JPH08242866A

JPH08242866A - ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２−サブユニットの調節配列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製されたトランスジェニック動物

Info

Publication number: JPH08242866A
Application number: JP7326094A
Authority: JP
Inventors: Jean-Pierre Changeux; ジャン−ピエール・シャンジュ; Marina Picciotto; マリナ・ピッチオットー; Alain Bessis; アラン・ベシス
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-12-14
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 1996-09-24
Anticipated expiration: 2015-12-14
Also published as: US6455754B1; US20090013421A1; AU4037395A; DK0717105T3; EP0717105A2; JP2008099686A; DE69534022T2; PT717105E; EP0717105A3; CA2165098A1; US6452066B1; ES2238677T3; EP0717105B1; US6177242B1; JP4450874B2; CA2165098C; ATE289628T1; NZ280674A; JP4468429B2; DE69534022D1

Abstract

(57)【要約】【課題】ｎＡＣｈＲのβ₂ −サブユニットの調節配列
及びこれをコードする配列を含むＤＮＡを発現すること
によって、ニコチンの薬理学的効果、ｎＡＣｈＲの役
割、ニコチン耽溺、ニコチン欠乏と関連する痴呆などに
関する有用な情報を得、ｎＡＣｈＲと関連した活性、行
動を回復又は調節する化合物をスクリーニングすること
ができるＤＮＡなどを提供する。【解決手段】表１に示す配列及び緊縮条件下にＤＮＡ
にハイブリダイズする配列から実質的になる、ｎＡＣｈ
Ｒのβ₂ −サブユニットのプロモーターを含む単離され
たＤＮＡ、これを含む組換えベクター、形質転換有機
体、これを導入されているトランスジェニック非ヒト哺
乳動物などを作成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ニューロンニコチ
ン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のβ₂−サブ
ユニットのＤＮＡ及びクローンに関する。本発明は、ま
た、β₂ −サブユニットニューロンｎＡＣｈＲの調節配
列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、
及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製された
トランスジェニック動物に関する。５’のフランキング
配列は、プロモーターを含み、これが、ニューロンに特
異的な発現をもたらす。ゲノムクローンにより、ニコチ
ン系、及びニコチンに対する薬理学的応答におけるβ₂
−サブユニット遺伝子の重要性が、証明されている。本
発明は、また、ＤＮＡ配列を含むベクター、ベクターに
より形質転換された細胞、本配列を有するトランスジェ
ニック動物、及びこれらのトランスジェニック動物より
誘導されるセルラインに関する。更にまた、本発明は、
上述したもの全ての用途を記載するものである。

【０００２】本明細書に引用する参考文献は、明細書の
終わりに、著者及び発行年又は引用番号を記載する。

【０００３】

【従来の技術】ニューロン特異的発現組換えＤＮＡに基
づく多くの操作では、組織特異的な発現が、必要であ
る。遺伝子導入療法における、望ましくない、又は潜在
的に有害な副作用、及び操作は、適正な組織特異的発現
を行うことによって、減少することができる。更に、一
つのセルタイプ単独に対してある種のタンパク質の発現
をコントロールすることができると、重要な治療又は解
析の目的で、科学者が、これらの細胞をマッピング、認
識又は精製する能力が、向上する。興味の対象である細
胞が、ニューロン、又はニューロンの特定のサブセット
である場合、ニューロン特異的又はサブセット特異的な
発現をもたらすＤＮＡ配列が、必要となる。

【０００４】有機体により発現されるタンパク質は、ニ
ューロンにより、しばしば、特定の目的に利用される。
これらのタンパク質の特定のサブユニット又は成分を、
ニューロン組織中のみで発現させることによって、ニュ
ーロンは、その目的に応じて、タンパク質活性を、作り
替える。特定の、ニューロン特異的なサブユニット、又
は成分を、発見し、なぜこれらが、ニューロン組織にお
いてのみ産生されるかを解明することによって、ニュー
ロン特異的な発現をもたらすＤＮＡ成分への鍵が得られ
る。

【０００５】アセチルコリン受容体の生物学に関する本
発明者らの知識により、本発明のための重要な知見が得
られた（Changeux, The New Biologist, Vol. 3, No.
5, pp. 413-429)。異なる型のアセチルコリン受容体
が、異なる組織に確認されており、異なるアゴニストに
応答する。その一種類であるニコチン性アセチルコリン
受容体（ｎＡＣｈＲ）は、ニコチンに応答する。この型
のサブグループは、ニューロンにおいてのみ確認されて
おり、ニューロンｎＡＣｈＲと称される。

【０００６】一般的には、５種類の型のサブユニット
が、アセチルコリン受容体複合体を形成する。受容体中
のサブユニットの型により、アゴニストに対する特異性
が決定される。ある種の細胞群に対する特定のアセチル
コリン受容体型の局在化をコントロールするのが、これ
らのサブユニットの発現パターンである。これらの特異
的発現パターンの獲得に関与する遺伝的メカニズムによ
り、組織に特異的、又はより限定された細胞群に特異的
な発現に対するコントロール能が得られる。本発明者ら
の研究は、プロモーター配列における規定された要素に
より、β₂ −サブユニットのためのニューロン特異的な
発現が得られることを示している。

【０００７】ニコチンの薬理学的効果上述したように、ｎＡＣｈＲは、アゴニストであるニコ
チンに応答する。ニコチンは、学習及び記憶を含む行動
の多くの面に関与している（１，２）。ニコチンの薬理
学的効果及び行動学的効果は、ニューロンｎＡＣｈＲと
関係する。低用量のニコチン（２３）又はニコチン様ア
ゴニスト（１６）を用いた研究では、脳における高親和
性ｎＡＣｈＲが、受動的忌避行動に対するニコチンの効
果に介在することが、示唆されている。従って、ニュー
ロンｎＡＣｈＲが変化しているモデルシステムにより、
ニコチンの薬理学的効果、認識の過程におけるニューロ
ンｎＡＣｈＲの役割、ニコチン耽溺、及びニコチン系に
おける欠損と関連する痴呆に関する有用な情報が、得ら
れる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】（α₇ −サブユニット
は、in vitro^6,7 において、機能性ホモオリゴマーを生
成することができるが）機能的ニューロンｎＡＣｈＲ
は、少なくとも一種類の型のα−サブユニット及び一種
類の型のβ−サブユニットを含む五量体タンパク質複合
体である（３〜５）。β₂ −サブユニットは、本研究の
ために、７種類の公知のα−サブユニット及び３種の公
知のβ−サブユニットから選択した（３）。脳におい
て、広く発現されており（８〜１０）、脳のほとんどの
領域では、その他のβ−サブユニットが、発現しないた
めである（１０）。したがって、このサブユニットの突
然変異により、ＣＮＳニコチン系における有意な欠損が
生じるはずである。本発明者らは、薬理学及び行動学に
おけるβ₂ −サブユニットの関与に関して、検討を行っ
た。トランスジェニックマウスにおいて、β₂ −サブユ
ニットを突然変異させるために、遺伝子ターゲッティン
グを用いた。

【０００９】本発明者らは、ニコチンに対する高親和性
結合部位が、β₂ −サブユニット突然変異に対してホモ
接合性である、つまりβ₂ −／−であるマウスの脳には
存在しないことを、発見した。更に、脳スライスの電気
生理学的記録により、これらのマウス由来の視床ニュー
ロンが、ニコチン投与に応答しないことが明らかになっ
た。最後に、行動学的試験により、ニコチンは、連想学
習の一手段である受動的忌避試験において、β₂ −／−
マウスの能力を、向上させないことが証明されている。
逆説的に、突然変異マウスは、この試験において、非突
然変異同胞種よりも、高い能力を示すことができる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】

本発明の簡単な概要及びその有用性本発明の特徴においては、我々は、ニューロンｎＡＣｈ
Ｒのβ₂ −サブユニットの調節及びコード領域を含むＤ
ＮＡの１５kbの断片について記載する。我々は、β₂ −
サブユニット遺伝子のプロモーターを、in vitro及びト
ランスジェニックマウスにおいて特徴づけるものであ
る。我々は、本遺伝子の正の調節に関与するＥ−ボック
ス及びその他の共通タンパク質結合配列を含む、数種類
のＤＮＡ要素について、記載するものである。更に、我
々は、β₂ −サブユニットプロモーターの細胞特異的な
転写が、転写された配列に位置する一つを含む、少なく
とも二つの負の調節要素を含むことを示すものである。

【００１１】これらの特徴の好ましい実施態様は、特定
のプロモーター配列、並びに各種細胞及び有機体におけ
るニューロン特異的発現のコントロールにおけるその用
途に関する。１１６３bp配列及び８６２bp配列は、両者
とも、ニューロン特異的発現をもたらす。その他の実施
態様には、必須活性化要素を含む、図１の−２４５〜−
９５の配列、及びリプレッサーを含む図１の−２４５〜
−８２４の配列が含まれる。ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列から
なるリプレッサー要素は、転写された領域にも存在す
る。これらのゲノム配列からなるある種のプラスミドに
ついても、同様に記載する。

【００１２】プロモーター配列は、ある種の規定された
細胞におけるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの
発現をコントロールする能力を有するため、重要であ
る。例えば、以下に示すようなトランスジェニックマウ
スにおいては、トキシンなどをコードする配列は、ニュ
ーロンに対して作用し、疾患状態におけるこれらの細胞
の崩壊をまねる。その他のものも、以下に記載するデー
タより、明らかであろう。

【００１３】替わりに、プロモーターは、ある種のニュ
ーロンに対して、コードされた成長因子又は腫瘍発生
性、腫瘍形成性若しくは不死化タンパク質をコントロー
ルして、腫瘍発生をまねることができる。これらの細胞
は、培養物中に単離及び増殖させることができる。別の
用途においては、プロモーター配列は、in situ におい
て特定のニューロンを認識、又は細胞選別技術により、
ニューロンを単離するために、レポーター配列に有効に
結合させることができる。単離、精製されたニューロン
は、次に、in vitroにおける生化学的又は遺伝子学的解
析に用いることができる。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼ
などのレポーター配列については、以下に記載する。

【００１４】本発明の別の特徴においては、本発明者ら
は、マウスのニューロンｎＡＣｈＲのβ₂ −サブユニッ
トのゲノムクローンを提供するものである。これらのク
ローンは、哺乳類のニコチン系及びニコチンの薬理学の
解析において有用である。本発明者らは、β₂ −サブユ
ニットのゲノムクローンを、ニコチンの高親和性結合を
はたきだすために用いたトランスジェニックマウスを用
いた解析について、記載する。

【００１５】記載した欠失突然変異体に加えて、β₂ −
サブユニットのエキソン又は調節配列に取り込まれた突
然変異により、有用な突然変異トランスジェニック動物
が得られるであろう。これらの突然変異は、点突然変
異、欠失突然変異又は挿入突然変異であることができ、
ｎＡＣｈＲの非有効な活性、又は非活性受容体を得るこ
とができる。このような突然変異動物により、化合物
の、ｎＡＣｈＲ活性若しくは機能を回復又は調節する能
力を決定するための方法が、可能となり、このような方
法を考案することができる。機能の調節は、受容体の
数、活性若しくはその他の補償のメカニズムを、アップ
レギュレーティング又はダウンレギュレーティングする
ことによって、行うことができる。また、化合物が、記
載する、又は公知（１７、２２、１８、２、１９、２
１、２３、２４を参照）の行動学的解析における野生型
の行動を回復又は調製する能力を決定するための方法
は、突然変異動物を用いて、考案することができる。行
動学的解析は、記憶、学習、不安症、運動活性及び注意
力を、非処理動物又は患者と比較して、試験することか
らなるが、これに限定されるわけではない。したがっ
て、ｎＡＣｈＲと関連した活性若しくは行動を回復又は
調節する化合物を選択するための薬理学的解析（１２、
１３、１４、１５、２０を参照）は、本発明により提供
される突然変異動物により行うことができる。可能性の
ある治療薬の投与量及び量は、確立された技術により決
定することができよう（例えば、参考文献１６を参
照）。

【００１６】トランスジェニック動物又はこれらの動物
から誘導される細胞からなる現在のモデルシステムは、
学習及び行動に対するニコチンの役割、ニコチンの薬理
学、ニコチン耽溺、及びニコチン系における欠乏と関連
する疾患の状態を解析するのに使用することができる。
更に、ニコチン耽溺又はニコチン系における欠乏に対す
る潜在的な治療法を、トランスジェニック動物、又はこ
れらより誘導される細胞及びセルライン、又はファージ
β₂ （ＣＮＣＭ受託番号Ｉ−１５０３）のＤＮＡ断片若
しくは完全なＤＮＡをトランスフェクションさせたいず
れのセルラインによっても、試験することができる。こ
れらのセルラインは、β₂ −サブユニット配列を有する
又はβ₂ −サブユニット配列において突然変異を起こし
たホモ接合又はヘテロ接合トランスジェニック動物か
ら、直接得られる全てを含むものである。加えて、これ
は、天然型β₂ −サブユニット配列又は突然変異β₂ −
サブユニット配列を用いた培養物中に形成されるセルラ
インを含むものである。ここで使用する技術は、例え
ば、PCT WO 90/11354 に引用されているそれらである。

