ES2256847T3 - Nuevos genes de respuesta p53. - Google Patents
Nuevos genes de respuesta p53.Info
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Abstract
SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS, EN PARTICULAR SECUENCIAS DE ADN, QUE CODIFICAN TODA O PARTE DE LA PROTEINA DE RESPUESTA P53 PIGI AS DE ADN, CELULAS HUESPEDES QUE CONTIENEN LOS VECTORES DE EXPRESION Y METODOS PARA LA UTILIZACION DE ESTOS MATERIALES. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A MOLECULAS DE POLIPEPTIDOS QUE CONTIENE TODA O PARTE DE LA PROTEINA DE RESPUESTA P53 PIGI Y A METODOS PARA LA PRODUCCION DE ESTAS MOLECULAS DE POLIPEPTIDOS.
Description
Nuevos genes de respuesta p53.
Esta invención se refiere a nuevos genes de
respuesta a p53, a los vectores de expresión que comprenden los
genes, a las células huésped que comprenden los vectores de
expresión, a las proteínas producidas por los genes, a los
procedimientos para producir las proteínas y a los procedimientos de
uso de los genes y de las proteínas.
La desactivación o la pérdida de p53 es un hecho
común asociado con el desarrollo de los cánceres humanos. La
desactivación funcional puede ocurrir como consecuencia de anomalías
genéticas en el gen p53, más comúnmente, mutaciones sin sentido
invertidas o como consecuencia de la interacción con oncogenes
virales y celulares [Véase: Levine, A. J., et al.,
Nature 351, 453-455 (1991);
Vogelstein, B. y Kinzler, K. W., Cell 70,
523-526 (1992); Zambetti, G. y Levine, A. J., FASEB
J. 7, 855-865 (1993); Harris, C. C.,
Science 262, 1980-1981 (1993)]. La
pérdida de las funciones de p53 salvaje (wt,
Wild-Type) conduce a un ciclo y a una
replicación celulares descontrolados, una reparación ineficaz del
ADN, una ventaja de crecimiento selectivo y, por consiguiente, a la
formación de tumores [Levine, A. J., et al., Nature
351, 453-455 (1991); Vogelstein, B. y
Kinzler, K. W., Cell 70, 523-526
(1992); Zambetti G. y Levine, A. J., FASEB J. 7,
855-865 (1993); Harris, C. C., Science
262, 1980-1981, (1993); Lane, D. P.,
Nature 358, 15-16 (1992);
Livingstone, L. R., et al., Cell 70,
923-935 (1992)]. La formación de tumores puede
acentuarse todavía más mediante la obtención de nuevas funciones
asociadas con muchas formas mutantes de p53 [Chen, P.-L., et
al, Science 250, 1576-1580 (1990);
Dittmer, D. et al., Nature Genetics 4,
4142-4145 (1993); Sun, Y., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90,
2827-2831 (1993)], proporcionando una base potencial
para su fuerte selección en los tumores humanos.
El mecanismo o los mecanismos subyacentes a la
supresión del crecimiento mediada por p53 todavía no están bien
definidos. Sin embargo, resulta de particular interés la capacidad
de p53 para actuar como factor de transcripción, una función que
está considerablemente correlacionada con su capacidad para actuar
como supresor de los tumores. Se ha observado que la proteína p53
inhibe una variedad de promotores que contienen elementos TATA [P.
ej., Ginsberg, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 88, 9979-9983 (1993), Santhanam, U.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88,
7605-7609 (1993); Kley, N., et al.,
Nucleic Acids Res. 20, 4083-4087
(1992); Mack, D. H., et al., Nature 363,
281-283 (1993)]. Esta inhibición es independiente
de la secuencia y puede suponer la unión de p53 a componentes de la
maquinaria de transcripción basal, tales como la proteína de unión
a TATA [p.ej., Seto, E., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., EE.UU., 89, 12028-12032 (1992),
Truant, R., et al., J. Biol. Chem. 268,
2284-2287 (1993), Liu, X., et al., Mol.
Cell. Biol. 13, 3291-3300 (1993)].
A diferencia de ello, la transactivación generada por p53 sí
depende de la secuencia y está correlacionada con su unión a
secuencias específicas de ADN tales como el sitio consenso de unión
del que se ha informado recientemente [El-Deiry, W.
S., et al., Nature Genetics 1, 45-49
(1992), Funk, W. D., et al., Mol. Cell. Biol. 12,
2866-2871 (1992)]. La proteína p53 puede activar
eficazmente la transcripción desde promotores que lleven tales
sitios, tanto in vivo como in vitro [p.ej., Kley, N.,
et al., Nucleic Acids Res. 20,
4083-4087 (1992), Seto, E. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89,
12028-12032 (1992); Weintraub, H., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 4570-4574
(1991); Kern, S. E., et al., Science 256,
827-830 (1992); Farmer, G. et al., Nature
358, 83-86 (1992); Zambetti, G. P., et
al., Genes & Development 6,
1143-1152 (1992)]. La mayoría de los mutantes
oncogénicos de p53 han perdido tanto las propiedad de inhibir la
transcripción como la de la transactivación específica de secuencias
mostradas por la proteína p53 salvaje.
La fuerte correlación que existe entre la
capacidad de p53 para activar la transcripción con especificidad
secuencial y su capacidad para inhibir el crecimiento celular o
inducir a la apóptosis [Vogelstein, B. Y Kinzler, K. W.,
Cell 70, 523-526 (1992);
Yonish-Rouach, E., et al., Nature 352,
345-347 (1991); Lowe, S. W., et al., Nature
362, 847-849 (1993); Clark, A. R., et
al., Nature 362, 849-852 (1993);
Shaw, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
89, 4495-4499 (1992)], sugiere que los genes
inducidos por p53 pueden desempeñar un papel fundamental en la
mediación de la función de p53 como un inhibidor tumoral. Se han
caracterizado unos cuantos genes endógenos por ser inducidos por
p53. Éstos incluyen el gen mdm-2 y su homólogo
humano hdm-2 [Wu, X., et al., Genes &
Development 7, 1126-1132 (1993)], el
GADD45 [Kastan, M. B., et al., Cell 71,
587-597 (1992)] y el WAF1/CIP1/p21
[El-Deiry, W. S., et al., Cell 75,
817-825 (1993)]. Se ha sugerido que el gen
hdm-2 actúa como un regulador de realimentación
negativa de p53, y en este sentido, funcionaría como un oncogén
[Wu, X., et al., Genes & Development 7,
1126-1132 (1993); Zambetti, G. y Levine, A. J.,
FASEB J. 7, 855-865 (1993)]. Esto concuerda
con que la amplificación del gen hdm-2 esté asociada
con los cánceres humanos [Oliner, J. D., et al., Nature
358, 80-83 (1992)]. Por el momento, se ha
observado que tanto el WAF1/CIP1/p21, un inhibidor de las quinasas
dependientes de la ciclina [Harper, J. W., et al., Cell
75, 805-816 (1993); Xiong, Y., et al.,
Nature 366, 701-704 (1993)] como el
gadd45 [Zhan, Q., et al., Mol. Cell. Biol. 14,
2361-2371 (1994)] inhiben el crecimiento de células
tumorales en cultivo [El-Deiry, W. S., et
al., 75, 817-825 (1993)].
Partanen et al., (Revista de la OEBM,
volumen 10, nº: 6, pp.: 134, 1347-1354, 1991)
describen la secuencia deducida de aminoácidos del
FGFR-4, un receptor ácido del factor de crecimiento
de fibroblastos (nº de identificación del banco de genes: X57205).
El documento WO 93/10230 describe un procedimiento de producción de
una genoteca de ADN complementario (ADNc) enriquecida con los genes
inducibles por ligandos de una célula. Se realizó un análisis de
transferencia northern con ARN aislado de blastos de células T
IL-2R positivas humanas estimulados bien con
ciclohexamida o sólo con IL-2, o con una combinación
de los dos agentes. En base a los patrones de inducción y a los
tamaños aproximados de los trancriptos de ARN, se distinguieron 8
genes inducidos por IL-2. Uno de estos clones,
denominado 1A8, tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ
ID Nº: 1. Hong et al., (Journal of Immunology, vol.
150, páginas: 3895-3904, 1993) describen el
aislamiento de una serie de clones de ADNc que son expresados de
forma diferente entre linfocitos B y T. Uno de dichos ADNc fue
indicado como BL34. El análisis de transferencia northern realizado
con el ADNc BL34 reveló un trancripto de ARNm de 1,6 kb que estaba
presente a niveles bajos en el ARN extraído de los linfocitos B
inactivos, pero cuya expresión era notablemente mayor en el ARN
preparado a partir de células B activadas por mitogenes. Se
secuenciaron dos ADNc BL34 de longitud completa, y se identificó un
marco de lectura abierto de 588 bp que se predijo que codificaba
una proteína de 196
aminoácidos.
aminoácidos.
La presente invención supone el aislamiento de un
gen sobreregulado por p53.
La presente invención se refiere a una molécula
polipeptídica aislada que comprende:
- i)
- la secuencia de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 (inhibidor 1 del crecimiento inducido por p53) según se muestra en la figura 7 [SEQ ID Nº: 2] o
- ii)
- una variante alélica de dicha secuencia en la que se eliminan, sustituyen, insertan, invierten o añaden uno o más aminoácidos,
en la que el polipéptido que
comprende la variante alélica de la secuencia tiene la propiedad
inhibidora del crecimiento de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1.
La presente invención también se refiere a una
molécula polipeptídica aislada que comprende la secuencia de
aminoácidos 142-202 de la secuencia de aminoácidos
de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 según se
muestra en la figura 7.
La presente invención se refiere además a una
molécula polipeptídica aislada obtenible mediante la expresión de
una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula
polipeptídica de la presente invención.
La presente invención también se refiere a una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula
polipeptídica de la presente invención. Preferiblemente, la molécula
de ácido nucleico es una molécula de ADN (ácido desoxiribonucleico)
y la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ADN.
También se prefiere una secuencia de ADN que
tenga la secuencia de nucleótidos como se muestra en la figura 6
[SEQ ID Nº: 1] o la secuencia de nucleótidos
416-2383 como se muestra en la figura 6 [SEQ ID
Nº:1].
La presente invención también se refiere a una
molécula de ácido nucleico aislada, en concreto, una molécula de
ADN, que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con
una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula
polipeptídica de la presente invención, en la que el tampón de
lavado de la hibridación es 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, y en la que la
temperatura de hibridación es de 65ºC.
La presente invención también se refiere a una
molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a
las secuencias de ácidos nucleicos anteriores.
La presente invención se refiere además a los
vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que
codifica una molécula polipeptídica como se define anteriormente.
Según una realización, la secuencia de ADN que codifica el
polipéptido tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura
6 [SEQ ID Nº: 1].
Según otra realización, la secuencia de ADN tiene
la secuencia de nucleótidos 416-2383 mostrada en la
figura 6 [SEQ ID Nº: 1].
La presente invención se refiere además a células
huésped procariotas o eucariotas que contienen un vector de
expresión como se define anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para producir una molécula polipeptídica de la
presente invención, cuyo procedimiento comprende cultivar una célula
huésped como la anteriormente definida bajo condiciones que
permitan la expresión de la molécula polipeptídica.
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende una cantidad
farmacéuticamente eficaz de una molécula polipeptídica de la
presente invención o de una molécula de ácido nucleico de la
presente invención o de un vector de expresión de la presente
invención, y al uso de una molécula polipeptídica de la presente
invención o de una molécula de ácido nucleico de la presente
invención o de un vector de expresión de la presente invención para
preparar una composición farmacéutica destinada a tratar tumores y
el cáncer. También se describen los procedimientos para detectar las
secuencias de ácidos nucleicos codificantes de toda o parte de la
novedosa proteína de respuesta a p53 que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 7 [SEQ ID Nº: 2] o las secuencias
de ácidos nucleicos relacionadas.
Figura
1
El plásmido activador de la tetraciclina (pUHD
15-1 Neo) expresa constitutivamente a tTa (véase el
texto). Los mutantes de p53 V143A y N247I fueron clonados en el
vector de expresión sensible a la tetraciclina
pUHG10-3, produciendo pTE9.5 y pTE3.1,
respectivamente. La expresión de los genes de p53 clonados es
regulada por tTa que se une a tOp en ausencia de tetraciclina y es
inhibida mediante la adición de tetraciclina.
