ES2256847T3

ES2256847T3 - Nuevos genes de respuesta p53.

Info

Publication number: ES2256847T3
Application number: ES95926643T
Authority: ES
Inventors: Leonard Buckbinder; Randy Talbott; Bernd R. Seizinger; Nikolai Kley
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1994-07-12
Filing date: 1995-07-10
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2015-07-10
Also published as: EP0804609A4; ATE315087T1; EP0804609B1; EP0804609A1; WO1996001907A1; US5886149A; DE69534733D1; US5667987A; DE69534733T2

Abstract

SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS, EN PARTICULAR SECUENCIAS DE ADN, QUE CODIFICAN TODA O PARTE DE LA PROTEINA DE RESPUESTA P53 PIGI AS DE ADN, CELULAS HUESPEDES QUE CONTIENEN LOS VECTORES DE EXPRESION Y METODOS PARA LA UTILIZACION DE ESTOS MATERIALES. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A MOLECULAS DE POLIPEPTIDOS QUE CONTIENE TODA O PARTE DE LA PROTEINA DE RESPUESTA P53 PIGI Y A METODOS PARA LA PRODUCCION DE ESTAS MOLECULAS DE POLIPEPTIDOS.

Description

Nuevos genes de respuesta p53.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevos genes de respuesta a p53, a los vectores de expresión que comprenden los genes, a las células huésped que comprenden los vectores de expresión, a las proteínas producidas por los genes, a los procedimientos para producir las proteínas y a los procedimientos de uso de los genes y de las proteínas.

Antecedentes de la invención

La desactivación o la pérdida de p53 es un hecho común asociado con el desarrollo de los cánceres humanos. La desactivación funcional puede ocurrir como consecuencia de anomalías genéticas en el gen p53, más comúnmente, mutaciones sin sentido invertidas o como consecuencia de la interacción con oncogenes virales y celulares [Véase: Levine, A. J., et al., Nature 351, 453-455 (1991); Vogelstein, B. y Kinzler, K. W., Cell 70, 523-526 (1992); Zambetti, G. y Levine, A. J., FASEB J. 7, 855-865 (1993); Harris, C. C., Science 262, 1980-1981 (1993)]. La pérdida de las funciones de p53 salvaje (wt, Wild-Type) conduce a un ciclo y a una replicación celulares descontrolados, una reparación ineficaz del ADN, una ventaja de crecimiento selectivo y, por consiguiente, a la formación de tumores [Levine, A. J., et al., Nature 351, 453-455 (1991); Vogelstein, B. y Kinzler, K. W., Cell 70, 523-526 (1992); Zambetti G. y Levine, A. J., FASEB J. 7, 855-865 (1993); Harris, C. C., Science 262, 1980-1981, (1993); Lane, D. P., Nature 358, 15-16 (1992); Livingstone, L. R., et al., Cell 70, 923-935 (1992)]. La formación de tumores puede acentuarse todavía más mediante la obtención de nuevas funciones asociadas con muchas formas mutantes de p53 [Chen, P.-L., et al, Science 250, 1576-1580 (1990); Dittmer, D. et al., Nature Genetics 4, 4142-4145 (1993); Sun, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90, 2827-2831 (1993)], proporcionando una base potencial para su fuerte selección en los tumores humanos.

El mecanismo o los mecanismos subyacentes a la supresión del crecimiento mediada por p53 todavía no están bien definidos. Sin embargo, resulta de particular interés la capacidad de p53 para actuar como factor de transcripción, una función que está considerablemente correlacionada con su capacidad para actuar como supresor de los tumores. Se ha observado que la proteína p53 inhibe una variedad de promotores que contienen elementos TATA [P. ej., Ginsberg, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88, 9979-9983 (1993), Santhanam, U., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88, 7605-7609 (1993); Kley, N., et al., Nucleic Acids Res. 20, 4083-4087 (1992); Mack, D. H., et al., Nature 363, 281-283 (1993)]. Esta inhibición es independiente de la secuencia y puede suponer la unión de p53 a componentes de la maquinaria de transcripción basal, tales como la proteína de unión a TATA [p.ej., Seto, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 89, 12028-12032 (1992), Truant, R., et al., J. Biol. Chem. 268, 2284-2287 (1993), Liu, X., et al., Mol. Cell. Biol. 13, 3291-3300 (1993)]. A diferencia de ello, la transactivación generada por p53 sí depende de la secuencia y está correlacionada con su unión a secuencias específicas de ADN tales como el sitio consenso de unión del que se ha informado recientemente [El-Deiry, W. S., et al., Nature Genetics 1, 45-49 (1992), Funk, W. D., et al., Mol. Cell. Biol. 12, 2866-2871 (1992)]. La proteína p53 puede activar eficazmente la transcripción desde promotores que lleven tales sitios, tanto in vivo como in vitro [p.ej., Kley, N., et al., Nucleic Acids Res. 20, 4083-4087 (1992), Seto, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 12028-12032 (1992); Weintraub, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 4570-4574 (1991); Kern, S. E., et al., Science 256, 827-830 (1992); Farmer, G. et al., Nature 358, 83-86 (1992); Zambetti, G. P., et al., Genes & Development 6, 1143-1152 (1992)]. La mayoría de los mutantes oncogénicos de p53 han perdido tanto las propiedad de inhibir la transcripción como la de la transactivación específica de secuencias mostradas por la proteína p53 salvaje.

La fuerte correlación que existe entre la capacidad de p53 para activar la transcripción con especificidad secuencial y su capacidad para inhibir el crecimiento celular o inducir a la apóptosis [Vogelstein, B. Y Kinzler, K. W., Cell 70, 523-526 (1992); Yonish-Rouach, E., et al., Nature 352, 345-347 (1991); Lowe, S. W., et al., Nature 362, 847-849 (1993); Clark, A. R., et al., Nature 362, 849-852 (1993); Shaw, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)], sugiere que los genes inducidos por p53 pueden desempeñar un papel fundamental en la mediación de la función de p53 como un inhibidor tumoral. Se han caracterizado unos cuantos genes endógenos por ser inducidos por p53. Éstos incluyen el gen mdm-2 y su homólogo humano hdm-2 [Wu, X., et al., Genes & Development 7, 1126-1132 (1993)], el GADD45 [Kastan, M. B., et al., Cell 71, 587-597 (1992)] y el WAF1/CIP1/p21 [El-Deiry, W. S., et al., Cell 75, 817-825 (1993)]. Se ha sugerido que el gen hdm-2 actúa como un regulador de realimentación negativa de p53, y en este sentido, funcionaría como un oncogén [Wu, X., et al., Genes & Development 7, 1126-1132 (1993); Zambetti, G. y Levine, A. J., FASEB J. 7, 855-865 (1993)]. Esto concuerda con que la amplificación del gen hdm-2 esté asociada con los cánceres humanos [Oliner, J. D., et al., Nature 358, 80-83 (1992)]. Por el momento, se ha observado que tanto el WAF1/CIP1/p21, un inhibidor de las quinasas dependientes de la ciclina [Harper, J. W., et al., Cell 75, 805-816 (1993); Xiong, Y., et al., Nature 366, 701-704 (1993)] como el gadd45 [Zhan, Q., et al., Mol. Cell. Biol. 14, 2361-2371 (1994)] inhiben el crecimiento de células tumorales en cultivo [El-Deiry, W. S., et al., 75, 817-825 (1993)].

Partanen et al., (Revista de la OEBM, volumen 10, nº: 6, pp.: 134, 1347-1354, 1991) describen la secuencia deducida de aminoácidos del FGFR-4, un receptor ácido del factor de crecimiento de fibroblastos (nº de identificación del banco de genes: X57205). El documento WO 93/10230 describe un procedimiento de producción de una genoteca de ADN complementario (ADNc) enriquecida con los genes inducibles por ligandos de una célula. Se realizó un análisis de transferencia northern con ARN aislado de blastos de células T IL-2R positivas humanas estimulados bien con ciclohexamida o sólo con IL-2, o con una combinación de los dos agentes. En base a los patrones de inducción y a los tamaños aproximados de los trancriptos de ARN, se distinguieron 8 genes inducidos por IL-2. Uno de estos clones, denominado 1A8, tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID Nº: 1. Hong et al., (Journal of Immunology, vol. 150, páginas: 3895-3904, 1993) describen el aislamiento de una serie de clones de ADNc que son expresados de forma diferente entre linfocitos B y T. Uno de dichos ADNc fue indicado como BL34. El análisis de transferencia northern realizado con el ADNc BL34 reveló un trancripto de ARNm de 1,6 kb que estaba presente a niveles bajos en el ARN extraído de los linfocitos B inactivos, pero cuya expresión era notablemente mayor en el ARN preparado a partir de células B activadas por mitogenes. Se secuenciaron dos ADNc BL34 de longitud completa, y se identificó un marco de lectura abierto de 588 bp que se predijo que codificaba una proteína de 196
aminoácidos.

Resumen de la invención

La presente invención supone el aislamiento de un gen sobreregulado por p53.

La presente invención se refiere a una molécula polipeptídica aislada que comprende:

i): la secuencia de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 (inhibidor 1 del crecimiento inducido por p53) según se muestra en la figura 7 [SEQ ID Nº: 2] o

ii): una variante alélica de dicha secuencia en la que se eliminan, sustituyen, insertan, invierten o añaden uno o más aminoácidos,

en la que el polipéptido que comprende la variante alélica de la secuencia tiene la propiedad inhibidora del crecimiento de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.

La presente invención también se refiere a una molécula polipeptídica aislada que comprende la secuencia de aminoácidos 142-202 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 según se muestra en la figura 7.

La presente invención se refiere además a una molécula polipeptídica aislada obtenible mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula polipeptídica de la presente invención.

La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula polipeptídica de la presente invención. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN (ácido desoxiribonucleico) y la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ADN.

También se prefiere una secuencia de ADN que tenga la secuencia de nucleótidos como se muestra en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1] o la secuencia de nucleótidos 416-2383 como se muestra en la figura 6 [SEQ ID Nº:1].

La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, en concreto, una molécula de ADN, que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula polipeptídica de la presente invención, en la que el tampón de lavado de la hibridación es 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, y en la que la temperatura de hibridación es de 65ºC.

La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a las secuencias de ácidos nucleicos anteriores.

La presente invención se refiere además a los vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica una molécula polipeptídica como se define anteriormente. Según una realización, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1].

Según otra realización, la secuencia de ADN tiene la secuencia de nucleótidos 416-2383 mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1].

La presente invención se refiere además a células huésped procariotas o eucariotas que contienen un vector de expresión como se define anteriormente.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir una molécula polipeptídica de la presente invención, cuyo procedimiento comprende cultivar una célula huésped como la anteriormente definida bajo condiciones que permitan la expresión de la molécula polipeptídica.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula polipeptídica de la presente invención o de una molécula de ácido nucleico de la presente invención o de un vector de expresión de la presente invención, y al uso de una molécula polipeptídica de la presente invención o de una molécula de ácido nucleico de la presente invención o de un vector de expresión de la presente invención para preparar una composición farmacéutica destinada a tratar tumores y el cáncer. También se describen los procedimientos para detectar las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de toda o parte de la novedosa proteína de respuesta a p53 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7 [SEQ ID Nº: 2] o las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

A. Constructos plasmídicos usados para la expresión de p53 regulada por tetraciclina

El plásmido activador de la tetraciclina (pUHD 15-1 Neo) expresa constitutivamente a tTa (véase el texto). Los mutantes de p53 V143A y N247I fueron clonados en el vector de expresión sensible a la tetraciclina pUHG10-3, produciendo pTE9.5 y pTE3.1, respectivamente. La expresión de los genes de p53 clonados es regulada por tTa que se une a tOp en ausencia de tetraciclina y es inhibida mediante la adición de tetraciclina.