【００１７】高親和性ニコチン結合部位が減少している
アルツハイマー病などの痴呆症により、この欠乏の補償
のための薬物をスクリーニングするために、本モデルを
使用することができることが示唆される。したがって、
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性を回
復又は検出できる程度にもたらす能力について、化合物
をスクリーニングする方法であって、本化合物を、適当
なセルラインに付加する、又は本化合物を、トランスジ
ェニック動物に導入することからなる方法を、考案する
ことができる。本発明により得られるトランスジェニッ
ク動物及びセルラインは、これらの方法において、用い
ることができる。このような動物又はセルライン系は、
β₂ 遺伝子の活性を回復又は調節することができる化合
物を、選択するためにも使用することができる。

【００１８】β₂ −サブユニット遺伝子配列（野生型又
はその突然変異体の断片）により得られたトランスジェ
ニック動物は、二重トランスジェニック動物を発生させ
るために使用することができる。この目的のために、β
₂ −サブユニットトランスジェニック動物を、同一種の
その他のトランスジェニック動物又は同一種の天然の突
然変異動物と、交配させることができる。得られる二重
トランスジェニック動物、又はそれより誘導される細胞
を、親のβ₂ −サブユニットトランスジェニック動物と
同じ用途に使用することができる。

【００１９】プロモーター配列及びゲノムクローンの両
者は、調節タンパク質が存在するか又はしないかについ
て解析するために使用することができる。以下のゲルシ
フト法は、このような用途を、例示するものである。配
列又はクローンは、放射性核種、蛍光化合物などのマー
カー、又は架橋タンパク質若しくはアビジン−ビオチン
などの化合物を、取り込む又は結合させることによっ
て、プローブとして使用することもできる。これらのプ
ローブは、ニューロンの作用若しくはアセチルコリン受
容体系に関与するタンパク質、核酸又はその他の化合物
を認識或いは測定するために使用することができる。

【００２０】有用なβ₂ 突然変異動物、セルライン又は
配列を発生させるために、核酸配列を突然変異させる又
は修飾するための公知の方法を、本発明と組み合わせて
使用することができる。このような方法には、点突然変
異、部位特異的突然変異誘発、欠失突然変異、挿入突然
変異、相同的組換えより得られる突然変異、及びＤＮＡ
若しくはＤＮＡを有する細胞の化学的又は放射線処理に
より得られる突然変異が含まれるが、これらに限定され
るわけではない。ＤＮＡ配列解析は、所望又は必要であ
れば、発生した突然変異を調べるために使用する。次
に、突然変異動物、セルライン又は配列を、本発明者ら
が記載するＤＮＡ配列、システム、測定法、方法又は工
程に使用する。突然変異を起こしたＤＮＡは、定義によ
りゲノムＤＮＡとは、異なる又は同一ではないであろ
う。突然変異動物は、また、ここに記載する配列を含
む、又は本発明により使用可能となる第一のトランスジ
ェニック動物を、第二の動物と交配することによって、
作製する。第二の動物は、第一の動物に含まれるＤＮＡ
とは異なるＤＮＡを含むことができる。このような方法
で、突然変異動物の各種ラインを作製することができ
る。

【００２１】更にまた、ここに記載するＤＮＡ配列を、
上述したように交配し、これらのＤＮＡ配列を、発現ベ
クターに結合させ、β₂ −サブユニットタンパク質又は
β₂−サブユニット配列から誘導される突然変異体を発
現させるために、組換えＤＮＡ技術が利用可能である。
したがって、β₂ −サブユニット又は突然変異体は、そ
の生化学的又は行動学的活性について、解析することが
できる。このような方法で、有効なｎＡＣｈＲの発現を
妨げる突然変異ＤＮＡ配列を、作製することができる。

【００２２】代わりに、記載するプロモーター配列を、
その他のタンパク質の発現を誘導するために、発現ベク
ター又はシステムにおいて使用することができる。得る
ことのできるＤＮＡ配列は、したがって、これらのＤＮ
Ａ配列を転写、又はこれらのＤＮＡ配列によりコードさ
れるタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを産生
するために、本発明者らが記載するプロモーター又は調
節配列に結合させることができる。

【００２３】関連技術の記載 In situ におけるハイブリダイゼーション(Wada et a
l., 1989; Hill et al.,1993; Zoli et al., 1994) 及
び免疫組織化学(Hill et al., 1993) による従来の研究
により、これまでにクローニングされたニューロンｎＡ
ＣｈＲサブユニットの全てが、厳密なニューロン特異的
分布を示すことが証明されている。しかし、異なるサブ
ユニットも、脳内のニューロンの小さなサブセットに対
してのみ、同様に厳密な分布を示す。例えば、ｎＡＣｈ
Ｒα₂ −サブユニットのトランスクリプトは、ニワトリ
の間脳のSpiriformis lateralis の核(Daubas et al.,
1990) 又はラットの脚間核(Wada et al., 1988) におい
てのみ、検出される。また、β₃ 、β₄ 及びα₃ −サブ
ユニットトランスクリプトは、脊椎動物の脳における構
造の小さいセットにおいてのみ検出される（Zoli et a
l., 1994 中の参考文献）。

【００２４】ｎＡＣｈＲ、α₄ 、α₅ 、α₆ 及びβ₂ −
サブユニット遺伝子トランスクリプトは、比較すると、
はるかに広い分布を示す（Wada eT al., 1989; Zoli et
al., 1994中の参考文献）。例えば、β₂ −サブユニッ
トトランスクリプトは、ＣＮＳのニューロンの多く及び
末梢ニューロンの全てに認められ、ｎＡＣｈＲを発現す
る(Role, 1992; Hill et al., 1993) 。

【００２５】これらのサブユニットの発現の違いの結
果、脊椎動物においては、ｎＡＣｈＲが、種により、非
常に多様に存在する。それぞれの種は、ニューロンの多
様なカテゴリー又はグループと関連する、定義された発
現パターンを有する。例えば、内側手綱由来のニューロ
ンは、脚間核由来のそれらと相互に結合し、それぞれ
が、異なる生理学的及び薬理学的特性を示す(Mulle et
al., 1991)、異なるセットのｎＡＣｈＲサブユニットを
発現する（参考のため、Role, 1992を参照）。

【００２６】ニューロンにおけるｎＡＣｈＲ遺伝子転写
の調節を説明する遺伝的メカニズムについては、これま
で限られた情報しか得られていない。In vitroで解析を
行ったニワトリα₇ −サブユニット遺伝子のプロモータ
ーに関するこれまでの研究では、転写調節を司るＤＮＡ
要素を特徴づけることができなかった(Matter-Sadzinsk
i et al., 1992) 。別の研究では、α₂ −サブユニット
遺伝子のプロモーターが、一部特徴づけられ、サイレン
サーが、記載され、配列が決定されている（Bessis et
al., 1993, Daubas et al., 1993も参照）。

【００２７】ある種の証拠により、特にβ₂ −サブユニ
ットに関する研究が、詳細に行われている。脳のニュー
ロンのほとんどにおいて、これは発現されている(Hill
et al., 1993) 。また、β₂ −トランスクリプトの出現
のタイミングは、ニューロン分化のそれと、密接に平行
している(Zoli et al, 1994)。従って、我々は、その転
写を調節する遺伝メカニズムについて研究することを決
定した。

【００２８】本発明の簡単な記載遺伝子構造我々は、マウスのｎＡＣｈＲβ₂ −サブユニット遺伝子
の調節配列及びそれをコードする配列を含む遺伝子断片
を、クローニングした。本発明者らは、調節領域の少な
くとも一部が、異なる哺乳類の種においても、保存され
ていることを発見した。特に、ＮＲＳＥ／ＲＥ１に対応
する＋１６〜＋３８bpの領域を、図１に記載する。プラ
イマー伸長生成物のＲＮアーゼによる保護及び増幅を用
いて、我々は、１カ所の大きな、そして３カ所の小さい
転写開始部位を発見した（図１）。プライマーの伸長実
験は、異なる２種類の逆転写酵素を用い、異なるバッチ
のｍＲＮＡ及び異なるプライマーにより行った。これら
のＰＣＲに基づく技術により、我々は、逆転写酵素の停
止部位ではなく、転写開始部位に対応する同一の断片を
増幅及びサブクローニングすることができた。我々が特
徴づけた転写開始部位は、最長のラット(Deneris et a
l., 1988)及びヒト(Anand and Lindstrom, 1990) β₂
ｃＤＮＡ５’末端の位置から下流に位置する（図１を参
照）。これは、ヒト及びラットでは、別の転写開始部位
が、使用されていることを意味する。種間におけるこの
ような不一致は、筋ｎＡＣｈＲ（Duerr et al., 1994,
Dong etal., 1993; Toussaint et al., 1994 も参照）
のεサブユニットについては、既に証明されている。α
₂ −サブユニット遺伝子(Bessis et al., 1993) とは反
対に、上流にエキソンは、検出することができなかっ
た。

【００２９】１．２kbp のフランキング領域の構造に関
する解析によって、Ｓｐ１部位及びＥ−ボックスを含む
核タンパク質結合のための多くの共通モチーフが示され
た。１．２kbの非欠失プロモーターの約９０bpが、転写
され、この領域は、ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列を含む(Krane
r et al., 1992; Mori et al., 1992)。ポリオーマウイ
ルス(Bourachot et al., 1989)又はｆｏｓ遺伝子(Lamb
et al., 1990) などの異なる系における転写開始部位の
下流に、調節要素が存在することは、既に記載されてい
る。

【００３０】プロモーター領域は、エキソン１に位置す
るＥｃｏ４７III （図１を参照）と、４．５kb上流のＢ
ａｍＨＩ部位の間に位置する。一つの好ましい実施態様
は、図１に記載した、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７III 部
位の間の１１６３bpの配列である。調節配列は、Ｅｃｏ
４７III 部位から２kb下流に位置するかもしれない。ｎ
ＡＣｈＲβ₂ −サブユニット配列由来の調節要素は、こ
れらに結合した、タンパク質、ポリペプチド又はペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列のニューロン特異的発
現をコントロールするために使用することができる。該
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、トキシン、
栄養因子、ニューロペプチド、腫瘍形成性、腫瘍発生性
若しくは不死化タンパク質、又はニューロンの機能を変
更することのできるその他のあらゆるタンパク質である
ことができる。

【００３１】１１６３bpのプロモーターは、細胞特異的
転写を達成する１１６３bpのプロモーターは、β₂ −サブユニット遺伝
子の組織特異的及び一時的に特異的である転写の両者の
ための調節配列を含有する。一時的トランスフェクショ
ンの実験により、１１６３bpの断片は、ｎＡＣｈＲβ₂
−サブユニット遺伝子の細胞特異的発現をもたらすため
の十分な情報を含むことが示された。我々は、同一のプ
ロモーターが、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポ
ーター遺伝子の厳密な細胞特異的転写をコントロールす
ることを示した。更に、導入遺伝子構成物は、胎児神経
系の初期の発達の間、内因性β₂ −サブユニット遺伝子
と同一のタイミングで、活性化されると考えられる（Zo
li et al., 1994)。発達の後期の段階では、末梢β₂ 発
現ニューロンの多くは、まだ標識されている（図４Ｃ、
Ｄ）。

【００３２】トランスジェニックマウスにおいて、β₂
−サブユニットプロモーターのコントロール下、β−ｇ
ａｌを発現する２種類のライン（１３及び２６）を発生
させることによって、プロモーター配列を試験した。Ｃ
ＮＳにおいては、βガラクトシダーゼ発現のパターン
は、２種類のラインの間で異なっていた。正常にβ₂ を
発現する細胞のサブセットのみが、導入遺伝子を発現す
る。導入遺伝子及び内因性遺伝子の発現におけるこの種
の不一致は、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ遺伝子プ
ロモーター(Mercer et al., 1991; Hoyle et al., 199
4) 又はＧＡＰ−４３遺伝子(Vanselow et al., 1994)
については、既に記載されている。性器結節及び皮膚筋
における導入遺伝子のライン１３においては、予想外の
発現が観察された。これらの組織は、ライン２６におい
ては、染色されないため、この発現は、導入遺伝子の組
込み部位に由来すると考えられる。我々の知る限りで
は、遺伝子導入により研究されたニューロンプロモータ
ーの多くは、小さい割合の導入遺伝子ラインにおいて、
異所性発現を示す(Forss-Petter et al., 1990; Kaneda
et al., 1991; Banerjee et al., 1992; Hoesche et a
l., 1993; Logan et al.,1993, Vanselow et al., 199
4)。しかし、当業界の技術では、導入遺伝子の発現パタ
ーンが、本来の遺伝子のそれを、厳密に反映又は重複し
ているラインの構成が可能である。詳細については、遺
伝子導入操作の結果を示す参考文献を参照。

