CN112189019A - 产生包含血凝素的广泛保护性疫苗组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及一种用于产生重组血凝素(HA)多肽的基于簇的共有化方法。本公开文本进一步涉及包含所述重组HA多肽的流感疫苗组合物。

Description

产生包含血凝素的广泛保护性疫苗组合物的方法
本申请要求2018年3月28日提交的美国临时申请号62/649,004的优先权权益，将该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2019年3月27日创建的所述ASCII副本被命名为01121-0036-00PCT_SL.txt并且大小为85,964字节。
流感具有大流行、流行、重现和爆发的悠久历史。例如，每年的流感流行被认为导致三至五百万例严重疾病，并且全世界范围内约有290,000至650,000例死亡。当前，疫苗提供了最有效的抗流感防御。世界卫生组织每年都会更新疫苗组合物，以适应循环流感株的变化。但是，由于预测不正确而导致疫苗不匹配，即使在接种疫苗的人群中也可导致很高的发病率和死亡率。
流感病毒在病毒膜表面含有两种结构糖蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA是一种同源三聚体膜蛋白，结合唾液酸并对病毒进入负责。NA负责通过除去唾液酸来从感染细胞释放病毒。当前的流感疫苗通常依赖于诱导识别HA的中和抗体。但是，这种中和抗体通常是株特异性的。因此，HA的变异性(例如，由于抗原转移)可导致免疫逃避和疫苗有效性降低。
因此，仍然需要有效的流感疫苗，其可以提供广泛的、长期的(例如，多季节的)针对流感病毒(包括不匹配的株)的保护。
发明内容
本发明尤其提供了基于簇的共有化(cluster-based consensus，CBC)方法，用于产生能够引起针对多种流感株的广泛反应性免疫应答的HA多肽。在各种实施方案中，所述方法包括：
·选择多于一个流感HA多肽序列并比对所述序列；
·计算成对相似度/不相似度矩阵；
·从所述成对相似度/不相似度矩阵中鉴定并创建相似序列的簇；
·在每个簇中，在所述序列比对中使用成对比对方法确定每个位置是否存在共有氨基酸，其中如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，而如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸；
·为每个簇产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的第一序列；
·任选地，如果分析了一个以上的簇，则通过以下将一个簇中产生的第一序列与另一个簇或多个簇中产生的序列进行比较：
ο为每个簇比对产生的序列；
ο在所述序列比对中使用成对比对方法确定每个位置是否存在共有氨基酸，其中如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，而如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸；以及
ο产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的第二序列；
·在产生的第一序列或产生的第二序列中，通过以下确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸：
ο基于所述第一序列或所述第二序列产生一组测试序列，其中测试氨基酸位于所述可变氨基酸位置；
ο对每个所述测试序列进行分子建模；
ο通过选择导致多肽具有负总能量值的一个或多个氨基酸来确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸；以及
·产生包括所述共有氨基酸的流感HA多肽。
在各种实施方案中，本发明提供了使用本发明的方法产生的HA多肽。在示例性的实施方案中，所述HA多肽包括SEQ ID NO：1-16中任一项的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，本发明进一步涉及包括一种或多种本文所述的HA多肽的三聚体HA蛋白。
在各种实施方案中，本发明的HA多肽和/或三聚体HA蛋白被用作疫苗抗原。在一些实施方案中，所述HA多肽和三聚体HA蛋白提供针对多种流感株、类型或亚型的广泛保护性免疫应答。不希望被理论所束缚，据信所述HA多肽和三聚体HA蛋白可以引起针对流感病毒内多个表位(例如，保守的表位)的中和抗体应答。
本申请的进一步的实施方案如下：
实施方案A 1.一种产生包括共有氨基酸的重组流感血凝素(HA)多肽的方法，其中所述方法包括：
a.选择多于一个流感HA多肽序列并比对所述序列；
b.计算成对相似度/不相似度矩阵；
c.从所述成对相似度/不相似度矩阵中鉴定并创建相似序列的簇；
d.在每个簇中，在所述序列比对中使用成对比对方法确定每个位置是否存在共有氨基酸，其中如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，而如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸；
e.为每个簇产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的第一序列；
f.任选地，如果分析了多个簇，则通过以下将步骤(e)中产生的一个簇的第一序列与另一个簇或多个簇中产生的第一序列进行比较：
i.为每个簇比对在步骤(e)中产生的序列；
ii.在所述序列比对中使用成对比对方法确定每个位置是否存在共有氨基酸，其中如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，而如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸；以及
iii.产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的第二序列；
g.在步骤(e)中产生的所述第一序列或步骤(f)(iii)中产生的所述第二序列中，通过以下确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸：
i.基于所述第一序列或所述第二序列产生一组测试序列，其中测试氨基酸位于所述可变氨基酸位置；
ii.对每个所述测试序列进行分子建模；
iii.通过选择导致多肽具有负总能量值的一个或多个氨基酸来确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸；以及
h.产生包括所述共有氨基酸的重组流感HA多肽。
实施方案A 2.根据实施方案A 1所述的方法，其中比对所述序列包括使用MAFFT、MUSCLE、CLUSTAL OMEGA、FASTA、其组合或任何其他多序列比对软件包。
实施方案A 3.根据实施方案A 1或A 2所述的方法，其中计算所述成对相似度/不相似度矩阵包括使用BLOSUM、PAM、IDENTITY替换矩阵或其组合。
实施方案A 4.根据实施方案A 1-3中任一项所述的方法，其中从所述成对相似度/不相似度矩阵中鉴定和创建相似序列的簇包括使用K-均值聚类、极小极大聚类(minimaxclustering)、主成分分析(PCA)、多维定标(MDS)或其组合。
实施方案A 5.根据实施方案A 1-4中任一项所述的方法，其中分子建模包括与流感HA多肽或蛋白的晶体结构进行比较。
实施方案A 6.根据实施方案A 1-5中任一项所述的方法，其中分子建模包括使用Rosetta或任何其他分子建模软件。
实施方案A 7.根据实施方案A 1-6中任一项所述的方法，其中所述测试氨基酸包括蛋白中发现的任何天然或非天然氨基酸。
实施方案A 8.一种使用实施方案A 1-7中任一项的方法产生的重组流感HA多肽。
实施方案A 9.根据实施方案A 8所述的重组流感HA多肽，其中所述多肽包括选自SEQ ID NO：1-16中任一项的氨基酸序列或其片段，或与SEQ ID NO：1-16中任一项具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或其片段。
实施方案A 10.一种重组三聚体HA蛋白，其包含根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽中的一种或多种。
实施方案A 11.一种分离的核酸，其编码根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽或根据实施方案A 10所述的重组三聚体HA蛋白。
实施方案A 12.一种载体，其包含根据实施方案A 11所述的核酸。
实施方案A 13.一种分离的细胞，其包含根据实施方案A 12所述的载体。
实施方案A 14.根据实施方案A 13所述的分离的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施方案A 15.根据实施方案A 14所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是HEK293T细胞或CHO细胞。
实施方案A 16.根据实施方案A 13所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是昆虫细胞。
实施方案A 17.一种融合蛋白，其包含根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽或根据实施方案A 10所述的重组三聚体HA蛋白。
实施方案A 18.一种流感病毒样颗粒(VLP)，其包含根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽或根据实施方案A 10所述的重组三聚体HA蛋白。
实施方案A 19.根据实施方案A 18所述的流感VLP，其还包含流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(M1)蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)gag蛋白或其组合中的一种或多种。
实施方案A 20.一种药物组合物，其包含根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽、根据实施方案A 10所述的重组三聚体HA蛋白、根据实施方案A 17所述的融合蛋白或根据实施方案A 18或A 19所述的流感VLP，以及药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
实施方案A 21.根据实施方案A 20所述的药物组合物，其中所述组合物引发针对一种或多种流感株、类型和/或亚型的免疫应答。
实施方案A 22.一种使受试者对流感病毒免疫的方法，其包括向所述受试者给予有效量的根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽、根据实施方案A 10所述的重组三聚体HA蛋白、根据实施方案A 17所述的融合蛋白、根据实施方案A 18或A 19所述的流感VLP、或根据实施方案A 20或A 21所述的药物组合物。
实施方案A 23.一种在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，其包括向所述受试者给予有效量的根据实施方案A 8或A 9所述的重组HA多肽、根据实施方案A 10所述的重组三聚体HA蛋白、根据实施方案A 17所述的融合蛋白、或根据实施方案A 18或A 19所述的流感VLP、或根据实施方案A 20或A 21所述的药物组合物。
实施方案A 24.根据实施方案A 22或实施方案A 23所述的方法，其中所述流感病毒是季节性或大流行流感病毒。
实施方案A 25.根据实施方案A 23或A 24所述的方法，其中所述免疫应答包括产生针对一种或多种流感病毒株、类型或亚型的抗体。
实施方案A 26.根据实施方案A 22-A 25中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
实施方案A 27.根据实施方案A 26所述的方法，其中所述受试者是人类。
实施方案A 28.根据实施方案A 22-A 27中任一项所述的方法，其中所述给予是通过肌内、鼻内、皮内、皮下、口服或静脉内途径进行的。
其他目的和优点将部分阐述于下文说明中，并且部分将从说明显而易见，或可通过实践来获知。这些目的和优点将借助在所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
应了解，上文的一般说明与下文的详细说明均仅是示例性和解释性的，并且不是对权利要求的限制。
并入本说明书并构成本说明书一部分的附图说明了一个(几个)实施方案，并且与说明书一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A-1B显示了用于设计HA多肽的示例性基于簇的共有化(CBC)方法。图1A描绘了通过主成分分析(PCA)生成HA序列簇。鉴定出八个HA序列簇，并且表示为圆圈。图1B说明了实施例1中所述的层级分配和组装顺序。
图2说明了各种层级1、层级2和层级3 CBC HA多肽已正确折叠并保留了功能。所述CBC HA多肽在293FT细胞中表达，并使用已知能识别球形头部(即CH65、5J8和4K8)或茎(即C179)区域中保守的表位的单克隆抗体检测表面表达。
图3说明了使用反向遗传学系统回收表达CBC HA蛋白的甲型流感病毒。通过噬菌斑测定和血凝素活性确定了具有层级1和层级2 CBC HA序列(即HAco3M、HAco4M、HAco5M和HAcb345M)的重组甲型流感病毒的成功收回。
图4提供了实施例3中所述的免疫原性研究的示意图。