B. Análisis de transferencia western de la expresión de p53 en células Saos-2-A3 y -D4

Se cultivaron células parenterales Saos-2, Saos-2-D4 y -A3 durante toda la noche con tetraciclina (1 ug/ml) o sin ella según lo indicado. Al día siguiente, se elaboraron los extractos nucleares, se resolvieron 80 ug de proteína en un gel de poliacrilamida en presencia de SDS (12%) y se detectó la proteína p53 mediante un análisis de transferencia western usando el anticuerpo monoclonal DO1 (Oncogene Science, Uniondale, NY). La posición de la proteína p53 de longitud completa está marcada por la punta de la flecha. La localización de los patrones de peso molecular está indicada a la derecha (en kilodaltones).

Figura 2

A. Inducción de la luciferaza mediante proteínas p53 mutantes revertidas mediante temperatura

Las células Sao-2-A3B y -D4H cultivadas en un medio que contenía tetraciclina fueron lavadas cuatro veces con DMEM e incubadas con un medio libre de antibiótico (\bullet y \Delta, respectivamente) o con un medio que contenía tetraciclina (\circ y \Delta, 1 ug/ml, respectivamente). Tras 16 horas a 37ºC, se cambiaron las células a una temperatura de 30ºC (punto temporal de 0 horas). Se prepararon los extractos celulares en los tiempos indicados (en horas) y se determinó la actividad de la luciferaza usando cantidades iguales de extractos celulares.

B. Inducción de la expresión del gen hdm-2 en células Saos-2-D4H

Se cultivaron células Saos-2-D4H durante toda la noche con o sin tetraciclina (1 ug/ml) y fueron posteriormente incubadas a 30ºC durante el período de tiempo indicado (en horas) antes de ser cosechadas. Se analizó el ARN total (10 ug) mediante análisis de transferencia northern. Las transferencias duplicadas fueron hibridadas con una sonda de ADNc marcada con ^{32}P bien para hdm-2 o \beta-actina, mostrándose los autorradiogramas de las transferencias hibridadas. A la izquierda, se indica la posición de los marcadores de peso molecular de ARN.

Figura 3

El fragmento de ADNc enriquecido W4.5 identifica un transcripto regulado por p53

Se incubaron células Saos-2-D4H en ausencia o en presencia de tetraciclina (1 ug/ml) a 30ºC como se describe en la fig. 2B. Se hibridó una transferencia northern (10 ug de ARN total/carril) con una sonda de ADNc marcado con ^{32}P correspondiente al clon W4.5. El autorradiograma de la transferencia hibridada se muestra con la posición del marcador de peso molecular indicada a la izquierda.

Figura 4

Los clones A28 y A26 identifican transcriptos regulados por p53V143A mutante sensible a la temperatura en células Saos-2-D4H

Se cultivaron células Saos-2-D4H en ausencia de tetraciclina a 37ºC. Se trataron las células con vehículo (agua o cicloheximida (10 ug/ml) durante 30 minutos y fueron posteriormente incubadas durante 7 horas más a 37 ó 30ºC según lo indicado. Se prepararon las transferencias northern usando cantidades iguales de ARN poli-adenilado y se hibridaron consecutivamente con una sonda de ADNc marcado con ^{32}P para A28 y A26. Se muestran los autorradiogramas con la posición de los marcadores de peso molecular de ARN indicados a la izquierda.

Figura 5

Los transcriptos A28 y A26 son inducidos por la proteína p53 salvaje en células de carcinoma de colon EB1

Se trataron células EB1 clónicas y EB parenterales (que contenían p53 salvaje bajo el control del promotor de la metalotioneína) con vehículo (agua) o CdCl_{2} (6 uM) durante 10 horas según lo indicado. Se aisló ARN poli-adenilado y se prepararon transferencias northern por cuadruplicado. Se hibridaron las transferencias con sondas para los clones A28, A26, W4.5 o \beta-actina. Los autorradiogramas se muestran con la posición de los marcadores de peso molecular indicada a la izquierda.

Figura 6

Secuencia de nucleótidos del ADNc codificante de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1

Figura 7

Secuencia predicha de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1

Figura 8

Análisis de transferencia northern de la expresión de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 en diferentes tejidos humanos

Se usaron 2,5 ug de ARN poli-adenilado procedente de los tejidos de humano adulto indicados para preparar transferencias northern (Clonetech, Palo Alto, CA). Se hibridaron las transferencias con una sonda de ADNc marcada con ^{32}P correspondiente al fragmento A28 del ADNc y se visualizaron mediante autorradiografía. A la derecha, se indica la posición de los patrones de ARN en kb. Se detectó un transcripto de aproximadamente 2,5 kb en todos los tejidos con la posible excepción de los leucocitos sanguíneos periféricos (carril 9). La expresión fue evidente en el tejido testicular ante una exposición más prolongada de la transferencia a la película.

Figura 9

Representación esquemática de la estrategia de clonación y secuenciación para el ADNc de A28 codificante de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1

Se rastrearon genotecas de ADNc de pulmón y cerebro humano con el fragmento A28 del ADNc identificado en el procedimiento de sustracción de genotecas. El clon de ADNc de hibridación más largo que se identificó, A28-15B, tenía una longitud de 1.968 bp y representaba un clon parcial de ADNc. El extremo 5' del ADNc fue obtenido mediante un RACE de 5'. El clon de longitud completa (o longitud casi completa) fue ensamblado usando el sitio único Bgl II en la posición 416 de nt. El ADNc fue secuenciado en ambos sentidos usando los oligonucleótidos específicos de cada gen indicados y la secuenciación automático de desoxi-nucleótidos con tinte (ABI, Foster City, CA).

Figura 10

Traducción in vitro de la proteína PIGI-1 Descripción detallada de la invención Uso y utilidad

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados en una variedad de modos según la presente invención. Por ejemplo, pueden ser usados como sondas de ADN para rastrear otros ADNc y genotecas de ADN genómico con el fin de seleccionar mediante hibridación otras secuencias de ADN que codifiquen proteínas relacionadas con la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Además, los ácidos nucleicos de la presente invención codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser usados como sondas de ADN para rastrear otros ADNc y genotecas de ADN genómico con el fin de seleccionar mediante hibridación las secuencias de ADN codificantes de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 de otros organismos. La sonda de ácidos nucleicos pudría ser ARN o ADN marcado con nucleótidos radiactivos o mediante procedimientos no radiactivos (i.e., biotina). El rastreo podría ser realizado en diversas condiciones restrictivas (a través de la manipulación de la temperatura óptima de hibridación (Tm), normalmente, usando una combinación de fuerza iónica, temperatura y/o presencia de formamida) para aislar homólogos estrecha o vagamente relacionados. Los ácidos nucleicos también pueden ser usados para generar cebadores para amplificar ADNc o ADN genómico usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction). Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también pueden ser usadas para identificar secuencias adyacentes en el ADNc o el genoma, por ejemplo, secuencias flanqueantes y elementos reguladores.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también pueden ser usadas mediante diagnóstico para detectar las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 cuya funcionalidad se ve comprometida en los tumores humanos. Esto estaría indicado por mutaciones, supresiones o mutaciones puntuales, lo que podría ser útil para el diagnóstico de cánceres. La detección de tales mutaciones podría ser determinada mediante técnicas estándar de análisis de ADN, incluyendo la secuenciación genómica y/o de ADNc, SSCP y la transferencia southern. Además, la propia proteína de respuesta a p53 PIGI-1 funcionalmente afectada puede ser detectada usando anticuerpos monoclonales y policlonales que pueden ser generados para que sean selectivos para proteínas normales y mutantes usando un ensayo ELISA, un análisis de inmunoprecipitación, un análisis de inmunohistoquímica o un análisis de transferencia western.

Los polipéptidos de la presente invención son útiles en el estudio de las características de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1; por ejemplo, su estructura, su mecanismo de acción y su función en la oncogénesis. Por ejemplo, se puede estudiar la proteína PIGI-1 para definir en mayor profundidad sus dominios funcionales, y, por lo tanto, puede ser usada para modelizar compuestos con una actividad similar. Además, la proteína PIGI-1 puede ser utilizada para determinar si interactúa consigo misma, con otros homólogos relacionados o con otras proteínas usando la co-inmunoprecipitación a partir de extractos celulares marcados, la transferencia western, el rastreo de genotecas de expresión usando proteína PIGI-1 marcada y/o otras metodologías comunes. La proteína PIGI-1 también puede ser utilizada para determinar su capacidad para unirse a ADN y para identificar sus sitios de unión usando el rastreo de los fragmentos de secuencia genómica o los fragmentos de oligonucleótido sintético usando una tecnología basada en la PCR de enriquecimiento y amplificación de elementos de ADN seleccionados, que pueden ser a su vez dianas en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos. La proteína PIGI-1 también puede ser usada en análisis celulares in vivo y análisis libres de células in vitro con el fin de detectar productos naturales y compuestos sintéticos que podrían imitar, regular o estimular la función de la proteína PIGI-1. La expresión de PIGI-1 (bien ARN o producto proteico) puede ser usada para monitorizar la presencia de la actividad de la proteína p53 salvaje, como en la detección de compuestos que imitan o restablecen la función a la p53 mutante.

Como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, la proteína PIGI-1 posee propiedades inhibidoras del crecimiento y puede verse funcionalmente comprometida en los tumores humanos. De este modo, se pueden utilizar diversas terapias destinadas a la proteína PIGI-1 en el tratamiento de tumores y el cáncer. Por ejemplo, para el tratamiento de los tumores y el cáncer, se pueden usar técnicas de terapia génica que utilizan todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la proteína PIGI-1, técnicas que suponen la administración de proteína PIGI-1 o de fragmentos biológicamente activos de la misma, técnicas que utilizan anticuerpos con especificidad antigénica fusionados a la proteína PIGI-1 o fragmentos biológicamente activos de la misma, o técnicas que utilizan moléculas pequeñas o compuestos modelizados o descubiertos para imitar a la PIGI-1.

A continuación, se describen otros procedimientos diversos de uso de los ácidos nucleicos, los polipéptidos, los vectores de expresión y las células huésped de la presente invención.

Ácidos nucleicos

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, según se define anteriormente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN y la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ADN. También se prefiere una secuencia de ADN que tenga la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1]. También se prefieren secuencias de ácidos nucleicos complementarias a una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, se prefieren las secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con una de estas secuencias de ácidos nucleicos. En el caso de una secuencia de nucleótidos (p.ej., una secuencia de ADN) que codifica parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, es preferible que la secuencia de nucleótidos tenga una longitud de al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente una longitud de al menos aproximadamente 20 a 30 nucleótidos consecutivos.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser aislados de una variedad de fuentes, aunque las secuencias preferidas actualmente han sido aisladas de genotecas de ADNc humano. La secuencia exacta de aminoácidos de la molécula polipeptídica producida variará según la secuencia de ADN inicial.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser obtenidos usando diversos procedimientos conocidos por aquéllos con conocimientos básicos de la técnica. Se pueden emplear al menos tres procedimientos principales alternativos:

(1): el aislamiento de una secuencia de ADN bicatenario procedente de ADN genómico o ADN complementario (ADNc) que contenga la secuencia;

(2): la síntesis química de la secuencia de ADN; y

(3): la síntesis de la secuencia de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En el primer procedimiento, se puede rastrear una genoteca genómica o de ADNc con el fin de identificar una secuencia de ADN que codifique toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Por ejemplo, se pueden rastrear genotecas de ADNc humano con el fin de identificar una secuencia de ADN que codifique toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Se pueden usar diversas genotecas de ADNc, por ejemplo, genotecas de ADNc (de cuerpo estriado) de cerebro humano adulto y pulmón humano adulto (Stratagene, La Jolla, CA).

