DE69225706T2

DE69225706T2 - Humanes galanin, cdna-klone die für humanes galanin kodieren und eine methode humanes galamin herzustellen

Info

Publication number: DE69225706T2
Application number: DE69225706T
Authority: DE
Inventors: Helen Frances Bondi Junction Nsw 2022 Evans; John Woolwich Nsw 2110 Shine
Original assignee: Garvan Institute of Medical Research
Current assignee: Garvan Institute of Medical Research
Priority date: 1991-03-06
Filing date: 1992-03-06
Publication date: 1998-11-26
Anticipated expiration: 2012-03-07
Also published as: WO1992015681A1; EP0587571A4; EP0587571B1; DE69225706D1; JPH06508984A; JP3135262B2; EP0587571A1; CA2105572A1; ATE166656T1

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit der Aminosäuresequenz von Human-Galanin, das sich von der Nukleotidsequenz von Human-Präprogalanin-cDNA ableitet. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin cDNA-Klone, die für das Peptid codieren. Darüberhinaus umfaßt die vorliegende Erfindung therapeutische Verwendungen des Peptids und die Verwendung des Peptids bei der Entwicklung von Galaninantagonisten und -Agonisten.

Hintergrund der Erfindung

Galanin ist ein mutmaßliches Neuropeptid, das erstmals 1983 (1) aus Schweindünndarm isoliert wurde. Galanin aus Schwein ist ein Peptid mit 29 Aminosäureresten, welches hinsichtlich seines N-terminalen Glycin- und amidierten C-terminalen Alaninrestes (1) benannt wurde. Die für Galanin codierenden cDNAs wurden aus drei Spezies kloniert, Ratte (2), Schwein (3) und Rind (4), wodurch gezeigt wurde, daß Galanin ein proteolytisches Produkt eines größeren Vorläuferproteins ist, das als Präprogalanin (2) bekannt ist. Galanin zeigt 90 % Homologie zwischen den Spezies, jedoch geringe Ähnlichkeit mit anderen bekannten Peptiden (1). Antikörper, die gegen Schweinegalanin gerichtet sind, erlaubten die Kartierung von galaninähnlicher Immunreaktivität (GAL-LI) auf diskrete Regionen des zentralen Nervensystems (ZNS) und über das gesamte periphäre Nervensystem (PNS) von verschiedenen anderen Spezies, einschließlich des Menschen.
Immunhistochemisches Kartieren von GAL-LI in dem ZNS wurde in der Ratte am intensivsten durchgeführt, worin die höchsten Konzentrationen in der Medianvorwölbung und dem Hypothalamus (5) gefunden wurden. Diese Ergebnisse stimmen überein mit den jüngeren in situ-Hybridisierungsuntersuchungen, worin die Lokalisation von Präprogalanin in dem Rattenhirn vorläufig die Beteiligung von Galanin an der Regulierung von verschiedenen Faktoren nahelegen, welche von dem Wassergleichgewichtsverhalten und der Nahrungsaufnahme bis zur Blutdruckkontrolle (6) reichen. Ähnlich zeigte der Radioimmunoassay von Galanin in dem Pavianhirn hohes GAL-LI in dem Hypothalamus und der Medianvorwölbung und ebenfalls GAL-LI in Verbindung mit limbischen Strukturen, wie etwa dem Amygdala (7). Die Immunhistochemie- und in situ-Untersuchungen von Präprogalanin-mRNA während der Entwicklung der Ratte hat gewebe spezifische Geschlechtsdifferenzierungen der Galaninkonzentration gezeigt, bemerkenswerterweise im Hypophysenvorderlappen (5), worin seine Expression östrogenabhängig ist (9). Die Gesamtverteilung von GAL-LI und seine Colokalisation in diskreten neuronalen Zellen mit Catecholaminen, Serotonin, GABA, Acetylcholin und verschiedenen anderen Peptiden (10) läßt stark eine Modulationsrolle von Galanin vermuten. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Koexistenz von Galanin mit Acetylcholin in Nervenfasern, welche sich von dem Basalvorhirn zum Ammonshorn erstrecken, in der Ratte (11) und im Pavian (7), was zu der Spekulation führte, daß Galanin eine Rolle bei der Alzheimer Krankheit spielen kann. Es bestehen jedoch widersprüchliche Hinweise, welche die Expression von Galanin in dieser Region des menschlichen Gehirns betreffen. Obwohl die physiologische Rolle von Galanin in dem ZNS bisher nicht nachgewiesen wurde, legt seine Pharmakologie eine Rolle bei der Neuroendocinregulierung nahe. Eine Injektion von Galanin in das dritte Ventrikel von Ratten bewirkt einen erhöhten Wachstumshormonspiegel (13) und eine Injektion in den paraventrikulären Kern (PVP) erhöht die Nahrungsaufnahme (14).
In dem PNS legt die Verteilung von GAL-LI nahe, daß Galanin weit verbreitet ist. Die Galaninverteilung und seine Pharmakologie, die unterschiedlich und häufig speziesspezifisch ist, lassen beide einen Bereich von physiologischen Wirkungen für Galanin vermuten. Jedoch kann bezüglich seiner pharmakologischen Rolle eine gewisse Verwirrung aufgetreten sein durch die Verwendung von Schweinegalanin in Versuchen, die andere Spezies umfassen. In zahlreichen Säugerspezies werden die höchsten Konzentrationen von GAL-LI in Darm (1), Pankreas (15), Nebennieren (3) und Respirationstrakten (16) und Urogenitaltrakten (17) gefunden. Die Galaninwirkung auf das Pankreas und seine mögliche Rolle bei der Diabetes ist umstritten; es wurde nachgewiesen, daß Schweinegalanininfusion in Hunde (15) und Ratten und Schweinegalaninperfusion durch das isolierten Rattenpankreas (18) Plasmainsulingehalte verringert. Jedoch bestehen widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Schweinegalaninwirkung auf das Schweinepankreas (19). Im Hund erniedrigt Galanin auch Somatostatin, während Glucagon erhöht wird, jedoch muß dies in anderen Spezies (15) nicht der Fall sein. Intravenös verabreichtes Schweinegalanin bewirkt eine Wachstumshormonsekretion in einer Vielzahl von Spezies, einschließlich Menschen. Jedoch bewirkt eine intravenöse Schweinegalanininfusion in Menschen mit einer Konzentration, die ausreichend hoch ist, um eine Erhöhung der Wachstumshormongehalte hervorzurufen, nicht die erwartete Inhibierung der Insulinsekretion (20). Die augenscheinliche Diskrepanz kann aufgrund des Unterschieds hinsichtlich der Aminosäuresequenz von Human- gegenüber Schweinegalanin bestehen oder kann einfach eine Wiederspiegelung der speziesspezifischen Wirkung von Galanin sein. Die Visualisierung von GAL-LI in Neuronen, die die Zellinseln von verschiedenen Spezies (15) inervieren, unterstützen zusammengenommen mit einem Vorschlag zur Erklärung der galanininduzierten Inhibierung der Insulinsekretion in Ratten- B-Zellinien (21) eine Neuromodulatinsrolle von Galanin auf die endokrine Pankreaswirkung. Andere pharmakologische Wirkungen von Galanin in dem PNS umfassen die speziesspezifische stimulierende oder inhibierende Wirkung von Galanin auf die Aktivität der glatten Muskeln von verschiedenen Säugerspezies (22).
Galaninrezeptoren wurden in einem Hamster-Insulinsektretierenden-B-Zell-Tumor (23), Ratten- (24) und Affenhirn (25) und Membranen der glatten Muskeln (22) nachgewiesen. Die Verteilung der Galaninbindung korreliert mit derjenigen von GAL-LI und unterstützt damit die Rolle von Galanin bei der Neurotransmission. Es ist weder klar ob Subtypen des Galaninrezeptors vorliegen, noch welche Region des Peptids verantwortlich für die Bindung an seinen Rezeptor ist.
Untersuchungen der biologischen Wirkung von tryptischen Fragmenten von Galanin auf Glattmuskelpräparationen (22), zusätzlich zu autoradiographischen Bindungsstudien an RINm5F- Pankreas-B-Zellinien (26) und an Darmmembranpräparationen (27) ergeben widersprüchliche Ergebnisse.
Die Molekularbiologie des Galaningens wurde bisher noch nicht in Menschen untersucht. Schweinepräprogalanin ist ein Protein mit 123 Aminosäureresten, das eine Signalsequenz, Galanin (29 Aminosäuren) und ein Peptid mit 59 Aminosäuren umfaßt, das als Galanin-mRNA-assoziiertes-Peptid (GMAP) bekannt ist. Die Länge und Struktur von Ratten-, Schweine- und Rinderpräprogalanin ist ähnlich. Der 20 %-ige Unterschied in der Galaninaminosäurehomologie zwischen den Spezies ist über das C-terminale Ende des Peptids manifestiert. Die Sequenz läßt in allen Spezies, in denen sie bis heute untersucht wurde, eine posttranslatorische Spaltung von mit Glycin verlängertem Galanin, gefolgt von einer Amidisierung vermuten. GMAP wird ebenfalls gut über die Spezies konserviert, was zu der Spekulation führte, daß es biologisch wirksam ist; es umfaßt eine Region von 35 Aminosäuren, die 78 % Homologie zwischen den Spezies zeigt und innerhalb dieser Region eine Strecke von 17 Resten, die größere Homologie zeigt.
Diese Erfindung offenbart die Isolierung und Charakterisierung von Human-Präprogalanin aus einer Neuroblastomzellinien- cDNA- Bibliothek und aus einer Hypophysen-cDNA-Bibliothek (28). Oligonukleotide, die komplementär mit zwei konservierten Regionen von Schweine- und Rattenpräprogalanin sind, wurden in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um spezifisch die entsprechende Sequenz von Neuroblastom- und HypophysencDNA zu amplifizieren. Die beiden verwendeten Amplifizierungsoligonukleotide (Nr. 1 und 2) entsprechen den Aminosäuren 29 bis 37 und 105 bis 97 von Ratten- bzw. Schweinepräprogalanin und flankieren eine Region mit 230 Basenpaaren, die für Galanin und den N-Terminus von GMAP (Figur 1) (29) codieren. Ein zusätzliches Oligonukleotid (Nr. 3) innerhalb dieser Region wurde verwendet, um die Sonde für das korrekte PCR-Produkt (30) zu sein. Die amplifizierte Region beider DNA-Quellen wurde subkloniert und dann sequenziert (31), wobei sich identische Sequenzen zeigten. Die von Neuroblastom-cDNA amplifizierte Region wurde als eine Sonde verwendet, um Klone zu isolieren, die für die vollständige Präprogalanin-cDNA aus dieser Bibliothek (32) codieren. Später wurde die Hypophysen-cDNA-Bibliothek mit der gleichen Sonde gescreent, um sicherzustellen, daß jegliche Aminosäureunterschiede, die zwischen Human-Präprogalanin und anderen Spezies auftreten, nicht auf die fehlerhafte Translation von DNA in der Neuroblastom-kultivierten Zellinie zurückzuführen sind.
