JPH06508984A - ヒトのガラニン、ヒトのガラニンをエンコードするｃＤ ＮＡクローンとヒトのガラニン製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのガラニン、ヒトのガラニンをエンコードするｃＤＮＡクローンとヒトのガ ラニンの製造方法 良囲亘立旦 本発明は、ヒトのプレブロガラニン（Ｐｒｅｐｒｏｇａｌｉｎｉｎ）　ｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａのヌクレオチド配列から引出されるようなヒトのガラニン（Ｇａｌｉｎｉ ｎ）のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。さらに本発明は、そのペプチド をエンコードするｃＤＮＡクローンに関する。加えて、本発明はペプチドの治療 的な使用と、ガラニンの拮抗と作動の計画におけるペプチドの使用とを包含する 。

１肌立！ｉ ガラニンは、１９８３年（１）においてブタの小腸から最初に分離された神経の ペプチドと推定されるものである。ブタのガラニンは、それのＮ一端末グリシン とＣ一端末アラニン残基によって命名された２９のアミノ酸残基のペプチドであ る。ｃＤＮＡエンコードされたガラニンは、ラット（２）、ブタ（３）及びウシ （４）の３つの種からクローンとされており、示されているガラニンはブレプロ ガラニン（２）として知られる大きなタンパク質前駆体のタンパク分解生成物で ある。ガラニンは橿の間で９０％の相同性を示すが他の既知のペプチドにも少し 類似的である（１）。ブタのガラニンに乗る抗体は、制御神経系（ＣＮＳ）とヒ トを含む他のいくつかの種の末梢神経系（ＰＮＳ）の至る所の領域と分離し、ガ ラニン類似免疫反応性（ＧＡＬ−Ｌｌ）のマツピングがされている。

ＣＮＳにおけるＧＡＬ−Ｌｌの免疫組織化学的なマツピングは、高濃度のものが 正中隆起と視床下部中に見出されているラットにおいて最も集中して実行されて いる（５）ｏこれらの結果は、血圧制御に動く水バランスから分類されるいくつ かのファクターの調節を供給することにおけるガラニンの影響を試験的に示唆す るラットの脳のなかのブレブロガラニンの分散化の交雑の本来の位置のより最近 の研究では一致している（６）。

同じく、つ７の脳におけるガラニンのラジオイムノアブセイでは視床下部と正中 隆起中に高いＧＡＬ−Ｌｌと、また扁桃と同様な片縁系の構造と結び付＜ＧＡＬ −Ｌｌとを示す（７）。ラットの発達する間のプレプロガラニンｍＲＮＡの免疫 組織化学と本来の位置の研究は、ガラニン濃度における特定の性の差異の組織で 示されており、そこで表現されたエオストロゲン依存性（Ｅｏｓｔｒｏｇｅｎ　 ｄｅｐｅｎｄｎｔ）との表現は以前の脳下垂体（Ｓ）中で注目に値する（９）。

ＧＡＬ−Ｌ　ｒの全ての分類と、カテコールアミン、セａトニン、ＧＡＢＡ、ア セチルコリン及び各種の他のペプチド（１０）とともに別個の神経細胞中のコロ カリゼーシ璽ン（Ｃｏｌｏｅａｌｉｓａｔｌｏｎ）はガラニンの調整の役割を強 く指摘している。注目するべき実例は、ガラニンがアルツハイマー病における役 割を演じるであろうという推測に達している、ラット（１１）とウシ（７）にお いて、前脳の基底の淘馬（Ｈｌｐｐｏｅａｍｐｕｓ）から突出した神経繊維中の アセチルコリンとガラニンとが共存するということである。これは、しかしなが ら、ヒトの脳のこの領域におけるガラニンの表現に関係している証拠と相争う。

たとえＣＮＳ中のガラニンの生理学的な役割がまだ確立されていないとしても、 その神経内分泌の調整における薬理学上の役割が指摘される。ラットの第三脳室 中にガラニンを注入すると成長ホルモンの増加を引き起こしく１３）、室労核（ ｐｖｐ）内に注入すると食物摂取が増す（１４）。

ＰＮＳにおいて、ガラニンについて指摘されたＧＡＬ−Ｌｌの分類は普及されて いる。ガラニンの分類とその薬理学、それは種々の、しばしば特定の種であるが 、ガラニンのための生理学上の作用の範囲を指摘する。しかしながら、い（つか の混同が、他の種を包含する実験中のブタのガラニンの使用を通してその薬理学 的な役割として生じているであろう。多数の哺乳動物の種においてＧＡＬ−Ｌｌ の最も高い濃度が、腸（１）、膵臓（１５）、副腎（３）、及び呼吸（１６）と 尿生殖器路（１７）において見出される。膵臓に関するガラニンの作用と糖尿病 中の役割の可能性は論争とされ；それがイヌにおけるブタのガラニンの注入（ｔ Ｓ）と、分離されたラット膵臓を通してラットとブタのガラニンの注入（１８） とによって確立され、血漿インシュリンのレベルが減少する。しかしながら、こ れらはブタ膵臓に関するブタのガラニンの作用に関する結果と相争う（１９）。

イヌのガラニンにおいては又・グルカゴンの増加の間ラットスタチンが減少する が、これは他の種において生じることはないであろう（１５）。静脈内へのブタ のガラニンはヒトを含むいろいろの橿で分泌される成長ホルモンを生じる。しか しながら、成長ホルモンのレベル増加を引出すような十分に高い濃度のブタのガ ラニンのヒトにおける静脈内への注入は、インタ１リンの予期される阻害が発生 しない（２ｏ）。明確な相違はヒトに対するブタのガラニンのアミノ酸配列の相 違によるものであろうし、又はガラニンの種に特有な影響を単に反映したもので あろう。幾つかの橿（１５）の神経支記された島状の神経細胞中のＧＡＬ−Ｌ　 Ｉの視覚化は、膵臓の内分泌作用に関しガラニンのための神経調節的な役割をサ ポートするラットのＢ−細胞系（２１）におけるインシュリン分泌の阻害を導（ ガラニンを説明する提議に加えられる。ＰＮＳ中のガラニンの他の薬理学的な効 果は、幾つかの哺乳類の種の平滑筋活性に関してガラニンの種に特有な刺激性又 は阻害作用を含む（２２）。

