PT1342410E

PT1342410E - Utilização de um agonista de galanina na preparação de um medicamento para melhorar a memória e outras funções cognitivas

Info

Publication number: PT1342410E
Application number: PT02028584T
Authority: PT
Inventors: David Wynick
Original assignee: Neurotargets Ltd
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2010-05-11
Also published as: WO1998003059A1; GB2331301C; AU3630297A; DK1342410T3; EP0918455B1; ES2196349T3; DK0918455T3; JP2000516212A; EP1342410B1; GB9901264D0; GB2331301B; DE69721005D1; EP1342410A3; ATE237346T1; PT918455E; DE69739760D1; DE69721005T2; GB2331301A; EP1342410A2; EP0918455A1

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE UM AGONISTA DE GALANINA NA PREPARAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA MELHORAR A MEMÓRIA E OUTRAS FUNÇÕES COGNITIVAS" A invenção refere-se à galanina, incluindo os seus análogos e suas utilizações. A galanina é um neuropéptido de 29 aminoácidos que foi isolado pela primeira vez a partir do intestino do porco, em 1983. Depois disso fez-se a clonagem do ADNc da galanina a partir de um banco da pituitária anterior do rato, em 1987. A análise das sequências de nucleótidos e de aminoácidos sugere que a galanina não está relacionada com nenhuma das outras familias conhecidas de péptidos reguladores, continuando a ser o único membro desta familia. A porção do terminal N da galanina é altamente conservada entre espécies, havendo uma variação na porção do terminal C. A galanina está profusamente distribuída nos sistemas nervosos periférico e central, no intestino e no pâncreas. Existe em concentrações elevadas na saliência mediana do hipotálamo e na pituitária. 0 documento W092/12997 (General Hospital Corporation), publicado em 1992, divulga a sequência da galanina humana. Estão a ser analisados estudos de outros autores que prevêem a administração da galanina do rato ou dos seus fragmentos do terminal N, para aumentar o efeito da morfina, sugerindo esse pedido de patente de invenção que é previsível que a galanina 1 tenha efeitos analgésicos tais que possa ser administrada por si só ou em combinação com outros analgésicos. 0 pedido reivindica a utilização da galanina ou dos seus análogos, para o tratamento da dor e a utilização de antagonistas da galanina para o tratamento de outras patologias. 0 documento W092/20709 (Astra AB) divulga diversos antagonistas putativos da galanina. Os antagonistas que são ali descritos têm todos por base os primeiros 12 aminoácidos da galanina, a que se seguem sequências parciais de outros péptidos, i. e., péptidos quiméricos. Alguns podem ser agonistas, outros podem ser antagonistas e outros ainda podem ser de ambas, dependendo do subtipo de receptor. 0 pedido divulga que os antagonistas podem ser úteis para o tratamento de patologias associadas à insulina, à hormona do crescimento, à acetil-colina, à dopamina, à Substância P, à Somatostatina e à noradrenalina, incluindo as doenças do foro endocrinológico, ingestão alimentar, neurológico e psiquiátrico, demência de tipo Alzheimer, analgesias, doenças intestinais. 0 pedido divulga os resultados de estudos em que são utilizados alguns dos antagonistas ali descritos para se obter diversos efeitos, tais como a inibição, determinada pela galanina, da libertação de insulina estimulada pela glucose; a inibição, induzida pela galanina, da libertação da Ach do hipocampo induzida pela escopolamina; a facilitação, induzida pela galanina, do reflexo flexor; e o deslocamento da galanina iodada ligada, em estudos de ligação membranares. Há uma sugestão nesse pedido, em que se admite que os antagonistas possam ser prescritos para analgesia, mas no pedido não há nenhuma divulgação relativa a este efeito.