图5A-5G显示了如噬菌斑减少中和试验(PRNT)所确定的，表达CBC HA序列的重组病毒诱导了中和抗体应答。
图6显示了如通过血凝素抑制(HAI)测定所确定的，表达CBC HA序列的重组病毒诱导了中和抗体应答。
图7A-7B显示了如通过抗体取证(AF)测定所确定的，表达CBC HA序列的重组病毒诱导了抗体结合。给出了野生型病毒(图7A和7C)和层级病毒(图7B和7D)的结果。
图8提供了实施例4中所述的VLP免疫研究的示意图。
图9显示了如通过血凝素抑制(HAI)测定所确定的表达各种CBC HA蛋白的VLP的免疫原性图谱。在每个小组中(以竖线分隔)，测试的病毒从左到右是A/加利福尼亚州/07/09；A/新泽西州/10/76；A/波多黎各/8/1934；A/福特/蒙茅斯/1/1947；A/USSR/90/1977；A/巴西/11/1978；A/智利/1/1983；A/台湾/1/86；A/德克萨斯州/36/91；A/北京/262/1995；A/新喀里多尼亚/20/99；A/所罗门群岛/3/2006；和A/布利斯班/59/2007。
图10显示了如通过微中和(MN)测定所确定的表达各种CBC HA蛋白的VLP的免疫原性图谱。在每个小组中，测试的病毒从左到右是A/加利福尼亚州/07/09；A/新泽西州/10/76；A/波多黎各/8/1934；A/福特/蒙茅斯/1/1947；A/USSR/90/1977；A/巴西/11/1978；A/智利/1/1983；A/台湾/1/86；A/德克萨斯州/36/91；A/北京/262/1995；A/新喀里多尼亚/20/99；A/所罗门群岛/3/2006；和A/布利斯班/59/2007。
序列说明
Figure BDA0002788129590000071
Figure BDA0002788129590000081
Figure BDA0002788129590000091
Figure BDA0002788129590000101
Figure BDA0002788129590000111
具体实施方式
定义
佐剂：如本文所用，佐剂是指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可以包括但不限于上面吸附了抗原的矿物质(例如，明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；油包水或水包油乳剂，其中抗原溶液在矿物油或水中乳化(例如，弗氏不完全佐剂)。有时包括杀死的分枝杆菌(例如，弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG基序)也可以用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还可以包括生物分子，如Toll样受体(TLR)激动剂和共刺激分子。示例性生物佐剂包括但不限于IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-a、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、41 BBL或其组合。
抗体：如本文所用，抗体是指包括足以赋予与特定抗原特异性结合的典范免疫球蛋白序列元件的蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述抗体是经典抗体，其包括两个重链和两个轻链。每条重链包括一个可变区(例如，VH)和至少三个恒定区(例如，CH1、CH2和CH3)，并且每条轻链包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。所述可变区决定了抗体的特异性。每个可变区包括三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其两侧是四个相对保守的框架区(FR)。称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR有助于所述抗体结合特异性。在一些实施方案中，抗体还指“抗体片段(antibody fragment或antibody fragments)”，其包括完整抗体的一部分，如例如抗体的抗原结合区或可变区。“抗体片段”的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和多特异性抗体中包括的含CDR的部分。在某些实施方案中，包括如在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或用作“抗体”，无论这种多肽是天然产生的(例如，由有机体对抗原反应而产生的)，或通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，抗体是单克隆的；在一些实施方案中，抗体是多克隆的。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化的。
抗原：如本文所用，抗原是指暴露于生物体或给予至生物体时引发免疫应答的试剂，和/或与T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)结合的因子或与抗体(例如，由B细胞产生的)结合的因子。在一些实施方案中，抗原在生物体中引发体液应答(例如，包括抗原特异性抗体的产生)。可替代地或另外地，在一些实施方案中，抗原在生物体中引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。本领域技术人员将认识到，特定抗原可以在靶标生物体(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人类)的一个或几个成员中引发免疫应答，而不是在靶标生物体物种的所有成员中都引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在靶标生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原结合抗体和/或T细胞受体，并且可以诱导或可以不诱导生物体中的特定生理反应。在一些实施方案中，例如，抗原可以在体外与抗体和/或T细胞受体结合，无论这种相互作用是否在体内发生。在一些实施方案中，抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应，包括由异源免疫原诱导的那些。在一些实施方案中，流感HA多肽或其免疫原性片段是抗原。
抗原漂移：如本文所用，抗原漂移是指HA或NA抗原中相对频繁发生的突变。抗原漂移会使流感病毒逃避免疫识别，并可能降低疫苗功效。
抗原转移：如本文所用，抗原转移是指HA或NA抗原的重大变化，其由不同流感株之间遗传物质的重配引起。
大约：如本文所用，在应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或者上下文另有明确含义，否则术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围(这个数字会超过可能值的100％的情况除外)。
表位：如本文所用，是指全部或部分被免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施方案中，当抗原采用相关的三维构象时，此类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采用这种构象时，此类化学原子或基团在空间上在物理上彼此靠近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，被线性化的)时，至少一些化学原子或基团在物理上彼此分离。
头部区域：如本文所用，术语“头部区域”是指流感HA蛋白的膜远端球状结构域。所述HA头部区域介导受体结合并且存在于HA蛋白的HA1亚基内。
血凝素或HA蛋白：如本文所用，血凝素或HA蛋白是指流感病毒膜表面上的整合膜糖蛋白。具体而言，所述HA蛋白通常在流感病毒粒子表面上表达为同源三聚体复合物。单独的HA单体多肽可进一步分离到膜远端球状头部区域和膜近端茎区域。所述HA蛋白负责介导病毒附着以及随后与靶标细胞的膜融合。当前，至少有18种已知的HA亚型(即H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18)，其通过它们与抗体的相互作用来定义。人类通常被H1、H2和H3亚型病毒感染。在一些实施方案中，所述HA蛋白可以是单体的并且包括单个HA多肽。在其他实施方案中，所述HA蛋白是三聚体并且包括三个HA多肽。如本文所用，“血凝素多肽”或“HA多肽”是指其氨基酸序列包括HA的至少一个特征序列的多肽。HA多肽可包括全长流感HA多肽序列及其片段。本领域普通技术人员可以容易地鉴定如下的序列，这些序列通常为HA多肽和/或特定HA多肽(例如，H1、H2或H3多肽)或者介导特定宿主(例如，禽类、骆驼、犬、猫、灵猫、马、人类、豹、貂、小鼠、海豹、石貂(stone martin)、猪、老虎、鲸鱼等)感染的HA的特征。美国国家生物技术信息中心(NCBI)维护着HA多肽序列的数据库。
宿主：如本文所用，术语“宿主”是指其中存在目的多肽的系统(例如，细胞、生物体等)。在一些实施方案中，宿主是易受特定感染因子感染的系统。在一些实施方案中，宿主是表达特定目的多肽或蛋白的系统。
宿主细胞：如本文所用，“宿主细胞”是指已引入外源DNA(重组或其他)的细胞。例如，可使用宿主细胞通过标准重组技术产生本文所述的流感HA多肽。本领域技术人员理解，此类术语不仅指特定受试者细胞，而且指这种细胞的子代。因为某些修饰可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语“宿主细胞”范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括适合于表达外源DNA(例如，重组核酸序列)的任何原核和真核细胞。示例性细胞包括原核或真核细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种的菌株等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合体(例如，杂交瘤或四重杂交瘤)。在一些实施方案中，所述细胞是人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞，并且选自但不限于CHO(例如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、支持细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和衍生自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，所述细胞包括一种或多种病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6TM细胞)。
免疫应答：如本文所用，术语“免疫应答”是指免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御反应的身体的任何细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天和/或适应性免疫应答。如本文所用，保护性免疫应答是指保护受试者免于感染(例如，预防感染或预防与感染有关的疾病发展)的免疫应答。测量免疫应答的方法是本领域公知的，并且包括例如，通过测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。
免疫原：如本文所用，术语“免疫原”是指能够在适当条件下刺激动物中的免疫应答(如抗体产生或T细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物。如本文所用，“免疫原性组合物”是包含免疫原(如HA多肽或三聚体HA蛋白)的组合物。如本文所用，“免疫”是指使受试者免于传染性疾病，如通过疫苗接种。
流感病毒：如本文所用，是指属于正粘病毒科的分段负链RNA病毒。
流感疫苗：如本文所用，是指能够刺激免疫应答的免疫原性组合物，其被给予以预防、改善或治疗流感病毒感染。流感疫苗可以包含例如，减毒或杀死的(例如，裂解)流感病毒、病毒样颗粒(VLP)和/或抗原性多肽或蛋白(例如，本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白)或衍生自它们的DNA，或此类免疫原性材料的任何重组形式。流感疫苗还包括基于DNA和病毒载体的疫苗。本文考虑的疫苗可任选地包括一种或多种佐剂。
分离的：如本文所用，是指一种药剂或实体，所述药剂或实体(i)在最初产生时(无论是在自然界中还是在实验环境中)与至少一些与其缔合的组分分离；或(ii)由人工生产。分离的试剂或实体可以与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其最初所缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则这种物质是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员将理解的，在与某些其他组分如例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合后，物质仍可被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，在不包括此类载体或赋形剂的情况下计算了物质的分离百分比或纯度。在示例性实施方案中，在以下情况时，生物聚合物如自然发生的多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：a)由于其来源或衍生源未与自然界中的天然状态下随附的部分或全部组分缔合；b)它基本上不含来自与自然界中产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸；c)由并非自然界中产生其的物种的细胞或其他表达系统表达或与来自并非自然界中产生其的物种的细胞或其他表达系统的组分缔合。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成的或在不同于在自然界中产生其的细胞系统的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施方案中，已经经历一种或多种纯化技术的多肽可以被认为是“分离的”多肽，程度是，其已经与a)在自然界中与其缔合的和/或b)最初产生时与其缔合的其他组分分离。
