JP3631765B2 - 哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法 - Google Patents

Description

発明の利用分野
本発明は、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関し、この方法は、例えば膵細胞（または前膵細胞）におけるPax4 mRNAおよび／またはタンパク質のレベルまたは状態を確かめて、そのレベルまたは状態を、正常な膵細胞（または前膵細胞）の対応するレベルまたは状態と比較することによる。この方法はある種の膵細胞に起因する疾病の診断または検出手段を提供し、特に例えば若年性糖尿病のような糖尿病の診断または検出手段を提供する。前記方法は、膵細胞（または前膵細胞）におけるPax6 mRNAおよび／またはタンパク質のレベルまたは状態を確かめて、そのレベルまたは状態を、正常な膵細胞（または前膵細胞）の対応するレベルまたは状態と比較することと組みわせて行うことができる。
以下に提示したデータは、Pax4発現の不足がβ細胞発生の欠損または不全、それ故にインスリン産生の欠乏または低下（故に、若年性糖尿病のような糖尿病）の指標となることを示す。したがって、本発明は、グルカゴン遺伝子の不適切な発現から生じる若年性糖尿病のような糖尿病などの膵臓の疾患を治療し、予防しまたは遅延させるためにPax4発現を回復させることに関し、それ故に発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする配列を有する第１の核酸分子少なくとも１つ、および場合により発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする第２の核酸配列、を含むように改変することでPax4発現を回復させたトランスジェニック哺乳動物に関する。これとは別に、またはこれに加えて、本発明は、若年性糖尿病のような糖尿病などの膵臓の疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、Pax4を単独でまたはPax6と一緒に、および／またはPax4の発現またはPax4とPax6の両発現を促進（stimulate）する物質を投与することに関する。
以下に提示したデータは、Pax4発現の不足がβ細胞発生の欠損または不全、それ故にインスリン産生の欠乏または低下（故に、若年性糖尿病のような糖尿病）の指標となることを示すから、本発明はまた、少なくとも１つの不活性化されたPax4対立遺伝子を含むように改変されたトランジェニック哺乳動物に関する。この哺乳動物には若年性糖尿病のような膵臓の疾患の研究用モデル動物をはじめとして多くの有用性があり、それ故、膵細胞の欠損または不全に起因する疾患の治療法などを開発するうえで有用な新規動物を提供する。したがって、この場合の哺乳動物はヒト以外の動物、例えばマウスやラットといった実験動物であることが好ましい。
さらに、Pax4の不適切な発現は腫瘍などの疾病を引き起こすこともあるので、本発明はまた、腫瘍などのPax4の不適切な発現に起因する膵臓疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、少なくとも１つの不活性化されたPax4対立遺伝子を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物に関する。この場合の哺乳動物はヒトであってもよい。というのは、少なくとも１つの不活性化されたPax4対立遺伝子の哺乳動物への導入が治療のためだからである。これとは別に、またはこれに加えて、本発明は、腫瘍などのPax4の不適切な発現に起因する膵臓疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、Pax4を阻害する物質またはPax4とPax6とを阻害する物質を投与することに関する。
いくつかの文献が本明細書全体にわたって引用されている。ここに引用された文献（製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、それぞれを参照することにより本明細書中に含めるものとする。
発明の背景
膵臓は、消化管への酵素の供給に係わる外分泌機能と、各種ホルモンを血流中に分泌する内分泌機能の両方を併せもつ重要な臓器である。外分泌機能は、種々の消化酵素（アミラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼなど）を産生する腺房細胞および房心細胞と、アルカリ性溶液中のこれら酵素を十二指腸に輸送する介在導管細胞が担当している。
内分泌膵臓の機能性単位は、膵臓の外分泌部全体に分散していて、４種類の細胞型（すなわち、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞）から構成されるランゲルハンス島であり、これについてはSlack,Development 121（1995）,1569−1580に概説されている。β細胞はインスリンを産生するもので、内分泌細胞の大部分に該当し、ランゲルハンス島のコアを形成している。一方、α細胞はグルカゴンを分泌し、周辺に局在している。δ細胞とPP細胞はあまり多くはないが、それぞれソマトスタチンおよび膵性ポリペプチドを分泌する。インスリンとグルカゴンは血中グルコース濃度を調節するための重要な物質である。インスリンは細胞によるグルコースの取込みおよびグルコースのグリコーゲンへの変換を高めることで血中グルコース濃度を低下させる。グルカゴンは肝臓グリコーゲンの分解により介在して血中グルコース濃度を上昇させる。内分泌機能が損なわれる通常の膵臓疾患としては真性糖尿病、ホルモン分泌性腫瘍などがある。
４種類全ての内分泌細胞は内胚葉由来の共通の多能性前駆細胞から生ずると考えられる。膵臓発生の初期に、これらの前駆細胞はインスリンやグルカゴンなどの数種のホルモンを同時発現する。マウスでは、α細胞が受胎後（p.c.）9.5日目に分化する最初の内分泌細胞であり、続いて受胎後14.5日目にβ細胞とδ細胞への分化、そして生後１日目にPP細胞への分化が起こる。異なる内分泌細胞の系列を規定することに係わっている分子および遺伝子要素については殆ど知られていない。これまでに記載された数個の遺伝子の一つはホメオボックス遺伝子Pdx1であり、この遺伝子は膵臓発生の初期段階で発現されて、成体ランゲルハンス島のβ細胞に制限されるようになる（Guzら,Development 121（1995）,11−18）。ホモ接合性マウスPdx1の突然変異体は膵臓を発生させることができず、生後数日で死亡する（Jonssonら,Nature 371（1994）,606−609）。Pax遺伝子ファミリーの２つのメンバーであるPax4およびPax6もまた膵臓の発生中に内分泌細胞において発現される。しかし、特にPax4およびPax6遺伝子が膵臓の発生にどのような影響を及ぼすのか、今日まで知られていなかった。
膵臓における種々の分化パラメーターを試験する方法は、これまで利用できなかったとは言え、非常に望ましいものである。かかる方法により得られる結果は、例えば膵臓関連疾患の診断および治療に、大きな影響を及ぼす。
発明の概要
本発明は、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法から直接もたらされる医療分野での応用（用途）に関する。加えて、本発明は、少なくとも１つの不活性化Pax4遺伝子を含み、場合により少なくとも１つの不活性化Pax6遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物に関する。
発明の詳細な説明
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、膵細胞の分化状態をモニターする方法を提供することである。この技術的課題の解決は請求の範囲において特徴づけられた実施形態により達成される。
かくして、本発明は哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関し、この方法は、
（ａ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｂ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｃ）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことを含んでなる。
本発明に関連して、「レベル」とは産生されたmRNAまたはタンパク質の量のことである。「状態」という用語には、この遺伝子、mRNA、タンパク質または転写制御エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）が、野生型の正常遺伝子産物と比較したとき、この遺伝子の全体的な活性に影響を与えるような突然変異、欠失または他の改変をもつ可能性があるという選択肢が含まれる。この用語にはタンパク質の翻訳後修飾が含まれる。
本発明の方法により、膵臓組織における異なる細胞型（すなわち、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞）の発生についての詳細な研究が初めて可能となる。以後の実施例に示したように、Pax4遺伝子は、場合によりPax6遺伝子と共同して、膵臓の発生の初期段階に係わっている。この驚くべき結果により、細胞の運命を追跡することが可能となり、また膵臓に含まれる特定の細胞型に起因する疾患の発症についての研究が可能となる。さらに、本発明が提示した結果により、Pax4および／またはPax6は特定の膵細胞のマスター調節剤であると結論づけることができる。つまり、Pax4はβ細胞のマスター調節剤であるようだ。Pax4は膵細胞以外の細胞においても発現される。Pax4の発現は発生中の脊髄に存在する細胞のサブセットにおいて検出される。それゆえ、Pax4は同様にこうした細胞の分化状態においても、ある役割を担っている可能性がある。