Para rastrear las genotecas de ADN genómico y ADNc en busca de secuencias que codifiquen la novedosa proteína de respuesta a p53 PIGI-1, se pueden usar diversas técnicas. Esta técnica, por ejemplo, emplea una sonda de ADN monocatenario marcado con una secuencia complementaria a una secuencia que codifica la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos de hibridación de ADN / ADN para identificar la secuencia en copias clonadas de ADN genómico o ADNc que han sido desnaturalizadas a una forma monocatenaria. Las sondas adecuadas incluyen ADNc para la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 adquirido de la misma especie o de una especie relacionada, oligonucleótidos sintéticos y similares.

También se puede rastrear una genoteca de ADN genómico o ADNc en busca de un ADN genómico o un ADNc codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, y en busca de secuencias que flanqueen tales secuencias codificantes, usando técnicas de inmunotransferencia.

En un procedimiento de rastreo típico adecuado para las técnicas de hibridación, primero se extiende una genoteca de ADN genómico o de ADNc sobre placas de agar, y luego se transfieren los clones a membranas filtrantes, por ejemplo, a membranas de nitrocelulosa. Normalmente, la genoteca genómica está contenida en un vector tal como EMBL 3 o EMBL 4 o derivados de los mismos (p.ej., lambda DASH®), o en genotecas de cósmidos, genotecas de fagos P1 o genotecas de YAC. La genoteca de ADNc, normalmente, está contenida en un vector tal como lgt10, lgt11 o lambda ZAP. Luego se puede hibridar una sonda de ADN con los clones para identificar aquellos clones que contienen el ADN genómico o el ADNc codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Alternativamente, Se pueden inducir cepas apropiadas de E. coli que contienen vectores tales como lgt11 o lambda ZAP para sintetizar proteínas de fusión que contengan fragmentos de proteínas correspondientes al inserto de ADNc en el vector. Las proteínas de fusión pueden ser transferidas a membranas filtrantes, por ejemplo, a nitrocelulosa. Luego se puede unir un anticuerpo a la proteína de fusión para identificar toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1.

En el segundo procedimiento, los ácidos nucleicos de la presente invención codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser sintetizados químicamente. Los oligonucleótidos más cortos, tales como de 15 a 50 nucleótidos, pueden ser sintetizados directamente. Para oligonucleótidos más largos, la secuencia de ADN codificante de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 puede ser sintetizada como una serie de 50-100 bases de oligonucleótidos que luego pueden ser ligados consecutivamente (por los sitios de restricción terminal apropiados) para formar la secuencia lineal correcta de nucleótidos.

En el tercer procedimiento, los ácidos nucleicos de la presente invención codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser sintetizados usando la RCP. Brevemente, se usan pares de oligonucleótidos de ADN sintético, generalmente, de una longitud de al menos 15 bases (cebadores RCP) que se hibridan en cadenas opuestas de la secuencia diana de ADN para amplificar enzimáticamente la región intercalada de ADN sobre la secuencia diana. Los ciclos repetidos de desnaturalización térmica del molde, el templado de los cebadores y la ampliación de los términos 3' de los cebadores templados con una polimerasa de ADN resulta en la amplificación del segmento definido por los cebadores RCP. Véase White, T. J., et al., Trends Genet. 5, 185-9 (1989).

Los ácidos nucleicos de la presente invención codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 también pueden ser modificados (i.e., mutados) para preparar diversas mutaciones. Tales mutaciones pueden cambiar la secuencia de aminoácidos codificada por el codón mutado, o pueden ser silenciosas y no cambiar la secuencia de aminoácidos. Se pueden preparar estos ácidos nucleicos modificados, por ejemplo, mutando el ácido nucleico que codifica la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, de manera que la mutación resulte en la supresión, la sustitución, la inserción, la inversión o la adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado usando diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear los procedimientos de mutagénesis dirigida descritos en Taylor, J. W., et al., Nucl. Acids. Res. 13, 8749-64 (1985) y Kunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82, 482-92 (1985). Además, los equipos para realizar la mutagénesis dirigida pueden ser adquiridos en proveedores comerciales. Por ejemplo, se puede adquirir un equipo para realizar la mutagénesis dirigida en Amersham Corp. (Arlington Heights, IL). Además, también se pueden emplear procedimientos de adición, interrupción, supresión y truncamiento como los descritos en Sayers, J. R., et al., Nucl. Acids Res. 16, 791-800 (1988). Las mutaciones pueden ser ventajosas en la producción o el uso de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, estas mutaciones puede modificar la función de la proteína (p.ej., dando como resultado una actividad mayor o menor), permitir niveles más elevados de producción de proteína o facilitar la purificación de la proteína, o proporcionar otros sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción en el ácido nucleico. Todos estos ácidos nucleicos y moléculas polipeptídicas modificados están incluidos en el alcance de la presente invención.

Según se usa en la presente solicitud, a no ser que se limite de otro modo en ejemplos específicos, el término "modificada", cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos o polipéptidos, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que difiere de la secuencia de tipo salvaje que se encuentra en la Naturaleza.

Vectores de expresión

La presente invención se refiere además a los vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, según se definen anteriormente. Los vectores de expresión contienen preferiblemente las secuencias de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1]. Además se prefieren los vectores de expresión que comprenden una o más secuencias reguladoras de ADN ligadas operativamente a la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Como se usa en este contexto, el término "ligado o ligada operativamente" significa que las secuencias reguladoras de ADN son capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.

Los vectores de expresión de utilidad en la presente invención, normalmente, están en forma de "plásmidos", que se refieren a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma vectorial, no están unidos al cromosoma. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas tales de vectores de expresión que realizan funciones equivalentes y que pasan a ser conocidos en la técnica después de ello. Los vectores de expresión de la presente invención también pueden ser usados para integrar de forma estable la secuencia de ADN que codifica la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 en el cromosoma de una célula huésped apropiada (p.ej., células COS, HepG2, Saos 2 y EB).

Los vectores de expresión útiles en la presente invención normalmente contienen un origen de replicación, un 5' localizado en el promotor con respecto a (i.e., corriente arriba de) y seguido por la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, las secuencias de finalización de la transcripción y el vector restante. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas en la técnica, por ejemplo, secuencias líderes de estabilidad que proporcionan la estabilidad del producto de expresión, secuencias líderes secretoras que proporcionan la secreción del producto de expresión, secuencias que permiten la modulación de la expresión del gen estructural (p.ej., mediante la presencia o la ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de cultivo), secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células huésped transformadas, secuencias que proporcionan sitios para el clivaje por endonucleasas de restricción y secuencias que permiten la expresión en diversos tipos de huéspedes, incluyendo, pero no limitándose a procariotas, levaduras, hongos y eucariotas superiores. Las características del vector de expresión real usado deben ser compatibles con la célula huésped que se emplee. Por ejemplo, cuando se expresen secuencias de ADN en un sistema celular mamífero, el vector de expresión debería contener promotores aislados del genoma de células mamíferas, (p.ej., promotor de metalotioneína de ratón), o de virus que crecen en estas células (p.ej., promotor de 7,5 K del virus vaccinia). Un vector de expresión según la presente invención es al menos capaz de dirigir la replicación, y preferiblemente la expresión, de los ácidos nucleicos de la presente invención. Los orígenes adecuados de la replicación incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación de la Col E1, el vírico SV4O y el M13. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus, el promotor del gen lac Z, el promotor de gal 10 y el promotor poliédrico del virus de la poliedrosis nuclear múltiple Autographa californica (AcMNPV). Las secuencias de finalización adecuadas incluyen, por ejemplo, la hormona de crecimiento bovino, SV40, lac Z y las señales de poli-adenilación poliédrica del AcMNPV. Los ejemplos de marcadores que se pueden seleccionar incluyen la resistencia a la neomicina, a la ampicilina y a la higromicina, y similares. Todos estos materiales son conocidos en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles.

Los vectores de expresión comercialmente disponibles que son adecuados para introducir las secuencias de ADN de la presente invención incluyen los vectores de expresión de mamíferos pcDNA3 o pcDNA/Neo, los vectores de expresión de baculovirus pBlueBac y BlueBacHis, el vector de expresión procariota pcDNAII y el vector de expresión de levaduras pYes2, pudiéndose obtener todo ellos en Invitrogen Corp., San Diego, CA.

Se pueden construir los vectores de expresión adecuados que contengan las regiones de codificación y control deseadas usando técnicas estándar de ADN recombinante conocidas en la técnica, muchas de las cuales se encuentran descritas en Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY (1989).

Como se usa en la presente solicitud, a no ser que se limite lo contrario en los ejemplos específicos, el término "regiones de control" se refiere a las secuencias de nucleótidos que regulan la expresión de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, incluyendo, pero no limitándose a, cualquier promotor, silenciador, elemento potenciador, sitio de empalme, elemento de iniciación transcripcional, elementos de finalización transcripcional, señales de poli-adenilación, elementos de control la traducción, sitio de inicio de la traducción, sitios de fin de la traducción y elementos de estabilidad de mensajes. Tales regiones de control pueden estar localizadas en las secuencias 5' ó 3' de la región codificante o en intrones que interrumpan la región codificante.

Células huésped

La presente invención también se refiere a las células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, según se define anteriormente. Véanse, por ejemplo, las células huésped del ejemplo 2 de la presente memoria, que son las preferidas. Las células huésped contienen preferiblemente un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se muestra en la figura 6. Véase, por ejemplo, el vector de expresión que aparece en el ejemplo 2 de la presente memoria, que es el preferido. También se prefieren las células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una o más secuencia de ADN reguladoras capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de y que está operativamente enlazado a una secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Las células huésped adecuadas incluyen células tanto procariotas como eucariotas. Las células huésped procariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, las cepas de E. coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101. Las células huésped eucariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, células del insecto Spodoptera frugiperda, células COS-7, células Saos-2, células HeLa, fibroblastos de piel humana y células de Saccharomyces cerevisiae.

Los vectores de expresión pueden ser introducidos en las células huésped mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la transfección de células huésped con vectores de expresión mediante el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio. Sin embargo, también se pueden emplear otros procedimientos para introducir los vectores de expresión en las células huésped, por ejemplo, la electroporación, la fusión liposomal, la inyección nuclear y la infección vírica o con fagos.

Una vez introducido el vector de expresión en la célula huésped apropiada, se puede cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de grandes cantidades del polipéptido deseado, en este caso, una molécula polipeptídica que comprende toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.

Las células huésped que contienen un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser identificadas mediante uno o más de los seis siguientes enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN; (b) la presencia o ausencia de las funciones génicas marcadoras; (c) evaluación del nivel de trascripción medido mediante la producción de transcriptos de ARNm codificantes de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 en la célula huésped; (d) detección del producto génico inmunológicamente; (e) actividad biológica y (f) PCR.

En el primer enfoque, se puede detectar la presencia de una secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 mediante la hibridación de ADN-ADN o ARN-ADN, usando sondas complementarias a la secuencia de ADN.

En el segundo enfoque, se puede identificar y seleccionar el sistema huésped del vector de expresión recombinante en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas marcadoras (p.ej., la actividad de la timidina-quinasa, la resistencia a antibióticos, etc). Se puede colocar un gen marcador en el mismo plásmido que la secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 bajo la regulación del mismo promotor o de un promotor diferente usado para regular la secuencia codificante de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. La expresión del gen marcador indica la expresión de la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.

En el tercer enfoque, se puede medir la producción de transcriptos de ARNm codificantes de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, se puede aislar ARN poli-adenilado y analizarlo mediante transferencia northern o un ensayo de protección a la nucleasa usando una sonda complementaria a la secuencia de ARN. Alternativamente, se puede extraer y analizar el ARN total de la célula huésped para la hibridación de tales sondas.