爆发：如本文所用，流感病毒“爆发”是指给定年份中来自单个国家的病毒分离株的集合。
大流行流感、季节性流感和猪流感株：如本文所用，“大流行”流感株是已引起人群大流行感染或者具有引起人群大流行感染的能力的流感株。在一些实施方案中，大流行流感株已引起大流行感染。在一些实施方案中，这种大流行感染涉及跨多个地域的流行感染。在一些实施方案中，大流行感染涉及跨越彼此分开的地域(例如，被山脉、水域分开，作为不同大陆的一部分等，使得感染通常不会在它们之间传播)的感染。在一些实施方案中，大流行流感株包括源自人流感病毒与禽流感病毒或猪流感病毒之间的重配(大约每20-30年发生抗原转移)的那些，所述重配导致具有禽类或猪来源的新型HA或NA的病毒，人类对该病毒缺乏免疫力。换句话说，由于先前的疫苗接种或先前的暴露，所述人群被认为是初始的，没有或仅有很少的抵抗力。大流行流感株和季节性流感株在抗原上截然不同，而且在序列上也大不相同。一般而言，季节性流感株可以定义为特定季节或特定年份(例如，1986年至2009年)的循环毒株(包括非大流行的2009序列)和具有基本上相似的编码抗原区域遗传序列的其他株(即在抗原序列空间中相似)。猪流感株是指与猪中流行的病毒有关的任何流感株。示例性大流行流感株包括但不限于A/加利福尼亚州/07/2009、A/加利福尼亚州/04/2009、A/比利时/145/2009、A/南卡罗来纳州/01/1918和A/新泽西州/1976。大流行亚型尤其包括H5N1、H2N2、H9N2、H7N7、H7N3、H7N9和H10N7亚型。示例性季节性流感株包括但不限于A/波多黎各/8/1934、A/福特/蒙茅斯/1/1947、A/智利/1/1983、A/德克萨斯州/36/1991、A/新加坡/6/1986、A/北京/32/1992、A/新喀里多尼亚/20/1999、A/所罗门群岛/03/2006和A/布利斯班/59/2007。示例性猪流感株包括但不限于A/新泽西州/1976分离株和A/加利福尼亚州/07/2009。其他大流行流感、季节性流感和/或猪流感株是本领域已知的。
预防：如本文所用，是指预防、避免疾病表现、延迟发作和/或减少特定疾病、障碍或病症(例如，感染，例如流感病毒感染)的一种或多种症状的频率和/或严重程度。在一些实施方案中，预防是以群体为基础进行评估的，使得如果在易感疾病、障碍或病症的群体中观察到所述疾病、障碍或病症的一个或多个症状的发展、频率和/或强度在统计学上显著降低，则认为药剂“预防”了特定疾病、障碍或病症。
重组：如本文所用，术语“重组”是指通过重组方式设计、工程化、制备、表达、创建或分离的多肽或蛋白(例如，本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白)，如，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽、从重组组合多肽文库中分离的多肽、或通过涉及将选择的序列元件相互剪接的任何其他方式制备、表达、创建或分离的多肽。在一些实施方案中，自然界中发现一种或多种此类选择的序列元件。在一些实施方案中，一种或多种此类选择的序列元件是计算机设计的。在一些实施方案中，一种或多种此类选择的序列元件是由例如天然或合成来源的已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生的。在一些实施方案中，一种或多种此类选择的序列元件是由非天然存在于同一多肽(例如，来自两个独立的HA多肽的两个表位)中的多个(例如，两个或更多个)已知序列元件的组合产生的。
茎区域：如本文所用，术语“茎区域”或“茎秆区域”是指从流感HA蛋白的球状头部结构域出现的膜近端细长结构域。所述茎区域介导膜融合，并且由HA蛋白的HA1和HA2亚基的序列区域组成。
信号序列、分泌信号或分泌信号肽：如本文所用，所述术语是指发出从细胞分泌的信号的肽序列。分泌信号可导致分泌在其他情况下不会分泌的多肽或蛋白。
三聚化结构域：如本文所用，所述术语是指编码导致多肽或蛋白的三聚体组装的结构域的氨基酸序列。对于特定蛋白质而言非天然的三聚化结构域可以被称为人工或异源三聚化结构域。示例性三聚化结构域包括但不限于胶原的三聚化结构域、基于GCN4的异亮氨酸拉链、HIV gp41三聚化结构域或T4噬菌体纤维蛋白折叠子(Fd)三聚化结构域。
序列同一性：氨基酸序列或核酸序列之间的相似度以序列之间的相似度和/或同一性表示。序列相似度可以包括具有序列同一性的元件和同源性上紧密相关的序列。序列相似度经常用百分比相似度(或同一性或同源性)来测量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，给定基因或蛋白的同源物或变体将具有相对较高程度的序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。现有技术中描述了各种程序和比对算法：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene 73：237-244，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153，1989；Corpet等，NucleicAcids Research 16：10881-10890，1988；以及Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988.Altschul等，Nature Genet.6：119-129，1994。可以从若干来源(包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，贝塞斯达，马里兰))获得NCBI基本局部比对搜索工具
Figure BDA0002788129590000181
(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。
受试者：如本文所用，是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“受试者”是指人类。在一些实施方案中，“受试者”是指非人类动物。在一些实施方案中，受试者包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或虫。在某些实施方案中，所述非人类受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，受试者可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。在本发明的某些实施方案中，所述受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，使用术语“个体”或“患者”，并且旨在可与“受试者”互换。本发明还考虑了药物组合物的给予和/或子宫内治疗方法的执行。
疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种”或“给......接种疫苗”是指旨在产生免疫应答的组合物的给予，例如针对致病因子的免疫应答。可以在暴露于致病因子之前、之中和/或之后，和/或形成一种或多种症状之前，并且在一些实施方案中，在暴露于所述因子之前、之中和/或之后，给予疫苗接种。在一些实施方案中，疫苗接种包括在时间上适当间隔多次给予疫苗组合物。
病毒样颗粒(VLP)：如本文所用，短语“病毒样颗粒”或“VLP”是指类似于病毒但缺乏任何病毒遗传物质的颗粒，因此是非传染性的。通过在包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母和植物细胞在内的各种细胞培养系统中异源表达，可以产生“病毒样颗粒”或“VLP”。另外，可以通过本领域已知的方法纯化VLP。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽和/或NA多肽。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或结构多肽。在一些某些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或流感M1多肽。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或HIVgag多肽。本领域技术人员意识到，其他病毒结构蛋白可以用作本文举例说明的那些的替代物。流感VLP可以通过用编码HA和NA蛋白以及任选地M1蛋白和/或HIV gag蛋白的质粒转染宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)来产生。将转染的细胞孵育适当时间以允许蛋白表达后，可以从细胞培养上清液中分离VLP。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP通过在哺乳动物细胞(例如，人类细胞)中瞬时转染而产生。在一些实施方案中，通过使用一种或多种测定来分析流感VLP。例如，可以通过动态光散射来分析流感VLP粒径，并且还可以通过蛋白染色来分析此类VLP的血凝素活性和血凝素含量定量。
野生型：如本领域中所理解的，术语“野生型”通常是指自然界中发现的蛋白或核酸的正常形式。例如，在流感病毒的天然分离物中发现了野生型HA多肽。在NCBI流感病毒序列数据库中可以发现各种不同的野生型HA序列。
设计血凝素(HA)多肽的方法
与产生共有流感蛋白序列相关的重大挑战涉及时间和地理序列偏差。存在这种偏差的部分原因是，公共和/或私有序列数据库中提供的序列记录通常严重偏向于较新的序列。进一步地，与某些地理区域(如美国)相关的序列通常过度代表。在一方面，本发明提供了使用基于簇的共有化方法来产生包含共有氨基酸的流感HA多肽的新颖方法，所述基于簇的共有化方法克服了此类时间和地理序列偏差。本发明的方法与系统发育信息无关，并且仅取决于一级氨基酸序列中包含的信息。因此，本方法能够产生HA多肽序列，其反映总体序列多样性并且不偏向于时间或地理上过度代表的序列。
在各种实施方案中，所述方法涉及基于对多个流感HA序列之间的序列变异的计算机分析来设计HA多肽序列，应用基于共有序列的算法来产生相似序列的簇，以及对具有共有氨基酸序列的HA多肽进行结构分析。在一些实施方案中，本方法产生可以使用如K-均值、极小极大聚类和最远优先(Farthest-First)聚类的工具聚类的成对相似度/不相似度矩阵。可替代地或另外地，使用如多维定标(MDS)或主成分分析(PCA)的排序技术以紧凑表示来可视化成对相似度/不相似度矩阵，以便定义适当的簇(例如，以分离并定义簇的数量)。更进一步地，本方法利用分子建模和对晶体结构的比较来解析共有序列内的可变氨基酸位置，并对可能正确折叠并因此起作用的候选物进行排序。
不希望受理论的束缚，据信本发明的方法产生了包括跨不同流感株、类型和/或亚型的保守表位的HA多肽。因此，在各种实施方案中，本方法产生能够诱导针对广泛范围的流感株(例如，一种或多种季节性流感、大流行流感或猪流感株)、流感类型(例如一种或多种甲型、乙型或丙型流感)和/或流感亚型(例如，一种或多种流感亚型，如但不限于H1N1、H3N2或H5N1)的增强的交叉反应性免疫应答的HA多肽。
在一些实施方案中，本方法包括选择各种流感HA多肽序列。可以在序列数据库中找到各种不同的HA序列，如美国国家生物技术信息中心(NCBI)流感病毒序列数据库。在一些实施方案中，选择唯一序列的非冗余子集用于序列比对。
在一些实施方案中，本方法包括比对流感HA多肽序列。可以使用本领域已知的任何多序列比对工具。参见，例如，Katoh和Kuma(2002)NAR，30：3059；Katoh和Standley(2013)Mol BioL Evol 30：772；Edgar，R.C.(2004)NAR，32：1792；Edgar，R.C.(2004)BMC Bioinf，113；Sievers等(2011)Mol Sys Biol 7：539；以及Pearson和Lipman.(1988)PNAS，85：2444)。可用于本发明的示例性序列比对工具包括但不限于MAFFT、MUSCLE、CLUSTAL OMEGA、FASTA或其组合。
在一些实施方案中，特定序列区域可能从进一步的分析中掩避掉。例如，HA信号肽序列、跨膜结构域序列、细胞质尾序列或任何其他保守的HA结构域中的任何一种都可能从进一步的分析中掩避掉。
在一些实施方案中，本方法包括从比对的序列计算成对相似度/不相似度矩阵。可以使用用于计算两个或更多个序列之间的距离的任何方法。用于计算成对相似度/不相似度矩阵的示例性工具包括但不限于BLOSUM、PAM、IDENTITY替换矩阵或其组合。在一个实施方案中，可以使用用于计算成对相似度/不相似度矩阵的替代方法，如FastTree(Price，M.N.，Dehal，P.S.，以及Arkin，A.P.(2009)Molecular Biology and Evolution 26：1641-1650)。