ガラニン受容体はハムスターのインシ１リン分泌Ｂ−細胞腫瘍（２３）　、ラッ ト（２４）とサルの脳（２５）、及び平滑筋の膜（２２）において同定されてい る。ガラニン結合の分１１１ｔＧＡＬ−ＬＩのそれと、その結果神経伝達におけ るガラニンの支持する役割とに関連する。これらがガラニン受容体のサブタイプ であるか、或いはその受容体に結合する原因であるペプチドの領域であるのかは 明確ではない。平滑筋の調整（２２）に関しガラニンのトリプシン断片の生物学 的影響についての研究、加えてＲｌｎ　５ｍｆパンクレアチンＢ−１を胞系に関 するラジオ−トゲラフイー的結合の研究（２６）と、腸のｌｌｌ１ｌ整（２）） について、相争う結果がある。

ガラニン遺伝子の分子生物学はヒトにおいてまだ調査していない。ブタのプレプ ロガラニンはシグナル配列を備えた１２３アミノ酸残基タンパク質であり、ガラ ニン（２９アミノ酸）とガラニンｍＲＮＡとして知られる５９アミノ酸ペプチド はペプチド（ＧＭＡＰ）に連合される。ラット、ブタ及びウシのプレプロガラニ ンの長さと構造は類似している。種を交差して相同なガラニンアミノ酸中の２０ ％の差異はペプチドのＣ−末端の終わりの上に明示される。今日までに同定され た全ての種の配列はアミド化（Ａｍｉｄａｔｉｏｎ）による結果として拡張され たグリシンがグリシンの部位翻訳的な分割を示唆する。ＧＭＡＰは又、種を交差 して良く保存され、それが生物学的活性の推測に達している；それは橿を交差し て７８％の相同性を示す３５アミノ酸の領域と、大きな相同性を示すこの領域内 の１７残基の範囲を含む。

この発明は神経芽腫細胞系ｃＤＮＡライブラリーからと、下垂体ｃＤＮＡライブ ５　！Ｊ　−（ＤＮＡ　１ｉｂｒ訂ｙ）からのヒトのプレプロガラニンの分離と 特徴づけを開示する（２８）。ブタとラ−ｙ）のブレブロガラニンの２つの保存 された領域に補充のオリゴヌクレオチドは神経芽腫と下垂体ｃＤＮＡからの一致 する配列を特別に拡大するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される 。使用する２つの拡大オリゴヌクレオチド（Ｎｏ、１及び２）はラットとブタの 各々のブレプロガラニンのアミノ酸２９−３７と１０５−９７、及びガラニンの エンコードする２３Ｇ塩基対領域の側面とＧＭＡＰのＮ−末端（第１図）に相当 する（２９）。この領域内に加えられるオリゴヌクレオチド（Ｎｏ、３）は適正 なＰＣＲ生産物のためのプローブが用いられる（３ｏ）。ＤＮＡの両方の源から の拡大された領域はサブクローンされ、次いで配列され（３１）、同一の配列を 示す。神経芽腫ｃＤＮＡからの拡大された領域はこのライブラリーからの完全な プレブロガラニンｃＤＮＡをエンコードするクローンを分離するプローブとして 使用される（３２）。後の、下垂体ｃＤＮＡライブラリーは、ヒトのプレブロガ ラニンと、神経芽腫の培養された細胞系中のＤＮＡの間違った転移のためでない 他の種の間の何らかのアミノ酸の明白な差異を確認するために、同じプローブと スクリーニングされる。

両方のライブラリーから分離されたヒトのプレブロガラニンｃＤＮＡクローンの 最初の構造は同定されたが、ブタ、ウシ及びラットのそれとは具なっている。

一般に、アミノ酸の置換は他の橿（系７図）の中での可変性の著明な位置のみで 起こり、それによりガラニンとして確認され、より小さい範囲のＧＭＡＰは両方 とも良く保存される。しかしながら、これらの変化の幾つか（例えばガラエン中 の１７．２３と２６）はヒトのガラニンの正確な機能のために重要であるそのよ うな変化を指摘する医学的及び化学的特性の非常に具なるアミノ酸を含む。また ヒトのガラニンは、タンパク質前駆体中のＬｙｓ−＾ｒｇ分割サイトの直接進展 するガラニンのＣ一端末でのグリシン残基とセリンの置換を生じることにより特 に表現される。これはヒトのガラニンがそのＣ一端末でアミド化されず、タンパ ク分解後の残留物を処理したアミド　ドナーとしてグリシン残基が保存される他 の橿とは対照をなすことを意味する。その結果として、人のガラニンは、ブタ、 ラット及びウシのガラニンと興なる生物学的特性の変化を冑しているだろう。

発！彰ＪＬｈ 従って、本発明の第１の態様は以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりな る： ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＡＶＧＮＨＲ３ＦＳＤＫＮＧＬＴＳ又はそれにつ いて機能的同等物又はそれの７ラグメント。

本発明のポリペプチドフラグメントの好適な実施態様は次のアミノ酸配列を持Ｇ ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＡＶＮＨＲＳＦＳＤＫＮＧＬＴＳポリペプチド配列 に関してここで使用される語句“機能的同等物°とは、ポリペプチドの生物学的 活性に影響する有毒ではないアミノ酸配列中の小さい変化を含むものとして言う 。それはペプチドの生物学的な活性に影響を及ぼし有害でない本発明のペプチド と制定して良い多くの変形を当業者であれば認識するであろう。これは挿入、削 除及び置換、ペプチドの生物学的な活性を十分に減少させることのないそのよう な変化させるペプチド配列における保存の又は非保存のような各種の変化により 達成されるであろう。置換を保存することにより企図される化合物は： Ｇ、Ａ；　Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；　Ｄ、Ｅ；　Ｎ；Ｑ；　Ｓ、Ｔ；　Ｋ、Ｒ，Ｈ；及 びＦ、Ｙ、Ｗである。

