KR20160095150A - 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20160095150A KR20160095150A KR1020167018610A KR20167018610A KR20160095150A KR 20160095150 A KR20160095150 A KR 20160095150A KR 1020167018610 A KR1020167018610 A KR 1020167018610A KR 20167018610 A KR20167018610 A KR 20167018610A KR 20160095150 A KR20160095150 A KR 20160095150A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cell
- human
- interest
- cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 261
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 29
- 230000004048 modification Effects 0.000 title description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 title description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 599
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 483
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims abstract description 157
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims abstract description 157
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims abstract description 157
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 154
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 126
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 522
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 333
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 333
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 312
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 235
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 155
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 139
- 101100193633 Danio rerio rag2 gene Proteins 0.000 claims description 119
- 101100193635 Mus musculus Rag2 gene Proteins 0.000 claims description 119
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 118
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 102
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 101
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 100
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 83
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 83
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 79
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 69
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 69
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 claims description 68
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 63
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 63
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 59
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 33
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 claims description 16
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 10
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 101150004694 Erbb4 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims description 4
- 101150092793 Trpa1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150093210 DPP4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108091007911 GSKs Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004103 Glycogen Synthase Kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 101150079449 Folh1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 2
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims 24
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 claims 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 claims 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 abstract description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 141
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 141
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 141
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 121
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 112
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 99
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 99
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 91
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 80
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 80
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 78
- 239000000463 material Substances 0.000 description 67
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 48
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 40
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 40
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 38
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 29
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 29
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 27
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 24
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 24
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 24
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 24
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 23
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 22
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 22
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 22
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 19
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 19
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 18
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 16
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 15
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- -1 expression cassette Proteins 0.000 description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 12
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 12
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 12
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 239000000306 component Substances 0.000 description 11
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 9
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 9
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 9
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 9
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 8
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 8
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 8
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 8
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 8
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 description 8
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 7
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 7
- 101100451662 Mus musculus Prm1 gene Proteins 0.000 description 7
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 description 7
- 108010032099 V(D)J recombination activating protein 2 Proteins 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 6
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 6
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 6
- 101000687343 Mus musculus PR domain zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 5
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 4
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 4
- 101100117236 Drosophila melanogaster speck gene Proteins 0.000 description 4
- 101150007884 Gata6 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 4
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 4
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 108010026638 endodeoxyribonuclease FokI Proteins 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 101150003286 gata4 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 4
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 4
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 4
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 101001055227 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit gamma Proteins 0.000 description 3
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 3
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 3
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 3
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 3
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 3
- 102100022964 Immunoglobulin kappa variable 3-20 Human genes 0.000 description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102100029450 M1-specific T cell receptor alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 3
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 3
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 230000014725 late viral mRNA transcription Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 101100004864 Arabidopsis thaliana ZFN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100272917 Arabidopsis thaliana ZFN2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100518995 Caenorhabditis elegans pax-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 description 2
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091005943 CyPet Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 101000771674 Homo sapiens Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 2
- 101000634835 Homo sapiens M1-specific T cell receptor alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 2
- 101000634836 Homo sapiens T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Proteins 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 101150002416 Igf2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 108010032774 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000007351 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Human genes 0.000 description 2
- 108010060632 Interleukin-2 Receptor beta Subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000008193 Interleukin-2 Receptor beta Subunit Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 2
- 101150040658 LHX2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 101100111033 Mus musculus Adamts5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100440312 Mus musculus C5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100332181 Mus musculus Dpp4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100501697 Mus musculus Erbb4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100344029 Mus musculus Lrp5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100518997 Mus musculus Pax3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100038118 Mus musculus Ror1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100482469 Mus musculus Trpa1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 2
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 101100285883 Rattus norvegicus Prm1 gene Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 2
- 208000012827 T-B+ severe combined immunodeficiency due to gamma chain deficiency Diseases 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010067022 Type III Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000023940 X-Linked Combined Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 2
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 102000053020 human ApoE Human genes 0.000 description 2
- 102000049902 human IL2RG Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 101150115794 lhx5 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- DWZAJFZEYZIHPO-UHFFFAOYSA-N santin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(OC)C(=O)C2=C(O)C(OC)=C(O)C=C2O1 DWZAJFZEYZIHPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 1
- 241001136782 Alca Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 101150061877 Asic1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000929194 Brassica napus Defensin-like protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 235000007627 Caesalpinia Nutrition 0.000 description 1
- 241000522234 Caesalpinia Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150063475 FCER1A gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033417 Glucocorticoid receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102100023696 Histone-lysine N-methyltransferase SETDB1 Human genes 0.000 description 1
- 101710168120 Histone-lysine N-methyltransferase SETDB1 Proteins 0.000 description 1
- 101000854886 Homo sapiens Immunoglobulin iota chain Proteins 0.000 description 1
- 101001002470 Homo sapiens Interferon lambda-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000853002 Homo sapiens Interleukin-25 Proteins 0.000 description 1
- 101000853000 Homo sapiens Interleukin-26 Proteins 0.000 description 1
- 101000998139 Homo sapiens Interleukin-32 Proteins 0.000 description 1
- 101001128431 Homo sapiens Myeloid-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 101150111528 IL1R2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100020744 Immunoglobulin iota chain Human genes 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108050009288 Interleukin-19 Proteins 0.000 description 1
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710181613 Interleukin-31 Proteins 0.000 description 1
- 108010067003 Interleukin-33 Proteins 0.000 description 1
- 108091007973 Interleukin-36 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000143973 Libytheinae Species 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000289419 Metatheria Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101100227588 Mus musculus Folh1 gene Proteins 0.000 description 1
- XJPVGBOSFIESGE-UHFFFAOYSA-N N1C(N)=NC=2N=CNC2C1=O.[Sn] Chemical compound N1C(N)=NC=2N=CNC2C1=O.[Sn] XJPVGBOSFIESGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 101150015730 Prlr gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010018324 Surrogate Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000002663 Surrogate Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 101150082427 Tlr4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010976 emerald Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008753 endothelial function Effects 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108090000681 interleukin 20 Proteins 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011819 knockout animal model Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004894 snout Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000010809 targeting technique Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
- C12N2999/007—Technological advancements, e.g. new system for producing known virus, cre-lox system for production of transgenic animals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 명세서에서 설명된 바와 같이, 다양한 내생성 또는 외생성 핵산 서열이 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 이용하여, 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 비-인간 포유류 세포 내 관심 대상의 게놈 좌의 변형을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 추가 방법은 LTVEC와 CRISPR/Cas 시스템의 이용을 복합한다. 생식계통에서 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 만들기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013년 12월 11일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 61/914,768, 2014년 6월 26일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 62/017,416, 2014년 7월 25일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 62/029,261, 2014년 9월 19일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 62/052,906, 2014년 10월 3일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 62/059,527, 그리고 2014년 10월 15일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 62/064,384을 우선권으로 청구하며, 이들 각각은 모든 목적을 위하여 이의 전문이 본 명세서에 편입된다.
EFS WEB을 통하여 텍스트 화일로 제출된 서열 목록에 대한 언급
서열 목록의 공식 복사본은 2014년 10월 15일자로 만들어진, 27.5 킬로바이트 크기의, 화일 명 453460SEQLIST.TXT을 가진, ASCII 포멧화된 서열 목록으로써, EFS-Web을 통하여 전자적으로 제공되며, 본 출원과 동시에 제출된다. ASCII 형식의 서류 안에 포함된 상기 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 이의 전문이 본 명세서에 편입된다.
발명의 배경
렛(rat)은 심혈관 질환(가령, 고혈압), 대사성 질환(가령, 비만, 당뇨병), 신경학적 질환(가령, 통증 병리학), 그리고 다양한 암을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 인간 질환의 병리를 다시 정리할 수 있는 중요한 동물 모델 시스템으로 간주되어 왔지만, 인간 질환을 모델링함에 있어서 마우스(mice)와 비교하였을 때, 부분적으로 가령, 일회 또는 그 이상의 일련의 전기천공(electroporations)과 같은 시험관내 일련의 유전적 변형(modifications)이후 이들의 다능성이 지속될 수 있는 생식계열-유전가능한 다능성(pluripotent) 렛 세포들의 이용불가능으로 인하여, 그리고 부분적으로 다능성 렛 세포 안에서 큰 게놈 DNA 서열의 도입 또는 결손, 또는 큰 내생성 게놈 DNA 서열을 외생성 핵산 서열로 대체를 허용하는 효과적인 표적화 기술의 부재로 인하여, 렛의 사용은 제한되어 왔었다.
유기체 게놈의 정확하게 표적화된 변화를 허용하는 조성물 및 방법들이 당분야에 필요하며, 이는 표적 발견의 현재 영역을 개방 또는 확장시킬 수 있으며, 좀더 신속하고, 용이하게 치료제를 인증할 수 있다.
요약
표적화된 유전적 변형을 통하여 진핵 세포 안에서 관심 대상의 게놈 좌(locus)를 변형시키는 방법들이 제공된다. 이러한 방법은 다음을 포함한다:
(a) 상기 진핵 세포 안으로 다음의 것들을 도입시키고: (i) 5' 상동성 아암(arm) 및 3' 상동성 아암이 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC), 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며; (ii) 제 2 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연결된 제 1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체(expression construct), (iii) 표적 서열과 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열이 포함된 가이드 RNA (gRNA)가 인코드된 제 3 핵산에 작동가능하도록 연결된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체, 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 진핵 세포 안에서 활성이며; 그리고 (b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 변형된 진핵 세포를 식별해낸다.
한 구체예에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질(biallelic) 유전적 변형이다.
한 구체예에서, LTVEC는 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb이다. 또다른 구체예에서, LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb이다.
한 구체예에서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포다. 한 구체예에서, 상기 포유류 세포는 섬유아세포다.
한 구체예에서, 상기 진핵 세포는 다능성 세포다. 한 구체예에서, 상기 다능성 세포는 인간 다능성 세포다. 한 구체예에서 상기 인간 다능성 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 인간 성인 줄기 세포다. 또다른 구체예에서, 상기 인간 다능성 세포는 발생학적으로 제한된 인간 선조(progenitor) 세포다. 또다른 구체예에서, 상기 인간 다능성 세포는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포다.
한 구체예에서, Cas 단백질은 Cas9이다.
한 구체예에서, 상기 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 측면에 있다. 한 구체예에서, 상기 표적 서열은 3' 단부 상에 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 측면에 있다.
일부 구체예들에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 150 kb이다. 일부 구체예들에서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb이다.
상기 방법들은 (a) 내생성 핵산 서열을 상동성 또는 이종상동성(orthologous) 핵산 서열로 대체; (b) 내생성 핵산 서열의 결손; (c) 내생성 핵산 서열의 결손, 이때 상기 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb 범위가 되며; (d) 외생성 핵산 서열의 삽입; (e) 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열의 삽입; (f) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열의 삽입; (g) 인간 및 비-인간 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열의 삽입; (h) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열이 측면에 있는 조건 조건부 대립인자(a conditional allele)의 삽입; (i) 상기 다능성 세포 안에서 활성인 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선택성 표지 또는 리포터 유전자의 삽입; 또는 (j) 이의 조합을 포함하는 표적화된 유전적 변형을 추가 제공한다.
한 구체예에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 (i) 5' 상동성 아암에 상동성인 5' 표적 서열; 그리고 (ii) 3' 상동성 아암에 상동성인 3' 표적 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리된다. 일부 구체예들에서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만의, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만의, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만의, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만의, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만의, 최소한 100 kb 그러나 150 kb미만의, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb미만의, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb미만의, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb미만의, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb미만의, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1 Mb미만의, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb미만의, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb미만의, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb미만의, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb미만으로 분리된다.
한 구체예에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 또는 Rag1 및 Rag2 좌 모두를 포함한다.
한 구체예에서, 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
게놈을 변형시키는 방법이 더 제공되는데, 이 방법은 최소한 10 kb의 핵산 서열이 포함된 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에 Cas 단백질 및 CRISPR RNA에 노출시키는 것을 포함하며, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, 그리고 LTVEC에 노출된 후, 상기 게놈은 최소한 10 kb 핵산 서열이 포함되도록 변형된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, LTVEC는 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb의 핵산 서열을 포함한다. 이러한 일부 방법들에 있어서, LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb의 핵산 서열을 포함한다.
게놈을 변형시키는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 상기 게놈을 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에 Cas 단백질, 표적 서열에 혼성화되는 CRISPR RNA, 그리고 tracrRNA에 접촉시키는 것을 포함하고, 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고, 이때 LTVEC 존재하에서 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA에 접촉된 후, 상기 게놈은 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산을 포함하도록 변형된다. 상기 표적 서열은 상기 관심 대상의 게놈 좌에 또는 이 부근에 존재할 수 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 게놈은 진핵 세포 안에 있으며, 그리고 Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 LTVEC가 상기 진핵 세포 안으로 도입된다. 이러한 일부 방법들은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 변형된 진핵 세포를 식별해내는 것을 더 포함한다.
이러한 일부 방법들에 있어서, CRISPR RNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA) 형태로 함께 도입된다. 다른 방법들에 있어서, CRISPR RNA 및 tracrRNA는 별도로 도입된다.
이러한 일부 방법들에 있어서 (a) Cas 단백질은 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 상기 진핵 세포 안으로 도입되며; (b) CRISPR RNA는 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 진핵 세포 안으로 도입되며; 그리고 (c)
tracrRNA는 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 진핵 세포 안으로 도입된다.
일부 방법들에서 (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고 (c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 상기 진핵 세포안에서 활성이다. 임의선택적으로, 제 1, 제 2, 및/또는 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
일부 방법들에서 (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고 (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고; 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 진핵 세포 안에서 활성이다. 임의선택적으로, 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
일부 방법들에서, Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 상기 진핵 세포 안에 단백질-RNA 복합체로 도입된다.
일부 방법들에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함한다. 일부 방법들에서, 상기 결손된 내생성 핵산 서열은 약 30 kb 내지 약 110 kb이며, 상기 삽입된 제 1 핵산은 약 40 kb 내지 약 140 kb이다. 일부 방법들에서, 상기 결손된 내생성 핵산 서열은 약 38 kb 내지 약 110 kb이며, 상기 삽입된 제 1 핵산은 약 43 kb 내지 약 134 kb이다.
일부 방법들에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형이다. 임의선택적으로, 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함한다.
일부 방법들에서, 상기 변형된 진핵 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성(compound heterozygous)이다. 일부 방법들에서, 상기 변형된 진핵 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성(hemizygous)이다. 임의선택적으로, 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함한다. 임의선택적으로, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다: (1) 2개의 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴(disruption). 상기 제 1 염색체는 2개의 상동성 염색체중에 하나일 수 있고, 제 2 염색체는 나머지 하나의 상동성 염색체일 수 있다.
일부 방법들에서, LTVEC는 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb이다. 임의선택적으로, LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb이다.
일부 방법들에서, 제 1 핵산은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 최소한 200 kb, 최소한 250 kb, 또는 최소한 300 kb이다. 일부 방법들에서, 제 1 핵산은 약 40 kb 내지 약 140 kb이다. 일부 방법들에서, 제 1 핵산은 약 43 kb 내지 약 134 kb이다.
일부 방법들에서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포, 섬유아세포, 다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 설치류 다능성 세포, 마우스 또는 렛 배아 줄기 (ES) 세포, 인간 다능성 세포, 인간 배아 줄기 (ES) 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 또는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포다.
일부 방법들에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 방법들에서, 상기 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 측면에 있다.
일부 방법들에서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 150 kb이다. 임의선택적으로, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb이다.
일부 방법들에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다: (a)
내생성 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열로 대체; (b) 내생성 핵산 서열의 결손; (c) 내생성 핵산 서열의 결손, 이때 상기 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb 범위이며; (d) 외생성 핵산 서열의 삽입; (e) 약 5kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열의 삽입; (f) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열의 삽입; (g) 인간 및 비-인간 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열의 삽입; (h) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자의 삽입; (i) 상기 다능성 세포 안에서 활성인 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선택성 표지 또는 리포터 유전자의 삽입; 또는 (j) 이의 조합.
일부 방법들에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 (i) 5' 상동성 아암에 상동성인 5' 표적 서열; 그리고 (ii) 3' 상동성 아암에 상동성인 3' 표적 서열을 포함한다. 임의선택적으로, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리된다. 임의선택적으로, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1Mb 미만, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb 미만, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb 미만에 의해 분리된다. 임의선택적으로, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 110 kb, 최소한 120 kb, 최소한 130 kb, 최소한 140 kb, 최소한 150 kb, 최소한 160 kb, 최소한 170 kb, 최소한 180 kb, 최소한 190 kb, 또는 최소한 200 kb에 의해 분리된다. 일부 방법들에서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 약 30 kb 내지 약 110 kb에 의해 분리된다. 일부 방법들에서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 약 38 kb 내지 약 110 kb에 의해 분리된다.
일부 방법들에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 또는 Rag1과 Rag2 좌 모두를 포함한다. 다른 방법들에 있어서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 Adamts5 좌, Trpa1 좌, Folh1 좌, 또는 Erbb4 좌를 포함한다. 여전히 다른 방법들에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 Lrp5 좌를 포함한다. 여전히 다른 방법들에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 C5 (Hc) 좌, Ror1 좌, 또는 Dpp4 좌를 포함한다.
관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된, F0 세대 비-인간 동물을 만드는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재 하에서 비-인간 ES 세포 안의 게놈에 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA를 접촉시켜, 변형된 비-인간 ES 세포를 만들고, 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고; (b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 상기 변형된 비-인간 ES 세포를 식별해내고; (c) 상기 변형된 비-인간 ES 세포를 비-인간 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (d) 상기 대리모에게 비-인간 숙주 배아를 임신시키고, 이때 상기 대리모는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 F0 세대 비-인간 동물을 출산한다.
이러한 일부 방법들에 있어서, CRISPR RNA와 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA) 형태로 함께 도입된다. 이러한 다른 방법들에서, CRISPR RNA와 tracrRNA는 별도로 도입된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, (a) Cas 단백질은 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입되며; (b) CRISPR RNA는 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입되며; 그리고 (c)tracrRNA는 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고 (c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 상기 비-인간 ES 세포안에서 활성이다. 임의선택적으로, 제 1, 제 2, 및 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고 (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고; 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 비-인간 ES 세포 안에서 활성이다. 임의선택적으로, 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 상기 비-인간 ES 세포 안에 단백질-RNA 복합체로 도입된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함한다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형이다. 임의선택적으로, 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함한다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 변형된 비-인간 ES 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 변형된 비-인간 ES 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성이다. 임의선택적으로, 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함한다. 임의선택적으로, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다: (1) 2개의 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴. 상기 제 1 염색체는 2개의 상동성 염색체중에 하나일 수 있고, 제 2 염색체는 나머지 하나의 상동성 염색체일 수 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, Cas 단백질은 Cas9이다.
진핵 세포, 마우스 세포, 또는 인간 세포 안에서 관심 대상의 게놈 좌에서 게놈을 변형시키는 방법들을 더 제공하는데, 이 방법은 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재 하에서 상기 게놈에 Cas 단백질, 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 표적 서열에 혼성화되는 CRISPR RNA 및 tracrRNA를 접촉시키고, 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 상기 관심 대상의 게놈에서 5'표적 서열에 상동성인 5' 상동성 아암과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고, 이때 제 1 핵산은 최소한 30 kb이며 및/또는 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 30 kb에 의해 분리되며, 이때 LTVEC 존재하에서 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA에 접촉된 후, 상기 게놈은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입이 포함된 표적화된 유전적 변형이 포함되도록 변형된다.
상기 방법들중 임의의 방법은 Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 LTVEC가 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 도입되는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 방법들중 임의의 방법은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 변형된 진핵 세포, 변형된 마우스 세포, 또는 변형된 인간 세포를 식별해내는 것을 더 포함할 수 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, CRISPR RNA 및 tracrRNA는 단일 전사체 형태로 함께 도입된다. 이러한 일부 방법들에 있어서, CRISPR RNA 및 tracrRNA는 별도로 도입된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, (a) Cas 단백질은 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 도입되며; (b) CRISPR RNA는 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 도입되며; 그리고 (c) tracrRNA는 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 도입된다. 이러한 일부 방법들에 있어서, Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안에 단백질-RNA 복합체로 도입된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고 (c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안에서 활성이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 제 1, 제 2, 및/또는 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고 (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 단일 전사체 안에 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고; 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 진핵 세포, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안에서 활성이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, LTVEC는 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb이다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 제 1 핵산은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 최소한 200 kb, 최소한 250 kb, 또는 최소한 300 kb이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 제 1 핵산은 약 40 kb 내지 약 140 kb이다.
이러한 일부 방법들에 있어서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 150 kb이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb이다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리된다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1Mb 미만, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb 미만, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb미만에 의해 분리된다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 110 kb, 최소한 120 kb, 최소한 130 kb, 최소한 140 kb, 최소한 150 kb, 최소한 160 kb, 최소한 170 kb, 최소한 180 kb, 최소한 190 kb, 또는 최소한 200 kb에 의해 분리된다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 약 30 kb 내지 약 110 kb에 의해 분리된다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 진핵 세포는 렛 세포는 아니다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 진핵 세포는 다능성 세포, 비-다능성 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 설치류 다능성 세포, 또는 섬유아세포다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 진핵 세포는 일차(primary) 세포 또는 불사화된(immortalized) 세포다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 설치류 다능성 세포는 마우스 또는 렛 배아 줄기 (ES) 세포다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포는 일차 세포 또는 불사화된 세포다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포는 다능성 세포다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 마우스 다능성 세포는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 인간 다능성 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 또는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 인간 iPS 세포는 기본 배지와 보충물이 포함된 배지 안에서 유지되며, 이때 상기 배지는 (a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드; (b) 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK3) 억제제; 그리고 (c) MEK 억제제를 포함하며; 이때 상기 배지는 약 175 mOsm/kg 내지 약 280 mOsm/kg의 오스몰농도를 갖는다.
이러한 일부 방법들에 있어서, Cas 단백질은 Cas9이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 측면에 있다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 단일 단계에서 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함한다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 결손된 내생성 핵산 서열은 약 30 kb 내지 약 110 kb이며, 상기 삽입된 제 1 핵산은 약 40 kb 내지 약 140 kb이다.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함한다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 변형된 진핵 세포, 상기 변형된 마우스 세포, 또는 상기 변형된 인간 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 변형된 진핵 세포, 상기 변형된 마우스 세포, 또는 상기 변형된 인간 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성이다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함한다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다: (1) 제 1 및 제 2 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다 : (a) 내생성 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열로 대체; (b) 내생성 핵산 서열의 결손; (c) 내생성 핵산 서열의 결손, 이때 상기 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb 범위가 되며; (d) 외생성 핵산 서열의 삽입; (e) 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열의 삽입; (f) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열의 삽입; (g) 인간 및 비-인간 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열의 삽입; (h) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자의 삽입; (i) 상기 다능성 세포 안에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선택성 표지 또는 리포터 유전자의 삽입; 또는 (j) 이의 조합.
이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, Rag1 및 Rag2 좌 둘 모두, Adamts5 좌, Trpa1 좌, Folh1 좌, Erbb4 좌, Lrp5 좌, C5 (Hc) 좌, Ror1 좌, 또는 Dpp4 좌를 포함한다. 이러한 일부 방법들에 있어서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 염색체외(extrachromosomal) DNA를 포함한다.
관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된, F0 세대 비-인간 동물 또는 마우스를 생산하는 방법들을 또한 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 방법들중 임의의 방법을 이용하여 비-인간 또는 마우스 ES 세포를 변형시키고; (b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 상기 변형된 비-인간 또는 마우스 ES 세포를 식별해내고; (c) 상기 변형된 비-인간 또는 마우스 ES 세포를 비-인간 또는 마우스 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (d) 비-인간 또는 마우스 숙주 배아를 대리모에 임신시키고, 이때 대리모는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형을 포함하는 F0 세대 비-인간 동물 또는 마우스를 출산한다.
도 1은 배양접시에서 통상적으로 분리되고, 부유되는 조밀한 구형 콜로니로 성장된 렛 ESCs를 나타낸다.
도 2a~d는 렛 ESCs에 의해 발현된 다양한 전분화능(pluripotency) 표지들을 나타낸다. a는 Oct-4 (녹색)를 나타내고; b는 Sox-2 (적색)를 나타내고; c는 DAPI (청색)를 나타내고; d는 rESCs에 의해 발현된 전분화능 표지들의 오버레이를 나타낸다.
도 3은 렛 ESCs가 소규모(light level)의 알칼리 포스파타제 (전분화능 표지)를 발현시킨다는 것을 나타낸다.
도 4는 계통 DA.2B의 핵형(karyotype), 즉 42X,Y를 나타낸다. 렛 ESCs는 흔히 사배수체(tetraploid)가 되기 때문에 핵형분석이 실행되었고; 따라서 계통들은 중기 염색체 스프레드(spreads)를 카운팅하여 사전-선별되었고, 주로 정상적인 카운트를 가진 계통들이 정식으로 핵형화되었다.
도 5a-b는 ACI.G1 렛 ES 세포 계통의 염색체 수 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 6a-b는 DA.2B 렛 ES 세포 계통의 염색체 수 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 7a-b는 DA.2C 렛 ES 세포 계통의 염색체 수 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 8은 도 1의 렛 ESC를 더 세밀하게 나타낸다.
도 9는 낭포 주사 및 생식계열을 통하여 렛 ESC 게놈의 전달에 의한 키메라 생산을 나타낸다. 부계 ACI.G1 렛 ESCs를 이용하여 낭포 주사에 의해 키메라가 만들어졌다. 고백분율의 키메라는 백색증 코(albino snouts)를 항상 가진다.
도 10은 도 9에서 별표(*)로 표시된 ACI/SD 키메라에 의해 아비가 된 백색증 한배새끼와 F1 아구티 새끼를 나타낸다.
도 11은 렛 ApoE 좌를 도식한 것으로, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 부위를 나타내는 회색 막대 (ZFN1 및 ZFN2)를 나타낸다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb)에 대응하는 게놈 영역은 짙은 회색 상자로 표시된다. ApoE 유전자의 엑손은 넌-코딩(non-coding)이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시된다. 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다.