【００３３】β−ｇａｌ陽性細胞の分布を、その他の公
知のニューロンマーカーのそれと比較することによっ
て、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ＴｒｋＡ（高
親和性神経成長因子受容体）及びｐ⁷⁵（低親和性神経成
長要素受容体）発現細胞の分布には、類似性があること
が明らかになっている(Yan and Johnson, 1988: Pioroa
nd Cuello, 1990a, b; Ringstedt et al., 1993) 。詳
細には、発達中のラットでは、ｐ⁷⁵が、ほぼ全部の神経
節及び中心核において発現されており（不確帯及び視床
下部核以外）、これは、導入遺伝子を発現したものであ
る(Yan and Johnson, 1988) 。ｐ⁷⁵の発現は、（β₂ −
プロモーター導入遺伝子の発現と同様）多くの末梢神経
節及び脳核においては、一時的であり、周産期又は生後
早い年齢で、検出不可能なレベルに低下することも、興
味深い。したがって、β₂ −サブユニットプロモーター
は、ｐ⁷⁵の活性化によりコントロールされる要素を含
み、又はβ₂ 導入遺伝子及びｐ⁷⁵遺伝子の両者が、共通
の調節要素によりコントロールされている可能性があ
る。

【００３４】結論として、本プロモーターでは、脳で活
性であるある種の調節要素が欠落するが、存在する調節
要素が、ＰＮＳ、脊髄及び幾つかの脳構造における、細
胞及び発達に特異的なβ−ガラクトシダーゼの発現を可
能とするのに十分である。このプロモーターは、また、
ニューロン組織における調節タンパク質を認識するため
の測定法に使用することもできる。

【００３５】ＤＮＡ調節要素 β₂ −サブユニット遺伝子の転写に関与するＤＮＡ要素
を更に特徴づけするため、我々は、１１６３bpプロモー
ターを欠失又は突然変異させ、結果として得られた構成
物を一時的トランスフェクションにより解析した。遠位
５’末端領域内に存在するリプレッサー要素は、線維芽
細胞内では活性であるが、神経芽腫内では活性でない。
したがって、この要素によって少なくとも部分的に、β
₂ −サブユニット遺伝子のニューロン特異的発現が説明
される。プロモーターを更に解析すると、５８９bpを欠
失させた場合に、神経芽腫内では活性が増大するが線維
芽細胞内では増大しないということが示される（図６、
８６２Ｅと２８３Ｅ−Ｌｕｃｉを比較すること）。

【００３６】ＮＲＳＥ／ＲＥ１要素は、プロモーターの
３’末端に位置する。この要素は既に、ニューロン細胞
内でプロモーターの活性を制限することが示されている
（Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992; Li et a
l., 1993)。β₂ −サブユニット遺伝子の１１６３bpの
プロモーターにおいては、この配列の点突然変異が、線
維芽細胞中の転写活性を１００倍（〜１００fold）増大
させ、このことが、この配列が、β₂ −サブユニット遺
伝子のニューロン特異的発現に関与していることを、意
味している。その上、配列を比較すると、この配列が、
ラット及びヒトβ₂ −サブユニットｃＤＮＡ内（Deneri
s et al., 1988; Anand and Lindstrom, 1990)並びに中
重量ニューロフィラメント遺伝子、ＣＡＭ−Ｌ１遺伝
子、カルビンジン遺伝子又は小脳Ｃａ結合タンパク質遺
伝子（以下に示す表２を参照）などの神経系内で発現さ
れる遺伝子のいくつかのプロモーターの中で、高度に保
存されていることが示される。

【００３７】

【表２】

【００３８】表２：１１６３bpプロモーターの近位領域
内の正及び負の調節要素その他のニューロンプロモーターとの、β−サブユニッ
トプロモーターの近位サイレンサーのアラインメント。
配列は(Maue et al., 1990; Ｎａチャンネル、受託番号
Ｍ３１４３３）、(Mori et al., 1990; ＳＣＧ１０、Ｍ
９０４８９）、(Sauerwald et al., 1990; Synapsin
Ｉ、Ｍ５５３０１）、(Kohl et al., 1992; ＣＡＭＬ１
遺伝子、Ｘ６３５０９）、(Gill and Christakos, 199
3; カルビンジン遺伝子、Ｌ１１８９１）、(Zopf et a
l., 1990; ニューロフィラメント遺伝子、Ｘ１７１０
２、逆配向）から取られたものである。番号付けは Gen
Bank/ＥＭＢＬライブラリ内の配列を意味する。

【００３９】図６に記載した欠失実験は、ヌクレオチド
−２４５と−９５の間に必須活性化部位が存在すること
を示している。この領域内でＳｐ１結合部位及びＥ−ボ
ックスを検出することができた。Ｓｐ１部位は、汎存要
素であり、一方Ｅ−ボックスは、筋肉内（ｎＡＣｈＲα
₁ −サブユニットについてはBessereau et al., 1994を
参照）並びにニューロン内（Guillemot et al., 1993）
でのいくつかの遺伝子調節メカニズムに関与してきた。
２回回転軸要素も同様に、チロシンヒドロキシラーゼ遺
伝子（Yoon and Chikaraishi, 1994）、ＳＣＧ１０遺伝
子（Mori et al., 1990)、ＧＡＰ４３遺伝子（Nedivi e
t al., 1992)のそれらなどのいくつかのニューロンプロ
モーター内、又はＮ−ＣＡＭ遺伝子のフランキング領域
内（Chenet al., 1990)でも報告されている。以下に示
す表３に示されている結果は、神経芽腫において、Ｅ−
ボックス／２回回転軸内で突然変異を受けた１１６３bp
のプロモーターが野生型プロモーターに比べて著しく活
性が低いことを証明している。その上、ゲルシフト測定
（図７）は、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、特異的複合
体を結合させることができることを更に証明している。
これは、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、β₂ −サブユニ
ット遺伝子の転写の活性化の少なくとも一部分を司るこ
とを示唆している。しかし、非相同プロモーターのトラ
ンス作用実験は、Ｅ−ボックスが２７bp上流にあるＳｐ
１部位と協力して、転写を正に活性化させることを示唆
している。Ｅ−ボックスとＳＰ１結合部位の間のこの種
の協力は、既に、筋肉ｎＡＣｈＲα₁ −サブユニット転
写の調節についても証明されている（Bessereau et a
l., 1993）。

【００４０】

【表３】

【００４１】表３：１１６３bpプロモーターの近位領域
内の正及び負の調節要素１１６３bpプロモーターの近位部分内の突然変異の効
果。野生型又は突然変異を受けたプロモーターの活性
は、プロモーター無しのＫＳ−Ｌｕｃｉプラスミドのル
シフェラーゼ活性に合わせて正常化している。ＥＥ１．
２−Ｌｕｃｉの活性は、図３からのものである。

【００４２】結論として、我々は、β₂ −サブユニット
遺伝子が、負の作用をする要素とＥ−ボックスを含む１
つの正の要素により基本的に調節されることを示してき
た。この二重調節は、いくつかのニューロン遺伝子に共
有される一般的特長であると思われ（Mandel and Mckin
non, 1993)、ニューロン遺伝子の転写の微調節を可能に
している。その上、我々の遺伝子導入に関する研究は、
１１６３bpのプロモーターが緊密なニューロン特異的発
現をもたらすものの、いくつかの発達要素又はＣＮＳ特
異的調節要素が欠如していることを示している。

【００４３】図１ β₂ −サブユニット遺伝子のイニシエーターＡＴＧをと
り囲む領域のヌクレオチド配列４つの垂直な矢印の頭は、転写開始部位に対応する、Ｒ
ＡＣＥ−ＰＣＲ及びＳＬＩＣを用いて発見された４つの
末端を示す。垂直な矢印は、最長のラット（ｒ）及びヒ
ト（ｈ）のβ₂ −サブユニットｃＤＮＡクローンの５’
末端に対応する位置を表わしている(Deneris et al., 1
988)。図３に記載する実験に使用した欠失の終点は、配
列の上に示す。イントロン内に位置するヌクレオチド
は、小文字でタイプしている。

【００４４】図２ β₂ −サブユニットｍＲＮＡの５’末端のマッピングａ．ＲＮアーゼ保護実験。イントロン１の１５８ヌクレ
オチド及び上流の配列の７８９ヌクレオチド（−６３４
／＋１５５）を含む³²Ｐで標識されたＲＮＡプローブに
対して、ＤＢＡ２マウスの脳（それぞれレーン２及び
３、５及び１５μg）及び酵母ｔＲＮＡ（レーン１、１
５μg)由来の総ＲＮＡをハイブリダイズした。保護され
たバンドのサイズを、ＤＮＡと比較してのＲＮＡのアク
リルアミドの低移動度に応じて(Ausubel et al., 199
4)、及び万能プライマーでプライミングされたＭ１３ｍ
ｐ１８の配列との比較により評価した。ゲルの左側部分
の矢印は、主要な保護バンドを指している。ｂ．ＳＬＩＣを用いた転写開始部位の認定。図の下部
は、ＳＬＩＣ又はＲＡＣＥ−ＰＣＲのために使用するオ
リゴヌクレオチドを記載し、その方針を示している。Ｓ
ＬＩＣ実験においては、プライマーの伸長を、オリゴヌ
クレオチドｐＥｘ３を用いて行った。ｃＤＮＡの最初の
ストランドを、その後オリゴヌクレオチドＡ５’に連結
させ、結果として得られた断片を、まずオリゴヌクレオ
チドＡ５’−１／ｐ⁰ を用い次にＡ’−２／ｐ１を用い
て増幅させた。その後、増幅させた断片を、１．２％の
アガロースゲル上に配置した。ゲルをブロッティング
し、オリゴヌクレオチドｐ２に対しハイブリダイズし
た。レーン１：全ＤＢＡ２マウス脳ＲＮＡ５μg 、レー
ン２−３：それぞれ逆転写酵素及びＲＮＡを用いないコ
ントロール。マイナス：Ｔ４ＲＮＡポリメラーゼを省略
した。ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、同じ結果を得た。

【００４５】図３ In vitroでのβ₂ −サブユニットプロモーターの細胞特
異的発現プロモーター無しのプラスミド（「材料と方法」の中で
記述するＫＳ−Ｌｕｃｉ）の活性に合わせて、プラスミ
ドのルシフェラーゼ活性を正常化した。ルシフェラーゼ
オリゴヌクレオチド（「材料と方法」の中で記述する）
を用いた、ＥＥ１，２−Ｌｕｃｉによりトランスフェク
ションを行ったＳＫ−Ｎ−Ｂｅから抽出したｍＲＮＡに
ついてのＲＡＣＥ−ＰＣＲは、増幅された断片が、適正
な転写開始部位について予想されたサイズを有すること
を示した。

【００４６】図４トランスジェニックマウスにおけるβ₂ −サブユニット
プロモーターの細胞特異的発現ａ．Ｅ１３胚の全マウント着色。矢印の頭は皮膚筋にお
ける異所的発現を指している。ｂ．腰仙レベルでのＥ１３胚の側矢状断面内でのβ−ガ
ラクトシダーゼ活性の検出。矢印の頭は、脊髄の前角及
び背角内での標識を示す。ｃ．同じ胚の隣接する断面内でのβ₂ −サブユニットの
トランスクリプトの検出。ｄｒ：背根神経節；ｔ：蓋；
ｏｇ：交感神経節鎖；ｔｒ：三叉神経節。

【００４７】図５トランスジェニックマウスにおけるβ−ガラクトシダー
ゼの発現ａ．網膜（ｒｅ）及び三叉神経節（ｔｒ）（Ｅ１４．
５）の染色。ｂ．心副交感神経節ニューロン（ｐｇ）（Ｅ１４．５）
の染色。ｃ．脊髄（ｐｌ）の横断面、ｄｒ：背根神経節、ｏｇ：
交感神経節ｄ．脊髄（ｐｌ）の腹側図。小さい方の矢印は、認識さ
れなかったニューロンを表わす。

【００４８】図６ β−サブユニットプロモーターの５’末端欠失を含むル
シフェラーゼ融合遺伝子の発現プラスミドは、ｎｎｎＥ−Ｌｕｃｉと呼ばれ、ここで、
ｎｎｎは、挿入ヌクレオチドのサイズであり、Ｅは、
５’末端制限部位（Ｅｃｏ４７III)である。矢印は、転
写開始部位を表わす。ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの活性は、
図３からのものである。

【００４９】図７ゲルシフト実験移動度シフト実験のオートラジオグラム。使用したプロ
ーブは、³²Ｐで標識した二本鎖Ｅ−Ｄオリゴヌクレオチ
ドであった。このオリゴヌクレオチドは、Ｅ−ボックス
／２回回転軸要素のみを有しており、一方オリゴヌクレ
オチドＳ−Ｅは、Ｓｐ１結合部位並びにＥ−ボックス／
２回回転軸要素を有している。競合性オリゴヌクレオチ
ドを、１００倍モル過剰においてのみ使用したＳ−Ｅを
除き、１０倍及び１００倍のモル過剰で使用した。