在一些实施方案中，本方法还包括从成对相似度/不相似度矩阵中鉴定并创建相似序列的簇。用于鉴定相似序列的簇的示例性工具包括但不限于K-均值聚类、极小极大聚类、最远优先聚类、主成分分析(PCA)、多维定标(MDS)或其组合。在一个实施方案中，利用了用于聚类的K-均值方法(参见Hartigan，J.A.等(1979)Journal of the RoyalStatistical Society，Series C，Applied Statistics，28(1)：100-108)。在另一个实施方案中，利用极小极大聚类(例如，相似度矩阵的极小极大连接分层聚类)(参见，Bien，J.等，(2011)The Journal of the American Statistical Association)。在进一步的实施方案中，使用最远优先遍历(参见Rosenkrantz等(1977)SIAM J Comp，6：563)。
在一些实施方案中，排序技术可以用于从成对相似度/不相似度矩阵中鉴定和创建相似序列的簇。例如，在一些实施方案中，将PCA用于成对相似度/不相似度矩阵的降维。可以利用PCA将高维成对相似度/不相似度矩阵转换成较低维的子空间，以方便可视化和鉴定相似序列的簇(参见Pearson，K.(1901)Philosophical Magazine 2(11)：559-572；以及Hotelling，H.(1933)Journal of Educational Psychology，24，417-441，以及498-520)。在进一步的实施方案中，使用多维定标(MDS)。MDS是指计算和可视化多维数据集相似度和不相似度的水平并发现最大程度地再现一组点的所有对之间距离的一组降维的方法。在一些实施方案中，MDS用于将每个物体放置在N维空间中，从而保持物体之间的距离。在一些实施方案中，MDS允许展示距离矩阵中包含的信息。在一些实施方案中，MDS将所述HA序列放置在降维空间中，从而准确地维持病毒序列对之间的相对距离。在一些实施方案中，MDS克服了系统发育方法中的缺点，因为在重配和/或重组的存在下系统发育方法可能不一致。在一些实施方案中，MDS过滤掉流感病毒中随机的中性取代。在各种实施方案中，如MDS或PCA等的排序技术帮助将高维成对的距离矩阵转换成较低维的子空间，以方便可视化和鉴定簇。
在一些实施方案中，本文所述的方法创建多于一个的相似序列簇(例如，季节性流感样、大流行流感样或猪流感样序列)。提出了用于本文所述的方法的示例性序列簇，但不限于图1A和1B中的那些。
在一些实施方案中，在每个簇内，基于多重序列比对中每个位置上最频繁的氨基酸来计算共有序列。例如，如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高(或任何其他用户定义的阈值)，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸。可替代地，如果给定位置的氨基酸频率小于50％(或任何其他用户定义的阈值)，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸。在一些实施方案中，为每个簇产生第一序列，其包括共有氨基酸和可变氨基酸。在一些实施方案中，为每个簇产生的第一序列被指定为簇内共有序列。
在一些实施方案中，为多个序列簇产生共有序列。在此类实施方案中，基于指定的结果属性合并用于多个簇的所选择的簇内共有序列，以便得出其他的共有序列。例如，可以合并与特定地理区域、宿主或时间段相关的簇内共有序列，以产生跨簇共有序列(例如，第二序列)。
在各种实施方案中，为了生成跨簇共有序列，将从一个簇中产生的簇内共有序列(例如，第一序列)与从另一个簇或多个簇中产生的簇内共有序列(例如，第一序列)进行比较。在一些实施方案中，将所述产生的序列彼此进行比对。在一些实施方案中，利用成对比对方法来确定比对中每个位置是否存在共有氨基酸。如前所述，如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高(或任何其他用户定义的阈值)，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，并且如果给定位置的氨基酸频率小于50％(或任何其他用户定义的阈值)，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸。在一些实施方案中，由这种多簇分析产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的跨簇共有序列(例如，第二序列)。在各种实施方案中，可以迭代地进行比对序列和确定每个位置处的共有氨基酸的过程，直到考虑了所有目的序列簇为止。
在一些实施方案中，进行其他步骤以确定产生的簇内共有序列和/或跨簇共有序列(例如，第一序列和/或第二序列)内每个可变氨基酸位置的共有氨基酸。在此类实施方案中，基于共有序列(例如，第一序列和/或第二序列)产生一组测试序列，其中将测试氨基酸放置在可变氨基酸位置。本文所述方法中使用的测试氨基酸涵盖蛋白中发现的任何天然或非天然(例如，非经典)氨基酸，包括必需和非必需氨基酸。示例性氨基酸包括下表2中提供的氨基酸以及本文其他地方描述的氨基酸。
表2
必需 非必需
组氨酸(H) 丙氨酸(A)
异亮氨酸(I) 精氨酸(R)
亮氨酸(L) 天冬氨酸(D)
赖氨酸(K) 半胱氨酸(C)
甲硫氨酸(M) 谷氨酸(E)
苯丙氨酸(F) 谷氨酰胺(Q)
苏氨酸(T) 甘氨酸(G)
色氨酸(W) 脯氨酸(P)
缬氨酸(V) 丝氨酸(S)
酪氨酸(Y)
天冬酰胺(N)
硒代半胱氨酸(U)
吡咯赖氨酸(O)
在各种实施方案中，本方法考虑使用分子建模来分析测试序列。在一些实施方案中，对每个测试序列进行分子建模。在一些实施方案中，分子建模包括与正在分析的流感蛋白(即HA)的晶体结构的比较。这种晶体结构信息可容易地从例如蛋白质数据库获得。在一个实施方案中，所述分子建模包括使用Rosetta(https：//www.rosettacommons.org/software)或任何其他类似的分子建模软件(参见例如，Leaveer-Fay等(2011)Meth.Enzymol.487：545-74)。例如，为了解析所述共有序列中可变氨基酸位置，可使用Rosetta中的Metropolis-Monte Carlo模拟退火方案来对存在于所鉴定的变异位点的氨基酸残基的所有可能组合的取代进行采样。然后根据能量值对可能的取代进行评分。
在一些实施方案中，通过选择导致HA多肽具有与起始值相似或低于起始值的计算总能量值的一个或多个氨基酸来确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸。在一些实施方案中，通过选择导致HA多肽具有负总能量值的一个或多个氨基酸来确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸。不希望受理论的束缚，据信具有负总能量评分的HA多肽更可能折叠成稳定的蛋白，而具有正能量评分的多肽较不可能正确折叠。在一些实施方案中，产生一种或多种HA多肽并根据它们的阴性总能量评分和/或与参考结构的比较对其排序。
在各种实施方案中，本方法产生在各个位置上包括共有氨基酸的HA多肽序列。表1提供了使用本发明的方法产生的示例性HA多肽(即，SEQ ID NO：1-16)。
血凝素(HA)多肽和蛋白质
在另一方面，本发明提供了使用本文所述的方法产生的HA多肽。在一些实施方案中，所述HA多肽包括共有氨基酸序列，并且能够引发针对多种流感株(例如，一种或多种大流行流感、季节性流感和/或猪流感株)、类型(例如，一种或多种甲型、乙型和/或丙型流感病毒)和/或亚型(例如，H1N1、H3N2或H5N1中的一种或多种)的免疫应答。因此，在一些实施方案中，可以将所述HA多肽作为抗原掺入疫苗组合物中以提供改善的针对流感的保护性免疫。
在一些实施方案中，本发明提供了一种HA多肽，其包括选自SEQ ID NO：1-16中任一项的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述HA多肽包括与SEQ ID NO：1-16中任一项具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或其片段。
例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种HA多肽，其包括SEQ ID NO：1-16中任一个的片段。在示例性实施方案中，所述HA多肽可缺乏信号肽。在另一个示例性实施方案中，所述HA多肽可缺乏跨膜结构域。
在一些实施方案中，本发明提供了一种HA多肽，其具有相对于SEQ ID NO：1-16中任一项的一个或多个氨基酸突变或其片段。例如，所述HA多肽可包括相对于SEQ ID NO：1-16中任一项或其片段的约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个、约30个、约31个、约32个、约33个、约34个、约35个、约36个、约37个、约38个、约39个、约40个、约41个、约42个、约43个、约44个、约45个、约46个、约47个、约48个、约49或约50个氨基酸突变。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可独立地选自取代、插入、缺失和截短。在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
可例如基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行保守取代。例如，可将20种天然存在的氨基酸分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；Gln、Asn；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。如本文所用，将“保守取代”定义为氨基酸与以上所示的六个标准氨基酸组的相同组中列出的另一个氨基酸的交换。例如，通过Glu交换Asp会在修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸破坏α-螺旋的能力，它们可彼此取代。如本文所用，将“非保守取代”定义为氨基酸与在以上所示的六个标准氨基酸组的不同组中列出的另一个氨基酸的交换。
在各种实施方案中，所述取代还可包括非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计氨基酸(designer amino acid)(如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)和一般的氨基酸类似物)。
在各种实施方案中，本发明进一步提供了包含三个HA多肽的三聚体HA蛋白。在一些实施方案中，所述三聚体HA蛋白内的至少1、至少2或全部3个HA多肽包括如本文所述的氨基酸序列。例如，所述三聚体HA蛋白的至少1、至少2或全部3个HA多肽可包括SEQ ID NO：1-16的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述三聚体HA蛋白包括三个相同的HA多肽。在其他实施方案中，所述三聚体HA蛋白包括两个或更多个具有不同氨基酸序列的不同HA蛋白。
在各种实施方案中，本发明进一步提供了一种融合蛋白，其包含本发明的HA多肽或其片段。
在各种实施方案中，本发明的HA多肽可包括三聚化序列或三聚化结构域，其促进单体HA多肽组装成三聚体HA蛋白。在一些实施方案中，所述HA多肽可包括促进三聚化的序列或结构域，其存在于天然流感分离物中发现的HA多肽中。例如，所述HA多肽可包括在包括茎区域的HA2序列中发现的序列，已知所述序列促进三聚体形成。在其他实施方案中，所述HA多肽可包括非天然存在于野生型HA多肽中的工程化或异源三聚化序列或三聚化结构域。在各种实施方案中，可以将所述HA多肽工程化以包括任何三聚化序列或三聚化结构域。示例性三聚化序列包括但不限于形成共价或非共价交联的氨基酸，并且三聚化结构域包括但不限于胶原蛋白的三聚化结构域、基于GCN4的异亮氨酸拉链、HIV gp41三聚化结构域或T4噬菌体纤维蛋白折叠子(Fd)三聚化结构域。
在一些实施方案中，所述HA多肽可包括分泌信号肽。在一个实施方案中，所述分泌信号肽的掺入允许从宿主细胞分泌HA多肽或三聚体HA蛋白。在另一个实施方案中，所述分泌信号肽的掺入允许纯化来自用于蛋白表达和生产的宿主细胞(例如，宿主细胞的上清液)的HA多肽或三聚体HA蛋白。
考虑的是，可以将本领域已知的任何分泌信号肽掺入本发明的HA多肽中。在一些实施方案中，所述分泌信号肽对于用于蛋白表达和生产的宿主细胞是特异性的。示例性分泌信号肽包括但不限于CD33信号肽序列、人类IgG κ轻链信号肽(用于在人类细胞中表达)、蜜蜂蜂毒肽信号序列(用于在昆虫细胞中表达)和酵母α因子信号序列(用于在酵母细胞中表达)。在示例性实施方案中，所述分泌信号序列是CD5分泌信号肽。在一个实施方案中，所述CD5分泌信号肽包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述HA多肽包括其他的功能序列，如接头序列。在一些实施方案中，所述接头是多肽。在一些实施方案中，所述接头的长度小于约100个氨基酸。例如，所述接头的长度可以小于约100、约90、约80、约70、约60、约50、约40、约30、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。
