JP2002508169A

JP2002508169A - ガラニン受容体ｇａｌｒ３およびそれをコードするヌクレオチド

Info

Publication number: JP2002508169A
Application number: JP2000539053A
Authority: JP
Inventors: ハワード，アンドリユー; カシアリ，マーガレツト; スミス，ロイ; サリバン，キヤサリン; タン，カリーナ; フアン・デル・プルーフ，レオナルドス; リンチ，ケビン
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1997-12-17
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2002-03-19
Also published as: CA2326694A1; EP1037913A4; WO1999031130A1; US20030023074A1; EP1037913A1; US6511827B1

Abstract

(57)【要約】新規ガラニン受容体GALR3を記載する。それをコードする核酸、および該受容体に特有のリガンドを同定するための種々のアッセイも提供する。そのようにして同定したリガンドは肥満の治療、痛みの治療および認識障害に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、GALR3と称される新規ガラニン（galanin）受容体、それをコードす
るヌクレオチド、およびそれを使用するアッセイに関する。

【０００２】（発明の背景）ガラニンは、最初はブタの腸から単離されたが、中枢および末梢神経系に広く
分布している。ほとんどの種におけるガラニンは、アミド化されたカルボキシル
末端を有する29アミノ酸のペプチドである。ヒトガラニンは、より長い30アミノ
酸でありアミド化されていない点で独特である。ガラニンの配列には強い保存性
が存在し、アミノ末端の15残基は全ての種において完全に保存されている。ガラ
ニンの免疫反応性および結合性は、視床下部、青斑、海馬および下垂体前葉なら
びに脊髄、膵臓および胃腸管の領域に豊富に見出される。

【０００３】神経ペプチドY（NPY）の場合と同様に、視床下部の室傍核（PVN）内へのガラニンの注射は、満腹のラットにおける摂食の用量依存的な増加をもたらす。ガラ
ニンは、ノルエピネフリンと同様に、炭水化物の摂取を増加させるが、いくつか
の研究は、それが脂肪の摂取を著しく増加させることを示している。ガラニンは
多量栄養素に関する好みを炭水化物から脂肪に変化させると示唆されている。摂
食を増加させる同じ注射はエネルギー消費を減少させ、インスリンの分泌を抑制
する。遺伝性肥満ラットの視床下部には、それらの痩せ型同腹子対照の場合と比
べて増強したガラニン発現が認められる。PVN内へのペプチド受容体アンタゴニストの注射は、脂肪摂取の増加のガラニン特異的誘導を阻止する。特異的なガラ
ニンアンチセンスオリゴヌクレオチドは、PVN内に注射されると、タンパク質または炭水化物の摂取にはほとんど影響を及ぼすことなく、脂肪摂取および全カロ
リー摂取の減少に伴うガラニン発現の特異的減少を引き起こす。したがって、ガ
ラニンは、脂肪摂取の行動に関連した1つの潜在的な神経化学的マーカーであるらしい。

【０００４】ガラニンは、ラットにおいてコリン作動性機能を抑制し作動記憶を損なう。コ
リン作動性ニューロンを破壊する病変は空間的学習作業の欠陥を引き起こす。局
所的に投与されたアセチルコリン（ACh）はこの欠損のいくつかを反転させるが、ガラニンは、このAChにより媒介される改善を阻止する。アルツハイマー病に罹患した脳の剖検サンプルからの証拠は、基底核のガリン作動性（galinergic）
神経支配の増加を示唆している。したがって、ガリン作動性の過剰活動がアルツ
ハイマー病における認識能力の低下に寄与しているとすると、ガラニンアンタゴ
ニストは認識障害の軽減に治療的に有用かもしれない。

【０００５】ラットにおいては、ガラニンの脳室内、皮下または静脈内投与は血漿成長ホル
モンを増加させる。健康な被検体へのヒトガラニンの注入も血漿成長ホルモンを
増加させ、GHRHに対する成長ホルモン応答を著しく増強する。