도 12는 렛 Rosa26 좌의 표적화를 나타내는데, 마우스에서 동일한 공간을 가자고, Setd5와 Thumpd3 유전자 사이에 있다. 패널 a는 마우스 Rosa26 좌의 구조를 나타낸다. 마우스 Rosa26 전사체는 2 또는 3개의 엑손으로 구성된다. 패널 b는 렛 Rosa26 좌의 구조를 나타내며; 상기 렛 좌는 마우스 엑손1 (Ex1a)에 대한 상동성 엑손에 추가하여 제 2 엑손 1 (Ex1b)을 포함하며; 렛에서 제 3 엑손은 확인되지 않았다. 패널 c는 표적화된 렛 Rosa26 대립유전자를 나타내는데; 각각 5 kb의 상동성 아암은 DA rESC의 게놈 DNA를 이용한 PCR에 의해 클론되었다; 상기 표적화된 대립유전자는 상기 렛 Rosa26 인트론 안에서 117 bp 결손을 대체하는 Splicing Acceptor (SA)-lacZ-hUB-neo 카세트를 포함한다.
도 13a는 X-gal로 착색된 14-주령의 야생형 렛의 대조 뇌를 나타낸다. 상기 대조 뇌는 LacZ에 대한 배경 착색 수준이 낮은 것으로 나타났다 (전면도).
도 13b는 rRosa26 이형접합성 렛 (14-주령)의 뇌에서 LacZ 발현을 나타낸다. 상기 lacZ 리포터는 rRosa26 이형접합체의 뇌를 통하여 편재되어 발현된다.
도 13c는 X-gal로 처리된 14-주령의 야생형 렛의 대조 심장 및 흉선(삽입도)를 나타낸다. 대조 심장 및 흉선은 LacZ에 대한 배경 착색 수준이 낮은 것으로 나타났다.
도 13d는 14주령 rRosa26 이형접합성 렛의 심장 및 흉선(삽입도)에서 LacZ 발현을 나타낸다. 상기 lacZ 리포터는 rROSA26 이형접합체의 심장 및 흉선을 통하여 편재되어 발현되었다.
도 13e는 X-gal로 착색된 14-주령의 야생형 렛의 대조 폐를 나타낸다. 상기 대조 폐는 LacZ에 대한 배경 착색 수준이 낮은 것으로 나타났다.
도 13f는 14주령 rRosa26 이형접합체 렛의 폐에서 LacZ 발현을 나타낸다. 상기 lacZ 리포터는 rRosa26 이형접합체의 폐를 통하여 편재되어 발현된다.
도 13g와 h는 E12.5 렛 배아에서 LacZ 발현을 나타낸다. 낮은 수준의 배경 LacZ 착색을 보이는 야생형 대조 배아 (h)와 대조적으로, rRosa26 이형접합성 배아는 배아를 통하여 LacZ 리포터의 편재된 발현을 나타내었다.
도 13i 및 j는 E14.5 렛 배아에서 LacZ 발현을 나타낸다. 낮은 수준의 배경 LacZ 착색을 보이는 야생형 대조 배아 (j)와 대조적으로, rRosa26 이형접합성 렛 배아는 배아를 통하여 LacZ 리포터의 편재된 발현을 나타내었다.
도 14는 선별 카세트 (lacZ-neo 카세트)가 포함된 표적화 벡터의 전기천공 후, 렛 ES 세포 안에서 발생되는 상동성 또는 비-상동성 재조합 이벤트를 설명한다.
도 15는 게놈-편집(editing) 엔도뉴클레아제 (가령, ZFNs 및 TALENs)가 표적 게놈 서열 안으로 이중 가닥 틈 (DSB)을 도입시키고, ES 세포 안에서 비-상동성 단부-연결 (NHEJ)을 활성화시키는 기전을 설명한다.
도 16은 표적화 벡터의 상동성 재조합 효과를 개선시키기 위하여, ZFN/TALENs를 이용하여 유전자 표적화 기술을 설명한다. DSB는 이중 가닥 틈을 나타낸다.
도 17은 상기 변형된 렛 ApoE 좌의 생식계열 유전에 의해 생산된 ApoE-ZFN-AB5 키메라를 나타낸다. 상기 표적화된 변형은 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 지원을 받았다.
도 18은 ZFN U 및 ZFN D를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제와 복합되어 IL2r-γ 표적화 이벤트를 도식화한 것이다. ZFN U 및 ZFN D에 의해 표적화되는 렛 IL2r-γ 좌의 영역이 표시된다(서열 번호: 93). ZFN 절단 부위들이 이 도면에서 표시된다.
도 19는 ZFN U 및 ZFN D를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제와 복합되어, 또는 gRNAs (gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4)와 복합되어 IL2r-γ 표적화 이벤트를 도식화한 것이다. ZFN U 및 ZFN D 또는 gRNAs1-4에 의해 표적화되는 렛 IL2r-γ 좌의 영역을 나타내며, ZFN 절단 부위가 표시된다.
도 20은 렛 ApoE 좌 및 표적화 플라스미드를 도식화한다. 상위 그림은 렛 ApoE 좌의 게놈 구조와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역을 나타낸다. ApoE 유전자의 엑손 1은 넌-코딩(non-coding)이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시된다. 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다. 아래 패널은 표적화 플라스미드를 나타낸다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 벡터는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들의 측면에 있는 자가-결손 카세트 (개방 화살표)를 포함한다. 상기 자가-결손 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 21a는 아연-핑거 뉴클레아제와 리포터 유전자 (LacZ)가 포함된 표적화 벡터 그리고 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터가 포함된 자가-결손 카세트 그리고 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터가 포함된 약물 선별 카세트를 이용하여, 렛 ES 세포 안에서 ApoE 좌를 표적화하는 과정을 도식한 것이다. 도 21b는 동형접합성(homozygous) 표적화된 ApoE 좌를 나타낸다.
도 22는 렛 ApoE 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 상위 패널은 렛 ApoE 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. ApoE의 엑손 1은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다. 아래 패널은 렛 ApoE 좌를 변경시키기 위한 LTVEC를 보여준다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 23은 렛 ApoE 좌를 도식한 것으로써, 상기 표적화 벡터와 상기 표적 동족(cognate) 염색체 영역 사이에 상동성 재조합을 강화시키기 위하여, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)와 함께 이용된, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 부위를 나타내는 회색 막대 (ZFN1 및 ZFN2)를 나타낸다.
도 24는 리포터 유전자 (eGFP)의 삽입, 그리고 약물 선별 카세트 (hUb-neo)와 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자를 포함하는 자가-결손 카세트의 삽입에 의해 파괴된 렛 IL2r-γ 좌를 나타낸다.
도 25는 3.2 kb 결손, 그리고 리포터 유전자 (eGFP) 및 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자, 그리고 약물 선별 카세트 (hUb-Neo)를 포함하는 자가-결손 카세트의 삽입에 의해 파괴된 렛 IL2r-γ 좌의 또다른 도식을 나타낸다.
도 26은 렛 Rag2 좌를 변형시키기 위한 렛 Rag2 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것이다. 상부 패널은 렛 Rag2 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2는 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 27은 렛 Rag1/Rag2 좌의 게놈 구조와 Rag2 표적화 (Rag2 결손) 또는 Rag2/Rag1 이중 표적화 (Rag2/Rag1 결손)에 의해 결손된 게놈 영역을 제공한다.
도 28은 상기 좌를 변형시키는데 이용된 렛 Rag2 및 Rag1 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것이다. 상부 패널은 Rag1 및 Rag2 좌 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2 및 Rag1은 각각 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 29는 II2rg-/y 키메라 렛 (패널 a-c) 및 WT DA렛 (패널 d-f)의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)에서 GFP 발현 및 T-세포 표지 CD3 (패널 a 및 d), B-세포 표지 B220 (패널 b 및 e), 및 NK 세포 표지 CD161a (패널c 및 f)에 대한 유동 세포 분석을 나타낸다. 이중-양성 세포는 사분면 R8에 나타낸다. 도 29는 II2rg-/y PBMC가 성숙한 림프구 표지들을 발현하지 않음을 보여준다.
도 30은 GFP-양성 림프구가 3 II2rg-/y 키메라중 2개에서 말초 혈액에서 탐지되었음을 보여준다.
도 31은 렛 Il2rg 좌의 완전한 인간화(humanization)를 위하여 렛 Il2rg 좌와 표적화 플라스미드를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Il2rg 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. 하부 패널은 상기 표적화 플라스미드다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 플라스미드는 상기 인간 IL-2rg 게놈 영역과 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 32는 렛 Il2rg 좌와 렛 Il2rg 좌의 엑토(ecto)-도메인을 위한 표적화 플라스미드를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Il2rg 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. 하부 패널은 상기 표적화 플라스미드다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 플라스미드는 IL-2Rg 게놈 영역의 상기 인간 엑토-도메인과 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 33은 상기 인간 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 20; NP_000197.1); 상기 렛 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 21; NP_543165.1); 그리고 상기 렛 IL-2rg 단백질의 나머지에 융합된 IL-2rg의 상기 인간 엑토-도메인이 포함된 키메라 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 22)의 서열 배열을 제공한다. 상기 인간과 렛 IL-2rg 사이의 교점(junction)은 수직 선으로 표시된다.
도 34는 마우스 Lrp5 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Lrp5 좌는 하부 패널에 나타낸다. 인간화된 영역은 엑토도메인이다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 및 ZFN (a-d) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 35는 결손 크기 증가에 따른 LTVECs 표적화 유전자의 표적화 효과 백분율 (도 35a)과 인간 유전자 삽입 크기 증가에 따른 LTVECs의 표적화 효과 백분율 (도 35b)을 나타낸다. 상기 LTVECs가 단독으로 이용되거나 (회색 사각형 또는 삼각형), 또는 ZFNs와 복합되어 이용되었다 (검정 사각형 또는 삼각형).
도 36은 마우스 Trpa1 유전자의 전체 코딩 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로써; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Trpa1 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 37은 마우스 Folh1 유전자의 엑토도메인 (엑손 2에서부터 중지 코돈까지) CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Folh1 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 38은 마우스 C5 (Hc) 유전자의 엑손 2에서부터 중지 코돈까지 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 C5 (Hc) 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 39는 마우스 Adamts5 유전자의 전체 코딩 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로써; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Adamts5 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 40은 마우스 Erbb4 유전자의 엑손 4-15의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Erbb4 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 41은 마우스 Ror1 유전자의 엑손 2-7의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Ror1 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gC, gD, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 42는 마우스 Dpp4 유전자의 엑손 2에서부터 중지 코돈까지 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Dpp4 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 43은 X-gal로 착색된 12-주령의 암컷 렛의 뇌를 보여준다. 도 43a-c는 야생형 렛의 뇌를 보여주며, 도 43d-f는 ApoE +/-렛의 뇌를 보여준다. 도 43a 및 d는 전면도이며, 도 43b 및 e는 복면도이고, 도 43c 및 f는 근접도(close-up view)이다.
도 44는 X-gal로 착색된 12-주령의 암컷 렛 심장 (a 및 c) 그리고 혈액 혈관의 대응하는 근접도 (b 및 d)를 보여준다. 도 44 a 및 b는 야생형 렛의 심장 및 혈액 혈관을 차례로 보여주며, 도 44c 및 d는 ApoE +/-렛의 심장 및 혈액 혈관을 차례로 보여준다. 착색은 심장의 심방과 일부 혈관 (가령, 대정맥)에 존재한다.
도 45는 X-gal로 착색된 12-주령의 암컷 렛의 간을 보여준다. 도 45a 및 b는 야생형 렛의 간을 보여주며, 도 45c 및 d는 ApoE +/-렛의 간을 보여준다. 도 45b 및 d는 간의 근접도다.
도 46은 동형접합성 ApoE-표적화된 렛, 이형접합성 ApoE-표적화된 렛, 그리고 야생형 렛에서 6 주, 9 주, 12 주, 및 15 주 시점에서 콜레스테롤, LDL, HDL, 및 트리글리세리드 수준의 탐지(도 46a-d, 차례로)를 나타낸다.
도 47은 상기 렛 ApoE 좌 (상부 패널)과 상기 렛 ApoE 좌를 표적으로 하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC) (하부 패널)를 도식화한 것을 제공한다. 상위 패널은 렛 ApoE 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. ApoE의 엑손 1은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다. ApoE gRNA2 (서열 번호: 87) 및 gRNA3 (서열 번호: 88)에 대한 표적 부위들이 표시된다. 아래 패널은 렛 ApoE 좌를 변경시키기 위한 LTVEC를 보여준다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 48은 상기 렛 Rag2 좌 (상부 패널)와 상기 렛 Rag2 좌를 표적으로 하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC) (하부 패널)를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Rag2 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2는 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. Rag2 gRNA1 (서열 번호: 89) 및 gRNA4 (서열 번호: 90)에 대한 표적 부위들이 표시된다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 히그로마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 49는 상기 렛 Il2rg 좌 (상부 패널)와 상기 렛 Il2rg 좌의 엑토도메인을 위한 표적화 플라스미드(하부 패널)를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Il2rg 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Il2rg gRNA2 (서열 번호: 91) 및 gRNA4 (서열 번호: 92)에 대한 표적 부위들이 표시된다. 하부 패널은 상기 표적화 플라스미드다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 플라스미드는 IL-2Rg 게놈 영역의 상기 인간 엑토-도메인과 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 50은 상기 렛 Rag2 및 Rag1 좌 그리고 Il2rg-표적화된 렛 ES 세포 (클론 Il2rg-CG12)에서 상기 좌를 변형시키는데 이용된 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 Rag1 및 Rag2 좌 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2 및 Rag1은 각각 비음영 화살표에 의해 표시된 단일 엑손을 포함한다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 LTVEC는 액틴 프로모터에 작동가능하도록 연계된, 리포터 유전자 (eGFP)와 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 분리된 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함한다. 상기 LTVEC는 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 더 포함한다.
도 51은 인간 ADAM6 좌의 일부분을 인간 iPS 세포 안에서 LTVEC 및 가이드 RNA를 이용하여 마우스 Adam6a 및 마우스 Adam6b 좌들이 포함된 핵산으로 대체를 도식으로 나타낸다. 상기 가이드 RNA의 표적 부위는 화살표로 나타낸다.
도 52a는 2i 배지에서 8일 동안 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다. 도 52b는 2i 배지에서 12일 동안 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다.
도 53a-53d는 6일 동안 mTeSR™ -hLIF 배지 또는 낮은 오스몰농도 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다. 도 53a 및 53b는 6일 동안 mTeSR™ -hLIF 배지 (도 3a) 또는 VG2i 배지 (도 53b)에서 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다. 도 53c 및 53d는 mTeSR™ -hLIF 배지 (도 53c) 또는 VG2i 배지 (도 53d)에서 6일 동안 신생 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 먹이공급(feeder) 세포 상에서 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다.
도 54a는 VG2i 배지에서 배양되고, 알칼리 포스파타제로 착색된, 재프로그램된(reprogrammed) 인간 iPS 세포를 나타낸다. 도 54b 및 54c는 VG2i 배지에서 배양되고, NANOG의 발현에 대하여 면역착색된, 재프로그램된 인간 iPS 세포를 나타낸다.
도 55a-55c는 VG2i 배지에서 배양된 재프로그램된 인간 iPS 세포의 효소적 분리(enzymatic dissociation) 및 계대배양(subculture)을 설명한다. 도 55a는 ROCK 억제제 부재하에 트립신에 의한 효소적 분리에 앞서, VG2i 배지에서 배양된, 재프로그램된 인간 iPS 세포를 나타낸다. 도 55b는 계대배양 후 1일 동안 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포를 나타낸다. 도 55c는 계대배양 후 1일 동안 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포를 나타낸다.
도 2a~d는 렛 ESCs에 의해 발현된 다양한 전분화능(pluripotency) 표지들을 나타낸다. a는 Oct-4 (녹색)를 나타내고; b는 Sox-2 (적색)를 나타내고; c는 DAPI (청색)를 나타내고; d는 rESCs에 의해 발현된 전분화능 표지들의 오버레이를 나타낸다.
도 3은 렛 ESCs가 소규모(light level)의 알칼리 포스파타제 (전분화능 표지)를 발현시킨다는 것을 나타낸다.
도 4는 계통 DA.2B의 핵형(karyotype), 즉 42X,Y를 나타낸다. 렛 ESCs는 흔히 사배수체(tetraploid)가 되기 때문에 핵형분석이 실행되었고; 따라서 계통들은 중기 염색체 스프레드(spreads)를 카운팅하여 사전-선별되었고, 주로 정상적인 카운트를 가진 계통들이 정식으로 핵형화되었다.
도 5a-b는 ACI.G1 렛 ES 세포 계통의 염색체 수 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 6a-b는 DA.2B 렛 ES 세포 계통의 염색체 수 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 7a-b는 DA.2C 렛 ES 세포 계통의 염색체 수 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 8은 도 1의 렛 ESC를 더 세밀하게 나타낸다.
도 9는 낭포 주사 및 생식계열을 통하여 렛 ESC 게놈의 전달에 의한 키메라 생산을 나타낸다. 부계 ACI.G1 렛 ESCs를 이용하여 낭포 주사에 의해 키메라가 만들어졌다. 고백분율의 키메라는 백색증 코(albino snouts)를 항상 가진다.
도 10은 도 9에서 별표(*)로 표시된 ACI/SD 키메라에 의해 아비가 된 백색증 한배새끼와 F1 아구티 새끼를 나타낸다.
도 11은 렛 ApoE 좌를 도식한 것으로, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 부위를 나타내는 회색 막대 (ZFN1 및 ZFN2)를 나타낸다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb)에 대응하는 게놈 영역은 짙은 회색 상자로 표시된다. ApoE 유전자의 엑손은 넌-코딩(non-coding)이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시된다. 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다.
도 12는 렛 Rosa26 좌의 표적화를 나타내는데, 마우스에서 동일한 공간을 가자고, Setd5와 Thumpd3 유전자 사이에 있다. 패널 a는 마우스 Rosa26 좌의 구조를 나타낸다. 마우스 Rosa26 전사체는 2 또는 3개의 엑손으로 구성된다. 패널 b는 렛 Rosa26 좌의 구조를 나타내며; 상기 렛 좌는 마우스 엑손1 (Ex1a)에 대한 상동성 엑손에 추가하여 제 2 엑손 1 (Ex1b)을 포함하며; 렛에서 제 3 엑손은 확인되지 않았다. 패널 c는 표적화된 렛 Rosa26 대립유전자를 나타내는데; 각각 5 kb의 상동성 아암은 DA rESC의 게놈 DNA를 이용한 PCR에 의해 클론되었다; 상기 표적화된 대립유전자는 상기 렛 Rosa26 인트론 안에서 117 bp 결손을 대체하는 Splicing Acceptor (SA)-lacZ-hUB-neo 카세트를 포함한다.
도 13a는 X-gal로 착색된 14-주령의 야생형 렛의 대조 뇌를 나타낸다. 상기 대조 뇌는 LacZ에 대한 배경 착색 수준이 낮은 것으로 나타났다 (전면도).
도 13b는 rRosa26 이형접합성 렛 (14-주령)의 뇌에서 LacZ 발현을 나타낸다. 상기 lacZ 리포터는 rRosa26 이형접합체의 뇌를 통하여 편재되어 발현된다.
도 13c는 X-gal로 처리된 14-주령의 야생형 렛의 대조 심장 및 흉선(삽입도)를 나타낸다. 대조 심장 및 흉선은 LacZ에 대한 배경 착색 수준이 낮은 것으로 나타났다.
도 13d는 14주령 rRosa26 이형접합성 렛의 심장 및 흉선(삽입도)에서 LacZ 발현을 나타낸다. 상기 lacZ 리포터는 rROSA26 이형접합체의 심장 및 흉선을 통하여 편재되어 발현되었다.
도 13e는 X-gal로 착색된 14-주령의 야생형 렛의 대조 폐를 나타낸다. 상기 대조 폐는 LacZ에 대한 배경 착색 수준이 낮은 것으로 나타났다.
도 13f는 14주령 rRosa26 이형접합체 렛의 폐에서 LacZ 발현을 나타낸다. 상기 lacZ 리포터는 rRosa26 이형접합체의 폐를 통하여 편재되어 발현된다.
도 13g와 h는 E12.5 렛 배아에서 LacZ 발현을 나타낸다. 낮은 수준의 배경 LacZ 착색을 보이는 야생형 대조 배아 (h)와 대조적으로, rRosa26 이형접합성 배아는 배아를 통하여 LacZ 리포터의 편재된 발현을 나타내었다.
도 13i 및 j는 E14.5 렛 배아에서 LacZ 발현을 나타낸다. 낮은 수준의 배경 LacZ 착색을 보이는 야생형 대조 배아 (j)와 대조적으로, rRosa26 이형접합성 렛 배아는 배아를 통하여 LacZ 리포터의 편재된 발현을 나타내었다.
도 14는 선별 카세트 (lacZ-neo 카세트)가 포함된 표적화 벡터의 전기천공 후, 렛 ES 세포 안에서 발생되는 상동성 또는 비-상동성 재조합 이벤트를 설명한다.
도 15는 게놈-편집(editing) 엔도뉴클레아제 (가령, ZFNs 및 TALENs)가 표적 게놈 서열 안으로 이중 가닥 틈 (DSB)을 도입시키고, ES 세포 안에서 비-상동성 단부-연결 (NHEJ)을 활성화시키는 기전을 설명한다.
도 16은 표적화 벡터의 상동성 재조합 효과를 개선시키기 위하여, ZFN/TALENs를 이용하여 유전자 표적화 기술을 설명한다. DSB는 이중 가닥 틈을 나타낸다.
도 17은 상기 변형된 렛 ApoE 좌의 생식계열 유전에 의해 생산된 ApoE-ZFN-AB5 키메라를 나타낸다. 상기 표적화된 변형은 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 지원을 받았다.
도 18은 ZFN U 및 ZFN D를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제와 복합되어 IL2r-γ 표적화 이벤트를 도식화한 것이다. ZFN U 및 ZFN D에 의해 표적화되는 렛 IL2r-γ 좌의 영역이 표시된다(서열 번호: 93). ZFN 절단 부위들이 이 도면에서 표시된다.
도 19는 ZFN U 및 ZFN D를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제와 복합되어, 또는 gRNAs (gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4)와 복합되어 IL2r-γ 표적화 이벤트를 도식화한 것이다. ZFN U 및 ZFN D 또는 gRNAs1-4에 의해 표적화되는 렛 IL2r-γ 좌의 영역을 나타내며, ZFN 절단 부위가 표시된다.
도 20은 렛 ApoE 좌 및 표적화 플라스미드를 도식화한다. 상위 그림은 렛 ApoE 좌의 게놈 구조와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역을 나타낸다. ApoE 유전자의 엑손 1은 넌-코딩(non-coding)이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시된다. 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다. 아래 패널은 표적화 플라스미드를 나타낸다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 벡터는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들의 측면에 있는 자가-결손 카세트 (개방 화살표)를 포함한다. 상기 자가-결손 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 21a는 아연-핑거 뉴클레아제와 리포터 유전자 (LacZ)가 포함된 표적화 벡터 그리고 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터가 포함된 자가-결손 카세트 그리고 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터가 포함된 약물 선별 카세트를 이용하여, 렛 ES 세포 안에서 ApoE 좌를 표적화하는 과정을 도식한 것이다. 도 21b는 동형접합성(homozygous) 표적화된 ApoE 좌를 나타낸다.
도 22는 렛 ApoE 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 상위 패널은 렛 ApoE 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. ApoE의 엑손 1은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다. 아래 패널은 렛 ApoE 좌를 변경시키기 위한 LTVEC를 보여준다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 23은 렛 ApoE 좌를 도식한 것으로써, 상기 표적화 벡터와 상기 표적 동족(cognate) 염색체 영역 사이에 상동성 재조합을 강화시키기 위하여, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)와 함께 이용된, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 부위를 나타내는 회색 막대 (ZFN1 및 ZFN2)를 나타낸다.
도 24는 리포터 유전자 (eGFP)의 삽입, 그리고 약물 선별 카세트 (hUb-neo)와 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자를 포함하는 자가-결손 카세트의 삽입에 의해 파괴된 렛 IL2r-γ 좌를 나타낸다.
도 25는 3.2 kb 결손, 그리고 리포터 유전자 (eGFP) 및 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자, 그리고 약물 선별 카세트 (hUb-Neo)를 포함하는 자가-결손 카세트의 삽입에 의해 파괴된 렛 IL2r-γ 좌의 또다른 도식을 나타낸다.
도 26은 렛 Rag2 좌를 변형시키기 위한 렛 Rag2 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것이다. 상부 패널은 렛 Rag2 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2는 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 27은 렛 Rag1/Rag2 좌의 게놈 구조와 Rag2 표적화 (Rag2 결손) 또는 Rag2/Rag1 이중 표적화 (Rag2/Rag1 결손)에 의해 결손된 게놈 영역을 제공한다.
도 28은 상기 좌를 변형시키는데 이용된 렛 Rag2 및 Rag1 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것이다. 상부 패널은 Rag1 및 Rag2 좌 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2 및 Rag1은 각각 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 29는 II2rg-/y 키메라 렛 (패널 a-c) 및 WT DA렛 (패널 d-f)의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)에서 GFP 발현 및 T-세포 표지 CD3 (패널 a 및 d), B-세포 표지 B220 (패널 b 및 e), 및 NK 세포 표지 CD161a (패널c 및 f)에 대한 유동 세포 분석을 나타낸다. 이중-양성 세포는 사분면 R8에 나타낸다. 도 29는 II2rg-/y PBMC가 성숙한 림프구 표지들을 발현하지 않음을 보여준다.
도 30은 GFP-양성 림프구가 3 II2rg-/y 키메라중 2개에서 말초 혈액에서 탐지되었음을 보여준다.
