DE10001975A1 - Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos - Google Patents
Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-FosInfo
- Publication number
- DE10001975A1 DE10001975A1 DE2000101975 DE10001975A DE10001975A1 DE 10001975 A1 DE10001975 A1 DE 10001975A1 DE 2000101975 DE2000101975 DE 2000101975 DE 10001975 A DE10001975 A DE 10001975A DE 10001975 A1 DE10001975 A1 DE 10001975A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- human mammal
- fos
- altered
- function
- switched
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 9
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 title claims abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 title description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 claims description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000004179 hypothalamic–pituitary–adrenal axis Effects 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims description 2
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 claims 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 description 31
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 108700025906 fos Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 101150078861 fos gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960002197 temoporfin Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000003826 endocrine responses Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000026727 thymocyte apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches Säugetier, das einen veränderten Glukokortikoid-Rezeptor (GR) und ein verändertes c-Fos aufweist. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen Säugetiers zur Testung von Chemikalien, Arzneimittel und Therapieansätzen hinsichtlich Erkrankungen und/oder Stoffwechsel-Vorgängen, bei denen Glukokortikoide von Bedeutung sind.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht-menschliches
Säugetier, das einen veränderten Glukokortikoid-Rezeptor (GR)
und ein verändertes c-Fos aufweist. Ferner betrifft die
Erfindung die Verwendung eines solchen Säugetiers zur Testung
von Chemikalien, Arzneimitteln und Therapieansätzen
hinsichtlich Erkrankungen und/oder Stoffwechsel-Vorgängen, bei
denen Glukokortikoide von Bedeutung sind.
Der Glukokortikoid-Rezeptor (GR) ist ein in vielen Zellen
vorliegender Rezeptor, der durch Bindung von Glukokortikoiden
aktiviert wird. In dieser Form kontrolliert er die
Transkription von Zielgenen und zwar (1) direkt durch
Interaktion mit regulatorischen DNA-Elementen und (2) indirekt
z. B. durch Interaktion mit weiteren Transkriptionsfaktoren.
Auf diese Weise koordinieren Glukokortikoide als Antwort auf
verschiedene Stimuli metabolische und endokrine Reaktionen
durch z. B. Reaktionen des Immunsystems und des Nervensystems
dadurch, daß ein passendes Transkriptionsprofil entsprechender
Zielgene gewährleistet wird. Zu den durch GR aktivierten, d. h.
in ihrer Expression induzierten Genen zählen Gene, deren
Produkte in der Glukoneogenese, der Proliferation von
Erythrozyten-Vorläuferzellen oder der Apoptose von Thymozyten
eine Rolle spielen. Andererseits reprimiert aktivierter GR
auch die Expression von Zielgenen, z. B. von Genen, die
wiederum von den Transkriptionsfaktoren AP-1 oder NFKB
aktiviert werden.
Aus Arbeiten des Anmelders geht hervor, daß die einzelnen
Funktionen von GR getrennt voneinander verändert werden
können. Insbesondere kann die induzierende Funktion
ausgeschaltet werden, ohne daß hiervon die reprimierende
Funktion betroffen ist. Der Anmelder hat dies in einem nicht-
menschlichen Säugetier gezeigt, dessen GR in seiner
induzierenden Funktion verändert, insbesondere ausgeschaltet,
ist (vgl. Deutsches Patent 198 15 958). Mit diesem nicht-
menschlichem Säugetier hat der Anmelder Untersuchungen der
reprimierenden Funktion von GR durchgeführt.
Es hat sich nun gezeigt, daß diese Untersuchungen selektiver
durchgeführt werden können, wenn ein nicht-menschliches
Säugetier verwendet wird, das neben einem in seiner
induzierenden Funktion veränderten GR auch ein verändertes c-
Fos aufweist. c-Fos ist eine Untereinheit des
Transkriptionsfaktors AP-1. Der Anmelder hat gefunden, daß die
reprimierende Funktion von GR direkt auf c-Fos wirkt und daß
diese Wirkung selektiv in einem solchen nicht-menschlichen
Säugetier, insbesondere im Vergleich mit dem nicht-
menschlichen Säugetier nach dem Deutschen Patent 198 15 958,
untersucht und beeinflußt werden kann. Ferner hat er erkannt,
daß die Wirkung der reprimierenden Funktion von GR auf c-Fos
ein elementarer Schritt in Stoffwechsel-Vorgängen,
insbesondere in solchen der Frühentwicklung, ist. Der Anmelder
hat eine hohe perinatale bis frühpostnatale Lethalität bei
solchen nicht-menschlichen Säugetieren gefunden.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt,
ein nicht-menschliches Säugetier bereitzustellen, bei dem die
induzierende Funktion von GR und c-Fos verändert sind.