Die Primärstruktur von Human-Präprogalanin-cDNA-Klonen, die aus beiden Bibliotheken isoliert wurden, war identisch, jedoch verschieden von derjenigen von Schwein, Kuh und Ratte. Im allgemeinen traten Aminosäuresubstitutionen nur an Positionen auf, die für Variabilität unter den anderen Spezies (Figur 2) angegeben sind, wobei bestätigt wird, daß Galanin und GMAP zu einem geringeren Ausmaß gut konserviert sind. Jedoch umfassen mehrere dieser Veränderungen (z.B. 17, 23 und 26 in Galanin) Aminosäuren mit sehr verschiedenen physikalischen und chemischen Eigenschaften, wodurch nahegelegt wird, daß derartige Veränderungen wichtig für die korrekte Funktion von Human-Galanin sind. Ebenfalls wichtig ist, daß Human-Galanin durch die auffallende Substitution eines Serinrestes für einen Glycinrest am C-Terminus von Galanin, direkt nachfolgend auf die Lys-Arg-Abspaltungsstelle in dem Vorläuferprotein, einzigartig gemacht wird. Dies impliziert, daß Human-Galanin an seinem C-Terminus nicht amidiert wird, im Gegensatz zu anderen Spezies, worin der Glycinerest als ein Amiddonor für den vorangehenden Rest nach Proteolyse dient. Folglich kann Human-Galanin eine Vielzahl von biologischen Eigenschaften aufweisen, die von Schweine-, Ratten- und Rindergalanin abweichen.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß besteht in einer ersten Hinsicht die vorliegende Erfindung aus einem Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS
oder einem funktionellen Äquivalent davon, das durch konservative Substitutionen, ausgewählt aus den folgenden: G, A; V, I, L, M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H; und F, Y, W erhalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Polypeptidfragment die Aminosäuresequenz
GWTLNSAGYLLGPHAVNHRSFSDKNGLTS
Der Ausdruck "funktionelles Äquivalent", wie er hier in Beziehung mit Polypeptidsequenzen verwendet wird, soll kleinere Variationen der Aminosäuresequenz umfassen, die keinen nachteiligen Effekt auf die biologische Wirkung des Polypeptids haben. Es wird durch den Fachmann in der Technik erkannt werden, daß eine Reihe von Modifikationen an den Peptid der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne nachteilig die biologische Wirkung des Peptids zu beeinflussen. Dies kann erreicht werden durch verschiedene konservative Substitutionen in der Peptidsequenz, wobei derartige Substitionen die biologische Aktivität des Peptids nicht wesentlich verringern. Unter den konservativen Substitutionen sind die vorgesehenen Substitutionen folgende: G, A; V, I, L, M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H; und F, Y, W. Es kann ebenfalls möglich sein, verschiedene Gruppen an das Peptid der vorliegenden Erfindung anzufügen, um Vorteile zu übertragen, wie etwa ein erhöhtes Potential oder eine verlängerte Halbwertszeit in vivo, ohne im wesentlichen die biologische Aktivität des Peptids zu verringern. Peptide, die konstruiert sind, um diese Funktionen auszuführen, sind als Galaninagonisten beschrieben. Diese Hinzufügungen und Veränderungen umfassen die Einführung von D-Aminosäureresten und die Bildung von cyclischen Analoga.
In einer zweiten Hinsicht besteht die vorliegende Erfindung in einem cDNA-Molekül, das für das Peptid der vorliegenden Erfindung codiert, wobei das cDNA-Molekül eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen wie in Figur 1 gezeigt ist, von Nukleotid 97 bis 186 oder eine funktionell äquivalenten Sequenz.
In einer dritten Hinsicht besteht die vorliegende Erfindung aus einem DNA-Molekül, das für Human-Präprogalanin und GMAP codiert, wobei das DNA-Molekül eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen wie in Figur 1 gezeigt ist oder eine funktionell äquivalente Sequenz ist.
Der Ausdruck "funktionell äquivalente Sequenz", wie er hier in Bezug auf DNA-Sequenzen verwendet wird, soll kleinere Variationen der DNA-Sequenz abdecken, die aufgrund einer Degeneration des DNA-Codes nicht zu der Sequenz führen, die für verschiedene Polypeptide codiert.
Weiterhin soll dieser Ausdruck Veränderungen des DNA-Codes umfassen, die zu Veränderungen des codierten Peptids führen, jedoch in welchem derartige Veränderungen die biologische Aktivität des Peptids nicht beeinflussen.
Eine verschiedene Halbwertszeit für Human-Galanin in vivo kann erwartet werden, zusätzlich zu Unterschieden in der Bindungsaffinität für spezifische Rezeptoren und somit ein verschiedenes Potential zwischen verschiedenen Spezies.
Von besonderem Interesse wird der Einfluß von Human-Galanin auf die Insulininhibierung sein. Infusion von sowohl Schweineals auch Rattengalanin über ein isoliertes Rattenpankreas zeigte, daß beide Galanintypen Insulin- und Somatostatinfreisetzung inhibierten, wenngleich Schweinegalanin eine geringere Potenz als Rattengalanin (18) zeigte. Zusätzlich verstärkt Rattengalanin die Glucagonsekretion, während Schweinegalanin keine Wirkung zeigte. Der Unterschied in der Aktivität von Schweine- und Rattengalanin wurde den 4 Aminosäureunterschieden zugeschrieben, die zwischen ihnen an ihrem C-Terminus bestehen. Ähnlich können die 5 Aminosäuren, die sich zwischen Human- und Schweinegalanin unterscheiden, zusammengenommen mit dem Unterschied aufgrund einer Amidierung, für den Verlust einer erwarteten Insulininhibierung verantwortlich sein, die beobachtet wird, wenn Schweinegalanin in Menschen (20) infundiert wurde. Dem entgegengesetzt, unter Bezugnahme auf die Galaninwirkung auf das Pankreas und andere Beispiele des speziesspezifischen Effekts von Galanin, wie etwa dem Effekt von Galanin auf den GI-Trakt, wird gezeigt, daß es vorzuziehen ist, Galaninhomologe auf die zu untersuchenden Spezies anzuwenden.