したがって、本発明の方法は、特定の膵細胞に起因する疾患の診断または検出手段を提供し、特に早期検出または診断手段、例えば若年性糖尿病のような糖尿病の検出または診断手段を提供し、そのような検出または診断は出生前であってもよいし出生後であってもよい。
好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに、
（ｄ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
（ｅ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
（ｆ）Pax6 mRNAおよび／またはPax6タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
ことを含んでなる。
本発明のこの実施形態により、Pax4およびPax6遺伝子産物の相乗作用の研究が可能となる。この相乗作用の分析は膵臓における細胞特異的発生の調節に対するより深い洞察を提供すると期待される。膵臓特異的疾患に関係した診断用または医薬用組成物の開発は、こうした深い洞察から大いに恩恵を受けるだろう。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態では、前記哺乳動物は、
（ｉ）胚体期、
（ii）新生児期、または
（iii）成体期、
にあるものである。
本発明により示されたように、Pax4遺伝子は、好ましくはPax6遺伝子と共に、異なるレベルで、かつ哺乳動物の膵臓の異なる発生段階において発現される。胚体期、新生児期または成体期の膵細胞の発生段階の詳細な分析により、例えば各時期と関連した特定の疾病状態に関して、さらなる洞察が得られるだろう。例えば、本発明の方法を応用し、かつ本発明のトランスジェニック哺乳動物（ヒト以外）を用いることにより、例えば若年性糖尿病の病因を解明することが期待される（以下で述べる；実施例も参照のこと）。この知識に基づいて、新しい医薬（例えば、若年性糖尿病の新薬）が開発されて、試験されるだろう。
本発明の方法は、研究の目的に応じて、さまざまな哺乳動物に適用することができる。したがって、好ましい実施形態においては、哺乳動物はマウスである。この実施形態は、膵臓の発生を調節している各種タンパク質の機能的相互関係をより明確に理解するための基礎研究に特に有用である。別の実施形態においては、哺乳動物はヒトである。この実施形態では、好ましくは診断および治療上の適用例が考えられる。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）と場合により（ｄ）、および／またはステップ（ｂ）と場合により（ｅ）はin vivoでおこなわれる。
本発明のこの実施形態は特に基礎研究または治療上の適用例において有用であると予想される。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）と場合により（ｄ）、および／またはステップ（ｂ）と場合により（ｅ）はin vitroでおこなわれる。
この実施形態の利点は主に診断上の適用例にあり、また基礎研究にも有利であると予想される。
本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）と場合によりステップ（ｄ）での前記確認を、
（ｉ）Pax4遺伝子の少なくとも一部に一致し、好ましくはPax4タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列、および場合によりPax6遺伝子の少なくとも一部に一致し、好ましくはPax6タンパク質の少なくとも一部をコードする第２核酸配列、
（ii）（ｉ）の核酸配列に相補的な核酸配列、または
（iii）（ｉ）もしくは（ii）の核酸配列とハイブリダイズするプライマーもしくはプライマー対、
を用いて行う。
本発明のこの実施形態によると、分化状態を試験する方法は、例えばサザンもしくはノーザンブロットまたはin situ分析の形で、Pax4遺伝子および／またはPax6遺伝子またはその一部をコードする核酸分子を用いておこなうことができる。前記核酸配列は上記遺伝子のいずれかのコード領域または非コード領域にハイブリダイズしうる。本発明の方法において（ii）の相補配列を用いる場合には、前記核酸分子はノーザンブロットにおいて再使用することができる。さらに、前記試験は実際上のブロック、例えば遺伝子転写のブロックと共におこなってもよく、かくして治療との関連性を有することが予期される。さらに、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、上記のPax遺伝子または対応mRNAの１つにハイブリダイズさせるためにも使用できる。ハイブリダイゼーション用の核酸は、当然、放射性マーカーや他のマーカーを組み込んだり結合させることで便利に標識される。このようなマーカーは当技術分野で周知である。上記核酸分子の標識付けも慣用方法でおこなうことができる。
さらに、Pax4および場合によりPax6の存在または発現は、対応する核酸配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて、標準方法に従ってPCR反応をおこなうことでモニターすることができる。
上記プローブまたはプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でおこなうことが好ましい。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら，“Molecular Cloning,A Laboratory Manual"第２版,CSH Press,Cold Spring Harbor,1989;“Nucleic Acid Hybridisation,A Practical Approach",Hames and Higgins編,IRL Press,Oxford,1985を参照されたい。
当業者であれば、この開示内容から、過度な実験を行わずとも本発明の上記実施形態のさらなる変更が容易に考えつくことである。
本発明のもう１つの実施形態は、ステップ（ｂ）と場合によりステップ（ｅ）での前記確認を、Pax4タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを用いて、場合により、Pax6タンパク質と特異的に結合する第２の抗体またはそのフラグメントを用いて行う方法に関する。
前記タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントは、例えばHarlowおよびLane“Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1988に記載される慣用方法を用いて取得することができる。これらの抗体はモノクロナール抗体であっても、ポリクローナル抗血清中に含まれるものであっても、またはそのフラグメントであってもよい。本発明の方法で用いる抗体は、ヒスチジンフラッグやビオチン分子などの検出可能なタグにより標識することができる。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、前記膵細胞がβ細胞またはδ細胞である。
本発明によると、Pax4はβ細胞において発現されることがわかった。したがって、Pax4遺伝子機能の破壊は、膵臓における前記細胞の発生の精密な追跡を可能にする。α細胞とβ細胞の両方ではPax6も発現されるので、Pax6発現は、Pax4が作用しうる環境を整えるために必要とされるのかもしれない。
Pax4とPax6は両方とも内分泌細胞の適正な分化にとって必要な調節タンパク質であるので、この実施形態は膵臓腫瘍のような疾病の発生に関してさまざまな結論を可能しうる。
したがって、さらに好ましい実施形態は、前記分化状態が膵細胞の悪性度または悪性力の指標となる方法に関する。機能性Pax4産物および場合によりPax6産物の過剰発現または欠損は、正常な内分泌細胞を癌化するように誘導する可能性がある。この記載に一致して、Pax4遺伝子の近くの染色体7qにおける対立遺伝子欠損が多くの膵臓癌に観察されている（Albertoら,Cancer Res.56（1996）,3808−3818）。Pax4は、場合によりPax6も、他の発癌因子と相互作用しているのかもしれない。
悪性度または悪性力は、本発明によれば、好ましくは、しかし排他的ではなく、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ソマトスタチノーマ、管細胞腺癌などの膵臓腫瘍との関連において用いられる。
本発明は、さらに好ましい実施形態において、
（a'）前記試験に先立って、前記哺乳動物から固形膵臓腫瘍を摘出すること、および
（b'）前記試験後、Pax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子が過剰発現している場合は、前記腫瘍の細胞における前記遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除すること、またはPax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子が過少発現しているか発現していない場合は、前記遺伝子の発現を促進すること、もしくは発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺伝子を前記細胞に導入すること、および
（b''）ステップ（b'）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物に再導入すること、
をさらに含む方法に関する。
これに関連して、本明細書全体を通して用いられる「機能性」Pax4（Pax6）とは、β細胞（α細胞およびランゲルハンス細胞）への内分泌細胞の発生に寄与するという生物学的性質をもつPax4（Pax6）タンパク質の一次構造コンホメーションの一部または全部を有するタンパク質を意味し、前記タンパク質はPax4（Pax6）をコードするDNA配列の原核または真核生物発現の産物であって、配列番号２もしくは18（配列番号４）のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは18（配列番号４）に示したアミノ酸配列のアミノ酸欠失、置換、挿入および／もしくは付加を有するそのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるアミノ酸配列を有する。また、「機能性」Pax4（Pax6）タンパク質という用語には、抗体応答のような特異的免疫応答を生じさせる前記タンパク質またはその一部の能力も含まれる。