도 31은 렛 Il2rg 좌의 완전한 인간화(humanization)를 위하여 렛 Il2rg 좌와 표적화 플라스미드를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Il2rg 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. 하부 패널은 상기 표적화 플라스미드다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 플라스미드는 상기 인간 IL-2rg 게놈 영역과 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 32는 렛 Il2rg 좌와 렛 Il2rg 좌의 엑토(ecto)-도메인을 위한 표적화 플라스미드를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Il2rg 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. 하부 패널은 상기 표적화 플라스미드다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 플라스미드는 IL-2Rg 게놈 영역의 상기 인간 엑토-도메인과 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 33은 상기 인간 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 20; NP_000197.1); 상기 렛 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 21; NP_543165.1); 그리고 상기 렛 IL-2rg 단백질의 나머지에 융합된 IL-2rg의 상기 인간 엑토-도메인이 포함된 키메라 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 22)의 서열 배열을 제공한다. 상기 인간과 렛 IL-2rg 사이의 교점(junction)은 수직 선으로 표시된다.
도 34는 마우스 Lrp5 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Lrp5 좌는 하부 패널에 나타낸다. 인간화된 영역은 엑토도메인이다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 및 ZFN (a-d) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 35는 결손 크기 증가에 따른 LTVECs 표적화 유전자의 표적화 효과 백분율 (도 35a)과 인간 유전자 삽입 크기 증가에 따른 LTVECs의 표적화 효과 백분율 (도 35b)을 나타낸다. 상기 LTVECs가 단독으로 이용되거나 (회색 사각형 또는 삼각형), 또는 ZFNs와 복합되어 이용되었다 (검정 사각형 또는 삼각형).
도 36은 마우스 Trpa1 유전자의 전체 코딩 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로써; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Trpa1 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 37은 마우스 Folh1 유전자의 엑토도메인 (엑손 2에서부터 중지 코돈까지) CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Folh1 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 38은 마우스 C5 (Hc) 유전자의 엑손 2에서부터 중지 코돈까지 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 C5 (Hc) 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 39는 마우스 Adamts5 유전자의 전체 코딩 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로써; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Adamts5 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gA2, gB, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 40은 마우스 Erbb4 유전자의 엑손 4-15의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Erbb4 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 41은 마우스 Ror1 유전자의 엑손 2-7의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Ror1 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gC, gD, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 42는 마우스 Dpp4 유전자의 엑손 2에서부터 중지 코돈까지 영역의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화를 도식한 것으로; LTVEC는 상부 패널에 나타내고, 마우스 Dpp4 좌는 하부 패널에 나타낸다. 화살표들은 gRNA (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF) 각각의 표적 부위를 나타낸다.
도 43은 X-gal로 착색된 12-주령의 암컷 렛의 뇌를 보여준다. 도 43a-c는 야생형 렛의 뇌를 보여주며, 도 43d-f는 ApoE +/-렛의 뇌를 보여준다. 도 43a 및 d는 전면도이며, 도 43b 및 e는 복면도이고, 도 43c 및 f는 근접도(close-up view)이다.
도 44는 X-gal로 착색된 12-주령의 암컷 렛 심장 (a 및 c) 그리고 혈액 혈관의 대응하는 근접도 (b 및 d)를 보여준다. 도 44 a 및 b는 야생형 렛의 심장 및 혈액 혈관을 차례로 보여주며, 도 44c 및 d는 ApoE +/-렛의 심장 및 혈액 혈관을 차례로 보여준다. 착색은 심장의 심방과 일부 혈관 (가령, 대정맥)에 존재한다.
도 45는 X-gal로 착색된 12-주령의 암컷 렛의 간을 보여준다. 도 45a 및 b는 야생형 렛의 간을 보여주며, 도 45c 및 d는 ApoE +/-렛의 간을 보여준다. 도 45b 및 d는 간의 근접도다.
도 46은 동형접합성 ApoE-표적화된 렛, 이형접합성 ApoE-표적화된 렛, 그리고 야생형 렛에서 6 주, 9 주, 12 주, 및 15 주 시점에서 콜레스테롤, LDL, HDL, 및 트리글리세리드 수준의 탐지(도 46a-d, 차례로)를 나타낸다.
도 47은 상기 렛 ApoE 좌 (상부 패널)과 상기 렛 ApoE 좌를 표적으로 하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC) (하부 패널)를 도식화한 것을 제공한다. 상위 패널은 렛 ApoE 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. ApoE의 엑손 1은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다. ApoE gRNA2 (서열 번호: 87) 및 gRNA3 (서열 번호: 88)에 대한 표적 부위들이 표시된다. 아래 패널은 렛 ApoE 좌를 변경시키기 위한 LTVEC를 보여준다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다.
도 48은 상기 렛 Rag2 좌 (상부 패널)와 상기 렛 Rag2 좌를 표적으로 하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC) (하부 패널)를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Rag2 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2는 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. Rag2 gRNA1 (서열 번호: 89) 및 gRNA4 (서열 번호: 90)에 대한 표적 부위들이 표시된다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 히그로마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 49는 상기 렛 Il2rg 좌 (상부 패널)와 상기 렛 Il2rg 좌의 엑토도메인을 위한 표적화 플라스미드(하부 패널)를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 렛 Il2rg 좌와 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Il2rg gRNA2 (서열 번호: 91) 및 gRNA4 (서열 번호: 92)에 대한 표적 부위들이 표시된다. 하부 패널은 상기 표적화 플라스미드다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 4.3 kb 및 4.0 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 플라스미드는 IL-2Rg 게놈 영역의 상기 인간 엑토-도메인과 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 보유하는 약물 선별 카세트를 보유한다.
도 50은 상기 렛 Rag2 및 Rag1 좌 그리고 Il2rg-표적화된 렛 ES 세포 (클론 Il2rg-CG12)에서 상기 좌를 변형시키는데 이용된 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 상부 패널은 Rag1 및 Rag2 좌 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb; 회색 상자)에 대응하는 동족 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2 및 Rag1은 각각 비음영 화살표에 의해 표시된 단일 엑손을 포함한다. 하부 패널은 LTVEC이다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb)은 회색 상자로 표시된다. 상기 LTVEC는 액틴 프로모터에 작동가능하도록 연계된, 리포터 유전자 (eGFP)와 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 분리된 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함한다. 상기 LTVEC는 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 더 포함한다.
도 51은 인간 ADAM6 좌의 일부분을 인간 iPS 세포 안에서 LTVEC 및 가이드 RNA를 이용하여 마우스 Adam6a 및 마우스 Adam6b 좌들이 포함된 핵산으로 대체를 도식으로 나타낸다. 상기 가이드 RNA의 표적 부위는 화살표로 나타낸다.
도 52a는 2i 배지에서 8일 동안 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다. 도 52b는 2i 배지에서 12일 동안 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다.
도 53a-53d는 6일 동안 mTeSR™ -hLIF 배지 또는 낮은 오스몰농도 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다. 도 53a 및 53b는 6일 동안 mTeSR™ -hLIF 배지 (도 3a) 또는 VG2i 배지 (도 53b)에서 배양된 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다. 도 53c 및 53d는 mTeSR™ -hLIF 배지 (도 53c) 또는 VG2i 배지 (도 53d)에서 6일 동안 신생 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 먹이공급(feeder) 세포 상에서 인간 iPS 세포에 의해 나타나는 형태를 나타낸다.
도 54a는 VG2i 배지에서 배양되고, 알칼리 포스파타제로 착색된, 재프로그램된(reprogrammed) 인간 iPS 세포를 나타낸다. 도 54b 및 54c는 VG2i 배지에서 배양되고, NANOG의 발현에 대하여 면역착색된, 재프로그램된 인간 iPS 세포를 나타낸다.
도 55a-55c는 VG2i 배지에서 배양된 재프로그램된 인간 iPS 세포의 효소적 분리(enzymatic dissociation) 및 계대배양(subculture)을 설명한다. 도 55a는 ROCK 억제제 부재하에 트립신에 의한 효소적 분리에 앞서, VG2i 배지에서 배양된, 재프로그램된 인간 iPS 세포를 나타낸다. 도 55b는 계대배양 후 1일 동안 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포를 나타낸다. 도 55c는 계대배양 후 1일 동안 VG2i 배지에서 배양된 인간 iPS 세포를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
원핵 세포 안에서 세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 렛 진핵, 렛이 아닌(non-rat) 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스, 또는 헴스터 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 조성물 및 방법들이 제공된다. 엔도뉴클레아제와 복합하여, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 이용하여 관심 대상의 게놈 좌, 예를 들면, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 또는 마우스 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 조성물 및 방법들이 제공된다. 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전적 변형이 포함된, 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 렛 마우스, 설치류, 또는 렛이 아닌 설치류를 생산하는 조성물 및 방법들이 제공된다. 시험관에서 하나 또는 그 이상의 일련의 유전적 변형 후 전분화능을 유지할 수 있고, 그리고 생식계열을 통하여 후세대로 상기 표적화된 유전적 변형을 유전시킬 수 있는, 인간 및 비-인간 분화전능성(totipotent) 또는 다능성(pluripotent)의 단리된 줄기 세포, 특히 렛 배아 줄기 세포가 또한 제공된다.
용어(
Glossary)
용어 "배아 줄기 세포" 또는 "ES 세포"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 배아 안으로 도입될 때 발달되는 배아의 임의의 조직에 기여될 수 있는 배아-유도된 분화전능성 또는 다능성 세포를 포함한다. 용어 "다능성 세포"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 하나 이상의 분화된 세포 유형으로 발달될 수 있는 능력을 보유한 미분화 세포를 포함한다. 용어 "비-다능성 세포"는 다능성 세포가 아닌 세포를 포함한다.
용어 "상동성 핵산"은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 공지의 기준 서열과 동일 또는 실질적으로 유사한 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 용어 "상동성 핵산"은 공지의 기준 서열에 대하여 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 보유한 서열을 특징화하는데 이용된다.
용어 "이종상동성 핵산"은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 한 종에서 공지의 기준 서열에 대하여 기능적으로 등가인 다른 종의 핵산 서열을 포함한다.
용어 "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 진핵 세포 안에서 상동성 유전자 표적화를 실행하기 위하여 의도된 방법에 의해 전형적으로 이용되는 것보다 훨씬 큰 클론된 게놈 DNA 단편들로부터 유도된, 진핵 세포용 큰 표적화 벡터를 포함한다. LTVEC의 예로는 세균성 상동성 염색체 (BAC) 및 효모 인공 염색체 (YAC)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "대립유전자의 변형" (MOA)은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 게놈에서 유전자(들) 또는 염색체 좌(들) 의 하나의 대립유전자의 정확한 DNA 서열의 변형을 포함한다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, "대립유전자의 변형 (MOA)"은 단일 뉴클레오티드의 결손, 치환, 또는 삽입 또는 관심대상의 유전자(들) 또는 염색체 좌(들)에 이어지는 긴 킬로베이스의 결손 뿐만아니라 이들 양단 사이에 있는 임의의 그리고 모든 가능한 변형이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "재조합 부위"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 부위-특이적 재조합효소가 인지하고, 그리고 재조합 이벤트의 기질로 기능을 할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"일련의(Serial)" 유전적 변형은 세포 (가령, 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포)에 독립적으로 실행되는 2가지 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 상기 제 1 변형은 전기천공, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다. 그 다음 제 2 변형은 적합한 제 2 핵산 구조체를 이용하여 상기 동일한 세포 게놈에 만들어진다. 상기 제 2 변형은 제 2 전기천공, 또는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 구체예들에서, 동일한 세포의 제 1 및 제 2 유전적 변형 후, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 및 기타 등등의, 일련의(하나에 이어서 또다른) 유전적 변형은 가령, 일련의 전기천공 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여(연속적으로) 이루어질 수 있다.
용어 "부위-특이적 재조합효소"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "재조합 부위들" 사이에서 재조합을 실행시킬 수 있는 일군의 효소를 포함하는데, 여기에서 두개의 재조합 부위는 단일 핵산 분자 안에서 물리적으로 떨어져 있거나, 또는 별도의 핵산 분자 상에 있다. "부위-특이적 재조합효소"의 예로는 Cre, Flp, 및 Dre 재조합효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
핵산 서열과 관련하여, 용어 "생식계열"은 후손으로 전달될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "중쇄", 또는 "면역글로블린 중쇄"는 임의의 유기체로부터 면역글로블린 중쇄 불변 영역 서열이 포함된, 면역글로블린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 다른 언급이 없는 한, 3개의 중쇄 CDRs과 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편들은 CDRs, CDRs 및 FRs, 그리고 이의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 (N-말단으로부터 C-말단 방향으로)에 이어서, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은 에피토프 (가령, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인지하는)를 특이적으로 인지할 수 있고, 세포로부터 발현 및 분비될 수 있고, 그리고 최소한 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드되며, 생식계열에 존재하는 VH, DH, 및 JH 세그먼트 레퍼토리로부터 유도된 VH, DH, 및 JH 세그먼트를 일반적으로 포함한다. 다양한 유기체들에 대한 V, D, 및 J 중쇄 세그먼트에 대한 서열, 위치 및 명명은 IMGT 데이터베이스에서 찾아볼 수 있으며, 이는 URL "imgt.org."에서 인터넷 월드와이드웹(www)상에서 접근가능하다.
구절 "경쇄"는 임의의 유기체의 면역글로블린 경쇄 서열을 포함하며, 다른 언급이 없는 한, 인간 카파 (κ)와 람다 (λ) 경쇄 그리고 VpreB, 뿐만 아니라 대용(surrogate) 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 다른 언급이 없는 한, 전형적으로 3개의 경쇄 CDRs와 4개의 틀구조 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단으로부터 카르복시 말단방향으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인과 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드되며, 생식계열에 존재하는 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트 레퍼토리로부터 유도된 경쇄 VL 및 경쇄 JL 유전자 세그먼트를 일반적으로 포함한다. 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트에 대한 서열, 위치 및 명명은 IMGT 데이터베이스에서 찾아볼 수 있으며, 이는 URL "imgt.org."에서 인터넷 월드와이드웹(www)상에서 접속가능하다. 경쇄는 가령, 이들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에의해 선택적으로 결합된 제 1 또는 제 2 에피토프에 선택적으로 결합되지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 이들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합하고, 인지하는 중쇄에 결합하고, 인지하거나 또는 지원하는 것들을 또한 포함한다.
구절 "작동가능하도록 연계된(operably linked)"이란 의도된 방식으로 성분들이 기능을 하도록 연계된 상관관계를 포함한다. 한 예로써, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절이 유지되도록, 조절 서열 (가령, 프로모터, 인헨서, 침묵 서열, 등등)에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 한 예로써, 면역글로블린 가변 영역 (또는 V(D)J 세그먼트)의 핵산 서열은 서열 사이에서 면역글로블린 중쇄 서열 또는 경쇄 서열로의 적절한 재조합이 허용되도록 하기 위하여, 면역글로블린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다.
1. 핵산이 포함된 표적 좌
표적 좌에서 최소한 하나의 삽입(insert) 핵산의 통합을 허용하는 다양한 방법 및 조성물들이 제공된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "관심 대상의 게놈 좌"는 삽입 핵산을 통합시키기를 원하는 게놈 안에 DNA의 임의의 세그먼트 또는 영역을 포함한다. 용어 "관심 대상의 게놈 좌" 및 "표적 관심 대상의 게놈 좌"는 호환사용될 수 있다. 관심 대상의 게놈 좌는 상기 세포에 고유(native)한 것일 수 있거나, 또는 대안으로 상기 세포의 게놈 안에 통합된 DNA의 이종성 또는 외생성 세그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 DNA의 이종성 또는 외생성 세그먼트는 이식유전자, 발현 카세트, 선별 표식들이 인코등된 폴리뉴클레오티드, 또는 게놈 DNA의 이종성 또는 외생성 영역을 포함할 수 있다. 용어 "좌"는 본 명세서에서 상기 게놈 DNA 안에 DNA의 세그먼트로써 정의된다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 유전적 변형은 관심대상의 좌로부터 하나 또는 그 이상의 결손, 관심대상의 좌에 추가, 관심대상의 좌의 대체, 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 관심대상의 좌는 코딩 영역 또는 넌-코딩 조절 영역을 포함한다.
상기 관심 대상의 게놈 좌는 예를 들면, 인지 부위, 선별 표지, 이미 통합된 삽입 핵산, 뉴클레아제 물질들이 인코딩된 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 등등이 포함된 표적화된 통합 시스템의 임의의 성분을 더 포함할 수 있다. 대안으로, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 상기 세포 안에 염색체외 DNA, 이를 테면 효모 인공 염색체 (YAC), 세균성 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체, 또는 적절한 숙주 세포 안에 포함된 임의의 기타 조작된 게놈 영역에 위치될 수 있다. 다양한 구체예들에서, 상기 표적화된 좌는 원핵, 진핵, 렛이 아닌 진핵, 효모, 세균, 비-인간 포유류, 비-인간 세포, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 인간, 렛 마우스, 헴스터, 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류 (가령, 마모셋, 붉은털원숭이), 길들여진 포유류 또는 농사용 포유류 또는 임의의 관심대상의 다른 유기체 또는 이의 조합으로부터 고유의, 이종성 또는 외생성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인간, 마우스, 또는 이의 조합의 핵산 서열을 포함한다.
특정 구체예들에서, 상기 표적 좌는 예를 들면, 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 CHO 세포에 있다.
특정 구체예들에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 "렛 핵산"의 표적 좌를 포함한다. 이러한 영역은 세포의 게놈 안에 통합된 렛의 핵산을 포함한다. 상기 표적 좌의 비-제한적 예로는 B 세포에서 발현된 단백질을 인코드하는 게놈 좌, 미성숙 B 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 게놈 좌, 성숙한 B 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 게놈 좌, 면역글로블린 (Ig) 좌들, 또는 예를 들면, T 세포 수용체 알파 좌가 포함된 T 세포 수용체 좌들을 포함한다. 표적 게놈 좌의 추가 예로는 Fcer1a 좌, Tlr4 좌, Prlr 좌, Notch4 좌, Accn2 좌, Adamts5 좌, Trpa1 좌, Folh1 좌, Lrp5 좌, 예를 들면, IL2 수용체 감마 (Il2rg) 좌가 포함된 IL2 수용체 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, Rag1/Rag2 좌, 그리고 Erbb4 좌를 포함한다. 임의의 이러한 표적 좌는 렛에 있거나 또는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 또는 비-인간 포유류 세포에 있을 수 있다.
한 구체예에서, 상기 표적 좌는 포유류 면역글로블린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 표적 좌는 렛 면역글로블린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 표적 좌는 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열안된 렛 마우스, 또는 인간 면역글로블린 중쇄 가변 영역 핵산 서열이 포함된 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이의 조합으로부터 선택된 렛 마우스, 또는 인간 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1-힌지-CH2-CH3을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 표적 좌는 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 렛 마우스, 또는 인간 면역글로블린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이의 조합으로부터 선택된 렛 마우스, 또는 인간 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1-힌지-CH2-CH3을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 표적 좌는 포유류 면역글로블린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 인코드된 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 DNA 서열은 재배열안된 포유류 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 DNA 서열은 재배열된 포유류 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 재배열안된 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열에서 선택된 포유류 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 한 구체예에서, 상기 포유류 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 렛 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 마우스 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 인간 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 (Il2rg) 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌는 상기 게놈 (가령, 포유류 게놈, 인간 게놈 또는 비-인간 포유류 게놈)의 해당 영역을 포함하는데, 여기에 이들 유전자 또는 유전자 조합이 위치된다. ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 (Il2rg) 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌 (가령, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 복합된 Rag2/Rag1 좌)중 임의의 하나의 변형은 주어진 좌에 임의의 원하는 변경을 포함할 수 있다. 주어진 좌에 변형(가령, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 좌)의 비-제한적인 예는 본 명세서에서 추가 논의된다.
예를 들면, 특정 구쳉예들에서, 하나 또는 그 이상의 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 (Il2rg) 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌 (가령, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 인터루킨-2 수용체 감마 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag2 좌, 및/또는 Rag2/Rag1 좌)는 인코드된 ApoE 단백질 또는 인터루킨-2 수용체 감마 단백질 또는 Rag1 단백질 또는 Rag2 단백질 또는 Rag1과 Rag2 단백질의 조합의 활성 및/또는 수준이 감소되도록 변형된다. 다른 구체예들에서, ApoE 단백질, 인터루킨-2 수용체 감마 단백질, Rag1 단백질, 또는 Rag2 단백질, 또는 Rag1과 Rag2 단백질의 조합의 활성은 없다.
"감소된"이란 관심대상의 좌에서 인코드된 유전자/단백질의 수준 또는 활성의 임의의 감소를 의미한다. 예를 들면,활성의 감소는 (1) 주어진 단백질 (가령, ApoE, 인터루킨-2 수용체 감마, Rag2, Rag2 또는 Rag1과 Rag2의 조합)의 전체 수준 또는 활성의 통계학적으로 유의적인 감소를 포함하는데, 예를 들면, 적절한 대조와 비교하였을 때, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% 또는 그 이상으로 감소된 수준 또는 활성을 포함할 수 있다. ApoE, 인터루킨-2 수용체 감마, Rag1과 Rag2중 임의의 것의 농도 및/또는 활성의 감소에 대한 분석 방법은 당분야에 공지되어 있다.
다른 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 상기 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 인터루킨-2 수용체 감마 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag2 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag1 좌 및/또는 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag2/Rag1 좌는 인코드된 ApoE 폴리펩티드, 인터루킨-2 수용체 감마 폴리펩티드, Rag2 폴리펩티드, Rag1 폴리펩티드, 또는 Rag1과 Rag2 폴리펩티드 둘 모두의 활성 및/또는 수준이 감소되는 변형을 포함한다. "증가된"이란 관심대상의 좌에서 인코드된 유전자/폴리펩티드의 수준 또는 활성의 임의의 증가를 의미한다. 예를 들면,활성의 증가는 (1) 주어진 단백질 (가령, ApoE, 인터루킨-2 수용체 감마, Rag1, Rag2 또는 Rag1와 Rag2)의 전체 수준 또는 활성의 통계학적으로 유의적인 감소를 포함하는데, 예를 들면, 적절한 대조와 비교하였을 때, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% 또는 그 이상으로 증가된 수준 또는 활성을 포함할 수 있다. ApoE, Rag1, Rag2 및 인터루킨-2 수용체 감마 단백질중 임의의 것의 농도 및/또는 활성의 감소에 대한 분석 방법은 당분야에 공지되어 있다.
포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 인터루킨-2 수용체 감마 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag2 좌, 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag1 좌 및/또는 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 Rag2/Rag1 좌에 대한 유전적 변형은 상기 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손, 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산의 삽입, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 결손 및/또는 삽입은 본 명세서의 도처에서 논의된 바와 같이, 주어진 좌 안에 임의의 장소에서 일어날 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 추가 구체예들은 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 (Il2rg) 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부분을 또다른 유기체의 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 대응하는 상동성 또는 이종상동성 부분으로 대체를 통하여 상기 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다.
여전히 다른 구체예들에서, 상기 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌, 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 하나 또는 그 이상의 변형은 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 (Il2rg) 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부를 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부분에 대하여 이의 전체 길이를 통하여 대체되는 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 공유하는 삽입 폴리뉴클레오티드로 대체를 통하여 실행된다.
주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 결손되는 좌의 대응하는 영역은 코딩 영역, 인트론, 엑손, 비해독 영역, 조절 영역, 프로모터, 또는 인헨서 또는 이의 임의의 조합 또는 이의 임의의 부분일 수 있다. 더욱이, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 예를 들면, 좌의 결손되는 영역은 임의의 원하는 길이가 될 수 있는데 예를 들면, 10-100 뉴클레오티드 길이, 100-500 뉴클레오티드 길이, 500-1 kb 뉴클레오티드 길이, 1 Kb 내지 1.5 kb 뉴클레오티드 길이, 1.5 kb 내지 2 kb 뉴클레오티드 길이, 2 kb 내지 2.5 kb 뉴클레오티드 길이, 2.5 kb 내지 3 kb 뉴클레오티드 길이, 3 kb 내지 5 kb 뉴클레오티드 길이, 5 kb 내지 8 kb 뉴클레오티드 길이, 8 kb 내지 10 kb 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상을 포함한다. 다른 경우들에 있어서, 삽입 또는 대체 크기는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 1 Mb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 2.8 Mb, 약 2.8 Mb 내지 약 3 Mb이다. 다른 구체예들에서, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 좌의 결손되는 영역은 최소한 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개 뉴클레오티드 또는 최소한 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb 또는 그 이상이다. 다른 구체예들에서, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 좌의 결손되는 영역은 최소한 10 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 최소한 200 kb, 최소한 250 kb, 또는 최소한 300 kb 또는 그 이상이다.
주어진 삽입 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 렛 마우스, 헴스터, 포유류, 비-인간 포유류, 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 인간, 농사용 동물 또는 길들여진 동물이 포함된 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 임의의 관심대상의 좌의 표적화된 변형, 예를 들면, ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 (Il2rg) 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌에서 표적화된 변형을 생성시키는 다양한 방법들이 제공된다. 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 유전적으로 변형된 비-인간 포유류, 유전적으로 변형된 렛이 아닌 진핵생물, 유전적으로 변형된 비-다능성 세포, 또는 유전적으로 변형된 다능성 세포 (가령, 다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 또는 인간 iPS 세포)가 더 제공되는데, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag2 좌, Rag1 좌, 및/또는 Rag2/Rag1 좌에서 결손, 삽입, 대체 및/또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 유전적 변형 (상기 표적 좌의 활성 부재, 감소, 증가 또는 조절을 야기하는 것들을 포함)은 생식계열을 통하여 전달될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 유전적 변형으로 원하는 표적 좌의 녹아웃을 야기한다. 이러한 비-인간 동물은 본 명세서 도처에서 논의되는 바와 같이, 예를 들면, 다양한 실험 시스템에 이용된다.