In einer vierten Hinsicht besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zum Herstellen von Human-Galanin, umfassend das Züchten einer Zelle, die mit dem cDNA-Molekül des zweiten oder dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung transformiert ist, unter Bedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz und das Gewinnen des Human-Galanins erlauben.
Wenngleich es möglich ist, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch biologische Mittel zu bilden, welche Rekombinationstechniken in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen umfassen, können die Polypeptide auch durch chemische Synthese gebildet werden. Die Entscheidung, welcher Syntheseweg gewählt wird, wird primär von der Länge des zu synthetisierenden Peptids abhängen.
Aus vorausgehenden Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß das Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine therapeutische Anwendung beim Modulieren der Pankreasaktivität als ein Stimulationsmittel des Wachstumshormons und als ein Dämpfungsmittel der Herzvagusfunktion hat.
Demgemäß besteht in weiteren Aspekten die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zum Modulieren der Pankreasaktivität, Stimulierung der Produktion von Wachstumshormon oder Dämpfung der Herzvagusfunktion in einem Menschen, umfassend das Verabreichen des Peptids der vorliegenden Erfindung an einen Menschen.
Die vorliegende Erfindung besteht auch in der Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der Pankreasaktivität, Stimulieren der Produktion von Wachstumshormon oder der Dämpfung der Herzvagusfunktion.
Es wurde gezeigt, daß Galaninantagnositen durch chemische Synthese von chimären galaninähnlichen Peptiden entwickelt werden können. Das N-terminale Galaninfragment (Aminosäuren 1 bis 13), welches den Galaninrezeptor bindet, kann an ein Peptid mit einer α-helikalen Struktur gekoppelt werden, das den N-terminalen Rest stabilisiert, jedoch von Natur aus keine eigene biologische Wirkung aufweist. Das resultierende Chimäre ist als ein Galaninantagonist beschrieben, da es den Galaninrezeptor binden jedoch nicht aktivieren wird, wobei die Wirkung von endogenem Galanin inhibiert wird. Die Fähigkeit eines derartigen chimären Peptids als ein Galaninantagonist zu wirken, kann eingeschätzt werden durch Messen seiner Bindungseffizienz an Galaninrezeptoren, die in RINm5F-Zellen exprimiert werden und die Fähigkeit die inhibierte Insulinreaktion auf Galanin umzukehren. Ein Galaninantagonist wird die 125I-Galaninbindung von RINm5F-Zellen ersetzen, in einer von der Art abhängigen Dosis, und die inhibierte glycerinaldehydinduzierte Insulinantwort auf Galanin umkehren. Der Antagonist wirkt als ein Kompetitor für Galanin, hat jedoch selbst keine Wirkung auf die glycerinaldehydinduzierte Insul insekretion.
Unter Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung wird es möglich sein, Peptide und andere Verbindungen auf Galaninagonisten- und -antagonistenaktivität zu screenen. Dies würde durch RINm5F-Zellen exprimierte Rezeptoren geschehen. Die Verbindungen, die kompetitive Bindung zeigten, würden dann bezüglich biologischer Aktivität beurteilt.
Unter einem anderen Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf Galaninagonisten- oder -antagonistenaktivität, umfassend das Abschätzen der Fähigkeit der Verbindung mit dem Peptid der vorliegenden Erfindung um die Bindung an Zellrezeptoren zu konkurrieren und die Abschätzung der biologischen Aktivität der Verbindungen, die kompetitiv binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Galaninantagonisten, die durch dieses Screeningverfahren erhalten werden.
Damit die vorliegende Erfindung besser verstanden werden kann, werden nun bevorzugte Formen davon bezugnehmend auf die folgenden Beispiele und beiliegenden Figuren beschrieben, worin:
Figur 1 die Nukleotidsequenze von Präprogalanin, die Aminosäuresequenz von Human-Galanin und GMAP zeigt;
Figur 2 ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Human-Galanin mit derjenigen von Rind, Schwein und Ratte liefert;
Figur 3 den Effekt einer Verabreichung von Human-Galanin auf Blutglucosegehalte (BG; (a) 350 ug und (b) 250 ug) und Seruminsulingehalte ((c) 250 ug) in der Ratte bei Bewußtsein zeigt. Der Pfeil zeigt den Zeitpunkt, bei welchem das Galanin verabreicht wurde:
Figur 4 zeigt das Versuchsprotokoll der Infusion von Human- Galanin in zwei Menschen;
Figur 5 zeigt die Wirkung der Verabreichung von Human-Galanin auf die Pulsgeschwindigkeit in einem Menschen.
Figur 6 zeigt die Wirkung der Verabreichung von Human-Galanin auf Plasmaglucose- und Insulingehalte in einem Menschen (u Salzlösung; -o- 1 x 10&supmin;&sup9;M Human-Galanin; - - 3-4 x 10&supmin;&sup9;M Human-Galanin; die Pfeile 1 und 3 zeigen Beginn bzw. Abbruch der Galanininfusion und Pfeil 2 zeigt wann Glucose verabreicht wurde).
Figur 7 zeigt die Wirkung der Verabreichung von Human-Galanin auf Wachstumshormongehalte in einem Menschen - - Salzlösung; - - x 10&supmin;&sup9;M Human-Galanin; - - 3-4 x 10&supmin;&sup9;M Human- Galanin).