それは又、ペプチドの生物学的な活性を十分に減少させることなく、インビボで の効能の増加又は半減期の延長のような有利性を授与する本発明のペプチドに各 種の基を加えることが可能であろう。これらの機能の実行を予定するペプチドは ガラニン作動薬として表現される。これら付加物と変換物はＤ−アミノ酸残基の 導入とサイクリック類似物の組成物とを含む。

本発明中の第２の態様は本発明のペプチドをエンコードするｃＤＮＡ分子よりな り、そのｃＤＮＡ分子は箪１図に示す９７から１８６のヌクレオチド又は機能の 相当する配列のような特定の配列を有する。

本発明の箪３の響様は、ヒトのプレブロガラニノとＧＭＡＰをエンコードするＤ ＮＡ分子よりなり、そのＤＮＡ分子は第１図に示すもの又は機能の相当する配列 のように特定の配列を有している。

ここで用いたようなりＮＡ配列における語句°機能的同等配列−は、興なるポリ ペプチドをエンコードする配列となることがない、ＤＮＡコード中の賢性のため にＤＮＡ配列中の小さい変化を包含することを意図する。

さらに、この語句はペプチドのエンコードにおける変化に通じるＤＮＡコード中 の変質を包含することを意図する。

ヒトのガラニンのインビボでの異なる半減期は特有な受容体に親和的結合とその 結果として種の翼なる両者の効能の差異に加え、予期することができる。

特に興味のあるのはインタ１リン阻害剤についてヒトのガラニンが有効であろう ことである。分離されたラットの膵臓を通してブタとラットのガラニンの両方の 注入は、ブタのガラニンがラットのガラニンよりも効能が損失しているが、イン シュリンとンマトスタチンの開放を阻害するガラニンの両方のタイプを示す（１ ８）。加えて、ブタのガラニンに反して分泌されるグルカゴンを増すラットのガ ラニンは無効である。ブタとラットのガラニンの活性における違いは、それのＣ 一端末でのそれらの間に存在する４個のアミノ酸の相違に帰されている。同様に 、ヒトとブタのガラニンの間で異なっている、アミド化のために異なった結合を した５つのアミノ酸は、ブタのガラニンがヒト被験者中に注入された時に観察さ れるインシュリン阻害の予測を欠く原因であろう（２０）。逆に膵臓に関するガ ラニンの作用に関係し、及びＧｌ路に関するガラニンの効果のようなガラニンの 櫂に特有な効果の別な例は調査を受けた種に相同のガラニンを用いることが好適 であることを示す。

本発明の第４の態様は、ＤＮＡ配列を表現させること及びヒトのガラニンを回復 する条件のもとで本発明の第２又は第３の態様のｃＤＮＡ分子と転換させる細胞 を培養することを備えたヒトのガラニンを製造する方法よりなる。

一方、原核生物の又は真核生物の中での組み替え技法を含む生物学的手段によっ て本発明のポリペプチドを形成することが可能であり、そのポリペプチドは又、 化学合成により形成してもよい。使用される合成の経路についての決定は合成さ れるペプチドの長さに主として頼るであろう。

予備試験の結果から本発明のポリペプチドは、成長ホルモンの刺激剤として、及 び心臓迷走神経性機能の希薄剤として、膵臓の活性の調整における治療の適用を 有する。

従って、本発明の更なる態様は膵臓の活性を調整する方法よりなり、ヒトにおけ る成長ホルモンの生産を刺激すること又は心臓迷走神経性機能を希薄化すること はヒトに本発明のペプチドを投与することを含んでいる。

本発明は又、膵臓の活性の調整、成長ホルモンの生産の刺激又は心臓迷走神経性 機能の希薄のための薬剤の調整において本発明のペプチドを使用することよりな る。

それは、ガラニン拮抗物質がキメラのガラニン類似ペプチドの化学合成により発 展することができるということを示している。ガラニン受容体に結合するＮ一端 末ガ−二ン７ラグメント（アミノ酸１−１３）は、生物学的な作用は有していな いがＮ一端末部位を安定させるα−螺旋構造のペプチドに結合することができる 。その結果キメラはガラニンの拮抗物質として表され、それ１を結合するであろ うがガラニン受容体を活性化することはなく、かくて内因性のガラニンの作用を 阻害する。ガラニン拮抗剤としての機能に同様なキメラのペプチドの能力は、Ｒ ■Ｎｍ５Ｆ細胞中で表現されるガラニン受容体に結合する能力と、ガラニンに対 応するインタ１リンの阻害に反する能力とを測定することによって評価すること カテキル。ガラニン拮抗剤は、投薬依存手法及びガラニンに対応するグルコース 導入の阻害を逆転することにおいてＲＩＮ　ｒｎｔＦ細胞から１２５！−ガラニ ンの結合を置き換えるだろう。ガラニンの競合物としての拮抗剤のｍ能はしかし グルコース導入によるインン１リン分泌に関してそれ自身の効果は持っていない 。

本発明のポリペプチドの使用は、ガラニン作動薬と拮抗剤のためのペプチドの他 の化合物のスクリーンが可能となるであろう。これはＲｒＮｍ５Ｆｍ胞中で押さ れた受容体によって行われる。競合の結合を示した化合物はついで生物学的活性 のための評価がなされる。

本発明の別の態様は、ｌｌＩ＋胞受容体に結合すること及び競合的な結合をする 化合物の生物学的な評価のために本発明のペプチドと競合する化合物の能力を評 価することを含んだガラニン作動薬又は拮抗剤活性のための化合物のスクリーニ ングの方法よりなる。

