ジオキサ−1,8−オクタン−ジチオールでの室温で3時間の処理により該ペプチドを該樹脂から切断した。該ペプチド溶液を濾過し、冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。該沈殿ペプチドを遠心分離によりペレット化し、ついで該ペレットを冷ジエチルエーテルで2回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の25% 酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配でJupiter C18カラム(250×30mm,10μ,300A,Phenomenex,Inc.,Torrance,CA)を使用する逆相HPLCにより、該粗ペプチドを精製した。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。該精製ペプチドに関して決定されたモノアイソトピック質量は7541.22Daであった(配列予想質量は7542.24Daである)。
精製CCIZN36(35mg)を、1N グアニジン、0.2N HEPES、1mM EDTA、1.5mM 還元型グルタチオンおよび0.75mM 酸化型グルタチオンを含有する30mlのバッファー(pH7.5)に溶解した。これらの条件下、CCIZN36を該分子の共有結合三量体(CCIZN36)3へとゆっくり酸化させる。該酸化反応の進行をHPLCによりモニターし、24時間後、該反応混合物への500μlのトリフルオロ酢酸の添加により該反応を終結させ、それをVydac(登録商標)ジフェニルカラム(22×250mm,10〜15μ,Grace,Deerfield,IL)上に直接的にロードし、20ml/分の流速で0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を使用する逆相HPLCにより精製した。画分をRP HPLC/質量分析により分析した。該共有結合三量体に対応する画分を更なる使用のためにプールした。該精製三量体に関して決定されたモノアイソトピック質量は22620.58Daであった(配列予想質量は22620.681Daである)。
2.KTA(N51)3
三価ブロミドスカフォールド,KTA−Br上の3個に、チオールタグ付き単量体N51ペプチド,S−アセチルグリコール酸−N51を連結させることにより、該三量体ペプチド複合体を合成した。
三価ブロミドスカフォールド,KTA−Br上の3個に、チオールタグ付き単量体N51ペプチド,S−アセチルグリコール酸−N51を連結させることにより、該三量体ペプチド複合体を合成した。
KTA−Brはケンプ(Kemp)の三酸中心対称性三価スカフォールドである。それは、Xuら,2007,Chem Bio Drug Des 70:319−328に記載されているプロトコルに従い、最終アシル化工程中にブロモ酢酸無水物を使用する変更を加えて、合成された。
自動ペプチド合成装置においてFmoc/t−Bu化学を用いる固相法により、ペプチドN51を合成した。使用した樹脂は、100% PEG樹脂であるH−Rink Amide ChemMatrix(Matrix−Innovation Inc.)であった。樹脂遊離アミノ基に対して5〜10倍過剰のアミノ酸を使用する30分間の二重カップリングでアシル化を行った。等モル量のHATU[2−(1H−9−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート]および2倍モル過剰のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)でアミノ酸を活性化した。側鎖保護基は以下のとおりであった:グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル;リジンおよびトリプトファンにはtert−ブトキシ−カルボニル;グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはtert−ブチル;ならびにアルギニンには2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル。配列の集合の終了時に、等モル量のN−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下のS−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル(SAMA−OPfp)の手動カップリングにより、該ペプチドN末端に保護チオール基を導入した。該チオールを保護しているアセチル基は次の連結工程中にヒドロキシルアミンにより容易に除去されうる。合成の終了時に、該乾燥ペプチド樹脂を切断混合物(90% トリフルオロ酢酸、2.5% トリイソプロピルシラン、2.5% 水)で室温で3時間処理した。該樹脂を濾過し、該溶液を冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、該ペプチドペレットを冷ジエチルエーテルで2回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の25% 酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配でJupiter C18カラム(250×30mm,10μ,300A)を40ml/分の流速で使用する逆相HPLCにより、該粗ペプチドを精製した。Jupiter C18カラム(150×4.6mm,5μ,300A)を使用して分析用HPLCを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは、電荷状態+4〜+7を示している。デコンボリューションされた質量は6051.6Daである(配列予想質量は6051Daである)。
精製ペプチド前駆体S−アセチルグリコール酸−N51(60mg)を、6N グアニジン、0.1N 酢酸アンモニウムおよび0.5N ヒドロシルアミンを含有する8mlのpH7〜7.5のバッファーに溶解した。1.7mgのKTA−Br3を1mlのトリフルオロエタノールに溶解し、ついで該ペプチド溶液に滴下した。該反応をLC−MSによりモニターした。5時間後、500μlのTFAを該溶液に加えることにより該反応を終結させ、該溶液をVydac(登録商標)ジフェニルカラム(22×250mm,10〜15μ)上に直接的にロードし、20ml/分の流速で0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を使用する逆相HPLCにより精製した。該共有結合三量体に対応する画分を質量分析により更に分析した。ESIスペクトルは+14〜+18の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は18532.8Daである(配列予想質量は18532aである)。
3.KTA(N51−2B)3
KTA(N51)3の合成に関して記載されているのと同じプロトコルに従うことにより、三価ブロミドスカフォールド,KTA−Br上での3個のチオールタグ付き単量体N51−2Bペプチド,S−アセチルグリコール酸(N51−2B)の連結により、該三量体ペプチド複合体を合成した。
KTA(N51)3の合成に関して記載されているのと同じプロトコルに従うことにより、三価ブロミドスカフォールド,KTA−Br上での3個のチオールタグ付き単量体N51−2Bペプチド,S−アセチルグリコール酸(N51−2B)の連結により、該三量体ペプチド複合体を合成した。
該N51−2B配列は、より可溶性で安定化されたN51三量体を製造することを試みるように設計された。三量体形成を最適化するために「a」および「d」位にIle残基を付加し、溶解を補助するために該ペプチドのN末端部分の「f」および「c」位に他の置換を施した。疎水性ポケット付近の1個のLeu残基をAla残基に変化させたが、疎水性ポケットの一部であるLeuは維持された。
ペプチドN51−2Bを、自動ペプチド合成装置を使用するFmoc/t−Bu化学を用いる固相法により合成した。使用した樹脂はH−Rink Amide MBHA樹脂LL(100〜200メッシュ,0.36mmol/g)(EMD Biosciences,San Diego,CA)であった。S−アセチルグリコール酸−N51−2Bの合成、切断および精製は、S−アセチルグリコール酸−N51に関して記載されているのと同じプロトコルに従った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは、電荷状態+4〜+7を示している。デコンボリューションされた質量は6109Daである(配列予想質量は6109Daである)。
精製ペプチド前駆体S−アセチルグリコール酸−N51(10mg)を、6N グアニジン、0.1N 酢酸アンモニウムおよび0.5N ヒドロシルアミンを含有する1mlのpH7.3のバッファーに溶解した。約0.25当量のKTA−Br3をトリフルオロエタノールに溶解し、ついで該ペプチド溶液に滴下した。該反応をLC−MSによりモニターした。4時間後、該反応を終結させ、該溶液をVydac(登録商標)C18カラム(10×250mm,5μ)上に直接的にロードし、5ml/分の流速で0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を使用する逆相HPLCにより精製した。該共有結合三量体に対応するプール化画分を質量分析により更に分析した。ESIスペクトルは+14〜+18の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は18708.8Daである(配列予想質量は18709Daである)。
4.KTA(N51−3B)3
KTA(N51)3の合成に関して記載されているのと同じプロトコルに従うことにより、三価ブロミドスカフォールド,KTA−Br上での3個のチオールタグ付き単量体N51−3Bペプチド,S−アセチルグリコール酸(N51−3B)の連結により、該三量体ペプチド複合体を合成した。
KTA(N51)3の合成に関して記載されているのと同じプロトコルに従うことにより、三価ブロミドスカフォールド,KTA−Br上での3個のチオールタグ付き単量体N51−3Bペプチド,S−アセチルグリコール酸(N51−3B)の連結により、該三量体ペプチド複合体を合成した。
該N51−3B配列は、より可溶性で安定化されたN51三量体を製造することを試みるように設計された。該配列は元のN51におけるAlaへの単一変化体である。
ペプチドN51−3Bを、自動ペプチド合成装置を使用するFmoc/t−Bu化学を用いる固相法により合成した。使用した樹脂はH−Rink Amide MBHA樹脂LL(100〜200メッシュ,0.36mmol/g)(EMD Biosciences)であった。S−アセチルグリコール酸−N51−3Bの合成、切断および精製は、S−アセチルグリコール酸−N51に関して記載されているのと同じプロトコルに従った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは、電荷状態+4〜+7を示している。デコンボリューションされた質量は6007.8Daである(配列予想質量は6010Daである)。
精製ペプチド前駆体S−アセチルグリコール酸−N51(5mg)を、6N グアニジン、0.1N 酢酸アンモニウムおよび0.5N ヒドロシルアミンを含有する1mlのpH7.3のバッファーに溶解した。約0.25当量のKTA−Br3をトリフルオロエタノールに溶解し、ついで該ペプチド溶液に滴下した。該反応をLC−MSによりモニターした。4時間後、該反応を終結させ、該溶液をVydac(登録商標)C4カラム(10×250mm,5μ)上に直接的にロードし、5ml/分の流速で0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を使用する逆相HPLCにより精製した。該共有結合三量体に対応するプール化画分を質量分析により更に分析した。ESIスペクトルは+14〜+18の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は18405.4Daである(配列予想質量は18406Daである)。