Aproximadamente 2-4% da população Ocidental padece de diabetes mellitus e entre estas pessoas há 10-15% que padecem de 2 dores crónicas e dormência nas suas extremidades, designada por "neuropatia dolorosa". As técnicas actuais para o combate à neuropatia dolorosa são inadequadas. A doença de Alzheimer é uma causa muito importante de morbidade em todo o mundo, sendo esta doença caracterizada pela perda de memória e por alterações da personalidade. Ao nível anatómico há uma diminuição muito significativa do número de nervos colinérgicos no córtex cerebral basal e no hipocampo, que são as zonas principais do cérebro que, presumivelmente, armazenam dados em memória e com eles executam operações. Trabalhos anteriores comprovaram que a galanina também é expressa nestes nervos do hipocampo e que as concentrações de galanina são duas vezes mais elevadas nos cérebros de doentes com doença de Alzheimer. A invenção refere-se a um método para melhorar a memória, aumentar a memória e melhorar a função cognitiva, compreendendo a administração de um agonista de galanina a um indivíduo. De um modo vantajoso, tal tratamento pode ser utilizado no tratamento da restauração da memória após lesão, trauma ou na doença de Alzheimer. A presente invenção proporciona a utilização de um agoniste de galanina na preparação de um medicamento para o tratamento da doença de Alzheimer e doenças e estados relacionados, e para aumentar a memória e a função cognitiva.

Seguidamente serão descritas formas de realização da invenção apenas a título exemplificativo, com referência os desenhos anexos, as Figuras 1 a 9 nas quais: 3 a Fig. 1 ilustra a estrutura genómica da galanina do murganho, a Fig.2 ilustra o vector de direccionamento utilizado para a produção do roedor da presente invenção, a Fig.3 ilustra o evento de recombinação específico na produção do roedor em conformidade com a invenção, a Fig.4 ilustra o genotipo da progenia, determinado utilizando a metodologia de análise por transferênciade Southern e por PCR, demonstrando a existência de resultados idênticos a partir da mesma ninhada proveniente de um acasalamento de dois animais heterozigóticos, a Fig.a 5 ilustra efeito da inactivação da galanina sobre a regeneração de curto prazo dos neurónios sensoriais, a Fig.6 ilustra o efeito da inactivação da galanina sobre a regeneração de longo prazo de neurónios sensoriais, a Fig.7 ilustra a expressão de uma ribossonda específica do exão 6 para se estudar a distribuição dos neurónios galaninérgicos no cérebro e no gânglio da raiz dorsal de murganhos de tipo natural e de murganhos mutantes, a Fig.8 ilustra os efeitos da inactivação da galanina sobre a geração de uma potenciação de longo prazo na zona do stratum radiatum do hipocampo; e a Fig.9 ilustra os efeitos da inactivação da galanina sobre a geração da potenciação de longo prazo na zona do stratum oriens do hipocampo. 4

Para se gerar uma mutação num murganho, isto é, para se introduzir num genoma de um murganho quer uma mutação de um locus de um gene especifico com perda de função ou com ganho de função (de acordo com o processo descrito por Kuehn, M. R. et al., Nature, 1987; 326:295-8; Thomas, K. R. e Capecchi, M. R. em Nature, 1986; 324:34-8), são necessários vários passos: (1) a clonagem do locus relevante genómico do murganho; (2) a construção de um vector de direccionamento, de tal modo que o locus/gene de interesse seja modificado para inactivar ou alterar a sua estrutura e a sua função de alguma forma; (3) a introdução do vector de direccionamento num banco de células estaminais embrionárias e a selecção e a identificação de clones de células singulares onde o evento de direccionamento adequado, correcto tenha tido lugar e onde tenha ficado inalterado o número de cromossomas; e (4} a introdução desses clones em blastócitos com 3,5 dias de idade com o acasalamento dos murganhos quiméricos resultantes com tipos naturais do sexo oposto. A descendência resultante demonstrou ser portadora da mutação, pelo que são assim seres heterozigóticos e graças a um acasalamento adequado são criados seres homozigóticos relativamente à mutação introduzida.