本発明は又このスクリーニング方法により得られたガラニン拮抗剤に関する。

本発明は、関連する以下の実施例と添付した図面に記載された好適な形状によっ て、より明確に理解されるであろう。

第１図はプレプロガラニンのヌクレオチド配列、ヒトのガラニンとＧＭＡＰのの アミノ酸配列を示す。

第２図はウシ、ブタ、及びラットと、ヒトのガラニンのアミノ酸配列の比較を供 給する。

第３図は血中グルコースのレベル（ａｃ；（ｉ＞ｓｓｏμｇと（ｂ）２５０Ｍｇ ）に関するヒトのガラニンの投与の影響と、意識のあるラットにおける血清イン シェリンのレベル（ｃ　２５０Ｍｇ）を示す。その矢印はガラニンが投与された 時点を示す。

第４図はヒトの中にヒトのガラニンを導入するための実験の原案を示す。

系５図はヒトの治験者における脈拍数に関するヒトのガラニンの投与の影響を示 す。

第６図はヒトの治験者における血漿グルコースとインシ二リンのレベルに関する ヒトのガラニンの投与の影響を示す（−一中一一食塩水；　−〇−Ｉ　Ｘ　１０ →Ｍヒトのガラニン；−（）−ａ−４ｘ　ｌｏ−９Ｍヒトのガラニン：矢印ｌと ３は各々のガラニン導入の開始と中止を示し、矢印２はグルコースを投与した時 を示す）。

第７図はヒト治験者における成長ホルモンのレベルのヒトガラニンの投与量影響 を示す（−ロー食塩水ニー−中−−ｔ　ｘ　ｔ　ｏ”’９Ｍヒトのガラニン；− １−３−４Ｘ　１０→Ｍヒトのガラニン）。

寛息匠 扛ｌ」−乞ま ブ　「　−・ ２つのｃＤＮＡライブラリーは、ライブラリーのスクリーニングのために、また ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために鋳型ＤＮＡの原料として使用した。

神経芽腫ｃＤＮＡライブラリー（ｃａｔＮｏ、　１ＩＬ１００７．　Ｃｌ０ｎｔ ｅＣｂ　ＬａｂＯｔａｔＯｒＩｅ婁１ｎｅ、。

ＵＳＡ）は、そのＥｃｏＲＩクローニングサイトでλｇｔｌｏベクターの中に挿 入された１、０５ｘ１０６の独立したクローンを含む。下垂体ｃＤＮＡライブラ リーはＤｒ　Ｐ、　Ｓｅｅｂｕｒｇ（ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｌ１ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｌ！ｅ奄р■撃ｂ■窒 ■B ＦＲＧ）から得られ、又、λｇｔｌｏとＥｃｏＲＩサイト中で搬ばれる。

第１ゴヌ　レオ　ドのＡ　： １ｇ　ｔ　１０　（Ｐｒｏｍｅｇａ、　ＶＩＣ，、Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）のＥｃ ｏＲＩクロー二ングサイトニ向けられたオリゴヌクレオチドの除外と共に、全て のす替ゴヌクレオチドはＤＮＡ合成装置（＾ｐｐｌ＋ｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅ ｍｓ、　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓ！ｓｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　３１１ＯＢ、　Ｂｕｒ ｖｏｏｄB Ａｕｇｔｒａｌ　ｉａ）で調整した。

オリゴヌクレオチドの配列： １、ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡ　（Ａ／Ｇ）ＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＣ（Ｔ／ Ｃ）ＣＴＧＡＡ　（ＥｃｏＲｒサイトに合体した）２、ＣＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧ Ｃ（Ｇ／Ｃ）ＣＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）ＴＣＴＴＴ　（Ａ／Ｇ）Ａ Ｇ　（Ａ／Ｇ）ＴＧＣＡ　（Ｇ／Ａ）ＧＡＡ　（Ｈ１ｎｄＩＩ＋サイトに合体し た） ３、ＣＣＡＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡ　（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧ　（Ｃ／Ｔ）Ｔ ＧＴＣ（Ａ／Ｇ）Ａ　（Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）ＧＣＡＴＧ　（Ｈｉ　ｎｄｌｌｌサ イトに合体した） ポ「メ　−ゼ　： 鋳型ｃＤＮＡの調製のため平板溶解法は伝染性ファージ（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　Ｅ、Ｆ。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ：　＾　Ｌａｂ　Ｍａｎｕａｌ、２Ｅｄ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ窒奄獅■ Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ＵＳＡ、　２．６５（１９８９））を用いた。

そのライブラリーは、１５０ｍｍ径の平板毎に２０．　Ｇｏｏプラークで平板培 養し、ｍ１当り１×１０９個のファージの滴下により与える保存媒体（ＳＭ　Ｏ ，ＩＭ　ＮａＣｌ１０．００８Ｍ　ＭｇＳＯ３）Ｈ２０１０，０５Ｍ　）リス塩 酸１０．０２％ゼラチン）内に抽出した。そのファージ株（２ｍｌ）はフェノー ル／ＣＨＣｌ３で抽出し次いでエタノールで析出した。そのＰＣＲは神経芽腫ｃ 　ＤＮＡライブラリー（オリゴｌと２）からのプレブロガラニンの２３０塩基対 の領域を拡大するのに使用し、スクリーニングによって後で分離されるｃＤＮＡ ライブラリークローン（λｇｔｌｏ　オリゴ）もまた拡大する。両方の反応にお いてハイブリ、ドインテリジェント加熱ブロック（Ｍｏｄｅｌ　１ＨＢ　２０２ ４．　［Ｉｙｂａｉｄ、　ＭＩｄｄｘ、、　ＬＩＤを以下の温度パラメーターで 使用した８９５℃で保持（５°）、次いで９２℃（１’）、４２℃（１゛）及び ７２℃（１°）の２５サイクル。各反応はＫＣＩ　（５０ｍＭ）　、ゼラチン（ １００Ｍｇ／ｍｌ）、Ｍｇｃ１２（１，５ｍＭ）　、）リス塩酸（ｐＨ８，１０ ｍＭ）ＤＮＡ　（Ｉｏｎ　ｇ−１ｏ。