BEISPIELE

MATERIALIEN UND VERFAHREN

cDNA-Bibliotheken:

Zwei cDNA-Bibliotheken wurden zum Bibliotheksscreening und auch als eine Matrizen-DNA-Quelle für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Die NeuroblastomcDNA-Bibliothek (Kat.-Nr. HL1007, Clontech Laboratories Inc., USA) enthielt 1,05 x 10&sup6; unabhängige Klone, die in einen λgt10-Vektor an seiner EcoRI-Klonierungsstelle insertiert waren. Die Hypophysen-cDNA-Bibliothek wurde von Dr. P. Seeburg (Centre for Molecular Biology, Universität von Heidelberg, BRD) erhalten und wurde ebenfalls von λgt10 getragen und in der EcoRI-Stelle kloniert.

Oligonukleotidsynthese

Mit der Ausnahme von oligonukleotiden, die auf die EcoRI Klonierungsstelle von λgt10 (Promega, CIV., Australien) gerichtet sind, wurden alle Oligonukleotide auf einem DNA- Synthesizer (Applied Biosystems, DNA-Synthesizer Modell 3808, Burwood, Australien) hergestellt.

Oligonukleotidsequenz:

1.GAATTCAAGGA(A/G)AAGAGAGGCTGGAC(T/C)CTGAA(EcoRI-Stelle eingebaut).
2.CCATAAGCTTGC(G/C)CC(G/C)GC(G/A/T/C)TCTTT(A/G)AG(A/G)TGCA(G/A)GAA (HindIII-Stelle eingebaut).
3.CCATAAGCTTAATGA(C/T)CTGTGG(C/T)TGTC(A/G)A(T/G)(C/G)GCATG (HindIII-Stelle eingebaut).

Polymerasekettenreaktion (PCR):

Um Matrizen-cDNA herzustellen, wurde ein Plattenlysatverfahren verwendet, um Phagen zu vermehren (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning: A Lab Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbour Press, USA 2.65 (1989)). Die Bibliotheken wurden mit 20.000 Plaques pro 150 mm Plattendurchmesser plattiert und in Aufbewahrungsmedium extrahiert (SM = 0,1M NaCl/0,008M MgSO&sub4;7H&sub2;O/0,05M Tris HCl/0,02 % Gelatine), die eine Präparation mit einem Titer von 1 x 10&sup9; Phagen pro ml ergaben. Die Phagenstammlösung (2 ml) wurde mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert und die DNA wurde dann mit Ethanol präzipitiert.
Das PCR wurde verwendet, um eine Region mit 230 Basenpaaren von Präprogalanin aus der Neuroblastom-cDNA-Bibliothek (Oligos 1 und 2) zu amplifizieren und ebenfalls, um die cDNA- Bibliotheksklone (λgt10-Oligos), die später durch Screening isoliert wurden, zu amplifizieren. In beiden Reaktionen wurde ein gesteuerter Hybaid-Heizblock (Modell 1HB 2024, Hybaid, Middx., UK) verwendet, mit den folgenden Temperaturparametern: Halten bei 95 ºC (5'), dann 25 Zyklen von 92 ºC (1'), 42 ºC (1') und 72 ºC (1'). Jede Reaktion enthielt KCl (50 mM), Gelatine (100 ug/ml), MgCl&sub2; (1,5 mM), Tris-HCl (pH = 8, 10 mM), DNA (10 ng bis 100 ug), DNTP (100 uM), Tth-Polymerase (0,25 U, Toyobo, Japan) und Oligonukleotide (500 uM).
PCR-Produkte wurden auf einem 3 % Nuseive-Agarosegel (FMC Bioprodukt, ME, USA) (Produkte mit weniger als 500 Basenpaaren) oder 1 % Agarose (Produkte größer 700 Basenpaare) aufgetrennt. Die Identität von PCR-Produktbanden wurde durch Southern Blotting (E. Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) der DNA auf einer Nylonmembran (Zetasonde, Bio-Rad Laboratories, Inc., CA. USA) nachgewiesen, unter Verwendung von 0,4M NaOH als der Transferpuffer, gefolgt von einer Hybridisierung mit Oligo #3. Die Prähybridisierung wurde bei 42 ºC in einer Lösung von 5 x SSPE (1X SSPE = 0,18M NaCl 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;/l mM NaEDTA pH = 7), 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 x Denhardts Lösung (1 x Denhardts Lösung = 0,02 % Ficoll-400/0,02 % Rinderserumalbumin/0,02 % Polyvinylpyrrolidon-40) und 100 ug/ml wärmedenaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt. Die Hybridisierung wurde unter der Zugabe einer Sonde in der gleichen Lösung für 6 bis 12 Stunden bei 42 ºC durchgeführt. Das Oligo wurde mit γ³²P ATP (Amersham, International PLC, UK) durchgeführt, unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (BRL, MD, USA). Die Blots wurden gewaschen bei 37 ºC in 1 x SSC (1 x SSC 0,151m NaCl/0,1675 M Trinatriumcitrat)/0,1 % SDS vor einer Röntgenfilmexpositon (Kodak Eastman, NY, USA) bei -70 ºC mit einem Intensivierungsröntgenschirm für 12 Stunden.