Insbesondere sind die induzierende Funktion von GR und c-Fos
ausgeschaltet.
Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches
Säugetier, bei dem die induzierende Funktion von GR und c-Fos
verändert werden können, z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd,
Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus
bevorzugt ist.
Der Ausdruck "die induzierende Funktion von GR ist verändert,
insbesondere ausgeschaltet" umfaßt einen GR eines nicht-
menschlichen Säugetiers, dessen reprimierende Funktion
unverändert ist, das aber eine Veränderung in der induzieren
den Funktion aufweist. Vorzugsweise ist die induzierende
Funktion ausgeschaltet. Dies kann z. B. dadurch erreicht
werden, daß die Dimerisierung von GR bzw. seine DNA-Bindung
mutiert wird. Solches wird z. B. durch eine Mutation im D-Loop
von GR, insbesondere durch die Punktmutation A 458 T erzielt.
Der Ausdruck "c-Fos ist verändert, insbesondere ausgeschaltet"
umfaßt ein c-Fos eines nicht-menschlichen Säugetiers, das
derart verändert ist, daß es nicht mehr als Untereinheit des
Transkriptionsfaktors AP-1 fungieren kann, d. h. daß die
Veränderung von c-Fos letztendlich die Funktion von AP-1
beeinträchtigt bzw. verhindert. Vorzugsweise ist c-Fos
ausgeschaltet. Eine Veränderung von c-Fos kann z. B. dadurch
erreicht werden, daß eine Deletion eines Teils des ersten und
des kompletten zweiten Exons des c-fos Gens vorgenommen wird
(Wang et al., Nature 360 (1992), 741-745).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind
Zellen, die aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier
erhalten werden. Diese Zellen können in jeglicher Form
vorliegen, z. B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.
Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch
verschiedene Verfahren bereitgestellt werden. Beispielsweise
kann eine Maus nach dem Deutschen Patent 198 15 958 mit einer
Maus gekreuzt wird, bei der c-Fos ausgeschaltet ist (vgl. Wang
et al., Nature 360 (1992), 741-745). Es wird auf das
nachstehende Beispiel verwiesen.
Günstig ist auch ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Transfektion von embryonalen Stammzellen eines nicht- menschlichen Säugetiers, bei dem die induzierende Funktion von GR verändert ist, insbesondere eines nicht- menschlichen Säugetiers nach dem Deutschen Patent 198 15 958, mit einem Vektor, der eine Rekombination zwischen der für c-Fos kodierenden DNA der embryonalen Stammzellen und einer entsprechenden mutierten DNA des Vektors ermöglicht,
- b) Isolierung von in (a) stabil transfizierten Zellen und Einbringung dieser in weibliche Tiere eines nicht- menschlichen Säugetiers, sowie
- c) Analyse der in (b) erhaltenen Embryonen bzw. Nachkommen auf ein c-Fos, das verändert, insbesondere ausgeschaltet, ist.
Für die Ausdrücke "nicht-menschliches Säugetier", "die
induzierende Funktion von GR ist verändert, insbesondere
ausgeschaltet" und "c-Fos ist verändert, insbesondere
ausgeschaltet" gelten die vorstehenden Ausführungen
entsprechend.
Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" umfaßt jegliche
embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers,
bei dem die induzierende Funktion von GR verändert ist, und
die sich zur Mutierung der für c-Fos kodierenden DNA eignen.
Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von einem nicht-
menschlichen Säugetier nach dem Deutschen Patent 198 15 958.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch
Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen eine
Veränderung der für c-Fos kodierenden DNA ermöglicht.
Vorzugsweise ist die Veränderung dergestalt, daß c-Fos
ausgeschaltet ist. Günstig ist es, wenn der Vektor eine DNA
aufweist, die eine Deletion eines Teils des ersten und des
kompletten zweiten Exons des c-fos Gens aufweist, was zu einem
kompletten Funktionsverlust des Genprodukts führt (Wang et
al., Supra).
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um
die Schritte (a)-(c) durchzuführen. Beispielsweise wird er die
in Schritt (a) stabil transfizierten Zellen in Blastocysten
eines Maus-Spenderweibchens injizieren. Die Blastocysten
werden dann in scheinschwangere Maus-Weibchen eingeführt.