5.コール酸(N51)3
三価トリマレイミドコール酸鋳型上での3個のチオールタグ付き単量体N51ペプチド,S−アセチルグリコール酸−N51の連結により該三量体ペプチド複合体を合成した。
三価トリマレイミドコール酸鋳型上での3個のチオールタグ付き単量体N51ペプチド,S−アセチルグリコール酸−N51の連結により該三量体ペプチド複合体を合成した。
コール酸ナトリウム1(2g,4.65mmol)を25mlのTHF(テトラヒドロフラン)に懸濁させた。ヨウ化アリル(3.8ml,1当量)を該混合物中に加え、ついで2.2gの水素化ナトリウム(60%)を加えた。得られた混合物を70℃で一晩撹拌し、TLCおよびLC−MSによりモニターした。ついで水を該反応混合物に加え、酢酸エチル/1N HClを加えた。生成物を有機層中に抽出し、ブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。得られた粗生成物をLC−MSにより特徴づけし、主要成分が、528.7Daの分子量を有する三価アリルコール酸2であることが確認された。
アリルコール酸2(300mg,0.8mmol)、システアミン塩酸塩およびアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)(ラジカル開始剤として)を光反応器内でメタノール(5ml,窒素で脱気)と混合した。該混合物に254nmの波長のUVランプを照射し、それを室温で3日間撹拌した。反応をLC−MSおよびTLCによりモニターした。化合物3(C39H73N3O5S3,分子量=760.29)の生成物およびそのメチルエステル4(C40H75N3O5S3,分子量=774.25)が1:1の比で得られた。
化合物4(10mg,1当量)を1mlのDMFに溶解し、ついでγ−マレイミド酪酸(3.6当量)、HATU(1当量)およびトリエチルアミン(2当量)を加えた。該反応を完了まで2時間撹拌した。蒸発後、残渣を酢酸エチル/1N HCl、NaHCO3およびブラインで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、ついで精製して、1269.6Daの分子量を有する化合物5を得た。一方、実測(M+Na+)ピークは1292.26Daである。
精製ペプチド前駆体S−アセチルグリコール酸−N51(4.8mg)を、20mM Trisおよび0.5N ヒドロキシルアミンを含有する0.2mlのpH7のバッファーに溶解した。50μgのトリマレイミドコール酸を50μlのDMF/TFEに溶解し、該ペプチド溶液に滴下した。該反応をLC−MSによりモニターした。2時間後、該反応を完了させ、該混合物をJupiter C18カラム(10×250mm,10μ)上に直接的にロードし、5ml/分の流速で0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を使用する逆相HPLCにより精製した。共有結合三量体化合物6コール酸(N51)3(ChA−(N51)3)に対応するプール化画分を質量分析により更に分析した。理論平均分子量は19296Daであり、一方、実測モノアイソトピックピークは19289.6Daである。
6.コンジュゲート化のためのチオールを有するコール酸(N51)3
保護チオール基を有する三価トリマレイミドコール酸鋳型上での3個のチオールタグ付き単量体N51ペプチド,チオプロパン酸アシル−N51の連結により該三量体ペプチド複合体を合成した。連結後、該保護チオールを除去して、コンジュゲート化可能なコール酸−(N51)3を得る。
保護チオール基を有する三価トリマレイミドコール酸鋳型上での3個のチオールタグ付き単量体N51ペプチド,チオプロパン酸アシル−N51の連結により該三量体ペプチド複合体を合成した。連結後、該保護チオールを除去して、コンジュゲート化可能なコール酸−(N51)3を得る。
システアミン(1.15g)およびアセトアミドメタノール(1g)の混合物をTFA(トリフルオロ酢酸)に溶解し、室温で3時間撹拌して、148Daの分子量を有する(S−アセトアミドメチル)システアミン7を得た。一方、実測(M+H)イオンピークは149Daである。
アリルコール酸2(100mg)をDCM(ジクロロメタン)中のDIEPA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)、EDC(エチレンジクロリド)と混合し、ついで、DCMに溶解された化合物7(56mg)を加えた。該反応をTLCによりモニターし、2時間後に完了したことが判明した。該反応混合物をDCMで希釈した後、1N HClを加え、該化合物を有機層中に抽出した。該有機層をNa2SO4で乾燥させ、濃縮して、658.97Daの分子量を有する化合物8を得た。一方、実測(M+H)イオンピークは659Daである。
化合物8(500mg)、システアミン塩酸塩およびアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を光反応器内でメタノール(5ml,窒素で脱気)と混合した。該混合物に254nmの波長のUVランプを照射し、それを室温で3日間撹拌した。反応の進行をLC−MSおよびTLCによりモニターした。反応が完了したら、該反応混合物に水を加え、ついで酢酸エチル/1N HCl(1:1)を加えて、889.5Daの理論分子量および890Da((M+H)イオンピーク)の実測分子量を有する生成物トリアミノコール酸(化合物9)を得た。
化合物9(50mg,1当量)を2mlのDMFに溶解し、ついでγ−マレイミド酪酸(4.5当量)、HATU(4.5当量)およびトリエチルアミン(9当量)を加えた。該反応を完了まで2時間撹拌した。蒸発後、残渣を酢酸エチル/1N HCl、NaHCO3およびブラインで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、ついで精製して化合物10(理論分子量1384.66Da)を得た。実測(M+H)イオンピークは1385.6Daである。
自動ペプチド合成装置においてFmoc/t−Bu化学を用いる固相法により、ペプチドN51を合成した。使用した樹脂はH−Rink Amide ChemMatrix(Matrix−Innovation Inc.)であった。樹脂遊離アミノ基に対して5〜10倍過剰のアミノ酸を使用する30分間の二重カップリングでアシル化を行った。等モル量のHATU[2−(1H−9−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル−アミヌムヘキサフルオロホスファート]および2倍モル過剰のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)でアミノ酸を活性化した。側鎖保護基は以下のとおりであった:グルタミン、アスパラギンおよびヒスチジンにはトリチル;リジンおよびトリプトファンにはtert−ブトキシ−カルボニル;グルタミン酸、トレオニンおよびセリンにはtert−ブチル;ならびにアルギニンには2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル。配列の集合の後、ペプチド樹脂上のN末端アミノ基を、HATUおよびトリエチルアミンの存在下、DMF中の3−(トリチルチオ)プロピオン酸にカップリングさせた。該合成の終了時に、該乾燥ペプチド樹脂を切断混合物(92.5% トリフルオロ酢酸、2.5% トリイソプロピルシラン、2.5% 水および2.5% 3,6−ジオキサ−1,8−オクタン−ジチオール)で室温で2時間処理した。該樹脂を濾過し、該溶液を冷ジエチルエーテルに加えて、該ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、該ペプチドペレットを冷ジエチルエーテルで2回洗浄して有機スカベンジャーを除去した。該最終ペレットを乾燥させ、水中の25% 酢酸に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配でJupiter C18カラム(250×30mm,10μ,300A)を40ml/分の流速で使用する逆相HPLCにより、該粗ペプチドを精製した。Jupiter C18カラム(150×4.6mm,5μ,300A)を使用して分析用HPLCを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは、電荷状態+4〜+7を示している。デコンボリューションされた質量は6022Daである(配列予想質量は6023Daである)。
精製ペプチド チオプロピオン酸N51(15mg)を5mlの20mM Trisバッファー(pH7.0)に溶解した。2mlのアセトニトリル溶液に溶解した鋳型化合物10(1.05mg)を該ペプチド溶液に加えた。該反応をHPLCによりモニターした。1時間後、得られた混合物をC18カラム上に直接的にロードし、精製して、19455Daの理論平均分子量を有する生成物11を得た。ESIスペクトルは+13〜+18の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は19451.5Daである。
化合物11(5mg)を、酢酸を含有する5mlのpH4の水性バッファーに溶解した。酢酸水銀(2.1mg)を2mlのアセトニトリルに溶解し、該ペプチド溶液に滴下した。該反応をHPLCによりモニターした。1時間後、12μlの2−メルカプトエタノールを該混合物に加えた。得られた混合物を50℃で3時間加熱し、ついで、5% 酢酸を溶離液として使用して、PD10脱塩カラム(GE Healthcare Lifesciences,Piscataway,NJ)を使用する精製を行った。ESIスペクトルは+13〜+19の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は19384Daである(配列予想質量は19384Daである)。
免疫原の製造:組換えペプチド
1.組換え(CCIZN36)3
以下に挙げられているペプチド配列をコードする合成遺伝子がGeneArt(登録商標)(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)により合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築された。NdeIおよびBamHIクローニング部位を使用して該断片をpET20b A092(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)内にクローニングした。該プラスミドを形質転換細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定により確認した。使用した制限部位内の配列一致は100%であった。該プラスミドを使用まで凍結乾燥した。
1.組換え(CCIZN36)3
以下に挙げられているペプチド配列をコードする合成遺伝子がGeneArt(登録商標)(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)により合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築された。NdeIおよびBamHIクローニング部位を使用して該断片をpET20b A092(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)内にクローニングした。該プラスミドを形質転換細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定により確認した。使用した制限部位内の配列一致は100%であった。該プラスミドを使用まで凍結乾燥した。
CCIZN36:
CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号46)