在各种实施方案中，所述接头基本上由甘氨酸和/或丝氨酸残基(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％的甘氨酸及丝氨酸)组成。例如，在一些实施方案中，所述接头是(Gly4Ser)n，其中n是约1至约8，例如，1、2、3、4、5、6、7或8(SEQ ID NO：19)。在一个实施方案中，所述接头序列是GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：20)。其他说明性接头包括但不限于具有序列LE、GGGGS(SEQID NO：21)、(GGGGS)n(n＝1-4)(SEQ ID NO：22)、(Gly)8(SEQ ID NO：23)、(Gly)6(SEQ IDNO：24)、(EAAAK)n(n＝1-3)(SEQ ID NO：25)、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID NO：26)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO：27)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO：28)、PAPAP(SEQ IDNO：29)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：30)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：31)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：32)和(XP)n(其中X表示任何氨基酸，例如，Ala、Lys或Glu)的接头。在一个示例性实施方案中，所述接头是GGS或GSG。在另一个示例性实施方案中，所述接头是SA。
在一些实施方案中，所述HA多肽还包括功能标签序列(例如，以促进蛋白纯化)。非限制性地，所述HA多肽可以包括亲和标签，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚组氨酸(例如，6xHis(SEQ ID NO：33))、蛋白A、基于链霉亲和素/生物素的标签，以及任何其他本领域已知的蛋白标签。
在一些实施方案中，所述HA多肽还包括蛋白酶切割位点，如凝血酶切割位点、胰蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点或本领域已知的任何其他蛋白酶切割位点。
在各种实施方案中，本文所述的HA多肽(或三聚体HA蛋白)提供了改善的针对一系列具有不同序列的流感病毒的保护性免疫(例如，广泛反应性免疫应答)。在各种实施方案中，本文所述的HA多肽(或三聚体HA蛋白)引发针对多种流感株中的保守表位的增强的免疫应答。在各种实施方案中，本文所述的HA多肽(或三聚体HA蛋白)诱导针对表现出抗原转移或抗原漂移的不同流感病毒的免疫应答。
在一些实施方案中，与来自野生型或天然存在的流感病毒株的HA多肽或三聚体HA蛋白相比，本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白在不同流感株/类型/亚型中表现出更大的免疫原性。在一些实施方案中，与来自野生型或天然存在的流感病毒株的HA多肽或三聚体HA蛋白相比，本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白具有更高的稳定性。
核酸的构建与表达
在各种实施方案中，提供了产生重组HA多肽的方法。所述方法包括使用本文所述的基于簇的共有化方法产生包括共有氨基酸序列的HA多肽，以及通过用编码所述HA多肽的载体转染宿主细胞来产生所述HA多肽。在各种实施方案中，还提供了产生重组三聚体HA蛋白的方法。
在一些实施方案中，可以使用本领域已知的分子生物学方法由核酸产生本文所述的HA多肽。例如，将核酸分子插入载体中，当将其引入适当宿主细胞中时，所述载体能够表达所述HA多肽。适当宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞，以及本文其他地方所述的任何其他细胞类型。本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体的任何方法都可以用于构建在转录/翻译控制信号的控制下编码所述HA多肽的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成克隆技术以及体内重组技术(参见Sambrook等MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory；Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等编辑，Greene Publ.Assoc.，Wiley-Interscience，纽约)。
在一些实施方案中，本发明提供了编码HA多肽或HA多肽的特征或生物学活性部分的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了与编码HA多肽或HA多肽的特征或生物学活性部分的核酸互补的核酸。在其他实施方案中，本发明进一步提供了编码三聚体HA蛋白的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了与编码HA多肽或HA多肽的特征或生物学活性部分的核酸杂交的核酸分子。此类核酸可以用作例如引物或探针。在示例性实施方案中，此类核酸可以用作聚合酶链反应(PCR)中的引物，用作杂交(包括原位杂交)的探针和/或用作逆转录PCR(RT-PCR)的引物。
在一些实施方案中，核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链的。在一些实施方案中，根据本发明的核酸可以包括一种或多种非天然核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的核酸仅包括天然核苷酸。
根据本发明的核酸分子的表达可以由第二核酸序列调节，使得所述分子在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，可以通过本领域已知的启动子和/或增强子元件来控制本发明的核酸分子的表达。
在一些实施方案中，将含有核酸分子的表达载体转化到合适的宿主细胞中，以允许产生由核酸构建体编码的HA多肽或蛋白。然后，用表达载体转化的宿主细胞在允许产生本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白的条件下生长，随后回收所述多肽或蛋白。可用于本发明的示例性细胞类型包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞和细菌细胞。昆虫细胞包括但不限于：SF细胞、毛虫细胞、蝴蝶细胞、蛾类细胞、SF9细胞、SF21细胞、果蝇细胞、S2细胞、秋夜蛾细胞、菜尺蛾细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞和粉纹夜蛾细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于：小猎犬肾(MDCK)细胞、VERO细胞、EBx细胞、鸡胚细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾细胞、人胚肾细胞、HEK293T细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、原发性腺样体细胞系、原发性支气管上皮细胞、转化的人细胞系和Per.C6细胞。其他有用的细胞或细胞系统包括但不限于基于植物的系统(例如，烟草植物；参见例如，Jul-Larsen，A.，等，Hum Vaccin Immunother.，8(5)：653-61，2012)，酵母菌(参见例如，Athmaram，T.N.等，Virol J.，8：524，2011)和真菌(参见例如，Allgaier，S.等，Biologicals，37：128-32，2009)。本发明还涵盖基于细菌的表达系统(参见例如，Davis，A.R.等，Gene，21：273-284，1983)。本发明进一步考虑了杆状病毒系统的使用。
本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白可通过本领域已知的任何技术来纯化。例如，所述HA多肽或三聚体HA蛋白可以以可溶性级分或作为包涵体从细胞中回收，可通过例如盐酸胍和透析从中提取所述HA多肽或三聚体HA蛋白。为了进一步纯化所述HA多肽或三聚体HA蛋白，可使用常规的离子交换层析、疏水相互作用层析、反相层析、尺寸排阻层析、亲和层析、凝胶过滤或其组合。在一些实施方案中，在从真核或原核细胞分泌后，也可从条件培养基中回收所述HA多肽或三聚体HA蛋白。在此类实施方案中，通过在足以使细胞将多肽或蛋白分泌到培养上清液中的条件下培养宿主细胞并从所述上清液中纯化多肽或蛋白来产生纯化的重组HA多肽或三聚体HA蛋白。
在一些实施方案中，将所述重组HA多肽作为单体从宿主细胞中纯化。在其他实施方案中，将所述重组HA多肽作为三聚体从宿主细胞中纯化。
Ha多肽和蛋白质的评估
在一些实施方案中，本发明考虑了评估使用本文所述方法产生的HA多肽或三聚体HA蛋白，以确定其是否(i)引发针对一种或多种流感病毒的免疫应答；(ii)提供针对一种或多种流感病毒的保护性免疫应答，或(iii)在给予受试者后产生针对一种或多种流感病毒的抗体。用于测试此类功能的各种方法在本领域中是众所周知的，并且可以被利用。
在一些实施方案中，评估根据本文所述的方法产生的HA多肽或三聚体HA蛋白的所期望表达和构象。筛选方法是本领域众所周知的，并且包括无细胞测定、基于细胞的测定和动物测定。体外测定包括涉及使用可检测标记物的固态或可溶性靶标分子检测方法。在此类测定中，可以通过与靶标分子(例如，免疫球蛋白)结合来鉴定所述HA多肽或三聚体HA蛋白。在一些实施方案中，可以基于所期望表达和构象特征来选择本文所述的HA多肽或蛋白。
本发明进一步提供了在动物宿主中测试HA多肽的方法。如本文所用，“动物宿主”包括适用于流感研究的任何动物模型。例如，动物宿主包括哺乳动物宿主，包括但不限于灵长类动物、雪貂、猫、狗、牛、马、兔和啮齿动物(如小鼠、仓鼠和大鼠)。在一些实施方案中，在给予HA多肽或三聚体HA蛋白之前或同时，将动物宿主接种、感染或以其他方式暴露于流感病毒。可替代地，可以给所述动物宿主给予编码所述HA多肽或三聚体HA蛋白的DNA分子。可以通过本领域已知的任何方法，包括通过鼻内途径，将动物宿主接种、感染或以其他方式暴露于流感病毒。
在一些实施方案中，在给予HA多肽或三聚体HA蛋白(任选地，作为组合物中的组分)之前，动物宿主对于病毒暴露或感染是初始的。初始和/或接种的动物可用于多种研究中的任何一种。例如，如本领域中已知的，此类动物模型可以用于病毒传播研究。例如，已知病毒性流感从接种的动物(例如，雪貂)到初始的动物的空气传播(Tumpey等，2007，Science315；655-59)。在示例性病毒传播研究中，可以将HA多肽或三聚体HA蛋白给予至适合的动物宿主，以确定所述HA多肽或蛋白在动物宿主中引发广泛免疫应答的功效。使用从动物宿主研究中收集的这种信息，可以预测HA多肽或蛋白在人类宿主中引发免疫应答的功效。
流感病毒样颗粒(VLP)
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白的流感病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中，流感VLP通常由HA、NA和/或病毒结构蛋白(例如，HIV gag、流感M1蛋白)组成。流感VLP的产生是本领域已知的。例如，可以通过用编码HA、NA和/或HIV gag或M1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生流感VLP。在示例性实施方案中，适合的宿主细胞包括人类细胞(例如，HEK293T)。在将转染的细胞孵育适当的时间以允许蛋白表达之后(例如，约72小时)，可以从细胞培养上清液中分离VLP。在一些实施方案中，本文公开的流感VLP可用作流感疫苗以引发针对一种或多种流感病毒的广泛中和免疫应答。
药物组合物和给予
在各种实施方案中，本发明提供了包含本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白和/或相关实体的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物是能够引发免疫应答如针对流感病毒的保护性免疫应答的免疫原性组合物(例如，疫苗)。