Se cultivaron células parenterales
Saos-2, Saos-2-D4 y
-A3 durante toda la noche con tetraciclina (1 ug/ml) o sin ella
según lo indicado. Al día siguiente, se elaboraron los extractos
nucleares, se resolvieron 80 ug de proteína en un gel de
poliacrilamida en presencia de SDS (12%) y se detectó la proteína
p53 mediante un análisis de transferencia western usando el
anticuerpo monoclonal DO1 (Oncogene Science, Uniondale, NY). La
posición de la proteína p53 de longitud completa está marcada por la
punta de la flecha. La localización de los patrones de peso
molecular está indicada a la derecha (en kilodaltones).
Figura
2
Las células
Sao-2-A3B y -D4H cultivadas en un
medio que contenía tetraciclina fueron lavadas cuatro veces con
DMEM e incubadas con un medio libre de antibiótico (\bullet y
\Delta, respectivamente) o con un medio que contenía tetraciclina
(\circ y \Delta, 1 ug/ml, respectivamente). Tras 16 horas a
37ºC, se cambiaron las células a una temperatura de 30ºC (punto
temporal de 0 horas). Se prepararon los extractos celulares en los
tiempos indicados (en horas) y se determinó la actividad de la
luciferaza usando cantidades iguales de extractos celulares.
Se cultivaron células
Saos-2-D4H durante toda la noche con
o sin tetraciclina (1 ug/ml) y fueron posteriormente incubadas a
30ºC durante el período de tiempo indicado (en horas) antes de ser
cosechadas. Se analizó el ARN total (10 ug) mediante análisis de
transferencia northern. Las transferencias duplicadas fueron
hibridadas con una sonda de ADNc marcada con ^{32}P bien para
hdm-2 o \beta-actina, mostrándose
los autorradiogramas de las transferencias hibridadas. A la
izquierda, se indica la posición de los marcadores de peso molecular
de ARN.
Figura
3
Se incubaron células
Saos-2-D4H en ausencia o en
presencia de tetraciclina (1 ug/ml) a 30ºC como se describe en la
fig. 2B. Se hibridó una transferencia northern (10 ug de ARN
total/carril) con una sonda de ADNc marcado con ^{32}P
correspondiente al clon W4.5. El autorradiograma de la transferencia
hibridada se muestra con la posición del marcador de peso molecular
indicada a la izquierda.
Figura
4
Se cultivaron células
Saos-2-D4H en ausencia de
tetraciclina a 37ºC. Se trataron las células con vehículo (agua o
cicloheximida (10 ug/ml) durante 30 minutos y fueron posteriormente
incubadas durante 7 horas más a 37 ó 30ºC según lo indicado. Se
prepararon las transferencias northern usando cantidades iguales de
ARN poli-adenilado y se hibridaron consecutivamente
con una sonda de ADNc marcado con ^{32}P para A28 y A26. Se
muestran los autorradiogramas con la posición de los marcadores de
peso molecular de ARN indicados a la izquierda.
Figura
5
Se trataron células EB1 clónicas y EB
parenterales (que contenían p53 salvaje bajo el control del
promotor de la metalotioneína) con vehículo (agua) o CdCl_{2} (6
uM) durante 10 horas según lo indicado. Se aisló ARN
poli-adenilado y se prepararon transferencias
northern por cuadruplicado. Se hibridaron las transferencias con
sondas para los clones A28, A26, W4.5 o
\beta-actina. Los autorradiogramas se muestran con
la posición de los marcadores de peso molecular indicada a la
izquierda.
Figura
6
Figura
7
Figura
8
Se usaron 2,5 ug de ARN
poli-adenilado procedente de los tejidos de humano
adulto indicados para preparar transferencias northern (Clonetech,
Palo Alto, CA). Se hibridaron las transferencias con una sonda de
ADNc marcada con ^{32}P correspondiente al fragmento A28 del ADNc
y se visualizaron mediante autorradiografía. A la derecha, se
indica la posición de los patrones de ARN en kb. Se detectó un
transcripto de aproximadamente 2,5 kb en todos los tejidos con la
posible excepción de los leucocitos sanguíneos periféricos (carril
9). La expresión fue evidente en el tejido testicular ante una
exposición más prolongada de la transferencia a la película.
Figura
9
Se rastrearon genotecas de ADNc de pulmón y
cerebro humano con el fragmento A28 del ADNc identificado en el
procedimiento de sustracción de genotecas. El clon de ADNc de
hibridación más largo que se identificó, A28-15B,
tenía una longitud de 1.968 bp y representaba un clon parcial de
ADNc. El extremo 5' del ADNc fue obtenido mediante un RACE de 5'.
El clon de longitud completa (o longitud casi completa) fue
ensamblado usando el sitio único Bgl II en la posición 416 de nt.
El ADNc fue secuenciado en ambos sentidos usando los
oligonucleótidos específicos de cada gen indicados y la
secuenciación automático de desoxi-nucleótidos con
tinte (ABI, Foster City, CA).
Figura
10
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden ser usados en una variedad de modos según la presente
invención. Por ejemplo, pueden ser usados como sondas de ADN para
rastrear otros ADNc y genotecas de ADN genómico con el fin de
seleccionar mediante hibridación otras secuencias de ADN que
codifiquen proteínas relacionadas con la proteína de respuesta a
p53 PIGI-1. Además, los ácidos nucleicos de la
presente invención codificantes de toda o parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser usados como sondas
de ADN para rastrear otros ADNc y genotecas de ADN genómico con el
fin de seleccionar mediante hibridación las secuencias de ADN
codificantes de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1 de otros organismos. La sonda de ácidos
nucleicos pudría ser ARN o ADN marcado con nucleótidos radiactivos
o mediante procedimientos no radiactivos (i.e., biotina). El
rastreo podría ser realizado en diversas condiciones restrictivas (a
través de la manipulación de la temperatura óptima de hibridación
(Tm), normalmente, usando una combinación de fuerza iónica,
temperatura y/o presencia de formamida) para aislar homólogos
estrecha o vagamente relacionados. Los ácidos nucleicos también
pueden ser usados para generar cebadores para amplificar ADNc o ADN
genómico usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR, Polymerase Chain Reaction). Las secuencias de ácidos
nucleicos de la presente invención también pueden ser usadas para
identificar secuencias adyacentes en el ADNc o el genoma, por
ejemplo, secuencias flanqueantes y elementos reguladores.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente
invención también pueden ser usadas mediante diagnóstico para
detectar las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 cuya
funcionalidad se ve comprometida en los tumores humanos. Esto
estaría indicado por mutaciones, supresiones o mutaciones
puntuales, lo que podría ser útil para el diagnóstico de cánceres.
La detección de tales mutaciones podría ser determinada mediante
técnicas estándar de análisis de ADN, incluyendo la secuenciación
genómica y/o de ADNc, SSCP y la transferencia southern. Además, la
propia proteína de respuesta a p53 PIGI-1
funcionalmente afectada puede ser detectada usando anticuerpos
monoclonales y policlonales que pueden ser generados para que sean
selectivos para proteínas normales y mutantes usando un ensayo
ELISA, un análisis de inmunoprecipitación, un análisis de
inmunohistoquímica o un análisis de transferencia western.
Los polipéptidos de la presente invención son
útiles en el estudio de las características de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1; por ejemplo, su estructura,
su mecanismo de acción y su función en la oncogénesis. Por ejemplo,
se puede estudiar la proteína PIGI-1 para definir en
mayor profundidad sus dominios funcionales, y, por lo tanto, puede
ser usada para modelizar compuestos con una actividad similar.
Además, la proteína PIGI-1 puede ser utilizada para
determinar si interactúa consigo misma, con otros homólogos
relacionados o con otras proteínas usando la
co-inmunoprecipitación a partir de extractos
celulares marcados, la transferencia western, el rastreo de
genotecas de expresión usando proteína PIGI-1
marcada y/o otras metodologías comunes. La proteína
PIGI-1 también puede ser utilizada para determinar
su capacidad para unirse a ADN y para identificar sus sitios de
unión usando el rastreo de los fragmentos de secuencia genómica o
los fragmentos de oligonucleótido sintético usando una tecnología
basada en la PCR de enriquecimiento y amplificación de elementos de
ADN seleccionados, que pueden ser a su vez dianas en los esfuerzos
de descubrimiento de fármacos. La proteína PIGI-1
también puede ser usada en análisis celulares in vivo y
análisis libres de células in vitro con el fin de detectar
productos naturales y compuestos sintéticos que podrían imitar,
regular o estimular la función de la proteína
PIGI-1. La expresión de PIGI-1 (bien
ARN o producto proteico) puede ser usada para monitorizar la
presencia de la actividad de la proteína p53 salvaje, como en la
detección de compuestos que imitan o restablecen la función a la p53
mutante.
Como se ha indicado anteriormente en la presente
memoria, la proteína PIGI-1 posee propiedades
inhibidoras del crecimiento y puede verse funcionalmente
comprometida en los tumores humanos. De este modo, se pueden
utilizar diversas terapias destinadas a la proteína
PIGI-1 en el tratamiento de tumores y el cáncer.
Por ejemplo, para el tratamiento de los tumores y el cáncer, se
pueden usar técnicas de terapia génica que utilizan todas o parte
de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la proteína
PIGI-1, técnicas que suponen la administración de
proteína PIGI-1 o de fragmentos biológicamente
activos de la misma, técnicas que utilizan anticuerpos con
especificidad antigénica fusionados a la proteína
PIGI-1 o fragmentos biológicamente activos de la
misma, o técnicas que utilizan moléculas pequeñas o compuestos
modelizados o descubiertos para imitar a la
PIGI-1.
A continuación, se describen otros procedimientos
diversos de uso de los ácidos nucleicos, los polipéptidos, los
vectores de expresión y las células huésped de la presente
invención.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica toda o parte de la proteína de respuesta a
p53 PIGI-1, según se define anteriormente.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de
ADN y la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ADN.
También se prefiere una secuencia de ADN que tenga la secuencia de
nucleótidos que se muestra en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1]. También
se prefieren secuencias de ácidos nucleicos complementarias a una
de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, se prefieren las
secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con una de estas
secuencias de ácidos nucleicos. En el caso de una secuencia de
nucleótidos (p.ej., una secuencia de ADN) que codifica parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1, es preferible
que la secuencia de nucleótidos tenga una longitud de al menos
aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente
una longitud de al menos aproximadamente 20 a 30 nucleótidos
consecutivos.
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden ser aislados de una variedad de fuentes, aunque las
secuencias preferidas actualmente han sido aisladas de genotecas de
ADNc humano. La secuencia exacta de aminoácidos de la molécula
polipeptídica producida variará según la secuencia de ADN
inicial.
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden ser obtenidos usando diversos procedimientos conocidos por
aquéllos con conocimientos básicos de la técnica. Se pueden emplear
al menos tres procedimientos principales alternativos:
- (1)
- el aislamiento de una secuencia de ADN bicatenario procedente de ADN genómico o ADN complementario (ADNc) que contenga la secuencia;
- (2)
- la síntesis química de la secuencia de ADN; y
- (3)
- la síntesis de la secuencia de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En el primer procedimiento, se puede rastrear una
genoteca genómica o de ADNc con el fin de identificar una secuencia
de ADN que codifique toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1. Por ejemplo, se pueden rastrear genotecas
de ADNc humano con el fin de identificar una secuencia de ADN que
codifique toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1. Se pueden usar diversas genotecas de ADNc,
por ejemplo, genotecas de ADNc (de cuerpo estriado) de cerebro
humano adulto y pulmón humano adulto (Stratagene, La Jolla, CA).
Para rastrear las genotecas de ADN genómico y
ADNc en busca de secuencias que codifiquen la novedosa proteína de
respuesta a p53 PIGI-1, se pueden usar diversas
técnicas. Esta técnica, por ejemplo, emplea una sonda de ADN
monocatenario marcado con una secuencia complementaria a una
secuencia que codifica la proteína de respuesta a p53
PIGI-1. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos
de hibridación de ADN / ADN para identificar la secuencia en copias
clonadas de ADN genómico o ADNc que han sido desnaturalizadas a una
forma monocatenaria. Las sondas adecuadas incluyen ADNc para la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 adquirido de la
misma especie o de una especie relacionada, oligonucleótidos
sintéticos y similares.
También se puede rastrear una genoteca de ADN
genómico o ADNc en busca de un ADN genómico o un ADNc codificante
de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1, y en busca de secuencias que flanqueen
tales secuencias codificantes, usando técnicas de
inmunotransferencia.