예를 들면, ApoE (아포리포단백질 E) 녹아웃은 플락 형성, 전사 변화 (전체 전사체 쇼트건 서열화 (RNA-Seq), 및 생체외 기능을 포함하나, 이에 국한되지 않은 내피 기능을 연구하는 동물 모델을 제공한다. ApoE는 중요한 운반 분자이며, 혈류를 통하여 지질, 이를 테면 콜레스테롤을 운반할 수 있다. ApoE는 예를 들면, 뇌로부터 β-아밀로이드를 청소하기 위하여 신경계에서 또한 기능을 할 수 있다. ApoE에서 변형은 예를 들면, 죽상경화증, 고지질혈증, 및 알츠하이머 질환이 포함된 다양한 상태와 연관되어 있다. ApoE 녹아웃 동물은 혈액으로부터 지단백질의 손상된 클리어링(clearing)을 나타내고, 죽상경화증이 발생된다. 따라서, ApoE 녹아웃 동물은 이를 테면, 예를 들면, 내종피 기능, 플락 형성, 전사 변화 (RNA-Seq), 고지질혈증, 죽상경화증 및 알츠하이머 질환 상태를 연구하고 및/또는 진행을 위한 모델을 제공한다. ApoE 활성을 측정하는 분석은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, ApoE 활성의 감소는 면역분석, 이를 테면 ELISA 또는 면역블랏팅 기술에 의해 대상으로부터 획득한 혈액 시료 안에 ApoE 수준의 감소를 분석함으로써 측정될 수 있다. 더욱이, 렛의 큰 체구는 이들 모든 분석을 용이하게 하고, 데이터의 질을 개선시킨다.
RAG1 (재조합-활성화 유전자 1) 및 RAG2 (재조합-활성화 유전자 2)는 VDJ 재조합 활성을 갖는 다중-소단위 복합체의 일부분이며, 림프구에서 면역글로블린과 T-세포 수용체 유전자의 재배열 및 재조합에 중요한 역할을 하는 효소들이다. RAG1 및 RAG2는 T 세포 수용체와 B 세포 수용체 (가령, 면역글로블린) 유전자의 세그먼트의 재조합 및 연결을 촉진시키기 위하여 이중 가닥으로 된 DNA 절단을 유도한다. RAG1 및/또는 RAG2의 녹아웃은 동물에서 B 세포와 T 세포가 상실되며, 이는 심각한 면역결핍을 초래한다. RAG1 및/또는 RAG2 녹아웃 동물은 예를 들면, 이종이식편 (가령, 렛에서 인간 세포 이종이식편), 암, 백신 개발, 자가면역 질환, 감염성 질환 및 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 연구에 용도를 찾는다. RAG1 및/또는 RAG2 활성을 측정하기 위한 다양한 분석이 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 대상에서 재조합 효과를 측정 또는 B 세포 및/또는 T 세포의 존재 또는 부재의 분석하는 것을 포함한다.
IL-2 수용체 (IL-2R)는 특정 면역 세포의 표면 상에 발현되며, 사이토킨 인터루킨-2 (IL-2)에 결합한다. IL-2R는 알파 쇄 (IL-2Ra, CD25), 베타 쇄 (IL-2Rb, CD122) 및 감마 쇄 (IL2-Rg, CD132)를 포함하는, 최소한 3개의 별도의 하부단위(subunit) 쇄들을 포함하는 내장된(integral) 막 단백질이다. IL-2 수용체 감마 (IL2r-γ 또는 IL2Rg라고도 불림) 쇄는 예를 들면, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21에 대한 수용체들이 포함된 다양한 사이토킨 수용체에 의해 공유되는 공통적인 감마 쇄다. IL-2Rg는 상기 세포의 세포외 표면 상에 있는 엑토도메인을 포함하는데, 리간드, 막통과 도메인, 및 세포내 도메인의 결합에 기여하며, 다양한 분자들과 상호작용하여 세포내 신호 전달 경로를 유도할 수 있다. Il2rg 유전자는 포유류의 X-염색체 상에서 발견되며, 인간의 감마 쇄 유전자에서 특정 돌연변이는 심각한 T-세포 결함에 의해 특징화되는 인간 X-연계된 심각한 복합된 면역결핍 (XSCID)을 야기할 수 있다. 추가적으로, 감마 쇄 엑토-도메인은 막통과 수용체로부터 탈락될 수 있으며, 가용성 감마 쇄 수용체로 방출될 수 있다. 상기 가용성 감마 쇄 수용체는 대상의 혈액에서 탐지될 수 있으며, 사이토킨 신호생성을 조절하는 기능을 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 비-인간 IL-2Rg 쇄는 상기 인간 IL2-Rg 쇄로 대체되어, 유전적으로 변형된 동물은 완전한 인간 IL-2Rg 쇄를 발현시킨다. 다른 경우들에 있어서, 비-인간 IL-2Rg 쇄의 오직 엑토도메인만을 상기 인간 IL-2Rg 쇄의 엑토도메인으로 대체시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 경우, 비-인간에서 발현된 생성된 인간화된 IL-2Rg 쇄는 인간 엑토도메인을 포함하며, 이 분자의 나머지는 고유 고유체로부터 기인된 것이다.
IL-2Rg의 전장(full-length)의 인간화는 이러한 변형된 좌를 가진 비-인간 포유류가 인간 IL-2Rg를 생산하기 때문에 유용하다. 이는 인간 IL-2Rg에 특이적인 항체를 가진 비-인간 포유류에서 인간 IL-2Rg를 탐지할 수 있도록 할 것이다. 상기 엑토-인간화(가령, 비-인간 포유류의 IL-2Rg 엑토-도메인이 인간 IL-2Rg엑토-도메인으로 대체됨)는 IL2-Rg에 대한 인간 리간드에 결합하는 IL-2Rg 폴리펩티드를 만들 것이며, 그러나, 세포질 도메인은 여전히 비-인간 포유류의 것이기 때문에, IL-2Rg의 엑토-인간화된 형태는 비-인간 포유류 신호생성 기전과 또한 상호작용하게 될 것이다.
2. 표적 좌의 변형
A. 표적화 벡터 및 삽입 핵산
i. 삽입 핵산
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 상기 "삽입 핵산"은 상기 표적 좌에 통합시키고자 하는 DNA 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 관심대상의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 주어진 발현 카세트는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 선별 표지 및/또는 리포터 유전자가 인코딩된 폴리뉴클레오티드 그리고 발현을 유도하는 다양한 조절 성분들을 포함할 수 있다. 상기 삽입 핵산 안에 포함될 수 있는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 선별 표지들, 그리고 리포터 유전자들의 비-제한적인 예들은 본원 명세서의 도처에서 논의된다.
특정 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 렛으로부터 게놈 DNA의 세그먼트, cDNA, 조절 영역, 또는 임의의 부분 또는 이의 조합을 포함할 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 포유류, 인간, 비-인간 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 인간, 렛 마우스, 헴스터, 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류 (가령, 마모셋, 붉은털원숭이), 길들여진 포유류, 또는 농사용 포유류 또는 관심대상의 임의의 다른 유기체로부터 핵산을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 추가 상세하게 보여주는 바와 같이, 다양한 방법 및 조성물에서 이용되는 삽입 핵산으로 상기 관심대상의 표적 좌의 "인간화(humanization)"를 초래할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 내생성 유전자의 최소한 하나의 엑손의 녹인(knock-in) 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 전체 내생성 유전자의 녹-인 대립유전자(가령, "유전자-스왑(swap) 녹-인")를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 예를 들면, 프로모터, 인헨서, 또는 전사 억제물질-결합 요소가 포함된, 조절 요소를 포함한다.
추가 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 조건부 대립인자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조건부 대립인자는 US 2011/0104799에서 설명된 바와 같이(이는 전문이 참고자료에 편입됨), 다중기능적 대립유전자이다. 특정 구체예들에서, 상기 조건부 대립인자는 다음을 포함한다: (a) 표적 유전자의 전사에 대하여 센스 방향으로(sense orientation) 방향으로 작동(actuating) 서열, 및 센스 또는 안티센스 방향으로 약물 선별 카세트; (b) 안티센스 방향(antisense orientation)의 관심대상의 뉴클레오티드 서열 (NSI) 및 조건적 역전 모듈 (COIN, 이는 엑손-분열성 인트론 및 역전 유전자트랩-유사 모듈을 이용한다; 예를 들면, US 2011/0104799 참고, 이는 전문이 참고자료에 편입됨); 그리고 (c) 조건부 대립인자를 형성하기 위하여 제 1 재조합효소에 노출시 재결합되고, (i) 작동 서열 및 DSC가 결여되고, 그리고 (ii) 센스 방향의 NSI 및 안티센스 방향의 COIN를 포함하는 재결합 단위.
상기 삽입 핵산은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 예를 들면, 약 1 kb 내지 약 200 kb, 약 2 kb 내지 약 20 kb, 또는 약 0.5 kb 내지 약 3 Mb 범위의 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 비-인간 포유류 세포 게놈 DNA 서열의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 DNA 서열의 결손 정도는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암의 총 길이보다 더 크다. 한 구체예에서, 상기 게놈 DNA 서열의 결손 크기는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb, 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 2.8 Mb, 약 2.8 Mb 내지 약 3 Mb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb 범위가 된다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간 또는 비-인간 포유류 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 삽입 또는 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 내생성 좌에서 DNA 서열이 대응하는 DNA 서열이 포함된 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 삽입 또는 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 핵산 서열의 추가다. 한 구체예에서, 상기 추가된 뉴클레오티드 서열은 5 kb 내지 200 kb 범위다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 코딩 서열 안에 유전적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 코딩 서열의 결손 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 2개의 내생성 코딩 서열의 융합을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간 또는 비-인간 포유류 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 삽입 또는 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 내생성 렛 좌에서 렛 DNA 서열이 대응하는 렛 DNA 서열이 포함된 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 삽입 또는 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 비-단백질-코딩 서열의 결손을 포함하지만, 그러나 단백질-코딩 서열의 결손은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 서열의 결손은 조절 요소의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터 또는 조절 요소의 추가를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터 또는 조절 요소의 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 표적화 벡터의 핵산 서열은 상기 게놈 안에 통합될 때 포유류, 인간, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌의 영역의 유전적 변형을 만들게 되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이때 ApoE 좌에서 상기 유전적 변형으로 인하여 ApoE 활성의 감소, ApoE 활성의 증가, 또는 ApoE 활성의 조절이 야기된다. 한 구체예에서, ApoE 녹아웃 ("무효(null) 대립유전자)이 생성된다.
한 구체예에서, 상기 표적화 벡터의 핵산 서열은 상기 게놈 안에 통합될 때포유류, 인간 세포, 또는 비-인간 포유류 인터루킨-2 수용체 좌의 영역의 유전적 변형을 만들게 되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이때 인터루킨-2 수용체 좌에서 유전적 변형은 인터루킨-2 수용체 활성을 감소시킨다. 한 구체예에서, 인터루킨-2 수용체 녹아웃 ("무효 대립유전자")이 생성된다.
추가 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 상기 포유류, 인간 세포, 또는 비-인간 포유류 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌 및/또는 Rag2 좌, 및/또는 Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부를 또다른 유기체의 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 대응하는 상동성 또는 이종상동성 부분으로 대체시킨다.
여전히 다른 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 대체되는 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부분에 대하여 이의 전체 길이를 통하여 대체되는 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 공유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
주어진 삽입 폴리뉴클레오티드와 대체되는 상기 포유류, 인간 세포, 또는 비-인간 포유류 좌의 대응하는 영역은 코딩 영역, 인트론, 엑손, 비해독 영역, 조절 영역, 프로모터, 또는 인헨서 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 더욱이, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 결손되는 상기 포유류, 인간 세포, 또는 비-인간 포유류 좌의 영역은 임의의 원하는 길이, 예를 들면, 10-100개 뉴클레오티드 길이, 100-500개 뉴클레오티드 길이, 500-1 kb 뉴클레오티드 길이, 1 Kb to 1.5 kb 뉴클레오티드 길이, 1.5 kb 내지 2 kb 뉴클레오티드 길이, 2 kb 내지 2.5 kb 뉴클레오티드 길이, 2.5 kb 내지 3 kb 뉴클레오티드 길이, 3 kb 내지 5 kb 뉴클레오티드 길이, 5 kb 내지 8 kb 뉴클레오티드 길이, 8 kb 내지 10 kb 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상이 포함된, 길이일 수 있다. 다른 경우들에 있어서, 상기 삽입 또는 대체 크기는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb, 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 2.8 Mb, 약 2.8 Mb 내지 약 3 Mb이다. 다른 구체예들에서, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 결손되는 상기 포유류, 인간 세포, 또는 비-인간 포유류 좌의 영역은 최소한 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 뉴클레오티드 또는 최소한 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb 또는 그 이상이다.
한 구체예에서, 상기 프로모터는 구성적으로 활성 프로모터다.
한 구체예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 유도성 프로모터는 화학적으로-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 화학적으로-조절된 프로모터는 알코올-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 알코올-조절된 프로모터는 알코올 탈수소효소 (alcA) 유전자 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 화학적으로-조절된 프로모터는 테트라사이클린-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 테트라사이클린-조절된 프로모터는 테트라사이클린-반응성 프로모터다. 한 구체예에서, 테트라사이클린-조절된 프로모터는 테트라사이클린 작동유전자 서열 (tetO)이다. 한 구체예에서, 테트라사이클린-조절된 프로모터는 tet-On 프로모터다. 한 구체예에서, 테트라사이클린-조절된 프로모터 tet-Off 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 화학적으로-조절된 프로모터는 스테로이드 조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 스테로이드 조절된 프로모터는 렛의 글루코코르티코이드 수용체의 프로모터다. 한 구체예에서, 스테로이드 조절된 프로모터는 에스트로겐 수용체의 프로모터다. 한 구체예에서, 스테로이드-조절된 프로모터는 엑디손(ecdysone) 수용체의 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 화학적으로-조절된 프로모터는 금속-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 금속-조절된 프로모터는 메탈로단백질 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 유도성 프로모터는 물리적으로-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 물리적으로-조절된 프로모터는 온도-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 온도-조절된 프로모터는 열쇼크 프로모터다. 한 구체예에서, 물리적으로-조절된 프로모터는 빛-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 빛-조절된 프로모터는 빛-유도성 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 빛-조절된 프로모터는 빛-억제성 프로모터다.
한 구체예에서, 상기 프로모터는 조직-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 신경교-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 근육 세포-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 심장 세포-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 신장 세포-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 골 세포-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 내피 세포-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 면역 세포-특이적 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 면역 세포 프로모터는 B 세포 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 면역 세포 프로모터는 T 세포 프로모터다.
한 구체예에서, 상기 프로모터는 발생학적으로-조절된 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 발생학적으로-조절된 프로모터는 배아 발생 단계 동안에만 활성이 있다. 한 구체예에서, 상기 발생학적으로-조절된 프로모터는 성인 세포에서만 활성이 있다.
특정 구체예들에서, 상기 프로모터는 상기 세포 유형에 근거하여 선택될 수 있다. 따라서, 상기 다양한 프로모터는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포 또는 CHO 세포에서 용도를 가진다.
일부 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 부위-특이적 재조합 표적 서열의 측면에 있는 핵산을 포함한다. 전체 삽입 핵산은 이러한 부위-특이적 재조합 표적 서열의 측면에 있을 수 있지만, 상기 삽입 핵산 안에 임의의 영역 또는 개별 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 이러한 부위들의 측면에 또한 있을 수 있음이 인지된다. 상기 부위-특이적 재조합효소는 재조합효소 폴리펩티드를 상기 세포 안으로 도입시키거나 또는 부위-특이적 재조합효소가 인코드된 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입시키는 것이 포함된, 임의의 수단에 의해 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 상기 부위-특이적 재조합효소가 인코드된 폴리뉴클레오티드는 상기 삽입 핵산 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 안에 위치될 수 있다. 상기 부위-특이적 재조합효소는 상기 세포 안에 활성인 프로모터, 예를 들면, 유도성 프로모터, 상기 세포에 대해 내생성인 프로모터, 상기 세포에 대해 이종성인 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 발생 단계-특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 상기 삽입 핵산의 측면에 있을 수 있거나 또는 상기 삽입 핵산 안에 임의의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 측면에 있을 수 있는 부위-특이적 재조합 표적 서열은 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 상기 부위-특이적 재조합 부위들은 상기 삽입 핵산 안에 포함된 선별 표지 및/또는 리포터 유전자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 측면에 있다. 이러한 경우, 상기 표적화된 좌에 상기 삽입 핵산을 통합시킨 후, 상기 부위-특이적 재조합 부위들 사이의 서열은 제거될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 선별 표지가 인코드된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 선별 표지는 선별 카세트 안에 포함될 수 있다. 이러한 선별 표지들은 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (neor), 히그로마이신 B 포스포트란스퍼라제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트란스퍼라제 (puror), 블라시티딘 S 데아미나제 (bsrr), 산틴/구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제 (gpt), 또는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-k), 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한 구체예에서, 상기 선별 표지가 인코드된 폴리뉴클레오티드는 상기 세포, 렛 세포, 다능성 렛 세포, ES 렛 세포, 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 CHO 세포 안에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 표적화된 좌 안으로 연속적으로 갈이할 때(tilling), 상기 선별 표지는 상기에서 나타낸 바와 같이, 뉴클레아제 물질에 대한 인지 부위를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 선별 표지가 인코드된 폴리뉴클레오티드는 부위-특이적 재조합 표적 서열의 측면에 있다.
상기 삽입 핵산은 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포터 유전자를 더 포함할 수 있는데, 이때 상기 리포터 유전자는 LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 강화된 황색 형광 단백질 (eYFP), Emerald, 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), CyPet, 시안 형광 단백질 (CFP), Cerulean, T-Sapphire, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 및/또는 이의 조합로 구성된 또는 포함하는 집단에서 선택된 리포터 단백질을 인코드한다. 이러한 리포터 유전자는 상기 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 이러한 프로모터들은 유도성 프로모터, 리포터 유전자 또는 상기 세포에 대해 내생성인 프로모터, 리포터 유전자 또는 상기 세포에 이종성인 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 발생 단계-특이적 프로모터일 수 있다.
한 구체예에서, 핵산 삽입은 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨계, 생식계, 또는 이의 조합에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함하는 포유류 핵산을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 골수 또는 골수-유도된 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 비장 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨계, 생식계, 또는 이의 조합에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 골수 또는 골수-유도된 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 비장 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 마우스 게놈 DNA 서열, 렛 게놈 DNA 서열, 진핵 게놈 DNA 서열, 렛이 아닌 진핵 게놈 DNA 서열, 포유류 게놈 DNA 서열, 인간 게놈 DNA 서열, 또는 비-인간 DNA 서열 포유류, 또는 이의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 렛과 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 마우스 및 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 마우스 및 렛 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 렛 마우스, 및 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 마우스 게놈 DNA 서열, 렛 게놈 DNA 서열, 헴스터 게놈 DNA 서열, 인간 게놈 DNA 서열, 진핵 게놈 DNA 서열, 렛이 아닌 진핵 게놈 DNA 서열, 포유류 게놈 DNA 서열, 또는 비-인간 DNA 서열 포유류, 또는 이의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 렛과 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 마우스 및 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 마우스 및 렛 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 렛 마우스, 및 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 인간 유전자의 최소한 하나의 인간 질환 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 신경학적 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 심혈관 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 신장 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 근육 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 혈액 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 암이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 면역계 질환이다.
한 구체예에서, 상기 인간 질환 대립유전자는 우성 대립유전자다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환 대립유전자는 열성 대립유전자다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP) 대립유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 변경된 결합 특징, 변경된 국소화, 변경된 발현, 및/또는 변경된 발현 패턴을 가진 단백질의 돌연변이 형태를 만든다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 선별 카세트를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 선별 카세트는 선별 표지가 인코드된 핵산 서열을 포함하고, 이때 상기 핵산 서열은 렛 ES 세포 안에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 한 구체예에서, 상기 선별표지는 히그로마이신 저항성 유전자 또는 네오마이신 저항성 유전자로부터 선택되거나, 또는 이를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 핵산은 B 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 미성숙 B 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 성숙한 B 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 조절 요소를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조절 요소는 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 조절 요소는 인헨서다. 한 구체예에서, 상기 조절 요소는 전사 억제물질-결합 요소다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 비-단백질-코딩 서열의 결손을 포함하지만, 그러나 단백질-코딩 서열의 결손은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 서열의 결손은 조절 요소의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 조절 요소의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터 또는 조절 요소의 추가를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터 또는 조절 요소의 대체를 포함한다.
ii.
발현 카세트
본 명세서에서 제공되는 표적화된 게놈 통합 시스템에 이용되는 다양한 성분들이 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자들이 제공된다 (가령, 뉴클레아제 물질들, 인지 부위들, 삽입 핵산, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 표적화 벡터, 선별 표지들, 및 기타 성분중 임의의 하나 또는 임의의 조합).
용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열", "핵산 서열", 및 "핵산 단편"은 본 명세서에서 호환사용된다. 이들 용어는 뉴클레오티드 서열 및 이와 유사한 것을 포괄한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-또는 이중-가닥으로 된, RNA 또는 DNA의 중합체일 수 있으며, 이들은 임의선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. DNA 중합체 형태의 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA의 하나 또는 그 이상의 세그먼트, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이들은 모두 자연적으로 생성되는 분자 및 합성 유사체, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥으로 된 형태, 이중-가닥으로 된 형태, 헤어핀, 스템-및-루프-구조, 그리고 이와 유사한 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는 모든 형태의 서열을 또한 포괄한다.
상기 표적화된 게놈 통합 시스템의 다양한 성분들이 포함된 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 제공한다. 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 명세서에서 호환이용된다. 재조합 구조체는 핵산 서열의 인공 또는 이종성 조합, 가령, 자연에서 함께 볼 수 없는 조절서열과 코딩 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 재조합 구조체는 상이한 원천으로부터 유도된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 원천으로부터 유도되었는지만, 자연상태에서 발현되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구조체는 자체로 이용되거나, 벡터와 병용하여 이용될 수 있다. 벡터가 이용되는 경우, 벡터의 선택은 숙주 세포를 형질변환시키는데 이용되는, 당분야에 공지된 방법에 따라 달라진다. 예를 들면, 플라스미드 벡터가 이용될 수 있다. 단리된 핵산 단편들중 임의의 것이 포함된 숙주 세포를 성공적으로 형질변환시키고, 선별하고, 그리고 증식시키는데 요구되는 유전적 요소들이 또한 제공된다. 면역탁본법, 그중에서도 DNA의 Southern 분석, mRNA의 Northern 분석, 단백질 발현의 면역블랏팅(immunoblotting) 분석, 또는 표현형 분석에 의해 스크리닝이 실행될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 상기 표적화된 게놈 통합 시스템의 하나 또는 그 이상의 성분들은 원핵 세포, 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 세균성, 효모 세포, 또는 포유류 세포 또는 관심대상의 다른 유기체 또는 세포 유형 안에서 발현을 위한 발현 카세트 안에 제공될 수 있다. 상기 카세트는 본 명세서에서 제공된 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연계된 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 수 있다. "작동가능하도록 연계된"이란 의도된 방식으로 성분들이 기능을 하도록 연계된 상관관계를 포함한다. 예를 들면, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드와 조절 서열 (가령, 프로모터) 사이에 작동가능한 연계는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 기능적 연계다. 작동가능하도록 연계된 요소들은 연속성 또는 비-연속성일 수 있다. 2개의 단백질 코딩 영역의 연결을 언급할 때 이용되면, 작동가능하도록 연계된이란 동일한 리딩 프레임안에 코딩 영역이 있다는 것을 의미한다. 또다른 경우에서, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절이 유지되도록, 조절 서열 (가령, 프로모터, 인헨서, 침묵 서열, 등등)에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 한 예로써, 면역글로블린 가변 영역 (또는 V(D)J 세그먼트)의 핵산 서열은 서열 사이에서 면역글로블린 중쇄 서열 또는 경쇄 서열로의 적절한 재조합이 허용되도록 하기 위하여, 면역글로블린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다.
상기 카세트는 유기체 안으로 공동-도입될 수 있는 최소한 하나의 추가적인 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 대안으로, 상기 추가적인 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 다중 발현 카세트 상에 제공될 수 있다. 이러한 발현 카세트는 상기 조절 영역의 전사 조절하에 재조합 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 제한 부위들 및/또는 재조합 부위들이 다수 포함된다. 상기 발현 카세트는 추가적으로 선별 표지 유전자를 포함할 수 있다.
상기 발현 카세트는 포유류 세포 또는 관심 대상의 숙주 세포 안에서 기능을 하는 전사의 5'-3' 방향에서, 전사 및 해독 개시 영역 (가령, 프로모터), 본 명세서에서 제공되는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그리고 전사 및 해독 종료 영역 (가령, 종료 영역)을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역 (가령, 프로모터, 전사 조절 영역, 및 해독 종료 영역) 및/또는 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대하여 또는 서로에 대하여 고유한 것이거나/유사한 것일 수 있다. 대안으로, 상기 조절 영역 및/또는 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대하여 또는 서로에 대하여 이종성일 수 있다. 예를 들면, 이종성 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연계된 프로모터는 상기 폴리뉴클레오티드가 유도된 종과는 상이한 종으로부터 기인되거나, 또는 동일한/유사한 종으로부터 기인된 경우, 하나 또는 둘 모두 이들의 고유 형태 및/또는 게놈 좌로부터 실질적으로 변형되거나, 또는 상기 프로모터는 상기 작동가능하도록 연계된 폴리뉴클레오티드에 대한 고유 프로모터는 아니다. 대안으로, 상기 조절 영역 및/또는 재조합 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 전체적으로 합성일 수 있다.
종료 영역은 전사 개시 영역과 함께 고유한 것일 수 있고, 상기 작동가능하도록 연계된 재조합 폴리뉴클레오티드와 함께 고유한 것일 수 있고, 상기 숙주 세포와 함께 고유한 것일 수 있고, 또는 상기 프로모터, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드, 상기 숙주 세포, 또는 이의 임의의 조합에 대하여 또다른 원천(가령, 외래성, 또는 이종성)으로부터 유도될 수 있다.