ｎｇ）　、ａＮＴＦ　（２００ＭＭ）、、Ｔｔｈポリメラーゼ（０，２５Ｕ、東 洋紡、８本）及びオリゴヌクレオチド（５００ＩｔＭ）を含めた。

ＰＣＲ生成物は３％Ｎｕｓｅｉｖｅゲル（ＦＭＣＢｌｏｐｒｏｄｕｃｔｇ、　Ｍ Ｅ、ＵＳＡ）（５００塩基対より少ない生成物）又は１％アガロース（７００塩 基対より大きな生成物）により分離した。ＰＣＲ生成物バンドの同定はサウザー ンブロツテイング（Ｌ、５ｏｕｔｈａｒｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８ ．５０３（１９〕Ｓ））により、ナイロン膜（Ｚｅｔａ　ｐｒｏｂｅ。

Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、Ｃ＾、ＵＳＡ）の上の ＤＮＡを、オリゴ＃３との交雑に従い転移緩衝液として０．４ＭＮａＯＨを使用 して設定した。予備交雑は５ｘＳＳＰＥ　（１ｘＳＳＰＥは０．１８Ｍ　ＮａＣ ｌ−１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯａ／１ｍＭＮａＥＤＴＡ　ｐＨ＝７）０．５％ドデ シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、５ｘＤａｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液（１ｘ　Ｄ ｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液は０．０２％フィコール−４００１０，０２％ウシ血 清アルブミン１０．０２％ポリビニリピロリドンー４０）と１００μｇ／ｍｌ変 成サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で実行した。交雑は同じ溶液中にプローブを加え４ ２℃、６−１２時間で実行した。そのオリゴは、Ｔ４ポリヌクレオキナーゼ（Ｂ ＲＬ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いγａ２ｐ　ＡＴＰ　（＾５ｅｒｓｈａｓ、　Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｉｅ、　ＯＫ）標識した。プロットは増反スクリーンと ともに一７０℃にて１２時間Ｘ線フィルム（コダック　イーストマン、ＮＹ、Ｕ Ｓ）に曝露する以前に、ｌＸ５ＳＣ（ｌｘｓｓｃは０．１５１Ｍ　ＮａＣ１７０ ，１６７５Ｍりｚン酸三ナトリウム）１０．１％ＳＯＳ中、３７℃で洗浄した。

サブ　ローニン ＰＣＲ生成物は上述したようなゲル上で分離した。適当なバンドは、制限消化の 前に遺伝子クリーン（Ｂｌｏ　１０１．　Ｃ＾、　ＵＳＡ）により切除し純化し た。ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄｌｌｌとＥｃｏＲＩで消化されたプレプロガラニン のオリゴｌと２によって生じ、そのＰＣＲ生成物はＭ１３ｍｐ１９内に連索する 前にＥｃｏＲｒで消化される１ｔ１０オリゴとともに生成した。そのＭ１３ｍｐ １９サブクローンはＪＭＩ　Ｏｌコンピテント細胞（Ｍａｎ［ａｔｉｓ、　１． ８２−１．８４）の転移に用いられ、続いて単鎖ＤＮＡが配列（ｋｌｔにｏ、　 ０５ｇ００．　Ｐｒｏｍｅｇｉ）のための標準法（Ｍｉｎ［１ｔｉｓ。

４．２９−４．３０）を用いて調製する。二次的構造のための配列の困難性は、 配列用酵素として７０℃の反応温度’？’のＴａｑ　ＤＮＡ＋ｔ！す／９−ゼ（ ｋｉｔ　Ｎｏ、０５５４Ｇ。

Ｐｒｏｍｅｇｉ）のＣｍにより克服される。

■−のス　１−二ン 上述したｃＤＮＡライブラリーを、神経芽腫プレプロガラニンの配列をエンコー ドする２３０塩基対のＰＣＲ生成物とスクリーニングする。そのプローブは、ゲ ル力ら切除し、５７ダム取付反応（ｋｉｔ　Ｎｏ、　１１１１７ｓＡ、　ＢＲＬ ）中のａ３２６ＣＴＰの標識（２５ｎｇ）以前に遺伝子クリーンを用いて純化す る。概ね５ｘｔｏ！！のプラークが２ＹＴプレート（Ａ３．　Ｍａｎｉｉｔｉｇ ）上に培養され、これをハイボンドＮナイロンフィルター（Ａ■・ｒｓｈａ■） に載せ、製造推奨名にしたがって固定した。予備水素化処理と交雑形成は上述し たように６５℃で実行した。フィルターは６５℃にて０．１％５ＤＳ１０．１％ ｓｓｃで厳重に洗浄し、装置スクリーンとともにＸ線フィルムに一夜曝露した。

ルコース　ルフ　ホルモンの の　る　トへのヒトのガラニンの ラットは確立した飼料で飼育し、麻酔下でカニ１−レ挿入した。そのラットは次 いで回復させてグルコースを導入した。１０分後にヒトのガラニンの素塊投薬を 投与し、次の３時間で血液試料を採取した。次のサンプリング手続により実験動 物を犠牲とした。

全血中グルコースレベルの上昇は、ヒトのガラニン３５０　ａ　ｇ　（ＩＩＯｉ ＊ｏｌ　；第２ａ図）と２５０μｇ（箪２ｂ図中８０ｎ■ｏｌ）の素塊投与に対 応して評価した。ヒトノカラニン２５０μｇ（ｊＰ１２ｃ図中８０止０１）の投 与に対応した全血中グルコースレベルの上昇は循環インシュリンのレベルの低下 と相互に関係した。

ホルモンの ヒト　でのヒトガ　ニンの 概ね３−４Ｘ１０″（ＩＭのガラニンの最大値の循環レベルに達するようにヒト 中にヒトガラニンの導入するための実験的原案を第４図に示す。