【００５０】図８は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ₂ −サ
ブユニットをコードする遺伝子の分断を示す。ａ−ｉ
は、マウスβ₂ −サブユニット遺伝子の通常のゲノム構
造である。組換え事象によって除去されたエキソンの部
分は、淡い灰色で示している。ＡＴＧ：イニシエーターメチオニン。囲いは、エキソン
Ｉ〜IVを表わす。ａ−ｉｉは、内因性β₂ −サブユニッ
ト遺伝子を分断するのに使用した標的置換ベクターであ
る。イニシエーターメチオニン及び第一のエキソンの残
りが、ＮＬＳ−ｌａｃＺのコード領域及びＭＣｌneo^R発
現カセット²⁵によって置き換えられている。この構成物
は、ＰＣ１２細胞（図示せず）の安定なトランスフェク
ションの後、ｌａｃＺの発現をコントロールすることが
できたが、ｌａｃＺＤＮＡにおける明らかな組換えの
欠如にもかかわらず、組換え動物中に、ｌａｃＺの発現
は検出されなかった。ジフテリアトキシン−Ａ遺伝子
（ＤＴＡ）²⁶を使用して、無作為的な組込みに対して選
択を実施した。ａ−ｉｉｉは、突然変異β₂ −遺伝子の
構造である。制限部位：Ｈ、ＨｉｎｄIII ；Ｒ、Ｅｃｏ
ＲＩ；Ｅ、Ｅｃｏ４７III ；Ｐ、ＰｓｔＩ。黒の矢印
は、胚ステム（ＥＳ）細胞中の組換え事象を検出するた
めに使用したプライマーを示す。灰色の矢印は、野生型
又は突然変異β₂ 遺伝子を検出するために使用したプラ
イマーを示す。ｂは、＋／＋マウス、＋／−マウス及び
−／−マウスから得た末端ＤＮＡのＰＣＲ解析図であ
る。ｃは、パネルｂで解析したものと同じマウスから得
た、ＨｉｎｄIII で制限した末端ＤＮＡのサザーンブロ
ッティング解析図である。ｄは、β₂ −サブユニットに
対して作製したモノクローナル抗体を用いた、全脳タン
パク質のウエスタンブロッティング解析図である。

【００５１】方法。ａ：多クローニング部位（ＭＣＳ）
をＭＣｌネオカセットに挿入することにより、β₂ −標
的ベクターを構成した(GTC GAC GGT ACC GCC CGG GCA G
GC CTG CTA GCT TAA TTA AGC GGC CGC CTC GAG GGG CCC
ATG CAT GGA TCC) 。ＡＴＧに対する４．１kbのＥｃｏ
ＲＩ−Ｅｃｏ４７III β₂ −ゲノム断片５’及びβ₂−
遺伝子の最初のイントロン内で開始する１．５kbのＰｓ
ｔＩ β₂ −ゲノム断片をＭＣＳ中にクローニングし
た。前記のエレクトロポレーション²⁵により、ＨＭｌ
^27,28 胚ステム細胞（５×１０⁷ 個）を、線形化した標
的ベクターでトランスフェクションした。生存する２４
個のＧ４１８耐性クローンをＰＣＲによって選別した
（β₂ −プライマー GCC CAG ACA TAG GTC ACA TGA TG
G T;ネオプライマー GTT TAT TGC AGC TTA TAA TGG TT
A CA）。４個が陽性であり、これらを、後にサザーンブ
ロッティング解析によって確認した。クローンを、non-
agoutiＣ５７ＢＬ／６マウスから得た３．５日齢の胚盤
胞に注入し、受容性のメスに播種した。得られたオスの
キメラマウスを、Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２の
non-agoutiメスと交配した。１５匹のキメラのうち、１
匹が生殖系列伝達を示した。β₂ ＋／−ヘテロ接合体を
交配し、子孫をＰＣＲ解析によって評価した（パネル
ｂ）。ｂ：ＰＣＲは、９４°／１分、６５°／２分及び
７２°／１分の３５サイクルであった。ｃ：前記²⁹のよ
うにサザーンブロッティングを実施した。標的構成に使
用した１．５kbのＰｓｔＩゲノム断片を無作為的なプラ
イミングによって標識した。ｄ：前記²⁹のように、モノ
クローナル抗体２７０¹¹を用いて、ウエスタンブロッテ
ィングを実施した。

【００５２】図９及び図１０は、in situ におけるハイ
ブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用
いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピ
ングを示す。図９は、ｎＡＣｈＲのβ₂ −、α₄ −及び
β₄ −サブユニットをコードするｃＤＮＡの配列に基づ
くアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを用いて、
β₂ ＋／＋、＋／−及び−／−マウスの脳から得た連続
切片におけるそれぞれのｍＲＮＡを検出したin situ に
おけるハイブリダイゼーションである。視床中間区分が
示されている。白の矢印は、β₄ −アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドによって標識されたＭＨｂを示す。図１０
は、野生型、ヘテロ接合体及びβ₂ −突然変異体のマウ
スの脳における高親和性結合部位を表わす、トリチウム
化ニコチンを用いた受容体オートラジオグラフィーであ
る。線条、視床及び蓋のレベルを表わす切片が示されて
いる。

【００５３】方法。in situ におけるハイブリダイゼー
ションを次のように実施した。In situ におけるハイブ
リダイゼーション手順。凍結した組織をクリオスタット
で切断し（厚さ１４μm の切片）、ポリ−１−リシン被
覆スライドに解凍しながらマウントし、−８０℃で１〜
３日間貯蔵した。この処置は、Young らの方法（１９８
６）にしたがって実施した。すばやく４％パラホルムア
ルデヒドを用いて、切片を室温で５分間固定化し、リン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したのち、エタノール及
びクロロホルム中でアセチル化し、脂質を除去した（５
分）。これらを、パラフィルムカバースリップの下、３
７℃で２〜４時間プレハイブリダイズした。プレハイブ
リダイゼーション及びハイブリダイゼーション混合物の
組成は、０．０２M トリスＨＣｌ（pH７．５）中、５０
％ホルムアミド、０．６M ＮａＣｌ、０．１M ジチオト
レイトール、１０％デキストラン硫酸エステル、１mMエ
チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１ＸDenhardt
溶液（５０×＝１％ウシ血清アルブミン／１％フィコー
ル／１％ポリビニルピロリドン）、０．１mg/ml ポリＡ
（Boehringer）、０．５mg/ml 酵母ＲＮＡ（Sigma)、
０．０５mg/ml ニシン精液ＤＮＡ（Promega)であった。
プローブを、切片３０μl 当り２，０００〜３，０００
Bcq の濃度で加えた（切片当り約１５fmolに相当）。カ
バースリップを取り外し、まず室温で２×標準生理食塩
水クエン酸（ＳＳＣ）溶液（３M ＮａＣｌ／０．３M ク
エン酸ナトリウム）ですすぎ（５分間２回）後、切片
を、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド中４２℃で１５分
間４回洗浄し、次いで１×ＳＳＣ中、室温で３０分間２
回洗浄した。すべての洗浄溶液に１mMジチオトレイトー
ルを加えた。氷冷蒸留水ですすぎ、乾燥させたのち、１
０〜２０日間、Hyperfilm βmax （Amersham）に暴露
し、次いで１〜２か月間、写真乳剤（NTB2、Kodak)に暴
露した。

【００５４】組織調製物の解析。種々のｍＲＮＡの標識
パターンの解析を、フィルムオートラジオグラム及びエ
マルジョンオートラジオグラムの両者で実施した。トル
イジンブルーを用いて全胚の連続切片を対染色したの
ち、解剖学的構造の同定を実施した。脳における解剖学
的面積及び末梢神経系（ＰＮＳ）構造の認識の定義は、
The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（Paxinos
and Watson, 1986）、The Atlas of Developing Rat Br
ain （Paxinos et al., 1991）、The Atlas of Mouse D
evelopment（Kaufman, 1992)及びThe Atlas of the Pre
natal Mouse Brain(Schambra et al., 1992)を含む異な
るアトラスを基に実施した。脳神経節の発達に関して
は、Altman and Bayerの図版及び記載（１９８２）を参
照した。いくつかの中枢及び末梢構造（例えば、脳神経
運動核、自律運動節）の同定を確認するために、コリン
アセチルトランスフェラーゼのin situ をいくつかの切
片に対して実施した。

【００５５】２人の実験者の主観的評価に基づき、１＋
（低い強度）〜３＋（高い強度）のスコアを、解剖学的
構造の標識に割り当てた。２０×冷プローブで置換した
のちの、高い細胞充実性をもつ非神経性組織（肝及び筋
など）若しくは高い細胞外マトリックスの密度を持つ非
神経性組織（軟骨など）中の粒子の密度、又は神経構造
上の標識の密度を、バックグラウンド標識と考慮した。
細胞レベルでカウントする粒子が存在しないとき、慎重
にスコアを評価しなければならない。例えば、発現する
構造の標識強度の低下は、陰性細胞の増殖又はニューロ
ンプロセスの形成によって生じる構造中の陽性細胞の分
散によるものかもしれない。オリゴヌクレオチドは同じ
長さを有し、同じプロトコルにしたがって標識したが、
信号強度又は異なるトランスクリプトを比較することは
試みなかった。別段指定しない限り、図に示す標識は、
オリゴヌクレオチドNo．３１（α₃)、４７（α₄)、５１
（α₂)及び６２（α₄)を使用して得たものである（オリ
ゴヌクレオチド特性については表２及び表３を参照）。

【００５６】特異性のコントロール。ｍＲＮＡごとに、
配列の唯一部分（例えば、ｎＡＣｈＲサブユニットの場
合、Ｍ３とＭ４との間の想像上の細胞質ループ）にある
２〜４個のオリゴヌクレオチドを選択した。特異性の初
期評価は、Genbank ／ＥＭＢＬ中の他の既知の配列との
可能な相同性を探索することによって実施した。特異性
の組織学的試験には、以下を考慮した。１．ｍＲＮＡご
とに２個以上のオリゴヌクレオチドプローブが、同じパ
ターンを示す（図１）。２．成体ラットの中枢構造の標
識のパターンが、他の著者たちによって確認されたもの
（Wada et al.,1989; Dineley-Miller and Patrick, 19
92)と一致している。３．使用した大部分のオリゴヌク
レオチドが、同様なＧＣ含量をもつ４５量体である（表
２及び表３）とすると、各オリゴヌクレオチドプローブ
が他のプローブの特異性のコントロールを構成してい
る。４．混合物への２０倍過剰の冷プローブの添加によ
り、標識が完全に消滅した（図２）。

【００５７】使用したオリゴヌクレオチドプローブは、
規準２を満たすことができなかったα₃ ｍＲＮＡに対す
る４個のプローブを除き、すべてがこれらの規準を満た
すものであった。ｃＲＮＡプローブに基づく以前の研究
は、成体ラットにおけるこのサブユニットｍＲＮＡの比
較的広い分布を示し、顕著には、大脳皮質層IV、内鼻皮
質層II、前側及び腹側視床核、内側及び側方顔面神経膝
核、内側手綱、後側視床下部並びに乳頭土核、松果体、
Ｖ及びVII 神経の運動核、青斑、疑核及び最後野におい
て高いレベルを示した（Wada et al., 1989)。これらの
観察結果の相違に関し、成体ラット中、内側手綱、松果
体の中間部、最後野、Ｖ神経の運動核及び小脳において
のみ高レベルのα₃ ｍＲＮＡ信号を検出することがで
き、いくつか視床核及び青斑においてはレベルは低かっ
た。この矛盾の一部は、リボプローブに比べて低いオリ
ゴヌクレオチドプローブの感度の低さに帰すことができ
る。しかし、特にプローブの加水分解を組織学的手法
（Wada et al., 1989)で実施する場合に、ｃＲＮＡプロ
ーブの特異的コントロールを実施する難点を考慮する
と、以前にα₃ ｍＲＮＡに帰属していたいくらかの標識
が、から他の（ｎＡＣｈＲ関連）ＲＮＡ配列に実際に誘
導することが可能である。

【００５８】オリゴヌクレオチド：β₂ ：5'-TCG CAT G
TG GTC CGC AAT GAA GCG TAC GCC ATC CAC TGC TTC CCG
-3' ；α₄ ：5'-CCT TCT CAA CCT CTG ATG TCT TCA AG
T CAG GGA CCT CAA GGG GGG-3'; β4:5'-ACC AGG CTG A
CT TCA AGA CCG GGA CGC TTCATG AAG AGG AAG GTG-3'
。Ｂ：Clarke et al.による記載³⁰にしたがって、 ³
Ｈ−ニコチン結合を実施した。１４μm の冠状切片を、
５０mMトリス（pH７．４）／８mM ＣａＣｌ₂ ／４nM
³Ｈ−Ｌニコチン中、室温で３０分間インキュベートし
た。Ｌ−ニコチンビタルトレートの存在下において非特
異的結合を評価した。インキュベーションに続き、切片
を氷冷ＰＢＳで２分間ずつ２回すすぎ、氷冷水ですばや
くすすいだ。スライドをHyperfilm ³Ｈに６０日間暴露
した。