本発明のこの実施形態は、腫瘍（特にヒトの腫瘍）を治療するのに適している。したがって、膵臓腫瘍細胞のPax4タンパク質および場合によりPax6タンパク質の発現レベルをモニターすることが考えられる。前記タンパク質の過剰発現の検出は、かかる過剰発現が腫瘍の発生または維持に相互関係していると結論づけることができよう。したがって、その発現レベルを正常レベルにまで下げるステップが追加されよう。例えば、これは、生物学的手段により、例えばリボザイム、アンチセンス核酸分子、またはPax4タンパク質かPax6タンパク質に対する細胞内抗体を用いることで、Pax4遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除することにより行うことができる。さらに、Pax4の発現レベルを下げるための薬剤が開発される可能性がある。目下のところPax4および場合によりPax6が膵臓組織においてどのように調節されるのかは不明であるが、さまざまな発生因子とホルモン因子がこれらの遺伝子の活性レベルを決定していると考えられる。例えば、特定の遺伝子の発現を抑制する小分子が知られている。TGFβスーパーファミリーの一員であるアクチビンＡは、発生しつつある脊髄におけるPax6の発現をダウンレギュレートすることが実証されている（Pituelloら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）,6952−6956）。同様の分子が膵臓でのPax4の発現と、場合によりPax6の発現、をダウンレギュレートする可能性がある。一方、発現の不足つまり過少発現は腫瘍細胞で発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子により回復され得る。また、発現の促進または誘導が小分子やその他の手段（この場合はPax4遺伝子発現を活性化するもの）を用いることで得られる。これに関して、本発明は、前記悪性状態では前記Pax遺伝子の一方が過剰発現されるが他方のPax遺伝子は過少発現されるという可能性を意図している点に留意することが重要である。最後に、ヒトの膵臓腫瘍の外科的切除または化学療法による治療により、しばしば、患者はグルカゴン産生細胞の相当数が存在しない状態になってしまう。Pax4および場合によりPax6は、欠損しているかまたは損傷を受けたβ細胞の機能性代替物を開発するための組織遺伝子工学的操作（LangerおよびVacanti,Science 260（1993）,920−924）において使用することができる。in vitroで正常レベルのPax4発現および場合によりPax6発現に復帰した膵臓腫瘍細胞を患者に再導入すると、患者自身の遺伝的背景にある正常なインスリン産生細胞が患者に供給される結果、細胞の免疫学的拒絶反応の危険性が低減する。
本発明のさらに好ましい実施形態において、膵細胞の分化状態を試験することは、実施例に示すように、若年性糖尿病の指標となるβ細胞の発生状態を試験することである。若年性糖尿病はβ細胞発生の欠損または不全の結果として発症することが多い。実施例により、Pax4発現の不足がβ細胞発生の欠損または不全の指標となり、したがってインスリン産生の欠乏または低下（それ故に若年性糖尿病のような糖尿病）の指標となることが示される。
若年性糖尿病の早期診断は特に有利であり、かなり医学的に重要なことである。したがって、糖尿病の診断または検出のために本発明の方法を用いることが好ましい実施形態となる。この好ましい実施形態は、コロナ絨毛（coronar villi）において、すなわち胚の着床前に、若年性糖尿病を診断するのに用いることができる。さらに、本発明の方法を用いて、羊水穿刺により若年性糖尿病を診断することも可能である。本発明の方法のあらゆる適用例に従う若年性糖尿病の早期診断は、誕生後で臨床的徴候の発現前に直接治療することを可能にする。
本発明方法の特に好ましい実施形態では、前記β細胞の分化状態を試験することが胚体または新生児哺乳動物において行われる。
先に示したように、個々の薬剤治療および遺伝子治療のアプローチに特有の、少なくとも１つの追加のステップを本発明の方法に含めることが特に好適である。上述したように、Pax4発現、および場合によってはPax6発現を活性化し、それゆえ、インスリン産生β細胞の分化および生産とランゲルハンス島の発生を誘導するために、医薬として有効な種々の小分子を用いることができよう。同様に、活性のPax4および／または場合によってはPax6の細胞内ターゲティングは同様の成果を前進させるだろう。この記載に合致して、膵管上皮細胞は内分泌細胞型の潜在的な幹細胞を含むことが提唱された。前記細胞に限らないが、前記細胞におけるPax4活性の誘導は、インスリン産生細胞への分化を促進し得る（Parsaら,1985,Cancer Res.45:1285−1290）。
本発明方法のさらに好ましい実施形態においては、膵細胞の前記分化状態が薬剤活性のまたは遺伝子治療法の結果である。例えば、前記分化状態は、機能性Pax4および場合によりPax6遺伝子を、レトロウイルスベクター（Naldiniら,Science 272（1996）,263−267;Mulligan,Science 260（1993）,926−932）または他の適切なベクターを用いて、in vivoで細胞に導入する遺伝子治療アプローチにより影響を受ける。同様に、本発明によると、患者由来の細胞を分離し、それらの細胞を標準的な組織培養技術を用いてβ細胞へと分化するようにin vitroで改変し、そして患者に再導入することができる。
特に好ましい実施形態では、前記薬剤または遺伝子治療法が、Pax4遺伝子と場合によりPax6遺伝子の発現レベルにmRNAレベルまたはタンパク質レベルで影響を与える。
本発明の上記実施形態は、とりわけ、上記Pax遺伝子の発現に及ぼす薬剤の影響について薬剤を試験することを可能にする。さらに上で述べたように、Pax4と場合によりPax6の異常な発現レベルは、例えば膵臓の固形腫瘍の発症の原因となると予想される。したがって、本発明の方法は、薬剤の適用により細胞が正常な発現レベルに戻れるような、そういった薬剤の試験を可能にする。前記正常な発現レベルは、例えば細胞の悪性度に直接影響を与えることが期待されよう。例えば、疾病または腫瘍がPax4の過少発現の直接的または間接的結果であるとすると、個々の患者を治療している医師は、Pax4の発現を促進する薬剤を投与するだろう。
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、膵細胞の分化状態を試験することはPax4（場合により、同時にPax6）のノックアウトマウスにおける発生状態を試験することである。
本発明方法のさらに好ましい実施形態において、前記方法は、β細胞と比べたとき、類似しているが異なる分化経路を有する膵臓α細胞または管上皮細胞に、発現可能な機能性Pax4遺伝子を導入し、場合によりさらに発現可能な機能性Pax6遺伝子を導入することをさらに含む。本発明のこの実施形態を用いると、当業者はα細胞または管上皮細胞の運命をβ細胞へと再度方向づけすることができる。こうして、α細胞は、Pax4遺伝子、および場合によりPax6遺伝子によるトランスフェクション後に、β細胞へと分化することが期待される。患者がβ細胞の不足、それ故インスリンの欠損に苦しんでいる場合は、相応の薬剤投与が考えられる。この方法はin vitroでもin vivoでも行うことができると考えられる。
本発明はさらに、少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物に関する。特にこのトランスジェニック哺乳動物の研究上の使用に関しては、哺乳動物はヒト以外のものであることが好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば膵臓における、種々の細胞の発生をモニターするのに有利に使用することができる。しかし、このトランスジェニック哺乳動物の使用は膵臓発生の研究に制限されない。本発明によると、Pax4は今やβ細胞のマスター調節剤であると考えられるので、その影響は生体の他の細胞型でも研究することが可能である。
本発明のトランスジェニック動物（好ましくは、ホモ接合状態のトランスジェニックマウス）は重症の膵臓障害（トランスジェニックマウスの場合には、生後三日以内に死に至る）を有するので、前記トランスジェニック動物は、特に膵臓の発生障害と関連した疾患の研究にさらに使用することができる。トランスジェニックマウスはインスリン産生細胞に欠陥があり、若年性糖尿病のヒト患者によく似た臨床的徴候を呈するので、前記マウスは若年性糖尿病に対する治療および薬剤研究用のモデル動物として有用である。
好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物は少なくとも１つの不活性化Pax6対立遺伝子をさらに含有する。
この実施形態は、哺乳動物またはその特定の組織（特に膵臓の組織）の発生に関するPax4とPax6の相互作用の研究を可能にする。Pax4トランスジェニック哺乳動物に関して本明細書中で先に述べた応用例はすべて、２個のトランスジーンを保有する哺乳動物にも当てはまる。また、トランスジェニック動物の発生および／または生涯の特定の時期にPax4遺伝子発現と場合によりPax6遺伝子発現を不活性化することが望ましいかもしれない。これは例えば、Pax4タンパク質をコードするRNA転写産物および場合によりPax6コード化RNAに対するアンチセンスまたはリボザイムの発現を駆動する、例えば組織特異的な、発生および／または細胞調節型のおよび／または誘導可能なプロモーターを使うことで達成できる。適当な誘導系は、例えばGossenおよびBujard（Proc.Natl.Acad.Sci.89 USA（1992）,5547−5551）およびGossenら（Trends Biotech.12（1994）,58−62）に記載されるテトラサイクリン調節遺伝子発現である。本発明の別の好ましい実施形態においては、前記トランスジェニック哺乳動物はヒト、マウスまたはラットである。上述したように、治療のために少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子を哺乳動物に導入し得るから、トランスジェニック動物はヒトであってよい。