En el cuarto enfoque, se puede medir inmunológicamente la expresión de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, por ejemplo, mediante inmunotransferencia con anticuerpo frente a la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 (transferencia western).

En el quinto enfoque, se puede medir la expresión de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 analizando la actividad de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 mediante el uso de procedimientos conocidos.

En el sexto enfoque, se usan cebadores de oligonucleótido homólogos a las secuencias presentes en el sistema de expresión (i.e., secuencias del vector de expresión o secuencias de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1) en una PCR para producir un fragmento de ADN de una longitud predeterminada, indicando la incorporación del sistema de expresión en la célula huésped.

Las secuencias de ADN de los vectores de expresión, los plásmidos o las moléculas de ADN de la presente invención pueden ser determinadas mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear el método de terminación de cadena didesoxi descrito en Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74, 5463-7 (1977) o el método de Maxam-Gilbert descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74, 560-4 (1977).

Debería entenderse, por supuesto, que no todos los vectores de expresión ni las secuencias reguladoras de ADN funcionarán igualmente bien en la expresión de las secuencias de ADN de la presente invención. Tampoco funcionarán igualmente bien todas las células huésped con un mismo sistema de expresión. Sin embargo, cualquier experto en la técnica puede hacer una selección de entre los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ADN y las células huésped, orientándose con la presente memoria, sin tener que realizar una experimentación excesiva y sin alejarse del alcance de la presente invención.

Polipéptidos

La presente invención también se refiere a moléculas polipeptídicas que comprenden toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, como las mostradas en la figura 7 [SEQ ID Nº:2], según se definen anteriormente. En el caso de moléculas polipeptídicas que comprenden parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, es preferible que las moléculas polipeptídicas tengan una longitud de al menos aproximadamente 5 a 8 aminoácidos consecutivos, y más preferiblemente, una longitud de al menos aproximadamente 15 a 20 aminoácidos consecutivos.

Todas las secuencias de aminoácidos están representadas en la presente memoria por fórmulas cuyas orientaciones de izquierda a derecha están en el sentido convencional de terminal amino a terminal carboxilo.

Se pueden obtener los polipéptidos de la presente invención mediante procedimientos sintéticos, i.e., síntesis química del polipéptido a partir de los aminoácidos de sus componentes, mediante procedimientos conocidos por aquéllos con un conocimiento normal de la técnica. Por ejemplo, se puede emplear el procedimiento en fase sólida descrito por Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 5131-5135 (1985). Es preferible que los polipéptidos sean obtenidos mediante su producción en células huésped procariotas o eucariotas que expresen una secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, o mediante la traducción in vitro del ARNm codificado por la secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Por ejemplo, la secuencia de ADN de la figura 6 [SEQ ID Nº: 1] puede ser sintetizada usando la PCR como se describe anteriormente e insertada en un vector de expresión adecuado, que a su vez puede ser usado para transformar una célula huésped adecuada. La célula huésped recombinante puede ser luego cultivada para producir proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Las técnicas para la producción de polipéptidos mediante estos procedimientos son conocidas en la técnica y se encuentran descritas en la presente memoria.

Los polipéptidos producidos de esta manera pueden ser luego aislados y purificados en algún grado usando diversas técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, se pueden emplear procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel y la cromatografía de inmunoafini-
dad.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser usados en una amplia variedad de modos. Por ejemplo, los polipéptidos, incluso aquéllos que sean biológicamente inactivos, pueden ser usados para preparar, de un modo conocido, anticuerpos monoclonales y policlonales capaces de unir los polipéptidos. Estos anticuerpos pueden ser usados, a su vez, para la detección de los polipéptidos de la presente invención en un muestra, por ejemplo, una muestra celular, usando técnicas de inmunoanálisis, por ejemplo, radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzimático o inmunohistoquímica. Los anticuerpos también pueden ser usados en la cromatografía de afinidad para aislar o purificar los polipéptidos de la presente invención procedentes de diversas fuentes.

Los polipéptidos de la presente invención han sido definidos mediante secuenciación determinada de ADN y secuenciación deducida de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, se pueden usar otras secuencias de ADN que codifiquen la misma secuencia de aminoácidos representada en la figura 7 [SEQ ID Nº: 2], o cualquier parte de la misma, para la producción de los polipéptidos de la presente invención.

Además, debería entenderse que existen variaciones alélicas naturales de estas secuencias de ADN y secuencias aminoacídicas, o que pueden ser introducidas intencionadamente usando procedimientos conocidos en la técnica. Estas variaciones pueden ser demostradas por cambios en uno o más aminoácidos de la secuencia total, tales como supresiones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más aminoácidos en dicha secuencia. Tales cambios pueden resultar ventajosos en la producción o el uso de los polipéptidos de la presente invención; por ejemplo, en el aislamiento de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 o de los polipéptidos mediante purificación por afinidad. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo, en base a la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilidad y/o la naturaleza anfifática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen la lisina y al arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargada o con grupos de cabeza no polar con valores similares de hidrofilidad incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina y tirosina. Otras variaciones contempladas incluyen sales y ésteres de los polipéptidos anteriormente mencionados, así como precursores de los polipéptidos anteriormente mencionados, por ejemplo, precursores con sustituyentes N-terminales tales como la metionina, la N-formilmetionina y secuencias líder. Todas estas variaciones están incluidas en el alcance de la presente invención.

Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos

El procedimiento para detectar una secuencia de ácidos nucleicos codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 o una secuencia de ácidos nucleicos relacionada comprende poner en contacto la secuencia de ácidos nucleicos con un marcador detectable que se una específicamente a al menos una porción de la secuencia de ácidos nucleicos, y detectar el marcador así unido. La presencia del marcador unido indica la presencia de la secuencia de ácidos nucleicos. Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos sustancialmente como la mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1], o es complementaria a la misma.

Se puede aislar una muestra de ADN que contenga la secuencia de ADN usando diversos procedimientos para el aislamiento de ADN que son conocidos por aquellos con conocimientos básicos en la técnica. Por ejemplo, se puede aislar una muestra de ADN genómico de tejido congelando rápidamente el tejido del que se va a aislar el ADN, triturando el tejido para producir piezas fácilmente digeribles, colocando el tejido triturado en una solución de proteasa K y SDS, e incubando la solución resultante hasta que se degrade la mayoría de la proteína celular. Luego se desprotoniza el ADN genómico mediante extracciones sucesivas con fenol / cloroformo / isoamil alcohol, se recupera mediante precipitación con etanol y se seca para volverlo a suspender en un tampón.

También se prefiere el procedimiento en el que la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ARN. Preferiblemente, la secuencia de ARN es una secuencia de ARNm. También se prefiere el procedimiento en el que la secuencia de ARN está localizada en las células de una muestra de tejido. Se puede aislar una muestra de ARN que contenga la secuencia de ARN usando diversos procedimientos para el aislamiento de ARN que son conocidos por aquéllos con conocimientos básicos en la técnica. Por ejemplo, se puede aislar una muestra de ARN de células cultivadas lavando las células libres de medio y luego, lisando las células mediante su colocación en una solución de guanidinio 4M. La viscosidad de la solución resultante es reducida extrayendo el lisado con una aguja de calibre 20. Luego se forma una pella de ARN a través de un gradiente secuencial de cloruro de cesio, y se separa cuidadosamente el fluido sobrenadante del gradiente para permitir una separación completa del ARN, encontrado en la pella, del ADN contaminante y de la proteína.

El marcador detectable útil para detectar una secuencia de ácidos nucleicos codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 o una secuencia de ácidos nucleicos relacionada puede ser una secuencia de ADN marcado, incluyendo una secuencia de ADNc marcado, con una secuencia de nucleótidos complementaria a al menos una porción de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.

El marcador detectable también puede ser un ARN marcado que tenga una secuencia complementaria a al menos una porción de la secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.

El marcador detectable de la presente invención puede estar marcado con etiquetas radiactivas comúnmente empleadas, tales como ^{32}P y ^{35}S, aunque se pueden emplear otras etiquetas tales como la biotina o el mercurio. Se pueden usar diversos procedimientos conocidos por aquéllos con conocimientos básicos en la técnica para marcar los marcadores detectables. Por ejemplo, las secuencias de ADN y las secuencias de ARN pueden ser marcadas con ^{32}P o ^{35}S usando el procedimiento de cebadores aleatorios.

Una vez obtenido un marcador detectable adecuado, se pueden emplear diversos procedimientos conocidos por aquéllos con conocimientos básicos en la técnica para poner en contacto el marcador detectable con la muestra de interés. Por ejemplo, se pueden realizar hibridaciones de ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. En un procedimiento típico de hibridación de ADN-ADN para detectar secuencias de ADN codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 en ADN genómico, primero se aísla el ADN genómico usando procedimientos conocidos, y luego se digiere con una o más enzimas de restricción. Los fragmentos de ADN resultantes son separados sobre geles de agarosa, desnaturalizados in situ y transferidos a membranas filtrantes. Tras una pre-hibridación para reducir la hibridación inespecífica, se hibrida una sonda de ácido nucleico radiomarcada con los fragmentos de ADN inmovilizados. Luego se lava la membrana para eliminar la sonda no unida o débilmente unida, y se autorradiografía para identificar los fragmentos de ADN que se han hibridado con la sonda.

La presencia de marcador detectable unido puede ser detectada usando diversos procedimientos conocidos por aquéllos con conocimientos básicos en la técnica. Por ejemplo, si el marcador detectable está marcado radiactivamente, se puede emplear una autorradiografía. En función de la etiqueta empleada, también se pueden usar otros procedimientos de detección tales como la espectrofotometría.

Debería entenderse que las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 también se pueden detectar usando los procedimientos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede usar una sonda de ADN que tenga regiones conservadas del gen para una proteína de respuesta a p53 novedosa con el fin de detectar y aislar las secuencias de ADN relacionadas (p.ej., una secuencia de ADN que codifique una proteína de respuesta relacionada con la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 de ratones, ratas, hámsteres o perros). También se puede usar ADNc de PIGI-1 para aislar regiones reguladoras flanqueantes tales como promotores, y para aislar nuevos genes que, por su proximidad, también pueden estar regulados por la proteína p53. Todos estos procedimientos están incluidos en el alcance de la presente invención.

Como se usa en la presente invención, a no ser que se limite lo contrario en los ejemplos específicos, el término "relacionado o relacionada", cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos, significa una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridarse con una sonda de oligonucleótido basada en la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1, en condiciones de hibridación usando un tampón 0,2 x 55 PE; SDS al 0,1%, y a una temperatura de hibridación de 65ºC.

Los siguientes ejemplos ilustran más a fondo la presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la presente invención, y pueden proporcionar un mejor entendimiento de la misma.

Ejemplo I Identificación de nuevos genes de respuesta a p53 A. Materiales y procedimientos 1.Construcción de plásmidos

Los plásmidos pUHD15-1 Neo (constructo de expresión de las proteínas de fusión a Tet-Vp16), pUHC13-3 (constructo de luciferasa sensible a Tet-VP16, contiene secuencias de operador de TET) y pUHG10-3 (vector de expresión sensible a Tet-Vp16) fueron obtenidos en Dr. H. Bujard, Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania. El ADNc codificante de la proteína p53 mutante en el codón 143 (sustitución de V por A) fue subclonado desde el plásmido pC53-SCX3 [Baker, S. J. et al., Science 249, 912-915 (1990)] en el sitio BamHI del pUHG10-3 dando lugar a pTE9.5. El pTE3.1 fue construido mediante la subclonación del ADNc codificante de la p53 mutante en el codón 247 (sustitución de N por I) desde el plásmido Gal4-53 247 [Unger, T., et al., EMBO J. 11, 1383-1390 (1992)] en el pUHG10-3. El constructo indicador de la luciferasa sensible a p53 fue generado reemplazando la secuencias del operador de TET del pUHC13-3 por dos copias de un fragmento de ADN, 5'-TCGAGCTTGCCTGGACTTGCCTGCCAGATCTGTC
GACGGAGG-3' [SEQ ID Nº: 3], que contenían el sitio de unión a p53 de RGC [Kern, S. E., et al., Science 252, 1708-1711 (1991)], produciendo el plásmido mRE10. Todos los constructos recombinantes fueron caracterizados y confirmados mediante un análisis de secuencias usando una secuenciación automática de ADN (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).