En un procedimiento de rastreo típico adecuado
para las técnicas de hibridación, primero se extiende una genoteca
de ADN genómico o de ADNc sobre placas de agar, y luego se
transfieren los clones a membranas filtrantes, por ejemplo, a
membranas de nitrocelulosa. Normalmente, la genoteca genómica está
contenida en un vector tal como EMBL 3 o EMBL 4 o derivados de los
mismos (p.ej., lambda DASH®), o en genotecas de cósmidos, genotecas
de fagos P1 o genotecas de YAC. La genoteca de ADNc, normalmente,
está contenida en un vector tal como lgt10, lgt11 o lambda ZAP.
Luego se puede hibridar una sonda de ADN con los clones para
identificar aquellos clones que contienen el ADN genómico o el ADNc
codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1. Alternativamente, Se pueden inducir cepas
apropiadas de E. coli que contienen vectores tales como
lgt11 o lambda ZAP para sintetizar proteínas de fusión que contengan
fragmentos de proteínas correspondientes al inserto de ADNc en el
vector. Las proteínas de fusión pueden ser transferidas a membranas
filtrantes, por ejemplo, a nitrocelulosa. Luego se puede unir un
anticuerpo a la proteína de fusión para identificar toda o parte de
la proteína de respuesta a p53
PIGI-1.
PIGI-1.
En el segundo procedimiento, los ácidos nucleicos
de la presente invención codificantes de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser
sintetizados químicamente. Los oligonucleótidos más cortos, tales
como de 15 a 50 nucleótidos, pueden ser sintetizados directamente.
Para oligonucleótidos más largos, la secuencia de ADN codificante
de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 puede ser
sintetizada como una serie de 50-100 bases de
oligonucleótidos que luego pueden ser ligados consecutivamente (por
los sitios de restricción terminal apropiados) para formar la
secuencia lineal correcta de nucleótidos.
En el tercer procedimiento, los ácidos nucleicos
de la presente invención codificantes de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 pueden ser
sintetizados usando la RCP. Brevemente, se usan pares de
oligonucleótidos de ADN sintético, generalmente, de una longitud de
al menos 15 bases (cebadores RCP) que se hibridan en cadenas
opuestas de la secuencia diana de ADN para amplificar
enzimáticamente la región intercalada de ADN sobre la secuencia
diana. Los ciclos repetidos de desnaturalización térmica del molde,
el templado de los cebadores y la ampliación de los términos 3' de
los cebadores templados con una polimerasa de ADN resulta en la
amplificación del segmento definido por los cebadores RCP. Véase
White, T. J., et al., Trends Genet. 5, 185-9
(1989).
Los ácidos nucleicos de la presente invención
codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1 también pueden ser modificados (i.e.,
mutados) para preparar diversas mutaciones. Tales mutaciones pueden
cambiar la secuencia de aminoácidos codificada por el codón mutado,
o pueden ser silenciosas y no cambiar la secuencia de aminoácidos.
Se pueden preparar estos ácidos nucleicos modificados, por ejemplo,
mutando el ácido nucleico que codifica la proteína de respuesta a
p53 PIGI-1, de manera que la mutación resulte en la
supresión, la sustitución, la inserción, la inversión o la adición
de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado usando
diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se
pueden emplear los procedimientos de mutagénesis dirigida descritos
en Taylor, J. W., et al., Nucl. Acids. Res. 13,
8749-64 (1985) y Kunkel, J. A., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 82, 482-92 (1985).
Además, los equipos para realizar la mutagénesis dirigida pueden
ser adquiridos en proveedores comerciales. Por ejemplo, se puede
adquirir un equipo para realizar la mutagénesis dirigida en
Amersham Corp. (Arlington Heights, IL). Además, también se pueden
emplear procedimientos de adición, interrupción, supresión y
truncamiento como los descritos en Sayers, J. R., et al., Nucl.
Acids Res. 16, 791-800 (1988).
Las mutaciones pueden ser ventajosas en la producción o el uso de
los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, estas
mutaciones puede modificar la función de la proteína (p.ej., dando
como resultado una actividad mayor o menor), permitir niveles más
elevados de producción de proteína o facilitar la purificación de la
proteína, o proporcionar otros sitios de reconocimiento de la
endonucleasa de restricción en el ácido nucleico. Todos estos
ácidos nucleicos y moléculas polipeptídicas modificados están
incluidos en el alcance de la presente invención.
Según se usa en la presente solicitud, a no ser
que se limite de otro modo en ejemplos específicos, el término
"modificada", cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos
o polipéptidos, significa una secuencia de nucleótidos o
polipéptidos que difiere de la secuencia de tipo salvaje que se
encuentra en la Naturaleza.
La presente invención se refiere además a los
vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN
codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1, según se definen anteriormente. Los
vectores de expresión contienen preferiblemente las secuencias de
ADN que tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en la
figura 6 [SEQ ID Nº: 1]. Además se prefieren los vectores de
expresión que comprenden una o más secuencias reguladoras de ADN
ligadas operativamente a la secuencia de ADN que codifica toda o
parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1.
Como se usa en este contexto, el término "ligado o ligada
operativamente" significa que las secuencias reguladoras de ADN
son capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de la
secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1.
Los vectores de expresión de utilidad en la
presente invención, normalmente, están en forma de
"plásmidos", que se refieren a bucles de ADN bicatenario
circular que, en su forma vectorial, no están unidos al cromosoma.
Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas tales de
vectores de expresión que realizan funciones equivalentes y que
pasan a ser conocidos en la técnica después de ello. Los vectores de
expresión de la presente invención también pueden ser usados para
integrar de forma estable la secuencia de ADN que codifica la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 en el cromosoma
de una célula huésped apropiada (p.ej., células COS, HepG2, Saos 2 y
EB).
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención normalmente contienen un origen de replicación, un 5'
localizado en el promotor con respecto a (i.e., corriente arriba de)
y seguido por la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1, las secuencias
de finalización de la transcripción y el vector restante. Los
vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN
conocidas en la técnica, por ejemplo, secuencias líderes de
estabilidad que proporcionan la estabilidad del producto de
expresión, secuencias líderes secretoras que proporcionan la
secreción del producto de expresión, secuencias que permiten la
modulación de la expresión del gen estructural (p.ej., mediante la
presencia o la ausencia de nutrientes u otros inductores en el
medio de cultivo), secuencias marcadoras que son capaces de
proporcionar una selección fenotípica en células huésped
transformadas, secuencias que proporcionan sitios para el clivaje
por endonucleasas de restricción y secuencias que permiten la
expresión en diversos tipos de huéspedes, incluyendo, pero no
limitándose a procariotas, levaduras, hongos y eucariotas
superiores. Las características del vector de expresión real usado
deben ser compatibles con la célula huésped que se emplee. Por
ejemplo, cuando se expresen secuencias de ADN en un sistema celular
mamífero, el vector de expresión debería contener promotores
aislados del genoma de células mamíferas, (p.ej., promotor de
metalotioneína de ratón), o de virus que crecen en estas células
(p.ej., promotor de 7,5 K del virus vaccinia). Un vector de
expresión según la presente invención es al menos capaz de dirigir
la replicación, y preferiblemente la expresión, de los ácidos
nucleicos de la presente invención. Los orígenes adecuados de la
replicación incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación de
la Col E1, el vírico SV4O y el M13. Los promotores adecuados
incluyen, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus, el promotor
del gen lac Z, el promotor de gal 10 y el promotor poliédrico del
virus de la poliedrosis nuclear múltiple Autographa
californica (AcMNPV). Las secuencias de finalización adecuadas
incluyen, por ejemplo, la hormona de crecimiento bovino, SV40, lac Z
y las señales de poli-adenilación poliédrica del
AcMNPV. Los ejemplos de marcadores que se pueden seleccionar
incluyen la resistencia a la neomicina, a la ampicilina y a la
higromicina, y similares. Todos estos materiales son conocidos en la
técnica y se encuentran comercialmente disponibles.
Los vectores de expresión comercialmente
disponibles que son adecuados para introducir las secuencias de ADN
de la presente invención incluyen los vectores de expresión de
mamíferos pcDNA3 o pcDNA/Neo, los vectores de expresión de
baculovirus pBlueBac y BlueBacHis, el vector de expresión
procariota pcDNAII y el vector de expresión de levaduras pYes2,
pudiéndose obtener todo ellos en Invitrogen Corp., San Diego,
CA.
Se pueden construir los vectores de expresión
adecuados que contengan las regiones de codificación y control
deseadas usando técnicas estándar de ADN recombinante conocidas en
la técnica, muchas de las cuales se encuentran descritas en
Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Habor, NY (1989).
Como se usa en la presente solicitud, a no ser
que se limite lo contrario en los ejemplos específicos, el término
"regiones de control" se refiere a las secuencias de
nucleótidos que regulan la expresión de la proteína de respuesta a
p53 PIGI-1, incluyendo, pero no limitándose a,
cualquier promotor, silenciador, elemento potenciador, sitio de
empalme, elemento de iniciación transcripcional, elementos de
finalización transcripcional, señales de
poli-adenilación, elementos de control la
traducción, sitio de inicio de la traducción, sitios de fin de la
traducción y elementos de estabilidad de mensajes. Tales regiones de
control pueden estar localizadas en las secuencias 5' ó 3' de la
región codificante o en intrones que interrumpan la región
codificante.
La presente invención también se refiere a las
células huésped que contienen un vector de expresión que comprende
una secuencia de ADN que codifica toda o parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1, según se define
anteriormente. Véanse, por ejemplo, las células huésped del ejemplo
2 de la presente memoria, que son las preferidas. Las células
huésped contienen preferiblemente un vector de expresión que
comprende la secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
sustancialmente como se muestra en la figura 6. Véase, por ejemplo,
el vector de expresión que aparece en el ejemplo 2 de la presente
memoria, que es el preferido. También se prefieren las células
huésped que contienen un vector de expresión que comprende una o más
secuencia de ADN reguladoras capaces de dirigir la replicación y/o
la expresión de y que está operativamente enlazado a una secuencia
de ADN codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1. Las células huésped adecuadas incluyen
células tanto procariotas como eucariotas. Las células huésped
procariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, las cepas de E.
coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101. Las células huésped
eucariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, células del insecto
Spodoptera frugiperda, células COS-7, células
Saos-2, células HeLa, fibroblastos de piel humana y
células de Saccharomyces cerevisiae.
Los vectores de expresión pueden ser introducidos
en las células huésped mediante diversos procedimientos conocidos
en la técnica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la transfección
de células huésped con vectores de expresión mediante el
procedimiento de precipitación con fosfato de calcio. Sin embargo,
también se pueden emplear otros procedimientos para introducir los
vectores de expresión en las células huésped, por ejemplo, la
electroporación, la fusión liposomal, la inyección nuclear y la
infección vírica o con fagos.
Una vez introducido el vector de expresión en la
célula huésped apropiada, se puede cultivar la célula huésped en
condiciones que permitan la expresión de grandes cantidades del
polipéptido deseado, en este caso, una molécula polipeptídica que
comprende toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1.
Las células huésped que contienen un vector de
expresión que contiene una secuencia de ADN codificante de toda o
parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1
pueden ser identificadas mediante uno o más de los seis siguientes
enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN; (b) la
presencia o ausencia de las funciones génicas marcadoras; (c)
evaluación del nivel de trascripción medido mediante la producción
de transcriptos de ARNm codificantes de la proteína de respuesta a
p53 PIGI-1 en la célula huésped; (d) detección del
producto génico inmunológicamente; (e) actividad biológica y (f)
PCR.
En el primer enfoque, se puede detectar la
presencia de una secuencia de ADN codificante de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 mediante la
hibridación de ADN-ADN o ARN-ADN,
usando sondas complementarias a la secuencia de ADN.
En el segundo enfoque, se puede identificar y
seleccionar el sistema huésped del vector de expresión recombinante
en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones génicas
marcadoras (p.ej., la actividad de la
timidina-quinasa, la resistencia a antibióticos,
etc). Se puede colocar un gen marcador en el mismo plásmido que la
secuencia de ADN codificante de toda o parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1 bajo la regulación del mismo
promotor o de un promotor diferente usado para regular la secuencia
codificante de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1. La expresión del gen marcador indica la
expresión de la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1.