本発明によれば、トランスジェニック動物は不活性化Pax4または不活性化Pax6のいずれかまたは両方の不活性化遺伝子に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
さらに、本発明は、哺乳動物の糖尿病を治療し、予防し、および／または遅延させるための医薬組成物を調製するための、発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする少なくとも１つの第１核酸配列および場合により発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする第２核酸配列の使用に関する。本発明によると、前記核酸配列を含むベクターは、前記核酸配列の発現および／または前記核酸配列の膵細胞へのターゲティングを可能にする調節エレメントに機能しうる形で連結させることができる。
さらに、本発明は、哺乳動物の糖尿病を治療し、予防しおよび／または遅延させるための医薬組成物を調製するための、機能性Pax4タンパク質および場合により機能性Pax6タンパク質の使用に関する。「機能性」という用語は本明細書中で先に説明した意味を有する。
好ましくは、上記実施形態で言及された哺乳動物はヒト、マウスまたはラットである。かくして、本発明はさらに、発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする配列からなる少なくとも１つの第１核酸分子および場合により発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする配列からなる第２核酸分子を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物（ただし、前記核酸分子は前記哺乳動物において発現される）を包含する。この哺乳動物は、出生前または出生後に、例えば本発明の方法により低い、欠損したまたは皆無のPax4タンパク質またはmRNAが示された後に、糖尿病を治療し、予防しおよび／または遅延させるために改変され得る。この改変は、本明細書中で述べた技法によりまたは当業者の技量の範囲内で、本明細書の開示から過度の実験をおこなうことなしに可能である。
本発明では、上記核酸およびタンパク質を単独でまたは任意の組合せで、場合により製薬上許容される担体または賦形剤と共に、投与することが意図される。前記核酸配列は哺乳動物のゲノムに安定に組み込むことができる。一方、ある種の細胞や組織、好ましくは膵臓および／または脳に特異的で、前記細胞内にとどまって前記細胞内でのPax遺伝子の発現を賦与するウイルスベクターを使用することもできる。適当な製薬上の担体および賦形剤は当技術分野で周知である。核酸分子および／またはタンパク質を特定の細胞にターゲティングすることができるエレメントは先行技術、例えばSomiaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）,7570−7574に記載されている。医薬組成物は哺乳動物に適切な用量で投与されるが、その用量は、当業者であれば、本明細書の開示および当技術分野の知識から過度の実験をおこなうことなしに、とりわけ哺乳動物の種、年齢、性別、体重、健康状態、投与経路、Pax4タンパク質を投与するのかPax4タンパク質とPax6タンパク質を投与するのか、Pax4またはPax4とPax6を抑制する薬剤または促進する薬剤のいずれかを投与するのか、単一の核酸を投与するのか、または複数の核酸を投与するのか、その核酸がPax4もしくはPax4とPax6を発現させるためのものなのか、またはPax4もしくはPax4とPax6の発現を抑制するためのものなのか、といった典型的な要因を考慮に入れて決定することができる。典型的な用量は例えば0.001〜1000μｇの範囲内（またはこの範囲内の発現用または発現抑制用の核酸の用量）であってよい。しかし、この代表的範囲より少ないまたは多い用量も、特に上記要因を考慮して、考えられる。
適切な組成物の投与はいろいろな方法でおこなうことができ、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によるものである。本発明に従って調製された医薬組成物は、さまざまな種類の疾患、例えば膵臓関連疾患、すなわち糖尿病、またはさまざまな種類の後天性もしくは先天性神経障害、神経変性および関連障害を治療し、予防しまたは遅延させるために使用することができる。前記疾患および障害は好ましくは内分泌または神経組織、例えば膵臓や脳に起因するものである。
さらに、Pax4タンパク質をコードする核酸配列および場合によりPax6タンパク質をコードする核酸配列を含む医薬組成物を遺伝子治療のために使用することが可能である。当然、両配列が同じベクター中に含まれていてもよい。上述したように、細胞がPax遺伝子の両方の機能性コピーを失うときに病気が発生することが多い。こうした場合に、対応する遺伝子の機能性コピーを導入してやると、その状況を改善させることができる。例えば、生殖細胞系の細胞への遺伝子導入に関する研究は生殖生物学において最も急速に進展している分野の一つである。遺伝子治療は、ex−vivoまたはin−vivo技術による治療用遺伝子の細胞への導入に基づくもので、遺伝子導入の最も重要な応用例の一つである。適当なベクターおよびin−vitroまたはin−vivo遺伝子治療法は文献に記載されており、当業者には公知である。例えば、Giordano,Nature Medicine 2（1996）,534−539;Schaper,Circ.Res.79（1996）,911−919;Anderson,Science 256（1992）,808−812;Isner,Lancet 348（1996）,370−374;Muhlhauser,Circ.Res.77（1995）,1077−1086;Wang,Nature Medicine 2（1996）,714−716;WO94/29469またはWO97/00957およびそこに引用された文献を参照のこと。Pax4および場合によりPax6をコードする遺伝子は細胞への直接導入のために、またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介しての導入のために設計され得る。例えば、ヒトPax4をコードする配列および場合によりPax6遺伝子を調節配列に機能しうる形で連結させて、標的細胞および組織内での発現を可能にすることができる。遺伝病において、突然変異を起こしている核遺伝子の正常なまたは機能的に十分な対立遺伝子を導入することが遺伝子置換療法に相当し（例えば、Mouellic,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87（1990）,4712−4716;Joyner,Gene Targeting,A Practical Approach,Oxford University Pressを参照のこと）、これは主に糖尿病や低血糖症などの単一遺伝子劣性疾患に応用される。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は糖尿病の治療方法に関し、この方法は、
（ａ）哺乳動物から細胞を取り出し、
（ｂ）発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺伝子を前記細胞に導入し、そして
（ｃ）ステップ（ｂ）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種の哺乳動物に再導入する、
ことを含んでなる。
また、さらなる実施形態において、本発明は神経障害の治療方法に関し、この方法は、
（ａ）哺乳動物から細胞を取り出し、
（ｂ）発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺伝子を前記細胞に導入し、そして
（ｃ）ステップ（ｂ）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種の哺乳動物に再導入する、
ことを含んでなる。
導入された遺伝子は、前記細胞への導入後に機能性で、かつ発現可能であり、好ましくは前記細胞の寿命の間その状態のままであり続けることを理解すべきである。
好ましくは、前記哺乳動物はヒト、ラットまたはマウスである。
本発明方法の好ましい実施形態において、前記細胞は生殖細胞系の細胞もしくは胚性細胞またはそれ由来の細胞である。胚性細胞は、例えばNagy,Proc.Natl.Acad.Sci.90（1993）8424−8428に記載されるような、胚性幹細胞であってよい。さらに好ましい実施形態では、前記細胞が卵細胞またはそれ由来の細胞である。
適当なベクターおよびin−vitroまたはin−vivo遺伝子治療法は文献に記載されており、当業者には公知である。本発明による医薬組成物は、Pax4遺伝子および／またはPax6遺伝子の発現および／または無発現に関係することがこれまで知られていない種類の疾患の治療に使用することができる。
これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例により開示されて、それらを包含するものである。例えば、本発明に従って用いられる化合物、使用および方法のいずれかに関する更なる文献は、例えば電子機器を使って、図書館から検索することができる。例えば、公共のデータベースである「Medline」を利用することができ、これは例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlのアドレスのもとにインターネットで入手可能である。更なるデータベースおよびアドレス、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/,http://www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html,http://www.tigr.org/が当業者に公知であり、また、例えばhttp://www.lycos.comを使って得ることもできる。バイオテクノロジーの特許情報の総覧および従来技術のサーチや現在の事情に有用な特許情報の関連ソースの概論は、Berks,TIBTECH 12（1994）,352−364に載っている。
【図面の簡単な説明】
本明細書の開示内容は、参照することにより本明細書中に組み入れられる添付図面と関連させることで最もよく理解されよう。
図１（図1a,1b,1c,1d）：ターゲティングされたPax4の破壊およびPax4（−／−）マウスの作製。
a. 野生型およびターゲティングされたPax4遺伝子座の構造。β−ガラクトシダーゼ−ネオマイシン耐性カセットをインフレームで融合することにより、Pax4のペアードボックス（paired box）ドメイン全体（黒塗り枠；エクソン２、３および４）のほぼ全部のターゲティングされた欠失を作製した（転写方向は矢尻２つで示す）。制限酵素:A、Apa I;K、Kpn I;Nh、Nhe I;N、Not I;S、Spe I;St、Stu I;X、Xho I。
b. ES細胞クローンから単離したDNAをSpe Iで消化し、0l7kb外部ゲノムフラグメント（プローブ１、左側）と0.5kb cDNAフラグメント（プローブ２、右側）の両方を用いたサザンブロットハイブリダーゼーションにより分析した。サイズはキロベースで示す。両方において、26kbフラグメントが野生型対立遺伝子の指標であり、20kbおよび7.8kbのフラグメントはそれぞれターゲティングされた対立遺伝子に由来するものである。星印は相同組換えに対して陽性な２つのクローンを表わす。
c. 野生型（上段）およびPax4欠損（下段）の１組の２日齢の同腹子であり、ヌル突然変異体マウスの体長が小さくなることを示している。
d. 野生型のペアードドメインおよび／またはneo遺伝子を増幅させるために、卵黄嚢または尾部からのゲノムDNAおよび２組のプライマー（ａにおいて矢印で示すように位置する）を用いたPCR分析により胚の遺伝子型を決定した。
図２（図2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2h）。Pax4（＋／−）およびPax4（−／−）El6.5胚および新生児マウスの膵臓におけるLacZ活性、インスリンおよびグルカゴン発現の分析。
E16.5（＋／）の膵臓では、インスリン細胞（ａ中の矢印）およびグルカゴン細胞（ｂ中の矢印）は、LacZ活性が検出される領域（ａおよびｂ中の矢尻）と関連する。これに対して、E16.5（−／−）胚の膵臓では、LacZの発現（ｅ中の矢尻）は減少し、インスリンは存在しない（ａとｅとを比較せよ）。E16.5（−／−）膵臓では、多数のグルカゴン細胞が見出され（ｆ中の矢印）、LacZ活性の領域（ｆ中の矢尻）と関連する。（＋／−）新生児膵臓では、LacZ発現はインスリン細胞（ｃ中の矢印）に制限され、グルカゴン細胞（ｄ中の矢印）によって囲まれているように見える。（−／−）新生児膵臓では、LacZ活性またはインスリンの発現が全く検出されない（ｃ、ｄおよびｇを比較せよ）。一方、（−／−）新生児膵臓では、多数のグルカゴン細胞が存在し（ｈ中の矢印）、異常に密集して分布している（ｄとｈとを比較せよ）。倍率は400×である。
図３（図3a、3b、3c、3d、3e、3f）。Pax4（＋／＋）および（−／−）新生児膵臓におけるPdx1およびソマトスタチンの発現。
（＋／＋）および（−／−）E10.5胚の両方の背側膵において、Pdx1の初期の発現は類似しているように見える（ａとｂとを比較せよ）。
新生児（＋／＋）膵臓では、Pdx1は成熟インスリン産生β細胞に制限される（ｃ中の矢印）。Pax4（−／−）新生児マウスの膵臓では、Pdx1の発現は全く検出されない（ｃとｄとを比較せよ）。（＋／＋）新生児膵臓では、ソマトスタチン産生δ細胞は主にランゲルハンス島周辺の細胞内（ｅ中の矢印）に分布する。しかし、（−／−）新生児膵臓では、ソマトスタチンは検出されない（ｅとｆとを比較せよ）。ａおよびｂはビブラトーム（vibratome）切片である。ｃおよびｄは低温槽切片である。ｅおよびｆはパラフィン切片である。（ｃ〜ｆ）の倍率は（200×）であり、ａおよびｂでは（400×）である。
図４（図4a、4b、4c、4d）。新生児マウスから得たPax4（＋／＋）および（−／−）膵臓の組織学的分析およびα−アミラーゼの発現。
外分泌腺房を（ａ）に示す。これは、ピラミッド型の細胞群（矢尻）を含み、その核は基底状態（base）にある。外分泌細胞（矢尻）はまた新生児（−／−）膵臓で存在する。しかし、広い細胞質領域が見られ、その核の無秩序な分布も見られる（ａとｂとを比較せよ）。（＋／＋）新生児膵臓では、外分泌細胞は異なる量のα−アミラーゼを含み（ａ、ｃの矢印および矢尻）、これは通常は哺乳の後で起こる消化酵素の欠乏を反映している。しかし、新生児（−／−）膵臓の外分泌組織のほぼ全部において大量のα−アミラーゼが存在し（ｅ中の矢印）、このことは、α−アミラーゼの分泌が影響を受けているかもしれないことを示すものである。ａおよびｂの倍率は（400×）であり、ｃおよびｄの倍率は（200×）である。
図５。マウス膵臓での内分泌分化におけるPax4の役割のためのモデル。
最も初期の内分泌前駆細胞は、そのPdx1発現によって特徴付けられ、マウス発生のE8.5付近である［Guzら,Development 121（1995）,11−18］。おそらくPdx1がもやは存在しない前駆細胞では、α細胞の分化は発生の非常に初期に起こる。最も初期のβ細胞前駆細胞では、Pdx1およびインスリンのような遺伝子は選択的に発現され、その発現を維持することが分化の進行にとって重要であると思われる。成熟内分泌細胞では、Pdx1、インスリンおよびPax4は発現がβ系譜に制限されている。Pax4は、インスリン産生β細胞に固有の遺伝子の発現を促進および／または維持することができる。
図６。野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax4突然変異体新生児マウスの膵臓におけるホルモン濃度。、
野生型動物とヘテロ接合性動物との間には、インスリンまたはグルカゴン濃度の差はほとんど、または全く見られなかった。ホモ接合性動物ではインスリン濃度はほぼ全部失われ、グルカゴンレベルは３倍増大した。
図７。膵腫瘍細胞系のノーザンブロット分析。
細胞系AR42Jは２種のPax4 RNA転写物を含んでいた。一方は野生型の転写物と同様のサイズであり（矢尻）、他方はそれよりもサイズが大きいものであった（星印）。細胞系βTC−１およびαTC 1−９では弱いPax4発現が検出される。
本発明およびその多くの利点は、例示としての以下の実施例からさらに理解されるだろう。
実施例
インスリン、グルカゴンおよびアミラーゼに対する抗体は数社から販売されている。本出願人の実験で用いた抗体はBoehringer Mannheim社から購入した。Pdx1抗体はUmea大学（Ｓ−901 87 Umea,Sweden）微生物学部のThomas Edlund教授から親切にも贈られたものである。同じ特異性を有する抗体、すなわちPdx1タンパク質を特異的に認識する抗体は、通常の手順に従って、抗原としてPdx1タンパク質を用いることで調製することができる。
実施例1:相同的組換え用の構築物の作製およびPax4欠損マウスの作出
β−ガラクトシダーゼ−ネオマイシン耐性カセットをイン・フレームで融合することにより、Pax4のペアード（paired）ボックスドメイン（黒塗りの枠：エクソン２、３および４）全体のほぼ全部のターゲティングされた欠失を作製した。LacZpA−pGKNeopA配列を含む5.1kbのXba−Xholフラグメントの末端を平滑にし、Nhe Iで消化し末端を平滑にしたPax4構築物と連結した。pGKneoプラスミド（Sorianoら,1991,Cell 64:693−702）と幾つかの供給元から入手可能なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（例えば、Pharmacia製のpCH110ベクター）とを組合せることにより、LacZpA−pGKNeopA構築物を作製した。５′側Nhel部位を保持し、３′末端に新たなSpel部位を作製した。陰性の選択として、F9ポリオーマ初期プロモーター由来のHSV TK遺伝子を５′側相同領域の上流に付加した。R1 ES細胞をエレクトポレーション処理し、標準的手順に従って選択した。陽性クローンを用いて、桑実胚集合によりキメラを作製した。尾部および卵黄嚢DNAの単離ならびにゲノムDNAのPCR増幅を標準的手法を用いて行った。表現型の分析はNMR1およびC57BL/6マウスで行った。両方の遺伝的バックグラウンド間に差異は全く見られなかった。
実施例2:発生過程でのPax4の発現についての検討
ゲノムスクリーニングにより、Pax4がPax遺伝子のマウスファミリーのメンバーであることが先に確認されている（Waltherら,Genomics 11（1991）,424−434）。本出願人らは、対応するcDNA配列をRT−PCRにより単離した。