2. Desarrollo de las líneas celulares de expresión de p53

Se cultivaron células Saos-2 (American Type Cell Culture, Bethesda, Maryland) a 37ºC, CO_{2} al 5%, en medio de McCoys complementado con suero fetal de ternero al 15%, L-Glutamina 2 mM, 10 U de penicilina y 10 ug/ml de estreptomicina (Gibco). Las células fueron co-transfectadas mediante electroporación (electroporador de Gibco) con el plásmido de expresión de tTA pUHD 15-1 Neo (proporcionando resistencia a G418) y bien pTE9.5 o pTE3.1 (a una proporción de 1:10, respectivamente). Las células fueron seleccionadas de medios que contenían G418 (250 u/ml, Gibco) y tetraciclina (1 ug/ml, Sigma). Se clonaron y expandieron colonias resistentes a G418, produciendo Saos-2-A3 y Saos-2-D4.

Posteriormente, se establecieron derivados de Saos-2-A3 y Saos-2-D4 que contenían constructo indicador de la luciferasa mRE10, usando pBShygro para la selección positiva (expresa el gen bacteriano de resistencia a la higromicina bajo el control del promotor temprano de SV40, obtenido en Dr. Mark Lynch, Bristol-Myers Squibb) de células resistentes en medios que contenían higromicina B (150 U/ml), produciendo líneas clónicas Saos-2-A3B y Saos-2-D4H, respectivamente.

Se mantuvieron las células EB y EB1 clónicas obtenidas en P. Shaw [Shaw, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)] a 37ºC y CO_{2} al 9% en DMEM (Gibco) complementado con suero fetal de ternero al 10% y antibióticos como se describe anteriormente.

3. Ensayo de luciferasa

Se prepararon extractos celulares en 100 ul de 2x tampón de luciferasa (glicil-glicina 30 mM, pH 7,8, MgSO_{4} 30 mM, EGTA 1,0 mM [Ácido etilenglicol-bis(B-aminoetil éter)N,N,N',N'-tetraacético], DTT 2,0 mM [ditiotreitol]) que contenía Triton X100 al 1%. Se determinó la actividad de la luciferasa mediante la lectura en un luminómetro (modelo LB 952 T/16 de Berthold o modelo ML 1000 de Dynatech) de la luminiscencia relativa producida por 50 ul de extracto (corregida para la concentración de proteína) tras la inyección de 100 ul de tampón de análisis (1 x tampón luciferasa con ATP 2,0 mM [trifosfato de adenosina, pH 7,0] y luciferina 5 mM).

4. Aislamiento de ARN y análisis de transferencia northern

El ARN total fue preparado usando el procedimiento de aislamiento en una sola etapa de tiocianato de guanidinio ácido [Chomczynski, P., et al., Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)]. Se preparó ARN poli-adenilado usando oligotex dT (Qiagen). El análisis de transferencia northern fue realizado como se describe anteriormente [Buckbinder, L., et al., J. Biol. Chem. 267, 25786-25791 (1992)]. La cuantificación de las transferencias northern fue realizada usando una densitometría láser (Molecular Dynamics) de los autorradiogramas o mediante la exposición de las transferencias a placas de formación de imágenes fosforescentes seguida del análisis en un reproductor de imágenes fosforescentes (Fuji).

5. Genotecas de ADNc

El procedimiento de sustracción de genotecas de ADNc fue realizado esencialmente como se describe [Wang, Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 11505-11509 (1991)], a excepción de lo indicado abajo. Se dividió el ADNc en tres alícuotas de las que una fue digerida con Hae III y una con Rsa I. La adición del ligador, la amplificación por PCR, la preparación del ADN conductor biotinilado, la hibridación y la eliminación de híbridos fueron realizadas como se describe anteriormente [Wang, Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 11505-11509 (1991); Buckbinder, L. et al., J. Biol. Chem. 267, 25786-25791 (1992)]. La clonación y el rastreo del ADNc comenzó tras la tercera vuelta de sustracción. El fragmento de ADNc clonado que fue identificado (W4.5) fue luego añadido al conductor para inhibir el fragmento, de manera que se pudieron enriquecer ADNc diferentes en una criba de cuatro vueltas.

6. Análisis de transferencia western

Se resolvieron proteínas nucleares (80 ug) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (12%). Las proteínas fueron electrotransferidas a una membrana de PVDF (Gibco) y se realizaron análisis de inmunotransferencia como se describe en [Harlow, E., et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988)]. Se usó el anticuerpo monoclonal frente a p53 DO1 (mAB-6, Oncogene Science, Uniondale, NY) como anticuerpo primario. Las reacciones de transferencia western fueron detectadas usando un sistema de fototransferencia basado en la quimioluminiscencia (Gibco, Grand Island, NY). La cuantificación del autorradiograma fue como se describe anteriormente.

B. Resultados 1. Desarrollo de líneas celulares que llevan genes inducibles de p53

Se seleccionaron células de osteosarcoma humano Saos-2 como la línea celular parental por varias razones: 1) son nulas para la proteína p53; 2) la sobreexpresión de la proteína p53 salvaje exógena en estas células inhibe su crecimiento [Diller, L., et al., Mol. Cell. Biol. 10, 5772-5781 (1990)]; y 3) en los análisis de la expresión transitoria varios mutantes sensibles a la temperatura (ts, temperature-sensitive) de la proteína p53 humana activan, a la temperatura permisiva (30ºC), un gen indicador que lleva corriente arriba elementos sensibles a p53 (datos no mostrados). Se seleccionaron dos mutantes naturales de p53 para establecer líneas celulares estables: p53N247I (sustitución de asparagina por isoleucina en el codón 247) y p53V143A (sustitución de valina por alanina en el codón 143). El mutante p53N247I resultó mostrar, como una proteína de fusión a GAL4, un fenotipo-ts en transactivación [Unger, T., et al., EMBO J. 11, 1383-1390 (1992)]. El mutante p53V143A [Baker, S. J., et al., Science 249, 912-915 (1990)] no había sido caracterizado previamente como un mutante-ts. Sin embargo, los experimentos de unión a ADN con p53V143A de baculovirus purificado indicaron que se une eficazmente al ADN a 30ºC (Takenaka, Faha y Kley, observación sin publicar), y los experimentos de transfección transitoria demostraron que activa un gen indicador sensible a p53 a la temperatura permisiva (datos no mostrados).

2. Expresión de la proteína p53 regulada por tetraciclina

Se usó un sistema de expresión regulado por tetraciclina (TET) establecido por Gossen y Bujard [Gossen, M. y Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 5547-5551 (1992)] para desarrollar líneas celulares estables. Los ADNc de p53 fueron clonados corriente abajo de un promotor mínimo que llevaba secuencias de operador de tetraciclina (tOp) bacteriano (véase la figura 1A). Un promotor CMV conduce la expresión constitutiva de una proteína bacteriana de fusión al activador VP16 represor de la tetraciclina (tTA) que, en ausencia de tetraciclina, se une a tOp y activa la transcripción del constructo de expresión de la proteína p53. La adición de tetraciclina desactiva la unión a ADN del tTA, acabando por tanto con la expresión de la proteína p53. Por lo tanto, la eliminación de tetraciclina del medio de cultivo celular resulta en una acumulación pronunciada de la proteína p53. Se seleccionaron y se expandieron distintos clones Saos-2-A3 y Saos-2-D4, que mostraban la expresión regulada por la tetraciclina de las dos proteínas p53 mutantes (p53N247I y p53V143A). La figura 1B muestra la expresión regulada de la p53 en estas células a 37ºC al eliminar la tetraciclina del medio de cultivo. La expresión basal es prácticamente indetectable en la línea celular Saos-2-D4. La inducción de la proteína p53 es 20 veces mayor en la células -D4H y aprox. 5 veces mayor en las células Saos-2-A3 (Figura 1B), con los niveles inducidos máximos de p53 siendo comparables en ambas líneas celulares (Figura 1B).

3. Actividad funcional de los mutantes ts de p53

Ambas líneas celulares Saos-2-A3 y Saos-2-D4 fueron posteriormente transfectadas con un constructo indicador de luciferasa que contenía dos copias de las secuencias de unión a p53 de RGC [Kern, S. E., et al., Science, 252, 1708-1711 (1991)]. Se seleccionaron y se caracterizaron clones estables que llevaban un constructo indicador integrado, Saos-2-A3B y Saos-2-D4H, para la inducción de la luciferasa dependiente de la p53. La expresión de la luciferasa fue determinada tras el cambio a la temperatura permisiva (30ºC). Las células Saos-2-A3B y -DH4 cultivadas sin TET mostraron una fuerte inducción al ser incubadas a 30ºC (figura 2A). La inducción es rápida, produciendo un aumento 6 y 10 veces mayor en 4 horas, y una inducción 10 y 200 veces mayor en 24 horas de incubación, en las células Saos-2-A3B y Saos-2-D4H respectivamente, indicando que estas proteínas p53 mutantes humanas sensibles a la temperatura pueden imitar en efecto las funciones de transactivación con especificidad secuencial de la p53 salvaje. No se detectó inducción en las células Saos-2-DH4 en presencia de tetraciclina, y se observó una inducción débil, probablemente debida a una expresión de p53 basal baja (figura 1B), en las células Saos-2-A3B.

Aunque estos experimentos demostraron que las proteínas p53 mutantes, cuando han revertido a un fenotipo de tipo salvaje, pueden activar la expresión génica desde un promotor exógeno que lleve un elemento sensible a p53 en un contexto artificial, no quedó claro si estas proteínas p53 mutantes podrían activar realmente la expresión génica endógena. La figura 2B muestra que la incubación de células Saos-2-D4H (que llevan el mutante p53V143A) a 30ºC está asociada con una inducción pronunciada del gen hdm-2 endógeno de una manera dependiente de p53. Se preparó ARN de células -D4H que habían sido cultivadas con o sin tetraciclina e incubadas a 30ºC durante diversos períodos de tiempo, y se caracterizó mediante un análisis de transferencia northern. La inducción de los niveles de ARNm del hdm-2 fue máxima a las 8 horas de producirse el cambio de temperatura (10 veces mayor, fig. 2B). El subsiguiente descenso rápido de los niveles de ARNm del hdm-2 puede deberse, en parte, al descenso rápido de la expresión de p53 que se produce durante este período de tiempo. Los niveles de ARN de p53 disminuyen rápidamente tras el cambio de temperatura a 30ºC (datos no mostrados), lo que podría ser un resultado de la reducción de temperatura y el descenso asociado en la actividad transcripcional, y/o cierto efecto de retroalimentación negativa mediado por la proteína p53.