【００５９】図１１及び１２は、β₂ ＋／＋マウス及び
−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘
発電流のパッチクランプ記録である。図１１は、野生型
マウス及びβ₂ −／−マウスのＭＨｂ及び前側視床にお
ける細胞からの記録を表わす。アゴニストのオフレート
は、ＭＨｂにおけるほうが前側視床におけるよりも有意
に大きく、その結果、二つの構造の間で異なる応答速度
をもたらしている。ＭＨｂのニコチンアゴニストは、β
₂ −／−動物中には維持されたが、β₂ −／−マウスに
おいては、前側視床のニコチンアゴニストに対する応答
は完全に廃されている。図１２は、β₂ ＋／＋マウス及
び−／−マウスの種々の核におけるニコチンアゴニスト
に対する応答を示す。

【００６０】方法。氷冷ＡＣＳＦ媒体（１２５mM Ｎａ
Ｃｌ／２６mM ＮａＨＣＯ₃ ／２５mM グルコース／
１．２５mM ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ／２．５mM ＫＣｌ／２mM
ＣａＣｌ₂ ／１mM ＭｇＣｌ₂ 、pH７．３）中、Dosa
kaスライサーを使用して、８〜１２日齢のマウスの視床
から冠状のスライスを得た。スライスをこの同じ媒体中
に１〜８時間維持した。Zeiss 顕微鏡を通してスライス
中の細胞を視覚化した。１５０mM ＣｓＣｌ／１０mM
ＥＧＴＡ／１０mM ＨＥＰＥＳ／４mM 二ナトリウムＡ
ＴＰ／４mM ＭｇＣｌ₂ をＫＯＨでpH７．３に調節した
ものを含む２〜４MOhm硬質ガラスピペットを用いて全細
胞記録を得た。スライスの上方に配した直径５０μM の
ピペットを介して、重力により、１５０mM ＮａＣｌ／
１０mM ＨＥＰＥＳ／２．５mM ＫＣｌ／２mM ＣａＣ
ｌ₂ ／１mM ＭｇＣｌ₂ を含む溶液を５〜１０秒のパル
スで細胞に適用した。記録は、ＣＮＱＸ（５μM)及びＧ
ＡＢＡアンタゴニストＳＲ−９５５３１（１０μM)の存
在下において実施した。電流は、Axopatch ID （Axon I
nstrument)パッチ増幅器によって記録し、Compaqパーソ
ナルコンンピューターでデジタル化し、PClampプログラ
ム（Axon Instrument)によって更に解析した。

【００６１】図１３及び１４は、受動忌避試験における
β₂ −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示
す。図１３は、訓練後に賦形剤又はニコチン（１０μ/k
g)のいずれかを注射したのちの、保持試験における種々
のレベルの足への衝撃に対する応答を示す。訓練試行中
の平均ステップスルー潜時は、突然変異マウスの場合に
は１７．０±３．６秒であり、それらの非突然変異同胞
種の場合には１５．０±３．５秒であった。図１４は、
賦形剤又はニコチン（１０μg/kg）のいずれかを注射さ
れた野生型マウスとホモ接合体β₂ 突然変異マウスとの
間の、２．００mAmpの強度の電流衝撃を足に印加した場
合の保持潜時の差を示す棒グラフである。データは、以
下の分類、すなわち、野生型＋賦形剤（ｎ＝２７）；野
生型＋ニコチン（ｎ＝２３）；β₂ −突然変異マウス＋
賦形剤（ｎ＝１７）；β₂ −突然変異マウス＋ニコチン
（ｎ＝１７）の平均＋／−ＳＥＭとして表わす。統計的
解析は、相違の混合因数解析を使用し、続いて単純効果
の事後試験を行うことによって実施した。＃、ｐ＜０．
０５、賦形剤注射後の野生型対突然変異マウス；＊、ｐ
＜０．０１、野生型マウスにおけるニコチン対賦形剤。

【００６２】方法。本文に記載のように、Nordberg及び
Bergh の方法²⁰並びにFaiman et al. の方法²⁰にしたが
って、受動忌避試験を実施した。ニコチンを（ビタルト
レート、Sigma)０新たにＰＢＳに溶解した。訓練試行
中、同量の賦形剤又はニコチンのいずれかを腹腔内注射
したのち、ただちに足に電気衝撃を印加した。

【００６３】図１５は、β₂ −サブユニット遺伝子及び
プロモーターの全部又は一部を含むファージ及びプラス
ミドの図である。プラスミドの名称においては、数字が
断片の大きさを表わし、文字が、それを生成するのに使
用した制限部位を表わす。

【実施例】

【００６４】以下の記載及び実施例は、本発明の実施態
様及び範囲を例示するものである。本発明は、この記載
の範囲に限定されるものではない。更にこの記載及び本
明細書の付随する各節及び参考として包含されている資
料は、クレームの全ての実施を可能にするものである。

【００６５】以下の例及び実施態様は、当然のことなが
ら、当該業界において公知の技術によって修正すること
ができる。記載又は請求されている核酸配列の変動は、
本発明者らが示した効果又は利点を変えることなく、公
知の方法によって生み出すことができる。したがって、
かかる変動は、当記載及び本発明の範囲に含まれる。

【００６６】材料と方法ゲノムクローンの分離全ラットｃＤＮＡ（カリフォルニア州サンディエゴのTh
e Salk InstituteのJ.Boulter博士及びS. Heinemann博
士から提供された）を含むＰＣＸ４９プラスミド（Dene
ris et al., 1988）を、ＥｃｏＲＩで切断し、２．２kb
までの（〜２．２kb）断片を単離し、マウスＤＢＡ２ゲ
ノムＤＮＡのＥＭＢＬ３バクテリオファージライブラリ
をスクリーニングするためのプローブとしてこれを使用
した。最初のエキソンから１５kbまで（〜１５kb）上流
のＤＮＡ及び５kbまで（〜５kb）下流のＤＮＡに広がる
１つの独特のクローンを得た。図１は、イニシエーター
ＡＴＧから１．２kb上流のヌクレオチド配列を示す。

【００６７】ハイブリダイゼーションの条件は、このプ
ローブのための緊縮条件を決定するために、公知の技術
²⁹により修正することができる。β₂ −サブユニット配
列に対するハイブリダイゼーションを可能にする充分に
緊縮な条件を開発するために、温度（約４５℃〜約６５
℃）及びＳＳＣ緩衝液濃度（約０．１×ＳＳＣ〜約６×
ＳＳＣ）などのハイブリダイゼーション条件の変更、並
びに洗浄条件の温度及びそのための緩衝液の変更を行う
ことが可能である。したがって、このハイブリダイゼー
ション手順に基づき、その他のライブラリから、その他
の関連する配列を単離することができる。４５℃及び６
×ＳＳＣなどのハイブリダイゼーション条件を使用する
ことによって、ヒト配列が分離されよう。

【００６８】１９９４年１２月１３日に、パスツール研
究所国立微生物培養収集所（ＣＮＣＭ）（25, Rue du D
octeur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15,フランス）におい
て、３件の寄託が行われた。ファージ、λβ₂ ｎＡＣｈ
Ｒは、受入れ番号Ｉ−１５０３として寄託されている。
このファージは、マウスのニューロンｎＡＣｈＲのβ₂
−サブユニットのエキソン全てをコードする配列及びプ
ロモーター配列を含む１５〜２０kbのゲノムＤＮＡを含
んでいる。プラスミドを有する２つのE. coli培養物も
同様に寄託された。E. coli ＤＨ５α内のプラスミドｐ
ＳＡ９は、受託番号Ｉ−１５０１が付与されており、β
₂ −サブユニットのエキソン１、２及び３についてコー
ドする領域及び調節配列を含むマウスゲノムＤＮＡ９kb
を含む。E. coli ＤＨ５α内のプラスミドｐＥＡ５は、
受託番号Ｉ−１５０２が付与されており、Ｅｃｏ４７−
III 部位の約１．２kb上流の領域及びβ₂ −サブユニッ
トのエキソン１〜５をコードする領域を含むマウスゲノ
ムＤＮＡ５kbを含む。本発明者らは、ＥＭＢＬ、GenBan
k 及びＤＤＢＪヌクレオチド配列データベースに、受託
番号Ｘ８２６５５として、ここに報告するヌクレオチド
配列データを寄託するつもりである。

【００６９】転写開始部位のマッピングｍＲＮＡのマッピングのために、我々は、Ｅ１３期又は
Ｅ１５期のＤＢＡ２胚から抽出した全ＲＮＡの異なるバ
ッチを使用した。ＤＮＡ汚染を避けるため、ＲＮＡ試料
をまずＤＮアーゼＩで消化させた。ＲＮアーゼ保護。Bl
uescript SK (Stratagene)中に、イントロン１の一部を
含むＸｂａＩ／ＰｓｔＩ断片を挿入した。その後プラス
ミドを、Ｂｇ１IIで線形化させ、Ｔ７プロモーターを用
いてＲＮＡプローブを合成した。その後、Ausbel et a
l. (1994)に記載されているように、保護実験を行っ
た。

【００７０】ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Frohman et al., 198
8) ｍＲＮＡを、８０℃で５分間、プライマー１０pmolを用
いて、ハイブリダイズした。供給業者が推奨する緩衝液
中、３７℃で４５分間、ＭＭＬＶ４００ｕ（Gibco)を用
いてｃＤＮＡの合成を行った。フェノール／クロロホル
ム抽出の後、ｃＤＮＡをエタノール沈降させた。３７℃
で３０分間、０．２M のカコジル酸カリウム；２５mMの
トリス−ＨＣｌpH６．６；２５mg/ml のＢＳＡ；１．５
mMのＣｏＣｌ₂ ；５０nMのｄＡＴＰ及び５０ｕのターミ
ナルトランスフェラーゼ（Boehringer）中、ターミナル
トランスフェラーゼ反応を行った。フェノール／クロロ
ホルム抽出及びエタノール沈降の後、Promega のＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ターミナルトランスフェ
ラーゼ反応の１０分の１を増幅させた（９４℃；５５
℃；７２℃で１分、３０サイクル）。増幅させた断片を
次にアガロースゲル上に配置した。ゲルをブロッティン
グし、オリゴヌクレオチドｐ² にハイブリダイズした。
我々は、脳からのｍＲＮＡをマッピングするため、ｃＤ
ＮＡ合成用のプライマとしてｐＥｘ２を、そしてＰＣＲ
のためにｐ０／ＢＥｐＴを用いた。トランスフェクショ
ンを行った細胞からｍＲＮＡをマッピングするには、Ｏ
ＬＵＣＩ３（ｃＤＮＡの合成）及びＯＬＵＣ１２／ＢＥ
ｐＴ（ＰＣＲ）を用いた。

【００７１】ＳＬＩＣ（Dumas Milnes Edwards et al.,
1991) ４２℃で４５分間、５０mMのトリス−ＨＣｌpH８．３；
８mMのＫＣｌ；１．６mMのＭｇＣｌ₂ ；５mMのスペルミ
ジン；０．５mMのｄＮＴＰ；１u/μl のＲＮａｓｉｎ；
０．１mg/ml のＢＳＡ；７０mMのβ−メルカプトエタノ
ール；８０ｕのＡＭＶ逆転写酵素（Promega)中、プライ
マーとしてｐＥｘ３（６pmol) を用いて、５μg の全Ｒ
ＮＡから、まずｃＤＮＡを合成した。その後、ＮａＯＨ
中でＲＮＡを分解させた。次にｃＤＮＡの第１のストラ
ンドを、オリゴヌクレオチドＡ５’と連結させた。得ら
れた一本鎖ｃＤＮＡを、次に、オリゴヌクレオチドＡ
５’−１／ｐ０及びＡ５’−２／ｐ１での２回のＰＣＲ
増幅に付した（９４℃で１分；６０℃で３０秒；７２℃
で４５秒で３５サイクル）。

【００７２】オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりで
あった。Ａ５’：5'-CTGCATCTATCTAATGCTCCTCTCGCTACCTGCTCACTC
TGCGTGACATC Ａ５’−１：5'-GATGTCACGCAGAGTGAGCAGGTAG Ａ５’−２：5'-AGAGTGAGCAGGTAGCGAGAGGAG ｐ０：5'-CCAAAGCTGAACAGCAGCGCCATAG ｐ１：5'-AGCAGCGCCATAGAGTTGGAGCACC ｐ２：5'-AGGCGGCTGCGCGGCTTCAGCACCACGGAC ｐＥｘ２：5'-GCCGCTCCTCTGTGTCAGTACCCAAAACCC ｐＥｘ３：5'-ACATTGGTGGTCATGATCTG ＢＥｐＴ：5-GCGGGATCCGAATTC(T)₂₁ A/C/G ＯＬＵＣＩ３：5'-CGAAGTATTCCGCGTACGTGATG ＯＬＵＣＩ２：5'-ACCAGGGCGTATCTCTTCATAGC