Pax4 cDNAのペアードドメインおよびホメオボックスドメインをコードするフラグメント（615nt）のPCR増幅は、E13.5マウス胚から単離した１μｇの全RNAを用いて行った。逆転写はPharmacia製のキットおよびランダムプライマーを用いて行った。用いたプライマーは、ペアードドメイン［５′側、センスプライマー:5'AGC AAT AAG AGG GAT GCG ACC 3'（配列番号５）」およびホメオボックスドメイン［３′側、アンチセンス:5'AGC TGT GCT TCC CAT TTC AGC 3'（配列番号６）］をそれぞれコードする対応するゲノム領域のシークエンシングを行った後で得た。実施した全てのPCR反応（５′および３′RACEを含む）において、最初の変性工程（95℃、３分間）の後、そして次のサイクルに入る前にTaqポリメラーゼを添加した。２ユニットのTaqポリメラーゼを１ユニットの「パーフェクトマッチ（Perfect Match）」（Stratagene社製）と共に添加した。95℃で1.5分;60℃で1.5分;72℃で2.5分を35サイクル行った。最後の工程は、60℃で1.5分および72℃で10分で行った。２％低融点アガロースでゲル電気泳動を行った後、予想したサイズの薄いバンドが見えた。これを切り出し、同じプログラムで再増幅した（５μｌの溶融アガロース）。２％分離用ゲルからDNAを電気溶出し、標準的手法に従ってフィルインし、末端を平滑化して、Sma Iで消化したBluescriptにクローニングした。単離したクローンのシークエンシングは、Pharmacia社製のシークエンシングキットを用いて行った。5'−RACE増幅は、GIBCO−BRL社製のキットを用いて製造業者の説明書に従って行った。簡単に説明すると、E10.5マウス胚の後方領域から単離した全RNA［後肢芽（hindlimb）の後部：「テイルRNA」］５μｇを第１鎖のcDNA合成用の鋳型として用いた。２組のネスティド（nested）プライマーをそれぞれAPプライマー［プライマーBS41:5'GCG AAT TCC CTG AAG TGC CCG AAG TAC TCG ATT 3'（配列番号７）］およびUAPプライマー［プライマーBS57:5'GGC TCC GTG AAA TGT CAC AG 3'（配列番号８）］と組合せて用いた。第１のPCR反応では、Pax4の既知配列の５′領域の近傍に位置するPax4に特異的な１つのプライマーを、市販のキット（GIBCO−BRL社製の5'RACEシステム）の「AP」プライマー:5'CGT AGT ACT GTC GAC TAG CAG GGI IGG GII GGG IIG 3'（配列番号９）と共に用いた。この「AP」プライマーは、dC−テイルを付けたcDNAとアニーリングするdG−テイルに連結したアダプターを含んでいる。第２の反応では、「ネスティド」Pax4プライマー（「ネスティド」とは、第１の反応で用いたPax4プライマーの５′側寄りまたは「上流」に位置することを意味する）を、市販の「UAP」プライマー［APプライマーのアダプター配列のみを含むプライマー:5'CGT AGT ACT GTC GAC TAG CA 3'（配列番号10）］と共に用いた。第１のPCR（AP/BS41プライマー）はdC−テイルを付けたcDNA5μｌを用いて行った（94℃で1.5分;55℃で1.5分;72℃で３分、を35サイクル）。この得られたPCR反応物（20倍希釈物）２μｌを、プライマーUAP/BS57を用い、94℃で１分;60℃で１分;72℃で2.5分を40サイクル行うことにより再増幅した。ゲル電気泳動を行った後、およそ500ntの単一のバンドが見えた。これを電気溶出し、TA−pGEMベクター（PROMEGA社製）にクローニングした。この方法によって、180ntの５′側の新らしい配列情報が得られた。３′RACE増幅を、2.5μｇの「テイル」E10.5 RNAを鋳型として用いて行った。第１鎖cDNAの合成は、第１鎖cDNA合成キット（Pharmacia社製）に添付のNot I−オリゴdTプライマーを用いて行った。第１のPCRはNot Iプライマー［5'AAC TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG GAA 3'（配列番号11）］およびBS36プライマー［5'CAG GAA GAC CAG AGC TTG CAC TGG 3'（配列番号12）］を用いて行った。35サイクル（94℃、1.5分;55℃、1.5分;72℃、３分）行った。このPCR反応物（20倍希釈物）２μｌをネスティドプライマー［BS42:5'GCG GAT CCC ACA GGA ATC GGG CTA TCT TC 3'（配列番号13）］およびNot Iプライマーを用いて再増幅した。ゲル電気泳動した後、２％低融点アガロースゲルから約550ntの顕著なバンドを切り出した。２μｌの溶融アガロースを、別のネスティドプライマー［BS59:5'GCG CAG GCA AGA GAA GCT GA 3'（配列番号14）］およびNot Iプライマーを用いて再増幅した。最後の２回のPCRは、60℃、1.5分;72℃、３分;94℃、1.5分を40サイクルとした。420ntの顕著なバンドを電気溶出し、TA−pGEMベクターにサブクローニングした。増幅した5'および3'PCRフラグメントの忠実度は、２種類の方法で評価した。すなわち、第１として、「テイル」E10.5 RNAから、最も5'側および3'側にある新規な配列から設計されたプライマー［センスプライマー:5'CTT CCA GAA GGA GCT CTC 3'（配列番号15）、およびそのアンチセンスプライマー:5'TGG GAT GAT GGC ACT TGT C 3'（配列番号16）］を用いて、1.1kbのフラグメントを増幅した。そのサイズおよび配列は予想したとおりであった。また、PCRで単離した３つのフラグメント（5'−、615ntおよび3'−）の配列をゲノムクローン中の対応するコード領域と比較した。
Pax4の発現を分析したところ、その転写物が前脊髄および早期発生段階にある膵臓では数個の細胞に限られることが判明した。発生過程でのこの遺伝子の機能を調べるために、本出願人らは、Pax4−欠損マウスを作出した（実施例１を参照）。ペアードボックスドメインのほぼ全体を欠失させ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をPax4のアミノ末端とインフレームで融合させた後、ES細胞における相同組換え後のPax4の不活性化を行った（図1a）。このアプローチにより、本出願人は、LacZ活性の検出によって、発生全体を通してのPax4の発現をより詳細に分析できる。
ヘテロ接合性マウスは明らかな異常は示さず、それらは生存可能であり繁殖能力がある。発生10.5日目の（＋／−）胚（E10.5）を染色することにより、背側膵内の細胞におけるLacZ活性が明らかになった。LacZ活性を検出するために、マウス胚および単離した新生児膵臓のＸ−gal染色を標準的手順に従って行った。４％パラホルムアルデヒド中で４℃にて一夜にわたって後固定を行った。免疫組織化学のために、Ｘ−gal染色した胚および組織をパラフィンに包埋し、ミクロトームで薄切した（10μＭ）。Pax4（＋／−）胚の膵臓におけるLacZの発現は、出生時まで続いた。ヘテロ接合性新生児の膵臓では、lacZ活性は、LacZとインスリンとの同時発現によって判定した場合に、ランゲルハンス島内のβ細胞に相当する不連続な領域に制限されていることが判った（図1Cおよびｄ）。
Pax4欠損の子孫が予想どおりのメンデル分布で生まれた。このことは、Pax4の不存在が子宮（utero）では致命的ではないことを示している。出生時、Pax4（−／−）マウスは正常に見え、その同腹子と区別できなかった。しかし、48時間後、それらには成長の遅れが現われ、脱水症状を示した（図1c）。Pax4欠損マウスは生後３日間以内に全て死亡した。このことは、突然変異型表現型の完全な浸透度を実証している。新生児Pax4（−／−）マウスの膵臓は肉眼で見たところ正常な外観を示した。Pax4（−／−）突然変異体マウスの膵臓におけるLacZの発現についても調べた。E10.5（−／−）胚では、ヘテロ接合性胚と同じように、LacZ活性は背側膵の細胞内で検出された。Pax4（＋／−）および（−／−）胚の発生途中の膵臓では、ほぼE16.5まではLacZ活性の発現に差異は全く見られなかった。しかしながら、この後、Pax4欠損マウスの膵臓では、LacZの発現は低下し始め（図2a、ｂと2e、ｆとを比較せよ）、出生後は検出不可能になった（図2dと2gとを比較せよ）。
実施例3:Pax4ターゲティング化マウスにおけるインスリンおよびグルカゴンの発現
膵臓において、全ての内分泌細胞は共通の多能性前駆細胞から発生する（Alpert,Cell 53（1988）,295−308）。インスリンおよびグルカゴンを含む最初の前駆細胞はE9.5付近に現れる［Gittesら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89（1992）,1128−1132;Teitelmanら,Development 118（1993）,1031−1039］。マウスの膵臓において、外分泌細胞および大部分の内分泌細胞の分化は、発生のE16.5付近で始まる［Githens,The Pancreas:biology,pathobiology,and disease.第２版，（編集:Vay Liang W.Goら）Raven,New York,（1993）,21−73］。出生時、インスリンの産生は、主に完全に分化したβ細胞（ランゲルハンス島の中心に位置する）に限られる。これらは、グルカゴン産生α細胞によって囲まれている。β細胞は、大部分が内分泌集団であるが、α細胞ではほんの一部がそれに該当するにすぎない（Slack,Development 121（1995）,1569−1580）。本出願人らは、Pax4ヘテロ接合性およびPax4ヌル突然変異体マウスの膵臓におけるインスリンおよびグルカゴンの発現について、文献に記載［Oliverら,EMBO J.7（1988）,3199−3209］のようにして行なわれるパラフィン切片についての免疫化学によって試験した。
E10.5では、インスリン産生細胞は、Pax4（＋／−）および（−／−）胚の膵臓において検出された。E16.5ヘテロ接合性胚では、全てのインスリン細胞は、LacZ活性の領域内に含まれていることがわかった（図2a）。先に述べたように、ヘテロ接合性新生児マウスでは、LacZおよびインスリンは同じ細胞内で検出され（図2c）、このことは、発生の後期のPax4発現がインスリン産生β細胞に限られることを示している。これに対して、Pax4（−／−）E16.5胚および新生児マウスの膵臓では、インスリン産生細胞は、検出されたとしてもほんの少ししか検出されなかった（図2e、ｇ）。このことは、Pax4の不存在下で膵β細胞の成熟が影響を受けたことを示している。E10.5（＋／−）および（−／−）胚の膵臓では、グルカゴンを含む細胞が存在している。ヘテロ接合性E16.5胚では、細胞中にグルカゴンが検出され、その大部分はLacZ活性領域内に含まれていた（図2b）。新生児ヘテロ接合性膵臓では、グルカゴンはLacZが発現される領域周辺の細胞中に存在していたが、該領域の内部には含まれていなかった（図2d）。Pax4（−／−）E16.5胚および新生児マウスの膵臓では、かなり多数のグルカゴン産生細胞が見出された。これらの細胞もまた、異常に密集した分布を示した（図2fおよびｈ）。