Einige der transferierten Blastocysten entwickeln sich zu
Maus-Chimären, von denen einige ein modifiziertes c-Fos Allel
in den Keimzellen tragen. Durch entsprechende Kreuzungen
werden dann hetero- und homozygote Mäuse erhalten. Zur
Durchführung der Schritte (a)-(c) eignen sich besonders
Mäuse embryonale Stammzellen nach dem Deutschen Patent 198 15 958.
Es wird auf das nachstehende Beispiel verwiesen.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches
Säugetier bereitgestellt, bei dem die Funktionen von GR und c-
Fos verändert sind. Diese Veränderungen können ein Ausschalten
der induzierenden Funktion von GR und von c-Fos sein. Mit
einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus können selektiv die
reprimierende Funktion von GR und damit verbundene
Stoffwechselvorgänge untersucht werden. Ferner ist es möglich,
Substanzen, Arzneimittel und Therapieansätze zu finden, mit
denen selektiv auf die reprimierende Funktion von GR und damit
verbundene Stoffwechsel-Vorgänge fördernd oder inhibierend
eingewirkt werden kann. Desweiteren liefert die vorliegende
Erfindung eine Basis, um auf Erkrankungen einzuwirken, die mit
,der reprimierenden Funktion von GR in Verbindung gebracht
werden. Solche Erkrankungen sind z. B. Störungen der Akut-
Phase-Reaktion, septischer Schock, akutes Atemnot-Syndrom,
Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis oder multiple
Sklerose, neuropsychiatrische Erkrankungen, Erkrankungen der
Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, Osteoporose,
Diabetes, Steroid-Myopathie, Hauterkrankungen, Leukämien,
Asthma und entzündliche Erkrankungen. Darüber hinaus eignet
sich die vorliegende Erfindung ganz besonders bei
Transplantationen eingesetzt zu werden.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.
Es werden Mäuse nach dem Deutschen Patent 198 15 958
(nachstehend mit GRdim bezeichnet) mit Mäusen verpaart, bei
denen c-Fos ausgeschaltet ist (nachstehend mit c-Fos-/-
bezeichnet; Wang et al., supra). Die Verpaarung erfolgt in
zwei Ansätzen. Im Ansatz 1 werden heterozygote GRdim-Mäuse mit
heterozygoten c-Fos-/--Mäusen verpaart. Im Ansatz 2 werden
homozygote GRdim-Mäuse mit heterozygoten c-Fos--Mäusen
verpaart. Der Genotyp der Embryonen bzw. geborenen Nachkommen
wird mit Hilfe von Polymerase Kettenreaktionen (PCR) unter
Verwendung von Genlokus-spezifischen Primern bestimmt.
Für die Bestimmung des Genotyps der Embryonen bzw. der
geborenen Nachkommen aus vorstehenden Verpaarungen wird
genomische DNA aus Schwanzbiopsien der zu untersuchenden Tiere
isoliert. Hierzu werden die Biopsien in 40 µl "Tailbuffer"
(50 mM Tris-HCl, pH 8; 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS) und
Zugabe von 25 µl Proteinase K (10 mg/ml) bei 55°C über Nacht
verdaut. Durch Zugabe von 250 µl 6 M NaCl-Lösung und
anschließendem 2 minütigen Schütteln werden die Proteine
ausgefällt und durch Zentrifugation (13.000 rpm, 7 min)
abgetrennt. Der Überstand wird mit 500 µl Isopropanol versetzt
und für 2 min durch Schütteln bei RT inkubiert. Durch 7
minütige Zentrifugation wird die ausgefallene genomische DNA
pelletiert, mit 80% Ethanol gewaschen, für eine Stunde an der
Luft getrocknet und in 40 µl TE (pH 8,0) aufgenommen.
In einer anschließenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden
ausgehend von zwei sequenzspezifischen Primern, die
komplementär zu Bereichen des zu untersuchenden Gen-Locus
sind, DNA-Fragmente, die innerhalb der Primer liegen, mit Taq-
Polymerase amplifiziert. Die Reaktion erfolgte unter folgenden
Bedingungen in einem Perkin-Elmer-Cycler (Norwalk, USA): 1/10
Volumen 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl; 100 mM Tris pH 8,4; 15 mM
MgCl2), 1/10 Volumen 10 × dNTP-Lösung (je 2 mM dATP; dCTP;
dGTP; dTTP; pH 7,0), je 1/10 Volumen 10 × Primer (100 pmol/µl),
1-2 U Taq-Polymerase und 10-500 ng Matrizen-DNA werden mit
Wasser auf das Endvolumen 25 µl aufgefüllt. Die Denaturierung
der DNA erfolgt bei 94°C für 1 Minute, die Hybridisierung bei
der für die verwendeten Primer optimalen Temperatur für 1
Minute und die DNA-Synthese bei 72°C für 1-2 Minuten. Die
Amplifikationsprodukte (nach 35 Zyklen) werden durch
gelelektrophoretische Auftrennung kontrolliert.