【００７３】プラスミドの構築ＫＳ−Ｌｕｓｉ：Bluescript ＫＳの対応する部位にお
いて、ｐＳＶＯＡＬプラスミドのＨｉｎｄIII ／Ｋｐｎ
Ｉ制限断片（de Wet et al., 1987)をサブクローニング
した。その後、ルシフェラーゼ遺伝子の最も５’のＥｃ
ｏＲＩ／ＢｓｍＩ（４５bp）断片を（de Wet et al., 1
987)にしたがって、欠失させ、ＳａｌＩ部位で置換し
た。ひき続き、ポリアデニル化部位を含むＳＶ４０の３
４２bpのＰｖｕII／ＨｉｎｄIII 制限断片を、アダプタ
を用いて、ＥａｇＩ部位にサブクローニングした。

【００７４】ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ：λβ₂ ファージの
１．２kbp のＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７II断片を、アダプ
タを用いて、ＫＳ−ＬｕｃｉのＥａｇＩ／ＳａII部位に
挿入した。「分子生物学における現行のプロトコル」
（Ausubil et al., 1994）におけるように、Ｂａｌ３．
１エキソヌクレアーゼを用いて、プロモーターの５’末
端欠失を得た。

【００７５】Sculptorキット（Amersham）を用いて、突
然変異を導入した。ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列中、突然変異
を受けた配列は、この突然変異がＮＲＳＥ要素の活性を
低下させることが示されたため（Morl et al., 1992)、
ACCACGGACAではなく、＋２４ACCACTTACAであった。Ｅ−
ボックス配列中では、突然変異を受けた配列はTCCACTTG
ではなく、−１２０TCCTCAGGであった。図７は、核タン
パク質が、野生型配列に結合することができるが、突然
変異を受けた配列には結合できないことを示している。

【００７６】細胞のトランスフェクション１％のグルタミン及び１％のストレプトマイシンを補給
したＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、神経芽細胞種Ｎ１Ｅ１
１５、ヒトＳＫ−Ｎ−Ｂｅ、ＨｅＬａ及び３Ｔ６線維芽
細胞、２９３ヒト腎細胞及びＳＶＬＴ線条体細胞（Evra
rd et al., 1990)を成長させた。１％のグルタミン及び
１％のストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ＋１０％
のＨＳ＋５％のＦＣＳ中、ＰＣ１２細胞を成長させた。

【００７７】６０mm² プレート当り１０⁵ 〜４×１０⁵
個の細胞の割合で、細胞を播種した。翌日、１５０mMの
ＮａＣｌ中、２．５μl のTransfectam(ＩＢＦ／Seprac
or）と混合した１μg のＤＮＡを用いて、７５０μl の
ＤＭＥＭ＋２％ペニシリン／ストレプトマイシン中、５
〜１２時間、細胞をトランスフェクションした。４８時
間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Qiagen又はWiza
rd prep(Promega)キットを用いて、ＤＮＡを調製した。
プラスミド活性を比較する際には、全てのプラスミドを
同じ日に調製した。各々のプラスミドについて少なくと
も２つの異なるＤＮＡ調製物を試験した。全てのトラン
スフェクションを、二重に実施し、少なくとも３回繰り
返した。

【００７８】トランスジェニックマウスの産生ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ由来のルシフェラーゼ遺伝子を切
除し、ｎｌｓＬａｃＺ遺伝子で置換した（Kalderon et
al., 1984)。ＴＡＥアガロースゲルからβ₂ −プロモー
ター／ｎｌｓＬａｃＺ断片を電気溶出し、次にエタノー
ル沈降によって更に精製し、最後にトリス−ＨＣｌ１０
mM pH７．５；ＥＤＴＡ０．１mM中で再懸濁させた。Ｄ
ＮＡ溶液（３ng/ml)を、Ｃ５７ＢＬ６×ＳＪＬハイブリ
ッドの受精卵母細胞内に注入した。組織の染色を、Merc
er et al., 1991 に記載されているとおりに行った。図
８の方法も参照のこと。

【００７９】ゲルシフト検定「分子生物学における現行のプロトコル」におけるよう
に、α〔³²Ｐ〕ＣＴＰ及びKlenow酵素又はγ〔³²Ｐ〕Ａ
ＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのいずれかを用
いて、オリゴヌクレオチドを標識した。核抽出物を、記
載のとおり（Bessis et al., 1993)、１０⁷ （〜１０
⁷ ）個までの細胞から調製した。結合のためには、１nm
olの標識されたオリゴヌクレオチドを、２０μl 中１０
mMのＨｅｐｅｓ pH８、１０％のグリセロール、０．１
mMのＥＤＴＡ、０．１M のＮａＣｌ、２mMのＤＴＴ、
０．１mg/ml のＢＳＡ、４mMのＭｇＣｌ₂ 、４mMのスペ
ルミジン、１mMのＰＭＳＦ、１μg のｐｏｌｙｄＩｄＣ
中、０．５μg のタンパク質抽出物と混合した。氷上で
１０分間反応物をインキュベートした。その後、ＤＮＡ
−タンパク質複合体を、７％ポリアクリルアミドゲル上
で分析した。

【００８０】本実験に用いたオリゴヌクレオチドは、以
下の配列を伴う二本鎖のものであった（下線のあるヌク
レオチドは、突然変異を受けたオリゴヌクレオチドと野
生型オリゴヌクレオチドの間で変更されたものであ
る）。Ｅ−Ｄ：5'-TCCTCCCCTAGTAGTTCCACTTGTGTTCCCTAG Ｍｕｔ−Ｅ：5'-CCTCCCCTAGTAGTTCCTCAGGTGTTCCCTAGA Ｓ−Ｅ：5'-CTAGCTCCGGGGCGGAGACTCCTCCCCTAGTAGTTCCAC
TTGTGTTCCCTAG

【００８１】結果 β₂ −サブユニットをコードする遺伝子の５’フランキ
ング配列の特徴づけβ₂ −サブユニットをコードする遺
伝子を含むλファージをクローニングし、イニシエータ
ーＡＴＧを取り囲む領域を配列決定した（図１）。転写
開始部位を、まず最初にＲＮアーゼ保護によりマッピン
グした（図２のａ）。この方法により我々は、少なくと
も３つの開始部位を検出することができた。しかしなが
ら、これらの実験では、わずかな付加的開始部位は検出
されなかった可能性がある。主要な保護バンドのサイズ
は、約１５０ヌクレオチドと見積られた。開始部位をよ
り精確に確認し、位置設定するため、我々は、プライマ
ー伸長生成物の増幅（図２のｂ）から成るＲＡＣＥ−Ｐ
ＣＲ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅；Prohman et al., 198
8) 及びＳＬＩＣ（ｃＤＮＡの一本鎖連結；Dumas Milne
s Edwards et al., 1991)の両方を実施した。両方の技
術により、我々が図１に記載した４つの開始部位に対応
する同じ断片をサブクローニングし、配列決定すること
が可能であった。−１３の開始部位はきわめて稀であ
り、ＲＮアーゼマッピングにより検出されなかったので
あろう。

【００８２】フランキング領域（図１）の配列の分析に
より、いくつかのコンセンサスＤＮＡ結合要素が明らか
になった：すなわち、Ｓｐ１部位（−１４６）、ｃＡＭ
Ｐ応答性要素結合（ＣＲＥＢ）部位（−２８７；Sasson
e-Corsi, 1998)、核受容体応答要素（−３４４〜−３５
６：Parker, 1993）、ＧＡＴＡ−３部位（−１０７３；
Ko and Engel, 1993) 、及び弱縮重オクタマー（八量
体）モチーフ（−５２２）。更に、２回回転軸対称要素
内に含まれているＥ−ボックス（−１１８）を認識する
ことができた。近位領域（−２４５〜＋８２）は同様
に、ある程度の調節上の意義をもちうる異常に高いＧＣ
含有量（６７％）及び多数のジヌクレオチドＣｐＧを有
している(Antequera and Bird, 1993)。最終的に、ＮＲ
ＳＥ（神経制限性サイレンサー要素；Mori et al., 199
2)又はＲＥ１（制限要素；Kraner etal,, 1992)配列と
同一の２０bpの配列が、１．２kbp 断片の３’末端に発
見された（＋１８〜＋３８）。

【００８３】β₂ −サブユニット遺伝子のフランキング
配列の１．２kbp の断片がin vitroでのニューロン特異
的発現を促進する。ルシフェラーゼ遺伝子に融合された
β₂ −サブユニット５’フランキング領域の１１６３bp
のＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７III 断片（−１１２５〜＋３
８）を含む構築物を生成した(de Wet et al., 1987)
（プラスミドＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ）。読み過しを避け
るため、β₂ −サブユニット配列から上流に、ＳＶ４０
のポリアデニル化部位を挿入した。次に、褐色細胞腫
（ＰＣ１２）細胞、神経芽腫セルラインＮＩＥ１１５及
びＳＫ−Ｎ−Ｂｅ、ＳＶＬＴ、線条体セルライン(Evrar
det al., 1990) 、ＮＩＨ３Ｔ６又はＨｅＬａ線維芽細
胞及びヒト腎セルライン２９３の中への一時的トランス
フェクションにより、プラスミドＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ
の転写活性を試験した。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、我々
は、神経芽腫及びＰＣ１２細胞は、正常に、β₂ −サブ
ユニットｍＲＮＡを発現するが、線条体ＳＶＬＴセルラ
イン又は３Ｔ６線維芽細胞はこれを発現しないことを確
認した。図３は、ＰＣ１２細胞及び神経芽腫において、
１．２kbp の断片が、その他のセルラインにおけるより
もレポーター遺伝子の転写を媒介する上で、２０〜１８
０倍の活性を示すことを示している。線維芽細胞、２９
３細胞及びＳＶＬＴ細胞においては、１．２kbp 断片の
転写活性は、プロモーター無しのベクターのそれと比べ
て、著しく高いものではない（図３）。したがって、β
₂ −サブユニットプロモーターは、これらのセルライン
では活性ではない。これらのin vitroにおけるトランス
フェクション実験は、１１６３bp断片が、内因性β₂ −
サブユニット遺伝子の発現パターンを模擬し、かくして
細胞特異的プロモーターを含むことを証明している。

【００８４】トランスジェニックマウスにおける１１６
３bpプロモーター In vivo で１１６３bpプロモーターを試験するために、
ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７III 断片を、ｎｌｓ−β−ガラ
クトシダーゼリポーター遺伝子(Kalderon et al., 198
4) から上流に連鎖させた。ＳＶ４０からのポリアデニ
ル化シグナルを、コーディング配列の下流に連結した。
その後、得られた４．７kbの断片を、Ｆ１ハイブリッド
マウス（Ｃ５７Ｂ１６×ＳＪＬ）からの受精卵の雄前核
内にマイクロインジェクションした。子孫の尾から抽出
したＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
り、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の有無について分析し
た。３つの独立したファウンダー（founder)を得、発現
についてこれを分析した。

【００８５】２つのライン（１３及び１６）が、ニュー
ロン内で発現を有し、３番目のラインは、全く発現しな
かった。これは、１１６３bpのプロモーターが、in viv
o でのニューロン特異的発現を駆動するのに充分な調節
要素を含んでいることを示している。末梢神経系ＰＮＳ
では、両方のラインとも同じ構造にて発現した。これと
は対照的に、ＣＮＳでは、ライン２６の標識パターン
は、ライン１３のそれのサブセットである。ここではラ
イン１３だけを詳細に記述する。予想されたとおり、大
部分の末梢β₂ −発現神経節が、β−ガラクトシダーゼ
（β−ｇａｌ）を発現し、一方ＣＮＳでは、β₂ −陽性
領域のサブセットのみが、β−ｇａｌを発現した。例え
ば、図４のｃは、腰仙脊髄のニューロンの大部分が、β
₂ −サブユニットのトランスクリプトを発現し、一方、
前角及び背角内のニューロンのサブユニットのみが、β
−ｇａｌ活性を呈することを示している。

【００８６】導入遺伝子の発現は、Ｅ１０．５及びＥ１
１胚の末梢神経節に検出することができた。Ｅ１３全胚
（図４のａ）及び更に加齢した脳（Ｅ１７、ＰＯ及び成
人期）の中で、標識を検査した。Ｅ１３において、標識
は、ＰＮＳ内で顕著であった：すなわち、背根神経節
（ＤＲＧ、図４及び５のｃ、ｄ；脳神経と関連したいく
つかの神経節（三叉神経節、図５のａ参照、膝神経節、
舌咽神経節及び迷走神経節）；交感神経鎖の神経節（図
５のｃ、ｄ）；網膜の神経節細胞（図５のａ）及び心壁
中の推定上の副交感神経節（図５のｂ）で、標識が強力
に観察された。Ｅ１３では、脳幹及び前脳の両者におい
て、いくつかの脳脊髄幹レベルでも、陽性細胞クラスタ
ーが存在していた。染色したニューロンのクラスター
は、腹面及び側面脊髄にも観察された。