実施例4:Pax4ターゲティング化マウスにおけるPdx1の発現
Pax4欠損新生児マウスの膵臓にはβ細胞が存在しないことをさらに確認するために、特異的なβ細胞マーカーであるPdx1の発現を試験した。この遺伝子は、膵臓発生の非常に初期に（おそらくは最も初期の膵前駆細胞中に）見られるが、後期では完全に分化したβ細胞に限られる（Guzら,Development 121,11−18（1995）;Millerら,EMBO J.13（1994）,1145−1156）（図3c）。その初期の発現は、E10.5マウス胚のホールマウント免疫染色法（whole−mount immunostaining）により確立されたプロトコール（Ohlssonら,EMBO J.13（1994）,1145−1158）を用いてアッセイした。但し、脱色は24時間とした。染色後、E10.5胚を後固定し、ゼラチン−BSAマトリックスに包埋し、ビブラトーム（vibratome）で薄切した。クリオスタット切片上での免疫染色による新生児膵臓でのPdx1発現は、先に記載のようにして、次にような改変を加えて行った。すなわち、新生児膵臓は４％パラホルムアルデヒドで３時間固定し、次に30％ショ糖（PBS中）で一夜凍害防御した。二次抗体を洗い出した後、切片を0.6％H₂O₂で20分インキュベートした。E10.5では、Pax4（＋／＋）および（−／−）胚の両方の膵臓において、Pdx1は同様に発現した（図3a、ｂ）。しかしながら、Pax4欠損新生児マウスの膵臓では、Pdx1発現は検出されなかった。このことは、Pax4ヌル突然変異体マウスの膵臓には成熟β細胞が存在しない、という最初の結論を確証するものである。また、Pax4は最も初期の内分泌前駆細胞の生産には必要ではないかもしれないが、β細胞の分化には非常に重要であることも示唆される。
実施例5:Pax4ターゲティング化マウスにおけるソマトスタチンの発現
マウス胚形成中に、ソマトスタチン産生細胞はα細胞やβ細胞よりも遅れて分化を始める（Teitelmanら,Development 118（1993）,1031−1039）。Pax4（＋／＋）新生児マウスの膵臓では、ソマトスタチン産生δ細胞は主に島の周辺部に分布し、α細胞と入り混じっていた（図3e）。このことは、Pax4の不活性化もまたδ系譜の成熟に影響を及ぼしたことを示唆している。しかし、消化管におけるソマトスタチンの発現は影響を受けていないように思えた。
実施例6:Pax4ターゲティング化マウス由来の新生児膵臓の組織学的分析
外分泌膵臓は、小葉に分かれた分枝状の細葉状腺であり、ピラミッド型の分泌細胞と基底核（basal nuclei）とを有する（Pictet,Devel.Biol.29（1972）,436−436）（図4a）。新生児Pax4（−／−）膵臓の組織学的分析から、この腺には外分泌組織が存在することが示された。しかし、外分泌細胞の細胞質は拡大していると思われ、それらの核は均一な基底状態の分布（basal distribution）は示さなかった（図4b）。３日齢の野生型マウスの膵臓を特定の外分泌酵素（α−アミラーゼ）の存在について分析したところ、大部分の外分泌組織がそのようなマーカーの発現を殆ど、または全く示さなかった（図4c）。このことが、通常は哺乳の後で生じる外分泌消化酵素の欠乏を最も反映しているようである（Githens,The Pancreas:biology,pathobiology,and disease.第２版（Vay Liang W.Goら編）Raven,New York,（1993）,21−73）。出生時、Pax4欠損マウスは、胃がミルクで満たされているので、乳を吸うことができる（図1c）。しかし、３日齢のPax4（−／−）膵臓は、全ての外分泌細胞においてα−アミラーゼの強い発現を示し、このことは、それらが酵素を消化管に分泌することができなかったであろうことを示すものである（図4d）。
上記の実施例の結果から導かれる、膵細胞の発生に及ぼすPax4およびPdx1遺伝子の影響についての結論を図５に示す。
実施例7:ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax4突然変異体新生児マウスの膵臓におけるインスリンおよびグルカゴン濃度
ヘテロ接合性またはホモ接合性新生児Pax4−LacZマウスから得た完全な膵臓におけるインスリンおよびグルカゴン産生をラジオイムノアッセイ（RIA）で定量した。野生型動物とヘテロ接合性動物とのインスリンまたはグルカゴン濃度には有意な差は見られなかった（図６）。ところが、ホモ接合性動物ではインスリン濃度は著しく、かつほぼ完全に失われたが、グルカゴンレベルは３倍に増大していることが認められた。これらの結果は免疫化学により得られた結果（実施例３）と合致しており、Pax4が欠損している突然変異型動物の膵臓にはβ細胞がほぼ完全に存在せず、正常値より多いα細胞集団が存在することを実証している。これらの観察結果から、Pax4が膵臓の発生過程でのβ細胞の形成に必要とされることが実証される。
インスリンについてのRIAは、Linco Researchから販売されているキット（カタログ番号RI−13K）を使って製造業者の説明書にしたがって実施した。野生型および突然変異型マウスから妊娠e19で帝王切開により生まれる直前に膵臓を摘出した。個々の膵臓を酸抽出緩衝液（80mlエタノール,17.9ml蒸留水,2.1ml濃HCl）40μｌ中に入れ、氷上で音波処理してそれらのタンパク質内容物を抽出した。４℃で一夜インキュベーション後、サンプルを13000rpmで15分遠心した。次に上清を新しい試験管に移し、1:1000から1:10,000に希釈した各タンパク質抽出物についてRIAを実施した。簡単に述べると、各希釈抽出物100μｌをラット・インスリン抗体100μｌおよび¹²⁵I−インスリン標識100μｌと共に４℃で18時間インキュベートした。次に、サンプルを1mlの沈殿用試薬中４℃で20分沈殿させ、2000rpmで15分遠心した。上清をデカントし、ペレットをシンチレーションカウンターで計数した。グルカゴンについてのRIAは、Linco Researchから販売されているキット（カタログ番号GL−32K）を使って製造業者の説明書にしたがって実施した。新生児野生型および突然変異型膵臓から上記のようにタンパク質を分離し、各希釈サンプル100μｌをラット・グルカゴン抗体100μｌと共に４℃で18時間、続いて¹²⁵I−グルカゴン標識100μｌと共に４℃で24時間インキュベートした。次に、サンプルを1mlの沈殿用試薬中４℃で20分沈殿させ、2000rpmで15分遠心した。上清をデカントし、ペレットをシンチレーションカウンターで計数した。
実施例8:膵臓腫瘍細胞系におけるPax4の発現
各種のインスリノーマ（RIN 5F,βTC1）、グルカゴノーマ（αTC 1−９）、ソマトスタチノーマ（RIN 14β）、島腫瘍（HC 13,HC 13T,RINm）、腺管癌（mPAC）および腫瘍AR42J細胞系におけるPax4発現レベルを分析した（図７）。βTC1およびαTC 1−９細胞系では低レベルのPax4発現が検出され、これは正常マウスのβ細胞における内分泌の低レベル発現を反映するものであった。RINm、RIN 5F、RIN 14β、HC 13TおよびmPac細胞系では発現は全く認められなかった。
興味深いことに、膵臓の外分泌組織中の腫瘍に由来するAR42J細胞［Christophe J,Am.J.Physiol.266（1994）,G963−G971に概説されている］では高レベルのPax4発現が検出された。さらに、この細胞系では第二の大きなRNAメッセンジャー転写物が検出され、このことは、Pax4の対立遺伝子の１つにおいてゲノム修飾されている可能性を示唆している。Pax遺伝子が関与する染色体再編成は、肺胞性（alveolar）横紋筋肉腫のような特定の腫瘍の発生と関連がある［Galiliら,Nature Genetics 5（1993）,230−205;Davisら,Cancer Res.54（1994）,2869−2872］。AR42J細胞で得られた結果から、そうした染色体再編成がPax4遺伝子座内で起こって、該タンパク質の特性を改変し得ること、そして腫瘍表現型に関連し得ることが示唆される。
各種細胞系における発現レベルは、例えばSambrookら"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1989に記載のような慣用のノーザンブロット分析法によって評価した。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、1mlのホモジナイズ用緩衝液（3M LiCl、6M尿素、0.1％SDS）を含む試験管に移し、氷上で20秒間３〜４回音波処理した。４℃で一夜インキュベーションした後、溶解物を18600rpmで30分間遠心分離した。RNAペレットを1mlの3M LiCl中で２回洗浄し、500μｌの可溶化緩衝液（10mM Tris−Cl pH7.5,0.5％SDS）に溶解し、フェノール−クロロホルム抽出により精製し、続いてエタノール沈殿を行った。20μｇのRNAがアガロースゲル上で移動し、標準ノーザンブロットプロトコールに従ってナイロン膜に転写した。次に、膜をマウスPax4 cDNAプローブ（EMBL受託番号Y09584）、マウス・グルカゴンcDNAプローブ（EMBL受託番号Z46845）またはラット・インスリンcDNAプローブ（EMBL受託番号J04807）のいずれかを用いてハイブリダイズさせた。細胞系RINm（カタログ番号CRL−2057）、RIM 5F（カタログ番号CRL−2058）およびRIN 14β（カタログ番号CRL−2059）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。細胞系βTC1、αTC 1−９、HC 13、HC 13TおよびmPacはRip1Taq2トランジェニックマウス［Hanahan,D.,Nature 315（1985）,115−122］から慣用の組織培養法を用いて単離できる。細胞系AR42Jは、ラット膵臓由来のアザセリン誘導悪性小節から誘導できる［Longneckerら,Cancer lett.7（1979）,197−202］。