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Invitrogen(商標),Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)を、該製造業者の指示に従い、CCIZN36の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリンおよび34μg/mL クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ(LB)寒天上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するLB培地に単コロニーを接種し、それを、225rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なLB培地に1:40希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、600nmでの光学濃度が0.6〜0.8に達するまで37℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を0.5mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。該培養を37℃で更に3〜4時間成長させ、ついで該細胞を10,000×g、4℃で15分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−20℃で保存した。
CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(配列番号46)
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Invitrogen(商標),Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)を、該製造業者の指示に従い、CCIZN36の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリンおよび34μg/mL クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ(LB)寒天上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するLB培地に単コロニーを接種し、それを、225rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なLB培地に1:40希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、600nmでの光学濃度が0.6〜0.8に達するまで37℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を0.5mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。該培養を37℃で更に3〜4時間成長させ、ついで該細胞を10,000×g、4℃で15分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−20℃で保存した。
該細胞を細胞溶解バッファー(50mM Tris,pH8.0,2mM MgCl2,10mM DTT,70U/mL Benzonase(登録商標)(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ),1×Roche Complete(商標)プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics Corp.,Indianopolis,IN))に再懸濁させ、マイクロフルダイザーへの3回通過により細胞溶解させた。ついで該ライセートを遠心分離により清澄化した。SDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析は、CCIZN36生成物の大部分が不溶性画分内で検出されることを証明した。したがって、繰り返されるホモジナイゼーションおよび遠心分離工程により、該不溶性画分から洗浄封入体を調製した。最終洗浄封入体を遠心分離によりペレット化し、−70℃で凍結した。
精製封入体(2g)を、200mgのTCEP[トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン]と共に0.1% TFAを含有する水中の50% アセトニトリルに溶解した。該溶液を室温で一晩維持した。翌朝、該調製物を遠心分離により清澄化した。該組換えペプチドを含有する上清をJupiter C18カラム(250×30mm,10μ,300A)上にロードし、0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を40ml/分の流速で用いる逆相HPLCにより精製した。Vydac(登録商標)ジフェニルカラム(150×4.6mm)上で分析用HPLCを行い、エレクトロスプレー質量分析により該ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは+4〜+11の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は7510.1Daである(配列予想質量は7506Daである)。
該精製ペプチド前駆体(60mg)を、1N グアニジン、0.2M HEPES、1mM EDTA、1.5mMの還元型グルタチオンおよび0.75mMの酸化型グルタチオンを含有する80mlのバッファー(pH7.5)に溶解した。該酸化反応をHPLCによりモニターした。一晩の後、500μlのTFAを該溶液に加えることにより、反応を停止させ、該溶液をVydac(登録商標)ジフェニルカラム(22×250mm,10〜15μ)上に直接的にロードし、0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を20ml/分の流速で用いる逆相HPLCにより精製した。分析用HPLC分析は前記と同じであった。該共有結合三量体に対応するプール化画分を高分解能質量分析により更に分析した。ESIスペクトルは+12〜+27の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は22524Daである(配列予想質量は22511Daである)。
2.組換え(CCIZN51)3
以下に挙げられているペプチド配列をコードする合成遺伝子がGeneArt(登録商標)(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)により合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築された。NdeIおよびBamHIクローニング部位を使用して該断片をpET20b A092内にクローニングした。該プラスミドを形質転換細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定により確認した。使用した制限部位内の配列一致は100%であった。該プラスミドを使用まで凍結乾燥した。
以下に挙げられているペプチド配列をコードする合成遺伝子がGeneArt(登録商標)(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)により合成オリゴヌクレオチドおよび/またはPCR産物から構築された。NdeIおよびBamHIクローニング部位を使用して該断片をpET20b A092内にクローニングした。該プラスミドを形質転換細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。最終構築物を配列決定により確認した。使用した制限部位内の配列一致は100%であった。該プラスミドを使用まで凍結乾燥した。
CCIZN51:
CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号40)
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Invitrogen(商標))を、該製造業者の指示に従い、CCIZN51の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリンおよび34μg/mL クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ(LB)寒天上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するLB培地に単コロニーを接種し、それを、225rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なLB培地に1:40希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、600nmでの光学濃度が0.6〜0.8に達するまで37℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を0.5mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。該培養を37℃で更に3〜4時間成長させ、ついで該細胞を10,000×g、4℃で15分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−20℃で保存した。
CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号40)
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Invitrogen(商標))を、該製造業者の指示に従い、CCIZN51の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリンおよび34μg/mL クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ(LB)寒天上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するLB培地に単コロニーを接種し、それを、225rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なLB培地に1:40希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、600nmでの光学濃度が0.6〜0.8に達するまで37℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を0.5mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。該培養を37℃で更に3〜4時間成長させ、ついで該細胞を10,000×g、4℃で15分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−20℃で保存した。
該細胞を細胞溶解バッファーに再懸濁させ、マイクロフルダイザーへの3回通過により細胞溶解させた。ついで該ライセートを遠心分離により清澄化した。SDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析は、CCIZN51生成物の大部分が不溶性画分内で検出されることを証明した。したがって、繰り返されるホモジナイゼーションおよび遠心分離工程により、該不溶性画分から洗浄封入体を調製した。最終洗浄封入体を遠心分離によりペレット化し、−70℃で凍結した。