상기 발현 카세트를 준비함에 있어서, 적절한 방향의 DNA 서열을 제공하기 위하여, 다양한 DNA 단편들이 조작될 수 있다. 이를 위하여, 어뎁터(adapters) 또는 링커가 상기 DNA 단편들을 연결시키는데 이용될 수 있거나, 또는 편리한 제한 부위들을 제공, 잉여 DNA의 제거, 제한 부위들, 또는 이와 유사한 것들을 위하여 다른 조작이 관련될 수 있다. 이를 위하여, 시험관 돌연변이생성, 프라이머 복구, 제한, 어닐링, 재치환, 가령, 천이(transitions) 및 전위(transversions)가 관련될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 발현 카세트 안에 다수의 프로모터가 이용될 수 있다. 상기 프로모터는 원하는 결과에 근거하여 선택될 수 있다. 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 발현 시기, 위치 및/또는 수준을 조절하기 위하여 발현 카세트 안에 상이한 프로모터의 사용으로 상이한 적용이 강화될 수 있음이 인지된다. 이러한 발현 구조체들은 필요한 경우, 프로모터 조절 영역 (가령, 유도성, 구성적, 환경적으로-또는 발생학적으로-조절된, 또는 세포-또는 조직-특이적/선택성 발현을 부여하는 것), 전사 개시 시작 부위, 리보솜 결합 부위, RNA 프로세싱 신호, 전사 종료 부위, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 카세트는 형질변환된 세포의 선별을 위한 선별 표지 유전자를 또한 포함할 수 있다. 선별가능한 표지 유전자는 형질변환된 세포 또는 조직의 선별에 이용된다.
적절한 경우, 상기 방법 및 조성물에 이용되는 서열 (가령, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 뉴클레아제 물질, 등등)은 상기 세포 안에서 발현의 증가를 위하여 최적화될 수 있다. 즉, 상기 유전자는 개선된 발현을 위하여 관심대상의 주어진 세포에서 선호되는 코돈, 예를 들면, 포유류-선호되는 코돈, 인간-선호되는 코돈, 설치류-선호되는 코돈, 렛이 아닌-설치류-선호되는 코돈, 마우스-선호되는 코돈, 렛-선호되는 코돈, 헴스터-선호되는 코돈, 등등을 이용하여 합성될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 다양한 방법들과 조성물은 선별 표지들을 이용할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 다양한 방법들과 조성물에 다양한 선별 표지들이 이용될 수 있다. 이러한 선별 표지들은 예를 들면, 항생제, 이를 테면 G418, 히그로마이신, 블라시티딘, 네오마이신, 또는 퓨로마이신에 대하여 저항성을 부여한다. 이러한 선별 표지들은 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (neor), 히그로마이신 B 포스포트란스퍼라제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트란스퍼라제 (puror), 및 블라시티딘 S 데아미나제 (bsrr)를 포함한다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 선별 표지은 유도성 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 상기 선별 표지의 발현은 상기 세포에 독성이 된다. 이러한 선별 표지들의 비-제한적인 예로는 산틴/구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제 (gpt), 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제 (HGPRT) 또는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK)를 포함한다. 상기 선별 표지들이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 상기 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
iii.
표적화 벡터
표적화 벡터는 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산의 표적 좌 안으로 삽입 핵산을 도입시키는데 이용된다. 상기 표적화 벡터는 상기 삽입 핵산을 포함하고, 상기 삽입 핵산을 측면에 둔 5' 및 3' 상동성 아암을 더 포함한다. 상기 삽입 핵산의 측면에 있는 상동성 아암은 렛, 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산 진핵의 표적 좌 안에 영역에 상응한다. 참고의 용이성을 위하여, 상기 표적화된 게놈 좌 안에 대응하는 동족 게놈 영역은 본 명세서에서 "표적 부위들"로 지칭된다. 예를 들면, 표적화 벡터는 제 1 및 제 2 표적 부위에 상보적인 제 1 및 제 2 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 삽입 핵산을 포함할 수 있다. 이와 같이, 상기 표적화 벡터는 상동성 아암과 상기 세포의 게놈 안에 있는 상보적인 표적 부위들 사이에서 발생되는 상동성 재조합 이벤트를 통하여 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산의 표적 좌 안으로 삽입 핵산의 통합을 지원한다.
한 구체예에서, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산의 표적 좌는 5' 상동성 아암에 상보적인 제 1 핵산 서열과 3' 상동성 아암에 상보적인 제 2 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 최소한 5 kb 떨어져 있다. 또다른 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 최소한 5 kb 그러나 200 kb 미만으로 떨어져 있다. 한 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 최소한 10 kb 떨어져 있다. 한 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 110 kb, 최소한 120 kb, 최소한 130 kb, 최소한 140 kb, 최소한 150 kb, 최소한 160 kb, 최소한 170 kb, 최소한 180 kb, 최소한 190 kb, 또는 최소한 200 kb에 의해 떨어져 있다. 여전히 추가 구체예들에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만의, 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만의, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만의, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만의, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만의, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만의, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만의, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만의, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만의, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만의, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만의, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만의, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1 Mb 미만의, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만의, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만의, 최소한 약 2 Mb 그러나 2.5 Mb 미만의, 최소한 약 2.5 Mb 그러나 3 Mb 미만의, 또는 최소한 약 2 Mb 그러나 약 3 Mb 미만으로 떨어져 있다.
상기 표적화 벡터의 상동성 아암은 대응하는 표적 부위와 함께 상동성 재조합 이벤트를 촉진시키는데 충분한 임의의 길이, 예를 들면, 최소한 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb의 길이 또는 그 이상일 수 있다. 하기에서 더 상세하게 제시되는 바와 같이, 큰 표적화 벡터는 더 큰 길이의 표적화 아암을 이용할 수 있다. 특이적 구체예에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 10 kb이거나 또는 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총합은 최소한 약 16 kb 내지 약 100 kb 또는 약 30 kb 내지 약 100 kb이다. 다른 구체예들에서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합 크기는 약 10 kb 내지 약 150 kb, 약 10 kb 내지 약 100 kb, 약 10 kb 내지 약 75 kb, 약 20 kb 내지 약 150 kb, 약 20 kb 내지 약 100 kb, 약 20 kb 내지 약 75 kb, 약 30 kb 내지 약 150 kb, 약 30 kb 내지 약 100 kb, 약 30 kb 내지 약 75 kb, 약 40 kb 내지 약 150 kb, 약 40 kb 내지 약 100 kb, 약 40 kb 내지 약 75 kb, 약 50 kb 내지 약 150 kb, 약 50 kb 내지 약 100 kb, 또는 약 50 kb 내지 약 75 kb, 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 약 150 kb이다. 한 구체예에서, 상기 결손의 크기는 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합 크기와 동일하거나 또는 유사하다.
한 구체예에서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 (i) 5' 상동성 아암에 상동성인 5' 표적 서열; 그리고 (ii) 3' 상동성 아암에 상동성인 3' 표적 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리된다. 여전히 추가 구체예들에서, 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만의, 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만의, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만의, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만의, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만의, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만의, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만의, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만의, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만의, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만의, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만의, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만의, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1 Mb 미만의, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만의, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만의, 최소한 약 2 Mb 그러나 2.5 Mb 미만의, 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb 미만의, 또는 최소한 약 2 Mb 그러나 약 3 Mb 미만에 의해 분리된다.
뉴클레아제 물질들이 이용될 때, 표적화 벡터의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암에 대응하는 동족 게놈 영역은 인지 부위에서 닉(nick) 또는 이중-가닥 파괴(break)시 동족 게놈 영역과 상동성 아암 사이에 상동성 재조합 이벤트의 발생을 촉진시키기 위하여 뉴클레아제 표적 부위에 "충분히 근접되도록" 위치한다. 예를 들면, 상기 뉴클레아제 표적 부위들은 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암에 대응하는 동족 게놈 영역 사이에 임의의 위치에 위치될 수 있다. 특정 구체예들에서, 인지 부위는 동족 게놈 영역중 최소한 하나 또는 모두에 바로 인접한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 상동성 아암과 표적 부위 (가령, 동족 게놈 영역)는 상동성 재조합 반응을 위한 기질로 작용하기 위하여 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때, 서로에 대해 "보체(complement) 또는 "상보적(complementary)"이다. "상동성(homology)"이란 대응하는 또는 "상보적" 서열과 동일하거나 또는 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 의미한다. 주어진 표적 부위와 표적화 벡터 상에서 발견되는 대응하는 상동성 아암 사이의 서열 동일성은 상동성 재조합의 발생을 허용하는 임의 수준의 서열 동일성일 수 있다. 예를 들면, 상기 표적화 벡터 (또는 이의 단편)의 상동성 아암과 상기 표적 부위 (또는 이의 단편)에 의해 공유되는 서열 동일성 양은 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있고, 상기 서열은 상동성 재조합을 겪는다. 더욱이, 상동성 아암과 상보적 표적 부위 사이의 상동성의 상보적 영역은 쪼개진(cleaved) 인지 부위에서 상동성 재조합을 촉진시키는데 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들면, 상기 상동성 아암은 상기 세포의 에놈 안에 있는 대응하는 표적 부위들과 상동성 재조합을 겪는데 충분한 상동성을 가지도록 하기 위하여, 주어진 상동성 아암 및/또는 상보적 표적 부위는 최소한 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90-100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180-190 kb, 190-200 kb, 200 kb 내지 300 kb의 길이 또는 그 이상이 되는 상동성의 상보적 영역을 포함할 수 있다 (이를 테면, 본 명세서의 도처에서 설명된 LTVEC 벡터에서 설명된). 참조의 용이성을 위하여, 상기 상동성 아암은 본 명세서에서 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암으로 지칭된다. 이 용어는 상기 표적화 벡터 안에서 삽입 핵산에 대한 상동성 아암의 상대적인 위치와 관련된다.
따라서, 표적화 벡터의 상동성 아암은 상기 표적화된 좌를 가진 표적 부위에 상보적이 되도록 기획된다. 따라서, 상기 상동성 아암은 상기 세포에 고유한 좌에 상보적일 수 있고, 또는 대안으로 상기 상동성 아암은 이식유전자, 발현 카세트, 또는 게놈 DNA의 이종성 또는 외생성 영역이 포함되나, 이에 국한되지 않는 상기 세포의 게놈안에 통합된 DNA의 이종성 또는 외생성 세그먼트의 영역에 상보적일 수 있다. 대안으로, 상기 표적화 벡터의 상동성 아암은 인간 인공 염색체의 영역 또는 적절한 숙주 세포 안에 포함된 임의의 다른 조작된 게놈 영역에 상보적일 수 있다. 더욱이, 상기 표적화 벡터의 상동성 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리, 또는 P1 파아지 라이브러리의 영역에 상보적이거나 또는 이로부터 유도될 수 있다. 따라서, 특정 구쳉예들에서, 상기 표적화 벡터의 상동성 아암은 주어진 세포에 고유한, 이종성 또는 외생성인, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 게놈 좌에 상보적이다. 추가 구체예들에서, 상기 상동성 아암은 통상적인 방법을 이용하여 표적화불가능한 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 게놈 좌에 상보적이거나, 또는 뉴클레아제 물질에 의해 유도된 닉 또는 이중-가닥 파괴 없이 단지 부정확하게 또는 상당히 낮은 효과로 표적화될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 상동성 아암은 합성 DNA로부터 유도된다.
여전히 다른 구체예들에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암은 상기 표적화된 게놈과 동일한 게놈에 상보적이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 아암은 관련된 게놈으로부터 유래되는데, 가령, 상기 표적화된 게놈은 제 1 균주의 렛 게놈이며, 상기 표적화 아암은 제 2 균주의 렛 게놈으로부터 유래되며, 이때 제 1 균주와 제 2 균주는 상이하다. 다른 구체예들에서, 상기 상동성 아암은 동일한 동물의 게놈으로부터 유래되거나, 동일한 균주의 상기 게놈으로부터 유래되며, 가령, 상기 표적화된 게놈은 제 1 균주의 렛 게놈이며, 상기 표적화 아암은 동일한 렛의 렛 게놈 또는 동일한 균주로부터 유래된다.
상기 표적화 벡터 (이를 테면 큰 표적화 벡터)는 본 명세서의 도처에서 논의된 바와 같은 선별 카세트 또는 리포터 유전자를 또한 포함할 수 있다. 상기 선별 카세트는 선별 표지가 인코드된 핵산 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 상기 프로모터는 관심 대상의 원핵 세포 및/또는 관심대상의 진핵 세포에서 활성이 있을 수 있다. 이러한 프로모터들은 유도성 프로모터, 리포터 유전자 또는 상기 세포에 대해 내생성인 프로모터, 리포터 유전자 또는 상기 세포에 이종성인 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 발생 단계-특이적 프로모터일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 선별 표지는 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (neor), 히그로마이신 B 포스포트란스퍼라제 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트란스퍼라제 (puror), 블라시티딘 S 데아미나제 (bsrr), 산틴/구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제 (gpt), 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-k), 및/또는 이의 조합으로부터 선택되거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 상기 표적화 벡터의 선별 표지는 5' 및 3' 상동성 아암의 측면에 있을 수 있거나, 또는 상기 상동성 아암의 5' 또는 3'에서 발견될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 표적화 벡터 (이를 테면, 큰 표적화 벡터)는 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포터 유전자를 포함하는데, 이때 상기 리포터 유전자는 LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 강화된 황색 형광 단백질 (EYFP), Emerald, 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), CyPet, 시안 형광 단백질 (CFP), Cerulean, T-Sapphire, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 및/또는 이의 조합로 구성된 또는 포함하는 집단에서 선택된 리포터 단백질을 인코드한다. 이러한 리포터 유전자는 상기 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 이러한 프로모터들은 유도성 프로모터, 리포터 유전자 또는 상기 세포에 대해 내생성인 프로모터, 리포터 유전자 또는 상기 세포에 이종성인 프로모터, 세포-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 발생 단계-특이적 프로모터일 수 있다.
한 구체예에서, 뉴클레아제 물질과 상기 표적화 벡터 (예를 들면, 큰 표적화 벡터 포함)의 복합 사용으로 상기 표적화 벡터 단독 사용과 비교하였을 때, 표적화 효과가 증가된다. 한 구체예에서, 상기 표적화 벡터가 뉴클레아제 물질과 병용 이용되면, 상기 표적화 벡터의 표적화 효과는 상기 표적화 벡터가 단독으로 이용될 때와 비교하여, 최소한 2-배, 최소한 3-배, 또는 최소한 4-배 증가된다.
표적화 벡터가 이용될 때, 상기 벡터 디자인은 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 약 5 kb 내지 약 200 kb의 주어진 서열의 삽입을 허용할 것이다. 한 구체예에서, 상기 삽입은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb이다.
표적화 벡터가 이용될 때, 상기 벡터 디자인은 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 약 5 kb 내지 약 200 kb 또는 약 5 kb 내지 약 3.0 Mb의 주어진 서열의 대체를 허용할 것이다. 한 구체예에서, 상기 대체는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb이다.
한 구체예에서, 상기 표적화 벡터는 부위-특이적 재조합효소 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 부위-특이적 재조합효소 유전자는 Cre 재조합효소를 인코드한다. 한 구체예에서, Cre 재조합효소 유전자는 Crei이며, 이때 Cre 재조합효소를 인코드하는 2개의 엑손은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론에 의해 분리되어 있다.
한 구체예에서, Cre 재조합효소 유전자는 핵으로 Cre (또는 임의의 재조합효소 또는 뉴클레아제 물질)의 국소화를 촉진시키기 위하여 핵 국소화 신호를 더 포함한다 (가령, 상기 유전자는 NL-Cre 유전자이다). 특이적 구체예에서, Cre 재조합효소 유전자는 핵 국소화 신호 및 인트론 (가령, NL-Crei)을 더 포함한다.
다양한 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 물질 (상기에서 논의되는 Cre 또는 Crei 재조합효소 포함)의 발현을 위한 적절한 프로모터는 Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, 및/또는 Pax3로부터 선택되거나, 이를 포함한다. 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 Gata6 또는 Gata4 프로모터이다. 상기 다양한 프로모터는 예를 들면, 설치류 이를 테면 마우스 또는 렛 렛이 아닌 설치류, 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 비-인간 포유류, 포유류, 인간 또는 헴스터가 포함된, 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 Prm1 프로모터이다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 렛 Prm1 프로모터이다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 마우스 Prm1 프로모터이다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 Blimp1 프로모터 또는 이의 단편, 가령, Blimp1 프로모터의 1 kb 또는 2 kb 단편이다. 예를 들면, U.S. 특허 8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다.
iv.
큰 표적화 벡터
용어 "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이 세포 안에서 상동성 표적화를 실행하기 위하여 의도된 다른 방법들에서 전형적으로 이용되는 것보다 더 큰 핵산 서열로부터 유도되고, 이에 상응하는 상동성 아암이 포함된 큰 표적화 벡터를 포함하고 및/또는 세포 안에서 상동성 표적화를 실행하기 위하여 의도된 다른 방법들에서 전형적으로 이용되는 것보다 더 큰 핵산 서열이 포함된 삽입 핵산이 포함된 큰 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들면, LTVEC는 이들의 크기 제한으로 인하여 통상적인 플라스미드-기반 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 큰 좌들의 변형을 가능하게 한다. 특정 구체예들에서, LTVEC의 상동성 아암 및/또는 상기 삽입 핵산은 진핵 세포 또는 렛이 아닌 진핵 세포의 게놈 서열을 포함한다. LTVEC의 크기는 너무 커서 통상적인 분석, 가령, 서던 블랏팅 및 긴-범위 (가령, 1 kb-5 kb) PCR에 의해 표적화 이벤트 스크리닝을 할 수 없다. LTVEC의 예로는 세균성 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체 (YAC)로부터 유도된 벡터가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. LTVEC의 비제한적인 예들과 이를 만드는 방법들은 가령, US 특허 번호 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, 및 WO 2002/036789 (PCT/US01/45375), 그리고 US 2013/0137101에서 설명되며, 이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
상기 LTVEC는 약 20 kb 내지 약 400 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 75 kb, 약 75 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 125 kb, 약 125 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 175 kb, 약 175 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 225 kb, 약 225 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 275 kb 또는 약 275 kb 내지 약 300 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 350 kb 내지 약 550 kb가 포함되나, 이에 국한되지 않는 임의의 길이를 가질 수 있다. 한 구체예에서, LTVEC는 약 100 kb이다.
일부 구체예들에서, LTVEC는 최소한 10 kb이며, 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb 또는 최소한 200 kb이다.
일부 구체예들에서, LTVEC는 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb 또는 최소한 200 kb의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, LTVEC는 약 5 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 0.5 kb 내지 약 30 kb, 약 0.5 kb 내지 약 40 kb, 약 30 kb 내지 약 150 kb, 약 0.5 kb 내지 약 150 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 삽입 핵산을 포함한다.
한 구체예에서, LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb의 핵산 서열을 포함한다.
LTVEC가 이용될 때, 상기 벡터 디자인은 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 약 5 kb 내지 약 200 kb 또는 약 5 kb 내지 약 3 Mb의 주어진 서열의 대체를 허용할 것이다. 한 구체예에서, 상기 대체는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb이다.
한 구체예에서, LTVEC의 상동성 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리, 또는 P1 파아지 라이브러리로부터 유도된다. 다른 구체예들에서, 상기 상동성 아암은 상기 세포의 표적화된 게놈 좌로부터 유도되며, 일부 경우에서 상기 표적 게놈 좌로부터 유도되며, 표적화되도록 기획된 LTVEC는 통상적인 방법에 의해 표적화될 수 없다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 상동성 아암은 합성 DNA로부터 유도된다.
한 구체예에서, LTVEC에서 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 10 kb이다. 다른 구체예들에서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 100 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 200 kb이다. 한 구체예에서 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 30 kb 내지 약 100 kb이다. 다른 구체예들에서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합 크기는 약 10 kb 내지 약 150 kb, 약 10 kb 내지 약 100 kb, 약 10 kb 내지 약 75 kb, 약 20 kb 내지 약 150 kb, 약 20 kb 내지 약 100 kb, 약 20 kb 내지 약 75 kb, 약 30 kb 내지 약 150 kb, 약 30 kb 내지 약 100 kb, 약 30 kb 내지 약 75 kb, 약 40 kb 내지 약 150 kb, 약 40 kb 내지 약 100 kb, 약 40 kb 내지 약 75 kb, 약 50 kb 내지 약 150 kb, 약 50 kb 내지 약 100 kb, 또는 약 50 kb 내지 약 75 kb, 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 약 150 kb이다. 한 구체예에서, 상기 결손의 크기는 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합 크기와 동일하거나 또는 유사하다.
다른 구체예들에서, 5' 상동성 아암은 약 5 kb 내지 약 100 kb의 범위다. 한 구체예에서, 3' 상동성 아암은 약 5 kb 내지 약 100 kb 범위다. 다른 구체예들에서, 5' 및 3' 상동성 아암의 총 합은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 약 190 kb 내지 약 200 kb, 또는 약 30 kb 내지 약 100 kb, 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 약 150 kb이다.
한 구체예에서, LTVEC는 LTVEC 상동성 아암의 측면 렛 핵산 서열에 대하여 상동성 또는 이종상동성인 삽입 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 서열은 렛이 아닌 종으로부터 유래된 것이다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 서열은 진핵생물로부터 유래된 것이다. 한 구체예에서, 상기 렛 핵산 서열에 대하여 상동성 또는 이종상동성인 삽입 핵산은 포유류 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 렛 핵산 서열에 대하여 상동성 또는 이종상동성인 삽입 핵산은 비-인간 포유류 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 마우스 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 인간 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 헴스터 핵산이다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 게놈 DNA다. 한 구체예에서, 상기 삽입은 상기에서 설명된 바와 같이, 5 kb 내지 200 kb이다.
한 구체예에서, LTVEC는 선별 카세트 또는 리포터 유전자를 포함한다. 이용될 수 있는 다양한 형태의 상기 선별 카세트와 리포터 유전자는 본 명세서의 도처에서 논의된다.
본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이, LTVEC는 상기 표적화 벡터와 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵에서 마우스 또는 헴스터 핵산, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 세포에서 표적 좌 사이에 상동성 재조합을 촉진시키는 뉴클레아제 물질과 복합되어, 본 명세서에서 제공되는 방법에 또한 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 큰 표적화 벡터 (LTVEC)는 부위-특이적 재조합효소 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 부위-특이적 재조합효소 유전자는 Cre 재조합효소를 인코드한다. 한 구체예에서, Cre 재조합효소 유전자는 Crei이며, 이때 Cre 재조합효소를 인코드하는 2개의 엑손은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론에 의해 분리되어 있다. 한 구체예에서, Cre 재조합효소 유전자는 핵으로 Cre (또는 임의의 재조합효소 또는 뉴클레아제 물질)의 국소화를 촉진시키기 위하여 핵 국소화 신호를 더 포함한다 (가령, 상기 유전자는 NL-Cre 유전자이다). 특이적 구체예에서, Cre 재조합효소 유전자는 핵 국소화 신호와 인트론 (가령, NL-Crei)을 더 포함한다.
다양한 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 물질 (상기에서 논의되는 Cre 또는 Crei 재조합효소 포함)의 발현을 위한 적절한 프로모터는 Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5, 및/또는 Pax3로부터 선택되거나, 이를 포함한다. 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 Gata6 또는 Gata4 프로모터이다. 상기 다양한 프로모터는 예를 들면, 설치류 이를 테면 마우스 또는 렛 렛이 아닌 설치류, 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 비-인간 포유류, 포유류, 인간 또는 헴스터가 포함된, 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 Prm1 프로모터이다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 렛 Prm1 프로모터이다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 마우스 Prm1 프로모터이다. 또다른 특이적 구체예에서, 상기 프로모터는 Blimp1 프로모터 또는 이의 단편, 가령, Blimp1 프로모터의 1 kb 또는 2 kb 단편이다. 예를 들면, U.S. 특허8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다.
한 구체예에서, 본 명세서의 도처에서 상세하게 논의되는 바와 같이, LTVEC는 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 ApoE 좌, Il2rg 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들 수 있는 삽입 핵산을 포함한다. 특정 구체예들에서, ApoE 좌에서 유전적 변형에 의해 ApoE 활성, IL-2Rg 활성, Rag2 활성, Rag1 활성 및/또는 Rag2와 Rag1 활성에서 감소, 증가 또는 조절된다. 한 구체예에서, ApoE 녹아웃, 및 Il2rg 녹아웃, Rag2 녹아웃, Rag1 녹아웃, Rag2/Rag1 녹아웃이 생성된다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 뉴클레아제 물질들은 임의의 관심 대상의 게놈 좌를 표적으로 하기 위하여 임의의 LTVEC 표적화 시스템과 함께 이용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 게놈은 최소한 10 kb의 핵산 서열이 포함된 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에서 Cas 단백질 및 CRISPR RNA에 노출된다. 이러한 경우, Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 LTVEC에 노출된 후, 상기 게놈은 최소한 10 kb 핵산 서열이 포함되도록 변형된다. 특정 구체예들에서, LTVEC는 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb 또는 최소한 200 kb의 핵산 서열을 포함한다.
v. 뉴클레아제 물질 및 뉴클레아제 물질에 대한 인지 부위
상기에서 상세하게 제시된 바와 같이, 뉴클레아제 물질들은 원핵 세포 또는 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류 ,마우스 또는 헴스터 세포안에 있는 표적 좌의 변형을 지원하기 위하여, 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물에 이용될 수 있다. 이러한 뉴클레아제 물질은 상기 표적화 벡터와 상기 표적 좌 사이의 상동성 재조합을 촉진시킬 수 있다. 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 엔도뉴클레아제 물질을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "뉴클레아제 물질에 대한 인지 부위"는 뉴클레아제 물질에 의해 닉 또는 이중-가닥 파괴가 유도되는 DNA 서열을 포함한다. 상기 뉴클레아제 물질에 대한 인지 부위는 상기 세포에 대하여 내생성(또는 고유한)이거나 또는 인지 부위는 상기 세포에 대하여 외생성일 수 있다. 특정 구체예들에서, 인지 부위는 상기 세포에 대하여 외생성이며, 그리고 이로 인하여,상기 세포의 게놈에서 자연적으로 생성되지 않는다. 여전히 추가 구체예들에서, 인지 부위는 상기 세포에 대하여 외생성이며, 그리고 상기 표적 게놈 좌에 위치되기를 원하는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드에 외생성이다. 추가 구체예들에서, 상기 외생성 또는 내생성 인지 부위는 숙주 세포의 게놈에 단지 한번만 존재한다. 특정 구체예들에서, 상기 게놈 안에서 오직 한번만 발생되는 내생성 또는 고유 부위가 식별된다. 그 다음 이러한 부위는 상기 내생성 인지 부위에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 만들게 되는 뉴클레아제 물질을 기획하는데 이용될 수 있다.