実施例9:別のPax4 cDNA配列のクローニング
β細胞cDNAライブラリーから別のPax4 cDNA配列を単離した。この配列（配列番号17）は、1131位の後ろにヌクレオチドＧが付加されていること以外は配列番号１に示すヌクレオチド配列と同一であり、その付加の結果、1214位で別の転写終結コドンを利用することになった。したがって、こうして得られた配列番号17により生じるタンパク質のＣ末端中の11個のアミノ酸は修飾され、配列番号１によって生じるタンパク質と比較した場合にアミノ酸17個分だけ長くなっている。
β細胞cDNAライブラリーは、βTC1細胞系から、Stratagene社製のZAP−cDNA合成キット（カタログ番号200400）を用い、製造業者の説明書に従って作製できる。このライブラリーの約１×10⁶のクローンをプレートし、ナイロン膜に写し取り、高ストリンジェンシー下で³²P標識Pax4プローブ（EMBL受託番号Y09584）を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは６×SSPE、５×Denhardts、0.5％SDS、0.1mg/ml変性サケ精子DNA中で65℃で一夜行い、続いて、２×SSC/0.5％SDS中で65℃にて30分間の洗浄を２回、そして0.1×SSC/0.5％SDS中で65℃にて30分間の洗浄を１回行った。陽性のクローンをプラーク精製し、得られたcDNA配列をStratagene社製の迅速切出キット（rapid excision kit）（カタログ番号211204）を用いて単離した。ヌクレオチド配列は、標準シークエンス法を用いて、例えばSambrookら，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1989に記載のようにして得た。
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲により規定される本発明は、上記説明において示した特定の細部により限定されるものでなく、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多くの明らかな変更が可能であることを理解すべきである。
配列表
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:1275塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:166..1161
（xi）配列：

（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:332アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：

（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:2481塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:163..1470
（xi）配列：

（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:436アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：

（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号15の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号16の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:19塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（Ａ）記載:/desc＝オリゴヌクレオチド
（xi）配列：

（２）配列番号17の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:1280塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:168..1214
（xi）配列：

（２）配列番号18の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:349アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：

Claims (19)

1. 哺乳動物の膵細胞の分化状態をin vitroで試験する方法であって、
   （ａ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
   （ｂ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
   （ｃ）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
   ことを含んでなる方法。
2. 非ヒト哺乳動物の膵細胞の分化状態をin vivoで試験する方法であって、
   （ａ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ／または
   （ｂ）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認し、そして
   （ｃ）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、
   ことを含んでなる方法。
3. 前記哺乳動物が、
   （ｉ）胚体期、
   （ii）新生児期、または
   （iii）成体期、
   にある、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記哺乳動物がマウスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１または３に記載の方法。
6. ステップ（ａ）の前記確認を、
   （ｉ）Pax4遺伝子の少なくとも一部に一致する核酸配列、
   （ii）（ｉ）の核酸配列に相補的な核酸配列、または
   （iii）（ｉ）もしくは（ii）の核酸配列とハイブリダイズするプライマーまたはプライマー対、
   を用いて行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップ（ｂ）の前記確認を、Pax4タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを使用して行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記膵細胞がβ細胞またはδ細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記分化状態が膵細胞の悪性腫瘍の指標となる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. （a'）前記試験に先立って、ヒトを除く前記哺乳動物から固形膵臓腫瘍を摘出すること、および
    （b'）前記試験後、Pax4遺伝子が過剰発現している場合は、前記腫瘍の細胞における前記遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除すること、またはPax4遺伝子が過少発現しているか発現していない場合は、前記遺伝子の発現を促進すること、もしくは発現可能な機能性Pax4遺伝子を前記細胞に導入すること、および
    （b''）ステップ（b'）の産物として得られた細胞を前記ヒトを除く哺乳動物に再導入すること、
    をさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記β細胞の分化状態が若年性糖尿病の指標となる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記β細胞の分化状態を胚体または新生児の状態で試験する、請求項11に記載の方法。
13. ヒトを除く前記新生児を、前記若年性糖尿病を好転または軽減する薬剤で治療することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
14. 前記分化状態が薬剤の活性または遺伝子治療法の結果である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記薬剤がmRNAまたはタンパク質のレベルでPax4遺伝子の発現レベルに影響を与える、請求項14に記載の方法。
16. Pax4ノックアウトマウスで前記分化状態を試験する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
17. in vitroで膵管上皮細胞に発現可能な機能性Pax4遺伝子を導入することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
18. 少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
19. マウスまたはラットである、請求項18に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。

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