該封入体を、4M 尿素、20mM HEPESおよび20mM TCEPを含有するバッファーに溶解した。該溶液を室温で一晩維持した。遠心分離後、上清をVydac(登録商標)ジフェニルカラム(22×250mm,10〜15μ)上に直接的にロードし、0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を20ml/分の流速で用いる逆相HPLCにより精製した。Vydac(登録商標)ジフェニルカラム(150×4.6mm)上で分析用HPLCを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは+6〜+11の電荷状態を示した。デコンボリューションされた質量は9419.4Daである(配列予想質量は9417Daである)。
該精製ペプチド前駆体(20mg)を、1N グアニジン、0.2M HEPES、1mM EDTA、1.5mMの還元型グルタチオンおよび0.75mMの酸化型グルタチオンを含有する40mlのバッファー(pH7.5)に溶解した。該酸化反応をHPLCによりモニターした。一晩の後、500μlのTFAを該溶液に加えることにより、反応を停止させ、該溶液をVydac(登録商標)ジフェニルカラム(22×250mm,10〜15μ)上に直接的にロードし、0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を20ml/分の流速で用いるRP HPLCにより精製した。分析用HPLC分析は前記と同じであった。該共有結合三量体に対応するプール化画分を高分解能質量分析により更に分析した。ESIスペクトルは+20〜+27の電荷状態を示している。デコンボリューションされた質量は28241.6Daである(配列予想質量は28248Daである)。
3.組換えSZN51
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Invitrogen)を、該製造業者の指示に従い、SZN51の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリンおよび34μg/mL クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ(LB)寒天上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するLB培地に単コロニーを接種し、それを、225rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なLB培地に1:40希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、600nmでの光学濃度が0.6〜0.8に達するまで37℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を0.5mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。該培養を37℃で更に3〜4時間成長させ、ついで該細胞を10,000×g、4℃で15分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−20℃で保存した。
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞(Invitrogen)を、該製造業者の指示に従い、SZN51の遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した。該形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリンおよび34μg/mL クロラムフェニコールを含有するルリア−ベルタニ(LB)寒天上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。幾つかのコロニーを該プレートから拾い、抗生物質を含有するLB培地に単コロニーを接種し、それを、225rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖させた。また、該一晩培養からの各コロニーに関して、グリセロールストックを調製し、該グリセロールストックを更なる大規模発現実験のための出発物質として使用した。抗生物質を含有する新鮮なLB培地に1:40希釈の該一晩予備培養を接種し、それを、600nmでの光学濃度が0.6〜0.8に達するまで37℃で増殖させた。ついでタンパク質発現を0.5mM イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導した。該培養を37℃で更に3〜4時間成長させ、ついで該細胞を10,000×g、4℃で15分間の遠心分離により集めた。該細胞ペレットを−20℃で保存した。
該細胞を細胞溶解バッファーに再懸濁させ、マイクロフルダイザーへの3回通過により細胞溶解させた。ついで該ライセートを遠心分離により清澄化した。SDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析は、SZN51生成物の大部分が不溶性画分内で検出されることを証明した。したがって、繰り返されるホモジナイゼーションおよび遠心分離工程により、該不溶性画分から洗浄封入体を調製した。最終洗浄封入体を遠心分離によりペレット化し、−70℃で凍結した。
洗浄封入体(0.2g)を、0.1% TFAを含有する20mlの15% アセトニトリル/水に溶解した。0.45μm PVDFディスク(Whatman)で濾過した後、溶液をVydac(登録商標)C4カラム(22×250mm,300オングストローム)上に直接的にロードし、0.1% トリフルオロ酢酸の存在下で水/アセトニトリル勾配を15ml/分の流速で用いる逆相HPLCにより精製した。Vydac(登録商標)C4カラム(150×4.6mm)上で分析用HPLCを行った。エレクトロスプレー質量分析により該精製ペプチドを特徴づけした。ESIスペクトルは+5〜+12の電荷状態を示した。デコンボリューションされた質量は9249.4Daである(配列予想=9243Da)。
4.組換え5−ヘリックス
C末端ヒスチジンタグ付き5−ヘリックスペプチドを発現する凍結組換え大腸菌(E.coli)細胞を解凍し、50mM Tris−HCl(pH8.0)および0.3M NaClに懸濁させた。マイクロフルイダイザー(〜18,000psiで2回通過)を使用してライセートを調製した。不溶性化画分を遠心分離により集め、上清を廃棄した。該不溶性画分を、50mM Tris−HCl(pH8.0)、0.3M NaClおよび0.05% Triton X−100を使用する複数ラウンドの再懸濁および遠心分離により洗浄した。該洗浄不溶性画分を8M 塩酸グアニジン(Gd−HCl)に溶解した。該グアニジン−可溶性抽出物をIMAC樹脂のスラリーと混合し、65℃で1時間混合した。該スラリーを冷却し、該樹脂を重力により沈降させた。該冷却樹脂をガラスクロマトグラフィーカラムに移し、カラムを50mM リン酸ナトリウム、20mM イミダゾール、0.3M 塩化ナトリウムおよび8M Gd−HCl(pH8.0)で洗浄した。該5−ヘリックスペプチドを50mM リン酸ナトリウム、300mM イミダゾール、0.3M 塩化ナトリウムおよび8M Gd−HCl(pH8.0)で該カラムから溶出した。該IMAC生成物にトリフルオロ酢酸(TFA)およびアセトニトリル(ACN)をそれぞれ0.1%および5%まで加え、それを50℃で逆相クロマトグラフィーにより精製した。該5−ヘリックスペプチドを0.1% TFA中の5%から80%までのACNの直線勾配で該カラムから溶出した。該ペプチド含有画分をプールし、ACNを窒素ガスの気流下で蒸発により除去した。ランニングバッファーとしての50mM Tris HCl(pH8.0)および150mM NaClと共にSuperdex(登録商標)200カラムを使用する分取サイズ排除クロマトグラフィーにより該5−ヘリックスペプチドを更に精製した。単量体5−ヘリックスペプチドを含有する画分をプールし、滅菌濾過し、−70℃での長期貯蔵のために液体窒素中で小さなアリコートにおいて瞬間冷凍した。
C末端ヒスチジンタグ付き5−ヘリックスペプチドを発現する凍結組換え大腸菌(E.coli)細胞を解凍し、50mM Tris−HCl(pH8.0)および0.3M NaClに懸濁させた。マイクロフルイダイザー(〜18,000psiで2回通過)を使用してライセートを調製した。不溶性化画分を遠心分離により集め、上清を廃棄した。該不溶性画分を、50mM Tris−HCl(pH8.0)、0.3M NaClおよび0.05% Triton X−100を使用する複数ラウンドの再懸濁および遠心分離により洗浄した。該洗浄不溶性画分を8M 塩酸グアニジン(Gd−HCl)に溶解した。該グアニジン−可溶性抽出物をIMAC樹脂のスラリーと混合し、65℃で1時間混合した。該スラリーを冷却し、該樹脂を重力により沈降させた。該冷却樹脂をガラスクロマトグラフィーカラムに移し、カラムを50mM リン酸ナトリウム、20mM イミダゾール、0.3M 塩化ナトリウムおよび8M Gd−HCl(pH8.0)で洗浄した。該5−ヘリックスペプチドを50mM リン酸ナトリウム、300mM イミダゾール、0.3M 塩化ナトリウムおよび8M Gd−HCl(pH8.0)で該カラムから溶出した。該IMAC生成物にトリフルオロ酢酸(TFA)およびアセトニトリル(ACN)をそれぞれ0.1%および5%まで加え、それを50℃で逆相クロマトグラフィーにより精製した。該5−ヘリックスペプチドを0.1% TFA中の5%から80%までのACNの直線勾配で該カラムから溶出した。該ペプチド含有画分をプールし、ACNを窒素ガスの気流下で蒸発により除去した。ランニングバッファーとしての50mM Tris HCl(pH8.0)および150mM NaClと共にSuperdex(登録商標)200カラムを使用する分取サイズ排除クロマトグラフィーにより該5−ヘリックスペプチドを更に精製した。単量体5−ヘリックスペプチドを含有する画分をプールし、滅菌濾過し、−70℃での長期貯蔵のために液体窒素中で小さなアリコートにおいて瞬間冷凍した。
ペプチドの特徴づけ
1.円二色性
全ての測定は、0.1cmの経路長の長方形石英セルを使用して、J−810分光旋光計(Jasco,Inc.,Easton,MD)において20℃で行った。1秒の時間応答および100nm/分の走査速度を用いてスペクトルを得、5つの獲得に関して平均化した。ストック溶液濃度を定量的アミノ酸分析により決定した。酢酸ナトリウム(25〜50mM)、NaCl(50〜150mM)(pH4〜4.5)中のペプチドの溶液に関して標準的な測定を行った。Chenら,1974,Biochemistry 13:3350−3359に従い、222nmにおいて、モル楕円率に基づいて、α−ヘリックスの比率を計算した。2℃/分の増加を用いて、温度の関数として222nmでのCDシグナルにおける変化をモニターすることにより、熱安定性を決定した。協同的熱性アンフォールディング転移の中間点から融解温度(Tm)を決定した。Tm>90℃のペプチドに関しては、2M 塩酸グアニジンの存在下で熱変性実験も行った。
1.円二色性
全ての測定は、0.1cmの経路長の長方形石英セルを使用して、J−810分光旋光計(Jasco,Inc.,Easton,MD)において20℃で行った。1秒の時間応答および100nm/分の走査速度を用いてスペクトルを得、5つの獲得に関して平均化した。ストック溶液濃度を定量的アミノ酸分析により決定した。酢酸ナトリウム(25〜50mM)、NaCl(50〜150mM)(pH4〜4.5)中のペプチドの溶液に関して標準的な測定を行った。Chenら,1974,Biochemistry 13:3350−3359に従い、222nmにおいて、モル楕円率に基づいて、α−ヘリックスの比率を計算した。2℃/分の増加を用いて、温度の関数として222nmでのCDシグナルにおける変化をモニターすることにより、熱安定性を決定した。協同的熱性アンフォールディング転移の中間点から融解温度(Tm)を決定した。Tm>90℃のペプチドに関しては、2M 塩酸グアニジンの存在下で熱変性実験も行った。
2.分析用超遠心分離