ヒトに　ζ　ルコース　ルコ　ホルモンの　−ヒトが　二ンユ【！ １対象者の予備データは、ヒトのガラニンがｌｘｌ　０４Ｍ＋！＝４ｘ１０”’ ９Ｍの１大値の循環レベルに達するように、東４図中の示す原案に従ってヒトの ガラニンの投与として示されインシュリン分泌の抑制が検出可能となる（第６図 ；Ｙ輪単位Ｘｍ１υ／Ｌ）。これはａｔｍ位置に関係する血漿グルコースの上昇 と結び付Ｃすられる（篇６図；Ｙ輪単位：ｍＭ）。

ホルモン　ヒトのガ　ニンの 第４図に表された原案に従った志願者へのヒトガラニンの投与は今日まで研究さ れた２対象者においてヒトガラニンｌＸｌ０″−９Ｍと３−４Ｘ１０→の両方の 循環レベルでの成長ホルモンレベルの上昇となった。使用した２つの投薬率での これら２対象者の１つにおいてヒトのガラニンの影響を第７図に示す。

真鳳血１重立ゑ たネコにお１　゛　に　るヒトのガ　ニンのジ麻酔したネコ中にヒトのガラニン の静脈内導入は心拍数の遅延する心臓迷走の希薄化となる。

ヒトに°Ｃヒトガ　ニンの１、　のヅ 第４図に詳細化したようにヒト中へのヒトガラニンの導入は、ヒトにおける迷走 神経機能の希薄化に関するヒトガラニンの効果と一致して、脈拍数が増加するこ とになる（茶５図参照）。

今日までに導かれた研究から、ヒトのガラニンは以下のものを含む多くの医学的 な使用をなされるであろう： １、胃腸の活性の阻害、例えば下痢止め薬として。

２、インシュリン分泌の阻害、例えば膵臓疾患における膵臓内分泌の活性調整。

３、放出されるホルモン成長ホルモンの独立的な動作である成長ホルモンの有効 な刺激物質として。

４、心臓迷走神経機能の希釈剤として。

５、今までのところよく特徴付けされていない神経系の効果、例えば　アルツハ イマー症の除去、食欲に関する効果、プロラクチン放出など。

ラットのモデルを用いて導かれた実験は最初の３つの使用を支持し、一方ヒトの ガラニンで着手した人においての研究は、インシュリン分泌の調整、成長ホルモ ン分泌及び心臓迷走神経機能に対してヒトのガラニンの能力を実証する。

本発明の以前のガラニンの医学的な使用の可能性はガラニンの種に特異的な薬理 学的な作用のために大きく制限され、即ちヒトに投与する時外因性のヒトのガラ ニンは、商業上利用できるブタとラットのガラニンと、薬理学的な効果が興なっ ていただろう。本発明より以前はこの種の特異性の理由が理解されていなかった 。現在ではその種の特異性が当然であることが確信され、少なくとも一部におい て、ヒトのガラニンと特に記載した他の種のがラニンとの間で目立つ差異の幾つ かのアミノ酸は、そのＣ一端末でのグリシン、及びその場所がインビボにおいて 転写微分割の後のアミド化（Ａｓｉｄａｔｉｏｎ）の可能性を除外するセリン残 基によって拡張されない。

当業者によって正しく判断されるであろうが、より広（記載された本発明の精神 又は範囲から逸脱することなく、明細書の実！１！！様中に示すように本発明に 対して多数の変形及び／又は変更態様を持たせて良い。本実施態様はそれゆえ例 示にすぎず、それに限定されるものではない。

１−丞 １、Ｋ、　Ｔａｔａｍｏｔｏ、　Ａ、　Ｒｏｋａｅｕｓ、　Ｈ，Ｊｏｒｎｖａｌ ｌ、　Ｔ、Ｊ、　１ｌｅＤｏｎａｌｄ　ａｎｄ　Ｖ、　Ｍｕ狽煤B ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１６４．１２４　（１９Ｍり。

２、Ｌ、Ｍ、　Ｋｉｐｌｉｎ、　Ｅ、Ｒ，５ｐｉｎｄｅｌ　Ｋ、Ｊ、　ｌ５ｓｅ ｌｂｉｃｈ＠ｒ　ａｎｄ　Ｗ、Ｌ　Ｃｈｉｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎ１ｔ１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ＾　８５．１０６５　（１９８８）。

Ｌ　Ａ、Ｒｏｋａｅｕｓ　ａｎｄ　翼、Ｊ、Ｂｒｏｖｎｓｔａｉｎ、Ｐｒｏｃ、 １ｌａｔ１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｉｌ、Ｓ、Ａ、、８３゜６２８７　（１９８ ３）。

４、　＾、　Ｒｏｋａｅｕｓ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｃａｒｌｑｕｉｓｔ、　ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔ、、　２３４．４００　（＋０８）５、　＾、　Ｒｏｋｉａｕｓ、　 Ｔ、　Ｍｅｌａｎｄａｒ、　Ｔ、　＋Ｉｏｋｆａｌｔ、　Ｊ、Ｍ、　Ｌｕｎｄｂ ｅｒｇ、　Ｋ、　Ｔａｔｅ高盾狽潤B Ｍ、　Ｃ１ｒｌｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｖ、　Ｍｕｔｔ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　 Ｌｅｔｔ、　４７．１６１　（１９８４）６、＾ル、　Ｇｕｎｄｌａｃｈ、　Ｗ 、　Ｗｉｓｄｅｎ、　８Ｊ、　Ｍｏｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｓ、Ｐ、　１ｌｕｎｔ、 ＷｅｕｒｏｓｃｊＬｅｔｔ、、１１４．２４１　（１９９０１゜７、Ｍ、Ｆ、　 Ｂａ１ｌ　Ｓ、Ｍ、　Ｇａｂｒｉｅｌ、　Ｋ、Ｊ、　５ｖａｒｔｚ、　Ｕ、Ｍ、 　ＭａｃＧａｒｖｅｙ、　ＰｅｐｔｉｄｅｓA　９゜ ８４７　（１９８８）。