En el tercer enfoque, se puede medir la
producción de transcriptos de ARNm codificantes de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1 mediante ensayos de
hibridación. Por ejemplo, se puede aislar ARN
poli-adenilado y analizarlo mediante transferencia
northern o un ensayo de protección a la nucleasa usando una sonda
complementaria a la secuencia de ARN. Alternativamente, se puede
extraer y analizar el ARN total de la célula huésped para la
hibridación de tales sondas.
En el cuarto enfoque, se puede medir
inmunológicamente la expresión de toda o parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1, por ejemplo, mediante
inmunotransferencia con anticuerpo frente a la proteína de respuesta
a p53 PIGI-1 (transferencia western).
En el quinto enfoque, se puede medir la expresión
de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1 analizando
la actividad de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1 mediante el uso de procedimientos
conocidos.
En el sexto enfoque, se usan cebadores de
oligonucleótido homólogos a las secuencias presentes en el sistema
de expresión (i.e., secuencias del vector de expresión o secuencias
de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1) en una
PCR para producir un fragmento de ADN de una longitud
predeterminada, indicando la incorporación del sistema de expresión
en la célula huésped.
Las secuencias de ADN de los vectores de
expresión, los plásmidos o las moléculas de ADN de la presente
invención pueden ser determinadas mediante diversos procedimientos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear el método de
terminación de cadena didesoxi descrito en Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74,
5463-7 (1977) o el método de
Maxam-Gilbert descrito en Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 74, 560-4 (1977).
Debería entenderse, por supuesto, que no todos
los vectores de expresión ni las secuencias reguladoras de ADN
funcionarán igualmente bien en la expresión de las secuencias de ADN
de la presente invención. Tampoco funcionarán igualmente bien todas
las células huésped con un mismo sistema de expresión. Sin embargo,
cualquier experto en la técnica puede hacer una selección de entre
los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ADN y las
células huésped, orientándose con la presente memoria, sin tener que
realizar una experimentación excesiva y sin alejarse del alcance de
la presente invención.
La presente invención también se refiere a
moléculas polipeptídicas que comprenden toda o parte de la proteína
de respuesta a p53 PIGI-1, como las mostradas en la
figura 7 [SEQ ID Nº:2], según se definen anteriormente. En el caso
de moléculas polipeptídicas que comprenden parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1, es preferible que las
moléculas polipeptídicas tengan una longitud de al menos
aproximadamente 5 a 8 aminoácidos consecutivos, y más
preferiblemente, una longitud de al menos aproximadamente 15 a 20
aminoácidos consecutivos.
Todas las secuencias de aminoácidos están
representadas en la presente memoria por fórmulas cuyas
orientaciones de izquierda a derecha están en el sentido
convencional de terminal amino a terminal carboxilo.
Se pueden obtener los polipéptidos de la presente
invención mediante procedimientos sintéticos, i.e., síntesis
química del polipéptido a partir de los aminoácidos de sus
componentes, mediante procedimientos conocidos por aquéllos con un
conocimiento normal de la técnica. Por ejemplo, se puede emplear el
procedimiento en fase sólida descrito por Houghton et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 82,
5131-5135 (1985). Es preferible que los
polipéptidos sean obtenidos mediante su producción en células
huésped procariotas o eucariotas que expresen una secuencia de ADN
codificante de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1, o mediante la traducción in vitro
del ARNm codificado por la secuencia de ADN codificante de toda o
parte de la proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Por
ejemplo, la secuencia de ADN de la figura 6 [SEQ ID Nº: 1] puede
ser sintetizada usando la PCR como se describe anteriormente e
insertada en un vector de expresión adecuado, que a su vez puede
ser usado para transformar una célula huésped adecuada. La célula
huésped recombinante puede ser luego cultivada para producir
proteína de respuesta a p53 PIGI-1. Las técnicas
para la producción de polipéptidos mediante estos procedimientos
son conocidas en la técnica y se encuentran descritas en la presente
memoria.
Los polipéptidos producidos de esta manera pueden
ser luego aislados y purificados en algún grado usando diversas
técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, se pueden
emplear procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía
de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel y la
cromatografía de inmunoafini-
dad.
dad.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser usados en una amplia variedad de modos. Por ejemplo, los
polipéptidos, incluso aquéllos que sean biológicamente inactivos,
pueden ser usados para preparar, de un modo conocido, anticuerpos
monoclonales y policlonales capaces de unir los polipéptidos. Estos
anticuerpos pueden ser usados, a su vez, para la detección de los
polipéptidos de la presente invención en un muestra, por ejemplo,
una muestra celular, usando técnicas de inmunoanálisis, por ejemplo,
radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzimático o
inmunohistoquímica. Los anticuerpos también pueden ser usados en la
cromatografía de afinidad para aislar o purificar los polipéptidos
de la presente invención procedentes de diversas fuentes.
Los polipéptidos de la presente invención han
sido definidos mediante secuenciación determinada de ADN y
secuenciación deducida de aminoácidos. Debido a la degeneración del
código genético, se pueden usar otras secuencias de ADN que
codifiquen la misma secuencia de aminoácidos representada en la
figura 7 [SEQ ID Nº: 2], o cualquier parte de la misma, para la
producción de los polipéptidos de la presente invención.
Además, debería entenderse que existen
variaciones alélicas naturales de estas secuencias de ADN y
secuencias aminoacídicas, o que pueden ser introducidas
intencionadamente usando procedimientos conocidos en la técnica.
Estas variaciones pueden ser demostradas por cambios en uno o más
aminoácidos de la secuencia total, tales como supresiones,
sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más
aminoácidos en dicha secuencia. Tales cambios pueden resultar
ventajosos en la producción o el uso de los polipéptidos de la
presente invención; por ejemplo, en el aislamiento de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1 o de los polipéptidos
mediante purificación por afinidad. Las sustituciones de aminoácidos
pueden realizarse, por ejemplo, en base a la similitud de
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilidad y/o la
naturaleza anfifática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos
cargados negativamente incluyen el ácido aspártico y el ácido
glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen la lisina
y al arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar no
cargada o con grupos de cabeza no polar con valores similares de
hidrofilidad incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina,
glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina;
fenilalanina y tirosina. Otras variaciones contempladas incluyen
sales y ésteres de los polipéptidos anteriormente mencionados, así
como precursores de los polipéptidos anteriormente mencionados, por
ejemplo, precursores con sustituyentes N-terminales
tales como la metionina, la N-formilmetionina y
secuencias líder. Todas estas variaciones están incluidas en el
alcance de la presente invención.
El procedimiento para detectar una secuencia de
ácidos nucleicos codificante de toda o parte de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1 o una secuencia de ácidos
nucleicos relacionada comprende poner en contacto la secuencia de
ácidos nucleicos con un marcador detectable que se una
específicamente a al menos una porción de la secuencia de ácidos
nucleicos, y detectar el marcador así unido. La presencia del
marcador unido indica la presencia de la secuencia de ácidos
nucleicos. Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos es una
secuencia de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos
sustancialmente como la mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1], o
es complementaria a la misma.
Se puede aislar una muestra de ADN que contenga
la secuencia de ADN usando diversos procedimientos para el
aislamiento de ADN que son conocidos por aquellos con conocimientos
básicos en la técnica. Por ejemplo, se puede aislar una muestra de
ADN genómico de tejido congelando rápidamente el tejido del que se
va a aislar el ADN, triturando el tejido para producir piezas
fácilmente digeribles, colocando el tejido triturado en una
solución de proteasa K y SDS, e incubando la solución resultante
hasta que se degrade la mayoría de la proteína celular. Luego se
desprotoniza el ADN genómico mediante extracciones sucesivas con
fenol / cloroformo / isoamil alcohol, se recupera mediante
precipitación con etanol y se seca para volverlo a suspender en un
tampón.
También se prefiere el procedimiento en el que la
secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ARN.
Preferiblemente, la secuencia de ARN es una secuencia de ARNm.
También se prefiere el procedimiento en el que la secuencia de ARN
está localizada en las células de una muestra de tejido. Se puede
aislar una muestra de ARN que contenga la secuencia de ARN usando
diversos procedimientos para el aislamiento de ARN que son
conocidos por aquéllos con conocimientos básicos en la técnica. Por
ejemplo, se puede aislar una muestra de ARN de células cultivadas
lavando las células libres de medio y luego, lisando las células
mediante su colocación en una solución de guanidinio 4M. La
viscosidad de la solución resultante es reducida extrayendo el
lisado con una aguja de calibre 20. Luego se forma una pella de ARN
a través de un gradiente secuencial de cloruro de cesio, y se
separa cuidadosamente el fluido sobrenadante del gradiente para
permitir una separación completa del ARN, encontrado en la pella,
del ADN contaminante y de la proteína.
El marcador detectable útil para detectar una
secuencia de ácidos nucleicos codificante de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 o una secuencia
de ácidos nucleicos relacionada puede ser una secuencia de ADN
marcado, incluyendo una secuencia de ADNc marcado, con una secuencia
de nucleótidos complementaria a al menos una porción de la
secuencia de ácidos nucleicos codificante de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1.
El marcador detectable también puede ser un ARN
marcado que tenga una secuencia complementaria a al menos una
porción de la secuencia de ADN codificante de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1.
El marcador detectable de la presente invención
puede estar marcado con etiquetas radiactivas comúnmente empleadas,
tales como ^{32}P y ^{35}S, aunque se pueden emplear otras
etiquetas tales como la biotina o el mercurio. Se pueden usar
diversos procedimientos conocidos por aquéllos con conocimientos
básicos en la técnica para marcar los marcadores detectables. Por
ejemplo, las secuencias de ADN y las secuencias de ARN pueden ser
marcadas con ^{32}P o ^{35}S usando el procedimiento de
cebadores aleatorios.
Una vez obtenido un marcador detectable adecuado,
se pueden emplear diversos procedimientos conocidos por aquéllos
con conocimientos básicos en la técnica para poner en contacto el
marcador detectable con la muestra de interés. Por ejemplo, se
pueden realizar hibridaciones de ADN-ADN,
ARN-ARN y ADN-ARN usando
procedimientos estándar conocidos en la técnica. En un
procedimiento típico de hibridación de ADN-ADN para
detectar secuencias de ADN codificantes de toda o parte de la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 en ADN genómico,
primero se aísla el ADN genómico usando procedimientos conocidos, y
luego se digiere con una o más enzimas de restricción. Los
fragmentos de ADN resultantes son separados sobre geles de agarosa,
desnaturalizados in situ y transferidos a membranas
filtrantes. Tras una pre-hibridación para reducir la
hibridación inespecífica, se hibrida una sonda de ácido nucleico
radiomarcada con los fragmentos de ADN inmovilizados. Luego se lava
la membrana para eliminar la sonda no unida o débilmente unida, y
se autorradiografía para identificar los fragmentos de ADN que se
han hibridado con la sonda.
La presencia de marcador detectable unido puede
ser detectada usando diversos procedimientos conocidos por aquéllos
con conocimientos básicos en la técnica. Por ejemplo, si el marcador
detectable está marcado radiactivamente, se puede emplear una
autorradiografía. En función de la etiqueta empleada, también se
pueden usar otros procedimientos de detección tales como la
espectrofotometría.
Debería entenderse que las secuencias de ácidos
nucleicos relacionadas con las secuencias de ácidos nucleicos
codificantes de toda o parte de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1 también se pueden detectar usando los
procedimientos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se
puede usar una sonda de ADN que tenga regiones conservadas del gen
para una proteína de respuesta a p53 novedosa con el fin de detectar
y aislar las secuencias de ADN relacionadas (p.ej., una secuencia
de ADN que codifique una proteína de respuesta relacionada con la
proteína de respuesta a p53 PIGI-1 de ratones,
ratas, hámsteres o perros). También se puede usar ADNc de
PIGI-1 para aislar regiones reguladoras flanqueantes
tales como promotores, y para aislar nuevos genes que, por su
proximidad, también pueden estar regulados por la proteína p53.
Todos estos procedimientos están incluidos en el alcance de la
presente invención.
Como se usa en la presente invención, a no ser
que se limite lo contrario en los ejemplos específicos, el término
"relacionado o relacionada", cuando se refiere a una secuencia
de nucleótidos, significa una secuencia de ácidos nucleicos que es
capaz de hibridarse con una sonda de oligonucleótido basada en la
secuencia de nucleótidos codificante de la proteína de respuesta a
p53 PIGI-1, en condiciones de hibridación usando un
tampón 0,2 x 55 PE; SDS al 0,1%, y a una temperatura de hibridación
de 65ºC.