4. Identificación de nuevos genes regulados por p53

Los experimentos anteriormente descritos sugirieron que la línea celular Saos-2-D4H representaría una herramienta útil para el aislamiento de genes regulados por p53. Con este fin, se preparó ARN 8 horas después de haberse producido el cambio de temperatura a partir de células mantenidas bajo tres condiciones distintas, denominadas: p53 "nula" (incubada con tetraciclina a 30ºC), "salvaje" (incubada sin tetraciclina a 30ºC) y "mutante" (incubada con tetraciclina y mantenidas a 37ºC). La metodología usada para enriquecer secuencias inducidas por p53 de tipo salvaje, i.e., p53V143A revertida mediante temperatura, estaba basada en un procedimiento de sustracción de genotecas conducido por la PCR [Wang Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 11505-11509 (1991)] (Para más información, véase el apartado de "Materiales y procedimientos" anterior de la presente memoria). Brevemente, el ADNc fue preparado a partir de las tres poblaciones de ARN, digerido con las enzimas de restricción Rsal o HaeIII y, tras la adición de ligadores, amplificado mediante PCR para dar lugar al material inicial de genotecas de ADNc. El conductor fue preparado mediante el acoplamiento de fotobiotina a la p53 "nula" y "mutante". Fragmentos de PCR que luego fueron incubados en un exceso molar 20 veces mayor con fragmentos de "tipo salvaje" (trazador) en una mezcla de hibridación. Tras una incubación prolongada, se separaron los híbridos y se sometió el resto de material no hibridado a un segundo ciclo de hibridación. El material no hibridado fue amplificado por PCR para producir el material enriquecido de la primera vuelta. Se siguió enriqueciendo éste mediante dos ciclos más de conducción. El material sobre regulado fue lo suficientemente enriquecido como para ser caracterizado por hibridación de colonias usando la sonda enriquecida de la tercera vuelta.

5. Identificación de transcriptos regulados por la proteína p53 pertenecientes a la clase de abundancia intermedia

Todas las colonias que se hibridaron fuertemente con la sonda enriquecida de la tercera vuelta estaban compuestas de un fragmento de ADNc, denominado W4.5. Un análisis de transferencia northern en el que se usó sonda de W4.5 marcada reveló la presencia de un ARNm fuertemente hibridante de aprox. 2,2 kb de tamaño en las células de expresión de la p53 "nula" y "mutante", y que fue inducido con fuerza al cambiar las células a la temperatura permisiva de 30ºC (estado de "tipo salvaje"). Se alcanzó una inducción 15 veces mayor a las 8 horas de haberse producido el cambio de temperatura (figura 3). De manera similar al perfil observado para la inducción del ARNm de hdm-2 (véase figura 2B), los niveles de ARNm descendieron a partir de entonces. Inicialmente, no se detectó ninguna homología de las secuencias de ADN con el W.4.5 mediante una búsqueda en la base de datos del banco de genes. Sin embargo, mientras estábamos caracterizando este nuevo gen más detalladamente, apareció un informe [El Deiry, W. S., et al., Cell 75, 817-825 (1993)] que describía la identificación de un gen inducido por la p53 codificante de un nuevo transcripto de aprox. 2,1 kb, denominado WAF1. La comparación de las secuencias reveló que la secuencia de ADN del W4.5 es idéntica a la de un fragmento de restricción Rsal de 466 bp presente en la región no traducida de 3' de la secuencia de ADNc del WAF1 publicada. Los esfuerzos de clonación realizados por nuestra cuenta confirman que el WAF1 es una gen regulado por p53, y demuestran que también es inducido eficazmente por una proteína mutante de p53V143A humana revertida al mediante un cambio de temperatura. A juzgar por la abundancia del fragmento W4.5 en el material inicial de la genoteca de ADNc original, y por la intensidad de las especies de ARNm hibridante de las transferencias northern, en comparación con la del transcripto de ARNm de la \beta-actina (abundancia elevada, aprox. 0,5% de la población total de ARNm), el transcripto codificante del W4.5 pertenece a una clase de transcriptos de abundancia intermedia (0,1-0,05% de ARNm, en comparación con la \beta-actina).

El procedimiento de sustracción de genotecas basado en la PCR tiende a enriquecer eficazmente para los transcriptos más abundantes y expresados diferencialmente. Con el fin de enriquecer para las secuencias de ADNc menos abundantes pero reguladas, los fragmentos de W5.4 fueron conducidos fuera de la genoteca de ADNc enriquecida. Esto condujo a la identificación de dos fragmentos de ADNc no solapantes, el W5.5 y el B26. Ambos W5.5 y B26 se hibridaron en transferencias northern con un transcripto regulado de un tamaño aprox. de 6 kb (datos no mostrados). El análisis secuencial reveló que el W5.5 es idéntico a una secuencia presente en la secuencia de ADNc del hdm-2 informada. El análisis secuencial del B26 no reveló ninguna homología secuencial con la secuencia parcial de ADNc del hdm-2 publicada. Sin embargo, mediante el uso de ADN genómico procedente de un tumor humano anteriormente caracterizado para la amplificación del gen hdm-2 (obtenido en A. J. Levine, Universidad de Princeton, Princeton, NJ), observamos la presencia de un fragmento de ADN genómico amplificado en el análisis de transferencia southern. Concluimos que el B26 representa el segundo fragmento identificado para el hdm-2 y, lo más probable, es que esté codificado por regiones no traducidas del gen que no hayan sido clonadas previamente. De manera similar a los resultados obtenidos con la sonda de W4.5, el transcripto de hdm-2 pertenece a los transcriptos de clase de abundancia intermedia de estas células.

6. Identificación de nuevos transcriptos regulados por la proteína p53 pertenecientes a la clase de baja abundancia

Tras varios rastreos de las genotecas, se identificaron clones simples para dos fragmentos de ADNc no solapantes, el A26 y el A28. Al hibridarse con el material inicial, ambos fragmentos parecieron estar codificados por transcriptos de baja abundancia pero regulados. Esto fue confirmado mediante un análisis de transferencia northern. Debido a la abundancia extremadamente baja de estos transcriptos (< 0,005% del ARNm total, en comparación con la \beta-actina), se preparó ARN poli-adenilado procedente de células -DH4 cultivadas en ausencia de tetraciclina y mantenidas a 37ºC o 30ºC durante 7 horas.

El análisis de transferencia northern en el que se usó la sonda A28 reveló un ARNm hibridante de aprox. 2,5kb que es inducido al producirse el cambio de temperatura de una manera dependiente de p53 (figura 4, carril 1 frente al 2). No se observó inducción en presencia de tetraciclina (datos no mostrados). El tamaño del ARNm es distinto del de otros transcriptos activados por la proteína p53 caracterizados y parece estar codificado por un nuevo gen regulado. No se detectó ninguna homología secuencial al buscar en la base de datos del banco de genes (datos no mostrados). El gen codificante de la secuencia A28 pareció ser un gen de respuesta directa a p53. Esto fue examinado en células que fueron tratadas como antes, a excepción de que el inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida (chx, 10 ug/ml) fue añadido 30 min antes del cambio de temperatura (el tratamiento con chx resultó en una inhibición >95% de la síntesis proteica a juzgar por el marcado de las células con metionina ^{35}S, datos no mostrados). El tratamiento con chx aumentó los niveles basales (no inducidos) del transcripto codificado por A28, pero no evitó la inducción dependiente de la p53 de este transcripto (inducción 12 veces mayor, figura 4, carril 3 frente al 4). Se ha observado una estabilización del ARN mediada por la chx, denominada super-inducción, para un número de especies de ARN, y ha sido especialmente bien caracterizada para los genes de respuesta inmediata-temprana al suero [Lau, L. F. Y Nathans, D., (1991). "Hormonal Control: Regulation of Gene Transcription" (Cohen, P. y Faulks, J. G. eds), pp. 757-793, Elsevier Sciences Publishers, Londres]. Como se propone anteriormente, la falta de inhibición de retroalimentación o la renovación de los inhibidores lábiles podría explicar esta estabilización.

La sonda A26 detectó dos especies de ARN de un tamaño aprox. de 3 y 4 kb al realizar el análisis de transferencia northern. Ambas especies de ARN son especialmente inducidas de una manera dependiente de p53 al cambiar la temperatura de las células -D4H (5 veces mayor, figura 4, carril 1 frente al 2). No se observó ninguna inducción en presencia de tetraciclina (datos no mostrados). Sin embargo, aunque está regulada, no está claro si A26 está codificado por un gen de respuesta directa a p53. En las células tratadas con chx, el transcripto codificante de A26 basal también es aumentado, si embargo, en contraste con el transcripto codificado por A28, no se observó ninguna inducción al producirse el subsiguiente cambio de temperatura (figura 4, carril 3 frente al 4). La información secuencial preliminar indica que A26 también está codificado por un nuevo gen (datos no mostrados).

7. La inducción de nuevos transcriptos regulados por p53 está correlacionada con la apóptosis inducida por p53

Para complementar nuestros estudios sobre la regulación de los transcriptos codificantes de A28 y A26 en células Saos-2, cuya velocidad de crecimiento es reducida, pero no suprimida ante la inducción de la proteína p53 de tipo salvaje como consecuencia del cambio de temperatura (datos no mostrados), estudiamos la regulación de estos transcriptos en una línea celular de carcinoma colorectal (EB) que transportaba un gen inducible de la proteína p53 de tipo salvaje. En estas células EB, se coloca la expresión de la proteína p53 de tipo salvaje bajo el control de un promotor de metalotioneína que es activado por iones metálicos tales como el zinc o el cadmio [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)]. La expresión de p53 en estas células, tanto en cultivo como en un tumor establecido en animales, conduce a la apóstosis [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)]. Se preparó ARN poli-adenilado procedente de células EB parenterales cultivadas y células EB1 clónicas (que transportaban el gen p53 de tipo salvaje) tratadas con y sin cadmio (6 uM) durante 10 horas. El análisis de transferencia northern muestra que el transcripto codificante de A28 es fuerte y específicamente inducido (>20 veces más, figura 5) en las células EB1 clónicas positivas en p53 tratadas con cadmio. De manera similar, los transcriptos que se hibridaron con la sonda A26 fueron inducidos (5 veces más, figura 5). Curiosamente, las principales especies de ARN detectadas por la sonda A26 son de un tamaño aprox. de 2 y 3 kb, en comparación con el tamaño aprox. de 3 y 4 kb para las células Saos-2-D4H. Ante una exposición más prolongada también se detectó una especie de ARN de aprox. 4 kb (datos no mostrados). Una posible explicación de estos descubrimientos es que el transcripto del gen codificante de A26 es alternativamente empalmado en diferentes tipos de células. El ARNm de WAF1/CIPI/p21 fue inducido 8 veces más bajo estas condiciones (figura 5). Los niveles de ARNm de la actina no fueron inducidos, y se observaron niveles similares en las células EB1 tratadas con o sin cadmio (figura
5).

C. Comentario de los resultados

La fuerte correlación entre la capacidad de p53 para unirse a ADN y activar la transcripción con especificidad secuencial, y su capacidad para inhibir el crecimiento celular o inducir a la apóptosis sugiere que los genes inducidos por p53 pueden desempeñar un papel fundamental en la mediación de la función de p53 como inhibidor de tumores. En este estudio, pretendemos aislar y caracterizar tales efectores potenciales en la ruta de señalización de p53. Esto conduce al aislamiento de genes regulados por p53 previamente identificados, así como otros nuevos transcriptos regulados por p53.