例如，在一些实施方案中，所述药物组合物可包含以下一种或多种：(1)减毒活流感病毒，例如，复制缺陷型病毒，(2)灭活病毒，(3)病毒样颗粒(VLP)，(4)本发明的重组HA多肽或重组三聚体HA蛋白或其特征或生物学活性部分，(5)编码本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白或其特征部分或生物学活性部分的核酸，(6)编码本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白或其特征部分或生物学活性部分的DNA载体，和/或(7)表达系统，例如，表达本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白的细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含与本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白有关的抗体或其他试剂。在一个实施方案中，所述药物组合物包含与本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白结合和/或竞争的抗体。可替代地，所述抗体可识别包含本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白的病毒颗粒。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含与本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白相互作用或竞争的小分子。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含可用于基因沉默的核酸，如具有与所述HA多肽序列互补的序列的核酸。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物单独给予或与一种或多种试剂组合给予以增强免疫应答。例如，在一些实施方案中，所述药物组合物与佐剂组合给予。本发明考虑使用任何已知的佐剂。示例性佐剂包括但不限于弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ)、一种或多种生长因子(例如，GM-CSF或G-CSF)、一种或多种分子(如OX-40L或41BBL)或其组合，可用作生物佐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物可包括作为佐剂的铝盐和单磷酰脂A。可替代地或另外地，可以使用用于人类疫苗的佐剂，如MF59(Chiron公司)、CPG 7909(Cooper等，(2004)Vaccine，22：3136)和皂角苷，如QS21(Ghochikyan等，(2006)Vaccine，24：2275)。佐剂的其他例子包括但不限于聚[二(羧基苯甲酰氧基)磷腈](PCCP；Payne等，(1998)Vaccine，16：92)、嵌段共聚物P1205(CRL1005；Katz等，(2000)Vaccine，18：2177)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA；Kreuter等，(1981)J.Pharm.Sci.，70：367)。在本文其他地方描述了其他佐剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所用，术语“载体”是指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在示例性实施方案中，载体可以包括无菌液体，如例如，水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的油，如例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，载体是或包括一种或多种固体组分。药学上可接受的载体还可包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。如本文所用，赋形剂是可包含在药物组合物中的任何非治疗剂，例如以提供或有助于所期望的稠度或稳定作用。合适的药物赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在各种实施方案中，所述药物组合物是无菌的。
在一些实施方案中，所述药物组合物含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。在一些实施方案中，所述药物组合物可以包含多种添加剂中的任何一种，如稳定剂、缓冲液或防腐剂。另外，可以包括辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
在各种实施方案中，可以将所述药物组合物配制成适合任何所期望的给药方式。例如，所述药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、滴剂、片剂、丸剂、微丸、胶囊、含有液体的胶囊、明胶胶囊、粉末、缓释配制品、栓剂、乳剂、气溶胶、喷雾剂、悬浮液、冻干粉、冻干悬浮液、干燥粉或任何其他适合使用的形式。在药剂的配制和制造中的一般考虑可以在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Co.，宾夕法尼亚州伊斯顿，1995(通过引用并入本文)找到。
所述药物组合物可以通过任何给予途径来给予。给予途径包括例如口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经直肠、通过气管内滴注、支气管滴注、吸入或局部。给予可为局部或全身的。在一些实施方案中，口服给予。在另一个实施方案中，给予是通过肠胃外注射。在一些情况下，给予导致本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白释放到血流中。给予方式可由从业者自行决定。
在一个实施方案中，所述药物组合物适于口服给予。用于口服递送的组合物可以是例如片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、颗粒剂、粉末、乳剂、胶囊、糖浆或酏剂的形式。
在另一个实施方案中，所述药物组合物适合于肠胃外给予(例如，静脉内、肌内、腹膜内和皮下)。此类组合物可以配制成例如溶液、悬浮液、分散液、乳剂等。它们也可以无菌固体组合物(例如，冻干的组合物，其可以在使用前立即溶解或悬浮在无菌注射介质中)的形式制造。例如，肠胃外给予可以通过注射来实现。在此类实施方案中，注射剂可以按常规形式制备，即作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式、或作为乳剂。在一些实施方案中，注射溶液和悬浮液由无菌粉末、冻干粉末或颗粒剂制备。
在进一步的实施方案中，将所述药物组合物配制成通过吸入递送(例如，直接递送至肺和呼吸系统)。例如，所述组合物可采取鼻喷雾剂或任何其他已知的气溶胶配制品的形式。在一些实施方案中，用于吸入或气溶胶递送的制剂包含多个颗粒。在一些实施方案中，此类制剂可以具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12或约13微米的平均粒径。在一些实施方案中，用于吸入或气溶胶递送的制剂被配制成干粉末。在一些实施方案中，用于吸入或气溶胶递送的制剂被配制成湿粉末，例如通过包含润湿剂。在一些实施方案中，所述润湿剂选自水、盐水或其他生理pH的液体。
在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物以滴剂的形式给予至鼻腔或颊腔。在一些实施方案中，剂量可包括多滴(例如，1-100、1-50、1-20、1-10、1-5滴等)。
在一些实施方案中，所述药物组合物将包含被包囊、捕获或结合在脂质囊泡、生物可利用的和/或生物相容的和/或生物可降解的基质或其他微粒内的HA多肽或三聚体HA蛋白。在一些实施方案中，所述药物组合物包含展示所述HA多肽或三聚体HA蛋白的纳米粒子。在一些实施方案中，所述纳米颗粒是铁蛋白纳米粒子(参见例如，美国专利公开2014/0072958)。
本发明的药物组合物可以以适合于实现期望结果的任何剂量给予。在一些实施方案中，所述期望的结果是诱导针对一种或多种流感株的长期适应性免疫应答。在一些实施方案中，所述期望的结果是减少流感感染的一种或多种症状的强度、严重性、频率和/或延迟发作。在一些实施方案中，所述期望的结果是抑制或预防流感病毒感染。取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况，正在预防或治疗的感染的严重程度，所使用的特定组合物及其给予方式，所需的剂量将因受试者而有所不同。
在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物以单剂量或多剂量给予。在一些实施方案中，所述药物组合物在不同天以多种剂量给予(例如，初免-加强免疫接种策略)。在一些实施方案中，根据连续给药方案给予所述药物组合物，以使受试者不经历治疗剂量时段之间插入的小于治疗剂量的时段。在一些实施方案中，根据间断给药方案给予所述药物组合物，以使受试者经历两个治疗剂量时段之间插入的至少一个小于治疗剂量的时段。在一些实施方案中，所述药物组合物作为加强免疫方案的一部分给予。
在各种实施方案中，所述药物组合物与一种或多种其他治疗剂共同给予。如果其时间安排使得其他治疗剂与所述HA多肽或所述三聚体HA蛋白的药理活性在时间上重叠，则共同给予不需要同时给予治疗剂，从而发挥组合治疗作用。通常，每种药剂将以针对所述药剂确定的剂量和时间表来给予。
在一些实施方案中，本发明涵盖递送药物组合物与可以改善其生物利用度、降低或改良其代谢、抑制其排泄和/或改良其在体内的分布的药剂的组合。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物与一种或多种抗病毒剂(例如，奥司他韦
Figure BDA0002788129590000341
或扎那米韦
Figure BDA0002788129590000342
等)组合给予。
HA多肽的抗体
本发明提供了针对根据本发明产生的HA多肽或三聚体HA蛋白的抗体。这些可以是单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何一种来制备(例如，参见Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory；通过引用并入本文)。例如，可以通过细胞培养技术产生抗体，包括产生单克隆抗体，或通过将抗体基因转染到适合的细菌或哺乳动物宿主细胞中，以产生抗体。
在一些实施方案中，所述抗体可以是由两条重链和两条轻链组成的经典抗体。在其他实施方案中，所述抗体可以是抗体衍生物。例如，在一些实施方案中，所述抗体可以是单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微蛋白(半胱氨酸结蛋白、打结素)、DARPin、四连接素、亲和体、反式体、Anticalin、AdNectin、Affilin、微型体、肽适体、奥特瑞斯、塑料抗体、费洛体、斯塔都体、巨型体、伊维体、菲诺体、犰狳重复蛋白、库尼茨型结构域、高亲合性多聚体、阿特里体、普罗体、免疫体、曲奥单抗、特洛伊体；佩普体；疫苗体、单特异性体；亲和性多聚体、双特异性体、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、肽模拟分子、或合成分子或本领域已知的任何其他抗体形式。
对流感病毒进行免疫和提供保护的方法
在另一方面，本发明提供了针对受试者中的一种或多种流感病毒免疫受试者的方法。本发明进一步提供了在受试者中引发针对一种或多种流感病毒的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的本文所述的重组HA多肽或三聚体HA蛋白。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的包含本文所述的HA多肽或三聚体HA蛋白的VLP。
在各种实施方案中，本文提供的免疫方法引发针对一种或多种流感病毒内的多个表位的广泛保护性免疫应答。在各种实施方案中，本文提供的免疫方法引起针对一种或多种流感病毒的广泛中和免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫应答包括抗体应答。因此，在各种实施方案中，本文所述的药物组合物可以针对不同类型的流感病毒提供广泛的交叉保护。在一些实施方案中，所述药物组合物提供针对禽类、猪、季节性和/或大流行流感病毒的交叉保护。在一些实施方案中，所述药物组合物提供针对一种或多种甲、乙或丙亚型流感的交叉保护。在一些实施方案中，所述药物组合物提供针对多种株的甲型流感H1亚型病毒(例如，H1N1)、甲型流感H3亚型病毒(例如，H3N2)和/或甲型流感H5亚型病毒(例如，H5N1)的交叉保护。
在一些实施方案中，本发明的方法能够引发改善的针对一种或多种季节性流感株的免疫应答。示例性季节性流感株包括但不限于A/波多黎各/8/1934、A/福特/蒙茅斯/1/1947、A/智利/1/1983、A/德克萨斯州/36/1991、A/新加坡/6/1986、A/北京/32/1992、A/新喀里多尼亚/20/1999、A/所罗门群岛/03/2006和A/布利斯班/59/2007。在一些实施方案中，本发明的方法能够引发改善的针对一种或多种大流行流感株的免疫应答。示例性大流行流感株包括但不限于A/加利福尼亚州/07/2009、A/加利福尼亚州/04/2009、A/比利时/145/2009、A/南卡罗来纳州/01/1918和A/新泽西州/1976。大流行亚型尤其包括H5N1、H2N2、H9N2、H7N7、H7N3、H7N9和H10N7亚型。在一些实施方案中，本发明的方法能够引发改善的针对一种或多种猪流感株的免疫应答。示例性猪流感株包括但不限于A/新泽西州/1976分离株和A/加利福尼亚州/07/2009。其他大流行流感、季节性流感和/或猪流感株是本领域已知的。
在各种实施方案中，本方法可以将免疫保护扩展到一系列抗原不同的流感株。例如，本发明的方法可以引发针对由抗原转移引起的新的大流行流感株的免疫应答(即使得它们覆盖在遗传序列空间上跨越延长的时间线相距遥远的抗原不同的株)。本方法还可用于解决在相对较短的时段内发生的遗传变化，使得本发明的药物组合物通过引发针对抗原漂移的循环季节性流感株的免疫应答(例如，改善的季节性应答)而继续有效。因此，在各种实施方案中，可以使用本发明的方法：(1)扩大针对一种或多种季节性流感株的覆盖范围(即引发中和免疫应答的能力)；(2)扩大针对一种或多种大流行流感株的覆盖范围(以解决抗原漂移)；以及(3)扩大针对任何其他抗原性不同的流感株的覆盖范围。考虑的是，本方法可以提供广泛的、长期的(例如，多季节的)针对流感病毒(包括不匹配的株)的保护。
在一些实施方案中，本发明提供了通过向有此需要的受试者给予本发明的药物组合物来预防或治疗流感感染的方法。在一些实施方案中，所述受试者患有或易感流感感染。在一些实施方案中，如果受试者展示出通常与流感感染相关的一种或多种症状，则认为所述受试者患有流感感染。在一些实施方案中，已知或据信所述受试者已暴露于流感病毒。在一些实施方案中，如果已知或据信受试者已暴露于流感病毒，则认为所述受试者易感流感感染。在一些实施方案中，如果受试者已经与已知或怀疑已感染流感病毒的其他个体接触和/或如果受试者现在或曾经出现在已知或被认为流行流感感染的地方，则已知或认为所述受试者已经暴露于流感病毒。