Los siguientes ejemplos ilustran más a fondo la
presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance
de la presente invención, y pueden proporcionar un mejor
entendimiento de la misma.
Los plásmidos pUHD15-1 Neo
(constructo de expresión de las proteínas de fusión a
Tet-Vp16), pUHC13-3 (constructo de
luciferasa sensible a Tet-VP16, contiene secuencias
de operador de TET) y pUHG10-3 (vector de expresión
sensible a Tet-Vp16) fueron obtenidos en Dr. H.
Bujard, Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania. El ADNc
codificante de la proteína p53 mutante en el codón 143 (sustitución
de V por A) fue subclonado desde el plásmido
pC53-SCX3 [Baker, S. J. et al.,
Science 249, 912-915 (1990)] en el
sitio BamHI del pUHG10-3 dando lugar a pTE9.5. El
pTE3.1 fue construido mediante la subclonación del ADNc codificante
de la p53 mutante en el codón 247 (sustitución de N por I) desde
el plásmido Gal4-53 247 [Unger, T., et al.,
EMBO J. 11, 1383-1390 (1992)] en el
pUHG10-3. El constructo indicador de la luciferasa
sensible a p53 fue generado reemplazando la secuencias del operador
de TET del pUHC13-3 por dos copias de un fragmento
de ADN, 5'-TCGAGCTTGCCTGGACTTGCCTGCCAGATCTGTC
GACGGAGG-3' [SEQ ID Nº: 3], que contenían el sitio de unión a p53 de RGC [Kern, S. E., et al., Science 252, 1708-1711 (1991)], produciendo el plásmido mRE10. Todos los constructos recombinantes fueron caracterizados y confirmados mediante un análisis de secuencias usando una secuenciación automática de ADN (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
GACGGAGG-3' [SEQ ID Nº: 3], que contenían el sitio de unión a p53 de RGC [Kern, S. E., et al., Science 252, 1708-1711 (1991)], produciendo el plásmido mRE10. Todos los constructos recombinantes fueron caracterizados y confirmados mediante un análisis de secuencias usando una secuenciación automática de ADN (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
Se cultivaron células Saos-2
(American Type Cell Culture, Bethesda, Maryland) a 37ºC, CO_{2} al
5%, en medio de McCoys complementado con suero fetal de ternero al
15%, L-Glutamina 2 mM, 10 U de penicilina y 10 ug/ml
de estreptomicina (Gibco). Las células fueron
co-transfectadas mediante electroporación
(electroporador de Gibco) con el plásmido de expresión de tTA pUHD
15-1 Neo (proporcionando resistencia a G418) y bien
pTE9.5 o pTE3.1 (a una proporción de 1:10, respectivamente). Las
células fueron seleccionadas de medios que contenían G418 (250
u/ml, Gibco) y tetraciclina (1 ug/ml, Sigma). Se clonaron y
expandieron colonias resistentes a G418, produciendo
Saos-2-A3 y
Saos-2-D4.
Posteriormente, se establecieron derivados de
Saos-2-A3 y
Saos-2-D4 que contenían constructo
indicador de la luciferasa mRE10, usando pBShygro para la selección
positiva (expresa el gen bacteriano de resistencia a la higromicina
bajo el control del promotor temprano de SV40, obtenido en Dr. Mark
Lynch, Bristol-Myers Squibb) de células resistentes
en medios que contenían higromicina B (150 U/ml), produciendo líneas
clónicas Saos-2-A3B y
Saos-2-D4H, respectivamente.
Se mantuvieron las células EB y EB1 clónicas
obtenidas en P. Shaw [Shaw, P., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)] a 37ºC
y CO_{2} al 9% en DMEM (Gibco) complementado con suero fetal de
ternero al 10% y antibióticos como se describe anteriormente.
Se prepararon extractos celulares en 100 ul de 2x
tampón de luciferasa (glicil-glicina 30 mM, pH 7,8,
MgSO_{4} 30 mM, EGTA 1,0 mM [Ácido
etilenglicol-bis(B-aminoetil
éter)N,N,N',N'-tetraacético], DTT 2,0 mM
[ditiotreitol]) que contenía Triton X100 al 1%. Se determinó la
actividad de la luciferasa mediante la lectura en un luminómetro
(modelo LB 952 T/16 de Berthold o modelo ML 1000 de Dynatech) de la
luminiscencia relativa producida por 50 ul de extracto (corregida
para la concentración de proteína) tras la inyección de 100 ul de
tampón de análisis (1 x tampón luciferasa con ATP 2,0 mM
[trifosfato de adenosina, pH 7,0] y luciferina 5 mM).
El ARN total fue preparado usando el
procedimiento de aislamiento en una sola etapa de tiocianato de
guanidinio ácido [Chomczynski, P., et al., Anal. Biochem.
162, 156-159 (1987)]. Se preparó ARN
poli-adenilado usando oligotex dT (Qiagen). El
análisis de transferencia northern fue realizado como se describe
anteriormente [Buckbinder, L., et al., J. Biol. Chem.
267, 25786-25791 (1992)]. La cuantificación
de las transferencias northern fue realizada usando una
densitometría láser (Molecular Dynamics) de los autorradiogramas o
mediante la exposición de las transferencias a placas de formación
de imágenes fosforescentes seguida del análisis en un reproductor de
imágenes fosforescentes (Fuji).
El procedimiento de sustracción de genotecas de
ADNc fue realizado esencialmente como se describe [Wang, Z., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88,
11505-11509 (1991)], a excepción de lo indicado
abajo. Se dividió el ADNc en tres alícuotas de las que una fue
digerida con Hae III y una con Rsa I. La adición del ligador, la
amplificación por PCR, la preparación del ADN conductor biotinilado,
la hibridación y la eliminación de híbridos fueron realizadas como
se describe anteriormente [Wang, Z., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 88, 11505-11509
(1991); Buckbinder, L. et al., J. Biol. Chem. 267,
25786-25791 (1992)]. La clonación y el rastreo del
ADNc comenzó tras la tercera vuelta de sustracción. El fragmento de
ADNc clonado que fue identificado (W4.5) fue luego añadido al
conductor para inhibir el fragmento, de manera que se pudieron
enriquecer ADNc diferentes en una criba de cuatro vueltas.
Se resolvieron proteínas nucleares (80 ug)
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
SDS (12%). Las proteínas fueron electrotransferidas a una membrana
de PVDF (Gibco) y se realizaron análisis de inmunotransferencia
como se describe en [Harlow, E., et al., "Antibodies: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988)]. Se
usó el anticuerpo monoclonal frente a p53 DO1
(mAB-6, Oncogene Science, Uniondale, NY) como
anticuerpo primario. Las reacciones de transferencia western fueron
detectadas usando un sistema de fototransferencia basado en la
quimioluminiscencia (Gibco, Grand Island, NY). La cuantificación del
autorradiograma fue como se describe anteriormente.
Se seleccionaron células de osteosarcoma humano
Saos-2 como la línea celular parental por varias
razones: 1) son nulas para la proteína p53; 2) la sobreexpresión de
la proteína p53 salvaje exógena en estas células inhibe su
crecimiento [Diller, L., et al., Mol. Cell. Biol.
10, 5772-5781 (1990)]; y 3) en los análisis
de la expresión transitoria varios mutantes sensibles a la
temperatura (ts, temperature-sensitive) de la
proteína p53 humana activan, a la temperatura permisiva (30ºC), un
gen indicador que lleva corriente arriba elementos sensibles a p53
(datos no mostrados). Se seleccionaron dos mutantes naturales de p53
para establecer líneas celulares estables: p53N247I (sustitución de
asparagina por isoleucina en el codón 247) y p53V143A (sustitución
de valina por alanina en el codón 143). El mutante p53N247I resultó
mostrar, como una proteína de fusión a GAL4, un
fenotipo-ts en transactivación [Unger, T., et
al., EMBO J. 11, 1383-1390 (1992)]. El
mutante p53V143A [Baker, S. J., et al., Science 249,
912-915 (1990)] no había sido caracterizado
previamente como un mutante-ts. Sin embargo, los
experimentos de unión a ADN con p53V143A de baculovirus purificado
indicaron que se une eficazmente al ADN a 30ºC (Takenaka, Faha y
Kley, observación sin publicar), y los experimentos de transfección
transitoria demostraron que activa un gen indicador sensible a p53 a
la temperatura permisiva (datos no mostrados).
Se usó un sistema de expresión regulado por
tetraciclina (TET) establecido por Gossen y Bujard [Gossen, M. y
Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89,
5547-5551 (1992)] para desarrollar líneas celulares
estables. Los ADNc de p53 fueron clonados corriente abajo de un
promotor mínimo que llevaba secuencias de operador de tetraciclina
(tOp) bacteriano (véase la figura 1A). Un promotor CMV conduce la
expresión constitutiva de una proteína bacteriana de fusión al
activador VP16 represor de la tetraciclina (tTA) que, en ausencia
de tetraciclina, se une a tOp y activa la transcripción del
constructo de expresión de la proteína p53. La adición de
tetraciclina desactiva la unión a ADN del tTA, acabando por tanto
con la expresión de la proteína p53. Por lo tanto, la eliminación
de tetraciclina del medio de cultivo celular resulta en una
acumulación pronunciada de la proteína p53. Se seleccionaron y se
expandieron distintos clones
Saos-2-A3 y
Saos-2-D4, que mostraban la
expresión regulada por la tetraciclina de las dos proteínas p53
mutantes (p53N247I y p53V143A). La figura 1B muestra la expresión
regulada de la p53 en estas células a 37ºC al eliminar la
tetraciclina del medio de cultivo. La expresión basal es
prácticamente indetectable en la línea celular
Saos-2-D4. La inducción de la
proteína p53 es 20 veces mayor en la células -D4H y aprox. 5 veces
mayor en las células Saos-2-A3
(Figura 1B), con los niveles inducidos máximos de p53 siendo
comparables en ambas líneas celulares (Figura 1B).
Ambas líneas celulares
Saos-2-A3 y
Saos-2-D4 fueron posteriormente
transfectadas con un constructo indicador de luciferasa que
contenía dos copias de las secuencias de unión a p53 de RGC [Kern,
S. E., et al., Science, 252, 1708-1711
(1991)]. Se seleccionaron y se caracterizaron clones estables que
llevaban un constructo indicador integrado,
Saos-2-A3B y
Saos-2-D4H, para la inducción de la
luciferasa dependiente de la p53. La expresión de la luciferasa fue
determinada tras el cambio a la temperatura permisiva (30ºC). Las
células Saos-2-A3B y -DH4 cultivadas
sin TET mostraron una fuerte inducción al ser incubadas a 30ºC
(figura 2A). La inducción es rápida, produciendo un aumento 6 y 10
veces mayor en 4 horas, y una inducción 10 y 200 veces mayor en 24
horas de incubación, en las células
Saos-2-A3B y
Saos-2-D4H respectivamente,
indicando que estas proteínas p53 mutantes humanas sensibles a la
temperatura pueden imitar en efecto las funciones de transactivación
con especificidad secuencial de la p53 salvaje. No se detectó
inducción en las células Saos-2-DH4
en presencia de tetraciclina, y se observó una inducción débil,
probablemente debida a una expresión de p53 basal baja (figura 1B),
en las células Saos-2-A3B.
Aunque estos experimentos demostraron que las
proteínas p53 mutantes, cuando han revertido a un fenotipo de tipo
salvaje, pueden activar la expresión génica desde un promotor
exógeno que lleve un elemento sensible a p53 en un contexto
artificial, no quedó claro si estas proteínas p53 mutantes podrían
activar realmente la expresión génica endógena. La figura 2B
muestra que la incubación de células
Saos-2-D4H (que llevan el mutante
p53V143A) a 30ºC está asociada con una inducción pronunciada del gen
hdm-2 endógeno de una manera dependiente de p53. Se
preparó ARN de células -D4H que habían sido cultivadas con o sin
tetraciclina e incubadas a 30ºC durante diversos períodos de
tiempo, y se caracterizó mediante un análisis de transferencia
northern. La inducción de los niveles de ARNm del
hdm-2 fue máxima a las 8 horas de producirse el
cambio de temperatura (10 veces mayor, fig. 2B). El subsiguiente
descenso rápido de los niveles de ARNm del hdm-2
puede deberse, en parte, al descenso rápido de la expresión de p53
que se produce durante este período de tiempo. Los niveles de ARN
de p53 disminuyen rápidamente tras el cambio de temperatura a 30ºC
(datos no mostrados), lo que podría ser un resultado de la
reducción de temperatura y el descenso asociado en la actividad
transcripcional, y/o cierto efecto de retroalimentación negativa
mediado por la proteína p53.