인지 부위의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들면, 최소한 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질의 각 모노머는 최소한 9개 뉴클레오티드의 인지 부위를 인지한다. 다른 구체예들에서, 인지 부위는 약 9 내지 약 12개 뉴클레오티드 길이, 약 12 내지 약 15개 뉴클레오티드 길이, 약 15 내지 약 18개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 18 내지 약 21개 뉴클레오티드 길이, 그리고 이러한 하위 범위의 조합 (가령, 9-18개 뉴클레오티드)이다. 상기 인지 부위는 팔린드롬성(palindromic)일 수 있는데, 즉, 한 가닥에 있는 서열은 상보적 가닥에서 반대 방향으로 동일한 것이 판독된다. 주어진 뉴클레아제 물질은 인지 부위에 결합하고, 이 결합 부위를 절단하거나, 또는 대안으로, 상기 뉴클레아제 물질은 인지 부위와 상이한 서열에 결합할 수 있다는 것이 인지된다. 더욱이, 용어 인지 부위는 상기 뉴클레아제 물질 결합 부위 안에 또는 외부에 있는지에 무관하게, 상기 뉴클레아제 물질 결합 부위와 닉/절단 부위를 모두 포함한다. 또다른 변이에서, 상기 뉴클레아제 물질에 의한 절단은 블런트(blunt) 단부 컷이 만들어지도록 서로에 대해 바로 반대 부위에 뉴클레오티드 위치에서 일어날 수 있고, 다른 경우들에서, 절개(incision)는 소위 "점착성(sticky) 단부"로 불리는 단일-가닥으로 된 오버행(overhangs)을 만들도록 스태그럴될 수 있는데(staggered), 5' 오버행, 또는 3' 오버행이 될 수 있다.
원하는 인지 부위 안에 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하는 임의의 뉴클레아제 물질이 본 명세서에서 공개된 방법 및 조성물에 이용될 수 있다. 상기 뉴클레아제 물질이 원하는 인지 부위 안에 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하는 한, 자연-발생적 또는 고유 뉴클레아제 물질이 이용될 수 있다. 대안으로, 변형된 또는 공작된(engineered) 뉴클레아제 물질이 이용될 수 있다. "공작된 뉴클레아제 물질"은 원하는 인지 부위를 특이적으로 인지하고, 이 인지 부위 안에 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하기 위하여 이의 고유 형태로부터 공작되는(변형된 또는 유도된) 뉴클레아제를 포함한다. 따라서, 공작된 뉴클레아제 물질은 고유, 자연-발생적 뉴클레아제 물질로부터 유도될 수 있거나, 또는 인공적으로 만들어지거나 또는 합성될 수 있다. 상기 뉴클레아제 물질의 변형은 단백질 절단 물질에서 하나의 아미노산 또는 핵산 절단 물질에서 하나의 뉴클레오티드와 같이 아주 작을 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 공작된 뉴클레아제는 인지 부위에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하며, 이때 인지 부위는 고유 (비-공작된 또는 비-변형된) 뉴클레아제 물질에 의해 인지될 수 있는 서열은 아니었다. 인지 부위 또는 다른 DNA에 닉 또는 이중-가닥 파괴의 생성은 본 명세서에서 인지 부위 또는 다른 DNA의 "컷팅(cutting)" 또는 "쪼갬(cleaving)"으로 언급될 수 있다.
구체화된 인지 부위들의 활성 변이체(variants) 및 단편들이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 상기 주어진 인지 부위에 대하여 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 이때 상기 활성 변이체는 생물학적 활성을 유지하고, 따라서 서열-특이적 방식으로 뉴클레아제 물질에 의해 인지되고, 쪼개질 수 있다. 뉴클레아제 물질에 의한 인지 부위의 이중-가작 파괴를 측정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 인지 부위를 컷팅하는 뉴클레아제의 능력을 측정한다.
상기 뉴클레아제 물질의 인지 부위는 상기 표적 좌 안에 또는 부근 임의의 위치에 있을 수 있다. 상기 인지 부위는 유전자의 코딩 영역 안에, 또는 조절 영역 안에 위치할 수 있으며, 이는 상기 유전자의 발현에 영향을 준다. 따라서, 상기 뉴클레아제 물질의 인지 부위는 인트론, 엑손, 프로모터, 인헨서, 조절 영역, 또는 임의의 비-단백질 코딩 영역 안에 위치될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 전사 활성화물질-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN)이다. TAL 작동체 뉴클레아제는 원핵 또는 진핵 유기체의 게놈 안에 특이적 표적 서열에서 이중-가닥 파괴를 만드는데 이용될 수 있는 서열-특이적 뉴클레아제 부류다. TAL 작동체 뉴클레아제는 고유 또는 공작된 전사 활성화물질-유사 (TAL) 작동체, 또는 이의 기능적 부분을 엔도뉴클레아제, 이를 테면, 예를 들면, FokI의 촉매 도메인에 융합시킴으로써 만들어진다. 이러한 독특한 모듈러 TAL 작동체 DNA 결합 도메인은 잠재적으로 임의의 주어진 DNA 인지 특이성을 가진 단백질을 기획할 수 있도록 한다. 따라서, TAL 작동체 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 특이적 DNA 표적 부위들을 인지하도록 공작될 수 있고, 따라서 원하는 표적 서열에 이중-가닥 파괴를 만드는데 이용될 수 있다. WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc . Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; 그리고 Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148 참고; 이들 모두 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
적합한 TAL 뉴클레아제의 예시들, 그리고 적합한 TAL 뉴클레아제를 제조하는 방법들은 가령, US 특허 출원 번호 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, 및 2006/0063231 A1에서 교시되고 있다 (각각 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 다양한 구체예들에서, TAL 작동체 뉴클레아제는 가령, 관심 대상의 게놈 좌에 있는 표적 핵산 서열 안에 또는 부근을 절단하도록 공작되며, 이때 상기 표적 핵산 서열은 표적화 벡터에 의해 변형되는 서열에서 또는 이 서열 부근이다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물에 이용되는 적합한 TAL 뉴클레아제는 본 명세서에서 설명된 표적화 벡터에 의해 변형되는 표적 핵산 서열에 또는 이 부근에 결합하도록 특이적으로 기획된 것들을 포함한다.
한 구체예에서, TALEN의 각 모노머는 12-25 TAL 반복부(repeats)를 포함하고, 이때 각 TAL 반복부는 1 bp 하위부위에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하도록 연계된 TAL 반복부-기반의 DNA 결합 도메인이 포함된 키메라 단백질이다. 한 구체예에서, 상기 독립적인 뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제다. 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 제 1 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인과 제 2 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인을 포함하며, 이때 각각의 제 1 및 제 2 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하도록 연계되며, 이때 제 1 및 제 2 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인은 상기 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6 bp 내지 약 40 bp 절단 부위에 의해 떨어져 있는 2개의 연속 표적 DNA를 인지하며, 이때 FokI 뉴클레아제는 표적 서열을 이량체화시키고, 표적 서열에서 이중 가닥 틈을 만든다.
한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 제 1 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인과 제 2 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인을 포함하며, 이때 각각의 제 1 및 제 2 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하도록 연계되며, 이때 제 1 및 제 2 TAL-반복부-기반의 DNA 결합 도메인은 상기 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 5 bp 또는 6 bp 절단 부위에 의해 떨어져 있는 2개의 연속 표적 DNA를 인지하며, 이때 FokI 뉴클레아제는 이량체화시키고, 이중 가닥 틈을 만든다.
본 명세서에서 공개된 다양한 방법 및 조성물에 이용되는 뉴클레아제 물질은 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, ZFN의 각 모노머는 3개 또는 그 이상의 아연 핑거-기반의 DNA 결합 도메인을 포함하며, 이때 각 아연 핑거-기반의 DNA 결합 도메인은 3 bp 하위부위에 결합한다. 다른 구체예들에서, ZFN은 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하도록 연계된 아연 핑거-기반의 DNA 결합 도메인이 포함된 키메라 단백질이다. 한 구체예에서, 상기 독립적인 엔도뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제다. 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 제 1 ZFN과 제 2 ZFN을 포함하며, 이때 각각의 제 1 ZFN 및 제 2 ZFN은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하도록 연계되며, 이때 제 1 및 제 2 ZFN은 상기 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6 bp 내지 약 40 bp 절단 부위 또는 약 5 bp 내지 약 6 bp 절단 부위에 의해 떨어져 있는 2개의 연속 표적 DNA를 인지하며, 이때 FokI 뉴클레아제는 이량체화시키고, 이중 가닥 틈을 만든다. 예를 들면, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; 그리고, WO/2011/017293A2를 참고하며, 이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
본 명세서에서 제공되는 방법들의 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 (a) FokI 엔도뉴클레아제에 융합된 아연 핑거-기반의 DNA 결합 도메인이 포함된 키메라 단백질; 또는 (b) FokI 엔도뉴클레아제에 융합된 전사 활성화물질-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN)가 포함된 키메라 단백질을 포함한다.
여전히 또다른 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 메가뉴클레아제다. 메가뉴클레아제는 보존된 서열 모티프에 근거하여 4개의 패밀리로 분류되는데, 이 패밀리는 LAGLIDADG (서열 번호: 16), GIY-YIG, H-N-H, 및 His-Cys 박스 패밀리들이다. 이들 모티프는 금속 이온들의 배위(coordination)와 포스포디에스테르 결합의 가수분해에 참여한다. HEases는 이들의 긴 인지 부위들에 대해 주목되며, 이들의 DNA 기질에서 일부 서열 다형을 표적화한다. 메가뉴클레아제 도메인, 구조 및 기능은 공지되어 있고, 예를 들면, Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; 그리고 Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764를 참고한다. 일부 실시예들에서 자연적으로 생성되는 변이체, 및/또는 공작된 유도체 메가뉴클레아제가 이용된다. 역학, 보조인자 상호작용, 발현, 최적 조건, 및/또는 인지 부위 특이성을 변형시키는 방법들, 그리고 활성을 스크리닝하는 방법들은 공지되어 있으며, 예를 들면, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; 그리고 WO2004031346을 참고한다.
본 명세서에서 I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, 또는 임의의 활성 변이체 또는 이의 단편들이 포함된, 임의의 메가뉴클레아제가 이용될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 상기 메가뉴클레아제는 12 내지 40개 염기쌍의 이중-가닥으로 된 DNA 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 상기 메가뉴클레아제는 게놈에서 하나의 완전하게 정합되는(matched) 표적 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 상기 메가뉴클레아제는 호밍(homing) 뉴클레아제다. 한 구체예에서, 상기 호밍(homing) 뉴클레아제는 LAGLIDADG (서열 번호: 16) 패밀리의 호밍(homing) 뉴클레아제다. 한 구체예에서, LAGLIDADG (서열 번호: 16) 패밀리의 호밍(homing) 뉴클레아제는 I-SceI, I-CreI, 및 I-Dmol에서 선택된다.
뉴클레아제 물질들은 타입 I, 타입 II, 타입 III, 및 타입 IV 엔도뉴클레아제를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 더 포함할 수 있다. 타입 I 및 타입 III 제한 엔도뉴클레아제는 특이적 인지 부위들을 인지하지만, 전형적으로 상기 뉴클레아제 결합 부위로부터 가변 위치에서 절단하며, 이는 상기 절단 부위 (인지 부위)로부터 수백 염기쌍 떨어진 거리일 수 있다. 타입 II 시스템에서, 상기 제한 활성은 임의의 메틸라제 활성과 독립적이며, 절단은 전형적으로 결합 부위 안 또는 부근의 특정 부위들에서 일어난다. 대부분의 타입 II 효소들은 팔린드롬성 서열을 컷트하지만, 그러나 타입 IIa 효소들은 비-팔린드롬성 인지 부위들을 인지하고, 이 인지 부위 외부를 절단하고, 타입 IIb 효소들은 이 인지 부위 외부의 양쪽 부위를 2회 컷트하고, 타입 IIs 효소들은 비대칭 인지 부위를 인지하고, 그리고 이 인지 부위로부터 약 1-20개의 뉴클레오티드의 한정된 거리에서 한쪽 측면만 절단한다. 타입 IV 제한 효소들은 메틸화된 DNA를 표적으로 한다. 제한 효소들은 예를 들면 REBASE 데이터베이스 (webpage at rebase.neb.com; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, 및 Belfort et al., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC)에서 더 설명되고, 분류된다.
본 명세서에서 공개된 다양한 방법 및 조성물에 이용되는 뉴클레아제 물질은 CRISPR/Cas 시스템을 또한 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들면, Cas9 뉴클레아제를 이용할 수 있는데, 일부 경우에서, 이들이 발현되는 원하는 세포 유형에 대하여 코돈-최적화된다. 이러한 시스템은 별도의 2개 분자를 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 또한 이용할 수 있다. 예시적인 2개-분자 gRNA는 crRNA-유사 ("CRISPR RNA" 또는 "타켓터-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자와 대응하는 tracrRNA-유사 ("트란스-작용 CRISPR RNA" 또는 "활성화물질-RNA" 또는 "tracrRNA" 또는 "스캐폴드(scaffold)") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트 (단일 가닥으로 된)와 이 gRNA의 단백질-결합 세그먼트의 이중 가닥으로 된 RNA (dsRNA) 듀플렉스중 하나의 절반을 형성하는 뉴클레오티드 스트레치 모두를 포함한다. 대응하는 tracrRNA (활성화물질-RNA)는 이 gRNA의 단백질-결합 세그먼트의 이중 가닥으로 된 RNA (dsRNA) 듀플렉스중 나머지 절반을 형성하는 뉴클레오티드 스트레치 모두를 포함한다. 따라서, crRNA의 뉴클레오티드 스트레치는 tracrRNA의 뉴클레오티드 스트레치에 상보적이며, 이와 혼성화되어, 상기 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성한다. 이와 같이, 각 crRNA는 대응하는 tracrRNA를 갖는다고 말할 수 있다. 상기 crRNA는 추가적으로 단일 가닥으로 된 DNA-표적화 세그먼트를 제공한다. 따라서, gRNA는 표적 서열에 혼성화되는 서열, 그리고 tracrRNA를 포함한다. 따라서, crRNA 및 tracrRNA (대응하는 쌍으로써)는 혼성화되어 gRNA를 형성한다. 세포 안에서 변형에 이용되는 경우, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열 및/또는 길이는 RNA 분자들이 이용되는 종에 특이적이 되도록 기획될 수 있다.
3개의 요소 (Cas9, tracrRNA 및 crRNA)를 인코딩하는 자연 발생적 유전자는 오페론(들)에서 전형적으로 조직화된다. 자연 발생적 CRISPR RNAs는 Cas9 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만, 21 내지 46개의 뉴클레오티드의 2개 직접 반복부(DR)의 측면에 있는 21 내지 72개의 뉴클레오티드 길이의 표적화 세그먼트을 대개 포함한다 (가령, WO2014/131833 참고). S. 피요젠(S. pyogenes)의 경우, DRs 길이는 36개 뉴클레오티드이며, 상기 표적화 세그먼트의 길이는 30개 뉴클레오티드다. 3' 위치된 DR은 대응하는 tracrRNA에 상보적이며, 이에 혼성화되고, 다시 Cas9 단백질에 결합한다.
대안으로, 상기 시스템은 코돈-최적화 Cas9와 함께 기능하는 융합된 crRNA-tracrRNA 구조체 (가령, 단일 전사체)를 더 이용한다. 이 단일 RNA는 대개 가이드 RNA 또는 gRNA로 지칭된다. gRNA 안에, crRNA 부분은 주어진 인지 부위에 대한 '표적 서열'로 식별되며, tracrRNA는 대개 '스캐폴드"로 지칭된다. 간략하게 설명하자면, 표적 서열이 포함된 짧은 DNA 단편이 가이드 RNA 발현 플라스미드에 삽입된다. gRNA 발현 플라스미드는 상기 표적 서열 (일부 구체예들에서 대략 20개 뉴클레오티드), tracrRNA 서열의 형태(스캐폴드) 뿐만 아니라 뿐만 아니라 상기 세포에 활성이 있는 적합한 프로모터 그리고 진행 세포 안에서 적절한 프로세싱을 위한 필수 요소들을 포함한다. 많은 시스템들이 이중 가닥으로 된 DNA를 형성하기 위하여 어닐되고, 그 다음 gRNA 발현 플라스미드로 클론되는 맞춤, 상보적 올리고에 의존적이다. 상기 gRNA 발현 카세트 및 Cas9 발현 카세트는 그 다음 상기 세포 안으로 도입된다. 예를 들면, Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb 15;339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):233-9; 그리고 Cong L et al. Science 2013 Feb 15;339(6121):819-23을 참고하며, 이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 또한, 예를 들면, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, 및 WO/2013142578A1을 참고하며, 이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
일부 구체예들에서, Cas9 뉴클레아제는 단백질 형태로 제공될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas9 단백질은 gRNA와 복합체 형태로 제공될 수 있다. 다른 구체예들에서, Cas9 뉴클레아제는 단백질을 인코드하는 핵산 형태로 제공될 수 있다. Cas9 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 RNA (가령, 메신져 RNA (mRNA)) 또는 DNA일 수 있다.
일부 구체예들에서, gRNA는 RNA 형태로 제공될 수 있다. 다른 구체예들에서, gRNA는 RNA가 인코딩된 DNA 형태로 제공될 수 있다. 일부 구체예들에서, gRNA는 별도의 crRNA 및 tracrRNA 분자, 또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 인코딩하는 별도의 DNA 분자 형태로 제공될 수 있다.
한 구체예에서, 세포 안에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법은 상기 세포 안으로 다음을 도입시키는 것을 더 포함한다: (a) 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)-연합된 (Cas) 단백질을 인코드하는 제 1 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 제 1 프로모터가 포함된 제1 발현 구조체; (b) 가이드 RNA (gRNA)에 연계된 게놈 표적 서열에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체, 이때 상기 게놈 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif)의 측면에 있다. 임의선택적으로, 상기 게놈 표적 서열은 3'단부에서 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 측면에 있다. 한 구체예에서, 상기 세포는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 CHO 세포를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 표적 서열은 뉴클레오티드 서열 GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1 -20 GG; 서열 번호: 1)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 표적 서열은 서열 번호: 23을 포함하고, 이때 N은 1 내지 20개의 뉴클레오티드 길이가 된다. 또다른 구체예에서, 상기 게놈 표적 서열은 서열 번호: 1의 14 내지 20개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다.
한 구체예에서, gRNA는 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR) RNA (crRNA) 및 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인코드하는 제 3 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, Cas 단백질은 Cas9이다.
일부 구체예들에서, gRNA는 (a) 핵산 서열 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호: 2)의 키메라 RNA; 또는 (b) 핵산 서열 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (서열 번호: 3)의 키메라 RNA를 포함한다.
또다른 구체예에서, crRNA는 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3' (서열 번호: 4); 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAG (서열 번호: 5); 또는 5'-GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUA-3' (서열 번호: 6)을 포함한다.
여전히 다른 구체예들에서, tracrRNA는 5'-AAGGCUAGUCCG-3' (서열 번호: 7) 또는 5'-AAGGCUAGUCCGU UAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호: 8)를 포함한다.
한 구체예에서, Cas 단백질은 유형 I Cas 단백질이다. 한 구체예에서, Cas 단백질은 유형 II Cas 단백질이다. 한 구체예에서, 유형 II Cas 단백질은 Cas9이다. 한 구체예에서, 제 1 핵산 서열은 인간 코돈-최적화 Cas 단백질을 인코드한다.
특정 구체예들에서, Cas 단백질은 이중 가닥으로 된 DNA (dsDNA)의 양쪽 가닥 모두의 커팅없이, 표적 부위에서 단일 가닥 파괴(가령, "닉")을 만들 수 있는 "닉카제(nickase)"다. 예를 들면, Cas9는 2개의 뉴클레아제 도메인-RuvC-유사 뉴클레아제 도메인과 HNH-유사 뉴클레아제 도메인-반대 DNA 가닥의 절단을 담당-을 포함한다. 이들 도메인중 임의의 돌연변이에 의해 닉카제가 만들어질 수 있다. 닉카제를 만드는 돌연변이의 예들은 예를 들면, WO/2013/176772A1 및 WO/2013/142578A1에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
특정 구체예들에서, dsDNA의 각 가닥에 있는 표적 부위에 특이적인 별도의 2개 Cas 단백질 (가령, 닉카제)은 또다른 핵산 또는 동일한 핵산의 별도의 영역 상의 오버행잉 서열에 상보적인 오버행잉 서열을 만들 수 있다. dsDNA의 양쪽 가닥 상에서 표적 부위들에 특이적인 2개 닉카제와 핵산의 접촉에 의해 만들어지는 오버행잉 단부는 5' 또는 3' 오버행잉 단부일 수 있다. 예를 들면, 제 1 닉카제는 dsDNA의 제 1 가닥 상에 단일 가닥 파괴를 만들 수 있고, 한편 제 2 닉카제는 dsDNA의 제 2 가닥 상에 단일 가닥 파괴를 만들 수 있고, 따라서 오버행잉 서열이 만들어진다. 만들어진 오버행잉 단부 서열이 상이한 핵산 분자 상에 있는 오버행잉 단부 서열에 상보적이 되도록 단일 가닥 파괴를 만드는 닉카제의 표적 부위들이 선택될 수 있다. 2개의 상이한 핵산 분자의 상보적 오버행잉 단부들은 본 명세서에서 공개된 방법에 의해 어닐될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제 1 가닥 상의 닉카제의 표적 부위는 제 2 가닥 상의 닉카제의 표적 부위와 상이하다.
한 구체예에서, 제 1 핵산은 Cas 단백질에서 뉴클레아제 활성 부위들의 최소한 하나의 아미노산 잔기를 파괴하는 돌연변이를 포함하며, 이때 돌연변이 Cas 단백질은 상기 표적 DNA 영역의 오직 하나의 가닥에만 파괴를 만들고, 그리고 이때 상기 돌연변이는 상기 표적 DNA 영역에서 비상동성 재조합을 감소시킨다.
한 구체예에서, Cas 단백질을 인코드하는 제 1 핵산은 핵 국소화 신호 (NLS)를 더 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵 국소화 신호는 SV40 핵 국소화 신호다.
한 구체예에서, 상기 게놈 표적 서열과 가이드 RNA (gRNA)의 발현을 유도하는 제 2 프로모터는 RNA 중합효소 III 프로모터다. 한 구체예에서, RNA 중합효소 III 프로모터는 인간 U6 프로모터다. 한 구체예에서, RNA 중합효소 III 프로모터는 렛 U6 중합효소 III 프로모터다. 한 구체예에서, RNA 중합효소 III 프로모터는 마우스 U6 중합효소 III 프로모터다.
한 구체예에서, crRNA 및 tracrRNA를 인코드하는 핵산 서열은 합성 루프를 통하여 연계되며, 이때, 발현 시, crRNA 및 tracrRNA는 crRNA:tracrRNA 듀플렉스를 형성한다.
상기에서 설명된 바와 같이, CRISPR/Cas 시스템은 다음의 세포 유형중 임의의 것과 함께 큰 표적화 벡터와 복합되어 이용될 수 있다: 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포 또는 CHO 세포.
한 구체예에서, 제 1 발현 구조체와 제 2 발현 구조체는 동일한 플라스미드로부터 발현된다.
한 구체예에서, 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 LTVEC와 함께 도입된다. 한 구체예에서, 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 일정 기간에 걸쳐 LTVEC와 별도로 도입된다.
한 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 구별되는 별개의 표적 좌들의 다중(multiplex) 편집을 위하여 다수의 제 2 구조체와 다수의 LTVEC를 도입시키는 것을 포함한다.
뉴클레아제 물질들의 활성 변이체 및 단편들(가령, 공작된 뉴클레아제 물질)이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 고유 뉴클레아제 물질에 대하여 최소한 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 포함하며, 이때 활성 변이체는 원하는 인지 부위를 절단하는 능력을 유지하며, 따라서 닉 또는 이중-가닥-파괴-유도 활성을 유지한다. 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 임의의 상기 뉴클레아제 물질들은 고유 엔도뉴클레아제 서열로부터 변형될 수 있고, 고유 뉴클레아제 물질에 의해 인지되지 않았던 인지 부위를 인지하고, 이 인지 부위에 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하도록 기획된다. 따라서 일부 구체예들에서, 상기 공작된 뉴클레아제는 대응하는 고유 뉴클레아제 물질 인지 부위와는 상이한 인지 부위에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 유도하기 위한 특이성을 갖는다. 닉 또는 이중-가닥-파괴-유도 활성에 대한 분석은 공지되어 있으며, 인지 부위가 포함된 DNA 기질 상에 엔도뉴클레아제의 전반적인 활성 및 특이성을 일반적으로 측정한다.
상기 뉴클레아제 물질은 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리펩티드는 상기 세포 안으로 직접적으로 도입될 수 있다. 대안으로, 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드가 상기 세포로 도입될 때, 상기 뉴클레아제 물질은 상기 세포 안에서 일시적으로, 조건적으로 또는 구성적으로 발현될 수 있다. 따라서, 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 안에 포함될 수 있고, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 관심대상의 이러한 프로모터는 본 명세서의 도처에서 더 상세하게 논의된다. 대안으로, 상기 뉴클레아제 물질은 뉴클레아제 물질이 인코딩된 또는 포함하는 mRNA로 상기 세포 안으로 도입된다.
한 구체예에서, crRNA 및 tracrRNA는 별도의 RNA 전사체로 발현된다.
특정 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 상기 세포의 게놈에 안정적으로 통합되며, 상기 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 다른 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 상기 삽입 핵산이 포함된 동일한 표적화 벡터 안에 있고, 한편 다른 경우들에서, 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 상기 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터와 별도의 벡터 또는 플라스미드 안에 있다.