【０００６】ガラニンレベルは背根神経節において特に高い。坐骨神経の切除は、ガラニン
のペプチドおよびmRNAのレベルを劇的にアップレギュレーションする。軸索切断
後のガラニン受容体アンタゴニスト（M35、M15）の慢性的投与は、ラットにおけ
る一般には痛みに対する反応であるとみなされている自己断節行動（self mult
ilation behavior）の著しい増加を引き起こす。ガラニンに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを離断坐骨神経の近位末端に適用すると、自切の増加と
共にガラニンペプチドレベルの増加が抑制された。鞘内に注射されたガラニンは
モルヒネと相乗的に作用して無痛覚を引き起こし、モルヒネのこの抗痛覚作用は
ガラニン受容体アンタゴニストにより阻止される。したがって、ガラニンアゴニ
ストは、神経痛の軽減におけるいくつかの有用性を有するかもしれない。

【０００７】ガラニンの作用は、アデニル酸シクラーゼ活性の阻害、L型Ca⁺⁺チャンネルの閉口およびATP感受性K⁺チャンネルの開口を引き起こすよう百日咳毒素感受性Gi/
Goタンパク質と共役した高アフィニティーガラニン受容体により媒介される。ガ
ラニンの免疫反応性の対応局在領域（視床下部、腹側海馬、基底前脳、脊髄、膵
臓および下垂体）において、¹²⁵I-ガラニンの特異的結合（Kd約1nM）が示されて
いる。ほとんどの組織においては、該アミノ末端（GAL 1-15）は高アフィニティ
ー結合およびアゴニスト活性に十分なものである。

【０００８】最近、ヒトBowes黒色腫細胞系からの発現クローニングにより、ガラニン受容体cDNAが単離された（Habert-Ortoliら1994. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91:9
780-9783）。この受容体GALR1は、ヒト胎児脳および小腸内で発現されるが、その分布についてはそれ以外にはほとんど知られていない。COS細胞内で一過性に発現されたこの受容体に対する¹²⁵I-ブタガラニンの結合のインヒビターとして、Gal(1-16)はpGAL(3-29)より少なくとも1000倍活性である。この受容体サブタイプが、ガラニンに特異的な摂食行動を媒介する視床下部受容体に相当するか否
かは依然として明らかでない。

【０００９】更なるガラニン受容体を同定し、それらを使用して、この生物系を更に特徴づ
け、ガラニン受容体サブタイプに選択的なアゴニストおよびアンタゴニストを同
定することができれば望ましいであろう。

【００１０】（発明の概要）本発明は、付随タンパク質を実質的に含有しない、GALR3と称される新規ガラニン受容体、および少なくとも約40％の相同性を有し実質的に同じ生物活性を有
するGALR3様受容体に関する。本発明の好ましい実施形態においては、GALR3様受
容体は、GAL3受容体に対して少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約75
％、より一層好ましくは少なくとも約85％の相同性を有する。また、本発明は特
に、付随タンパク質を実質的に含有しないラット、ヒトおよびマウスGALR3、および少なくとも約50％の相同性を有し実質的に同じ生物活性を有する受容体に関
する。

【００１１】本発明のもう1つの態様は、実質的に同じ核酸配列にコードされる霊長類および非霊長類GALR3タンパク質であって、発現されるタンパク質が天然形態と相同であるが異なるアミノ酸配列を有するよう、スプライシングもしくは他のRNAプロセシングに由来する修飾における変化または突然変異誘発により誘導される変
化を受けているタンパク質である。これらの変異体は、ヒトおよび動物の生理学
において又はインビトロの細胞に基づくアッセイにおいて、異なる及び／又は追
加的な機能を有することがある。

【００１２】本発明のもう1つの態様は、GALR3受容体、GALR3様受容体、またはGALR3受容体
の機能的等価体（ラット、ヒト、マウス、ブタまたは他の種からのもの）をコー
ドする核酸である。これらの核酸は、付随核酸を含有していなくてもよく、ある
いは単離または精製されていてもよい。本発明の受容体をコードする核酸は任意
のタイプの核酸であってもよい。好ましい形態は、ゲノムおよびcDNAを含むDNA であるが、本発明は特にRNAも含む。また、核酸構築物は、転写および翻訳を制御する領域、例えば、1以上のプロモーター領域、終結領域、および所望によりエンハンサー領域を含有していてもよい。該核酸は、プラスミドを含む任意の公
知ベクター内に挿入することができ、当業者に一般に利用可能な技術を用いて適
当な宿主細胞にトランスフェクトするために使用することができる。