全ての分析用超遠心分離(AU)実験は、20℃でXL−1分析用超遠心機(Beckman Coulter,Inc.,Indianopolis,IΝ)を使用して行った。沈降速度分析のために、ラジアル吸光度走査を約4分ごとに行いながら、該サンプルを48,000rpm、20℃で5時間遠心分離した。プログラムDCDT+,バージョン2.21(John Philo,Thousand Oaks,CA)またはOptima XL−Iデータ分析ソフトウェア(Beckman Coulter,Inc.)を使用して、g*(s)分析を行った。3つの異なるローディング濃度および3つの異なる回転速度(16,000、20,000および30,000)で沈降平衡実験を行った。Optima XL−Iデータ分析ソフトウェアまたはHeteroanalysisバージョン1.1.33(Analytical Ultracentrifugation Facility,Biotechnology and Bioservices Center of the University of Connecticut)を使用して分子量を計算した。
全ての分析用超遠心分離(AU)実験は、20℃でXL−1分析用超遠心機(Beckman Coulter,Inc.,Indianopolis,IΝ)を使用して行った。沈降速度分析のために、ラジアル吸光度走査を約4分ごとに行いながら、該サンプルを48,000rpm、20℃で5時間遠心分離した。プログラムDCDT+,バージョン2.21(John Philo,Thousand Oaks,CA)またはOptima XL−Iデータ分析ソフトウェア(Beckman Coulter,Inc.)を使用して、g*(s)分析を行った。3つの異なるローディング濃度および3つの異なる回転速度(16,000、20,000および30,000)で沈降平衡実験を行った。Optima XL−Iデータ分析ソフトウェアまたはHeteroanalysisバージョン1.1.33(Analytical Ultracentrifugation Facility,Biotechnology and Bioservices Center of the University of Connecticut)を使用して分子量を計算した。
3.D5/5−ヘリックス競合結合アッセイ(DCBA)
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に基づくインビトロ結合アッセイを、Caulfieldら,2010,J Biol Chem 255:40604−40611に既に記載されているとおりに行った。簡潔に説明すると、該アッセイは、ユーロピウムクリプタートにコンジュゲート化されたD5 IgG(Eu−D5)(米国特許第7,744,887号を参照されたい)、および組換えgp41模倣体5−ヘリックス(5H)のビオチン化誘導体を使用する。ビオチン−5Hはストレプトアビジン結合アロフィコシアニン(APC)基質に結合して、5H−SA−APC複合体を形成する。5HへのEu−D5の結合はEuからAPCへのFRETを引き起こす。該反応系が340nmの波長で励起されると、665nmの発光波長で結合Eu−D5の量が測定され、620nmの発光波長で全Euが測定される。データは620nmにおけるシグナルに対する665nmにおけるシグナルの比×10000として示される。いずれかの成分に競合的に結合する物質は該比率値の減少を引き起こす。
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に基づくインビトロ結合アッセイを、Caulfieldら,2010,J Biol Chem 255:40604−40611に既に記載されているとおりに行った。簡潔に説明すると、該アッセイは、ユーロピウムクリプタートにコンジュゲート化されたD5 IgG(Eu−D5)(米国特許第7,744,887号を参照されたい)、および組換えgp41模倣体5−ヘリックス(5H)のビオチン化誘導体を使用する。ビオチン−5Hはストレプトアビジン結合アロフィコシアニン(APC)基質に結合して、5H−SA−APC複合体を形成する。5HへのEu−D5の結合はEuからAPCへのFRETを引き起こす。該反応系が340nmの波長で励起されると、665nmの発光波長で結合Eu−D5の量が測定され、620nmの発光波長で全Euが測定される。データは620nmにおけるシグナルに対する665nmにおけるシグナルの比×10000として示される。いずれかの成分に競合的に結合する物質は該比率値の減少を引き起こす。
4.p4−2R5中和アッセイ
この中和アッセイは、以下の変更を加えて、Joyceら,2002,J Biol Chem 277:45811−45820に既に記載されているとおりに行った。HeLa P4R5細胞を384ウェルプレート内に1000細胞/ウェルで播き、翌日、それに適当なHIV−1またはSHIVウイルスを免疫血清または分画化IgG(感染後48時間のもの)の系列希釈物の存在下で約0.01の感染多重度で感染させ、細胞を細胞溶解し、化学発光基質(GalScreen(登録商標),Applied Biosystems(商標),Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。精製IgGの分析では、該データは、化学発光シグナルの50%低下を引き起こすIgG濃度として定められるIC50として表される。血清の分析では、該IC50は、化学発光シグナルの50%低下を引き起こす血清希釈度の逆数として定められる。
この中和アッセイは、以下の変更を加えて、Joyceら,2002,J Biol Chem 277:45811−45820に既に記載されているとおりに行った。HeLa P4R5細胞を384ウェルプレート内に1000細胞/ウェルで播き、翌日、それに適当なHIV−1またはSHIVウイルスを免疫血清または分画化IgG(感染後48時間のもの)の系列希釈物の存在下で約0.01の感染多重度で感染させ、細胞を細胞溶解し、化学発光基質(GalScreen(登録商標),Applied Biosystems(商標),Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。精製IgGの分析では、該データは、化学発光シグナルの50%低下を引き起こすIgG濃度として定められるIC50として表される。血清の分析では、該IC50は、化学発光シグナルの50%低下を引き起こす血清希釈度の逆数として定められる。
結果
ペプチドの特徴づけはCD分光法による二次構造およびAUCによるオリゴマー状態の生物物理学的評価からなるものであった。D5エピトープの完全性および提示を、プレヘアピン中間体内に含有される疎水性ポケットの適切な提示を測定するためのDCBAおよびP4/2R5中和アッセイにおいて評価した。
ペプチドの特徴づけはCD分光法による二次構造およびAUCによるオリゴマー状態の生物物理学的評価からなるものであった。D5エピトープの完全性および提示を、プレヘアピン中間体内に含有される疎水性ポケットの適切な提示を測定するためのDCBAおよびP4/2R5中和アッセイにおいて評価した。
表2は、得られたペプチド構築物に関するデータを要約している。一般に、ペプチドの溶解度は3〜5のpH範囲において最適であった。したがって、CDおよびAUCの決定は、TFA対イオンが〜3.5のpHを与える水において、またはpH4が最も信頼しうるものである酢酸ナトリウムバッファー(pH4)において行った。このpH範囲においては、単量体ペプチド構築物および三量体ペプチド構築物は共に、予想に合致して、高比率のα−ヘリックス構造を示した。NHRに基づくペプチド構築物は、pHが増加するにつれて、特にpH6〜8の範囲において、凝集および沈殿の増加傾向を示した。予測分子量に対する実測分子量のAUC比から明らかなとおり、単量体N51、N51−2BおよびN51−3Bペプチドは全て、強い自己会合傾向を示している。しかし、これらの構築物のほとんどは中性pH付近で比較的不安定であり、有意な凝集を示した。SZ三量体化ドメインの付加によりN51を安定化させるための初期の試みは部分的に成功しており、溶液中では、このペプチドは自己集合して、見掛け上の三量体−四量体平衡を形成する。これらのペプチドの螺旋性は完全長N51の場合に最適であった。なぜなら、N51およびSZN51の両方のC末端トランケート化Δ23形態はヘリックス含量の減少を示したからである。複数の濃度および複数の回転速度における沈降平衡によるN51およびSZN51ファミリーのペプチドのAUC分析は、相当に変動する計算分子量値を示したが、このことは、該分析モデルが該データの全てに正確には適合しなかったことを示唆している。最もありうる説明は、これらのペプチドは自己会合の傾向を示したが、このオリゴマー化は無制御であり、次第に高次となるオリゴマーおよび凝集物の複数形態が経時的に形成したというものである。これとは対照的に、操作ジスルフィドの酸化により安定化された三量体N51ペプチド(CCIZN51)3または化学的スカフォールディングにより安定化された三量体N51ペプチド、例えばKTA(N51)3は、非常に高い度合の二次構造を示し、AUCは均一に近い比率を有し、このことは、該三量体の見掛け上の凝集も自己会合もほとんどないことを示唆している。
中和モノクローナル抗体D5に対してコンホメーション的に適切な結合性エピトープを種々のペプチド構築物が提示する能力を、DCBAアッセイにおいて5−ヘリックスへの結合に関してそれらが競合する能力を測定することにより評価した。N51−2BおよびN51−3Bにおいて用いられた突然変異がD5結合に対して見掛け上の負の影響を及ぼすという点以外は、IC50値はそれらの種々の構築物において同等のものであった。これらのペプチドにおけるアミノ酸置換はいずれも、L568、W571、G572およびK574として定められる決定的に重要なD5接触残基を変化させないが、共通の突然変異L565AがL568に接近しており、結合に対して予想外の影響を及ぼす可能性がある。これとは対照的に、これらのペプチドは、ウイルス侵入抑制に関して、天然N51と同等のIC50値を示しており、このことは、該突然変異は、疎水性ポケットがC−7アミノ酸反復ペプチドに結合し、したがって、融合のドミナントネガティブインヒビターとして機能する能力に悪影響を及ぼさないことを示唆している。一般に、該ペプチド系列にわたって観察された比較的一定の抗ウイルス活性は、該プレヘアピン中間体構造の適切な提示が維持されているという定性的証拠を示している。V570Aに関する抑制効力の約10倍の増強がKTA(N51)3において実現していることが注目される。
実施例2
血清学
1.ELISA
ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Pittsburg,PA)に直接的に加えられたビオチン化ペプチド(CCIZN17)3に対して免疫血清サンプルを試験することにより、終点血清希釈度を決定した。ビオチン化ペプチドをウェル当たりPBS中の4μg/mlの濃度で4℃で一晩コート(被覆)した。プレートを、0.05% Tween−20(PBST)を含有するPBSで6回洗浄し、3%(v/v)脱脂乾燥乳(PBST−乳)を含有するPBSTでブロッキングした。試験サンプル、免疫前および免疫サンプルを1:100から希釈し、ウェル当たり100μlの最終体積中で4倍の系列希釈を8回行った。プレートを室温で2時間インキュベートし、ついでPBSTで6回洗浄した。50マイクロリットルのHRP結合ヤギ抗モルモット(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)またはヤギ抗ヒト(Invitrogen)二次抗体をPBST−乳中でそれぞれ1:5000または1:2000で希釈し、各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを6回洗浄し、ついでウェル当たり100μl中の基質(TMB;Virolabs,Inc.,Chantilly,VA)を加え、3〜5分間の現像の後、TMB−停止溶液で停止させた。コンジュゲート対照ウェルの平均+2標準偏差を超える450nmでのOD値を与えた最高希釈度の逆数として、抗体価を決定した。
血清学
1.ELISA
ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Pittsburg,PA)に直接的に加えられたビオチン化ペプチド(CCIZN17)3に対して免疫血清サンプルを試験することにより、終点血清希釈度を決定した。ビオチン化ペプチドをウェル当たりPBS中の4μg/mlの濃度で4℃で一晩コート(被覆)した。プレートを、0.05% Tween−20(PBST)を含有するPBSで6回洗浄し、3%(v/v)脱脂乾燥乳(PBST−乳)を含有するPBSTでブロッキングした。試験サンプル、免疫前および免疫サンプルを1:100から希釈し、ウェル当たり100μlの最終体積中で4倍の系列希釈を8回行った。プレートを室温で2時間インキュベートし、ついでPBSTで6回洗浄した。50マイクロリットルのHRP結合ヤギ抗モルモット(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)またはヤギ抗ヒト(Invitrogen)二次抗体をPBST−乳中でそれぞれ1:5000または1:2000で希釈し、各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを6回洗浄し、ついでウェル当たり100μl中の基質(TMB;Virolabs,Inc.,Chantilly,VA)を加え、3〜5分間の現像の後、TMB−停止溶液で停止させた。コンジュゲート対照ウェルの平均+2標準偏差を超える450nmでのOD値を与えた最高希釈度の逆数として、抗体価を決定した。
2.D5/5−ヘリックス競合結合アッセイ(DCBA)
Caulfieldら,2010,J Biol Chem 255:40604−40611に既に記載されているとおりに、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に基づくインビトロ結合アッセイを行った。簡潔に説明すると、該アッセイは、ユーロピウムクリプタート(Eu−D5)にコンジュゲート化されたD5 IgGおよび組換えgp41模倣体5−ヘリックス(5H)のビオチン化誘導体を使用する。ビオチン−5Hはストレプトアビジン結合アロフィコシアニン(APC)基質に結合して、5H−SA−APC複合体を形成する。5HへのEu−D5の結合はEuからAPCへのFRETを引き起こす。該反応系が340nmの波長で励起されると、665nmの発光波長で結合Eu−D5の量が測定され、620nmの発光波長で全Euが測定される。データは620nmにおけるシグナルに対する665nmにおけるシグナルの比×10000として示される。いずれかの成分に競合的に結合する物質は該比率値の減少を引き起こす。
Caulfieldら,2010,J Biol Chem 255:40604−40611に既に記載されているとおりに、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に基づくインビトロ結合アッセイを行った。簡潔に説明すると、該アッセイは、ユーロピウムクリプタート(Eu−D5)にコンジュゲート化されたD5 IgGおよび組換えgp41模倣体5−ヘリックス(5H)のビオチン化誘導体を使用する。ビオチン−5Hはストレプトアビジン結合アロフィコシアニン(APC)基質に結合して、5H−SA−APC複合体を形成する。5HへのEu−D5の結合はEuからAPCへのFRETを引き起こす。該反応系が340nmの波長で励起されると、665nmの発光波長で結合Eu−D5の量が測定され、620nmの発光波長で全Euが測定される。データは620nmにおけるシグナルに対する665nmにおけるシグナルの比×10000として示される。いずれかの成分に競合的に結合する物質は該比率値の減少を引き起こす。
3.中和アッセイ
a.P4/2R5アッセイ
Joyceら,2002,J Biol Chem 277:45811−45820に既に記載されているものに以下の変更を加えて、アッセイを行った。HeLa P4R5細胞を384ウェルプレート内に1000細胞/ウェルで播き、翌日、それに適当なHIV−1またはSHIVウイルスを免疫血清または分画化IgGの系列希釈物の存在下で約0.01の感染多重度で感染させた。感染の48時間後、細胞を細胞溶解し、化学発光基質(GalScreen,Applied Biosystems)を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。精製IgGの分析では、該データは、化学発光シグナルの50%低下を引き起こすIgG濃度として定められるIC50として表される。血清の分析では、該IC50は、化学発光シグナルの50%低下を引き起こす血清希釈度の逆数として定められる。
a.P4/2R5アッセイ
Joyceら,2002,J Biol Chem 277:45811−45820に既に記載されているものに以下の変更を加えて、アッセイを行った。HeLa P4R5細胞を384ウェルプレート内に1000細胞/ウェルで播き、翌日、それに適当なHIV−1またはSHIVウイルスを免疫血清または分画化IgGの系列希釈物の存在下で約0.01の感染多重度で感染させた。感染の48時間後、細胞を細胞溶解し、化学発光基質(GalScreen,Applied Biosystems)を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。精製IgGの分析では、該データは、化学発光シグナルの50%低下を引き起こすIgG濃度として定められるIC50として表される。血清の分析では、該IC50は、化学発光シグナルの50%低下を引き起こす血清希釈度の逆数として定められる。
b.TZM−blアッセイ
既に記載されているとおりに、TZM−bl細胞における1ラウンドの感染の後のルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低下として、中和を測定した。Montefiori(2004),Current Protocols in Immunology,Coliganら編(John Wiley & Sons)12.11.1−12.11.15およびLiら,2005,J Virol 79:10108−10125を参照されたい。NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramからTZM−bl細胞を得た(John KappesおよびXiaoyun Wuにより提供された)。簡潔に説明すると、200 TCID50のウイルスを、150μlの合計体積中の二重重複試験サンプルの系列3倍希釈物と共に、96ウェル平底培養プレート内で37℃で1時間インキュベートした。新たにトリプシン処理された細胞(75μg/ml DEAEデキストランを含有する100μlの増殖培地中の10,000細胞)を各ウェルに加えた。一組の対照ウェルには細胞およびウイルスを加え(ウイルス対照)、もう一組には細胞のみを加えた(バックグラウンド対照)。48時間のインキュベーションの後、ブライトライト発光レポーター遺伝子アッセイ系(Britelite Luminescence Reporter Gene Assay System)(PerkinElmer Inc.,Waltham,MA)を使用するルシフェラーゼの測定のために、100μlの細胞を96ウェル黒ソリッドプレート(Costar(登録商標))に移した。中和力価は、バックグラウンドRLUの差し引きの後、ウイルス対照ウェルと比較して相対発光単位(RLU)が50%低下する希釈度である。分子クローン化Env−偽型ウイルスのアッセイストックを293T細胞のトランスフェクションにより調製し、Liら,2005,J Virol 79:10108−10125に記載されているとおりにTZM−bl細胞において力価測定した。クレードA、BおよびC参考Envクローンは既に記載されている。Liら,2005,J Virol 79:10108−10125;Liら,2006,J Virol 80:11776−11790;およびBlishら,2007,AIDS 21:693−702を参照されたい。
既に記載されているとおりに、TZM−bl細胞における1ラウンドの感染の後のルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低下として、中和を測定した。Montefiori(2004),Current Protocols in Immunology,Coliganら編(John Wiley & Sons)12.11.1−12.11.15およびLiら,2005,J Virol 79:10108−10125を参照されたい。NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramからTZM−bl細胞を得た(John KappesおよびXiaoyun Wuにより提供された)。簡潔に説明すると、200 TCID50のウイルスを、150μlの合計体積中の二重重複試験サンプルの系列3倍希釈物と共に、96ウェル平底培養プレート内で37℃で1時間インキュベートした。新たにトリプシン処理された細胞(75μg/ml DEAEデキストランを含有する100μlの増殖培地中の10,000細胞)を各ウェルに加えた。一組の対照ウェルには細胞およびウイルスを加え(ウイルス対照)、もう一組には細胞のみを加えた(バックグラウンド対照)。48時間のインキュベーションの後、ブライトライト発光レポーター遺伝子アッセイ系(Britelite Luminescence Reporter Gene Assay System)(PerkinElmer Inc.,Waltham,MA)を使用するルシフェラーゼの測定のために、100μlの細胞を96ウェル黒ソリッドプレート(Costar(登録商標))に移した。中和力価は、バックグラウンドRLUの差し引きの後、ウイルス対照ウェルと比較して相対発光単位(RLU)が50%低下する希釈度である。分子クローン化Env−偽型ウイルスのアッセイストックを293T細胞のトランスフェクションにより調製し、Liら,2005,J Virol 79:10108−10125に記載されているとおりにTZM−bl細胞において力価測定した。クレードA、BおよびC参考Envクローンは既に記載されている。Liら,2005,J Virol 79:10108−10125;Liら,2006,J Virol 80:11776−11790;およびBlishら,2007,AIDS 21:693−702を参照されたい。
c.A3R5アッセイ
該アッセイは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低下の関数として、96ウェル・マイクロダイルーション・プレートにおいて中和を測定する。A3R5細胞(A3.01/R5.6)はUS Medical HIV Research Program(MHRP)により提供された。これは、CCR5を発現するようにMHRPにおいて操作された、CD4およびCXCR4を天然で発現するヒトリンパ芽球細胞系,CEMの誘導体である。Folksら,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)52:4539−4543を参照されたい。該細胞はHIV−1によるほとんどの株による感染に対して中程度に許容性であった。感染性を増強するために、中和アッセイ中に該培地内でDEAEデキストランを使用した。該細胞系はレポーター遺伝子を含有しないため、ウイルスゲノム内にレポーター遺伝子を保持する分子的クローン化ウイルスが使用されなければならない。ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子(Env.IMC.LucRウイルス)を保持するEnv発現感染性分子クローンは中和アッセイのための適当な感染をもたらす。感染直後に、該レポーター遺伝子の発現をウイルスTatタンパク質によりトランスで誘導した。ルシフェラーゼ活性を発光により定量した。該活性は、初期接種物中に存在する感染性ウイルス粒子の数に正比例する。該アッセイは、高いハイスループット能力のために96ウェル培養プレート内で行った。クローン細胞集団の使用は精度および均一性の向上をもたらした。該アッセイは、293T細胞におけるトランスフェクションにより産生されたEnv.IMC.LucRウイルスでの複数ラウンドの感染に関して標準化されている。