상기 뉴클레아제 물질이 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드의 도입을 통하여 세포 안에 제공될 때, 이러한 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 자연적으로 생성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때, 관심 세포 안에서 더 빈번한 용도를 가지는 코돈으로 대체시키기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들면 상기 뉴클레아제 물질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 생성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때, 세균성 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 마우스 세포, 렛 세포, 헴스터 세포 또는 관심 대상의 임의의 다른 숙주 세포를 포함하는, 관심 대상의 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서 더 빈번한 용도를 가지는 코돈으로 대체시키기 위하여 변형될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제 물질은 LTVEC와 함께 도입된다. 한 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제 물질은 일정 기간에 걸쳐 LTVEC와 별도로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제 물질은 LTVEC 전에 도입된다. 한 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제 물질은 LTVEC 도입 후, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 ES 세포로 도입된다.
한 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제 물질은 엔도뉴클레아제가 인코드된 핵산 서열을 포함하는 발현 구조체이며, 이때 상기 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하도록 연계된다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 구성적으로 활성 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 상기 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 세포에서 활성이 있다. 한 구체예에서, 상기 엔도뉴클레아제 물질은 엔도뉴클레아제가 인코드된 mRNA이다.
B. 표적 좌 안으로 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 통합시키는 방법
관심대상의 표적 좌를 변형시키는 방법들이 제공된다. 한 구체예에서, 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 세포 안에 표적 좌는 유전적 변형에 대해 표적화된다. 이러한 방법은 다음을 포함한다: (a) 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 세포 안으로 5' 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 상동성 아암과 3' 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 도입시키고; 그리고 (b) 상기 표적 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 세포를 식별해내고, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있다. 특정 구체예들에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 10 kb이며 및/또는 큰 표적화 벡터가 이용된다.
다른 구체예들에서, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합 크기는 약 10 kb 내지 약 150 kb, 약 10 kb 내지 약 100 kb, 약 10 kb 내지 약 75 kb, 약 20 kb 내지 약 150 kb, 약 20 kb 내지 약 100 kb, 약 20 kb 내지 약 75 kb, 약 30 kb 내지 약 150 kb, 약 30 kb 내지 약 100 kb, 약 30 kb 내지 약 75 kb, 약 40 kb 내지 약 150 kb, 약 40 kb 내지 약 100 kb, 약 40 kb 내지 약 75 kb, 약 50 kb 내지 약 150 kb, 약 50 kb 내지 약 100 kb, 또는 약 50 kb 내지 약 75 kb, 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 약 150 kb이다. 한 구체예에서, 상기 결손의 크기는 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합 크기와 동일하거나 또는 유사하다.
다능성 세포, 예를 들면, 렛 세포는 배아 줄기 세포, 예를 들면, 렛 배아 줄기 세포일 수 있다. 특이적 구체예에서, (a) 상기 렛 ES 세포는 DA 균주 또는 ACI 균주로부터 유도되며; 또는 (b) 상기 렛 ES 세포는 Oct-4, Sox-2, 알칼리 포스파타제, 또는 이의 조합이 포함된 전분화능 표지의 발현을 특징으로 한다. 다른 경우들에 있어서, 이용된 렛 배아 줄기 세포는 2014년 2월 20일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/185,103(본 명세서에 전문이 참고자료에 편입됨)에서 설명된 바와 같은, 렛 ES 세포를 포함한다.
본 명세서에서 제공된 방법들에서 임의의 다능성 또는 비-다능성 세포가 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 다능성 또는 비-다능성 세포는 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 비-인간 포유류, 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 렛 마우스, 인간 또는 헴스터로부터 유래될 수 있다.
본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이, 상기 삽입 핵산은 임의의 핵산 서열일 수 있다. 비-제한적인 구체예들에서, (a) 상기 삽입 핵산은 내생성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 포유류 핵산 서열로 대체를 포함하며; (b) 상기 삽입 핵산은 내생성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산 서열의 결손을 포함하며; (c) 상기 삽입 핵산은 내생성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 핵산 서열의 결손을 포함하며, 이때 상기 결손은 5 kb 내지 200 kb 또는 5 kb 내지 3 Mb (본 명세서의 도처에서 상세하게 논의된 바와 같이) 범위가 되며; (d) 상기 삽입 핵산은 외생성 핵산 서열 (예를 들면, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열포함)의 추가를 포함하고; (e) 상기 삽입 핵산은 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열을 포함하고; (f) 상기 (a)의 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열, 이때 상기 핵산 서열은 인간 핵산 서열이며; (g) 상기 삽입 핵산은 (a)의 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열을 포함하며, 이때 상기 핵산 서열은 인간과 렛 핵산 서열을 포함하는 키메라 핵산 서열이며; (h) 상기 삽입 핵산은 (e)의 외생성 핵산 서열을 포함하며, 이때 상기 삽입 핵산은 약 5 kb 내지 약 200 kb 범위가 되며; (i) 상기 삽입 핵산은 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자를 포함하며; (j) 상기 삽입 핵산은 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포터 유전자를 포함하고; (k) 상기 삽입 핵산은 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 JH 유전자 세그먼트를 포함하며, 이들은 설치류 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계되며; (l) 상기 삽입 핵산은 설치류 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하며; (m) 상기 삽입 핵산은 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Vκ 또는 Vλ 유전자 세그먼트 그리고 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Jκ 또는 Jλ 유전자 세그먼트를 포함하며, 이들은 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계되며; (n) 상기 삽입 핵산은 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하며; (o) (k) 및/또는 (l)의 포유류 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함하고; 또는 (p) (m) 및/또는 (n)의 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 불변 영역 핵산은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 기능적 인간 VH 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 기능적 인간 D 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 기능적 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ 7-3, Vκ 2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 인간 Vκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 인간 Vλ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 인간 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
특정 구체예들에서, 다능성 또는 비-다능성 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 세포에서 표적 좌의 변형 시, 상기 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전된다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 서열은 상기 게놈 안에 통합될 때, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 ApoE 좌의 영역의 유전적 변형을 만들게 되는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이때 ApoE 좌에서 상기 유전적 변형으로 인하여 ApoE 활성의 감소, ApoE 활성의 증가, 또는 ApoE 활성의 조절이 야기된다. 한 구체예에서, ApoE 녹아웃이 생성된다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 서열은 상기 게놈 안에 통합될 때, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간, 비-인간 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 영역의 유전적 변형을 만들게 되는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이때 인터루킨-2 수용체 감마 좌에서 유전적 변형으로 인터루킨-2 수용체 활성의 감소, 인터루킨-2 수용체 감마 활성의 증가, 또는 인터루킨-2 수용체 활성의 조절이 초래된다. 한 구체예에서, 인터루킨-2 수용체 녹아웃이 생성된다.
여전히 또다른 구체예에서, 상기 삽입 핵산 서열은 상기 게놈 안에 통합될 때, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 Rag1 좌, 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 비-인간 포유류, 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 Rag2 좌 및/또는 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 Rag2/Rag1 좌의 영역의 유전적 변형을 만들게 되는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이때 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 Rag1, Rag2 및/또는 Rag2/Rag1 좌에서 유전적 변형에 의해 Rag1, Rag2 또는 Rag1과 Rag2 단백질 활성의 감소, Rag1, Rag2 또는 Rag1과 Rag2 단백질 활성의 증가, 또는 Rag1, Rag2 또는 Rag 1 및 Rag2 단백질 활성의 조절이 초래된다. 한 구체예에서, Rag1, Rag2 또는 Rag2/Rag1 녹아웃이 생성된다.
추가 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌 및/또는 Rag2 좌, 및/또는 Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 부분이 또다른 유기체의 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 대응하는 이종상동성 부분으로 대체를 야기한다.
여전히 다른 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 대체되는 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 부분에 대하여 이의 전체 길이를 통하여 대체되는 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 공유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
주어진 삽입 폴리뉴클레오티드와 대체되는 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 좌의 대응하는 영역은 코딩 영역, 인트론, 엑손, 비해독 영역, 조절 영역, 프로모터, 또는 인헨서 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 더욱이, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 대체되는 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간, 비-인간 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 좌의 영역은 예를 들면, 10-100 뉴클레오티드 길이, 100-500 뉴클레오티드 길이, 500-1 kb 뉴클레오티드 길이, 1 kb 내지 1.5 kb 뉴클레오티드 길이, 1.5 kb 내지 2 kb 뉴클레오티드 길이, 2 kb 내지 2.5 kb 뉴클레오티드 길이, 2.5 kb 내지 3 kb 뉴클레오티드 길이, 3 kb 내지 5 kb 뉴클레오티드 길이, 5 kb 내지 8 kb 뉴클레오티드 길이, 8 kb 내지 10 kb 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상이 포함된, 임의의 원하는 길이가 될 수 있다. 다른 경우들에 있어서, 상기 삽입 또는 대체 크기는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb, 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 2.8 Mb, 약 2.8 Mb 내지 약 3 Mb이다. 다른 구체예들에서, 주어진 삽입 폴리뉴클레오티드 및/또는 대체되는 렛 진핵, 렛이 아닌 진핵, 비-인간 포유류, 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스 또는 헴스터 좌의 영역은 최소한 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 뉴클레오티드 또는 최소한 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb 또는 그 이상이다.
i. 세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 핵산의 표적 좌를 변형시키는 방법들
원핵 세포 안에서 세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간 또는 비-인간 포유류 핵산의 표적 좌를 변형시키는 방법 및 조성물들이 제공된다. 이러한 방법은 표적화 벡터를 만들기 위하여, 진핵, 렛이 아닌 진핵, 포유류, 인간 또는 비-인간 포유류 핵산의 표적 좌를 유전적으로 변형시키기 위하여 원핵 세포 안에서 세균성 상동성 재조합을 이용하는데 용도를 찾는다. 유전적으로 변형된 표적 좌가 포함된 이러한 표적화 벡터는 진핵 세포, 예를 들면, 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 CHO 세포 안으로 도입될 수 있다. "상동성 재조합"은 2개의 DNA 분자들 사이에서 상동성 영역 안에 교차 부위에서 DNA 단편들의 교환을 포함한다. 따라서, "세균성 상동성 재조합" 또는 "BHR"은 세균 안에서 일어나는 상동성 재조합을 포함한다.
세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 CHO 세포로부터 핵산의 표적 좌를 변형시키는 방법들이 제공된다. 상기 방법들은 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 원핵 세포 안으로 도입시키는 것을 포함하며, 이때 상기 원핵 세포는 핵산의 표적 좌를 포함하고, 상기 표적 좌에서 BHR을 중재하는 재조합 효소를 발현시킬 수 있다. 이러한 표적화 벡터는 본 명세서에서 논의된 임의의 큰 표적화 벡터를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 원핵 세포 안으로 다음을 도입시키는 것을 포함한다: (i) 관심 DNA 서열을 갖는 핵산이 포함된 제 1 구조체; (ii) 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 제 2 표적화 구조체, 그리고 (iii) 세균성 상동성 재조합을 중재하는 재조합효소가 인코딩된 제 3 구조체. 한 구체예에서, 제 1, 제 2, 및 제 3 구조체는 일정 시간에 걸쳐 별도로 원핵 세포 안으로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 원핵 세포는 재조합효소가 인코드된 핵산을 포함하며, 이 방법은 제 3 구조체의 도입을 필요로 하지 않는다. 한 구체예에서, 상기 재조합효소는 유도성 프로모터의 조절 하에 발현된다.
한 구체예에서 상기 핵산이 포함된 제 1 구조체는 세균성 인공 염색체 (BAC) 또는 효모 인공 염색체 (YAC)로부터 유도된다. 상기 표적 게놈 좌에서 삽입 핵산이 포함된 원핵 세포가 선별될 수 있다. 이 방법은 원핵 세포 안에서 표적화된 좌에 다중 삽입 핵산이 도입되도록 본 명세서에서 공개된 바와 같이 연속적으로 반복될 수 있다. 일단, 상기 표적 핵산 좌가 원핵 세포 안에서 "구축(built)"되면, 상기 변형된 표적 좌가 포함된 표적화 벡터는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로-제한된 인간 선조 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 섬유아세포, 또는 CHO 세포 안에 표적 게놈 좌로 도입될 수 있다.
표적화 벡터를 회수하는데 바람직한 렛 세포는 2014년 2월 20일자로 제출된 U.S. 출원 14/185,703에 공개되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에서 요약된다. 이들 렛 세포는 시험관에서 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전적 변형 후, 이들의 전분화능을 유지할 수 있고, 생식계열을 통하여 상기 표적화된 유전적 변형을 유전시킬 수 있다.
예를 들면, 전기천공된 다능성 세포는 상기 표적화 벡터가 포함된 약물-저항성 세포의 선별을 위하여 고밀도로 도말된다. 상기 약물 선별 공정은 상기 도말된 세포의 대부분(~99%)을 제거하며, 개별 콜로니를 남겨두며, 이때 콜로니 각각은 단일 세포로부터 유도된 클론이다. 남아있는 세포 중에서, 대부분 세포 (~ 80-100%)는 상기 게놈에서 무작위 위치에 통합된 상기 표적화 벡터 (약물 선별 카세트가 포함된)를 보유한다. 따라서, 상기 콜로니은 개별적으로 떼어내고, 정확한 게놈 위치에서 상기 표적화 벡터를 품고 있는 ES 세포를 식별해내기 위하여 유전자유형분석된다 (가령, 하기에서 설명된 대립유전자의 변형 분석).
유전자형분석(genotyping)을 위하여 고처리량 정량적 분석, 이름하여, 대립유전자의 변형 (MOA) 분석이 이용될 수 있다. 이러한 분석은 유전적 변형 후, 부계 염색체에서 변형된 대립유전자(들)의 대규모 스크리닝(screening)을 허용한다. MOA 분석은 정량적 PCR, 가령, 실시간 PCR (qPCR)을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 분석 기술을 통하여 실행될 수 있다. 예를 들면, 실시간 PCR은 상기 표적 좌를 인지하는 제 1 프라이머 세트와 비-표적화된 참고 좌를 인지하는 제 2 프라이머 세트를 포함한다. 추가적으로, 상기 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인지하는 형광 프로브를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 Invader Probes®를 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 MMP 분석®을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 TaqMan® Molecular Beacon을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 Eclipse™ 프로브 기술을 통하여 실행된다. (예를 들면, US2005/0144655 참고하며, 이의 전문이 참고자료에 편입됨).
표적화된 유전적 변형이 포함된 선별된 다능성 세포 (가령, 비-인간 다능성 세포, 비-인간 ES 세포)는 그 다음 숙주 배아, 예를 들면, 상실배-전(pre-morula) 단계 또는 낭포 단계 배아로 도입될 수 있고, 시조(founder) 비-인간 동물 (F0 동물)을 만들기 위하여 대리모의 자궁 안에 이식된다. 차후, 상기 시조 동물은 예를 들면, 상기 유전적 변형을 위한 F1 자손을 만들기 위하여 야생형 동물로 사육될 수 있다. 이형접합성 F1 동물의 짝짓기는 유전적 변형을 위한 동형접합성 자손을 생산한다. 이형접합성 F1 동물의 짝짓기는 유전적 변형을 위한 동형접합성 자손을 생산한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 상기 표적 좌들의 다양한 유전적 변형은 본 명세서의 도처에서 상세하게 설명된 바와 같이, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 이용하여 실행될 수 있다. 예를 들면, LTVEC는 VELOCIGENE® 유전 공학적 기술 (가령, US 특허 번호 6,586,251 및 Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659, 이들은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입됨)을 이용하여 세균성 인공 염색체(BAC) DNA로부터 유도될 수 있다.
큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 만들기 위하여 세균성 상동성 재조합 (BHR)의 사용은 큰 게놈 DNA 단편을 수용함에 있어서 플라스미드의 제약과, 다능성 또는 비-다능성 세포에서 내생성 좌 안으로 표적화된 변형을 도입함에 있어서 결과되는 낮은 효과를 회피한다. LTVEC를 생성하는데 있어서 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전적 변형이 실행될 수 있다. 원핵 세포에서 생산된 예시적인 LTVEC는 상동성 아암의 측면에 있는, 특이적 게놈 영역에 상보적인 하나 또는 그 이상의 유전적 변형 또는 외생성 핵산(가령, 렛 핵산의 동족체(homolog) 또는 오르소로그(ortholog))와 함께, 게놈 서열을 운반하는 삽입 핵산을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 설명된 다양한 표적화 벡터가 포함된 숙주 원핵 세포가 또한 제공된다. 이러한 원핵 세포는 세균, 이를 테면, 대장균(E. coli )을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한 구체예에서, 숙주 원핵 세포는 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 포함하며, 이때 상기 삽입 핵산은 약 5 kb 내지 약 200 kb 범위가 된다.
상기 숙주 원핵 세포는 재조합효소 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 더 포함할 수 있고 또는 재조합효소 폴리펩티드가 인코드된 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
표적화된 유전적 변형을 만들기 위하여 원핵 세포와 복합되어, 본 명세서에서 설명된 LTVEC를 이용하는 다양한 방법 및 조성물들이 더 제공된다. 이러한 조성물 및 방법들은 본 명세서의 도처에서 논의된다.
세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 핵산의 표적 좌를 변형시키는 방법은 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 원핵 세포 안으로 도입시키는 것을 포함하며, 이때 상기 원핵 세포는 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암에 대응하는 핵산을 포함하고, 상기 원핵 세포는 상기 표적 좌에서 BHR을 중재하는 재조합 효소를 발현시킬 수 있다. 이러한 표적화 벡터는 본 명세서에서 논의된 임의의 큰 표적화 벡터를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본 명세서에서 상세하게 논의되는 LTVEC를 이용할 수 있고, 본 명세서의 도처에서 논의된 바와 같은 CRISPR/Cas 시스템을 더 이용한다.
한 구체예에서, CRISPR/Cas 시스템은 원핵 세포, 이를 테면, 예를 들면, 대장균(E. coli)에서 활성인 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
ii. 다분화능 세포 또는 비-다분화능 세포에서 관심대상의 표적 좌를 변형시키는 방법
표적화된 유전적 변형을 통하여 다능성 세포 또는 비-다능성 세포 안에서 관심대상의 표적 좌를 변형시키는 방법이 더 제공되는데, 이 방법은 (a) 상기 다능성 세포 또는 비-다능성 세포 안으로 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 도입시키고, 이때 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 10 kb이며; 그리고 (b) 상기 관심대상의 표적 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 또는 비-다능성 세포를 식별해내는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 약 16 kb 내지 약 30 kb이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있다. 이러한 표적화 벡터는 본 명세서에서 논의된 임의의 큰 표적화 벡터를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 관심대상의 표적 좌를 변형시키는 방법에 다양한 세포들이 또한 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 세포는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 인간 유도화된 다능성 세포 (iPS) 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 섬유아세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포 또는 CHO 세포이다.
한 측면에서, 표적화된 유전적 변형을 통하여 다능성 세포 안에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 게놈의 최소한 하나의 표적화된 유전적 변형 후, 이의 전분화능을 지속할 수 있고, F1 세대의 생식계열로 상기 표적화된 변형을 유전시킬 수 있는 다능성 세포가 제공되며; (b) 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 상기 다능성 세포 안으로 도입시키고, 이때 LTVEC는 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하고, 이때 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암은 게놈 DNA 단편을 포함하며; 그리고 (c) 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 세포를 식별해낸다.
상기 관심대상의 표적 좌에 통합된 삽입 핵산을 보유하는 세포를 식별해내는데 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 상기 관심대상의 표적 좌에 삽입 핵산으로 삽입으로 "대립유전자의 변형"이 초래된다. 용어 "대립유전자의 변형"과 상기 변형된 대립유전자의 탐지 방법은 본 명세서에서 더 상세하게 논의된다.
한 측면에서, 엔도뉴클레아제-중개된 유전자 표적화를 통하여 비-다능성 세포 또는 다능성 세포에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 유전적으로 변형된 게놈을 F1 세대의 생식계열로 유전시킬 수 있는 단리된 비-다능성 세포 또는 단리된 다능성 세포를 제공하고; (b) 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 엔도뉴클레아제 물질을 도입시키고; 이때 상기 엔도뉴클레아제 물질은 상기 관심 대상의 게놈 좌 안에 위치된 표적 DNA 서열에 닉 또는 이중 가닥 틈을 만들고, 그리고 이때 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포의 상기 표적 DNA 서열에서 닉 또는 이중 가닥 틈은 (i) 닉 또는 이중 가닥 틈의 비-상동성 단부 연결 (NHEJ)-중개된 DNA 복구를 유도하고, 이때 상기 NHEJ-중개된 DNA 복구는 상기 표적 DNA 서열에서 핵산 서열의 삽입 또는 결손이 포함된 돌연변이 대립유전자를 만들고; 또는 (ii) 상동성 재조합-중개된 DNA 복구는 야생형 핵산 서열의 복원을 초래하며; 그리고 (c) 상기 변형된 관심 대상의 게놈 좌를 식별해낸다.
한 측면에서, 단리된 배아 줄기 세포 (ES)에서 뉴클레아제 물질을 통하여 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 유전적으로 변형된 게놈을 F1 세대의 생식계열로 유전시킬 수 있는 단리된 ES 세포를 제공하고; (b) ES 세포 안으로 다음을 도입시키고: (i) LTVEC는 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC), 이때 상기 삽입은 최소한 5 kb인 핵산 서열이며; 그리고 (ii) 엔도뉴클레아제 물질, 이때 상기 엔도뉴클레아제 물질은 상기 관심 대상의 게놈 좌 안에 위치된 표적 DNA 서열에 닉 또는 이중 가닥 틈을 만들고, 그리고 이때 상기 표적 서열은 상기 삽입 핵산에 존재하지 않고; 그리고 (c) 상기 배아 줄기 (ES) 세포에서 상기 표적화된 유전적 변형을 식별해낸다.
한 측면에서, RNA-안내된 게놈 공학을 통하여 비-다능성 세포 또는 다능성 세포에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 유전적으로 변형된 게놈을 F1 세대의 생식계열로 유전시킬 수 있는 비-다능성 세포 또는 다능성 세포를 제공하고; (b) 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 다음을 도입시킨다: (i) 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)-연합된 (Cas) 단백질이 인코드된 제 1 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 제 1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체, (ii) 가이드 RNA (gRNA)에 게놈 표적 서열에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체, 이때 상기 게놈 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 측면에 있다. 임의선택적으로 상기 게놈 표적 서열은 3'단부 상에서 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 측면에 있다. 한 구체예에서, Cas 단백질 및 CRISPR RNA 및/또는 tracrRNA는 자연적으로 함께 생성되지 않는다 (가령, Cas 단백질 및 CRISPR RNA는 자연적으로 함께 생성되지 않는다). 한 구체예에서, 상기 게놈 표적 서열은 상기 뉴클레오티드 서열 GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1 -20GG; 서열 번호: 1)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 표적 서열은 서열 번호: 1을 포함하고, 이때 N은 14 내지 20개의 뉴클레오티드 길이가 된다. 한 구체예에서, gRNA는 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR) RNA (crRNA)를 인코드하는 제 3 핵산 서열과 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인코드하는 제 4 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 발현 시, Cas 단백질 형태 CRISPR-Cas 복합체는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하며, 그리고 CRISPR-Cas 복합체는 관심 대상의 게놈 좌에 위치된 표적 DNA 서열에 닉 또는 이중가닥 틈을 만들고, 그리고 이때 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포안 상기 표적 DNA 서열에서 닉 또는 이중 가닥 틈은 (i) CRISPR-Cas 복합체에 의해 만들어진 닉 또는 이중 가닥 틈의 비-상동성 단부 연결 (NHEJ)-중개된 DNA 복구를 유도하고, 이때 NHEJ는 상기 표적 DNA 서열에서 핵산 서열의 삽입 또는 결손이 포함된 돌연변이 대립유전자를 만들고; 또는 (ii) 상동성 재조합-중개된 DNA 복구는 야생형 핵산 서열의 복원을 초래하며; 그리고 (c) 상기 변형된 상기 관심 대상의 게놈 좌를 식별해된다.
한 측면에서, RNA-안내된 게놈 공학을 통하여 비-다능성 세포 또는 다능성 세포에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 생식계열을 통하여 상기 변형된 게놈을 유전시킬 수 있는 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 다음을 도입시키는 것을 포함한다: (i) 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)-연합된 (Cas) 단백질 또는 Cas 단백질이 인코드된 핵산; 그리고 (ii) gRNA 또는 gRNA인코딩된 DNA, 이때 gRNA는 게놈 표적 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열과 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 포함하며; 이때 상기 게놈 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 측면에 있다.
일부 구체예들에서, Cas 단백질은 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안에 단리된 단백질로 도입될 수 있다. 일부 구체예들에서, Cas 단백질은 이 단백질의 세포 취입을 촉진시키는 세포-침투성 도메인을 더 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, Cas 단백질은 Cas 단백질이 인코드된 메신져 RNA (mRNA) 분자 형태로 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 다른 구체예들에서, Cas 단백질은 Cas 단백질이 인코드된 DNA 분자 형태로 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 예를 들면, Cas 단백질이 인코드된 DNA 분자는 구조체 안에 제공되며, 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 특정 구체예들에서, Cas 단백질이 인코드된 핵산은 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안에서 발현을 위하여 코돈 최적화된다.
일부 구체예들에서, gRNA는 RNA 분자 형태로 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 도입될 수 있다. 예를 들면, gRNA 분자는 시험관에서 전사될 수 있다. 다른 구체예들에서, gRNA는 gRNA가 인코딩된 DNA 분자 형태로 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 gRNA가 인코딩된 분자는 구조체 안에 제공되며, 상기 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포에서 gRNA를 발현시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 다른 구체예들에서, gRNA는 화학적으로 합성될 수 있다.
일부 구체예들에서, gRNA는 융합된 crRNA-tracrRNA 분자 (가령, 단일 전사체) 로써 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 도입될 수 있다. 다른 구체예들에서, gRNA는 별도의 crRNA 및 tracrRNA 분자 (가령, 별도의 전사체)로써 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 도입될 수 있다. 다른 구체예들에서, gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 인코드하는 별도의 DNA 분자로써 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 도입될 수 있다. 예를 들면, crRNA 및 tracrRNA를 인코드하는 별도의 DNA 분자는 별도의 구조체 안에 제공되며, 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 상기 구체예들중 임의의 것에서, 상기 구조체들의 임의의 조합은 별도의 핵산 분자에 있을 수 있거나 또는 단일 핵산 분자에 함께 있을 수 있다.