Como um primeiro passo efectuou-se a clonagem do gene da galanina dos murinos. Efectuou-se uma pesquisa da biblioteca genómica de murganhos (Ehrich, E. et al., Gene, 1987; 57:229-37) utilizando como uma sonda o ADNc de galanina de rato com o comprimento completo, em condições de elevado rigor. Foram identificados dois clones cosmidicos com uma extensão de 60 kB em torno do locus da galanina. Utilizando sondas de 5' e de 3', obtidas a partir do ADNc do rato, efectuou-se a subclonagem de uma região de 14 Kb de ADN que continha o gene completo, tendo 5 sido feita a sua sequenciação parcial. A partir da sequência genómica foram concebidos iniciadores complementares para as regiões exónicas não traduzidas do gene. Foi gerado um fragmento de 630 pb por PCR-TR (kit fornecido por INVITROGEN BV, Holanda), utilizando como fonte de ARNm o cérebro intacto de uma fêmea adulta. A sequenciação subsequente deste fragmento demonstrou que as galaninas do murganho e do rato são 100% idênticas ao nível das proteínas e 94,8% idênticas ao nível dos nucleótidos. A estrutura genómica do gene do murganho (Fig. 1} é idêntica à do gene do rato. O gene abrange 4,8 Kb e consiste em seis exões. O local de início da tradução (AUG) começa na primeira base do segundo exão e a região codificadora para a galanina desenvolve-se através dos exões, terceiro e quarto ficando o codão de paragem (UGA) no meio do sexto exão.

Utilizando o subclone de 14 Kb descrito acima, construiu-se um vector de direccionamento para selecção positiva/negativa (Fig. 2) . A mutação introduzida remove os primeiros cinco exões que contêm a região codificadora completa do péptido de galanina (Fig. 3) .

Na figura 3, A e B são os locais das sondas externas utilizadas para a pesquisa das células de ES para a integração adequada do arquétipo.

Neo = gene de resistência à neomicina

VHS-TK = vírus do herpes simplex-gene da timidina-cinase B = Bamhl E = EcoRI X = Xhol Bg = BglII 6

Em particular, o gene de direccionamento remove um segmento de 3,2 Kb do ADN e, conseguentemente, remove os primeiros 5 exões do gene da galanina. Os locais exactos que flanqueiam o segmento de ADN removido são o local de S' do BamRI que fica 10 pb a jusante do local de inicio da transcrição e o local de 3' é o local de Bgll no meio do intrão 5. Estes locais estão indicados com asteriscos na Fig. 3. Outros locais que poderiam ser utilizados são o mesmo local de 5' e um local diferente de Xhol de 3' no intrão 4 que poderia remover apenas 2,9 Kb do ADN e poderia, por isso, remover apenas os primeiros 4 exões.

Este vector foi linearizado e submetido a uma operação de electroporação na linhagem de células estaminais embrionárias (EE) E14 (Hooper, M. et al., Nature, 1987, 326:292-5). A cartografia de restrição do locus de tipo natural com BglII gera um fragmento de 9,3 Kb quando hibridado com uma sonda externa de 5' (marcada com A na Fig. 3), ao passo que o locus correctamente identificado gera um fragmento de 4,4 Kb. No total, foram

identificados 9 clones nos quais um alelo do gene da galanina foi correctamente identificado por recombinação homóloga entre 209 colónias duplamente resistentes, determinando uma frequência de marcação de 4,3%. Estes nove clones foram cariotipifiçados, confirmaram a euploidia e foram injectados em blastócitos com 3,5 dias de idade de murganhos da estirpe C57/BL/6. A transmissão da linhagem germinativa do locus da galanina destruído foi obtida a partir de três clones separados de células EE. Determinou-se o genotipo da progenia utilizando a metodologia de análise por transferência de Southern e por PCR (a Fig. 4 demonstra resultados idênticos obtidos pela metodologia de análise por transferência de Southern e por pesquisa por PCR na mesma ninhada obtida a partir de um acasalamento de dois animais heterozigóticos). A mutação 7 prosseguiu com uma procriação até â homozigoticidade na estirpe de serotipo-129 sv e todos os dados apresentados são do murganho com esta formação. 1. Os resultados da análise dos genotipos dos nascituros vivos estão dentro da proporção prevista pelas leis da genética de Mendel, com uma razão entre sexos igual a 1;1. Foram medidas as concentrações de galanina por meio de radioimunoensaios e por imunocitoquímica em zonas onde previamente se havia demonstrado que havia expressão da galanina a concentrações elevadas, tendo sido incluídos o cérebro, a pituitária, a medula espinal, o gânglio da raiz dorsal, o estômago, o intestino delgado e o útero. As concentrações de galanina nos animais heterozigóticos relativamente à supressão foram 50% das contraprovas de tipo natural, ao passo que as concentrações de galanina nos animais homozigóticos relativamente à supressão foram indetectáveis em todos os casos.