Los experimentos anteriormente descritos
sugirieron que la línea celular
Saos-2-D4H representaría una
herramienta útil para el aislamiento de genes regulados por p53.
Con este fin, se preparó ARN 8 horas después de haberse producido
el cambio de temperatura a partir de células mantenidas bajo tres
condiciones distintas, denominadas: p53 "nula" (incubada con
tetraciclina a 30ºC), "salvaje" (incubada sin tetraciclina a
30ºC) y "mutante" (incubada con tetraciclina y mantenidas a
37ºC). La metodología usada para enriquecer secuencias inducidas por
p53 de tipo salvaje, i.e., p53V143A revertida mediante temperatura,
estaba basada en un procedimiento de sustracción de genotecas
conducido por la PCR [Wang Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 88, 11505-11509 (1991)] (Para más
información, véase el apartado de "Materiales y procedimientos"
anterior de la presente memoria). Brevemente, el ADNc fue preparado
a partir de las tres poblaciones de ARN, digerido con las enzimas de
restricción Rsal o HaeIII y, tras la adición de ligadores,
amplificado mediante PCR para dar lugar al material inicial de
genotecas de ADNc. El conductor fue preparado mediante el
acoplamiento de fotobiotina a la p53 "nula" y "mutante".
Fragmentos de PCR que luego fueron incubados en un exceso molar 20
veces mayor con fragmentos de "tipo salvaje" (trazador) en una
mezcla de hibridación. Tras una incubación prolongada, se separaron
los híbridos y se sometió el resto de material no hibridado a un
segundo ciclo de hibridación. El material no hibridado fue
amplificado por PCR para producir el material enriquecido de la
primera vuelta. Se siguió enriqueciendo éste mediante dos ciclos
más de conducción. El material sobre regulado fue lo suficientemente
enriquecido como para ser caracterizado por hibridación de colonias
usando la sonda enriquecida de la tercera vuelta.
Todas las colonias que se hibridaron fuertemente
con la sonda enriquecida de la tercera vuelta estaban compuestas de
un fragmento de ADNc, denominado W4.5. Un análisis de transferencia
northern en el que se usó sonda de W4.5 marcada reveló la presencia
de un ARNm fuertemente hibridante de aprox. 2,2 kb de tamaño en las
células de expresión de la p53 "nula" y "mutante", y que
fue inducido con fuerza al cambiar las células a la temperatura
permisiva de 30ºC (estado de "tipo salvaje"). Se alcanzó una
inducción 15 veces mayor a las 8 horas de haberse producido el
cambio de temperatura (figura 3). De manera similar al perfil
observado para la inducción del ARNm de hdm-2
(véase figura 2B), los niveles de ARNm descendieron a partir de
entonces. Inicialmente, no se detectó ninguna homología de las
secuencias de ADN con el W.4.5 mediante una búsqueda en la base de
datos del banco de genes. Sin embargo, mientras estábamos
caracterizando este nuevo gen más detalladamente, apareció un
informe [El Deiry, W. S., et al., Cell 75,
817-825 (1993)] que describía la identificación de
un gen inducido por la p53 codificante de un nuevo transcripto de
aprox. 2,1 kb, denominado WAF1. La comparación de las secuencias
reveló que la secuencia de ADN del W4.5 es idéntica a la de un
fragmento de restricción Rsal de 466 bp presente en la región no
traducida de 3' de la secuencia de ADNc del WAF1 publicada. Los
esfuerzos de clonación realizados por nuestra cuenta confirman que
el WAF1 es una gen regulado por p53, y demuestran que también es
inducido eficazmente por una proteína mutante de p53V143A humana
revertida al mediante un cambio de temperatura. A juzgar por la
abundancia del fragmento W4.5 en el material inicial de la genoteca
de ADNc original, y por la intensidad de las especies de ARNm
hibridante de las transferencias northern, en comparación con la
del transcripto de ARNm de la \beta-actina
(abundancia elevada, aprox. 0,5% de la población total de ARNm), el
transcripto codificante del W4.5 pertenece a una clase de
transcriptos de abundancia intermedia (0,1-0,05% de
ARNm, en comparación con la \beta-actina).
El procedimiento de sustracción de genotecas
basado en la PCR tiende a enriquecer eficazmente para los
transcriptos más abundantes y expresados diferencialmente. Con el
fin de enriquecer para las secuencias de ADNc menos abundantes pero
reguladas, los fragmentos de W5.4 fueron conducidos fuera de la
genoteca de ADNc enriquecida. Esto condujo a la identificación de
dos fragmentos de ADNc no solapantes, el W5.5 y el B26. Ambos W5.5 y
B26 se hibridaron en transferencias northern con un transcripto
regulado de un tamaño aprox. de 6 kb (datos no mostrados). El
análisis secuencial reveló que el W5.5 es idéntico a una secuencia
presente en la secuencia de ADNc del hdm-2
informada. El análisis secuencial del B26 no reveló ninguna
homología secuencial con la secuencia parcial de ADNc del
hdm-2 publicada. Sin embargo, mediante el uso de ADN
genómico procedente de un tumor humano anteriormente caracterizado
para la amplificación del gen hdm-2 (obtenido en A.
J. Levine, Universidad de Princeton, Princeton, NJ), observamos la
presencia de un fragmento de ADN genómico amplificado en el análisis
de transferencia southern. Concluimos que el B26 representa el
segundo fragmento identificado para el hdm-2 y, lo
más probable, es que esté codificado por regiones no traducidas del
gen que no hayan sido clonadas previamente. De manera similar a los
resultados obtenidos con la sonda de W4.5, el transcripto de
hdm-2 pertenece a los transcriptos de clase de
abundancia intermedia de estas células.
Tras varios rastreos de las genotecas, se
identificaron clones simples para dos fragmentos de ADNc no
solapantes, el A26 y el A28. Al hibridarse con el material inicial,
ambos fragmentos parecieron estar codificados por transcriptos de
baja abundancia pero regulados. Esto fue confirmado mediante un
análisis de transferencia northern. Debido a la abundancia
extremadamente baja de estos transcriptos (< 0,005% del ARNm
total, en comparación con la \beta-actina), se
preparó ARN poli-adenilado procedente de células
-DH4 cultivadas en ausencia de tetraciclina y mantenidas a 37ºC o
30ºC durante 7 horas.
El análisis de transferencia northern en el que
se usó la sonda A28 reveló un ARNm hibridante de aprox. 2,5kb que
es inducido al producirse el cambio de temperatura de una manera
dependiente de p53 (figura 4, carril 1 frente al 2). No se observó
inducción en presencia de tetraciclina (datos no mostrados). El
tamaño del ARNm es distinto del de otros transcriptos activados por
la proteína p53 caracterizados y parece estar codificado por un
nuevo gen regulado. No se detectó ninguna homología secuencial al
buscar en la base de datos del banco de genes (datos no mostrados).
El gen codificante de la secuencia A28 pareció ser un gen de
respuesta directa a p53. Esto fue examinado en células que fueron
tratadas como antes, a excepción de que el inhibidor de la síntesis
proteica cicloheximida (chx, 10 ug/ml) fue añadido 30 min antes del
cambio de temperatura (el tratamiento con chx resultó en una
inhibición >95% de la síntesis proteica a juzgar por el marcado
de las células con metionina ^{35}S, datos no mostrados). El
tratamiento con chx aumentó los niveles basales (no inducidos) del
transcripto codificado por A28, pero no evitó la inducción
dependiente de la p53 de este transcripto (inducción 12 veces
mayor, figura 4, carril 3 frente al 4). Se ha observado una
estabilización del ARN mediada por la chx, denominada
super-inducción, para un número de especies de ARN,
y ha sido especialmente bien caracterizada para los genes de
respuesta inmediata-temprana al suero [Lau, L. F. Y
Nathans, D., (1991). "Hormonal Control: Regulation of Gene
Transcription" (Cohen, P. y Faulks, J. G. eds), pp.
757-793, Elsevier Sciences Publishers, Londres].
Como se propone anteriormente, la falta de inhibición de
retroalimentación o la renovación de los inhibidores lábiles podría
explicar esta estabilización.
La sonda A26 detectó dos especies de ARN de un
tamaño aprox. de 3 y 4 kb al realizar el análisis de transferencia
northern. Ambas especies de ARN son especialmente inducidas de una
manera dependiente de p53 al cambiar la temperatura de las células
-D4H (5 veces mayor, figura 4, carril 1 frente al 2). No se observó
ninguna inducción en presencia de tetraciclina (datos no
mostrados). Sin embargo, aunque está regulada, no está claro si A26
está codificado por un gen de respuesta directa a p53. En las
células tratadas con chx, el transcripto codificante de A26 basal
también es aumentado, si embargo, en contraste con el transcripto
codificado por A28, no se observó ninguna inducción al producirse
el subsiguiente cambio de temperatura (figura 4, carril 3 frente al
4). La información secuencial preliminar indica que A26 también
está codificado por un nuevo gen (datos no mostrados).
Para complementar nuestros estudios sobre la
regulación de los transcriptos codificantes de A28 y A26 en células
Saos-2, cuya velocidad de crecimiento es reducida,
pero no suprimida ante la inducción de la proteína p53 de tipo
salvaje como consecuencia del cambio de temperatura (datos no
mostrados), estudiamos la regulación de estos transcriptos en una
línea celular de carcinoma colorectal (EB) que transportaba un gen
inducible de la proteína p53 de tipo salvaje. En estas células EB,
se coloca la expresión de la proteína p53 de tipo salvaje bajo el
control de un promotor de metalotioneína que es activado por iones
metálicos tales como el zinc o el cadmio [Shaw, P. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89,
4495-4499 (1992)]. La expresión de p53 en estas
células, tanto en cultivo como en un tumor establecido en animales,
conduce a la apóstosis [Shaw, P. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 89, 4495-4499 (1992)]. Se
preparó ARN poli-adenilado procedente de células EB
parenterales cultivadas y células EB1 clónicas (que transportaban el
gen p53 de tipo salvaje) tratadas con y sin cadmio (6 uM) durante
10 horas. El análisis de transferencia northern muestra que el
transcripto codificante de A28 es fuerte y específicamente inducido
(>20 veces más, figura 5) en las células EB1 clónicas positivas
en p53 tratadas con cadmio. De manera similar, los transcriptos que
se hibridaron con la sonda A26 fueron inducidos (5 veces más,
figura 5). Curiosamente, las principales especies de ARN detectadas
por la sonda A26 son de un tamaño aprox. de 2 y 3 kb, en
comparación con el tamaño aprox. de 3 y 4 kb para las células
Saos-2-D4H. Ante una exposición más
prolongada también se detectó una especie de ARN de aprox. 4 kb
(datos no mostrados). Una posible explicación de estos
descubrimientos es que el transcripto del gen codificante de A26 es
alternativamente empalmado en diferentes tipos de células. El ARNm
de WAF1/CIPI/p21 fue inducido 8 veces más bajo estas condiciones
(figura 5). Los niveles de ARNm de la actina no fueron inducidos, y
se observaron niveles similares en las células EB1 tratadas con o
sin cadmio (figura
5).
5).
La fuerte correlación entre la capacidad de p53
para unirse a ADN y activar la transcripción con especificidad
secuencial, y su capacidad para inhibir el crecimiento celular o
inducir a la apóptosis sugiere que los genes inducidos por p53
pueden desempeñar un papel fundamental en la mediación de la función
de p53 como inhibidor de tumores. En este estudio, pretendemos
aislar y caracterizar tales efectores potenciales en la ruta de
señalización de p53. Esto conduce al aislamiento de genes regulados
por p53 previamente identificados, así como otros nuevos
transcriptos regulados por p53.
La estrategia que usamos suponía establecer
células de osteosarcoma Saos-2 humanas transformadas
por ingeniería genética (con una deficiencia en la expresión de la
proteína p53 endógena) que transportaban genes inducibles
codificantes de mutantes sensibles a la temperatura (ts) de p53.