該アッセイは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の低下の関数として、96ウェル・マイクロダイルーション・プレートにおいて中和を測定する。A3R5細胞(A3.01/R5.6)はUS Medical HIV Research Program(MHRP)により提供された。これは、CCR5を発現するようにMHRPにおいて操作された、CD4およびCXCR4を天然で発現するヒトリンパ芽球細胞系,CEMの誘導体である。Folksら,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)52:4539−4543を参照されたい。該細胞はHIV−1によるほとんどの株による感染に対して中程度に許容性であった。感染性を増強するために、中和アッセイ中に該培地内でDEAEデキストランを使用した。該細胞系はレポーター遺伝子を含有しないため、ウイルスゲノム内にレポーター遺伝子を保持する分子的クローン化ウイルスが使用されなければならない。ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子(Env.IMC.LucRウイルス)を保持するEnv発現感染性分子クローンは中和アッセイのための適当な感染をもたらす。感染直後に、該レポーター遺伝子の発現をウイルスTatタンパク質によりトランスで誘導した。ルシフェラーゼ活性を発光により定量した。該活性は、初期接種物中に存在する感染性ウイルス粒子の数に正比例する。該アッセイは、高いハイスループット能力のために96ウェル培養プレート内で行った。クローン細胞集団の使用は精度および均一性の向上をもたらした。該アッセイは、293T細胞におけるトランスフェクションにより産生されたEnv.IMC.LucRウイルスでの複数ラウンドの感染に関して標準化されている。
実施例3
HIV350および365:モルモット免疫原性
ダンカン・ハートレー(Duncan−Hartley)モルモット(HIV−350,n=8/群*)を100マイクログラムのペプチド免疫原で筋肉内に第0週、第4週および第8週に3回免疫化した。20mM Hepesバッファー(中性pH)中で再構成されたペプチドを用量当たり180μgのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート(Merck & Co.,Inc.)+40μgのIscomatrix Adjuvant(商標)(CSL,Inc.)中で製剤化した。第7週および第11週に、各動物および初回免疫化前(採血前)の幾つかの血清採集物に関して、血清セパレータチューブ中の全血から血清サンプルを集めた。
HIV350および365:モルモット免疫原性
ダンカン・ハートレー(Duncan−Hartley)モルモット(HIV−350,n=8/群*)を100マイクログラムのペプチド免疫原で筋肉内に第0週、第4週および第8週に3回免疫化した。20mM Hepesバッファー(中性pH)中で再構成されたペプチドを用量当たり180μgのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート(Merck & Co.,Inc.)+40μgのIscomatrix Adjuvant(商標)(CSL,Inc.)中で製剤化した。第7週および第11週に、各動物および初回免疫化前(採血前)の幾つかの血清採集物に関して、血清セパレータチューブ中の全血から血清サンプルを集めた。
研究HIV−350はペプチド構築物SZN51を試験していた。表3aは該研究におけるこの群に関する免疫化プロトコルを示す。
ダンカン・ハートレー(Duncan−Hartley)モルモット(HIV−365,n=6/群)を30μgのペプチド免疫原で筋肉内に第0週、第4週および第8週に3回免疫化した。20mM Hepesバッファー(中性pH)中で再構成されたペプチドを用量当たり180μgのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート(Merck & Co.,Inc.)+40μgのIscomatrix Adjuvant(商標)(CSL,Inc.)中で製剤化した。第3週、第7週および第11週に、各動物に関して、血清セパレータチューブ中の全血から血清サンプルを集めた。実施例2に記載されているとおりに血清学的検査を行った。
研究HIV−365は、(1)合成KTA(N51)3、KTA(N51−2B)3、KTA(N51−3B)3、ChA(N51)3および組換え(CCIZN51)3からなる一連の制限され安定化されたN51三量体ペプチド、ならびに(2)同種(CCIZN36)3免疫化を、(CCIZN36)3およびそれに続くKTA(N51)3および5−ヘリックスのレジメンとの比較において評価した。表3bは該研究の免疫化プロトコルおよび群名称を示す。血清学的検査は、p4/2R5中和アッセイを用いて、ならびにTZM−blアッセイ(ウイルスV570A)およびA3R5アッセイを用いて行った。
結果
図2は、p4/2R5アッセイにおいてウイルスV570Aに対してアッセイされた一連のN51ペプチドに関する中和アッセイデータの要約を示す。共有結合的に拘束されていない組換えSZN51ペプチドは、中和抗体応答を惹起するその能力に関して、残りのペプチド免疫原の全てより明らかに劣る。このことは、CCIZまたは化学的スカフォールドコアでのスカフォールディングにより達成されるN−ペプチドの共有結合的安定化が、所望の機能的免疫応答を惹起するのに決定的に重要であることを、明らかに示している。
図2は、p4/2R5アッセイにおいてウイルスV570Aに対してアッセイされた一連のN51ペプチドに関する中和アッセイデータの要約を示す。共有結合的に拘束されていない組換えSZN51ペプチドは、中和抗体応答を惹起するその能力に関して、残りのペプチド免疫原の全てより明らかに劣る。このことは、CCIZまたは化学的スカフォールドコアでのスカフォールディングにより達成されるN−ペプチドの共有結合的安定化が、所望の機能的免疫応答を惹起するのに決定的に重要であることを、明らかに示している。
表4は、計算幾何平均及び個々の動物の両方に関して、最終用量の投与の3週間後のT=11の時点で決定された中和抗体価の要約を示す。一貫して、(CCIZN36)3または5−ヘリックスと組み合わされたN51ペプチドを含む群は、試験された全てのウイルス株にわたり、より高い中和抗体価の惹起に関して、(CCIZN36)3単独体より優れていた。
実施例4
HIV360:非ヒト霊長類免疫原性
このNHP研究は、(1)(CCIZN36)3の複数免疫化の投与効果を試験する、および(2)(CCIZN36)3で初回抗原刺激された動物における異種抗原投与の利益を評価するための2つの相において行われた。
HIV360:非ヒト霊長類免疫原性
このNHP研究は、(1)(CCIZN36)3の複数免疫化の投与効果を試験する、および(2)(CCIZN36)3で初回抗原刺激された動物における異種抗原投与の利益を評価するための2つの相において行われた。
アカゲザル(Macaca mulatta)(3頭/群)を100、300または1000μgの(CCIZN36)3で第0、1および2月に免疫化した。第34週に、全ての群を100マイクログラムの(CCIZN36)3の追加的用量で追加抗原刺激した。該追加免疫化の7か月後、全ての群が(CCIZN36)3の全用量の等しい表示を有するように該サルを再分類した。各群を以下のプロトコルで4週間間隔で免疫化した。群1に(CCIZN36)3の2回の免疫化を行った。群2をKTA(N51)3および5−ヘリックスで連続的に免疫化した。群3を5−ヘリックスおよびKTA(N51)3で連続的に免疫化した。20mM Hepesバッファー(中性pH)中で再構成されたペプチドまたは5−ヘリックスを用量当たり180μgのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート(Merck & Co.,Inc.)+40μgのIscomatrix Adjuvant(商標)(CSL,Inc.)中で製剤化した。示されている時点で血清用の全血を集め、結合およびウイルス中和アッセイを含む血清学的分析のために使用した。
結果
図3および4は該研究全体のELISAおよびDCBAアッセイの結果を要約している。第11週(用量3の投与の3週間後)におけるELISAおよびDCBAは良好な応答を示していたが、p4/2R5アッセイにおける中和抗体価はD5超感受性V570A HXB2ウイルスに対してさえも低かった(データ非表示)。ついで第34週に全ての動物に100μgの(CCIZN36)3の第4用量が投与された。ELISAおよびDCBA力価は共に、この26週間の休息期間の後で低下し、T=36週の採血の分析が示しているとおり、どちらも増強された。ELISA力価は以前のピークレベルに達しなかったが、機能的D5様特異性の尺度であるDCBA力価はより高いレベルに達した。しかし、再び、p4/2R5中和抗体価は、以前のモルモット実験から予想されたもの(この場合、免疫化動物は、同等のELISAおよびDCBA応答を生じた。)より低かった。この時点で、いずれかの有りうる偏りを排除するために、各群内の動物をごちゃ混ぜにし、更なる休息期間の後、それらの3つの研究群の2つに関する逐次的組合せにおいて該異種抗原を使用した。この場合、群1には(CCIZN36)3の2つの追加的用量を投与し、群2にはKTA(N51)3、ついで5−ヘリックスを投与し、群3には5−ヘリックス、ついでKTA(N51)3を投与した。ELISAおよびDCBA力価は34〜62週の一時的休息期間中に有意に低下していたが、免疫化直後に上昇した。図5A〜Bおよび6から明らかなとおり、異種抗原が投与された群において、中和力価における重要な相違が明らかに観察された。P4/2R5およびA3R5アッセイにおいて測定された中和抗体応答の大きさおよび範囲の両方が群2および3において有意に増強されている。
図3および4は該研究全体のELISAおよびDCBAアッセイの結果を要約している。第11週(用量3の投与の3週間後)におけるELISAおよびDCBAは良好な応答を示していたが、p4/2R5アッセイにおける中和抗体価はD5超感受性V570A HXB2ウイルスに対してさえも低かった(データ非表示)。ついで第34週に全ての動物に100μgの(CCIZN36)3の第4用量が投与された。ELISAおよびDCBA力価は共に、この26週間の休息期間の後で低下し、T=36週の採血の分析が示しているとおり、どちらも増強された。ELISA力価は以前のピークレベルに達しなかったが、機能的D5様特異性の尺度であるDCBA力価はより高いレベルに達した。しかし、再び、p4/2R5中和抗体価は、以前のモルモット実験から予想されたもの(この場合、免疫化動物は、同等のELISAおよびDCBA応答を生じた。)より低かった。この時点で、いずれかの有りうる偏りを排除するために、各群内の動物をごちゃ混ぜにし、更なる休息期間の後、それらの3つの研究群の2つに関する逐次的組合せにおいて該異種抗原を使用した。この場合、群1には(CCIZN36)3の2つの追加的用量を投与し、群2にはKTA(N51)3、ついで5−ヘリックスを投与し、群3には5−ヘリックス、ついでKTA(N51)3を投与した。ELISAおよびDCBA力価は34〜62週の一時的休息期間中に有意に低下していたが、免疫化直後に上昇した。図5A〜Bおよび6から明らかなとおり、異種抗原が投与された群において、中和力価における重要な相違が明らかに観察された。P4/2R5およびA3R5アッセイにおいて測定された中和抗体応答の大きさおよび範囲の両方が群2および3において有意に増強されている。
図7A〜Bは、該研究の第1相および第2相において決定されたP4/2R5中和抗体価の比較を示す。V570A HXB2に対する応答はいずれの相においても測定されなかったが、V570Aに対する応答は、応答する動物の数および中和抗体価の大きさの点で、該異種群において明らかに増強されている。