Na Tabela 1 estão indicados os dados de comparação das concentrações da expressão de galanina entre murganhos de tipo natural, heterozigóticos e mutantes, em vários tecidos corporais.

Tabela 1

Genotipo Córtex Hipotálamo Pituitária anterior Estômago Duodeno íleo + / + 5,78±0,33 110,34±7,81 0,42±0,07 27,46±1,91 122,90±11,60 267,43+13,46 + /- 2,91±0,21 53,82±3,76 0,21±0,04 13,8±0,83 68,36±5,67 125,8717,55 ND ND ND ND ND ND

Todos os valores são valores médios de galanina-LI pmol/g ± SEM, excepto no caso da pituitária anterior das fêmeas, em que o valor é expresso em pmol/glângula ± SEM ND = Não detectável.

Verificar-se-à que a galanina não foi detectada em nenhum dos tecidos testados nos murganhos mutantes homozigóticos e que diminuiu em 50% nos murganhos mutantes heterozigóticos.

2. Mediu-se as aptidões regenerativas dos axónios sensoriais nos nervos ciáticos directamente pelo teste do beliscão (Danielsen, N., Kerns, J. M., Holmquist, B., Zhao, O., Lundborg, G. & Kanje, M. Brain Res. 681, 105-108, 1995). A seguir ao esmagamento dos nervos, os axónios sensoriais regeneram-se, dando origem a nervos distais e podem ser estimulados por outro beliscão subsequente dos nervos, que induz uma resposta motora reflexa abdominal. Os primeiros axónios regenerativos são localizados beliscando segmentos consecutivos do nervo num sentido que progride desde uma posição distai até uma posição proximal, até se observar um reflexo, sendo calculada a distância a partir do local de esmagamento do nervo. Num exemplo comparativo, a regeneração comprovou a existência de uma redução estatisticamente significativa da ordem de 30-40% nos animais homozigóticos comparativamente com os murganhos de tipo selvagem, aos 2, 4 e 6 dias após o esmagamento dos nervos (Fig. 5). A regeneração foi intermédia nos murganhos heterozigóticos, mas continuou a ser significativamente diferente dos animais de tipo selvagem.

Para se testar a hipótese de uma taxa reduzida de regeneração afectar, em murganhos com falta de galanina, a 9 recuperação funcional a seguir a uma lesão por esmagamento, testou-se uma correlação de regeneração comportamental, utilizando o índice de desdobramento dos dedos das patas (Hoogeveen, J.F., Van Der Kracht, A.H., Wondergem, J., Gonzalez Gonzalez, D. & Haveman, J. Neurotoxicology, 14, 1-7, 1993) . Os roedores desdobram os dedos das suas patas traseiras quando estes entram em contacto com uma superfície sólida, o que é uma resposta que exige enervação sensorial. Assim, os dedos deixam de se desdobrar a seguir a uma axotomia, até ocorrer nova enervação dos axónios sensoriais. Mediu-se a distância de desdobramento durante 6 semanas após o esmagamento unilateral do nervo ciático direito e fez-se a comparação com a pata lateral correspondente intacta (pata esquerda). 0 desdobramento dos dedos nos murganhos de tipo natural regressou à situação normal em menos de 3 semanas após o esmagamento do nervo ciático, mas a regeneração funcional continuou incompleta ao fim de seis semanas nos murganhos mutantes (Fig. 6). 3. A menor regeneração e a menor autonomia nos murganhos com falta de galaninas podem estar eventualmente relacionadas com a morte dos neurónios a seguir à axotomia, especialmente aqueles neurónios com aptidão para a expressão normal de galanina a seguir à lesão. Num outro exemplo comparativo, para se testar a hipótese de a galanina ser essencial à sobrevivência dos neurónios durante o desenvolvimento, estudou-se a distribuição de neurónios galaninérgicos em murganhos de tipo natural e em murganhos mutantes. Uma vez que não se conseguiu visualizar os neurónios galaninérgicos nos animais mutantes ao nível das proteínas, estudou-se a expressão do ARNm, utilizando uma ribossonda específica para o sexto exão (marcada com B; ver a Fig. 3) . Para se confirmar a sobrevivência de outras populações de neurónios 10 em que há expressão da galanina, utilizou-se a ribossonda especifica do sexto exão para se visualizar os neurónios galaninérgicos no hipocampo e o núcleo paraventricular do hipotálamo de murganhos adultos de tipo natural e mutantes (Fig. 7). Não foram observadas nenhumas diferenças de expressão entre os grupos, sugerindo tal facto que o desenvolvimento neuronal foi normal nesses animais e não dependeu da galanina.