Subklonieren und Sequenzieren:

PCR-Produkte wurden auf einem Gel wie vorstehend beschrieben abgetrennt. Die geeignete Bande wurde herausgeschnitten und unter Verwendung von Geneclean (Bio 101, CA, USA) vor dem Restriktionsverdau gereinigt. Das durch Präprogalaninoligos 1 und 2 erzeugte PCR-Produkt wurde mit Hindill und EcoRI verdaut; während das mit λgt10 Oligos erzeugte PCR-Produkt mit EcoRI verdaut wurde, vor Ligation in M13mp19. Die M13mp19- Subklone wurden verwendet, um JM101 kompetente Zellen (Maniatis, 1.82-1.94) zu transformieren und nachfolgend wurde Einzelstrang-DNA hergestellt, unter Verwendung von Standardverfahren (Maniatis, 4.29-4.30) zum Sequenzieren (Kit Nr. Q5800 Promega). Sequenzierungsschwierigkeiten aufgrund der Sekundärstruktur wurden durch die Verwendung von Taq-DNA- Polymerase (Kit Nr. Q 5540, Promega) als das Sequenzierungsenzym bei einer Reaktionstemperatur von 70 ºC beseitigt.

cDNA-Bibliothekscreening:

Die vorstehend beschriebenen cDNA-Bibliotheken wurden mit dem 230-Basenpaar-PCR-Produkt, das für die Sequenz von Neuroblastompräprogalanin codiert, gescreent. Die Sonde wurde aus einem Gel herausgeschnitten und unter Verwendung von Gene Clean gereinigt, bevor sie mit α³²-DCTP (25 mg) in einer statistischen Primingreaktion (Kit Nr. 8187SA, PRL) markiert wurde. Ungefähr 6 x 10&sup5; Plaques wurden auf 2YT-Platten (A3, Maniatis) plattiert, die auf Hybond Nylon Filter (Amersham) übertragen und gemäß den Anweisungen des Herstellers fixiert wurden. Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 65 ºC wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Filter wurden bis zu einer Stringenz von 0,1 % SDS/0,1 % SSC bei 65 ºC gewaschen und über Nacht mit einem Intensivierungsröntgenschirm Röntgenfilmexponiert.

Blutglucose und Sekretion von glucoregulierenden Hormonen

Die Verabreichung von Human-Galanin an Ratten bei Bewußtsein

Ratten wurden bei einer festgesetzten Nahrung gehalten und unter Anästhesie wurde eine Kanüle eingeführt. Man ließ die Ratten sich dann erholen und infundierte ihnen Glucose. 10 Minuten später wurde eine Bolusdosis Human-Galanin verabreicht und Blutproben wurden über die nächsten drei Stunden entnommen. Nachfolgend auf die Entnahmeverfahren wurden die Tiere getötet.
Eine Erhöhung der Blutglucosegehalte wurde in Reaktion auf die Bolusverabreichung von 350 ug (110 nMol; Fig. 2a) und 250 ug (80 nMol; Fig. 2b) Human-Galanin beobachtet. Die Erhöhung der Blutglucosegehalte in Reaktion auf die Verabreichung von 250 ug (80 nMol in Fig. 2c) Human-Galanin korreliert mit einem Abfall der Gehalte zirkulierenden Insulins.

Wachstumshormonsekretion Infusion von Human-Galanin in Menschen

Der Versuchablauf splan für die Infusion von Human-Galanin in Menschen, um maximale zirkulierende Gehalte von Galanin von ungefähr 3 bis 4 x 10&supmin;&sup9; M zu erhalten, ist in Figur 4 gezeigt.

Der Effekt von Human-Galanin auf Blutglucose und Sekretion von glucoregulatorischen Hormonen in Menschen

Vorausgehende Daten für ein Subjekt zeigen an, daß die Verabreichung von Human-Galanin gemäß dem Ablaufplan, der in Figur 4 beschrieben ist, um maximale zirkulierende Gehalte von 1 x 10&supmin;&sup9;M und 4 x 10&supmin;&sup9;M Human-Galanin zu erreichen, zu einer nachweisbaren Suppression der Insulinsekretion führte (Figur 6; Y-Achseneinheiten: mIU/l). Dies war verbunden mit einer Erhöhung der Plasmaglucose relativ zur Kontrollsituation (Figur 6; Y-Achseneinheiten: mM).