８、Ｓ、Ｍ、　Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｌ、Ｍ、　Ｋａｐｌａｎ、Ｊ、Ｂ、Ｍａｒｔｉ ｎ　ａｎｄ　Ｊ、１．　Ｉｏｅｎｉｇ、　ＰｅｐｔｉｄｅｓB １０、　３６９　（１１ｇ９）。

９、Ｌ、Ｍ、　Ｉａｐｌａｎ、Ｓ、Ｍ、　Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｊ、１．　Ｉｏａｎ ｉｇ、　Ｍ、Ｅ、５ｕｎｄａｙ、　Ｅ、Ｒ，５ｐｉｎｄｅｌB Ｂ、Ｊ、　Ｍｉｒｔｌｎ、　１１　Ｃｈｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８５．７４０１１　（P９０１゜ １Ｇ、Ｔ、Ｍｅｌａｎｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌ＾、５ｔａｉｎｅｓ、ｌ１ｅｕｒｏｓ ｅｉ、Ｌｅｔｔ、、６ｆｉ、１７　（１９８６）：　Ｍｕ。

Ｂｒｏｕｎｓｔａｉｎ、　Ｅ、　Ｍｅｚｅｙ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｉｎ　Ｂｒａ ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　８ｇ、　（ＥＤＳ、@Ｔ。

Ｈｏｋｆｅｌｔ、Ｌ　Ｆｕｘｅ　ａｎｄ　Ｂ、Ｐｅｒｎｏｗ）、１６１−１６８ ．　Ｅｌｓｓｖｉｅｒ。

１１、　Ｔ、Ｍｅｌａｎｄｅｒ、ｆ、Ａ、５ｔａｉｎｅｓ、↑、Ｈｏｋｆｅｌｔ 、＾、Ｒｏｋａａｕｓ、　Ｆ、Ｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ。

Ｐ、Ｍ、５ａＩｖａｔｅｒｒａ　ａｎｄ　Ｂ、Ｈ，１Ｔｉｉｉｅｒ、　Ｂｒａｉ ｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、３６０．　１３０　（１９８５１゜１２、’ｉ、Ｃｈａ ｎ−Ｐａｌ！ｙ、Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、２４１　５４３　（１９８８） ：　Ｊ、［１，Ｉｏｒｄｏｖｅｒ　ａｎ■ Ｅ、Ｊ、Ｍｕｒｆ畠ｏｎ、Ｊ、Ｃｏｏｐ、Ｎｅｕｒａｌ、２９４．２８１　（１ ９９０３゜１３、　＾、０ｔｔｌｅｃｚ、ＬＬ　Ｓａｓ＋ｐｍｏｎ、　Ｓ、Ｍ、 ＭｃＣａｎｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、５１　（１９８６）。

１４、Ｓ、ε、ｒｙｒｋｏｕｌＨ，Ｂ、Ｑ、５ｔａｎｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓ、Ｆ、 ＬａｌｂｏｗＬｔｚ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈ訂曹ａｅｏ＋１２２、　１５９　（１９ ８６）。

Ｉｓ、Ｂ、Ｅ、　Ｄｕｎｎｉｎｇ、　Ｂ、　Ａｈｒｅｎ、　Ｒ，Ｃ，Ｖｅｉｔｈ 、　Ｇ、Ｂｏｔｔｃｈａｒ、　Ｆ、　５ｕｎｄｌｅｒ、　Ｇ梶B Ｔａｂｏｒｓｋｙ、＾ｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、２５１．　１４：Ｂ１２７　（ １９０）。

１６、＾、Ｃｈｅｕｎｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐｏ１ａｋ、Ｆ、Ｅ、Ｂｉｕｅｒ、＾、Ｃａ ｄｌａｕｘ、Ｎ、Ｐ、Ｃｂｒｉｓｔｏｐｂｌｄｅｓ。

Ｄ、Ｒ，Ｓｐｒ［ｎｇａｌｌ、Ｓ、Ｒ，Ｂｌｏｏｍ、Ｔｈｏｒａｘ、４０．８８ ９　（１０５）１７、Ｐ、Ｅ、Ｂａｕｅｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃｈｒｉ＠ｔｏｐｈｉｄｅ ｓ、　Ｇ、Ｗ、ｌ１ａｃｋｅｒ、Ｍ、＾、Ｂ１１ｎｋ、Ｊ、Ｍ。

Ｐｏ１ａｎｋ、Ｓ、Ｒ，Ｂ１００＠、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、７．　５　（＋９０＞ 。

１ｇ、　Ｐ、Ｍｉｒｉｌｌｅｓ、　Ｅ、Ｐｉｅｒｏ、　Ｐ、Ｄｅｇｉｎｏ、　＾ 、Ｒａｍｏｎｉ、Ｊ、Ｍａｒｃｏ、ＤＩａｂｅｔｅｓ。

３９、　９９６　（１９９０）。

１９、Ｔ、Ｍｅｓｓｅｌ、Ｈ，［Ｉａｒｌｉｎｇ、Ｇ、Ｂｏｔｔｅｈｅｒ、Ａ、 １１．　Ｊｏｂｎｓｅｎ、Ｊ、Ｊ、Ｈｏ１ｓｔ。

Ｒｅｇｕｌｉｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２１　１６１　（１９９０）。

２０、Ｓ、Ｇ、Ｇ１１ｂｙ、Ｊ、５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ、Ｄ、Ｊ、Ｏ’［Ｉａｌ ｌｏｒｉｎ、Ｊ、Ｍ、Ｂｕｒｒｉｎ、Ｓ、Ｒ。

Ｂｌｏａｔ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、ＳＬ　０１４　０９８Ｂ）。

２１　Ｍ、Ｊ、Ｄｕｎｎｅ、Ｍ、Ｊ、Ｂｕｌｌｅｔ、Ｌ、Ｇｕｏｅｂｏｎｇ、Ｃ ，Ｂ、Ｗｏｌｌｈａｉｓ、　ＯＪ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ。