実施例5
HIV366:非ヒト霊長類免疫原性
このNHP研究の目的は、研究HIV−360の結果を拡張すること、および該異種群において観察された増強がKTA(N51)3または5−ヘリックスの添加に起因するものなのかどうか、あるいは両方が必要なのかどうかを判定することであった。
HIV366:非ヒト霊長類免疫原性
このNHP研究の目的は、研究HIV−360の結果を拡張すること、および該異種群において観察された増強がKTA(N51)3または5−ヘリックスの添加に起因するものなのかどうか、あるいは両方が必要なのかどうかを判定することであった。
アカゲザル(Macaca mulatta)(6頭/群)を用量当たり100μgの製剤化抗原で免疫化した。1つの群に100μg/抗原の全3個の試験抗原の同等混合物の一連の4つの同種免疫化を行った。該免疫化は第0、1、6および8月に行った。20mM HEPESバッファー(中性pH)中で再構成されたペプチドまたは5−ヘリックスを用量当たり180μgのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート(Merck & Co.,Inc.)+40μgのIscomatrix Adjuvant(商標)(CSL,Inc.)中で製剤化した。示されている時点で血清用の全血を集め、結合およびウイルス中和アッセイを含む血清学的分析のために使用した。
表6はその全研究のためのプロトコルを要約している。群1および5は、HIV−360において試験されたものと同一の抗原の組合せを含む。また、KTA(N51)3または5−ヘリックスの同種投与の効力を試験した。群4は、連続的に投与された(CCIZN36)3およびKTA(N51)3の効力を試験した。一方、群6は、全免疫原が各用量投与において同時に投与される複数の抗原の組合せを試験した。
結果
図8A〜Bは、最終免疫化の2週間後に集められたT=38週の血液においてP4/2R5およびTZM−blアッセイにおいて決定されたウイルスV570A HXB2に対する中和抗体価を示す。両方のアッセイにおいて最も強力な中和力価はKTA(N51)3単独体での同種免疫化により得られている。尤も、このペプチドを、(CCIZN36)3と共に、または(CCIZN36)3と5−ヘリックスの両方と共に含む群は、(CCIZN36)3単独体より良好な効力の傾向を示している。3つの免疫原の組合せ混合物は連続的投与と有意には異ならないようである。
図8A〜Bは、最終免疫化の2週間後に集められたT=38週の血液においてP4/2R5およびTZM−blアッセイにおいて決定されたウイルスV570A HXB2に対する中和抗体価を示す。両方のアッセイにおいて最も強力な中和力価はKTA(N51)3単独体での同種免疫化により得られている。尤も、このペプチドを、(CCIZN36)3と共に、または(CCIZN36)3と5−ヘリックスの両方と共に含む群は、(CCIZN36)3単独体より良好な効力の傾向を示している。3つの免疫原の組合せ混合物は連続的投与と有意には異ならないようである。
V570A HXB2に関する陽性の中和結果は、図9A〜Bに示されているとおり、2つのTier1クレードCウイルス分離体、Ce0393およびMW965を使用するA3R5アッセイにおいて、独立して確認された。Ce0393に関する結果は、第38週における用量4投与の2週間後の血液を用いて、そしてMw965に関しては、第26週における用量3投与の2週間後の血液を用いて得られた。V570A HXB2超感受性分離体で観察されたとおり、最も強力な中和力価は、同種KTA(N51)3群において観察され、一方、このペプチドを含む他の群は(CCIZN36)3または5−ヘリックス単独体より高い力価の傾向を示した。実際、全てのアッセイにおいて、5−ヘリックス単独体は、ELISAによる測定では免疫学的に強力であったものの(データ非表示)、中和抗体価の惹起において極めて不良であった。更に、この分析は、これらの免疫原がクレード間防御を誘導しうるという証拠を示している。なぜなら、当該結果は、クレードB分離体(HXB2)に由来する配列を有するペプチドを使用した場合の、2つのクレードCウイルスの陽性中和を示しているからである。
表7は、該研究の全体にわたって集められた種々の血液における全群に関する中和力価の幾何平均の要約を示す。予想されたとおり、用量3投与と用量4投与との間の12週間の休息期間の終了時の第36週に、中和力価は有意に低下した。他の全ての時点に関して、KTA(N51)3群は同種(CCIZN36)3または5−ヘリックスと比較して最高の中和力価を示し、一方、N51を含む群も同種(CCIZN36)3または5−ヘリックスより高い傾向を示した。
総合すると、研究HIV−366からの結果は、研究HIV−360において観察された中和効力の増強がKTA(N51)3の添加に起因し、5−ヘリックスには起因しないという仮説を強く支持しており、拘束された三量体N51に基づくN−ペプチドが機能的免疫学的観点から優れているという主張を直接的に支持している。
Claims (20)
- 3個のN−ペプチドに連結されたスカフォールドコアを含むgp41ペプチド模倣体であって、各N−ペプチドが、N36(SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL;配列番号1)またはその修飾形態を含むアミノ酸配列を含み、前記の3個のN−ペプチドが互いに相互作用して、HIV gp41のプレヘアピンコンホメーションを模倣した三量体コイルドコイルを形成しており、ただし、該gp41ペプチド模倣体が(CCIZN36)3ではない、gp41ペプチド模倣体。
- 前記の3個のペプチドのそれぞれが、異なる結合点において該スカフォールドコアに共有結合している、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該スカフォールドコアが、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセタート、トリス−(2−マレイミドエチル)アミン、KTA−ブロミドまたはコール酸を含む又はそれらからなる、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該スカフォールドコアがKTA−ブロミドまたはコール酸である、請求項3記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該スカフォールドコアが、3個のN−ペプチドの結合を可能にする3個の官能基化残基を含む直鎖状ポリペプチド鎖である、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該スカフォールドコアが、
a)CH3CO−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−Lys−Ava−NH2(配列番号41);
b)CH3CO−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2(配列番号42);
c)CH3CO−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2(配列番号43);
d)CH3CO−Cys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−Lys−Arg−NH2(配列番号44);または
e)CH3CO−Cys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−Lys−Glu−NH2(配列番号45)を含む、請求項5記載のgp41ペプチド模倣体。 - 該スカフォールドコアが、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタンを含む炭素環式スカフォールドである、請求項2記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該スカフォールドコアが、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、オキサン、チアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ピペラジン、モルホリンまたはチオモルホリンを含む複素環式スカフォールドである、請求項2記載のgp41ペプチド模倣体。
- 1以上のN−ペプチドが、N51(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号4);N51−2B(QIRELISKIVEQINNILRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号8)またはN51−3B(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHALQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号9)を含む、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 各N−ペプチドがN51(QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(配列番号4)からなる、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該N−ペプチドが、同じ又は異なるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該N−ペプチドが、同じアミノ酸配列からなる、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。
- 1以上のN−ペプチドが、
a)三量体コイルドコイルを形成しうる可溶性α−ヘリックス領域を含むスカフォールド部分と、
b)HIV gp41 NH2末端7アミノ酸反復領域の全部または一部を含むN−ペプチド部分とを含むキメラN−ペプチドであり、ここで、該スカフォールド部分がヘリックス相で該N−ペプチド部分に融合してα−ヘリックスドメインを形成しており、前記の3個のN−ペプチドが互いに相互作用して三量体コイルドコイルを形成している、請求項1記載のgp41ペプチド模倣体。 - 該キメラN−ペプチドのN−ペプチド部分がヘリックス相で該キメラN−ペプチドのスカフォールド部分のCOOH末端に融合している、請求項13記載のgp41ペプチド模倣体。
- 該キメラN−ペプチドのスカフォールド部分が、
a)スズキ(Suzuki)−IZコイルドコイルモチーフ(YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(配列番号31)、
b)IZコイルドコイルモチーフ(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK(配列番号34)、または
c)EZコイルドコイルモチーフ(IEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEK(配列番号37)を含む、請求項13記載のgp41ペプチド模倣体。 - a)KTA(N51)3、
b)KTA(N51−2B)3、
c)KTA(N51−3B)3、
d)chA(N51)3、
e)(CCIZN51)3または
f)SZN51であるgp41ペプチド模倣体。 - KTA(N51)3である、請求項16記載のgp41ペプチド模倣体。
- 請求項1記載のgp41ペプチド模倣体と医薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物。
- 請求項18記載の免疫原性組成物の予防的有効量を哺乳類宿主内に導入することを含む、哺乳類宿主において免疫応答を惹起する方法。
- 該哺乳類宿主がヒトである、請求項19記載の方法。
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