La estrategia que usamos suponía establecer células de osteosarcoma Saos-2 humanas transformadas por ingeniería genética (con una deficiencia en la expresión de la proteína p53 endógena) que transportaban genes inducibles codificantes de mutantes sensibles a la temperatura (ts) de p53. Mediante el uso de un sistema de expresión regulado por tetraciclina, desarrollado por Gossen y Bujard [Gossen, M. y Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 5547-5551 (1992)], se establecieron líneas celulares estables que contenían un gen de p53 integrado codificante de cualquiera de los dos mutantes oncogénicos naturales de p53, p53N247I y p53VI43A. La proteína p53 está estrechamente regulada por la tetraciclina, y ante un cambio de temperatura (de 37ºC a 30ºC), ambas proteínas mutantes activan eficaz y específicamente un constructo indicador de luciferasa integrado que contiene dos copias del elemento sensible a p53 de RGC [Kern, S. E, et al., Science 252, 1708-1711 (1991)], y el gen hdm-2 endógeno. Ya se ha observado que el mutante p53N247I es sensible a la temperatura para la transactivación como una proteína de fusión a GAL4 [Unger, T., et al., EMBO J. 11, 1383-1390 (1992)]. Nuestros descubrimientos confirman que este mutante presenta propiedades sensibles a la temperatura cuando se expresa de una forma regulada como una proteína nativa. Además, nuestros estudios revelan que el mutante p53V143A [Baker, S. J., et al., Science 249, 912-915 (1990)] es sensible a la temperatura para la transactivación y parece más activo que el mutante p53N247I en estas células Saos-2 clónicas. Sin embargo, sólo se detectó actividad de tipo salvaje al incubar las células a 30ºC, en oposición con la incubación a 34ºC para las células mutantes p53N247I (datos no mostrados). Estos resultados indican que mutantes diferentes de p53 pueden mostrar una sensibilidad diferente con respecto a su capacidad por revertir a un fenotipo de tipo salvaje. Los estudios en los que se usa p53V143A de baculovirus purificado muestran que este mutante es sensible a la temperatura para la unión a ADN in vitro, lo que indica que la sensibilidad a la temperatura es una propiedad intrínseca de este mutante de p53 (Takenaka, Faha y Kley; observaciones no publicadas).

Dada su sensibilidad a la transactivación dependiente de p53, se usó la línea celular que expresa a p53V143A, Saos-2-D4H, para aislar nuevos transcriptos sobre-regulados por p53. Los ADNc que clonamos usando un procedimiento de selección descrito por Wang y Brown [Wang, Z. y Brown, D. D., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 11505-11509 (1992)] están codificados por transcriptos que pertenecen principalmente a dos categorías, i.e., transcriptos regulados por p53 pertenecientes a la clase de abundancia intermedia y de abundancia baja (en comparación con el transcripto de \beta-actina de la clase de abundancia alta, por ejemplo). Los clones que aislamos para los transcriptos de la clase de abundancia intermedia representaban secuencias codificadas por el gen recientemente clonado WAF1/CIP1/p21 [El-Deiry, W. S., et al., Cell 75, 817-825 (1993)], del que se informó mientras caracterizábamos la sonda W4.5 clonada, y el gen hdm-2. De este modo, nosotros confirmamos por nuestra cuenta que el WAF1/CIP1/p21 es un gen regulado por p53, y demostramos que su activación puede ser desencadenada mediante proteínas p53 humanas mutantes revertidas mediante temperatura. Esto confirma además que estas proteínas mutantes actúan como las verdaderas proteínas p53 de tipo salvaje a la temperatura permisiva. Los clones que aislamos para los transcriptos pertenecientes a la clase de baja abundancia (la expresión es al menos un orden de magnitud menor que la de los transcriptos WAF1/CIP1/p21 y hdm-2) parecieron estar codificados por nuevos genes regulados por p53. Un fragmento de ADN, el A28, detecta un ARNm regulado específicamente por p53 de aprox. 2,5 kb en transferencias northern. Otro fragmento de ADNc clonado, el A26, detecta dos transcriptos sobre-regulados específicamente por p53 en células Saos-2-D4H de aprox. 3 kb y 4 kb de tamaño.

Aunque ambos transcriptos estén regulados por p53, la inducción es distinta en lo que respecta a su sensibilidad hacia el inhibidor proteico cicloheximida. Por definición, el gen codificante de A28 es un gen de respuesta directa a p53, pues la síntesis proteica en curso no es requerida para la inducción. Por el contrario, no está claro si el gen codificante de A26 es un gen de respuesta directa, pues la inducción generada por p53 es bloqueada por la cicloheximida. Esto se puede interpretar de varios modos: 1) el gen codificante de A26 no es un gen de respuesta directa; 2) debido a la estabilización del ARN codificante de A26 y a la posible activación de rutas alternativas de señalización ante un tratamiento con cicloheximida, la inducción directa generada por p53 puede verse ocultada; o 3) la cinética de la inducción de los transcriptos codificantes de A26 por parte de p53 es comparable con la de otros genes de respuesta directa tales como WAF1/CIP1/p21, hdm-2, lo que sugiere que el gen codificante de A26 puede ser un gen de respuesta directa. En tal caso, la activación directa por parte de p53 requeriría la presencia de una proteína co-activadora de vida corta y, posiblemente, estar mediada por un elemento de respuesta a ADN distinto del sitio consenso de unión de 20 bp de p53 [El-Deiry, W. S., et al., Natura Genetics 1, 45-49 (1992)], según lo dictado por el co-activador putativo. La clonación y la caracterización del promotor debería abordar este asunto.

Este estudio muestra que la p53 activa múltiples genes diana de células Saos-2. Todavía queda por establecer si las proteínas codificadas por los transcriptos pertenecientes a la clase de abundancia baja podrían ser inhibidores del crecimiento particularmente potentes. En realidad, las células Saos-2-D4H sólo tienen una disminución moderada de su velocidad de crecimiento ante la inducción de p53 a la temperatura permisiva (datos no mostrados). La razón de ello no está clara, pero puede implicar el hecho de que estas células también son negativas para la expresión de RB endógeno. De este modo, ampliamos nuestros estudios a un tipo diferente de células, a una línea celular de carcinoma colorectal (células EB), que ante una inducción mediada por cadmio de un gen de p53 de tipo salvaje integrado, han demostrado sufrir apóstosis, tanto in vitro como in vivo como un tumor establecido [Shaw, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)]. Nuestros resultados demuestran que el ARN de WAF1/CIP1/p21, y los transcriptos codificantes de A28 y A26, son aumentados de manera eficaz y específica ante la inducción de la proteína p53 de tipo salvaje. La inducción se hizo más pronunciada para el ARN codificante de A28 que para los ARN codificantes de WAF1/CIP1/p21 y A26. Como la inducción de estos transcriptos tuvo lugar en un tipo de células sometido a una apóptosis mediada por p53, es posible que las proteínas codificadas puedan representar efectores corriente abajo de la ruta de señalización de p53 que participa en la muerte celular programada. Se requerirá un análisis más a fondo para estudiar esta posibilidad.

En resumen, demostramos que la p53 puede activar múltiples rutas de señalización a través de su capacidad para actuar como un activador transcripcional. De este modo, la activación de múltiples efectores puede participar en la mediación de las funciones de p53 como un inhibidor tumoral.

Ejemplo II Clonación y análisis del ADNc de longitud completa correspondiente al fragmento de ADNc A28

Se demostró que un fragmento específico de ADNc, denominado A28 (véase ejemplo I), reconoce un trascripto regulado por la proteína p53 de aproximadamente 2,5 kb. Esta sonda fue usada para clonar el correspondiente ADNc de longitud completa. El ADNc fue secuenciado y la proteína codificada predicha fue identificada.

A. Clonación del ADNc correspondiente al fragmento de ADNc A28

Se sondaron transferencias northern que contenían ARN poli-adenilado de múltiples tejidos humanos (adquiridos en Clonetech, Palo Alto, CA) con el fragmento de ADNc A28 (análisis de transferencia northern como el descrito en el ejemplo I anterior de la presente memoria). Este análisis reveló que todos los tejidos analizados expresaban cantidades variables de un transcripto correspondiente a A28, de un tamaño aproximado de 2,5 kb, con la posible excepción de los leucocitos sanguíneos periféricos (figura 8). En el cerebro, se detectó una elevada expresión.

Se adquirió una genoteca de ADNc de cerebro humano en Stratagene (La Jolla, CA). Se rastrearon 1 x 10^{6} fagos usando una sonda de A28 marcada con ^{32}P (1 x 10^{6} cpm/ml) bajo las condiciones descritas por el productor de la genoteca (Stratagene) con las siguientes modificaciones. La solución de hibridación fue: formamida al 50%, 5 x SSPE (1 X SSPE = NaCl 0,15M; NaH_{2}PO_{4} 0,01 M, EDTA 1,25 mM, pH 7,4), 5 x solución de Denhardt [Eds. Ausubel et al.,"In Current Protocols In Molecular Biology", John Wiley and Sons Publishers, Nueva York, NY (1988)], y 50 ug/ml de ADN esperma desnaturalizado de arenque. La hibridación fue llevada a cabo mediante la incubación a 42ºC durante toda la noche. Las transferencias fueron lavadas 3 veces durante 15 minutos con un exceso de tampón de lavado (2 x SSPE, SDS al 1%), a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 15 minutos en 0,2 x SSPE, SDS al 0,1% a 65ºC.

Las placas de hibridación fueron purificadas mediante una vuelta secundaria de rastreo. Se analizaron más a fondo tres clones que contenían ADNc que variaban de 1,5 a 2,0 kb. El clon más largo, A28-15B, fue rescatado como plásmido pBluescript (descrito en los procedimientos proporcionados por Stratagene). El A28-15B fue secuenciado usando cebadores con especificidad vectorial (T3, T7, KS, SK, véase Bluescript, Stratagene) y cebadores con especificidad génica (figura 9). El A28-15B era 1969 nts (415-2383 de la secuencia mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº:1]). Pareció no haber longitud completa en base a la discrepancia en el tamaño con las transferencias northern y al hecho de que la secuencia comenzó en medio del marco de lectura abierto putativo.

B. RACE de 5' de las secuencias de A28

Para obtener la secuencia 5' perdida, se realizó una técnica en la que se usó una combinación de ARN transcrito a la inversa, ligación de cebadores de anclaje monocatenarios y PCR con cebadores anidados (denominados colectivamente RACE de 5'), usando un equipo adquirido en Clonetech. Se siguió el protocolo propuesto por las instrucciones de los fabricantes, que se describe brevemente abajo. Se transcribió inversamente ARN poli-adenilado de células EB1 (descritas en el ejemplo I anterior de la presente memoria), usando un cebador LB 57 (figura 9). El anclaje fue ligado al ADNc de la primera cadena. Entonces se realizó una PCR secuencial con el cebador de anclaje y LB 57, y luego con el cebador de anclaje y LB 44 (figura 9). Se obtuvo un producto de aproximadamente 1.000 pares de bases y fue secuenciado con el anclaje y el LB 50 como anteriormente. El A28-15B de solapamiento de secuencias fue idéntico, pero se extendió también a aproximadamente 415 bases más de 5' (figuras 6 y 9). Se realizó la secuenciación de este producto y la información obtenida predijo que contenía el sitio de inicio de la traducción y la región codificante de la proteína perdida (véase más abajo). Además de su tamaño, cuando el producto de RACE de 5' fue alineado con la secuencia A28-15B, sugirió que era casi de longitud completa.

C. Construcción de un clon de longitud completa de A28

El clon de ADNc parcial de A28-15B contiene un único sitio de restricción Bgl II a 16 nucleótidos de su extremo 5'. De este modo, A28-15B fue digerido con BglII y SmaI, sólo presentes en el poli-ligador (todas las enzimas de restricción fueron adquiridas en Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, y usadas según las especificaciones del fabricante). El fragmento de ADNc de 5' de la PCR fue digerido con Bgl II y clonado al A28-15B digerido produciendo pBS-A28. La secuenciación confirmó una inserción fiel. En la figura 6 [SEQ ID Nº: 1], se ofrece la secuencia del clon de longitud completa construido. Todas las secuencias generadas mediante PCR también fueron confirmadas mediante la secuenciación de la correspondiente secuencia genómica derivada de un clon de cósmido, identificado con el fragmento original de ADNc A28. El plásmido pBS-A28.7 de una célula huésped de Escherichia coli (cepa D45\alpha) fue depositado en la colección estadounidense de tipos de cultivos, en Rockville, Maryland, el 29 de junio de 1994, bajo el Tratado de Budapest, y recibió en nº 69649 de identificación en la ATCC. Al concederse una patente estadounidense, todas las restricciones en cuanto a la disponibilidad por parte del público de la línea celular depositada serán irrevocablemente eliminadas. El depósitos será reemplazado si las muestras viables no pueden ser dispensadas por el depositario.