Utilizou-se, também, a ribossonda específica do sexto exão para estudar a distribuição dos neurónios galaninérgicos do GAD duas semanas após a axotomia do nervo ciático. Observou-se um nítido aumento, por externalização, das concentrações e do número de células em que há expressão da galanina nos neurónios do DRG dos murganhos de tipo natural (Fig. 7) . No entanto, não houve nenhuma expressão nos murganhos homozigóticos com falta de galanina, sugerindo que a galanina é necessária para que tais células sobrevivam à axotomia.

Estes resultados, referentes à regeneração e à sobrevivência das células, são particularmente significativos, na medida em que indicam que o gene da galanina é o primeiro gene a afectar a sistema nervoso periférico.

Assim sendo, a invenção contempla à utilização de um agonista da galanina para o tratamento de neuropatias sensoriais periféricas resultantes, por exemplo, de diabetes mellitus ou de traumas (tais como os que são provocados por acidentes rodoviários). 4. Presume-se que a galanina esteja implicada na etiologia da doença de Alzheimer. A expressão da galanina no hipocampo 11 é aumentada nos neurónios colinérgicos quando há um decaimento dos níveis de acetilcolina e de colina-acetil-transferase (ChAT). A administração de galanina reduz o comportamento de amestração em diversos modelos com murganhos, sendo também verdadeira a proposição inversa, aquando da infusão de antagonistas da galanina. Mediu-se a potenciação de longo prazo (LTP) em murganhos de tipo natural e em murganhos mutantes. A LTP é um teste electrofisiológico em que nervos específicos do hipocampo são estimulados por meio de um choque eléctrico: Davies CH, Collingridge GL. J. Physiol. Lond. 1996; 496:451-470; Davies CH, Starkey SJ, Pozza MF, Collingridge GL. GABA Nature 1991; 349: 609-611. Este processo é executado in vitro utilizando secções muito finas de cérebro de animais mortos recentemente. Os resultados mostram que a LTP diminui 50% no stratum oriens no instante correspondente aos 80 minutos nos animais mutantes, comparativamente com os murganhos de tipo natural (Fig. 9 A vs C) . Pelo contrário, não foi observada nenhuma LTP quando a medição foi feita no stratum radiatum. A galanina existe com concentrações elevadas no stratum oriens, mas não existe no stratum radiatum. Até ao momento presente os dados demonstram que uma diminuição da LTP nos mutantes implica uma diminuição da memória e das faculdades cognitivas - estão a ser efectuados testes para a avaliação destas funções. Estes dados comprovam que um agonista da galanina é útil para o tratamento da doença de Alzheimer e da perda de memória associada, determinando um aumento da memária e das faculdades cognitivas.

Lisboa, 4 de Maio de 2010 12

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agonista da galanina para a preparação de um medicamento para melhoramento da memória e outras funções cognitivas.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para o tratamento da doença de alzheimer. Lisboa, 4 de Maio de 2010 1