Mediante el uso de un sistema de expresión regulado por
tetraciclina, desarrollado por Gossen y Bujard [Gossen, M. y
Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89,
5547-5551 (1992)], se establecieron líneas celulares
estables que contenían un gen de p53 integrado codificante de
cualquiera de los dos mutantes oncogénicos naturales de p53,
p53N247I y p53VI43A. La proteína p53 está estrechamente regulada
por la tetraciclina, y ante un cambio de temperatura (de 37ºC a
30ºC), ambas proteínas mutantes activan eficaz y específicamente un
constructo indicador de luciferasa integrado que contiene dos
copias del elemento sensible a p53 de RGC [Kern, S. E, et al.,
Science 252, 1708-1711 (1991)], y el gen
hdm-2 endógeno. Ya se ha observado que el mutante
p53N247I es sensible a la temperatura para la transactivación como
una proteína de fusión a GAL4 [Unger, T., et al., EMBO J.
11, 1383-1390 (1992)]. Nuestros
descubrimientos confirman que este mutante presenta propiedades
sensibles a la temperatura cuando se expresa de una forma regulada
como una proteína nativa. Además, nuestros estudios revelan que el
mutante p53V143A [Baker, S. J., et al., Science 249,
912-915 (1990)] es sensible a la temperatura para la
transactivación y parece más activo que el mutante p53N247I en
estas células Saos-2 clónicas. Sin embargo, sólo se
detectó actividad de tipo salvaje al incubar las células a 30ºC, en
oposición con la incubación a 34ºC para las células mutantes
p53N247I (datos no mostrados). Estos resultados indican que mutantes
diferentes de p53 pueden mostrar una sensibilidad diferente con
respecto a su capacidad por revertir a un fenotipo de tipo salvaje.
Los estudios en los que se usa p53V143A de baculovirus purificado
muestran que este mutante es sensible a la temperatura para la
unión a ADN in vitro, lo que indica que la sensibilidad a la
temperatura es una propiedad intrínseca de este mutante de p53
(Takenaka, Faha y Kley; observaciones no publicadas).
Dada su sensibilidad a la transactivación
dependiente de p53, se usó la línea celular que expresa a p53V143A,
Saos-2-D4H, para aislar nuevos
transcriptos sobre-regulados por p53. Los ADNc que
clonamos usando un procedimiento de selección descrito por Wang y
Brown [Wang, Z. y Brown, D. D., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 88, 11505-11509 (1992)] están
codificados por transcriptos que pertenecen principalmente a dos
categorías, i.e., transcriptos regulados por p53 pertenecientes a
la clase de abundancia intermedia y de abundancia baja (en
comparación con el transcripto de \beta-actina de
la clase de abundancia alta, por ejemplo). Los clones que aislamos
para los transcriptos de la clase de abundancia intermedia
representaban secuencias codificadas por el gen recientemente
clonado WAF1/CIP1/p21 [El-Deiry, W. S., et al.,
Cell 75, 817-825 (1993)], del que se
informó mientras caracterizábamos la sonda W4.5 clonada, y el gen
hdm-2. De este modo, nosotros confirmamos por
nuestra cuenta que el WAF1/CIP1/p21 es un gen regulado por p53, y
demostramos que su activación puede ser desencadenada mediante
proteínas p53 humanas mutantes revertidas mediante temperatura. Esto
confirma además que estas proteínas mutantes actúan como las
verdaderas proteínas p53 de tipo salvaje a la temperatura permisiva.
Los clones que aislamos para los transcriptos pertenecientes a la
clase de baja abundancia (la expresión es al menos un orden de
magnitud menor que la de los transcriptos WAF1/CIP1/p21 y
hdm-2) parecieron estar codificados por nuevos
genes regulados por p53. Un fragmento de ADN, el A28, detecta un
ARNm regulado específicamente por p53 de aprox. 2,5 kb en
transferencias northern. Otro fragmento de ADNc clonado, el A26,
detecta dos transcriptos sobre-regulados
específicamente por p53 en células
Saos-2-D4H de aprox. 3 kb y 4 kb de
tamaño.
Aunque ambos transcriptos estén regulados por
p53, la inducción es distinta en lo que respecta a su sensibilidad
hacia el inhibidor proteico cicloheximida. Por definición, el gen
codificante de A28 es un gen de respuesta directa a p53, pues la
síntesis proteica en curso no es requerida para la inducción. Por el
contrario, no está claro si el gen codificante de A26 es un gen de
respuesta directa, pues la inducción generada por p53 es bloqueada
por la cicloheximida. Esto se puede interpretar de varios modos: 1)
el gen codificante de A26 no es un gen de respuesta directa; 2)
debido a la estabilización del ARN codificante de A26 y a la posible
activación de rutas alternativas de señalización ante un
tratamiento con cicloheximida, la inducción directa generada por
p53 puede verse ocultada; o 3) la cinética de la inducción de los
transcriptos codificantes de A26 por parte de p53 es comparable con
la de otros genes de respuesta directa tales como WAF1/CIP1/p21,
hdm-2, lo que sugiere que el gen codificante de A26
puede ser un gen de respuesta directa. En tal caso, la activación
directa por parte de p53 requeriría la presencia de una proteína
co-activadora de vida corta y, posiblemente, estar
mediada por un elemento de respuesta a ADN distinto del sitio
consenso de unión de 20 bp de p53 [El-Deiry, W. S.,
et al., Natura Genetics 1,
45-49 (1992)], según lo dictado por el
co-activador putativo. La clonación y la
caracterización del promotor debería abordar este asunto.
Este estudio muestra que la p53 activa múltiples
genes diana de células Saos-2. Todavía queda por
establecer si las proteínas codificadas por los transcriptos
pertenecientes a la clase de abundancia baja podrían ser
inhibidores del crecimiento particularmente potentes. En realidad,
las células Saos-2-D4H sólo tienen
una disminución moderada de su velocidad de crecimiento ante la
inducción de p53 a la temperatura permisiva (datos no mostrados).
La razón de ello no está clara, pero puede implicar el hecho de que
estas células también son negativas para la expresión de RB
endógeno. De este modo, ampliamos nuestros estudios a un tipo
diferente de células, a una línea celular de carcinoma colorectal
(células EB), que ante una inducción mediada por cadmio de un gen
de p53 de tipo salvaje integrado, han demostrado sufrir apóstosis,
tanto in vitro como in vivo como un tumor establecido
[Shaw, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89,
4495-4499 (1992)]. Nuestros resultados demuestran
que el ARN de WAF1/CIP1/p21, y los transcriptos codificantes de A28
y A26, son aumentados de manera eficaz y específica ante la
inducción de la proteína p53 de tipo salvaje. La inducción se hizo
más pronunciada para el ARN codificante de A28 que para los ARN
codificantes de WAF1/CIP1/p21 y A26. Como la inducción de estos
transcriptos tuvo lugar en un tipo de células sometido a una
apóptosis mediada por p53, es posible que las proteínas codificadas
puedan representar efectores corriente abajo de la ruta de
señalización de p53 que participa en la muerte celular programada.
Se requerirá un análisis más a fondo para estudiar esta
posibilidad.
En resumen, demostramos que la p53 puede activar
múltiples rutas de señalización a través de su capacidad para
actuar como un activador transcripcional. De este modo, la
activación de múltiples efectores puede participar en la mediación
de las funciones de p53 como un inhibidor tumoral.
Se demostró que un fragmento específico de ADNc,
denominado A28 (véase ejemplo I), reconoce un trascripto regulado
por la proteína p53 de aproximadamente 2,5 kb. Esta sonda fue usada
para clonar el correspondiente ADNc de longitud completa. El ADNc
fue secuenciado y la proteína codificada predicha fue
identificada.
Se sondaron transferencias northern que contenían
ARN poli-adenilado de múltiples tejidos humanos
(adquiridos en Clonetech, Palo Alto, CA) con el fragmento de ADNc
A28 (análisis de transferencia northern como el descrito en el
ejemplo I anterior de la presente memoria). Este análisis reveló que
todos los tejidos analizados expresaban cantidades variables de un
transcripto correspondiente a A28, de un tamaño aproximado de 2,5
kb, con la posible excepción de los leucocitos sanguíneos
periféricos (figura 8). En el cerebro, se detectó una elevada
expresión.
Se adquirió una genoteca de ADNc de cerebro
humano en Stratagene (La Jolla, CA). Se rastrearon 1 x 10^{6}
fagos usando una sonda de A28 marcada con ^{32}P (1 x 10^{6}
cpm/ml) bajo las condiciones descritas por el productor de la
genoteca (Stratagene) con las siguientes modificaciones. La solución
de hibridación fue: formamida al 50%, 5 x SSPE (1 X SSPE = NaCl
0,15M; NaH_{2}PO_{4} 0,01 M, EDTA 1,25 mM, pH 7,4), 5 x
solución de Denhardt [Eds. Ausubel et al.,"In Current
Protocols In Molecular Biology", John Wiley and Sons
Publishers, Nueva York, NY (1988)], y 50 ug/ml de ADN esperma
desnaturalizado de arenque. La hibridación fue llevada a cabo
mediante la incubación a 42ºC durante toda la noche. Las
transferencias fueron lavadas 3 veces durante 15 minutos con un
exceso de tampón de lavado (2 x SSPE, SDS al 1%), a temperatura
ambiente, seguido de un lavado de 15 minutos en 0,2 x SSPE, SDS al
0,1% a 65ºC.
Las placas de hibridación fueron purificadas
mediante una vuelta secundaria de rastreo. Se analizaron más a
fondo tres clones que contenían ADNc que variaban de 1,5 a 2,0 kb.
El clon más largo, A28-15B, fue rescatado como
plásmido pBluescript (descrito en los procedimientos proporcionados
por Stratagene). El A28-15B fue secuenciado usando
cebadores con especificidad vectorial (T3, T7, KS, SK, véase
Bluescript, Stratagene) y cebadores con especificidad génica
(figura 9). El A28-15B era 1969 nts
(415-2383 de la secuencia mostrada en la figura 6
[SEQ ID Nº:1]). Pareció no haber longitud completa en base a la
discrepancia en el tamaño con las transferencias northern y al hecho
de que la secuencia comenzó en medio del marco de lectura abierto
putativo.
Para obtener la secuencia 5' perdida, se realizó
una técnica en la que se usó una combinación de ARN transcrito a la
inversa, ligación de cebadores de anclaje monocatenarios y PCR con
cebadores anidados (denominados colectivamente RACE de 5'), usando
un equipo adquirido en Clonetech. Se siguió el protocolo propuesto
por las instrucciones de los fabricantes, que se describe
brevemente abajo. Se transcribió inversamente ARN
poli-adenilado de células EB1 (descritas en el
ejemplo I anterior de la presente memoria), usando un cebador LB 57
(figura 9). El anclaje fue ligado al ADNc de la primera cadena.
Entonces se realizó una PCR secuencial con el cebador de anclaje y
LB 57, y luego con el cebador de anclaje y LB 44 (figura 9). Se
obtuvo un producto de aproximadamente 1.000 pares de bases y fue
secuenciado con el anclaje y el LB 50 como anteriormente. El
A28-15B de solapamiento de secuencias fue idéntico,
pero se extendió también a aproximadamente 415 bases más de 5'
(figuras 6 y 9). Se realizó la secuenciación de este producto y la
información obtenida predijo que contenía el sitio de inicio de la
traducción y la región codificante de la proteína perdida (véase más
abajo). Además de su tamaño, cuando el producto de RACE de 5' fue
alineado con la secuencia A28-15B, sugirió que era
casi de longitud completa.
El clon de ADNc parcial de
A28-15B contiene un único sitio de restricción Bgl
II a 16 nucleótidos de su extremo 5'. De este modo,
A28-15B fue digerido con BglII y SmaI, sólo
presentes en el poli-ligador (todas las enzimas de
restricción fueron adquiridas en Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN, y usadas según las especificaciones del fabricante). El
fragmento de ADNc de 5' de la PCR fue digerido con Bgl II y clonado
al A28-15B digerido produciendo
pBS-A28. La secuenciación confirmó una inserción
fiel. En la figura 6 [SEQ ID Nº: 1], se ofrece la secuencia del
clon de longitud completa construido. Todas las secuencias generadas
mediante PCR también fueron confirmadas mediante la secuenciación
de la correspondiente secuencia genómica derivada de un clon de
cósmido, identificado con el fragmento original de ADNc A28. El
plásmido pBS-A28.7 de una célula huésped de
Escherichia coli (cepa D45\alpha) fue depositado en la
colección estadounidense de tipos de cultivos, en Rockville,
Maryland, el 29 de junio de 1994, bajo el Tratado de Budapest, y
recibió en nº 69649 de identificación en la ATCC. Al concederse una
patente estadounidense, todas las restricciones en cuanto a la
disponibilidad por parte del público de la línea celular depositada
serán irrevocablemente eliminadas. El depósitos será reemplazado si
las muestras viables no pueden ser dispensadas por el
depositario.