D. Análisis del ADNc de cadena completa de A28

La proteína que se prevé que está codificada por el ADNc de A28 es de 202 aminoácidos (figura 7 [SEQ ID Nº:2], y es conocida por la presente memoria como la proteína PIGI-1. La proteína predicha comienza con la metionina de iniciación (ATG) en el nucleótido 93, y continúa hasta el codón de terminación (TGA) en el nucleótido 740. El ATG está precedido por secuencias asociadas con los sitios de iniciación de la traducción [Kosak, M., Nucl. Acids Res. 20, 8125-8132 (1987)]. La proteína predicha presenta una fuerte homología aminoacídica con dos proteínas predichas de tamaño similar, pero de función desconocida, presentes en el banco de genes (HUMGOS8PPC, 44,3% de identidad con respecto a 185 aminoácidos, y Hslr20arna, 48,3% con respecto a 147 aminoácidos).

E. Expresión de la PIGI-1 sentido y antisentido in vitro e in vivo

Se clonó ADNc de longitud completa de PIGI-1 en un vector de expresión eucariota / procariota, pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Esto se llevó a cabo mediante la subclonación de los ADNc flanqueados por el sitio EcoRI procedentes de pBS-A28 (el sitio EcoRI de 3' fue el sitio de clonación original para la genoteca de ADNc y el sitio EcoRI de 5' fue generado mediante el cebador de anclaje en el RACE de 5') al pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Brevemente, el fragmento 2.4 EcoRI fue resuelto desde el vector sobre un gel de agarosa al 0,8%, y la banda de ADN extirpada fue purificada usando Gene Clean (Bio101, La Jolla, CA). El vector pCDNA3 fue preparado mediante digestión con EcoRI, seguida por un tratamiento con fosfatasa intestinal de ternero (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) y la purificación con Gene Clean. El inserto fue mezclado con vector tratado con fosfatasa en una proporción molar de 5:1 y ligado con la ligasa de ADN del fago T4 (Boehringer Mannheim) durante 1 hora a 14ºC. Se usaron 10 ng de ADN ligado para transformar la cepa competente de E. coli DH5\alpha, según las instrucciones del fabricante (GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, NY). Los recombinantes fueron seleccionados sobre placas de medio LB con ampicilina [Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)]. Los recombinantes fueron analizados mediante la preparación de plásmido producido a partir de cultivos líquidos usando columnas de purificación de plásmidos Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y mediante la digestión bien con ApaI o con BamHI para determinar, mediante diagnóstico, la orientación (ambas enzimas cortan al vector y al inserto cada una a un tiempo), produciendo pCDNA3-PIGI-1 y pCDNA3-PIGI-1AS (antisentido).

Estos plásmidos fueron usados como molde para producir ARN, y posteriormente la proteína, usando un sistema acoplado in vitro de transcripción / traducción (TNT, Promega, Madison, WI), según las instrucciones del fabricante. Se usó metionina ^{35}S (Amershan, Arlington Heights, IL) para marcar los productos de traducción in vitro (según el fabricante, Promega), que fueron fraccionados sobre un gel de poliacrilamida en presencia de SDS (Novex, San Diego, CA) y visualizados tras la exposición a placas de formación de imágenes fosforescentes (Fuji, Stamford, CT). Se detecta un producto de aproximadamente 23 kd mediante el extracto programado con pCDNA-PIGI-1 (figura 10). Este tamaño es cercano al tamaño predicho de 22,7 kd. El extracto programado con antisentido no mostró ningún producto proteico específico. No se observa ningún producto de traducción con el vector de expresión antisentido de PIGI-1 (pCDNA3-PIGI-1AS).

Se detectó un producto de aproximadamente 8 Kd en las reacciones de traducción programadas con el truncamiento A28-15B. El A28-15B comienza en la posición nt 416 de la PIGI-1 de longitud completa, y se observa que un ATG del nucleótido 493 parece cumplir las reglas de iniciación de Kozak; sin embargo, éste sólo codificaría un péptido de 5 aminoácidos antes de llegar al codón de terminación, no siendo, de este modo, responsable del producto observado. La siguiente metionina de iniciación potencial (ATG) está en la posición 517, cumple las reglas de Kozak, está en el marco con la proteína PIGI-1 predicha y se prevé que codifique los 61 aminoácidos C-terminales. El tamaño de este producto sería de 7,4 kd y concuerda con el tamaño del producto de traducción in vitro observado producido con los lisados programados de pCDNA3-A2815B.

F. La proteína PIGI-1 inhibe el crecimiento de las células tumorales

Se demostró que la proteína PIGI-1 es inducida directamente por p53. Como p53 es un inhibidor tumoral conocido del que se ha demostrado que regula al menos dos genes, WAFI/p21 y Gadd45, que tienen por sí mismos propiedades inhibidoras del crecimiento, examinamos los efectos de PIGI-1 en el crecimiento de las células tumorales humanas. Los vectores de expresión eucariotas pCDNA3-PIGI-1, pCDNA3-PIGI-1AS, la proteína p53 salvaje o el vector pDCNA3 fueron transfectados usando lípido catiónico (Lipofectamina, Gibco, Grand Island, NY) en células de carcinoma de colon EB (adquiridas en Dr. Phillip H. Shaw, Institut de Pathologie, Lausanne, Suiza), líneas celulares de carcinoma cervical HeLa o de osteosarcoma Saos2 (ambas adquiridas en ATCC, Rockville, MD). Las células fueron cultivadas en presencia de G418, y las colonias fueron clasificadas tras aproximadamente 2 semanas de selección. Los resultados con A28-15B sugieren que los 61 aminoácidos del terminal carboxilo de la proteína PIGI-1 también son capaces de mediar la inhibición del crecimiento de células tumorales (datos no mostrados).

En concordancia con su función de inhibición de tumores, observamos una importante reducción en el crecimiento de todas las líneas celulares transfectadas con p53, que variaba del 88 al 100% de reducción en la formación de colonias en comparación con el plásmido de control, pCDNA3 (tabla 1). La expresión del ARN de PIGI-1 también conduce a una reducción del crecimiento de las células tumorales humanas, Saos-2 y EB (97 y 82% respectivamente) así como de otras especies de mamíferos; células de mono COS7 y células de ratón NIH 3T2 (61 y 90% de inhibición del crecimiento por PIGI-1 respectivamente). La expresión de la PIGI-1 antisentido (PIGI-1-AS) no presentó un efecto apreciable sobre el crecimiento de las células COS7 (110% de vector), pero, en las líneas humanas Saos 2 y EB, pareció proporcionar una ligera ventaja de crecimiento (200% y 179% respectivamente). Esto puede indicar que la PIGI-1 antisentido está inhibiendo el ARNm de la PIGI-1 endógena (la estabilidad o la expresión), lo que indica además que la PIGI-1 endógena participa en las funciones de crecimiento celular.

En concordancia con el papel de p53 en la respuesta al daño producido en el ADN, hemos descubierto que, como WAF1 [El-Deiry, et al., Cancer Res. 54, 1169-1174 (1994)], la proteína PIGI-1 es inducida por agentes que dañan el ADN tales como la adriamicina o la radiación ultravioleta (datos no mostrados), y que esta inducción guarda correlación con el estado de p53 de la célula. Por lo tanto, la activación de PIGI-1 podría representar un importante paso en la respuesta apoptótica y/o inhibidora del crecimiento celular ante el daño del ADN. Además, los fármacos quimioterapéuticos convencionales que se dirigen directa o indirectamente a la proteína p53 pueden ser sustituidos por nuevos fármacos quimioterapéuticos dirigidos a la proteína PIGI-1. Estos nuevos fármacos quimioterapéuticos serán eficaces incluso en células tumorales que carezcan de la expresión de la proteína p53 normal.

TABLA 1 Efecto de la expresión génica de PIGI-1 en el crecimiento de células de cultivo

Línea celular	PIGI-1	pCDNA3	PIGI-1-AS	p53
Saos 2	3 (0-15)	100	200	10 (2-17)
EB	18 (0-33)	100	179	12 (7-19)
COS7	29 (19-38)	100	NR	0
NIH 3T3	10 (4-19)	100	110	4 (2-7)

Se transfectaron células de cultivo tisular (3 x 10^{5} por pozo) con el constructo de plásmido indicado (2 ug) y fueron seleccionadas en medio que contenía G418 (500 U/ml, excepto las células EB, que fueron 800 U/ml) durante aproximadamente 2 semanas. Las células fueron lavadas y teñidas con cristal violeta-formalina. Los números representan la fracción media de colonias supervivientes en comparación con las células transfectadas con el plásmido de control pCDNA3 (las transfecciones fueron repetidas 3 veces en pozos por duplicado usando diferentes preparaciones de ADN, excepto para el antisentido, que representa transfecciones por duplicado). El intervalo de la fracción de colonias supervivientes está indicado entre paréntesis. NR significa no realizado.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Bristol-Myers Squibb Company

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos genes de respuesta a p53

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DESTINATARIO: Bristol-Myers Squibb Company

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(B): CALLE: 3005 First Avenue

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(C): CIUDAD: Seattle

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(D): ESTADO: Washington

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 98121

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(v): FORMATO DE LECTURA INFORMÁTICO:

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(A): TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC compatible de IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn versión 1.0, versión 1.25

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(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95926643.8

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de febrero de 1997

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:

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(A): NOMBRE: Dr. Kinzebach, Werner.

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(B): NÚMERO DE LA CAUSA / REFERENCIA: M/38028

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(ix): INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A): TELÉFONO: (089) 998397-0

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(B): FAX: (089) 987304

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

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(A): LONGITUD: 2383 pares de bases

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(B): TIPO: Ácido nucleico

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(C): ENCADENAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:1

1

2

3

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:2

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

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(A): LONGITUD: 202 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:2

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4

5

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:3

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.

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(A): LONGITUD: 42 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENCADENAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGCTTGC CTGGACTTGC CTGCCAGAT TGTCGACGGA GG

\hfill

42

Claims

1. Una molécula polipeptídica aislada que comprende:

i) la secuencia de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 según se muestra en la figura 7 [SEQ ID Nº: 2] o

ii) una variante alélica de dicha secuencia, en la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos, insertados, invertidos o añadidos,

2. Una molécula polipeptídica aislada que comprende la secuencia de aminoácidos 142-202 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 como se muestra en la figura 7.

3. Una molécula polipeptídica aislada obtenible mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una molécula polipeptídica según la reivindicación 1 ó 2.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada codificante de una molécula polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, que es una molécula de ADN.

6. La molécula de ADN según la reivindicación 5, que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1].

7. La molécula de ADN según la reivindicación 5, que tiene la secuencia de nucleótidos 416-2383 mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1].

8. Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una molécula polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el tampón de lavado de la hibridación es 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, y en la que la temperatura de hibridación es de 65ºC.

9. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, que es una molécula de ADN.

10. Una molécula de ADN que tiene una secuencia de ADN que es complementaria a la secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 ó 7.

11. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN codificante de una molécula polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. El vector de expresión según la reivindicación 11, en el que la secuencia de ADN tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en a figura 6 [SEQ ID Nº: 1].

13. El vector de expresión según la reivindicación 11, en el que la secuencia de ADN tiene la secuencia de nucleótidos 416-2383 mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1].

14. Una célula huésped eucariota o procariota que comprende el vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13.

15. Un procedimiento para producir una molécula polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuyo procedimiento comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 14 en condiciones que permitan la expresión de la molécula polipeptídica.

16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 o de un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

17. El uso de una molécula polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 o de un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para preparar una composición farmacéutica destinada a tratar tumores y cáncer.