在各种实施方案中，本文所述的药物组合物可以在出现一种或多种流感感染症状之前或之后给予。在一些实施方案中，所述药物组合物作为预防性药物给予。在此类实施方案中，本发明的方法有效地预防或保护受试者免受流感病毒感染。在一些实施方案中，本发明的药物组合物用作季节性和/或大流行流感疫苗的组分或用作旨在给予长期(多季节)保护的流感疫苗接种方案的一部分。在一些实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗流感感染的症状。
在一些实施方案中，在给予根据本发明的药物组合物之前、期间或之后，测试患有或易感流感感染的受试者针对本发明的HA多肽或三聚体HA蛋白的抗体。在一些实施方案中，不给具有此类抗体的受试者给予本发明的药物组合物。在一些实施方案中，基于对此类抗体的检测(或其缺乏)来选择适当剂量的药物组合物。
在各种实施方案中，受试者是动物界的任何成员。在一些实施方案中，所述受试者是非人类动物。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物、禽类(例如，鸡或鸟)、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或虫。在某些实施方案中，所述非人类受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，受试者是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。
在一些实施方案中，所述受试者是人类。在某些实施方案中，所述受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，所述人类受试者小于6月龄。在一些实施方案中，所述人类受试者为6月龄或更大，为6月龄至35月龄，为36月龄至8岁，或9岁或更大。在一些实施方案中，所述人类受试者为55岁或更大，如60岁或更大，或65岁或更大的老年人。本发明还考虑了药物组合物的给予和/或子宫内治疗方法的执行。
此描述和示例性实施方案不应被视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有指示，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表达数量、百分比或比例的数字和其他数值应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰至已无法将其如此修饰的程度。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据试图获得的所期望特性而变化。至少并且不试图限制将等同原则应用于权利要求的范围，每个数字参数至少应被解释为是根据所报告的有效数字的数量并且通过应用普通修约技术的。
注意，如本说明书和所附权利要求书所用，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包括复数个指示物，除非明确地并且清楚地限于一个/种指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的详述不排除可以取代或添加到所列项目的其他类似
通过参考下述实施例，会更加全面地理解本发明。本文包括的所有文献引证均通过引用并入本文。
实施例
提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开文本的范围。如本文所用，CBC HA是指使用本文所述的基于簇的共有化(CBC)方法设计的HA多肽或蛋白质。
实施例1-用于设计重组流感HA多肽的基于簇的共有化方法
使用基于簇的共有化(CBC)方法产生重组流感HA多肽。作为第一步，从美国国家生物技术信息中心的流感病毒资源下载了从1918年至今的甲型流感血凝素(HA)蛋白序列(H1N1亚型)(N＝5664，其中2043个是唯一序列)(参见Bao等(2008)J.Virol.82，596-601)。编辑所述HA序列以去除信号肽序列和跨膜区域。然后产生2043个唯一序列的非冗余集的多序列比对。计算完整的成对同一性矩阵(2043x2043)，并将其用作主成分分析(PCA)的输入。保留了PCA的前两个成分，可以在二维欧几里得空间中紧凑表示高维输入矩阵。如图1A所示，鉴定了相关序列的八个代表性簇。
随后，分析每个单独簇中的序列以鉴定每个位置上最频繁出现的残基，并产生包括共有氨基酸序列的代表性HA多肽。举例来说，如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，并且如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸。在比对中特定位置的氨基酸变异的情况下(例如，最大频率＜0.5)，所述位置上的代表性氨基酸的决定是基于对由比较模型产生的共有序列的结构模型的分析。
具体而言，在明确的多数表决不能在序列的特定位置定义单个氨基酸的情况下，会产生多个共有序列(基于比对，每个可能的氨基酸对应一个)。不能明确确定的位置被编码为‘X’，通过分子建模从可能在任何一个特定位置发生的唯一组可能氨基酸中解析出来。因此，所述设计的一个重要方面是通过分子建模进行改进，以解决潜在的结构问题，并在可变位置选择合适的氨基酸，并基于低的计算能量选择序列。例如，使用Rosetta分子建模软件包对通过共有化方法产生的序列的3D结构进行了建模(Leaver-Fay等(2011)Meth.Enzymol.487：545-74)。预测具有负总能量值的分子折叠为稳定和/或功能蛋白的可能性很高，而具有正能量值的分子被认为不太可能正确折叠。因此，在无法使用共有化产生方法明确分配残基位置的情况下，选择了导致具有最低或接近最低计算势能的结构的氨基酸，因为其被假定为更稳定，因此可能被表达和起作用。
使用该过程，产生了包括多个候选序列的一组能量最小化设计。特别是，为八个簇中的每个簇选择了单个代表性序列(簇内原型序列)进行进一步评估。将这些代表性序列称为“层级1”序列。层级1序列中的四个似乎是新颖的，没有出现在公共数据库中。已知其他四个序列是天然出现的(簇1：A/朝鲜/CJ04/2009；簇3：A/宾夕法尼亚州/02/2008；簇4：A/惠灵顿/10/2005；以及簇5：A/孟菲斯/06/1996)。未已知四种天然存在的序列已被用作疫苗抗原，因此在本发明的范围内将具有新的应用。
为了进一步扩大抗原覆盖的广度，使用与之前所述的用于定义共有序列和结构建模的相同程序，将多个层级1共有序列组合以产生跨簇共有序列。使用此程序，层级1原型序列的组合分组产生了三个‘层级2’序列。具体而言，簇1和簇2的组合产生了“大流行流感或猪流感样”层级2序列；簇3、簇4和簇5的组合产生了“季节性流感样组1”层级2序列；簇6和簇7的组合产生了“季节性流感样组2”层级2序列。
通过合并层级2序列以计算并随后产生“层级3”共有序列，再次重复所述过程。特别是，层级2和层级3共有序列被设计为解决在不同序列簇中发现的不相等数目的序列，并最小化具有更多序列的较大簇对较小簇的信号的任何潜在掩避。另外，还对层级2和层级3序列进行了结构指导的建模和设计，以评估序列的稳定性，解决氨基酸变异并产生表现出改善的生物物理和免疫学特征的折叠良好的分子。
使用本文所述的基于簇的共有化方法设计的示例性层级1、层级2和层级3序列在表1中显示为SEQ ID NO：1-16。这些序列是全长HA序列，其包括信号肽和跨膜结构域。
实施例2.CBC HA蛋白的体外表达
由于CBC HA蛋白是根据不同于自然进化过程的标准设计的，因此重要的是要确认表位完整性的正确表达、组装、折叠和/或维持。因此，进行实验以确定层级1、层级2和层级3CBC HA蛋白是否可以在哺乳动物细胞表面表达，并被识别头部或茎部区域保守表位的抗HA抗体检测到。在这些实验中，通过流式细胞术评估抗体结合。
例如，已知单克隆抗体C179结合H1N1 HA蛋白的保守的HA茎结构域中的构象表位(Okuno，Y等，J.Virology 1993)。如图2所示，所述C179抗体结合了所有测试的野生型和CBCHA蛋白，但效率不同，表明表位暴露或蛋白表达水平存在差异。
这三种HA头部特异性单克隆抗体(即CH65、5J8和4K8)识别一些但不是全部野生型和CBC HA蛋白。5J8和4K8抗体均与A/加利福尼亚州/07/2009(Ca09)的HA结合，但未能结合A/新喀里多尼亚/20/1999(NC99)的HA。所述CH65抗体与NC99的HA结合，但不与大流行Ca09的HA结合。相比之下，5J8和4K8抗体都结合了几种层级1和层级2 CBC HA蛋白(即，HAco1M、HAco2M、HAco6M、HAcb12M和HAcb67M)，以及所有层级3CBC HA蛋白，表明这些CBC HA蛋白可能与Ca09抗原性相关。关于CH65和5J8抗体的结合，层级1和层级2蛋白HAco3M、HAco4M、HAco5M和HAcb345M展示出不同的抗体结合模式，而野生型HA则未观察到。
总而言之，这些数据表明所有CBC HA蛋白均被表达、加工并运输至细胞表面，在此处它们被正确折叠并呈递以允许抗体结合。此外，所述CBC HA蛋白起作用并与红细胞上的唾液酸结合。因此，本文所述的基于簇的共有化方法能够产生正确折叠并保留功能的HA多肽和蛋白。
实施例3.表达CBC HA序列的重组甲型流感病毒的产生
通过反向遗传学产生了包括CBC HA序列的甲型流感病毒。具体而言，使用12-质粒反向遗传系统产生带有CBC HA序列和神经氨酸酶的重组A/波多黎各/8/1934(PR8)H1N1病毒(在鸡蛋中具有高生长特性的减毒人类病毒)以及八个其他病毒基因片段(图3)。将12个载体转染到293T和MDCK细胞的混合物中。3-4天后，收集细胞培养物上清液，并接种到有胚鸡蛋的尿囊腔中，以进一步进行病毒繁殖。
通过在噬菌斑测定中检测传染性病毒并确定血凝素活性，证明成功收回了带有层级1和层级2HA序列(即HAco3M、HAco4M、HAco5M和HAcb345M)的流感重组病毒(图3)。通过Sanger测序也确认了重组病毒中CBC HA序列的存在。
这些结果证明可以产生表达CBC HA序列的流感病毒，并有可能制成裂解灭活疫苗。
实施例4.表达CBC HA序列的重组甲型流感病毒的免疫原性研究
评估了表达CBC HA序列的重组甲型流感病毒的免疫原性。图4提供了不同免疫原性研究的示意图。
进行噬菌斑减少中和测试(PRNT)以评估重组病毒诱导针对病毒小组的中和抗体的能力。特别是，所述小组包括来自多个HA序列簇的病毒(参见图5G)。用表达各种层级1和层级2CBC HA或野生型HA的重组病毒鼻内感染小鼠。从感染的小鼠中收集血清，并评估中和抗体的诱导。
如图5A和5B所示，表达野生型A/新喀里多尼亚/20/1999 HA的重组病毒(来自簇4的病毒)诱导了针对病毒小组的相当广泛的中和应答。表达HAco4M的重组病毒(衍生自簇4的层级1CBC HA序列)表现出与表达A/新喀里多尼亚/20/1999 HA的病毒相当的保护广度。值得注意的是，与表达野生型HA的病毒相比，表达HAco4M的重组病毒潜在地诱导了针对A/德克萨斯州/36/1991病毒(来自簇5的病毒)的更高的中和应答。
还评估了表达HAco5M(层级1 CBC HA)的重组病毒，并将其保护广度与表达野生型A/德克萨斯州/36/1991 HA的重组病毒进行了比较。如图5C所示，两种重组病毒针对病毒小组诱导了相似广度的中和应答。
另外地，将表达HAcb345M(层级2 CBC HA)的重组病毒的免疫原性与表达层级1CBC HA(即HAco4M和HAco5M)的重组病毒进行了比较。如图5D所示，与表达HAco4M的病毒相比，表达HAcb345M的重组病毒表现出针对A/布里斯班/59/2007病毒(簇3病毒)的相似中和应答。值得注意的是，与表达HAco4M的病毒相比，表达HAcb345M的重组病毒针对簇4A/德克萨斯州/36/1991病毒的活性潜在地展现出略微改善，而与表达HAco5M的病毒相比，表达HAcb345M的重组病毒针对簇3A/布里斯班/59/2007病毒的活性展现出显著改善(图5D)。
与表达野生型HA的重组病毒相比，表达HAcb345M的重组病毒针对A/布利斯班/59/2007病毒诱导了相当的中和应答，但针对A/德克萨斯州/36/1991、A/新喀里多尼亚/20/1999 HA和A/所罗门群岛/3/2006病毒的应答较低(图5E)。然而，如图5F所示，表达CBCHAcb345M的重组病毒针对所测试的病毒小组表现出更平衡的中和图谱，而野生型病毒表现出针对同源病毒的最强中和抗体应答。
还通过血凝素抑制(HAI)测定评估了各种重组病毒的免疫原性。HAI测定方案改编自基于CDC实验室的流感监测指南。如图6所示，由表达CBC HA的重组病毒诱导的HAI滴度与由表达野生型HA的重组病毒诱导的HAI滴度相当。当使用抗体取证(AF)测定评估总体抗体结合时，可获得相似的结果(图7A-7D)。
实施例6.表达CBC HA蛋白的病毒样颗粒(VLP)的表征
进行了免疫研究，以研究表达各种CBC HA蛋白的病毒样颗粒(VLP)的免疫原性。为了产生VLP，用表达HIV-1 Gag、NA(A/绿头鸭/艾伯塔/24/01；H7N3)和来自野生型H1N1株的CBC HA或HA的质粒瞬时转染HEK 293T细胞，并在37℃下孵育72小时。收集上清液，并通过低速离心除去细胞碎片，随后通过0.22μm无菌过滤器进行真空过滤。通过在4℃下超速离心(100,000X g通过20％甘油，每体积重量)纯化VLP 4小时。随后将沉淀重悬于pH 7.2的PBS中，并以单次使用的等分试样在-80℃下储存直至使用。通过Micro BCATM蛋白测定试剂盒(Pierce Biotechnology，伊利诺伊州洛克福德，美国)测定总蛋白浓度。通过电子显微镜以及动态光散射分析来表征VLP。进一步地，通过HA测定定量了VLP上的HA的量，以表明HA具有功能活性。