Zur Identifizierung des Genotyps der Mäuse aus der c-Fos-/--
Linie wird durch PCR mit c-Fos spezifischen Primern ein 1527 bp
großes Fragment kennzeichnend für das Wildtyp-Allel und ein
1935 bp großes Fragment, kennzeichnend für das c-Fos-/--Allel
amplifiziert.
Verwendet c-Fos--Primer:
FosRT1 5'-TTCCTACTACCATTCCCCAGCCG-3'
FosRT2 5'-GCCATCTTATTCCGTTCCCTT-3'
FosRT1 5'-TTCCTACTACCATTCCCCAGCCG-3'
FosRT2 5'-GCCATCTTATTCCGTTCCCTT-3'
Zur Identifizierung des Genotyps der Mäuse aus der GRdim-Linie
wird durch Verwendung von GR-spezifischen Primern ein 0,24 kb
großes Fragment amplifiziert. Zur Unterscheidung zwischen
Wildtyp- und mutiertem Allel wird das Fragment mit dem
Restriktionsenzym BsrGI verdaut, wobei das Wildtyp-Allel eine
0,24 kb Bande ergibt, während das mutierte Allel zwei fast
gleich große 0,12 kb Banden ergibt.
Verwendete GRdim-Primer:
GR 5' 5'-GTGTCTTGATGATAGTCTGCTC-3'
GR 3' 5'-CCATTACCTTCCAGGTTCATTC-3'
GR 5' 5'-GTGTCTTGATGATAGTCTGCTC-3'
GR 3' 5'-CCATTACCTTCCAGGTTCATTC-3'
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße Mäuse in hetero- und
homozygoter Form erhalten werden können. Ferner zeigt sich,
daß homozygote 18.5 dpc Embryonen in der erwarteten Häufigkeit
erhalten werden, während geborene Nachkommen im homozygoter
Form im Alter von drei Wochen eine große Lethalität aufweisen.
Alternativ wird ein Vektor verwendet, der wie in Wang et al.,
Supra, beschrieben, eine Selektionskassette innerhalb des c-
fos Gens aufweist, so daß kein funktionsfähiges c-Fos mehr
exprimiert wird.
Dieser Vektor wird durch Elektroporation in embryonale
Stammzellen einer Maus nach dem Deutschen Patent 198 15 958
eingeführt. Erfolgreich transfizierte und homolog
rekombinierte Zellen werden durch der vorstehenden
Selektionskassette entsprechenden Selektionsbedingungen
isoliert. Diese Zellen werden in Blastozysten einer Maus
injiziert und die Blastozysten dann in weibliche Mäuse eines
Stammes eingeführt, der sich zum Austragen transferierter
Embryonen eignet. Es werden chimäre Mäuse erhalten, aus denen
durch Verpaarung heterozygote GRdim/dim/c-Fos+/- und homozygote
GRdim/dim/c-Fos-/- Mäuse gewonnen werden.
Claims (8)
1. Nicht-menschliches Säugetier, bei dem die induzierende
Funktion des Glukokortikoid-Rezeptors (GR) und c-Fos
verändert sind.
2. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1, wobei die
induzierende Funktion von GR ausgeschaltet ist.
3. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 1 oder 2,
wobei GR in seiner Dimerisierung bzw. DNA-Bindung mutiert
ist.
4. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1-
3, wobei GR an der Position 458 ein Threonin aufweist.
5. Nicht-menschliches Säugetier nach einem der Ansprüche 1
bis 4, wobei c-Fos ausgeschaltet ist.
6. Zellen, erhalten aus dem nicht-menschlichen Säugetier
nach einem der Ansprüche 1-5.