Der Effekt von Human-Galanin auf die Wachstumshormonsekretion

Die Verabreichung von Human-Galanin an freiwillige menschliche Versuchspersonen führte gemäß dem Ablaufplan, der in Figur 4 beschrieben ist, zu einer Erhöhung der Wachstumshormongehalte bei zirkulierenden Gehalten von sowohl 1 x 10&supmin;&sup9;M als auch 3 bis 4 x 10&supmin;&sup9;M Human-Galanin in den beiden bisher untersuchten Versuchspersonen. Die Wirkung von Human-Galanin in einer dieser beiden Personen bei den beiden verwendeten Dosisraten ist in Figur 7 gezeigt.

Cardiovaskuläre Effekte

Der Effekt von Human-Galanin auf den Blutdruck und die Vagal- Nervenfunktion in der anästhesierten Katze

Die intravenöse Injektion von Human-Galanin in anästhesierte Katzen führte zu einer Herzvagusdämpfung wobei die Herzfrequenz erniedrigt wird.

Cardiovaskulärer Effekt von Human-Galanin in Menschen

Die Infusion von Human-Galanin in Menschen, wie in Figur 4 detailliert dargestellt, resultierte in einer Erhöhung der Pulsfrequenz (siehe Figur 5), was übereinstimmend ist mit einem Effekt von Human-Galanin auf die Dämpfung der Vagus- Funktion im Menschen.
Angesichts der bis heute durchgeführten Untersuchungen wird angenommen, daß Human-Galanin eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen aufweisen wird, einschließlich:
1. Inhibierung der Gastrointestinal-Aktivität, d.h. als ein Antidiarrhoe-Mittel.
2. Inhibierung der Insulinsektretion, z.B. Modulationsaktivität von endokrinem Pankreas bei Pankreasstörungen.
3. Als ein wirkungsvoller Stimulator des Wachstumshormons, welcher unabhängig vom Wachstumshormon freisetzendem Hormon wirkt.
4. Als ein Dämpfungsmittel der Herzvagusfunktion.
5. Bisher nicht gut charakterisierte Effekte auf das Nervensystem, z.B. seine Erschöpfung bei der Alzheimer- Krankheit, Einfluß auf Appetit, Prolaktinfreisetzung usw.
Versuche, die unter Verwendung von Rattenmodellen durchgeführt wurden, unterstützen die ersten drei Anwendungen, während Studien in Menschen, die vorstehend mit Human-Galanin angegeben sind, die Möglichkeit von Human-Galanin zeigen, um die Insulinsekretion, Wachstumshormonsekretion und Herzvagus- Funktionen zu modlieren.
Vor der vorliegenden Erfindung waren die möglichen therapeutischen Anwendungen von Galanin stark begrenzt, aufgrund der speziesspezifischen pharmakologischen Wirkung von Galanin, d.h. exogenes Human-Galanin würde bei Verabreichung an Menschen einen unterschiedlichen pharmakologischen Effekt aufweisen als kommerziell verfügbares Schweine- und Ratten- Galanin. Vor der vorliegenden Erfindung waren die Gründe für diese Speziesspezifität nicht verstanden. Es wird nun angenommen, daß die Speziesspezifität zumindest zum Teil auf verschiedene Aminosäureunterschiede zwischen Human-Galanin und demjenigen von anderen Spezies zurückzuführen ist und im speziellen ist festzuhalten, daß Human-Galanin nicht durch Glycin an seinem C-Terminus erweitert ist und daß an seiner Stelle ein Serinrest sitzt, welcher die Möglichkeit einer Amidierung nach der posttranslatorischen Spaltung in vivo ausschließt.