La proteína que se prevé que está codificada por
el ADNc de A28 es de 202 aminoácidos (figura 7 [SEQ ID Nº:2], y es
conocida por la presente memoria como la proteína
PIGI-1. La proteína predicha comienza con la
metionina de iniciación (ATG) en el nucleótido 93, y continúa hasta
el codón de terminación (TGA) en el nucleótido 740. El ATG está
precedido por secuencias asociadas con los sitios de iniciación de
la traducción [Kosak, M., Nucl. Acids Res. 20,
8125-8132 (1987)]. La proteína predicha presenta una
fuerte homología aminoacídica con dos proteínas predichas de tamaño
similar, pero de función desconocida, presentes en el banco de genes
(HUMGOS8PPC, 44,3% de identidad con respecto a 185 aminoácidos, y
Hslr20arna, 48,3% con respecto a 147 aminoácidos).
Se clonó ADNc de longitud completa de
PIGI-1 en un vector de expresión eucariota /
procariota, pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Esto se llevó a
cabo mediante la subclonación de los ADNc flanqueados por el sitio
EcoRI procedentes de pBS-A28 (el sitio EcoRI de 3'
fue el sitio de clonación original para la genoteca de ADNc y el
sitio EcoRI de 5' fue generado mediante el cebador de anclaje en el
RACE de 5') al pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Brevemente, el
fragmento 2.4 EcoRI fue resuelto desde el vector sobre un gel de
agarosa al 0,8%, y la banda de ADN extirpada fue purificada usando
Gene Clean (Bio101, La Jolla, CA). El vector pCDNA3 fue preparado
mediante digestión con EcoRI, seguida por un tratamiento con
fosfatasa intestinal de ternero (Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN) y la purificación con Gene Clean. El inserto fue mezclado con
vector tratado con fosfatasa en una proporción molar de 5:1 y ligado
con la ligasa de ADN del fago T4 (Boehringer Mannheim) durante 1
hora a 14ºC. Se usaron 10 ng de ADN ligado para transformar la cepa
competente de E. coli DH5\alpha, según las instrucciones
del fabricante (GibcoBRL Life Technologies, Grand Island, NY). Los
recombinantes fueron seleccionados sobre placas de medio LB con
ampicilina [Maniatis et al., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)].
Los recombinantes fueron analizados mediante la preparación de
plásmido producido a partir de cultivos líquidos usando columnas de
purificación de plásmidos Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y mediante
la digestión bien con ApaI o con BamHI para determinar, mediante
diagnóstico, la orientación (ambas enzimas cortan al vector y al
inserto cada una a un tiempo), produciendo
pCDNA3-PIGI-1 y
pCDNA3-PIGI-1AS (antisentido).
Estos plásmidos fueron usados como molde para
producir ARN, y posteriormente la proteína, usando un sistema
acoplado in vitro de transcripción / traducción (TNT,
Promega, Madison, WI), según las instrucciones del fabricante. Se
usó metionina ^{35}S (Amershan, Arlington Heights, IL) para marcar
los productos de traducción in vitro (según el fabricante,
Promega), que fueron fraccionados sobre un gel de poliacrilamida en
presencia de SDS (Novex, San Diego, CA) y visualizados tras la
exposición a placas de formación de imágenes fosforescentes (Fuji,
Stamford, CT). Se detecta un producto de aproximadamente 23 kd
mediante el extracto programado con
pCDNA-PIGI-1 (figura 10). Este
tamaño es cercano al tamaño predicho de 22,7 kd. El extracto
programado con antisentido no mostró ningún producto proteico
específico. No se observa ningún producto de traducción con el
vector de expresión antisentido de PIGI-1
(pCDNA3-PIGI-1AS).
Se detectó un producto de aproximadamente 8 Kd en
las reacciones de traducción programadas con el truncamiento
A28-15B. El A28-15B comienza en la
posición nt 416 de la PIGI-1 de longitud completa, y
se observa que un ATG del nucleótido 493 parece cumplir las reglas
de iniciación de Kozak; sin embargo, éste sólo codificaría un
péptido de 5 aminoácidos antes de llegar al codón de terminación, no
siendo, de este modo, responsable del producto observado. La
siguiente metionina de iniciación potencial (ATG) está en la
posición 517, cumple las reglas de Kozak, está en el marco con la
proteína PIGI-1 predicha y se prevé que codifique
los 61 aminoácidos C-terminales. El tamaño de este
producto sería de 7,4 kd y concuerda con el tamaño del producto de
traducción in vitro observado producido con los lisados
programados de pCDNA3-A2815B.
Se demostró que la proteína
PIGI-1 es inducida directamente por p53. Como p53 es
un inhibidor tumoral conocido del que se ha demostrado que regula
al menos dos genes, WAFI/p21 y Gadd45, que tienen por sí mismos
propiedades inhibidoras del crecimiento, examinamos los efectos de
PIGI-1 en el crecimiento de las células tumorales
humanas. Los vectores de expresión eucariotas
pCDNA3-PIGI-1,
pCDNA3-PIGI-1AS, la proteína p53
salvaje o el vector pDCNA3 fueron transfectados usando lípido
catiónico (Lipofectamina, Gibco, Grand Island, NY) en células de
carcinoma de colon EB (adquiridas en Dr. Phillip H. Shaw, Institut
de Pathologie, Lausanne, Suiza), líneas celulares de carcinoma
cervical HeLa o de osteosarcoma Saos2 (ambas adquiridas en ATCC,
Rockville, MD). Las células fueron cultivadas en presencia de G418,
y las colonias fueron clasificadas tras aproximadamente 2 semanas
de selección. Los resultados con A28-15B sugieren
que los 61 aminoácidos del terminal carboxilo de la proteína
PIGI-1 también son capaces de mediar la inhibición
del crecimiento de células tumorales (datos no mostrados).
En concordancia con su función de inhibición de
tumores, observamos una importante reducción en el crecimiento de
todas las líneas celulares transfectadas con p53, que variaba del 88
al 100% de reducción en la formación de colonias en comparación con
el plásmido de control, pCDNA3 (tabla 1). La expresión del ARN de
PIGI-1 también conduce a una reducción del
crecimiento de las células tumorales humanas, Saos-2
y EB (97 y 82% respectivamente) así como de otras especies de
mamíferos; células de mono COS7 y células de ratón NIH 3T2 (61 y 90%
de inhibición del crecimiento por PIGI-1
respectivamente). La expresión de la PIGI-1
antisentido (PIGI-1-AS) no presentó
un efecto apreciable sobre el crecimiento de las células COS7 (110%
de vector), pero, en las líneas humanas Saos 2 y EB, pareció
proporcionar una ligera ventaja de crecimiento (200% y 179%
respectivamente). Esto puede indicar que la PIGI-1
antisentido está inhibiendo el ARNm de la PIGI-1
endógena (la estabilidad o la expresión), lo que indica además que
la PIGI-1 endógena participa en las funciones de
crecimiento celular.
En concordancia con el papel de p53 en la
respuesta al daño producido en el ADN, hemos descubierto que, como
WAF1 [El-Deiry, et al., Cancer Res.
54, 1169-1174 (1994)], la proteína
PIGI-1 es inducida por agentes que dañan el ADN
tales como la adriamicina o la radiación ultravioleta (datos no
mostrados), y que esta inducción guarda correlación con el estado
de p53 de la célula. Por lo tanto, la activación de
PIGI-1 podría representar un importante paso en la
respuesta apoptótica y/o inhibidora del crecimiento celular ante el
daño del ADN. Además, los fármacos quimioterapéuticos
convencionales que se dirigen directa o indirectamente a la proteína
p53 pueden ser sustituidos por nuevos fármacos quimioterapéuticos
dirigidos a la proteína PIGI-1. Estos nuevos
fármacos quimioterapéuticos serán eficaces incluso en células
tumorales que carezcan de la expresión de la proteína p53
normal.
Línea celular | PIGI-1 | pCDNA3 | PIGI-1-AS | p53 |
Saos 2 | 3 (0-15) | 100 | 200 | 10 (2-17) |
EB | 18 (0-33) | 100 | 179 | 12 (7-19) |
COS7 | 29 (19-38) | 100 | NR | 0 |
NIH 3T3 | 10 (4-19) | 100 | 110 | 4 (2-7) |
Se transfectaron células de cultivo tisular (3 x
10^{5} por pozo) con el constructo de plásmido indicado (2 ug) y
fueron seleccionadas en medio que contenía G418 (500 U/ml, excepto
las células EB, que fueron 800 U/ml) durante aproximadamente 2
semanas. Las células fueron lavadas y teñidas con cristal
violeta-formalina. Los números representan la
fracción media de colonias supervivientes en comparación con las
células transfectadas con el plásmido de control pCDNA3 (las
transfecciones fueron repetidas 3 veces en pozos por duplicado
usando diferentes preparaciones de ADN, excepto para el
antisentido, que representa transfecciones por duplicado). El
intervalo de la fracción de colonias supervivientes está indicado
entre paréntesis. NR significa no realizado.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Bristol-Myers Squibb Company
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos genes de respuesta a p53
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Bristol-Myers Squibb Company
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3005 First Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98121
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO DE LECTURA INFORMÁTICO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn versión 1.0, versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95926643.8
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de febrero de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dr. Kinzebach, Werner.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE LA CAUSA / REFERENCIA: M/38028
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (089) 998397-0
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (089) 987304
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2383 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 202 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA.
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGCTTGC CTGGACTTGC CTGCCAGAT TGTCGACGGA GG
\hfill42
Claims (17)
1. Una molécula polipeptídica aislada que
comprende:
i) la secuencia de aminoácidos de la proteína de
respuesta a p53 PIGI-1 según se muestra en la
figura 7 [SEQ ID Nº: 2] o
ii) una variante alélica de dicha secuencia, en
la que uno o más aminoácidos son eliminados, sustituidos,
insertados, invertidos o añadidos,
en la que el polipéptido que
comprende la variante alélica de la secuencia tiene la propiedad
inhibidora del crecimiento de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1.
2. Una molécula polipeptídica aislada que
comprende la secuencia de aminoácidos 142-202 de la
secuencia de aminoácidos de la proteína de respuesta a p53
PIGI-1 como se muestra en la figura 7.
3. Una molécula polipeptídica aislada obtenible
mediante la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos
codificante de una molécula polipeptídica según la reivindicación 1
ó 2.
4. Una molécula de ácido nucleico aislada
codificante de una molécula polipeptídica según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3.
5. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 4, que es una molécula de ADN.
6. La molécula de ADN según la reivindicación 5,
que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la figura 6
[SEQ ID Nº: 1].
7. La molécula de ADN según la reivindicación 5,
que tiene la secuencia de nucleótidos 416-2383
mostrada en la figura 6 [SEQ ID Nº: 1].
8. Una molécula de ácido nucleico que tiene una
secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con una secuencia de
ácidos nucleicos codificante de una molécula polipeptídica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el tampón de
lavado de la hibridación es 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, y en la que la
temperatura de hibridación es de 65ºC.
9. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 8, que es una molécula de ADN.
10. Una molécula de ADN que tiene una secuencia
de ADN que es complementaria a la secuencia de ADN según una
cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 ó 7.
11. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN codificante de una molécula polipeptídica según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
12. El vector de expresión según la
reivindicación 11, en el que la secuencia de ADN tiene la secuencia
de nucleótidos mostrada en a figura 6 [SEQ ID Nº: 1].
13. El vector de expresión según la
reivindicación 11, en el que la secuencia de ADN tiene la secuencia
de nucleótidos 416-2383 mostrada en la figura 6 [SEQ
ID Nº: 1].
14. Una célula huésped eucariota o procariota
que comprende el vector de expresión según una cualquiera de las
reivindicaciones 11, 12 ó 13.
15. Un procedimiento para producir una molécula
polipeptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
cuyo procedimiento comprende cultivar una célula huésped según la
reivindicación 14 en condiciones que permitan la expresión de la
molécula polipeptídica.
16. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad farmacéuticamente eficaz de una molécula polipeptídica
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de una molécula
de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a
10 o de un vector de expresión según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13.
17. El uso de una molécula polipeptídica según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de una molécula de
ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 o
de un vector de expresión según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, para preparar una composición farmacéutica
destinada a tratar tumores y cáncer.
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