【００８７】発達の更に後期（Ｅ１７）において、陽性
ニューロンが、いくつかの基底終脳核中にクラスター化
して発見されたが、一方尾状−果核の中では、分散した
細胞が染色された。間脳レベルでは、不確帯及び網様視
床核、並びに多数の視床下部核に、陽性クラスターが存
在していた。脳幹内では、脳神経の大部分の運動核（迷
走神経の背面運動核を除く）が、ある程度から高いもの
に至るまでの標識を示した。更に、Ｖ中脳核の分散した
細胞は、橋核、前置舌下神経核及びいくつかの橋中脳被
蓋内の分散した細胞と同様、高度に染色されたと思われ
た。

【００８８】ライン１３内のＰＯでは、陽性細胞の分布
は、既に、それ以前の年令におけるよりも更に制限され
ているように思われた（例えば、基底終脳及び動眼神経
核内の標識は、明らかに減少していた）。成体動物のＣ
ＮＳ内では、標識された細胞は、視床下部内でのみ検出
された。ライン１３では、細胞のいくつかのクラスター
が、胃腸管（胃及び十二指腸）の粘膜及び膵で染色され
た。ライン１３の性器結節及びいくつかの表在筋に、異
所性標識が検出されたが、これらの組織のいずれも、ラ
イン２６では染色されなかった。

【００８９】最小細胞特異的プロモーターの認識プロモーター活性に関与する調節要素をより詳しく調査
するため、我々は、１１６３bpプロモーターの５’欠失
を含む一連のプロモーターを生成した。これらのプラス
ミドは、線維芽細胞及びＳＫ−Ｎ−Ｂｅ細胞内への一時
的トランスフェクションによって試験した。これら２つ
のセルラインは、最も容易にトランスフェクションされ
たセルラインであったために選ばれたものである。更
に、神経芽腫のラインは、最初末梢構造から分離され(B
iedler et al., 1978)、１１６３ｂｐプロモーターによ
って支持された調節要素を研究するための便利な手段と
なっている。

【００９０】１５７ｂｐが、１１６３bpプロモーター
（図１に示されているプラスミド１００６Ｅ−Ｌｕｃ
ｉ）の５’末端から欠失された時点では、神経芽腫では
ルシフェラーゼ活性は、著しく変化しなかったが、線維
芽細胞では増大した（図６）。３０１bpを更に欠失させ
た場合、残りのプロモーターの活性は、線維芽細胞内で
増大し続けたが、神経芽腫内では増大し続けなかった
（プラスミド８６２Ｅ−Ｌｕｃｉ、図６を参照）。した
がって、１５７及び３０１bpの欠失したプラスミドは、
線維芽細胞内でのみ活性であるリプレッサー要素を有す
る。しかしながら、トランケートされた８６２bpプロモ
ーターは、なおもニューロン特異的活性を呈し（図６、
両方のセルライン中の８６２Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を比較
のこと）、このことは、１．２kbp プロモーターが、付
加的な調節要素を有していることを示している。更に、
−８２４と−２４５の間には、リプレッサーが存在し得
た（神経芽腫内の８６２Ｅ及び２８３Ｅ−Ｌｕｃｉの活
性を比較のこと）。この推定上の調節要素を更には分析
しなかった。実際、２８３bpプロモーター（プラスミド
２８３Ｅ−Ｌｕｃｉ）は、なおも線維芽細胞よりも神経
芽腫で、〜１６０倍もの活性を示し、プロモーターのこ
の近位部分内にもう１つのニューロン特異的調節要素が
存在することが確認されている。

【００９１】近位の２８３bpプロモーターの５’末端か
ら１５０bpを欠失させた場合、線維芽細胞と神経芽腫の
両者において、転写活性が非常に低下しているのが検出
された（プラスミド１３３Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を参照の
こと）。このことは、すなわち、非常に重要な正の調節
要素が欠失したことを示している。これらの正の及び負
の要素については、更に、プロモーターの近位部分の欠
失及び突然変異研究によって調査した。

【００９２】近位領域内の負及び正の調節要素 β₂ −サブユニットプロモーターの３’末端は、推定上
のタンパク質要素結合部位を含む。β₂ −サブユニット
遺伝子調節におけるこれらの要素の役割を分析するた
め、我々は、これらの結合部位に突然変異を含むプラス
ミドを生成した。欠失実験を用いて、−９５と−２４５
の間に、活性化物質を検出した（図３参照、２８３Ｅと
１３３Ｅ−Ｌｕｃｉの間の差）。ｎｔ−１１８に位置す
るＥ−ボックスが優れた候補であったことから、我々
は、転写活性に対するこの要素におけける突然変異の効
果を分析した。表３は、野生型プロモーターのそれと比
べた場合の突然変異を受けたプロモーターの転写活性が
４０％低下していることを示している。非ニューロン組
織中のＥ−ボックスの役割は、転写の基底レベルが、線
維芽細胞中で、既に低いものであったために、更に評価
が困難であった。

【００９３】プロモーターの調節におけるＥ−ボックス
の役割を更に理解するため、我々はこの配列と相互作用
することのできるタンパク質複合体について調査した。
プローブとして３３bp配列（ｎｔ−１３５〜−１０３、
オリゴヌクレオチドＥ−Ｄ）を用いて、ゲルシフト測定
を行った。神経芽腫又は線維芽細胞からの核抽出物を³²
−Ｐ標識オリゴヌクレオチドと混合したところ、３つの
複合体が観察された（図７）。これは全て、過剰の標識
オリゴヌクレオチドＥ−Ｄにより、完全に置換されてい
た。これとは対照的に、Ｅ−ボックス／２回回転軸内で
競合的オリゴヌクレオチドを突然変異させたところ、い
かなる競合も見られなかった（オリゴヌクレオチドＭｕ
ｔ．Ｅ、図７のレーン「Ｍｕｔ．Ｅ」を参照のこと）。
このことは、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、核タンパク
質を結合することのできる−１３５／１０３配列内に含
まれる唯一の要素であることを示している。この配列
は、β−サブユニットプロモーターの活性に関与すると
考えられる。

【００９４】近位領域内には、ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列も
存在しており、線維芽細胞内ではサイレンサーとして作
用するが、ＰＣ１２細胞又は神経芽腫内では作用しない
ことが示されている(Kraner et al., 1992; Li et al.,
1993; Mori et al., 1992)。１１６９bpプロモーター
の存在下でのこの配列の点突然変異により、線維芽細胞
内では転写活性が１０５倍に上昇したが、神経芽腫内で
はわずか３倍に上昇したにすぎなかった（表３）。した
がって、この配列は、β₂ −サブユニット遺伝子の細胞
特異的発現の少なくとも一部分を司る。

【００９５】トランスジェニックマウスにおける高親和
性ニコチン受容体の除去により、忌避学習の変化が生じ
るｎＡＣｈＲのβ₂ −サブユニットを、胚の（ＥＳ）細
胞の中で分断し、このサブユニットが欠如しているマウ
スをひきつづき発生させた（図８）。β₂ −／−マウス
は生存可能で正常に交尾し、明らかな肉体的欠損を示さ
なかった。脳の全体的サイズ及び組織は正常であった
（例えば、図９及び図１０を参照のこと）。抗−β₂ モ
ノクローナル２７０¹¹（図８ｄ）を用いた全脳ホモジネ
ートのウエスタンブロット分析及びポリクローナル抗−
β₂ 抗体⁹ を用いた脳全体を通しての免疫細胞化学反応
は、コントロールのマウスにおいて検出された免疫反応
性がβ₂ −／−マウスには見られず、β＋／−マウスで
は低下していたことを証明した。β₂ −アンチセンスオ
リゴヌクレオチドを用いたin situ のハイブリダイゼー
ションによって、β₂ −／−マウス内でβ₂ をコードす
るｍＲＮＡを検出することはできなかった。

【００９６】α₄ −及びβ₂ −サブユニットの分布は、
脳の中で大幅に重複し、これらのサブユニットは、組み
合わさってＣＮＳ¹²内で優性なｎＡＣｈＲイソ型タンパ
ク質を形成すると考えられる。卵母細胞発現実験⁶ に基
づくと、α₄ −サブユニットと機能的ヘテロ五量体を形
成することもできることがこれまでに確認されたのは、
β₄ −だけである。β₄ −サブユニットは、内側手綱
（ＭＨｂ）及び脚間核（ＩＰＮ)¹⁰ 内での発現を伴っ
て、β₂ ＋／−マウス又はβ₂ −／−マウスの脳の中で
正常に発現され、β₂ −サブユニットを置換するための
アップレギュレーションは脳のどこにも見られなかった
（図９）。又、突然変異マウスにおいて、α₄ −（図
９）、α₅ −又はβ₃ −サブユニットのｍＲＮＡの発現
が著しく変わることもなかった。

【００９７】平衡結合実験によると、ニコチンは、α₄
−及びβ₂ −サブユニット^13-15 の分布と一致する分布
をもつ高親和性部位（１０nM^13、14 に近いＫＤ）の集団
に結合することが示された。β₂ ＋／＋、＋／−及び−
／−マウスからの脳切片内の高親和性ｎＡＣｈＲを視覚
化するため、定量的受容体オートラジオグラフィを行っ
た（図１０）。

【００９８】In situ でのニコチン結合は、β₂ −／−
の動物においては完全に破壊され、β₂ ＋／−の動物で
は全ての脳部域内で約５０％低下し、この高親和性結合
を媒介する上でのβ₂ −サブユニットの関与を表わして
いる。

【００９９】トランスジェニックマウスの電気生理学きわめて高いレベルのβ₂ （及びα₄ ）サブユニットｍ
ＲＮＡ（図９）を発現する前部視床のニューロンを、ニ
コチンに対する電気生理学的応答について研究した。ス
ライス作成に容易に利用できるこの部域は、１μM のジ
ヒドロ−β−エリスロイジンによって遮断された１５５
＋／−７３pAの平均内部電流で、野生型動物において、
１０μM のニコチンに対し一貫して応答した。応答のア
ゴニスト順位は、in vitro⁶ でのα₄ ／β₂ −含有ニコ
チン性受容体について見られるものと匹敵するものであ
った（ニコチン＞ＤＭＰＰ＞シチジン）（図１１）。前
部視床ニューロンは、アゴニスト応答の完全な回復に
は、数分から１時間を必要とし、このことは、受容体応
答が脱感作に陥りやすいことを示唆している。その上、
再現可能な応答のためには、１μM という比較的高用量
が必要とされ、これは、ニコチンがその高親和性部位に
結合して活性化するのではないことを意味している。し
たがって、脱感作されたコンホーメーションにおいて
は、高親和性ニコチン結合部位は、ｎＡＣｈＲであろ
う。

【０１００】β₂ −／−マウスにおいては、ニコチンに
対する前部視床ニューロンの応答は、試験したニューロ
ンの１００％において完全に破壊された（図１２）。コ
ントロールとして、α₃ 及びβ₄ の両者ともが強く発現
されているＭＨｂ内のニューロンも同様に試験した。ニ
コチンは、野生型マウスにおいて５０５＋／−１３２ｐ
Ａの平均内側電流をひき起こし、この応答のアゴニスト
潜在性は、α₃ ／β₄含有受容体についての階級（ラン
ク）順に従っていた（シチシン＝ニコチン＞ＤＭＰＰ）
（図１１）。予想したとおり、ニコチンに対するＭＨｂ
内の細胞の応答は、突然変異マウスにおいて維持され
た。

【０１０１】β₂ サブユニットは、野生型動物^8-10の神
経節内で発現されるが、心拍数又は基底体温には明らか
な差異は全くなかった。高用量のニコチンに対して感受
性を有し、かつｎＡＣｈＲ¹⁶のβ₂ ／α₄ イソ型タンパ
ク質に対して選択的である薬物によって修正されない自
発的歩行活動は、β₂ −／−、β＋／１、及びβ＋／＋
マウスにおいて著しく異なっていなかった。

【０１０２】認識及び行動に関する結果２つの手順を用いて、突然変異体及び野生型マウスにお
いて、学習及び記憶を試験した。モリスの水迷路^17,18
は、空間的指向性学習を評価する。この試験での突然変
異体マウスの能力は、可視プラットフォームタスク又は
隠ぺいプラットフォームタスクで試験した場合に、野生
型マウスの能力と異なっていなかった（５日間の訓練後
に到達した最小水泳時間：突然変異体（ｎ＝８）：７．
４＋／−１．４秒：野生型（ｎ＝８）：８．２＋／−
２．０秒）。移行試験では、両者の動物群とも、同じプ
ラットフォーム横断数で、約３５％の時間をプラットフ
ォーム四分円内で過ごした（突然変異体：４＋／−０．
４；野生型：３．９＋／−０．６）。