Literaturstellen

1. K. Tatemoto, A. Rokaeus, H. Jornvall, T.J. McDonald und V. Mutt, FEBS Lett. 164,124 (1983)
2. L.M. Kaplan, E.R. Spindel, K.J. Isselbacher und W.W. Chin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 1065 (1988).
3. A. Rokaeus und M.J. Brownstein, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 83, 6287 (1983).
4. A. Rokaeus and M. Carlquist, FEBS Lett., 234, 400 (1988).
5. A. Rokaeus, T. Melander, T. Hokfelt, J.M. Lundberg, K. Tatemato, M. Carlquist und V. Mutt, Neurosci. Lett., 47, 161 (1984).
6. A.L. Gundlach, W. Wisden, B.J. Morris and S.P. Hunt, Neurosci. Lett., 114, 241 (1990).
7. M.F. Beal, S. M. Gabriel, K.J. Swartz, U.M. MacGarvey, Peptides, 9, 847 (1988).
8. S.M. Gabriel, L. M. Kaplan, J.B. Martin und J.I. Koenig, Peptides, 10, 369 (1989).
9. L.M. Kaplan, S.M. Gabriel, J.I, Koenig, M.E. Sunday, E.R. Spindel, B.J. Martin, W.W. Chin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 7408 (1988).
10. T. Melander and W.A. Staines, Neurosci. Lett., 68,17 (1986): M.J. Brownstein, E. Mezey, Progress in Brain Research, Band. 68, (EDS.T. Hokfelt, K. Fuxe und B. Pernow), 161-168, Elsevier.
11. T. Melander, W.A. Staines, T. Hokfelt, A. Rokaeus, F. Eckenstein, P.M. Salvaterra and B.H. Wainer, Brain Research, 360, 130 (1985).
12. V. Chan-Palay, J. Comp. Neurol. 243, 543 (1988): J.H. Kordower und E. J. Murf son, J. Comp. Neurol. 294,281 (1990).
13. A. Ottlecz, W.K. Sampson, S.M. McCann, Peptides, 51 (1986).
14. S.E. Kyrkoulii, B.G. Stanley and S.F. Leibowitz, Eur. J. Pharmacol. 122, 159 (1986)
15. B.E. Dunning, B. Ahren, R.C. Veith, G. Bottcher, F. Sundler, G. J. Taborsky, Am. J. Physiol. 251,14: E127 (1986)
16. A. Cheung, J.M. Polak, P.E. Bauer, A. Cadieux, N. P. Christophides, D. R. Springall, S. R. Bloom, Thorax, 40, 889 (1985).
17. F.E. Bauer, N.D. Christophides, G.W. Hacker, M.A. Blank, J.M. Polank, S. R. Bloom, Peptides, 7, 5 (1986)
18. P. Miralles, E. Piero, P. Degano, A. Ramona J. Marco, Diabetes, 39, 996 (1990).
19. T. Messel, H. Harling, G. Bottcher, A.H. Johnsen, J.J. Holst, Regulatory Peptides, 28, 161 (1990).
20. S.G. Gilby, J. Stephenson, D.J. O'Halloran, J.M. Burrin, S.R. Bloom, Diabetes, 38, 1114 (1989).
21. M.J. Dunne, M.J. Bullet, L. Guochong, C.B. Wollheim, O.H. Petersen, EMBO, 8, 413 (1989).
22. E. Ekblad, R. Hakanson, F. Sundler, C. Wahlestedt, Br. J. Pharmacol, 86, 241 (1985): J.E.T., B. Brooks, T.J. McDonald, W. Barnett, F. Kostolanska, C. Yanaihara, A. Rokaeus, Peptides, 9, 1183 (1988).
23. B. Amiranoff, A.L. Servin, C.R. Rouyer-Fessard, A. Couvineau, K. Tatemoto und M. Luburthe, Endocrinology, 12, 284 (1987).
24. G. Skofitsch, M. Sills, D.E. Jacobowitz, Peptides, 7, 1029 (1986): T. Melander, T. Hokfelt, S. Nelsson, E. Brodin, Eur. J. Pharm., 124, 381 (1986)
25. C. Kohler, G. Hallmann, T. Melander, T. Hokfelt, E. Northeim, J. Chem. Neuro Anat. 2, 269 (1989).
26. B. Gallwitz, W.E. Shimdt, R. Schwarzhoff, W. Creutzfeldt, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 172, 268 (1990): B. Amiranoff, A.M. Lorinet, N. Yanaihara, M. Laburthe, Eur. J. Pharm., 163, 205 (1989).
27. W.J. Rossowski&sub5; T.M. Rossowski, S. Zacharia, A. Ertan und D.H. Coy, Peptides, 11, 333, (1990).

Claims

1. Ein Polypeptid mit folgender Aminosäuresequenz

GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS

oder ein funktionelles Äquivalent desselben, das durch konservative Substitutionen, ausgewählt aus dem Nachfolgenden:

G, A; V, I, L , M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H; und F, Y, W, erhalten wird.

2. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptidfragment die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS.

3. Ein cDNA-Molekül, das für das Peptid nach Anspruch 1 oder 2 codiert, wobei das cDNA-Molekül eine Sequenz, wie im wesentlichen in Fig. 1 gezeigt, von Nukleotid 97 bis 186 oder von Nukleotid 97 bis 145 oder eine funktionell äquivalente Sequenz aufweist.

4. Ein DNA-Molekül, das für humanes Präprogalanin und für Galanin mRNA assoziiertes Peptid codiert, wobei das DNA- Molekül eine Sequenz aufweist, wie im wesentlichen in Fig. 1 gezeigt, oder eine funktionell äquivalente Sequenz.

5. Ein Verfahren zur Herstellung von humanem Galanin, das eine, mit dem DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4 unter Bedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz und das Gewinnen von humanem Galanin erlauben, transformierte Zelle umfaßt.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle ein Bakterium ist.

7. Die Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Regulierung der Pankreasaktivität.

8. Die Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments für die Stimulierung der Wachstumshormonproduktion.

9. Die Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Dämpfung der Herzvagus- Funktion.

10. Ein Verfahren zum Testen von Verbindungen mit einer Wirksamkeit als Galaninagonisten oder -antagonisten, das das Bewerten der Fähigkeit der Verbindung, mit dem Peptid nach Anspruch 1 oder 2 um die Bindung an die Zellrezeptoren zu konkurrieren, und das Bewerten der biologischen Wirksamkeit der Verbindungen, die kompetitiv binden, umfaßt.

11. Die Verwendung eines Antagonisten für das Peptid nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung der Insulinsekretion.

12. Die Verwendung eines Antagonisten des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung des Nahrungsaufnahmeverlangens.

13. Die Verwendung eines Agonisten des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung der Hyperinsulinämie.

14. Ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung bei einem Verfähren zur überprüfung der Fähigkeit eines Individuums, Wachstumshormon herzustellen.

15. Die Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Agonisten desselben zur Konfektionierung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Überprüfung der Fähigkeit eines Individuums, Wachstumshormon herzustellen, wobei das Verfahren die Verabreichung der zusammensetzung an ein Individuum und das Messen des zirkulierenden Wachstumshormonspiegels in dem Individuum umfaßt.