【００１３】本発明のもう1つの態様は、GALR3をコードする核酸を含んでなるベクター、お
よびこれらのベクターを含有する宿主細胞である。本発明の更にもう1つの態様は、GALR3をコードする核酸を含むベクターを培養条件下で宿主細胞内に導入することを含んでなる、GALR3の製造法である。

【００１４】本発明の更にもう1つの態様は、本発明の受容体および／または核酸を使用するGALR3リガンドに関するアッセイである。この実施形態の好ましいアッセイにおいては、GALR3に対する推定GALR3リガンドの結合性をガラニンの結合性と比較
する。

【００１５】（発明の詳細な記載）本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり用いる用語においては、以下の
定義が適用される。

【００１６】「付随タンパク質を実質的に含有しない」は、該受容体が、ガラニン受容体を
発現する生きた哺乳類細胞において通常見出される他の細胞膜タンパク質の少な
くとも約90％、好ましくは少なくとも約95％を含有しないことを意味する。

【００１７】「付随核酸を実質的に含有しない」は、該核酸が、ガラニン受容体遺伝子を天
然に発現する生きた哺乳類細胞において通常見出される他の核酸の少なくとも約
90％、好ましくは少なくとも約95％を含有しないことを意味する。

【００１８】「実質的に同じ生物活性」は、該受容体-ガラニン結合定数が、GALR3とガラニ
ンとの結合定数の5倍以内、好ましくは、GALR3とガラニンとの結合定数の2倍以内であることを意味する。

【００１９】「ストリンジェントなハイブリダイゼーション後洗浄条件」は、65℃における
0.1 X標準食塩-クエン酸緩衝液（SSC）を意味する。

【００２０】「標準的なハイブリダイゼーション後洗浄条件」は、55℃における6 X SSCを意味する。

【００２１】「緩和なハイブリダイゼーション後洗浄条件」は、30℃における6 X SSC、または55℃における1〜2 X SSCである。

【００２２】「機能的等価体」は、選択的スプライシング、欠失、突然変異または付加によ
り、天然に存在するGALR3タンパク質と全く同じアミノ酸配列を有しないが、天然に存在する受容体の生物活性の少なくとも1％、好ましくは10％、より好ましくは25％を保有する受容体を意味する。そのような誘導体は、天然GALR3に対する有意な相同性を有し、GALR3から得たDNA配列に対する、減少したストリンジェ
ンシーのハイブリダイゼーションにより検出されうる。機能的等価体をコードす
る核酸は、天然に存在する受容体の核酸に対してヌクレオチドレベルで少なくと
も約60％の相同性を有する。

【００２３】 GALR3と称される第3のガラニン受容体が存在することが本発明において見出さ
れた。ヒト（クローン3-3および3-2）およびラットGALR3配列を、それぞれ図１、３および８に記載し実施例に示すが、本発明は特に、種には無関係にGALR3を含み、特に、げっ歯類（ラットおよびマウスを含む）、アカゲザル、ブタ、ニワ
トリ、ウシおよびヒトGALR3を特に含むと理解されるべきである。ガラニン3受容
体は種全体にわたり高度に保存されており、当業者は、本明細書に記載のラット
、ヒトおよび／またはマウス配列が与えられたら、他の種からのGALR3を得るためのプローブを容易に設計することができる。

【００２４】 GALR3タンパク質は、種々の機能的ドメイン、例えば、細胞膜内に該受容体をアンカーする1以上のドメイン、および少なくとも1つのリガンド結合ドメインを
含有する。多数の受容体タンパク質の場合と同様に、該アミノ酸（特に、リガン
ド結合ドメイン内に存在しないもの）の多数を修飾し、それでもなお元の受容体
の生物活性の少なくとも一部を保有させることが可能である。したがって、本発
明は特に、欠失した、トランケート化した又は突然変異したN末端部分を有する修飾された機能的等価体GALR3を含む。また、本発明は特に、機能的活性の喪失を伴わない他のドメイン内の修飾および／または欠失を含有する修飾された機能
的等価体GALR3を含む。

【００２５】また、結合特異性および／または選択性を改変することにより、他の機能的ド
メイン（例えば、第2メッセンジャーエフェクター系と相互作用するもの）を修飾することが可能である。そのような機能的に等価な突然変異受容体も本発明の
範囲内に含まれる。

【００２６】本発明のタンパク質は、7個の膜貫通ドメイン（TM）を含有するGタンパク質結
合受容体スーパーファミリー（GPC-Rまたは7-TM受容体）に典型的な構造的特徴を有することが判明した。したがって、GALR3タンパク質は、GPC-Rファミリーの
受容体の新規メンバーを構成する。本発明の無傷GALR3は、7個の膜貫通領域、3 個の細胞内および細胞外ループならびにGPC-Rタンパク質シグネチャー（signatu
re）配列を含むGPC-Rの一般的特徴を有することが判明した。該TMドメインおよびGPC-Rタンパク質シグネチャー配列はGALR3のタンパク質配列内で認められる。
機能するためには全ての領域が必要なわけではない。したがって、本発明はまた
、1以上の非必須ドメインを欠く機能的受容体を含む。

【００２７】ヌクレオチド配列の決定は、GALR3がGPC-Rのイントロン含有クラスに属するこ
とを示した。

【００２８】推定GALR3をコードするDNA配列を図１および３に示す。ヒト推定GALR3遺伝子はヒトGALR2と同様に構成されており、単一のイントロン（〜1kb）が該オープン
リーディングフレームを2つのエキソンに分割しており、エキソン1は〜350bpよりなり、エキソン2は〜700bpよりなる。データベースの検索に基づくと、この新
規遺伝子のオープンリーディングフレームタンパク質配列（図２および４）はGA
LR2およびGALR1と最も密接に関連しており、ヒトGALR2に対して58、75％の同一性および類似性を有し、ラットGALR1に対して37、61％の同一性および類似性を有する（図５）。オープンリーディングフレームDNA配列および生じる推定アミノ酸配列におけるクローンGALR3-2とGALR3-3との間の相違は、事実上、対立遺伝
子によるものである。推定GALR3タンパク質配列の系統発生学的分析は、この遺伝子がガラニンの受容体をコードしているという見解を支持している（図６）。

【００２９】ヒトGALR3タンパク質は、ラットGALR3オーソログ（ortholog）に対して高い配
列相同性および類似性を有する。

【００３０】本発明はまた、GALR3のトランケート化形態、特に、該受容体の細胞外部分を含むが該受容体の細胞内シグナリング部分を欠くもの、およびこれらのトランケ
ート化形態をコードする核酸に関する。そのようなトランケート化受容体は種々
の結合アッセイに有用である。したがって、本発明は特に、欠失した、トランケ
ート化した又は突然変異したN末端部分を有する修飾された機能的等価体GALR3を
含む。また、本発明は特に、機能的活性の喪失を伴わない他のドメイン内の修飾
および／または欠失を含有する受容体キメラを含む修飾された機能的等価体GALR
3を含む。

【００３１】また、結合特異性および／または選択性を改変することにより、他の機能的ド
メイン（例えば、第2メッセンジャーエフェクター系と相互作用するもの）を修飾することが可能である。そのような機能的に等価体な突然変異受容体も本発明
の範囲内に含まれる。

【００３２】本発明の更なる態様を構成するアッセイは、結合アッセイ（¹²⁵I-ガラニンの結合に関する競合）、共役活性測定（ガラニン受容体を発現する細胞における、
フォルスコリンで刺激されたアデニル酸シクラーゼのガラニン媒介阻害を含む）
、ガラニン受容体を発現する細胞における、ガラニンで刺激されたカルシウム遊
離の測定（例えば、エクオリンアッセイ）、ガラニン受容体を発現する細胞にお
ける、内向き整流性カリウムチャンネル（電位変化により測定されるGIRKチャン
ネル）の刺激、ガラニン受容体を発現する細胞をガラニンで刺激した際のpH変化
の、ミクロフィシオメーター（microphysiometer）での測定を含む。

【００３３】 GALR3を産生させるために、適当な条件下で宿主細胞を培養することができる。組換え宿主細胞内で受容体を発現させるためには、該受容体をコードするDNA を含有する発現ベクターを使用することができる。組換え宿主細胞は、原核性ま
たは真核性であることが可能であり、それらには、大腸菌（E. coli）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系
を含む（これらに限定されるものではない）哺乳類細胞、およびショウジョウバ
エ（Drosophila）、スポドプテラ（Spodoptera）およびカイコに由来する細胞系
を含む（これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれる。哺乳類種に由
来する商業的に入手可能な適当な細胞系には、L細胞L-M(TK^-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（ATCC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、C
V-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-
K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（A
TCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（A
TCC CCL 171）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００３４】該受容体に対するアフィニティーを示す化合物の結合の特異性は、該クローン
化受容体でトランスフェクトされた細胞に対する又はこれらの細胞からの膜に対
する化合物のアフィニティーを測定することにより示される。該クローン化受容
体の発現、およびこれらの細胞に対する放射能標識リガンドの結合を阻害する化
合物に関するスクリーニングは、該受容体に対して高いアフィニティーを有する
化合物の迅速な選択のための合理的な方法を与える。前記のアッセイにより同定
されるこれらの化合物は、該受容体のアゴニストまたはアンタゴニストでありう
る。また、それらはペプチド、タンパク質または非タンパク質性有機分子であり
うる。あるいは、該受容体の活性に影響を及ぼす化合物に関してスクリーニング
するために該受容体の機能的アッセイを用いることができる。そのような機能的
アッセイは、エクスビボ（ex vivo）筋収縮アッセイから、該受容体を発現する細胞内の第2メッセンジャーのレベルを測定するアッセイまで、多岐にわたる。該第2メッセンジャーアッセイには、サイクリックAMPまたはカルシウムレベルを
測定するためのアッセイ、またはアデニルシクラーゼ活性を測定するためのアッ
セイが含まれるが、これらに限定されるものではない。前記アッセイにより同定
されるこれらの化合物は、該受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、サプレッサ
ーまたはインデューサーでありうる。これらの化合物の機能的活性は、組織内で
天然で発現された又はクローニングされ外因的に発現された受容体を使用するこ
とにより最も良く評価される。

【００３５】本発明のアッセイを用いて、ガラニンのアゴニストおよびアンタゴニストを同
定することができる。ガラニンのアゴニストは、GALR3に結合する化合物（例えば、ガラニン模擬体）であり、ガラニンの場合と少なくともほぼ同等でありガラ
ニンの場合より大きいことがある細胞応答を引き起こす。そのような化合物は、
ガラニンの不足により食欲不振が生じている場合に又は痛みの治療に有用であろ
う。

【００３６】また、該アッセイのこの実施形態を用いて、ガラニンのアンタゴニストを同定
することができる。ガラニンのアンタゴニストは、GALR3に結合しうるが天然ガラニンの場合より低い応答を引き起こす化合物である。そのような化合物は肥満
の治療に有用であろう。

【００３７】本発明の1つのアッセイは、GALR3受容体をモジュレーションする化合物を同定
する方法であって、a）該化合物の存在下でGALR3受容体を発現する細胞を培養し
、b）GALR3受容体の活性または第2メッセンジャーの活性を測定することを含んでなる方法である。所望により、測定した活性を、標準体（例えば、該化合物と
してガラニンを使用して測定したもの）と比較することができる。好ましい実施
形態においては、該細胞を形質転換し、GALR3受容体を発現させる。

【００３８】該コンサルタント（consultant）cDNAクローン（またはより短い部分、例えば
、15ヌクレオチド長の部分）は、該核酸がハイブリダイズしうるのに十分な程度
に類似した他の受容体を見出すためにハイブリダイゼーション条件下でライブラ
リーをプローブするのに使用することが可能であり、他の種からのライブラリー
をスクリーニングするのに特に有用である。この工程においては、ハイブリダイ
ゼーション条件は非常にストリンジェントなものから緩和なものまで様々となり
うると当業者に理解されるであろう。適切な温度、塩条件およびバッファーは良
く知られている。

【００３９】本発明を更に例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。

【００４０】実施例１ヒトGALR3：ヒトGalR3遺伝子の同定およびクローニング、配列ならびに遺伝子構造公知受容体クローンからの配列を使用して、GenBank（National Center For B
iotechnology Information, Bethesda, MD）からの配列データベースの自動検索
に照会した。50〜60個のロドプシンファミリーアミノ酸配列の一覧を用いて、Ge
nBankのNEW部を検索した。照会アルゴリズムはTFASTXであり、該出力はファイル
に配置され、該ファイルにおいて照会配列によりアライメントが分類され、得点
化される（例えば0.01に設定された期待値に基づくカットオフ）。受託番号Z976
30を有する大きなBACクローン（〜100,000bp）の一部に対する300bpのDNA配列の
アライメントを、ハイスループットのゲノム配列（HTGSデータベース、GenBank ）から同定した。ついで、BAC Z97630からの配列およびHTGSデータベースからの
追加的なBACクローン（受託番号Z82241）を使用して、GALR3をコードする推定遺
伝子の完全なオープンリーディングフレーム（ORF）を同定した。該Genbank受託
番号は、以下のHTGS BACクローン（HSエントリー）に対応するものであった：Z9
7630, HS466N1; Z82241, HS81I2。

【００４１】 PCRプライマーを選択するために、これらのBACに由来するDNA配列を使用した。予想される開始Metから始まり、予想される終結コドンより3’側で終わるPCR プライマーを、予想されるエキソンI、介在イントロンおよび予想されるエキソンIIを含有するヒトゲノムDNA断片からのPCRに使用した。このPCR産物をサブクローニングし、配列決定し、発現プラスミドGALR3-3を得た。

【００４２】平行したアプローチにおいて、ヒトゲノムDNAライブラリー（Stratagene, La
Jolla, CA）をスクリーニングして、推定GALR3遺伝子を単離した。エキソン2プローブを使用する中等度のストリンジェンシーにおける一次スクリーニングは、
6個の陽性プラークを与えた。ハイブリダイズした1個のファージプラークを二次
スクリーニングから得た。13kbのEcoRI/EcoRV断片をサザンブロットによりゲノムクローンから同定し、pBluescriptベクター（Stratagene, La Jolla, CA）内に移し、配列決定によりそれがGALR3であることを確認した。イントロン無しのG
ALR3発現構築物を、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）を使用して前記方法と同様の方法で合体させて、発現プラスミドGALR3-2を得た。

【００４３】実施例２染色体の位置 HTGSデータベースの検索により同定されたBACクローンは、The Sanger Centre
（Cambridge, UK）ゲノム研究所によりヒト第22番染色体にマッピングされている。

【００４４】本発明において行なったFISH分析はこの帰属を立証し、それを更に厳密に22q1
2.2-13.1に位置づけた。

【００４５】実施例３受容体の発現：ヒトGalR3発現プラスミドの構築ヒトGalR3 cDNA発現構築物を、ヒトゲノムDNAから増幅したPCR産物から段階的
に合体させた。標準的な条件を用いて各エキソンをPCR増幅した。エキソンIのた
めのプライマーは、フォワードエキソンI（5’-gcg aat tcg gta cca tgg ctg a
tg ccc aga aca t-3’; 配列番号13）およびリバースエキソンI（5’-cgc ctg t
cg aca gat aca gca gc-3’; 配列番号14）であった。エキソンIIのためのプライマーは、フォワードエキソンII（5’-tgt atc tgt cga cag gta acc tgg ccg
tgc ggc acc c-3’; 配列番号15）およびリバースエキソンII（5’-gcg cgg ccg
ctt att ccg gtc ctc ggg c-3’; 配列番号16）であった。PCR産物をpCRII内に
サブクローニングし、配列決定した。哺乳類細胞内での発現のために、推定GALR
3 ORFをpcDNA-1/amp（Invitrogen）およびpcDNA-3（Invitrogen）内にサブクローニングして、それぞれプラスミドGALR3-3およびプラスミドGALR3-2を得た。

【００４６】実施例４ RNA発現プロフィール RNアーゼプロテクション分析を用いて、ヒトGALR3 mRNAの相対レベルを評価し
た。後記に示すとおり、GALR3が多数の脳領域および末梢組織内で発現されることがGALR1およびGALR2に関して認められた。

【００４７】

【表１】

【００４８】実施例５放射性リガンドの結合ヒトGALR3の薬理学哺乳類COS-7細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。COS
-7細胞（1×10⁷個）を0.85mlのリンガーバッファーに懸濁し、15mgのGALR3-2またはGALR3-3発現プラスミドを0.4mmのエレクトロポレーションキュベット（Bio-
Rad, Hercules, CA）に加えた。Bio-Rad Electroporator装置を使用して電流を流し（960mF, 260V）、該細胞をT-180フラスコ（Corning）に移した。発現を72 時間進行させた。

【００４９】氷冷膜バッファー（10mM Tris, pH7.4, 10mM PMSF, 10mMホスホラミドンおよび40mg/mlバシトラシン）中のDounceホモジナイザー内での破裂による無酵素解離溶液（Specialty Media, Lavallette, NJ）中での解離後、トランスフェクト化細胞から膜を調製した。低速（1100 x g、4℃で10分間）および高速（38,700
x g、4℃で15分間）での遠心分離の後、膜をバッファーに再懸濁し、タンパク質
濃度を測定した（Bio-Radアッセイキット）。全容積250ml中の25mM Tris（pH7.4
）、0.5% BSA、2mM MgCl₂、40μg/mlバシトラシン、4mg/mlホスホラミドンおよび10μMロイペプチンのバッファーを使用して、¹²⁵I-ヒトまたはブタガラニン（
2200 Ci/mmolの比活性, DuPont NEN）の結合を膜において測定した。70pMの¹²⁵I
-ヒトまたはブタガラニンを使用した。プラスミドGALR3-3を発現するトランスフ
ェクト化細胞は¹²⁵I-ヒトガラニンに結合させ、一方、プラスミドGALR3-2を発現
する細胞は¹²⁵I-ブタガラニンに結合させた。メンブレンを加えることにより反応を開始し、該インキュベーションを室温で1時間進行させた。非特異的結合は、それぞれ1mMの未標識ガラニンの存在下で依然として結合している放射能の量と定義され、一般には200cpm以下であった（結合した全放射能の<10％）。1〜50
μgで膜タンパク質の滴定を行なった。競合実験では、GALR3-2プラスミドを発現
する細胞において、¹²⁵I-ブタガラニン（70pM）と共に、種々の濃度の未標識ヒトまたはブタガラニンを用いた。TOMTEC（Orange, CT）細胞収集装置を使用して
0.1％ポリエチレンアミンに予め浸漬されたGF/Cフィルターに通す高速濾過によりインキュベーションを終了した。Prismソフトウェアパッケージ（GraphPad, S
an Diego, CA）を使用して、結果を分析した。以下の表は、ヒトおよびブタの両
方のガラニン放射性リガンドに関して、両方のクローンがタンパク質濃度の相関
因子としてCOS-7細胞に特異的結合をもたらすことを示している。発現ベクターのみ（GALR3遺伝子無し）で模擬トランスフェクトされたCOS-7細胞においては、
いずれの放射性リガンドの特異的結合も観察されなかった。

【００５０】

【表２】

【００５１】図７に示すとおり、ヒトおよびブタガラニンに対する¹²⁵I-ブタガラニンに関する競合曲線を作成して、両方の未標識ペプチド（クローンGALR3-2）のIC50を求めた。ブタおよびヒトガラニンのIC50値は、それぞれ16nMおよび93nMであった
。

【００５２】実施例６ラットGALR3 ラットGalR3遺伝子の同定およびクローニング TM4およびTM7からのイントロン無しのヒトGALR3配列に基づくプライマーを設計し、それを使用してPfu DNAポリメラーゼによりラットゲノムDNAからのラット
GALR3オーソログをPCR増幅した。ヒトGALR3遺伝子由来のエキソン2プローブにハ
イブリダイズした適当なサイズ（約400bp）のPCR産物をpBluescriptベクター（S
tratagene, La Jolla, CA）内にサブクローニングした。該DNA配列を図８に示し
、該推定アミノ酸配列を図９に示す。DNA配列分析は、ヒトGALR3に対する有意な
相同性（TM4からTM7にわたる129アミノ酸についての約95％のタンパク質配列同一性）を示した。

【００５３】 RNA発現ラットGALR3 ORFに由来するプローブを使用するノーザンブロット分析は、視床下部、中脳、橋および全胎児脳においてラットGALR3 mRNAの発現を示した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトGALR3遺伝子（クローンGALR3-3）のDNA配列（配列番号1）である。

【図２Ａ】ヒトGALR3（クローンGALR3-3）の推定アミノ酸配列（配列番号2）である。

【図２Ｂ】ヒトGALR3（クローンGALR3-3）の推定アミノ酸配列（配列番号2）である。

【図３】ヒトGALR3（クローンGALR3-2）のDNA配列（オープンリーディングフレームのみ）（配列番号3）である。

【図４】 GALR3（クローンGALR3-2）の推定アミノ酸配列（配列番号4）である。

【図５Ａ】ヒトおよびラットGALR3のオープンリーディングフレームタンパク質配列と、G
ALR1（マウス-配列番号5、ラット-配列番号6およびヒト-配列番号7）およびGALR
2（マウス-配列番号8、ラット-配列番号9およびヒト-配列番号10）の対応配列と
の比較である。

【図５Ｂ】ヒトおよびラットGALR3のオープンリーディングフレームタンパク質配列と、G
ALR1（マウス-配列番号5、ラット-配列番号6およびヒト-配列番号7）およびGALR
2（マウス-配列番号8、ラット-配列番号9およびヒト-配列番号10）の対応配列と
の比較である。

【図５Ｃ】ヒトおよびラットGALR3のオープンリーディングフレームタンパク質配列と、G
ALR1（マウス-配列番号5、ラット-配列番号6およびヒト-配列番号7）およびGALR
2（マウス-配列番号8、ラット-配列番号9およびヒト-配列番号10）の対応配列と
の比較である。

【図６】推定GALR3タンパク質配列の系統発生学的分析である。

【図７】ヒトおよびブタガラニンに対する¹²⁵I-ブタガラニンについての競合曲線を示す。

【図８】領域TM4から領域TM7までのラットGALR3のDNA配列（配列番号11）である。

【図９】領域TM4から領域TM7までのラットGALR3の推定アミノ酸配列（配列番号12）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者ハワード，アンドリユーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者カシアリ，マーガレツトアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者スミス，ロイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者サリバン，キヤサリンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者タン，カリーナアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フアン・デル・プルーフ，レオナルドスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リンチ，ケビンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB01 FB02 4B024 AA01 BA63 CA01 DA02 EA04 GA14 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA03 CA24 CA44 4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 EA21 EA27 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】付随タンパク質を実質的に含有しないガラニン受容体3（GAL
R3）、またはGALR3に対して少なくとも約40％の相同性を有し実質的に同じ生物活性を有するGALR3様受容体。
【請求項２】 GALR3に対して少なくとも約50％の相同性を有する、請求項１に記載のGALR3様受容体。
【請求項３】 GALR3に対して少なくとも約75％の相同性を有する、請求項１に記載のGALR3様受容体。
【請求項４】 GALR3に対して少なくとも約85％の相同性を有する、請求項１に記載のGALR3様受容体。
【請求項５】ヒトGALR3である、請求項１に記載のGALR3。
【請求項６】ラットGALR3である、請求項１に記載のGALR3。
【請求項７】図１に示す、請求項１に記載のGALR3。
【請求項８】図３に示す、請求項１に記載のGALR3。
【請求項９】図８に示す、請求項１に記載のGALR3。
【請求項１０】 GALR3をコードするか、またはGALR3に対して少なくとも約
40％の相同性を有し実質的に同じ生物活性を有するGALR3様受容体をコードする、付随核酸を実質的に含有しない核酸。
【請求項１１】該GALR3様受容体がGALR3に対して少なくとも約50％の相同
性を有する、請求項１０に記載のGALR3様受容体をコードする核酸。
【請求項１２】該GALR3様受容体がGALR3に対して少なくとも約75％の相同
性を有する、請求項１０に記載のGALR3様受容体をコードする核酸。
【請求項１３】該GALR3様受容体がヒトGALR3に対して少なくとも約85％の
相同性を有する、請求項１０に記載のGALR3様受容体をコードする核酸。
【請求項１４】 DNAである、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１５】請求項１３に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１６】請求項１０に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項１７】ある化合物がGALR3のリガンドであるか否かを判定する方法であって、該化合物とGALR3とを接触させ、結合が生じるか否かを判定することを含んでなる方法。
【請求項１８】 GALR3受容体の活性をモジュレーションする化合物を同定する方法であって、（a）該化合物の存在下でGALR3受容体を発現する細胞を培養し、（b）GALR3受容体の活性または第2メッセンジャーの活性を測定することを含んでなる方法。
【請求項１９】 GALR3受容体を発現させるために該細胞を形質転換する、請求項１８に記載の方法。