【０１０３】同じくニコチン投与に対するその薬理的感
受性^19,20 のため選択された、受動的忌避試験を用い
て、阻害性忌避応答の保持を評価した。この試験は、マ
ウスをシャトルボックスの充分に照明されたチャンバ内
に入れるトレーニングトライアルからなり、隣接する暗
いチャンバ内に入るまでの時間を測定した。暗いチャン
バに入った時点で、穏やかな逃避不可能な衝撃を足に与
え、賦形剤又はニコチン（１０μg/kg）をマウスに注射
した。２４時間後に、暗いチャンバへ入るまでの時間を
測定することによって、保持を評価した。明るいチャン
バ内で過ごした時間（保持潜時）は、突然変異体及び野
生型マウスの両者において、加えられた足部衝撃に比例
して増大した。

【０１０４】しかしながら、ニコチンによる処置は、野
生型マウスにおいてのみ約８０秒だけ上向きに曲線を移
動させることによって、保持を一貫して促進した（ｐ＜
０．０１）（図１３）。ニコチン投与は、突然変異マウ
スでは全く効力が無かった。興味深いことに、保持潜時
は、突然変異体マウスについての方が、その非突然変異
体で賦形剤注入された同胞よりも有意に高いものであっ
た（ｐ＜０．０５）（図１４）。

【０１０５】痛覚閾値が低下したか又は情動性が増大し
た動物においては、受動的忌避試験での保持の増加が観
察できる。したがって、この実験に関与した全てのマウ
スについて、挙動試験を更に行った。突然変異体マウス
は、足部衝撃に対する尻込み、発声又は跳躍応答につい
て、その非突然変異体同胞との相異を示さなかった。１
５分間２コンパートメント式装置内での探査活動を測定
することによって、情動性を試験した^21,22 。暗いコン
パートメント内で過ごした平均時間；暗いコンパートメ
ント内での歩行活動及びコンパートメント間の移動は、
突然変異体と野生型マウスの間で異なっていなかった。
したがって、痛覚感受性の変化も情動性の変化も、受動
的忌避試験において見られた保持潜時の差異を説明する
ことができない。

【０１０６】低用量のニコチン²³又は特異的ニコチンア
ゴニスト¹⁶を用いた研究は、受動的忌避に対するニコチ
ンの効果を、脳内の高親和性ｎＡＣｈＲが媒介すること
を、示唆している。したがって、β₂ −／−マウスには
高親和性結合部位が欠如していることから、ニコチン
が、この試験についてのβ₂ −／−マウスの能力を変え
ることはできない。しかしながら、野生型マウスに比べ
ての突然変異マウスの能力の向上は、かなり驚くべきも
のである。β₂ −サブユニット突然変異の逆説的効果に
ついてはいくつかの説明を提案することができる。１つ
の仮説は、ニコチン注入が、脱感作ひいてはｎＡＣｈＲ
の不活化の結果として受動的忌避についての野生型マウ
スの能力を向上させ、試験に対する能力の向上が導かれ
る、というものである。

【０１０７】したがって、受容体の欠如したマウスの挙
動は、受容体が脱感作されたマウス²⁴の挙動を模擬して
いると考えられる。もう一つの可能性は、ｎＡＣｈＲが
少なくとも２つの経路に存在して、反応の効果と相互作
用して、受動的忌避において測定された行動を起こさせ
るというものである。一つの経路がもう一つの経路に比
べて、生理学的により活性であるならば、不活性経路
は、野生型動物におけるニコチン注入により優先的に刺
激され、一方より活性な経路は、β₂ −遺伝子の不活化
により優先的に影響されることになる。

【０１０８】上述の実験は、β₂ −サブユニットを含む
ｎＡＣｈＲが、特異的学習タスクという、受動的忌避に
対するニコチンの効果を媒介することを証明している。
これらのマウスは、ＣＮＳにおけるニコチンの薬理的効
果を研究するためのモデルシステムを提供しており、ニ
コチン系の欠乏が関与する認知プロセス、ニコチン嗜
癖、及び痴呆における高親和性ｎＡＣｈＲの役割を解明
する上で有用である。

【０１０９】参考文献以下の各参考文献は、参考のため、本明細書に、特に記
載する。

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【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、β₂ −サブユニット遺伝子のイニシエ
ーターＡＴＧをとり囲む領域のヌクレオチド配列を示
す。

【図２】図２は、β₂ −サブユニットｍＲＮＡの５’末
端のマッピングを示す。

【図３】図３は、in vitroでのβ₂ −サブユニットプロ
モーターの細胞特異的発現を示す。

【図４】図４は、トランスジェニックマウスにおけるβ
₂ −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現を示
す。

【図５】図５は、トランスジェニックマウスにおけるβ
−ガラクトシダーゼの発現を示す。

【図６】図６は、β−サブユニットプロモーターの５’
末端欠失を含むルシフェラーゼ融合遺伝子の発現を示
す。

【図７】図７は、ゲルシフト実験を示す。

【図８】図８は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ₂ −サブユ
ニットをコードする遺伝子の分断を示す。

【図９】図９は、in situ におけるハイブリダイゼーシ
ョン及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳
におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。

【図１０】図１０は、in situ におけるハイブリダイゼ
ーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウ
ス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示
す。

【図１１】図１１は、β₂ ＋／＋マウス及び−／−マウ
スのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパ
ッチクランプ記録を示す。

【図１２】図１２は、β₂ ＋／＋マウス及び−／−マウ
スのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパ
ッチクランプ記録を示す。

【図１３】図１３は、受動忌避試験におけるβ₂ −／−
マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。

【図１４】図１４は、受動忌避試験におけるβ₂ −／−
マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。

【図１５】図１５は、β₂ −サブユニット遺伝子及びプ
ロモーターの全部又は一部を含むファージ及びプラスミ
ドを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者アラン・ベシスフランス国、75013 パリ、リュ・ドュ・シャトー・デ・ランチエ 202 (54)【発明の名称】ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２−サブユニットの調節配列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製されたトランスジェニック動物

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】表１【表１】に示す配列及び緊縮条件下にＤＮＡにハイブリダイズす
る配列から実質的になる、ニューロンニコチン性アセチ
ルコリン受容体のβ₂ −サブユニットのプロモーターを
含む単離されたＤＮＡ。
【請求項２】タンパク質、ポリペプチド又はペプチド
をコードするヌクレオチド配列に作用的に連鎖した請求
項１記載のＤＮＡを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項３】タンパク質、ポリペプチド又はペプチド
が、レポーター遺伝子である請求項２記載の単離された
ＤＮＡ。
【請求項４】レポーター遺伝子が、ＬａｃＺ又はルシ
フェラーゼである請求項３記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項５】請求項１又は２のヌクレオチド配列並び
に緊縮条件下に核酸にハイブリダイズする配列に対して
相補的な単離された核酸。
【請求項６】請求項１の表１の約−２４５〜約−９５
の配列から実質的になる、プロモーターとして作用する
単離されたＤＮＡ。
【請求項７】配列が、請求項１の表１の約−２４５〜
約−８２４の配列である請求項６記載の単離されたＤＮ
Ａ。
【請求項８】配列が、請求項１の表１の約−１３５〜
約−１０３の配列である請求項６記載の単離されたＤＮ
Ａ。
【請求項９】配列が、請求項１の表１の約＋１６〜約
＋３６の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】配列が、請求項１の表１の約−１１２
５〜約−８２５の配列である請求項６記載の単離された
ＤＮＡ。
【請求項１１】請求項１記載のヌクレオチド配列を含
む組換えベクター。
【請求項１２】請求項２のヌクレオチド配列を含む組
換えベクター。
【請求項１３】請求項９又は１０記載のベクターを含
む形質転換有機体。
【請求項１４】腫瘍形成性、腫瘍発生性又は不死化性
の遺伝子に作用的に連鎖した請求項１のＤＮＡを含む配
列を有する単離されたＤＮＡ。
【請求項１５】すべての生殖細胞及び体細胞が請求項
２記載のＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動
物であって、ＤＮＡがその哺乳動物又はその哺乳動物の
祖先に胚段階で導入されている哺乳動物。
【請求項１６】請求項１５記載の哺乳動物から細胞を
単離する、哺乳動物細胞をin vitroにおいて培養する方
法。
【請求項１７】マウスである請求項１５記載の哺乳動
物。
【請求項１８】哺乳動物がマウスである請求項１６記
載の方法。
【請求項１９】ニューロンニコチン性アセチルコリン
受容体のβ₂ −サブユニットの少なくとも１個のエキソ
ンをコードする、クローニングされたゲノムＤＮＡ配
列。
【請求項２０】マウスニューロンニコチン性アセチル
コリン受容体のβ₂−サブユニットのためのゲノムＤＮ
Ａクローンを単離する方法であって、マウスゲノムＤＮ
Ａライブラリを用意し、適当な条件下に、別の哺乳動物
種から得たニューロンニコチン性アセチルコリン受容体
のβ₂ −サブユニットをコードするＤＮＡプローブをハ
イブリダイズすることを含む方法。
【請求項２１】プラスミドｐＳＡ９。
【請求項２２】プラスミドｐＥＡ５。
【請求項２３】ファージλβ２ｎＡＣｈＲ。
【請求項２４】請求項１又は１９記載の配列から実質
的になる核酸プローブ。
【請求項２５】請求項１又は１９記載のＤＮＡ及びタ
ンパク質を含む巨大分子複合体。
【請求項２６】転写的に活性なタンパク質を測定又は
同定する方法であって、請求項１又は１９記載のＤＮＡ
を、核抽出物とともに、適当な条件下にインキュベート
する方法。
【請求項２７】ＤＮＡが、オリゴヌクレオチドＥ−
Ｄ、Ｍｕｔ−Ｅ又はＳ−Ｅの配列である請求項２６記載
の方法。
【請求項２８】非ヒト組織からニューロンを単離する
方法であって、コードされたタンパク質がレポーター遺
伝子であるところの請求項１５記載のトランスジェニッ
ク哺乳動物を用意し、そのレポーター遺伝子を発現する
ニューロンを同定し、レポーター遺伝子を発現するニュ
ーロンを他の細胞から分離することを含む方法。
【請求項２９】非ヒトのトランスジェニック哺乳動物
中のニューロンを標的にして所望のポリペプチド、タン
パク質又はペプチド生成物を発現する方法であって、ニ
ューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ₂ −サブ
ユニットの遺伝子を、相同組換えにより、哺乳動物のゲ
ノム中の、ＤＮＡ配列によってコードされている所望の
生成物をコードするＤＮＡで置き換えることを含む方
法。
【請求項３０】ＤＮＡが点突然変異、欠失、挿入又は
他の手段によって変異されたものであり、それにより、
トランスジェニック哺乳動物の生化学的測定又は行動的
測定により測定されるように、ニューロンニコチン性ア
セチルコリン受容体の活性が変化している請求項１５記
載の哺乳動物。
【請求項３１】請求項３０記載の哺乳動物から産生さ
れたセルライン。
【請求項３２】ＤＮＡが点突然変異、欠失、挿入又は
他の手段によって変異されたものであり、それにより、
トランスジェニック哺乳動物の生化学的測定又は行動的
測定により測定されるように、該ＤＮＡから発現された
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ₂ −サ
ブユニットの活性が変化している請求項１又は１９記載
の組換えＤＮＡ。
【請求項３３】制限酵素又は機械的せん断によって請
求項２３のＤＮＡを切断することによって得ることがで
きる単離されたＤＮＡ断片。
【請求項３４】タンパク質、ポリペプチド又はペプチ
ドをコードする非相同ＤＮＡ配列に作用的に連鎖した請
求項１のＤＮＡ又は請求項１のＤＮＡの断片から実質的
になるＤＮＡ。
【請求項３５】ニューロン細胞中の作用的に連鎖した
ＤＮＡ配列の転写を促進するのに十分な配列を含む請求
項３４記載のＤＮＡ。
【請求項３６】そのゲノム中に、請求項１〜１０のい
ずれか１項記載のＤＮＡに相当する異質のヌクレオチド
配列を含むセルライン。
【請求項３７】ニューロンニコチン性アセチルコリン
受容体の活性を回復する、又は検出可能に生じさせる能
力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項３１又は３６記載のセルラインに化合物を加える
か、又は、請求項３０記載の哺乳動物中に化合物を導入
することを含む方法。
【請求項３８】請求項１若しくは１９のＤＮＡ又はそ
れから誘導されたＤＮＡから本質的になる突然変異組換
えＤＮＡであって、β₂ −サブユニット遺伝子又はその
断片が、適当な発現系及びホストにおける効率的なニコ
チン性アセチルコリン受容体の発現を妨げるＤＮＡ。
【請求項３９】野生型又は突然変異ＤＮＡを有する第
一の哺乳動物を用意し、該第一の動物を、異なる同一で
はないＤＮＡを有する第二の哺乳動物と交配させること
によって発生させる請求項１５記載のトランスジェニッ
ク哺乳動物。