为了评估VLP(与AF04佐剂组合)的免疫原性，在研究的第0天和第21天对小鼠皮下注射两次(图8)。为了比较，还用广泛的代表性活流感病毒激发小鼠。然后在研究第-1、20和35天从受激发的小鼠中收集血液样本。使用血凝素抑制(HAI)和微中和(MN)测定对血清样品进行流感特异性抗体应答分析。
如图9所示，用表达野生型A/新喀里多尼亚/20/1999 HA的VLP免疫诱导了与活A/新喀里多尼亚/20/1999病毒感染相似的中和抗体应答的广度。但是，VLP免疫诱导了更高的HAI滴度。如通过HAI测定(图9)和MN测定(图10)所检测的，表达CBC HAcb345M的VLP诱导了相当广泛的中和抗体应答。如在MN测定中检测的，表达CBC HAco5M的VLP还诱导了相当广泛和平衡的中和抗体应答。
总而言之，这些数据证明了使用CBC方法设计的示例性HA蛋白是起作用的并且能够在体内诱导中和抗体应答。
序列表
<110> 圣诺菲•帕斯图尔公司(SANOFI PASTEUR INC.)
<120> 产生包含血凝素的广泛保护性疫苗组合物的方法
<130> 01121-0036-00PCT
<140>
<141>
<150> 62/649,004
<151> 2018-03-28
<160> 33
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
<400> 1
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
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<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
<400> 2
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1 5 10 15
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<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
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Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 16
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
<400> 16
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn
130 135 140
Val Thr Arg Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Asn Gly Ser Tyr Pro
165 170 175
Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Gln Thr Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser Asn Tyr Ser
210 215 220
Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr
245 250 255
Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser
275 280 285
Met Asp Glu Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 17
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Met Leu Val Ala Ser Val Leu
20
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 18
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 19
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(40)
<223> /注释="此序列可涵盖1-8 'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元"
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 20
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(20)
<223> /注释="此序列可涵盖1-4 'Gly Gly Gly Gly Ser'重复单元"
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(15)
<223> /注释="此序列可涵盖1-3 'Glu Ala Ala Ala Lys'重复单元"
<400> 25
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 26
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(26)
<223> /注释="此区域可涵盖2-5 'Glu Ala Ala Ala Lys'重复单元"
<400> 26
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20 25
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 27
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽”
<400> 28
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 29
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 30
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 31
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽”
<400> 32
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的6xHis标签"
<400> 33
His His His His His His
1 5

Claims (28)

1.一种产生包括共有氨基酸的重组流感血凝素(HA)多肽的方法，其中所述方法包括：
a.选择多于一个流感HA多肽序列并比对所述序列；
b.计算成对相似度/不相似度矩阵；
c.从所述成对相似度/不相似度矩阵中鉴定并创建相似序列的簇；
d.在每个簇中，在所述序列比对中使用成对比对方法确定每个位置是否存在共有氨基酸，其中如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，而如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸；
e.为每个簇产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的第一序列；
f.任选地，如果分析了多个簇，则通过以下将步骤(e)中产生的一个簇的第一序列与另一个簇或多个簇中产生的第一序列进行比较：
i.为每个簇比对在步骤(e)中产生的序列；
ii.在所述序列比对中使用成对比对方法确定每个位置是否存在共有氨基酸，其中如果给定位置的氨基酸频率为50％或更高，则将所述氨基酸指定为共有氨基酸，而如果给定位置的氨基酸频率小于50％，则将所述氨基酸指定为可变氨基酸；以及
iii.产生包括共有氨基酸和可变氨基酸的第二序列；
g.在步骤(e)中产生的所述第一序列或步骤(f)(iii)中产生的所述第二序列中，通过以下确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸：
i.基于所述第一序列或所述第二序列产生一组测试序列，其中测试氨基酸位于所述可变氨基酸位置；
ii.对每个所述测试序列进行分子建模；
iii.通过选择导致多肽具有负总能量值的一个或多个氨基酸来确定每个可变氨基酸位置的共有氨基酸；以及
h.产生包括所述共有氨基酸的重组流感HA多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中比对所述序列包括使用MAFFT、MUSCLE、CLUSTALOMEGA、FASTA、其组合或任何其他多序列比对软件包。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中计算所述成对相似度/不相似度矩阵包括使用BLOSUM、PAM、IDENTITY替换矩阵或其组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中从所述成对相似度/不相似度矩阵中鉴定和创建相似序列的簇包括使用K-均值聚类、极小极大聚类、主成分分析(PCA)、多维定标(MDS)或其组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中分子建模包括与流感HA多肽或蛋白的晶体结构进行比较。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中分子建模包括使用Rosetta或任何其他分子建模软件。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述测试氨基酸包括蛋白中发现的任何天然或非天然氨基酸。
8.一种使用根据权利要求1-7中任一项所述的方法产生的重组流感HA多肽。
9.根据权利要求8所述的重组流感HA多肽，其中所述多肽包括选自SEQ ID NO:1-16中任一项的氨基酸序列或其片段，或与SEQ ID NO:1-16中任一项具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或其片段。
10.一种重组三聚体HA蛋白，其包含根据权利要求8或9所述的重组HA多肽中的一种或多种。
11.一种分离的核酸，其编码根据权利要求8或9所述的重组HA多肽或根据权利要求10所述的重组三聚体HA蛋白。
12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。
13.一种分离的细胞，其包含根据权利要求12所述的载体。
14.根据权利要求13所述的分离的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
15.根据权利要求14所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是HEK293T细胞或CHO细胞。
16.根据权利要求13所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是昆虫细胞。
17.一种融合蛋白，其包含根据权利要求8或9所述的重组HA多肽或根据权利要求10所述的重组三聚体HA蛋白。
18.一种流感病毒样颗粒(VLP)，其包含根据权利要求8或9所述的重组HA多肽或根据权利要求10所述的重组三聚体HA蛋白。
19.根据权利要求18所述的流感VLP，其还包含流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(M1)蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)gag蛋白或其组合中的一种或多种。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求8或9所述的重组HA多肽、根据权利要求10所述的重组三聚体HA蛋白、根据权利要求17所述的融合蛋白或根据权利要求18或19所述的流感VLP，以及药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述组合物引发针对一种或多种流感株、类型和/或亚型的免疫应答。
22.一种使受试者对流感病毒免疫的方法，其包括向所述受试者给予有效量的根据权利要求8或9所述的重组HA多肽、根据权利要求10所述的重组三聚体HA蛋白、根据权利要求17所述的融合蛋白、根据权利要求18或19所述的流感VLP、或根据权利要求20或21所述的药物组合物。
23.一种在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，其包括向所述受试者给予有效量的根据权利要求8或9所述的重组HA多肽、根据权利要求10所述的重组三聚体HA蛋白、根据权利要求17所述的融合蛋白、或根据权利要求18或19所述的流感VLP、或根据权利要求20或21所述的药物组合物。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述流感病毒是季节性或大流行流感病毒。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述免疫应答包括产生针对一种或多种流感病毒株、类型或亚型的抗体。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述给予是通过肌内、鼻内、皮内、皮下、口服或静脉内途径进行的。
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