ＥＭＢｏ、８．　４１３　（１９８９＞。

２２、Ｅ、Ｅｋｂｌａｄ、Ｒ，Ｈｘｋａｎｓｏｎ、Ｐ、５ｕｎｄｌ＠ｒ、Ｃ，Ｗ ｉｈｌｓｓｔａｄｔ、Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

８６．　２４１　＜１９８５）：　Ｊ、Ｅ、Ｔ、、Ｂ、Ｂｒｏｏｋｓ、丁、Ｊ、 ＭｅＤｏｎ禽１ｄ、Ｗ、Ｂａｒｎｅｔｔ、Ｆｌｏｓｔｏｌａｎｓｋｔ　Ｃ，Ｙ暑 ｎａＩｈａｒ麿、＾　Ｒｏｋｘｅｕｓ、ＰｅｐＬＩｄｅｓ、９．　１１１１３　 （１９８ｇ）−２３、Ｂ、＾ｍ１ｒａｎｏｆｆ、　＾、Ｌ、５ｅｒｖｌｎ、Ｃ， Ｒ，Ｒｏｕｙｅｒ−Ｆｅｔｓａｒｄ、＾、Ｃｏｕｖｆｎｅｉｕ、Ｋ。

Ｔａｔｓｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｍ、Ｌｕｂｕｒｔｈｅ、Ｅｎｄｏｅｒｉｎｏｌｏｇ ｙ、　１２．　２８４　（１９Ｂ？）２４、Ｇ、５ｋｏｆｌｔｓｃｈ、　Ｍ、５ ｉｌｌｙ、　Ｄ、Ｍ、ＪａＣＯｂＯ＠１ｔｔ、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、７．　１０ ２９　（１９８６j： 丁、Ｍｅｌａｎｄｅｒ、Ｔ、ｌ１ｏｋｆｅｌｔ、Ｓ、Ｎｅ１ｓｓｏｎ、Ｅ、Ｂｒ ｏｄｌｎ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｔ、１２４゜３８１、（１９８６）。

２５、　Ｃ，にｏｈｌｅｒ、Ｇ、Ｈａｌｌｓｕｎ、Ｔ、Ｍａｒａｎｄｅｒ、Ｔ、 Ｈｏｋｒｅｌｔ、Ｅ、ＮｏｒｔｈｅＩｎ、Ｊ。

Ｃｈｅｗ、Ｎｅｕｒｏ＾ｎａｔ、２．２０　（１０９）。

２６、　Ｂ、Ｇａ１ｌｖｉＬｚ、Ｖ、Ｅ、Ｓｈ！ｍｄｔ、Ｒ，５ｅｈｖａｒｚｈ ｏｆｆ、Ｗ、Ｃｒａｕｔｚｆｅｌｄｔ、Ｂｉｏｃｈｅｔａｎｄ　Ｂｌｏｐｈｙｓ 、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１７２．　２８８　（１９９０）： 　Ｂ、＾ｍ１ｒａｎｏｆｔ、Ａ　ＭB Ｌｏｒｊｎａｔ、Ｎ、Ｙａｎａｉｈａｒ４　Ｍ、Ｌａｂｕｒｔｈａ、Ｅｕｒ、Ｊ 、Ｐｈ１ｒｔ、１６３．２０５　（１９８９）。

２７、ｆ、Ｊ、Ｒｏｇｇｏｗｉｋｌ、丁、Ｍ、Ｒｏｓｓｏｖ＋＋ｋｊ、Ｓ、Ｚａ ｃｈａｒｉａ、＾、Ｅｒｔａｎ　ａｎｄ　Ｄ、Ｈ，Ｃｏｙ。

Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１１．　３３３．　（１９９０１゜Ｆｔ＝３１ ／”／６Σ 時間　（／ｉＪ 時間　（例） Ｆ、６６ 時間（分、） フロントページの続き （７２）発明者　シャイン、　ジョン オーストラリア国　２１１０　ニュー　サウスウエールズ　ウールウィッチ　メ イフィールド　アヴエニュ　２

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．次のアミノ酸配列を有するポリペプチド：【配列があります】 又はそれの機能的同等物又はそれのフラグメント。
2. ２．次のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載のポリペプチドフラグメ ント 【配列があります】。
3. ３．請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドをエンコードするｃＤＮＡ分子 であり、第１図中に示すヌクレオチド９７から１８６又はヌクレオチド９７から １４５又は機能的同等の配列のような特定な配列を有するｃＤＮＡ分子。
4. ４．ヒトのプレプロガラニンとペプチドに合体したガラニンｍＲＮＡをエンコー ドするＤＮＡ分子であって、第１図中の又は機能的同等の配列のような特定の配 列を有するｃＤＮＡ分子。
5. ５．ＤＮＡ配列を抑制させ及びヒトのガラニンを回復する条件のもとで請求の範 囲第３項又は第４項のＤＮＡ分子で細胞を形質転換することを備えたヒトのガラ ニンの製造方法。
6. ６．前記細胞が細菌である請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．ヒト対象者における膵臓の機能を調整する方法であって、請求の範囲第１項 又は第２項に記載のペプチドの医学的に有効な量を、対象者に投与することを備 えた前記の方法。
8. ８．ヒト対象者における成長ホルモンの生産を刺激する方法であって、請求の範 囲第１項又は第２項に記載のペプチドの医学的に有効な量を、対象者に投与する ことを備えた前記の方法。
9. ９．ヒト対象者における心臓迷走神経機能を希釈する方法であって、請求の範囲 第１項又は第２項に記載のペプチドの医学的に有効な量を、対象者に投与するこ とを備えた前記の方法。
10. １０．ガラニンの拮抗又は阻害活性のための化合物をスクリーニングする方法で あって、細胞受容体に結合及び競金的結合する化合物の生物学的な評価のため請 求の範囲第１項又は第２項に記載されたペプチドに競合する化合物の能力を評価 することを備えた前記の方法。