7. Verwendung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem
der Ansprüche 1-5 oder der Zellen nach Anspruch 6 zur
Testung von Substanzen, Arzneimitteln und/oder Therapie
ansätzen hinsichtlich der reprimierenden Funktion von GR.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Substanzen,
Arzneimittel und/oder Therapieansätze hinsichtlich
Störungen der Akut-Phase-Reaktion, eines septischen
Schocks, eines akuten Atemnot-Syndroms, Autoimmunerkrankungen,
wie rheumatoide Arthritis oder multiple Sklerose,
neuropsychiatrischen Erkrankungen, Erkrankungen der
Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, Osteoporose,
Diabetes, Steroid-Myopathie, Hauterkrankungen, Leukämien,
Asthma, entzündliche Erkrankungen oder Transplantationen
zu verstehen sind.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000101975 DE10001975A1 (de) | 2000-01-18 | 2000-01-18 | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos |
| PCT/DE2001/000221 WO2001052641A1 (de) | 2000-01-18 | 2001-01-17 | Nicht-menschliches säugetier mit verändertem glukokortikoid-rezeptor und verändertem c-fos |
| AU2001240433A AU2001240433A1 (en) | 2000-01-18 | 2001-01-17 | Non-human mammal with a modified glucocorticoid receptor and a modified c-fos |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000101975 DE10001975A1 (de) | 2000-01-18 | 2000-01-18 | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10001975A1 true DE10001975A1 (de) | 2001-07-26 |
Family
ID=7627918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000101975 Withdrawn DE10001975A1 (de) | 2000-01-18 | 2000-01-18 | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2001240433A1 (de) |
| DE (1) | DE10001975A1 (de) |
| WO (1) | WO2001052641A1 (de) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19815958C1 (de) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
-
2000
- 2000-01-18 DE DE2000101975 patent/DE10001975A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-01-17 WO PCT/DE2001/000221 patent/WO2001052641A1/de active Application Filing
- 2001-01-17 AU AU2001240433A patent/AU2001240433A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19815958C1 (de) * | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Deutsches Krebsforsch | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WANG et.al.: Bone and haematopoietic defects in mice locking c-fos, Nature 360 (1992), S. 741-745 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001052641A1 (de) | 2001-07-26 |
| AU2001240433A1 (en) | 2001-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69333082T2 (de) | Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse | |
| DE69024440T2 (de) | Verfahren zum spezifischen ersetzen einer genkopie, die sich in einem rezeptorengenom befindet, durch genintegration | |
| DE69120146T2 (de) | Erzeugung xenogener antikörper | |
| DE69933886T2 (de) | Transgene mäuse, die den menschliche immunoglobulinlambdalokus exprimieren | |
| DE60310202T2 (de) | Zielgerichtete chromosomale mutagenese mit zinkfingernukleasen | |
| DE69333984T2 (de) | Androgen-regulierung durch dns sequenzen des rattenprobasin-gens | |
| DE60014067T2 (de) | Zusammensetzungen und verfahren zur genetischen analyse | |
| EP3443103A1 (de) | Kernkodierte männliche sterilität durch mutation in cytochrom p450 oxidase | |
| Haberfeld et al. | Development of DNA fingerprint probes: an approach and its application | |
| DE102015004187A1 (de) | Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum | |
| DE10001975A1 (de) | Nicht-menschliches Säugetier mit verändertem Glukokortikoid-Rezeptor und verändertem c-Fos | |
| DE69734143T2 (de) | Neue methoden zur charakterisierung von verbindungen, welche die stf-1 expression in inselzellen der bauchspeicheldrüse stimuliert | |
| DE60319667T2 (de) | Polynukleotide, Polypeptide und Methoden, um nützliche Hunde zu testen | |
| DE102016015741A1 (de) | Kernkodierte männliche Sterilität durch Mutation in Cytochrom P450 Oxidase | |
| WO2008155306A1 (de) | Nukleinsäurekonstrukte zur inaktivierung und konditionalen mutagenese von genen | |
| DE10061634B4 (de) | Verfahren zur Bestimmung unbekannter DNS-Sequenzen in komplexen Genomen | |
| Yamasu et al. | Functional organization of DNA elements regulating SM30α, a spicule matrix gene of sea urchin embryos | |
| DE19815958C1 (de) | Nicht-menschliches Säugetier sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
| DE602004013319T2 (de) | Hefemodell für die toxizität amyloidogener proteine | |
| EP0879300A1 (de) | Verwendung von primern für universelle fingerprint-analysen | |
| DE4406512C1 (de) | Integrationsvektoren zur Herstellung von Genen, die rekombinante Antikörper codieren | |
| AT501628A1 (de) | Promotor zur expression von fremdgenen in neuronalen zellen | |
| DE10211617A1 (de) | Neuer Promotor mit erhöhtem Expressionsprofil | |
| WO2001077374A2 (de) | Verfahren zur identifizierung und isolierung von genomfragmenten mit kopplungsungleichgewicht | |
| DE4325699A1 (de) | Rekombinantes DNA-Konstrukt |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |