JPH0787981A - アドレナリン受容体遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトα_1Cアドレナリン受容体をコードするＤ
ＮＡ、及び該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドで
ある。 【効果】 組換えＤＮＡ技術により十分な量の精製され
たヒトα_1Cアドレナリン受容体を得る事ができ、ヒトα
_1Cアドレナリン受容体の機能解明に向けての研究が容易
になる。また本受容体に選択的なアゴニスト、アンタゴ
ニストの検索を行うときに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトα_1Cアドレナリン
受容体をコードするＤＮＡ及びそのＤＮＡにコードされ
ている受容体に関する。

【０００２】

【従来の技術】アドレナリン受容体は神経系をはじめ、
循環器、内分泌系において、重要な役割を果たしている
ことが知られている。この受容体は機能や薬剤に対する
感受性の違い、組織内分布などによりサブクラスα₁、
α₂、β₁、β₂およびβ₃に分類されている（Bylund,D.
B.ら FASEB J. 6, 832-839 (1992)）。これらのうち、
α₁アドレナリン受容体はカテコールアミンと結合する
ことによって、フォスファチジルイノシトール代謝亢
進、細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇を誘導し、その結果身体各
部位の平滑筋の収縮を引き起こすことが知られている
（Puceat,M.ら TIPS 13,263-265 (1992)）。このα
₁は、薬理学的及び遺伝子的にさらにα_1A、α_1B、α_1C
に分類される（Cotecchia,S.ら Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 85, 7159-7163(1988)、Lomasney,J.W.ら J.Biol.Che
m. 266, 6365-6369 (1991)、 Schwinn,D.A. J.Biol.Che
m.26 5, 8183-8189 (1990)）。

【０００３】α₁アドレナリン受容体のアンタゴニスト
は、血管平滑筋弛緩作用を有するので降圧剤として用い
られる。また、前立腺又は尿道の平滑筋に対する弛緩作
用もあるので泌尿器系の治療剤としても有用である。し
かし現存するα₁アドレナリン受容体のアンタゴニスト
のほとんどは、α_1A、α_1B、α_1Cという受容体のサブタ
イプの相違を認識できない。そのため、例えば泌尿器系
の治療薬として用いる際に、血管平滑筋弛緩作用及び前
立腺或いは尿道の平滑筋に対する弛緩作用を同時に発揮
してしまい、過度の血圧低下という副作用をもたらすこ
とが問題となっている。

【０００４】一方、前立腺を含む泌尿器に α₁アドレナ
リン受容体のサブタイプのうちどのタイプが多く存在す
るかについて研究がなされ、その結果、薬理学的にも遺
伝子的にも、α_1Cアドレナリン受容体がヒト前立腺の主
なサブタイプであると報告された（Price,D.T. J.Urolo
gy 149, 324A (1993)）。つまり α_1Cアドレナリン受容
体に選択的なアンタゴニスト、又はアゴニストを開発す
ることができれば、同受容体が血管平滑筋にあまり存在
しないことから、副作用の少ない泌尿器系治療剤が得ら
れることが示された。

【０００５】しかしながら、ヒトα_1Cアドレナリン受容
体を組織より単離したという、又はその遺伝子をクロー
ニングしたという報告はなされていない。従って、ヒト
α_1Cアドレナリン受容体を大量に高純度で得て、その機
能を詳細に解明することや、本受容体を発現する形質転
換細胞を作り、有用なアンタゴニスト、又はアゴニスト
の開発を行うためのアッセイ系を確立することはできな
かった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のようにヒトα_1C
アドレナリン受容体を十分量、高純度で得ること及び当
受容体を発現している形質転換細胞を得ることは非常に
困難であったため、有効なアゴニスト又はアンタゴニス
トの開発は遅れている。従って、ヒトα_1Cアドレナリン
受容体に対する有効なアゴニスト又はアンタゴニストを
開発するにあたって、また、尿失禁や排尿困難などの泌
尿器系疾患のメカニズムを解明していくには、ヒトα_1C
アドレナリン受容体の遺伝子をクローニングし、ヒトα
_1Cアドレナリン受容体を発現する形質転換細胞を作製す
ることが非常に有効な手段となる。本発明の目的は、ヒ
トα_1Cアドレナリン受容体をコードする遺伝子を提供す
ることにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情に
鑑み、鋭意研究を重ねた結果、２種のヒトα_1Cアドレナ
リン受容体のアミノ酸配列を初めて決定し、これをコー
ドする遺伝子を調製することができた。本発明の一つ
は、ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子をコードするＤ
ＮＡである。本発明のＤＮＡは、このヒトα_1Cアドレナ
リン受容体遺伝子を含むものであり、全長 2.29kbp の
ＤＮＡよりなるＰ２Ｃ４（ｃＤＮＡ）である。その配列
は配列番号３に示した。そのヌクレオチド配列は以下の
特徴を有する。 １）ウシα_1Cアドレナリン受容体（Schwinn,D.A.ら J.B
iol.Chem. 265, 8183-8189 (1990)）と共通する部分全
体の塩基配列は、８６％と高い相同性を示した。また、
翻訳可能領域の塩基配列のウシα_1Cアドレナリン受容体
との相同性は９０％とさらに高かった。 ２）開始コドンの位置はウシα_1Cアドレナリン受容体と
一致し、終止コドンもウシα_1Cアドレナリン受容体が T
AA であるのに対してＰ２Ｃ４は TAG であって異なった
ものになっているが、その位置はよく一致していた。

【０００８】この塩基配列より導かれる本発明の受容体
のアミノ酸配列は配列番号１に示した。そのアミノ酸配
列は以下の特徴を有する。 １）アミノ酸残基数は４６６で、ウシα_1Cアドレナリン
受容体の予想されるアミノ酸残基と同一であった。この
クローンとウシα_1Cアドレナリン受容体との間のアミノ
酸配列の相同性は、全体で９２％であった。 ２）７個の膜貫通領域を有しており、他のアドレナリン
受容体と同じく、Ｇ蛋白共役受容体のファミリーである
ことが示唆されていた。 ３）その膜貫通領域のウシα_1Cアドレナリン受容体との
アミノ酸配列の相同性は９７％、７回膜貫通以降のテー
ルの部分の相同性は８３％であった。 以上の結果より、このＰ２Ｃ４はヒトα_1Cアドレナリン
受容体遺伝子をコードしたものであることが判明した。

【０００９】また本発明のＤＮＡは、ヒトα_1Cアドレナ
リン受容体遺伝子を含むものであり、全長 1.89kbp の
ＤＮＡよりなるＰ２Ｃ７（ｃＤＮＡ）である。その配列
は配列番号４に示した。この塩基配列より導かれる本発
明の受容体のアミノ酸配列は配列番号２に示した。その
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はＰ２Ｃ４と同様の
特徴を有する。

【００１０】本発明のｃＤＮＡはヒト前立腺のｃＤＮＡ
ライブラリーから、たとえばプラークハイブリダイゼー
ション法を利用して得ることができる。この方法によれ
ば、既に塩基配列がわかっている、ヒトα_1Aやα_1Bアド
レナリン受容体のα₁アドレナリン受容体ファミリーに
共通すると思われる相同性の高い配列のプローブ又はウ
シα₁アドレナリン受容体遺伝子をプローブとして用
い、ｃＤＮＡライブラリーからプローブと相補的な塩基
配列を持つＤＮＡを得ることができる。一度に全長が得
られなくても、たとえばＮ末端寄りの部分、Ｃ末端寄り
の部分を、塩基配列の相同性により同一のｍＲＮＡ由来
のものと確認できれば、適当な制限酵素切断部位でつな
ぎ換えて、全長を得てもよい。このようにしてヒトα_1C
アドレナリン受容体を形成するために必要なすべての遺
伝情報を有する本発明のｃＤＮＡが得られる。

【００１１】こうして得られたｃＤＮＡは、適当なベク
ター、例えばプラスミドまたはファージに挿入し、これ
を宿主となるバクテリア、例えば大腸菌ＨＢ１０１株や
サッカロマイセス・セルビシエ等に導入し形質転換する
ことにより、大量に生産させることができる。こうして
得られた形質転換体も本発明に含まれる。また、本発明
のｃＤＮＡは、適当なベクター、例えばプラスミドまた
はウィルスに挿入し、これを宿主となる動物細胞、例え
ばＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞等に導入し形質転換すること
により、細胞膜に大量に発現させることができる。宿主
は酵母を用いてもよい。このようにして得たヒトα_1Cア
ドレナリン受容体を発現させた本発明の細胞は、例えば
当受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニ
ングの研究に用いることができる。

【００１２】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明するが、これらの実施例は本発明を制限するものでは
ない。なお、下記実施例において、各操作は特に明示が
ない限り、サムブルック等のマニュアル（Sambrook,J.
ら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd E
d.,Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
ring Harbor,NY (1989)）に記載されている方法により
行った。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体
的使用方法は市販品の指示書に従った。

【００１３】（Ａ）ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子
のｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング ヒト前立腺のｃＤＮＡライブラリー（λgt11、1×10⁶ p
fu クローンテック社）からまずヒト脳α_1Aアドレナリ
ン受容体の遺伝子中のヒトα₁アドレナリン受容体ファ
ミリーに相同性の高い部分である PstI-XhoI 断片（480
bp）（Bruno,J.F ら Biochem.Biophys.Res.Commun. 17
9, 1485-1490 (1991)）及びウシα_1Cアドレナリン受容
体（Schwinn,D.A.ら J.Biol.Chem. 265, 8183-8189 (19
90)）のＰＣＲ産物（残基番号 810-1524：715bp）をプ
ローブにしてスクリーニングした。プローブの標識はジ
ゴキシゲニンＤＮＡ−ラベリングキット（ベーリンガー
マンハイム社）を用いて行なった。

【００１４】ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー 4×10⁵
pfu を大腸菌 Y1090 株に吸収させて寒天プレート上に
まき、３７℃で９時間培養した。その寒天上にナイロン
フィルター（Schleicher & Schuell 社）を置き１−２
分間放置してファージをフィルターに吸着させた後、ア
ルカリ液（0.5N NaOH, 1.5M NaCl）に５分間浸し、変性
処理を行った。中和液（0.5M Tris-HCl pH7.5, 1.5M Na
Cl）で５分間中和した後、さらに 2 × SSC で５分間洗
浄した。その後、８０℃、２時間のベーキング又はＵＶ
ストラタリンカー２４００（Stratagene 社）で処理し
ＤＮＡをフィルターに固定した。ハイブリダイズおよび
発色の条件はＤＮＡラベリングキット（ベーリンガーマ
ンハイム社）に従った。ポジティブプラークをパスツー
ルピペットの頭部を使用して掻き取り、1 mlのＳＭバッ
ファー（50mM Tris-HCl pH7.5, 0.1M NaCl, 8mM MgSO₄,
0.01%(W/V)ゼラチン）中で３７℃で１時間放置し、ク
ロロホルムを１滴加え、ファージ液とした。このファー
ジ液を、大腸菌Y1090を宿主に培養し、QIAGEN LAMBDA K
IT（QIAGEN社）を使用してラムダファージＤＮＡを精製
した。このＤＮＡの一部を制限酵素EcoRI で切断した
後、１％低温溶解性アガロースゲルを用いた電気泳動で
EcoRI断片を分離した。ゲルから回収したＤＮＡ断片は
ELUTIP-d（Schleicher & Schuell 社）で精製した。

【００１５】（Ｂ）ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子
のプラスミドベクターへのサブクローニング プラスミドベクター（ｐＵＣ１８及び１１９）を EcoRI
切断後、大腸菌アルカリフォスファターゼ処理した。
このベクター 0.1μg とファージＤＮＡ断片とをライ
ゲーションした後、大腸菌ＴＢ１を形質転換し、アンピ
シリンおよびＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート（40 g/ml
の X-gal 及び 100ng/ml の アンヒ゜シリン を含む）上で選択
を行なった。１６時間、３７℃で培養後、白いコロニー
のみ数個選び、 1.5 ml のＬＢ培地で培養後、アルカリ
抽出法（Sambrook,J.ら Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, 2nd Ed.,Vol.1-3, Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor,NY (1989)）でプラスミ
ドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを Eco
RI で切断した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行
った。このゲルをアルカリ液（0.5N NaOH、0.5M NaCl）
で０.５−１時間処理し、Vacugene 2016（ＬＫＢ社）を
使って、ナイロンフィルター（Schleicher & Schuell
社）にアルカリ条件下で３０分 −１時間ＤＮＡをトラ
ンスファーした。このフィルターを 2 x SSC で洗浄
後、ＵＶストラタリンカー 2400を使って固定し、ハイ
ブリダイゼーションを行なった。ヒト脳α_1Aアドレナリ
ン受容体の PstI-XhoI 断片（480bp）及びウシα_1Cアド
レナリン受容体のＰＣＲ産物（715bp）をプローブにし
て検出した。ハイブリダイズおよび発色の条件はＤＮＡ
ラベリングキット（ベーリンガーマンハイム社）に従っ
た。プローブで発色し検出したＤＮＡの位置が、ファー
ジより切り出されたｃＤＮＡと同じものであることが確
認されたプラスミドを持つ大腸菌を選び出し、サブクロ
ーニングされたインサートの塩基配列の決定を行った。

【００１６】（Ｃ）ｃＤＮＡインサートの全塩基配列の
決定 上記の方法で、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１９に組み込ま
れたＤＮＡが、ファージより切り出したｃＤＮＡと同じ
ものであることが確認された大腸菌を、ＬＢ培地で一晩
培養し、ＤＮＡの調製に用いた。培養液は、常法に従
い、アルカリ抽出法でＤＮＡを抽出後、塩化セシウム密
度勾配超遠心分離を２回行いＤＮＡを精製した。超遠心
機はベックマン L8-70 を用いて、68,000 rpm で１６時
間、更にベックマン TL-100 を用いて 100,000 rpm で
５時間遠心を行なった。精製したＤＮＡの濃度は 260nm
の吸光度より算定した。

【００１７】ＤＮＡの塩基配列の決定はＡＢＩ ３７３
Ａ ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム
社）を用いて行った。1-2μg のプラスミドＤＮＡを塩
基配列の決定に用いた。プライマーは New England Bio
Labs 社の M13/pUC Sequencing Primer #1224、M13/pU
C SequencingPrimer #1211、M13/pUC reverse sequenci
ng Primer #1233、M13/pUC reversesequencing Primer
#1201を用いた。塩基配列のデータ解析には GeneWorks
（Intelligenetic社）を、ホモロジー検索にはピアソン
の fast A （Pearson,W.R.ら Proc.Natl.Acad.Sci.USA
85, 2444-2448 (1988)）を用いた。

【００１８】以上のようにして塩基配列を決定し、ウシ
α_1Cアドレナリン受容体の遺伝子とホモロジー検索をし
た結果、非常に相同性の高いクローンＰ２（1687bp）と
クローンＣ４（903bp）及びクローンＣ７（480bp）の３
種のクローンが得られた。クローンＰ２は翻訳可能領域
1251bp を含んでおり、開始コドンより 436bp上流から
７回目の膜貫通領域までを含んでいたが、Ｃ末端の部分
は欠けていた。クローンＣ４及びクローンＣ７は、それ
ぞれ、ウシα_1Cアドレナリン受容体のＣ末端領域と高い
相同性を示し、Ｃ末端も含んでいた。Ｐ２クローンは、
配列番号３に記載してある配列の１−１６８７番を含ん
でおり、Ｃ４は１３８８−２２９０番まで、Ｃ７は１４
１１−１８９０番までをそれぞれコードしていた。つま
り、Ｐ２とＣ４は 300bp、Ｐ２とＣ７は 277bp の共通
領域を持っていた。クローンＣ７はクローンＣ４と一箇
所塩基が異なっていた。つまり配列番号３に記載の第１
７２７番目のＧがＣに置き換わっており、その結果４３
１番目のアミノ酸ＧｌｕがＧｌｎになっていた。Ｐ２と
Ｃ４及びＰ２とＣ７のそれぞれのクローンの配列の重な
り合う部分の塩基配列は完全に一致したことから、それ
ぞれのクローンの組み合わせは同じｍＲＮＡ由来のもの
であることが判明した。そこでＰ２とＣ４は両者に共通
する領域に存在する PvuII の制限酵素サイト（配列番
号３の１３９３番目）で、またＰ２とＣ７は StuI の制
限酵素サイト（配列番号３の１４４３番目）で、常法に
従いそれぞれののクローンを組換え、全長を含むヒトα
_1Cアドレナリン受容体遺伝子をＰ２Ｃ４及びＰ２Ｃ７を
作製した。

【００１９】（Ｄ）ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子
の塩基配列とアミノ酸配列の解析 Ｐ２Ｃ４の全長は 2.29kbp で（配列番号３）、翻訳可
能領域は 1398bp、５'−非翻訳領域は436bp、３'−非翻
訳領域は 456bp であった。５'−非翻訳領域はウシα_1C
アドレナリン受容体より長く、３'−非翻訳領域はウシ
α_1Cアドレナリン受容体より短く、ポリＡテールは認め
られなかった。ウシα_1Cアドレナリン受容体との共通す
る部分全体の塩基配列は、８６％と高い相同性を示し
た。また、翻訳可能領域の塩基配列のウシα_1Cアドレナ
リン受容体との相同性は９０％とさらに高かった。開始
コドンの位置はウシα_1Cアドレナリン受容体と一致し、
終止コドンもウシα_1Cアドレナリン受容体が TAA であ
るのに対してＰ２Ｃ４は TAGであり異なったものになっ
ているがその位置はよく一致していた。この塩基配列よ
り予想されるアミノ酸残基数は４６６で、ウシα_1Cアド
レナリン受容体の予想されるアミノ酸残基数と同一であ
った。このクローンとウシα_1Cアドレナリン受容体との
アミノ酸配列の相同性は、全体で９２％であり、膜貫通
領域は９７％、７回膜貫通以降のテールの部分は８３％
であった。一方、ヒトα_1Aアドレナリン受容体とのアミ
ノ酸配列の相同性は、全体で４５％、膜貫通領域は６７
％であり、ヒトα_1Bアドレナリン受容体とのアミノ酸配
列の相同性は、全体で４６％、膜貫通領域は７６％であ
った。

【００２０】また、Kyte-Doolittle のハイドロパシー
解析から（Kyte,J.ら J.Mol.Biol.157, 105-132 (198
2)）、Ｐ２Ｃ４に、Ｇ−蛋白共役受容体ファミリーで報
告されている７つの疎水性の高い領域（Trumpp-Kallmey
er,S.ら J.Med.Chem. 35,3448-3462 (1992)）が認めら
れた（図１）。以上の結果より、このＰ２Ｃ４はヒトα
_1Cアドレナリン受容体遺伝子をコードしたものであるこ
とが判明した。

【００２１】Ｐ２Ｃ７についても同様の解析を行った結
果、Ｐ２Ｃ４との相同性は９９％以上であり、同じ性質
を示したことから、この遺伝子もヒトα_1Cアドレナリン
受容体遺伝子をコードしたものであることが判明した
（配列番号４）。これらの結果はヒトα_1Cアドレナリン
受容体遺伝子は少なくとも２種存在し、遺伝子多型があ
ることを示している。

【００２２】（Ｅ）ヒトα_1Cアドレナリン受容体Ｐ２Ｃ
４の動物細胞での一過性形質発現 ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子、Ｐ２Ｃ４の EcoRI
-PstI 断片(塩基番号1-2065)を動物細胞の発現ベクター
ｐＭＥ１８Ｓ（Takebe,Y.ら、Mol.Cell.Biol.8,466-472
(1988)）の EcoRI-PstI サイトに、常法に従って組み
込み、得られたＤＮＡをｐＭＥ１８Ｓ−Ｐ２Ｃ４と名付
けた。このｐＭＥ１８Ｓ−Ｐ２Ｃ４をＤＥＡＥーデキス
トラン法（Cullen,B.R.ら Nethods Enzymol. 152, 684-
704 (1987)）でＣＯＳ−７細胞に形質導入し、４８−７
２時間後に細胞を収穫した。収穫したＣＯＳ−７細胞
は、ブランソンの超音波破砕機（Model SONIFIER 250）
を用いて破砕し、3,000 × g で１０分間遠心した。そ
の上清液をさらに 35,000 ×g で２０分間遠心し、その
沈澱を結合緩衝液（50 mM Tris-HCl pH7.4, 12.5mMMgCl
₂, 10mM EGTA）で懸濁し、発現したヒトα_1Cアドレナリ
ン受容体が含まれている膜画分とした。蛋白量の測定は
ＢＣＡ蛋白アッセイキット（PIERCE社）を用いた。

【００２３】発現した受容体がヒトα_1Cアドレナリン受
容体であることを確認するため、α₁アドレナリン受容
体のアンタゴニストであるＨＥＡＴ（2-β-(4-hydroxyp
henyl)-ethylaminomethyl)-tetralone）と、各種アゴニ
スト又はアンタゴニストとの競争実験を行った。約 10
μg の蛋白質を含む膜蛋白に約 70pMの ¹²⁵ＩーＨＥＡＴ
（ 81.4TBq/mmol、ニューイングランドニュークレア
社）と各種アゴニスト又はアンタゴニストを加え、２５
℃で６０分間反応させた。１アッセイ当りの溶液量は 2
50μl とした。その後、この混合液を、氷冷した結合緩
衝液で希釈し、速やかにブランデルセルハーベスタ（ブ
ランデル社製Model-30）を用い、ワットマンＧＦ／Ｃの
グラスフィルターを通し、さらに氷冷した結合緩衝液で
洗浄した。フィルター上に残存した¹²⁵Ｉの放射活性を
ガンマーカウンター（アロカ社、ARC-370M）で測定し、
ムンソンらのＬＩＧＡＮＤプログラム（Munson,P.J. An
alytical Biochemistry107,220-239 (1980)）でＫｉ値
を計算した。

【００２４】種々のアゴニスト又はアンタゴニストのＨ
ＥＡＴに対する結合阻害のＫｉ値を表１に示した。

【００２５】

【表１】 この実験結果は以下の特徴を示している。 １）アゴニストの結合阻害の強さは オキシメタゾリン
>> (-)エピネフィリン >ノルエピネフィリン >> イソプ
ロテレノール の順であった。 ２）アゴニストの結合はα₁アンタゴニストのプラゾシ
ンで強く阻害されるが、α₂アンタゴニストのヨヒンビ
ンの阻害は弱いものであった。 ３）アゴニストのオキシメタゾリン並びにメソキサミン
及びアンタゴニストの WB4101（2-(2,6-dimethoxypheno
xyethyl-)aminomethyl-1,4-benzodioxane）並びにフェ
ントールアミンの結合阻害力が、α_1Bアドレナリン受容
体における阻害力（Lomasney,J.W.ら J.Biol.Chem. 26
6, 6365-6369 (1991)）より、１０−１００倍程度強
い。これらの特徴は、発現した受容体はα₁アドレナリ
ン受容体ファミリーのうち、α_1Aもしくはα_1Cアドレナ
リン受容体であることを示している。さらにロマズネイ
らの方法に従い（Lomasney,J.W.ら J.Biol.Chem. 266,
6365-6369 (1991)）、発現細胞より調製した細胞膜をＣ
ＥＣ（Chlorethylclonidine）処理することにより、Ｈ
ＥＡＴの受容体に対する結合を不可逆的に阻害するか否
かを調べた結果、結合が９７％阻害された。α_1Aアドレ
ナリン受容体はＣＥＣで阻害されない（Lomasney,J.W.
ら J.Biol.Chem. 266, 6365-6369 (1991)）ため、発現
した受容体はヒトα_1Cアドレナリン受容体であることが
確認された。

【００２６】（Ｆ）ヒトα_1C−アドレナリン受容体遺伝
子の安定形質発現細胞の作製 ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子が核内染色体ＤＮＡ
に導入された、安定形質発現細胞を作製した。このこと
により、均一な発現受容体をもった細胞を、継代培養す
ることにより再現性よく大量に調製することができる。
つまり、薬物のスクリーニング系に好都合な形質転換細
胞が得られることになる。

【００２７】（Ｆ−１）発現ベクターへの導入 発現ベクターｐＳＶＫ３−neoＲ（ファルマシア社の発
現ベクターｐＳＶＫ３のＳＶ４０の初期プロモーターの
下流にある NaeI サイトに、ｐＭＡＭ−neo（クロンテ
ック社）のネオマイシン耐性遺伝子の領域を含んだ約
2.7kbp の BamHI断片を順方向に組み込んだベクター）
の EcoRI サイトにヒトα_1C−アドレナリン受容体遺伝
子Ｐ２Ｃ７を組み込んだ。大腸菌ＨＢ１０１に組み換え
たＤＮＡを導入し、50mM のカナマイシンで選択した。
得られたコロニーの内、２４コロニーを任意に選び、培
養後、アルカリ法でＤＮＡを抽出した。これらのクロー
ンのＤＮＡは 1.89kbp の EcoRI 断片があること及び E
coRV-XhoI で約 0.5kbp の断片が出現することから、Ｓ
Ｖ４０のプロモーターに対して順方向に入ったクローン
であることを確認した。Ｐ２Ｃ７が組み込まれたベクタ
ーをｐＳＶＫ−Ｐ２Ｃ７と命名した。得られたベクター
をＣＨＯ（chinease hamster ovary）細胞に以下の方法
で導入し、安定形質発現細胞を確立した。

【００２８】（Ｆ−２）リポフェクション法によるＰ２
Ｃ７遺伝子の動物細胞への導入 リポフェクチン（GIBCO BRL社）を使い、そのマニュア
ルに従い遺伝子の導入を行った。直径６０ｍｍのディシ
ュ（コーニング社）に 2x10⁵ 個のＣＨＯ細胞を継代
し、２４時間培養した。4.5μg のｐＳＶＫ−Ｐ２Ｃ７
を制限酵素 ScaIで切断し、直鎖状にしたＤＮＡを 100
μl の無血清のＨａｍｍ’ｓＦ１２培地に溶解し、リポ
フェクチン 50μl に無血清のＨａｍｍ’ｓＦ１２培地
を加え 100μl としたものとを混和し、室温で１５分間
静置した。その後、無血清のＨａｍｍ’ｓＦ１２培地で
２回洗浄した細胞に、この混和液に同培地を混和して 2
mlにした液を加えた。２４時間後、１０％の仔牛血清入
りのＨａｍｍ’ｓＦ１２培地と入れ替え、４８時間培養
した。その後 0.6mg/ml の濃度のＧ４１８（ジェネティ
シン：GIBCO BRL社）を含む１０％の血清入りのＨａｍ
ｍ’ｓＦ１２培地で選択を開始した。Ｇ４１８を含む培
地は２−３日間隔で交換した。１０−１４日の間にＧ４
１８耐性のクローンの選択を行い、２０個のクローンを
直径６０ｍｍのディッシュに移した。実施例（Ｅ）に記
載されている方法で各々のクローンより細胞膜を調製
し、受容体の発現の有無をレセプターアッセイで確認し
たところ、３つのクローンに発現が認められた。このう
ちの１つのクローンについて更に詳細にレセプターアッ
セイを行なった結果を表２に示す。

【００２９】

【表２】 実験例（Ｅ）で示した結果と同様の特徴を示し、発現し
た受容体はα_1Cアドレナリン受容体であることを示して
いる。

【００３０】（Ｆ−３）Ｃａ²⁺の細胞内の上昇作用 レセプターアッセイでは、細胞膜上の受容体の結合阻害
活性のみしか測定できないため、アゴニストとアンタゴ
ニストを区別することができない。そこで、細胞膜の受
容体から細胞内情報伝達系を測定すること、例えば以下
に示す様な細胞内Ｃａ²⁺を測定することにより、アゴニ
スト作用を見ることが可能となる。これによりスクリー
ニングする薬物がアゴニストであるかアンタゴニストで
あるかを区別することができる。以下にその実施例を示
す。

【００３１】細胞内Ｃａ²⁺濃度の測定は、蛍光色素 Fur
a-2 がＣａ²⁺と結合すると蛍光を発するという原理に基
づいて行った。５枚の直径９０ｍｍディシュで培養した
ｐＳＶＫ−Ｐ２Ｃ７が組み込まれた対数増殖期の安定形
質発現細胞を 0.025% トリプシン／ 0.02% ＥＤＴＡで
剥がし、8.2mlの Ｃａ²⁺ローディング緩衝液（140mM Na
Cl,4mM KCl,1mM MgCl₂,1.25 mMCaCl₂,1mM Na₂HPO₄,5mM
Hepes,11mM グルコース,0.2% BSA,pH 7.4）で懸濁し 4m
l ずつ分注した。この細胞懸濁液に Fura-2-AM（Furaー2
の Acetoxyl methyl体）を 16μl（1mM DMSO溶液：同
仁（株））を添加し、遮光状態で２５℃で振盪した。３
０分後 1500rpm で３分間遠心し、細胞を回収した。更
に 4ml のＣａ²⁺ローディング緩衝液で洗浄後、同様に
遠心し、再度 5ml のＣａ²⁺ローディング緩衝液で細胞
を懸濁し測定に用いた。

【００３２】細胞内Ｃａ²⁺濃度は、細胞内の蛍光強度
を、日本分光社製細胞内イオン測定装置ＣＡＦ−１１０
により測定しマックラボシステム（アナログ・ディジタ
ル・インストゥルメント社）で解析することにより算定
した。 0.5ml の Fura-2 ローディング細胞懸濁液を回
転子が入ったセルに分注し、ＣＡＦ−１１０にセルを設
置し、２５℃で、励起波長 340nm で 380nm の蛍光強度
（F340）を、同時に励起波長 380nm で 500nm の蛍光強
度（F500）を波長を測定し、両者の比 R=F340/F500 を
求めた。１−２分間経ち値が安定した後、5μl の試験
薬剤を加え、蛍光強度が一定になるまで反応させ、その
値を測定した（下記の式で R と表す）。反応終了後、
最終濃度 0.2% TritonX-100 を入れ完全に細胞破壊し蛍
光強度を測定した（その時の R の値を Rmax、F380 の
値を Fmax と表す）。更に最終濃度 3mM となるようＥ
ＤＴＡを加え蛍光強度を測定した（その時の R の値を
Rmin、F380 の値を Fmin と表す）。

【００３３】以下の式に従い細胞内Ｃａ²⁺濃度を算定し
た。 ［Ca²⁺］＝ Kd × β × (R - Rmin)/(Rmax - R) 但し Kd： Fura-2-AM の解離定数（224nM） β= Fmin/Fmax ヒトα_1Cアドレナリン受容体遺伝子Ｐ２Ｃ７を安定形質
発現したＣＨＯ細胞を使い、受容体のアゴニストである
ノルエピネフリンおよびフェニレフリンの細胞内Ｃａ²⁺
濃度に及ぼす影響を上記の方法で測定した。図２に示し
たようにアゴニストの濃度に依存して細胞内Ｃａ²⁺濃度
が上昇し、α₁受容体に特徴的な挙動を示し、Ｐ２Ｃ７
遺伝子はヒトα_1Cアドレナリン受容体をコードしている
ことが示された。

【００３４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 組織の種類：前立腺 直接の起源 ライブラリー名：ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー 配列 Met Val Phe Leu Ser Gly Asn Ala Ser Asp Ser Ser Asn Cys Thr Gln 1 5 10 15 Pro Pro Ala Pro Val Asn Ile Ser Lys Ala Ile Leu Leu Gly Val Ile 20 25 30 Leu Gly Gly Leu Ile Leu Phe Gly Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile 35 40 45 Leu Ser Val Ala Cys His Arg His Leu His Ser Val Thr His Tyr Tyr 50 55 60 Ile Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Thr Ser Thr Val Leu 65 70 75 80 Pro Phe Ser Ala Ile Phe Glu Val Leu Gly Tyr Trp Ala Phe Gly Arg 85 90 95 Val Phe Cys Asn Ile Trp Ala Ala Val Asp Val Leu Cys Cys Thr Ala 100 105 110 Ser Ile Met Gly Leu Cys Ile Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Ile Gly Val 115 120 125 Ser Tyr Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Ile Val Thr Gln Arg Arg Gly Leu 130 135 140 Met Ala Leu Leu Cys Val Trp Ala Leu Ser Leu Val Ile Ser Ile Gly 145 150 155 160 Pro Leu Phe Gly Trp Arg Gln Pro Ala Pro Glu Asp Glu Thr Ile Cys 165 170 175 Gln Ile Asn Glu Glu Pro Gly Tyr Val Leu Phe Ser Ala Leu Gly Ser 180 185 190 Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Ile Ile Leu Val Met Tyr Cys Arg Val Tyr 195 200 205 Val Val Ala Lys Arg Glu Ser Arg Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Thr 210 215 220 Asp Lys Ser Asp Ser Glu Gln Val Thr Leu Arg Ile His Arg Lys Asn 225 230 235 240 Ala Pro Ala Gly Gly Ser Gly Met Ala Ser Ala Lys Thr Lys Thr His 245 250 255 Phe Ser Val Arg Leu Leu Lys Phe Ser Arg Glu Lys Lys Ala Ala Lys 260 265 270 Thr Leu Gly Ile Val Val Gly Cys Phe Val Leu Cys Trp Leu Pro Phe 275 280 285 Phe Leu Val Met Pro Ile Gly Ser Phe Phe Pro Asp Phe Lys Pro Ser 290 295 300 Glu Thr Val Phe Lys Ile Val Phe Trp Leu Gly Tyr Leu Asn Ser Cys 305 310 315 320 Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Pro Cys Ser Ser Gln Glu Phe Lys Lys Ala 325 330 335 Phe Gln Asn Val Leu Arg Ile Gln Cys Leu Arg Arg Lys Gln Ser Ser 340 345 350 Lys His Ala Leu Gly Tyr Thr Leu His Pro Pro Ser Gln Ala Val Glu 355 360 365 Gly Gln His Lys Asp Met Val Arg Ile Pro Val Gly Ser Arg Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Arg Ile Ser Lys Thr Asp Gly Val Cys Glu Trp Lys Phe Phe 385 390 395 400 Ser Ser Met Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ile Thr Val Ser Lys Asp Gln 405 410 415 Ser Ser Cys Thr Thr Ala Arg Val Arg Ser Lys Ser Phe Leu Glu Val 420 425 430 Cys Cys Cys Val Gly Pro Ser Thr Pro Ser Leu Asp Lys Asn His Gln 435 440 445 Val Pro Thr Ile Lys Val His Thr Ile Ser Leu Ser Glu Asn Gly Glu 450 455 460 Glu Val 465

【００３５】 配列番号：２ 配列の長さ：４６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 組織の種類：前立腺 直接の起源 ライブラリー名：ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー 配列 Met Val Phe Leu Ser Gly Asn Ala Ser Asp Ser Ser Asn Cys Thr Gln 1 5 10 15 Pro Pro Ala Pro Val Asn Ile Ser Lys Ala Ile Leu Leu Gly Val Ile 20 25 30 Leu Gly Gly Leu Ile Leu Phe Gly Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile 35 40 45 Leu Ser Val Ala Cys His Arg His Leu His Ser Val Thr His Tyr Tyr 50 55 60 Ile Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Thr Ser Thr Val Leu 65 70 75 80 Pro Phe Ser Ala Ile Phe Glu Val Leu Gly Tyr Trp Ala Phe Gly Arg 85 90 95 Val Phe Cys Asn Ile Trp Ala Ala Val Asp Val Leu Cys Cys Thr Ala 100 105 110 Ser Ile Met Gly Leu Cys Ile Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Ile Gly Val 115 120 125 Ser Tyr Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Ile Val Thr Gln Arg Arg Gly Leu 130 135 140 Met Ala Leu Leu Cys Val Trp Ala Leu Ser Leu Val Ile Ser Ile Gly 145 150 155 160 Pro Leu Phe Gly Trp Arg Gln Pro Ala Pro Glu Asp Glu Thr Ile Cys 165 170 175 Gln Ile Asn Glu Glu Pro Gly Tyr Val Leu Phe Ser Ala Leu Gly Ser 180 185 190 Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Ile Ile Leu Val Met Tyr Cys Arg Val Tyr 195 200 205 Val Val Ala Lys Arg Glu Ser Arg Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Thr 210 215 220 Asp Lys Ser Asp Ser Glu Gln Val Thr Leu Arg Ile His Arg Lys Asn 225 230 235 240 Ala Pro Ala Gly Gly Ser Gly Met Ala Ser Ala Lys Thr Lys Thr His 245 250 255 Phe Ser Val Arg Leu Leu Lys Phe Ser Arg Glu Lys Lys Ala Ala Lys 260 265 270 Thr Leu Gly Ile Val Val Gly Cys Phe Val Leu Cys Trp Leu Pro Phe 275 280 285 Phe Leu Val Met Pro Ile Gly Ser Phe Phe Pro Asp Phe Lys Pro Ser 290 295 300 Glu Thr Val Phe Lys Ile Val Phe Trp Leu Gly Tyr Leu Asn Ser Cys 305 310 315 320 Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Pro Cys Ser Ser Gln Glu Phe Lys Lys Ala 325 330 335 Phe Gln Asn Val Leu Arg Ile Gln Cys Leu Arg Arg Lys Gln Ser Ser 340 345 350 Lys His Ala Leu Gly Tyr Thr Leu His Pro Pro Ser Gln Ala Val Glu 355 360 365 Gly Gln His Lys Asp Met Val Arg Ile Pro Val Gly Ser Arg Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Arg Ile Ser Lys Thr Asp Gly Val Cys Glu Trp Lys Phe Phe 385 390 395 400 Ser Ser Met Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ile Thr Val Ser Lys Asp Gln 405 410 415 Ser Ser Cys Thr Thr Ala Arg Val Arg Ser Lys Ser Phe Leu Gln Val 420 425 430 Cys Cys Cys Val Gly Pro Ser Thr Pro Ser Leu Asp Lys Asn His Gln 435 440 445 Val Pro Thr Ile Lys Val His Thr Ile Ser Leu Ser Glu Asn Gly Glu 450 455 460 Glu Val 465

【００３６】 配列番号：３ 配列の長さ：２２９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 組織の種類：前立腺 直接の起源 ライブラリー名：ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４３７．．１８３４ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GAATTCCGAA TCATGTGCAG AATGCTGAAT CTTCCCCCAG CCAGGACGAA TAAGACAGCG 60 CGGAAAAGCA GATTCTCGTA ATTCTGGAAT TGCATGTTGC AAGGAGTCTC CTGGATCTTC 120 GCACCCAGCT TCGGGTAGGG AGGGAGTCCG GGTCCCGGGC TAGGCCAGCC CGGCAGGTGG 180 AGAGGGTCCC CGGCAGCCCC GCGCGCCCCT GGCCATGTCT TTAATGCCCT GCCCCTTCAT 240 GTGGCCTTCT GAGGGTTCCC AGGGCTGGCC AGGGTTGTTT CCCACCCGCG CGCGCGCTCT 300 CACCCCCAGC CAAACCCACC TGGCAGGGCT CCCTCCAGCC GAGACCTTTT GATTCCCGGC 360 TCCCGCGCTC CCGCCTCCGC GCCAGCCCGG GAGGTGGCCC TGGACAGCCG GACCTCGCCC 420 GGCCCCGGCT GGGACC ATG GTG TTT CTC TCG GGA AAT GCT TCC GAC AGC TCC 472 Met Val Phe Leu Ser Gly Asn Ala Ser Asp Ser Ser 1 5 10 AAC TGC ACC CAA CCG CCG GCA CCG GTG AAC ATT TCC AAG GCC ATT CTG 520 Asn Cys Thr Gln Pro Pro Ala Pro Val Asn Ile Ser Lys Ala Ile Leu 15 20 25 CTC GGG GTG ATC TTG GGG GGC CTC ATT CTT TTC GGG GTG CTG GGT AAC 568 Leu Gly Val Ile Leu Gly Gly Leu Ile Leu Phe Gly Val Leu Gly Asn 30 35 40 ATC CTA GTG ATC CTC TCC GTA GCC TGT CAC CGA CAC CTG CAC TCA GTC 616 Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Ala Cys His Arg His Leu His Ser Val 45 50 55 60 ACG CAC TAC TAC ATC GTC AAC CTG GCG GTG GCC GAC CTC CTG CTC ACC 664 Thr His Tyr Tyr Ile Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Thr 65 70 75 TCC ACG GTG CTG CCC TTC TCC GCC ATC TTC GAG GTC CTA GGC TAC TGG 712 Ser Thr Val Leu Pro Phe Ser Ala Ile Phe Glu Val Leu Gly Tyr Trp 80 85 90 GCC TTC GGC AGG GTC TTC TGC AAC ATC TGG GCG GCA GTG GAT GTG CTG 760 Ala Phe Gly Arg Val Phe Cys Asn Ile Trp Ala Ala Val Asp Val Leu 95 100 105 TGC TGC ACC GCG TCC ATC ATG GGC CTC TGC ATC ATC TCC ATC GAC CGC 808 Cys Cys Thr Ala Ser Ile Met Gly Leu Cys Ile Ile Ser Ile Asp Arg 110 115 120 TAC ATC GGC GTG AGC TAC CCG CTG CGC TAC CCA ACC ATC GTC ACC CAG 856 Tyr Ile Gly Val Ser Tyr Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Ile Val Thr Gln 125 130 135 140 AGG AGG GGT CTC ATG GCT CTG CTC TGC GTC TGG GCA CTC TCC CTG GTC 904 Arg Arg Gly Leu Met Ala Leu Leu Cys Val Trp Ala Leu Ser Leu Val 145 150 155 ATA TCC ATT GGA CCC CTG TTC GGC TGG AGG CAG CCG GCC CCC GAG GAC 952 Ile Ser Ile Gly Pro Leu Phe Gly Trp Arg Gln Pro Ala Pro Glu Asp 160 165 170 GAG ACC ATC TGC CAG ATC AAC GAG GAG CCG GGC TAC GTG CTC TTC TCA 1000 Glu Thr Ile Cys Gln Ile Asn Glu Glu Pro Gly Tyr Val Leu Phe Ser 175 180 185 GCG CTG GGC TCC TTC TAC CTG CCT CTG GCC ATC ATC CTG GTC ATG TAC 1048 Ala Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Ile Ile Leu Val Met Tyr 190 195 200 TGC CGC GTC TAC GTG GTG GCC AAG AGG GAG AGC CGG GGC CTC AAG TCT 1096 Cys Arg Val Tyr Val Val Ala Lys Arg Glu Ser Arg Gly Leu Lys Ser 205 210 215 220 GGC CTC AAG ACC GAC AAG TCG GAC TCG GAG CAA GTG ACG CTC CGC ATC 1144 Gly Leu Lys Thr Asp Lys Ser Asp Ser Glu Gln Val Thr Leu Arg Ile 225 230 235 CAT CGG AAA AAC GCC CCG GCA GGA GGC AGC GGG ATG GCC AGC GCC AAG 1192 His Arg Lys Asn Ala Pro Ala Gly Gly Ser Gly Met Ala Ser Ala Lys 240 245 250 ACC AAG AGC CAC TTC TCA GTG AGG CTC CTC AAG TTC TCC CGG GAG AAG 1240 Thr Lys Thr His Phe Ser Val Arg Leu Leu Lys Phe Ser Arg Glu Lys 255 260 265 AAA GCG GCC AAA ACG CTG GGC ATC GTG GTC GGC TGC TTC GTC CTC TGC 1288 Lys Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Val Val Gly Cys Phe Val Leu Cys 270 275 280 TGG CTG CCT TTT TTC TTA GTC ATG CCC ATT GGG TCT TTC TTC CCT GAT 1336 Trp Leu Pro Phe Phe Leu Val Met Pro Ile Gly Ser Phe Phe Pro Asp 285 290 295 300 TTC AAG CCC TCT GAA ACA GTT TTT AAA ATA GTA TTT TGG CTC GGA TAT 1384 Phe Lys Pro Ser Glu Thr Val Phe Lys Ile Val Phe Trp Leu Gly Tyr 305 310 315 CTA AAC AGC TGC ATC AAC CCC ATC ATA TAC CCA TGC TCC AGC CAA GAG 1432 Leu Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Pro Cys Ser Ser Gln Glu 320 325 330 TTC AAA AAG GCC TTT CAG AAT GTC TTG AGA ATC CAG TGT CTC CGC AGA 1480 Phe Lys Lys Ala Phe Gln Asn Val Leu Arg Ile Gln Cys Leu Arg Arg 335 340 345 AAG CAG TCT TCC AAA CAT GCC CTG GGC TAC ACC CTG CAC CCG CCC AGC 1528 Lys Gln Ser Ser Lys His Ala Leu Gly Tyr Thr Leu His Pro Pro Ser 350 355 360 CAG GCC GTG GAA GGG CAA CAC AAG GAC ATG GTG CGC ATC CCC GTG GGA 1576 Gln Ala Val Glu Gly Gln His Lys Asp Met Val Arg Ile Pro Val Gly 365 370 375 380 TCA AGA GAG ACC TTC TAC AGG ATC TCC AAG ACG GAT GGC GTT TGT GAA 1624 Ser Arg Glu Thr Phe Tyr Arg Ile Ser Lys Thr Asp Gly Val Cys Glu 385 390 395 TGG AAA TTT TTC TCT TCC ATG CCC CGT GGA TCT GCC AGG ATT ACA GTG 1672 Trp Lys Phe Phe Ser Ser Met Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ile Thr Val 400 405 410 TCC AAA GAC CAA TCC TCC TGT ACC ACA GCC CGG GTG AGA AGT AAA AGC 1720 Ser Lys Asp Gln Ser Ser Cys Thr Thr Ala Arg Val Arg Ser Lys Ser 415 420 425 TTT TTG GAG GTC TGC TGC TGT GTA GGG CCC TCA ACC CCC AGC CTT GAC 1768 Phe Leu Glu Val Cys Cys Cys Val Gly Pro Ser Thr Pro Ser Leu Asp 430 435 440 AAG AAC CAT CAA GTT CCA ACC ATT AAG GTC CAC ACC ATC TCC CTC AGT 1816 Lys Asn His Gln Val Pro Thr Ile Lys Val His Thr Ile Ser Leu Ser 445 450 455 460 GAG AAC GGG GAG GAA GTC TAGGACAGGA AAGATGCAGA GGAAAGGGGA 1864 Glu Asn Gly Glu Glu Val 465 ATAATCTTAG GTACCCACCC CACTTCCTTC TCGGAAGGCC AGCTCTTCTT GGAGGACAAG 1924 ACAGGACCAA TCAAAGAGGG GACCTGCTGG GAATGGGGTG GGTGGTAGAC CCAACTCATC 1984 AGGCAGCGGG TAGGGCACAG GGAAGAGGGA GGGTGTCTCA CAACCAACCA GTTCAGAATG 2044 ATACGGAACA GCATTTCCCT GCAGCTAATG CTTTCTTGGT CACTCTGTGC CCACTTCAAC 2104 GAAAACCACC ATGGGAAACA GAATTTCATG CACAATCCAA AAGACTATAA ATATAGGATT 2164 ATGATTTCAT CATGAATATT TTGAGCACAC ACTCTAAGTT TGGAGCTATT TCTTGATGGA 2224 AGTGAGGGGA TTTTATTTTC AGGCTCAACC TACTGACAGC CACATTTGAC ATTTATGCCG 2284 GAATTC 2290

【００３７】 配列番号：４ 配列の長さ：１８９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 組織の種類：前立腺 直接の起源 ライブラリー名：ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４３７．．１８３４ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GAATTCCGAA TCATGTGCAG AATGCTGAAT CTTCCCCCAG CCAGGACGAA TAAGACAGCG 60 CGGAAAAGCA GATTCTCGTA ATTCTGGAAT TGCATGTTGC AAGGAGTCTC CTGGATCTTC 120 GCACCCAGCT TCGGGTAGGG AGGGAGTCCG GGTCCCGGGC TAGGCCAGCC CGGCAGGTGG 180 AGAGGGTCCC CGGCAGCCCC GCGCGCCCCT GGCCATGTCT TTAATGCCCT GCCCCTTCAT 240 GTGGCCTTCT GAGGGTTCCC AGGGCTGGCC AGGGTTGTTT CCCACCCGCG CGCGCGCTCT 300 CACCCCCAGC CAAACCCACC TGGCAGGGCT CCCTCCAGCC GAGACCTTTT GATTCCCGGC 360 TCCCGCGCTC CCGCCTCCGC GCCAGCCCGG GAGGTGGCCC TGGACAGCCG GACCTCGCCC 420 GGCCCCGGCT GGGACC ATG GTG TTT CTC TCG GGA AAT GCT TCC GAC AGC TCC 472 Met Val Phe Leu Ser Gly Asn Ala Ser Asp Ser Ser 1 5 10 AAC TGC ACC CAA CCG CCG GCA CCG GTG AAC ATT TCC AAG GCC ATT CTG 520 Asn Cys Thr Gln Pro Pro Ala Pro Val Asn Ile Ser Lys Ala Ile Leu 15 20 25 CTC GGG GTG ATC TTG GGG GGC CTC ATT CTT TTC GGG GTG CTG GGT AAC 568 Leu Gly Val Ile Leu Gly Gly Leu Ile Leu Phe Gly Val Leu Gly Asn 30 35 40 ATC CTA GTG ATC CTC TCC GTA GCC TGT CAC CGA CAC CTG CAC TCA GTC 616 Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Ala Cys His Arg His Leu His Ser Val 45 50 55 60 ACG CAC TAC TAC ATC GTC AAC CTG GCG GTG GCC GAC CTC CTG CTC ACC 664 Thr His Tyr Tyr Ile Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Thr 65 70 75 TCC ACG GTG CTG CCC TTC TCC GCC ATC TTC GAG GTC CTA GGC TAC TGG 712 Ser Thr Val Leu Pro Phe Ser Ala Ile Phe Glu Val Leu Gly Tyr Trp 80 85 90 GCC TTC GGC AGG GTC TTC TGC AAC ATC TGG GCG GCA GTG GAT GTG CTG 760 Ala Phe Gly Arg Val Phe Cys Asn Ile Trp Ala Ala Val Asp Val Leu 95 100 105 TGC TGC ACC GCG TCC ATC ATG GGC CTC TGC ATC ATC TCC ATC GAC CGC 808 Cys Cys Thr Ala Ser Ile Met Gly Leu Cys Ile Ile Ser Ile Asp Arg 110 115 120 TAC ATC GGC GTG AGC TAC CCG CTG CGC TAC CCA ACC ATC GTC ACC CAG 856 Tyr Ile Gly Val Ser Tyr Pro Leu Arg Tyr Pro Thr Ile Val Thr Gln 125 130 135 140 AGG AGG GGT CTC ATG GCT CTG CTC TGC GTC TGG GCA CTC TCC CTG GTC 904 Arg Arg Gly Leu Met Ala Leu Leu Cys Val Trp Ala Leu Ser Leu Val 145 150 155 ATA TCC ATT GGA CCC CTG TTC GGC TGG AGG CAG CCG GCC CCC GAG GAC 952 Ile Ser Ile Gly Pro Leu Phe Gly Trp Arg Gln Pro Ala Pro Glu Asp 160 165 170 GAG ACC ATC TGC CAG ATC AAC GAG GAG CCG GGC TAC GTG CTC TTC TCA 1000 Glu Thr Ile Cys Gln Ile Asn Glu Glu Pro Gly Tyr Val Leu Phe Ser 175 180 185 GCG CTG GGC TCC TTC TAC CTG CCT CTG GCC ATC ATC CTG GTC ATG TAC 1048 Ala Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Ile Ile Leu Val Met Tyr 190 195 200 TGC CGC GTC TAC GTG GTG GCC AAG AGG GAG AGC CGG GGC CTC AAG TCT 1096 Cys Arg Val Tyr Val Val Ala Lys Arg Glu Ser Arg Gly Leu Lys Ser 205 210 215 220 GGC CTC AAG ACC GAC AAG TCG GAC TCG GAG CAA GTG ACG CTC CGC ATC 1144 Gly Leu Lys Thr Asp Lys Ser Asp Ser Glu Gln Val Thr Leu Arg Ile 225 230 235 CAT CGG AAA AAC GCC CCG GCA GGA GGC AGC GGG ATG GCC AGC GCC AAG 1192 His Arg Lys Asn Ala Pro Ala Gly Gly Ser Gly Met Ala Ser Ala Lys 240 245 250 ACC AAG AGC CAC TTC TCA GTG AGG CTC CTC AAG TTC TCC CGG GAG AAG 1240 Thr Lys Thr His Phe Ser Val Arg Leu Leu Lys Phe Ser Arg Glu Lys 255 260 265 AAA GCG GCC AAA ACG CTG GGC ATC GTG GTC GGC TGC TTC GTC CTC TGC 1288 Lys Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Val Val Gly Cys Phe Val Leu Cys 270 275 280 TGG CTG CCT TTT TTC TTA GTC ATG CCC ATT GGG TCT TTC TTC CCT GAT 1336 Trp Leu Pro Phe Phe Leu Val Met Pro Ile Gly Ser Phe Phe Pro Asp 285 290 295 300 TTC AAG CCC TCT GAA ACA GTT TTT AAA ATA GTA TTT TGG CTC GGA TAT 1384 Phe Lys Pro Ser Glu Thr Val Phe Lys Ile Val Phe Trp Leu Gly Tyr 305 310 315 CTA AAC AGC TGC ATC AAC CCC ATC ATA TAC CCA TGC TCC AGC CAA GAG 1432 Leu Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Pro Cys Ser Ser Gln Glu 320 325 330 TTC AAA AAG GCC TTT CAG AAT GTC TTG AGA ATC CAG TGT CTC CGC AGA 1480 Phe Lys Lys Ala Phe Gln Asn Val Leu Arg Ile Gln Cys Leu Arg Arg 335 340 345 AAG CAG TCT TCC AAA CAT GCC CTG GGC TAC ACC CTG CAC CCG CCC AGC 1528 Lys Gln Ser Ser Lys His Ala Leu Gly Tyr Thr Leu His Pro Pro Ser 350 355 360 CAG GCC GTG GAA GGG CAA CAC AAG GAC ATG GTG CGC ATC CCC GTG GGA 1576 Gln Ala Val Glu Gly Gln His Lys Asp Met Val Arg Ile Pro Val Gly 365 370 375 380 TCA AGA GAG ACC TTC TAC AGG ATC TCC AAG ACG GAT GGC GTT TGT GAA 1624 Ser Arg Glu Thr Phe Tyr Arg Ile Ser Lys Thr Asp Gly Val Cys Glu 385 390 395 TGG AAA TTT TTC TCT TCC ATG CCC CGT GGA TCT GCC AGG ATT ACA GTG 1672 Trp Lys Phe Phe Ser Ser Met Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ile Thr Val 400 405 410 TCC AAA GAC CAA TCC TCC TGT ACC ACA GCC CGG GTG AGA AGT AAA AGC 1720 Ser Lys Asp Gln Ser Ser Cys Thr Thr Ala Arg Val Arg Ser Lys Ser 415 420 425 TTT TTG CAG GTC TGC TGC TGT GTA GGG CCC TCA ACC CCC AGC CTT GAC 1768 Phe Leu Gln Val Cys Cys Cys Val Gly Pro Ser Thr Pro Ser Leu Asp 430 435 440 AAG AAC CAT CAA GTT CCA ACC ATT AAG GTC CAC ACC ATC TCC CTC AGT 1816 Lys Asn His Gln Val Pro Thr Ile Lys Val His Thr Ile Ser Leu Ser 445 450 455 460 GAG AAC GGG GAG GAA GTC TAGGACAGGA AAGATGCAGA GGAAAGGGGA 1864 Glu Asn Gly Glu Glu Val 465 ATAATCTTAG GTACCCACCC CACTTC 1890

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト及びウシα_1Cアドレナリン受容体のアミノ
酸配列のヒドロパシープロットを示す。各々、横軸はア
ミノ酸残基数を、縦軸は疎水度を表す。図中のローマ数
字は、膜貫通ドメインを表す。

【図２】Ｐ２Ｃ７遺伝子を発現したＣＨＯ細胞の細胞内
Ｃａ²⁺濃度に及ぼすアゴニストの影響を示す。縦軸は細
胞内Ｃａ²⁺濃度、横軸はアゴニスト濃度を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトα_1Cアドレナリン受容体をコードす
   るＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ヒトα_1Cアドレナリン受容体が配列番号
   １のアミノ酸配列によって示されるものである請求項１
   記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号１のアミノ酸配列によって示さ
   れるヒトα_1Cアドレナリン受容体。
4. 【請求項４】 ヒトα_1Cアドレナリン受容体が配列番号
   ２のアミノ酸配列によって示されるものである請求項１
   記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸配列によって示さ
   れるヒトα_1Cアドレナリン受容体。
6. 【請求項６】 請求項１記載のヒトα_1Cアドレナリン受
   容体をコードする遺伝子を含むＤＮＡで形質転換した微
   生物。
7. 【請求項７】 請求項１記載のヒトα_1Cアドレナリン受
   容体をコードする遺伝子を含むＤＮＡで形質転換した動
   物細胞。