일부 구체예들에서, Cas 단백질과 gRNA는 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 유사하게, gRNA의 crRNA 및 tracrRNA는 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. gRNA (또는 DNA를 인코딩하는)에 대한 Cas 단백질 (또는 핵산을 인코딩하는)의 비율 및/또는 tracrRNA에 대한 crRNA 비율은 대략 화학량론적일 수 있고, 이들은 RNA-단백질 복합체를 형성할 수 있다.
특정 구체예들에서, Cas 단백질은 gRNA와의 복합체 형태로 비-다능성 세포 또는 상기 다능성 세포 안으로 도입될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 다능성 세포는 유도화된 다능성 줄기 세포 (iPS)다. 한 구체예에서, 상기 다능성 세포는 발생학적으로 제한된 선조 세포다.
다양한 구체예들에 있어서, 선별 표지내 인지 부위에서 닉 또는 이중-가닥 파괴가 존재한다면, 표적화 벡터 (이를 테면 LTVEC)와 상기 표적화된 관심대상의 좌 사이의 재조합 효과 및/또는 빈도가 증가된다. 한 구체예에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다. 또다른 구체예에서, 상기 재조합은 비-상동성 단부 연결에 의한 삽입이다. 다양한 구체예들에서, 닉 또는 이중 가닥 틈 존재하에서, 상기 표적 게놈 좌에서 표적화 벡터 (이를 테면 LTVEC)의 표적화 효과는 닉 또는 이중-가닥 파괴 없는 경우(가령, 동일한 표적화 벡터와 동일한 상동성 아암 그리고 관심 대상의 게놈 좌에서 대응하는 표적 부위들을 이용하지만, 닉 또는 이중 가닥 틈을 만드는 추가된 뉴클레아제 물질이 없는)보다 최소한 약 2-배 더 높고, 최소한 약 3-배 더 높고, 최소한 약 4-배 높다.
한 구체예에서, 상기 표적 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질이다. "이중대립형질"이란 유전자의 양쪽 대립유전자는 상기 표적화된 유전적 변형을 포함한다는 것을 의미한다. 상기 표적화된 유전적 변형은 각 대립유전자에서 동일한 또는 상이할 수 있다. 예를 들면, 이중대립형질 변형은 대응하는 상동성 염색체에서 대응하는 대립유전자에 대해 만들어진 동일한 변형으로부터 기인될 수 있거나, 또는 대응하는 상동성 염색체상에 대응하는 대립유전자에 대하여 만들어진 상이한 변형으로부터 기인될 수 있다. 따라서, 이중대립형질 변형은 예를 들면, 관심 대상의 게놈 좌에서 특이적 변형에 대하여 동형접합성(homozygosity) (가령, 양쪽 대립유전자에서 특이적 변형), 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성(compound heterozygosity) (가령, 하나의 대립유전자에는 특이적 변형을, 그리고 다른 대립유전자는 비활성화 또는 붕괴), 또는 관심 대상의 게놈 좌에서 이형접합성 (가령, 하나의 대립유전자에는 특이적 변형을, 그리고 다른 대립유전자는 상실)을 초래할 수 있다. 특정 구체예들에서, 뉴클레아제 물질과 함께 표적화 벡터 (예를 들면, LTVEC를 포함)의 복합된 사용은 상기 표적화 벡터 단독 사용과 비교하였을 때, 세포에서 상기 관심 대상의 게놈 좌의 이중대립형질 표적화된 유전적 변형을 초래한다. 상기 표적화 벡터가 뉴클레아제 물질과 병행이용될 때, 이중대립형질 표적화 효과는 상기 표적화 벡터가 단독으로 이용될 경우와 비교하였을 때, 2-배, 최소한 3개의-배, 최소한 4-배 또는 그 이상 증가된다. 추가 구체예들에서, 상기 이중대립형질 표적화 효과는 최소한 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 또는 더 높다.
상기 표적 좌에서 이중대립형질 표적화된 유전적 변형은 동형접합성으로 유전적으로 변형된 세포를 초래한다. "동형접합성"이란 상기 표적 좌의 양쪽 대립유전자 (가령, 양쪽 상동성 염색체상의 대립유전자)들이 동일한 방식으로 변형되었다는 것을 의미한다. 특정 구체예들에서, 뉴클레아제 물질과 함께 표적화 벡터 (예를 들면, LTVEC를 포함)의 복합된 사용은 세포에서 상기 관심 대상의 게놈 좌의 이중대립형질 표적화된 동형접합성 유전적 변형을 초래한다. 한 구체예에서, 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 (가령, 제 1 및 제 2 상동성 염색체의 쌍)의 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 2개의 상동성 염색체 (가령, 제 1 및 제 2 상동성 염색체의 쌍)의 관심 대상의 게놈 좌에서 삽입 핵산의 삽입을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 삽입 핵산은 양쪽 상동성 염색체의 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열을 대체한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 상기 결손된 내생성 핵산 서열에 대하여 상동성 또는 이종상동성이다.
한 구체예에서, 상기 표적 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 반접합성 유전적으로 변형된 세포를 초래한다. "반접합성"이란 표적 좌의 오직 하나의 대립유전자 (가령, 2개의 상동성 염색체중 하나에 있는 대립유전자)만 존재하거나, 또는 오직 하나의 대립유전자만 발현되고 기능을 할 수 있음을 의미한다. 다른 구체예들에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 더욱 일반적으로 컴파운드 이형접합성을 초래한다. 컴파운드 이형접합성은 상기 표적 좌의 양쪽 대립유전자 (가령, 양쪽 상동성 염색체 상의 대립유전자들)들이 변형되었는지만, 상이한 방식으로 변형된 상황 (가령, 하나의 대립유전자에서 삽입과, 다른 대립유전자의 비활성화 또는 붕괴)을 포함한다. 특정 구체예들에서, 뉴클레아제 물질과 함께 표적화 벡터 (예를 들면, LTVEC를 포함)의 복합된 사용은 세포에서 상기 관심 대상의 게놈 좌의 반접합성 표적화된 유전적 변형을 초래한다. 특정 구체예들에서, 뉴클레아제 물질과 함께 표적화 벡터 (예를 들면, LTVEC를 포함)의 복합된 사용은 세포에서 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성을 만드는 표적화된 유전적 변형을 초래한다. 한 구체예에서, 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 삽입 핵산을 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다: (1) 2개의 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 삽입 핵산의 삽입과 제 2 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴. 상기 제 1 염색체는 2개의 상동성 염색체의 첫번째일 수 있고, 제 2 염색체는 2개의 상동성 염색체의 두번째일 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 표적화된 변형은 다음을 포함한다: (1) 제 1 상동성 염색체에서 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌 안으로 상기 삽입 핵산의 삽입; 그리고 (2) 제 2 상동성 염색체에서 상기 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴 예를 들면, 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 뉴클레아제 물질에 의해 만들어진 이중-가닥 파괴가 비-상동성 단부 연결 (NHEJ)-중개된 DNA 복구에 의해 복구될 때, 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 핵산 서열의 삽입 또는 결손이 포함된 돌연변이 대립유전자가 생성되고, 이로 인하여 상기 관심 대상의 게놈 좌가 붕괴되어, 내생성 핵산 서열의 붕괴가 일어난다. 붕괴의 예로는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 조절 요소 (가령, 프로모터 또는 인헨서)의 변경, 미스센스 돌연변이, 절두 돌연변이, 무효 돌연변이, 또는 소수의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결손(가령, 틀이동(frameshift) 돌연변이를 일으키는)을 포함한다. 붕괴의 또다른 예는 넌센스 돌연변이다. 붕괴는 대립유전자의 비활성화 (가령, 기능의 상실) 또는 대립유전자의 상실을 초래할 수 있다.
동형접합성 및 반접합성 표적화된 유전적 변형은 이러한 돌연변이가 포함된 유전적으로 변형된 세포들이 하기에서 논의되는 바와 같이 유전적으로 변형된 동물을 생성하는데 이용될 때, 의도된 표적화된 유전적 변형에 대하여 비-이형접합성 (가령, 동형접합성 또는 반접합성)인 유전적으로 변형된 동물을 만들기 위한 공정은 더 효과적이며, 번식 단계가 더 적게 요구되기 때문에 시간 소모가 작아서 유익하다. 컴파운드 이형접합성 또는 반접합성(가령, 하나의 대립유전자에는 삽입, 다른 대립유전자의 비활성화, 붕괴, 또는 상실)을 야기하는 표적화된 유전자 변형이 동일한 이유로 유익할 수 있다.
뉴클레아제 물질을 통하여 게놈 좌를 변형시키기 위하여 상기 본 명세서에서 설명된 다양한 방법들중 임의의 것에 다양한 세포 유형이 또한 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 세포는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 인간 유도화된 다능성 세포 (iPS) 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 섬유아세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포 또는 CHO 세포이다.
인터루킨-2 수용체 감마 좌 또는 ApoE 좌 안에 표적화된 유전적 변형을 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 포함된 조성물이 제공된다. 본 명세서에서 제공되는 다양한 방법들과 조성물은 이들 변형된 좌들이 생식계열을 통하여 유전되는 것을 허용한다.
특정 구체예들에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 또는 유전적으로 변형된 다능성 또는 비-다능성 세포는 인터루킨-2 감마 수용체 좌에 표적화된 유전적 변형을 갖는 또는 ApoE 좌에 표적화된 유전적 변형을 갖는 게놈 좌를 포함하며, 이때 인터루킨-2 감마 수용체 게놈 좌 또는 ApoE 좌는 다음을 포함한다: (i) 인터루킨-2 감마 수용체 좌의 최소한 한 부분 또는 ApoE 좌의 최소한 한 부분의 결손; (ii) ApoE 좌 또는 인터루킨-2 감마 수용체 좌 안으로 이종성 핵산 서열의 삽입; 또는 (iii) 이의 조합, 이때 상기 유전적으로 변형된 게놈 좌는 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
이러한 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 허용하고, 그리고 이러한 유전적으로 변형된 다능성 세포가 만들어지는 것을 허용하는 방법들이 더 제공된다. 이러한 방법들은 표적화된 유전적 변형을 통하여 다능성 세포에서 ApoE 게놈 좌 또는 인터루킨-2 감마 수용체 좌를 변형시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) 상기 다능성 세포 안으로 ApoE 좌에 대하여 5' 상동성 아암 측면에 그리고 ApoE 좌에 대하여 3' 상동성 아암 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 도입시키고, (b) ApoE 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 세포를 식별해내는 것을 포함하며, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
추가 방법들은 (a) 상기 다능성 세포 안으로 인터루킨-2 수용체 감마 좌에 대하여 5' 상동성 아암의 측면에, 그리고 인터루킨-2 수용체 감마 좌에 대하여 3' 상동성 아암 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화된 벡터를 도입시키고, (b)인터루킨-2 수용체 감마 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 세포를 식별해내는 것을 포함하며, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
iii. 표적화된 좌에 관심대상의 다중 폴리뉴클레오티드를 통합시키는 방법.
본 명세서에서 제공되는 다양한 방법 및 조성물은 주어진 표적 좌에 다수의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 표적화된 통합을 허용한다. 상기에서 제시하는 다양한 방법은 주어진 표적화된 좌 안으로 임의의 갯수의 삽입 핵산의 표적화된 통합을 위하여 순차적으로 반복될 수 있다. 따라서, 상기 다양한 방법은 상기 표적 좌 안으로 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 삽입 핵산의 삽입을 제공한다. 특정 구체예들에서, 이러한 순차적 타일링(tiling) 방법은 표적화된 좌 안으로 진핵 세포, 예를 들면, 렛이 아닌 진핵 세포, 포유류 세포 (가령, 인간, 비-인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스, 원숭이, 렛 헴스터, 길들여진 포유류 또는 농사용 동물)의 큰 게놈 영역의 재구성을 허용한다. 이러한 경우들에서, 코딩 영역과 넌-코딩 영역이 모두 포함된 게놈 영역의 이전 및 재구성은 주어진 영역은 코딩 영역, 넌-코딩 영역이 최소한 일부분 유지됨으로써 보존되고, 그리고 고유 게놈 영역 안에서 발견되는 복제 수 변이의 복합을 허용한다. 따라서, 상기 다양한 방법이 제공되는데, 예를 들면, 임의의 진핵 세포, 임의의 렛이 아닌 진핵 세포, 임의의 포유류 세포 또는 관심 대상 동물 안에, 구체적으로 원핵 숙주 세포 또는 비-다능성 세포, 다능성 세포 또는 ES 세포 안에 "이종성" 또는 "외생성" 게놈 영역을 만드는 방법들이 제공된다. 한 가지 비-제한적인 예에서, 비-인간 동물 (가령, 렛 안에) 안에 "인간화된" 게놈 영역이 생성된다. 임의의 세포 안에 게놈 영역을 만드는 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 특정 구체예들에서, 상기 세포는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 인간 유도화된 다능성 세포 (iPS) 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 섬유아세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포 또는 CHO 세포다.
3. 인간화된 게놈 좌
인간화된 게놈 좌가 포함된 조성물과 다양한 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "인간화된" 게놈 좌란 최소한 하나의 인간 핵산 서열이 포함된 비-인간 게놈 영역을 의미한다. 상기 인간화된 게놈 좌는 유기체 내에 삽입된 인간 DNA 서열을 갖는 임의의 유기체로부터 기인된 DNA 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 유기체는 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 비-인간 포유류, 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 렛 마우스 또는 헴스터다. 예를 들면, "인간화된 렛 좌"는 유기체 안에 삽입된 인간 DNA 서열을 갖는 렛의 DNA 영역을 포함한다.
상기 인간 DNA 서열은 자연적으로 생성되는 인간 DNA 서열이거나 또는 고유한 형태에서 변형된 것일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 인간 DNA는 고유 인간 서열과 최소한 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 인간 서열이 고유 인간 서열이 아닌 경우, 이 서열은 이종상동성 비-인간 서열과 비교하여, 고유 인간 서열에 대해 최소한 더 큰 서열 동일성을 갖는다. 더욱이, 상기 인간 DNA 서열은 cDNA, 인간 게놈 DNA의 영역, 넌-코딩 조절 영역, 또는 인간 DNA의 코딩, 게놈, 또는 조절 영역의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 비-인간 좌 안으로 삽입된 인간 DNA 서열 삽입은 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이, 임의의 상기 삽입 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 인간 DNA 서열은 비-인간 표적 좌에 대하여 이종상동성이며, 한편 다른 경우들에서, 상기 인간 DNA 서열은 비-인간 표적 좌에 대하여 상동성이다.
한 구체예에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 삽입, 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로의 대체가 된다. 한 구체예에서, 상기 표적화된 유전적 변형은 대응하는 비-인간 핵산 서열을 포함하는 내생성 좌에서 내생성 핵산 서열의 삽입 또는 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로의 대체를 포함한다.
인간화된 좌를 만드는 방법은 핵산이 포함된 표적 좌 안으로 인간 핵산 서열을 도입시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 비-인간 동물을 만드는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 비-인간 다능성 세포 또는 비-다능성 세포의 게놈은 인간 핵산 서열이 포함된 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터로 변형시켜, 공유 세포를 만들고; (b) 상기 공여 세포를 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (c) 대리모에게 숙주 배아를 임신시키고; 이때 대리모는 상기 인간 핵산 서열이 포함된 자손을 생산한다. 특정 구체예들에서, 상기 인간화된 좌는 생식계열을 통하여 유전될 수 있다. 추가 구체예에서, 상기 표적화 벡터는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 포함하고, 인간 핵산 서열이 포함된 삽입 핵산은 최소한 5 kb이다.
다른 방법들에 있어서, 상기 인간화된 게놈 좌는 세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 핵산의 표적 좌를 변형시켜 만들어진다. 상기 방법은 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 원핵 세포 안으로 도입시키는 것을 포함하며, 이때 상기 삽입 핵산은 인간 핵산 서열을 포함하고, 그리고 이때 상기 원핵 세포는 핵산을 포함하고, 상기 표적 좌에서 BHR을 중재하는 재조합 효소를 발현시킬 수 있다.
상기 인간화된 게놈 좌는 (a) 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열의 삽입; (b) 내생성 핵산 서열을 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 대체, 또는 (c) 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 인간화된 게놈 좌는 생식계열을 통하여 유전될 수 있다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 인간 이종상동성 서열은 비-인간 좌에서 발견되는 대응하는 서열을 대체한다.
본 명세서에서 제공되는 방법들과 조성물에 임의의 인간 핵산 서열이 이용될 수 있다. 상기 방법에서 이용될 수 있는 인간 핵산 서열의 비-제한적인 예들은 본 명세서의 도처에서 상세하게 논의된다.
관심대상의 좌 안으로 삽입되는 인간 핵산 서열은 임의의 크기일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 인간 핵산 서열은 약 500개 뉴클레오티드 내지 약 200 kb, 약 500개 뉴클레오티드 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb 범위 일 수 있다. 특이적 구체예에서, 상기 인간 핵산 서열은 최소한 5 kb이다.
한 구체예에서, 게놈 좌가 제공되는데, 이때 상기 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열은 (a) 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 JH 유전자 세그먼트, 이들은 포유류 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계되며; (b) 포유류 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 중쇄 가변 영역 핵산 서열; (c) 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Vκ 또는 Vλ 유전자 세그먼트 그리고 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Jκ 또는 Jλ 유전자 세그먼트, 이들은 포유류, 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계되며; 또는 (d) 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다.
또다른 구체예에서, 게놈 좌가 제공되는데, 이때 (a) 상기 포유류 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합이며; 또는 (b) 상기 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합이다.
특이적 구체예에서, 게놈 좌가 제공되는데, 이때 상기 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 선별된 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 이의 조합으로부터 선별되거나, 또는 이를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH 3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 기능적 인간 VH 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 기능적 인간 D 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 및/또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 기능적 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ 7-3, Vκ 2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 인간 Vκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 인간 Vλ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, 또는 이의 조합이 포함된, 하나 또는 그 이상의 인간 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
여전히 또다른 구체예에서, 인간 인터루킨-2 수용체 (IL2R) 핵산 서열 또는 변이체 또는 이의 단편이 포함된 인간화된 게놈 좌를 포함하는 게놈 좌가 제공된다. 특정 구체예들에서, IL2R 핵산 서열은 인터루킨-2 수용체 알파, 인터루킨-2 수용체 베타, 또는 인터루킨-2 수용체 감마 핵산 서열 또는 변이체 또는 이의 단편들을 포함한다.
추가 구체예들에서, 게놈 좌는 대응하는 비-인간 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 대응하는 상동성 또는 이종상동성 부분을 대체하는, 상기 인간 ApoE 좌, 상기 인간 인터루킨-2 수용체 감마 좌, 인간 Rag2 좌, 인간 Rag1 좌 및/또는 인간 Rag2/Rag1 좌의 일부분을 포함하는 인간화된 게놈좌를 포함한다. 한 구체예에서, IL-2Rg의 비-인간 엑토-도메인은 인간 IL-2Rg의 엑토-도메인으로 대체되며, 이 분자의 나머지 부분은 상기 비-인간으로부터 유래된다.
또다른 구체예에서, 인간화된 게놈 좌가 포함된 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 이러한 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 (a) 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열의 삽입; (b) 내생성 게놈 좌에서 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 대체; 또는 (c) 이의 조합을 포함하며, 이때 상기 인간화된 게놈 좌는 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
본 명세서에서 제공되고, 상기에서 설명된 임의의 상기 다양한 인간화된 게놈 좌들이 포함된, 비-인간 동물)을 포함하는 유전적으로 변형된 동물이 또한 제공된다.
4. 관심대상의 폴리뉴클레오티드
임의의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드가 상기 다양한 삽입 핵산 안에 포함될 수 있으며, 이로 인하여 상기 표적 좌에 통합될 수 있다. 본 명세서에 공개된 방법들은 상기 표적화된 게놈 좌 안에 통합되는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 관심 대상 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 표적 게놈 좌에 통합될 때 상기 삽입 핵산 내의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 상기 세포로 하나 또는 그 이상의 유전적 변형을 유도할 수 있다. 상기 유전적 변형은 상기 표적 게놈 좌 안에 내생성 핵산 서열의 결손 및/또는 외생성 또는 이종성 또는 이종상동성 폴리뉴클레오티드의 추가를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 표적 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열이 외생성 관심 대상의 폴리뉴클레오티드로 대체되는 것을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 방법들은 녹아웃, 결손, 삽입, 대체 ("녹-인"), 점 돌연변이, 도메인 스왑, 엑손 스왑, 인트론 스왑, 조절 서열 스왑, 유전자 스왑, 또는 이의 조합이 포함된 유전적 변형을 허용한다. 이러한 변형은 상기 표적 게놈 좌 안으로 삽입 핵산의 제 1 차, 제 2 차, 제 3 차, 제 4 차, 제 5 차, 제 6 차, 제 7 차, 또는 임의의 후속적 삽입 핵산의 통합시에 발생될 수 있다.
상기 삽입 핵산내의 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 대하여 고유한 서열을 포함할 수 있고; 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 대하여 이종성일 수 있고; 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 대하여 외생성성일 수 있고; 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포에 대하여 이종상동성일 수 있고; 또는 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 이것이 도입되는 세포가 아닌 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 표적 좌에 삽입되는 서열이 언급될 때, "고유(native)"한 이란 상기 표적 좌를 갖는 세포에 있어서 고유한 서열 또는 상기 표적 좌가 유도된 세포 (가령, 렛으로부터 유도된)에 있어서 고유한 서열이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 서열과 관련하여 "이종성(heterologous)"이란 이질 종으로부터 유래된 서열; 또는 동일한 종인 경우 조성물에서 및/또는 게놈 좌에서 정교한 인간의 중재에 의하여 이의 고유한 형태와 실질적으로 상이한 또는 변형된 서열을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 서열과 관련하여 "외생성(exogenous)"이란 이질 종으로부터 유래된 서열을 포함한다. 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 비-인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 헴스터, 마우스, 렛 인간, 원숭이, 농사용 포유류 또는 비-농사용 포유류가 포함되나, 이에 국한되지 않는 관심 대상의 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 코딩 영역, 넌-코딩 영역, 조절 영역, 또는 게놈 DNA를 더 포함할 수 있다. 따라서, 제 1 차, 제 2 차, 제 3 차, 제 4 차, 제 5 차, 제 6 차, 제 7 차, 또는 임의의 후속적 삽입 핵산은 이러한 서열을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 마우스 핵산 서열, 인간 핵산, 비-인간 핵산, 진핵 핵산, 렛이 아닌 진핵 핵산, 비-인간 포유류 핵산, 포유류 핵산, 설치류 핵산, 렛이 아닌 설치류 핵산, 렛 핵산, 헴스터 핵산, 원숭이 핵산, 농사용 포유류 핵산, 또는 비-농사용 포유류 핵산에 대하여 고유하다. 여전히 추가 구체예들에서, 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 게놈 핵산의 단편의 단편이다. 한 구체예에서, 상기 게놈 핵산은 마우스 게놈 핵산, 인간 게놈 핵산, 비-인간 핵산, 진핵 핵산, 렛이 아닌 진핵 핵산, 비-인간 포유류 핵산, 포유류 핵산, 설치류 핵산, 렛이 아닌 설치류 핵산, 렛 핵산, 헴스터 핵산, 원숭이 핵산, 농사용 포유류 핵산 또는 비-농사용 포유류 핵산 또는 이의 조합이다.
한 구체예에서, 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 상기에서 설명된 바와 같이 약 500개 뉴클레오티드 내지 약 200 kb 범위일 수 있다. 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 약 500개 뉴클레오티드 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위일 수 있다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 삽입된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 인코드할 수 있고, miRNA를 인코드할 수 있거나, 또는 이 뉴클레오티드는 임의의 조절 영역 또는 넌-코딩 영역, 예를 들면, 조절 서열, 프로모터 서열, 인헨서 서열, 전사 억제물질-결합 서열, 또는 비-단백질-코딩 서열의 결손이 포함된 관심대상의 임의의 조절 영역 또는 넌-코딩 영역을 포함할 수 있지만, 단백질-코딩 서열의 결손을 포함하지는 않는다. 추가적으로, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 삽입된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨계, 생식계, 또는 이의 조합에서 발현되는 단백질을 인코드할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 삽입된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 골수 또는 골수-유도된 세포에서 발현되는 단백질을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 비장 세포에서 발현되는 단백질을 인코드한다. 여전히 추가 구체예들에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 삽입된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 B 세포에서 발현되는 단백질을 인코드하고, 미성숙 B 세포에서 발현되는 단백질을 인코드하고 또는 성숙한 B 세포에서 발현되는 단백질을 인코드한다.
상기 삽입 핵산 안에 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 ApoE 좌, Il2rg 좌, Rag1 좌, Rag2 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부분을 포함할 수 있다. 주어진 좌들의 이러한 부분들은 본 명세서의 도처에서 논의되며, 이용될 수 있는 관심대상의 임의의 유기체로부터 유래된 다양한 상동성 및 이종상동성 영역들이다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 삽입된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 면역글로블린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열이 인코드된 게놈 핵산 서열을 포함한다. 구절 "중쇄", 또는 "면역글로블린 중쇄"는 본 명세서의 도처에서 설명된다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열이 인코드된 게놈 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 중쇄 JH 유전자 세그먼트를 포함하며, 이들은포유류 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 한 구체예에서, 상기 게놈 핵산 서열은 포유류 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Vκ 또는 Vλ 유전자 세그먼트 그리고 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Jκ 또는 Jλ 유전자 세그먼트를 포함하며, 이들은 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 한 구체예에서, 상기 게놈 핵산 서열은 포유류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 불변 영역 핵산은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 선별된 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 이의 조합으로부터 선별되거나, 또는 이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1-힌지-CH2-CH3을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 면역글로블린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 인코드된 게놈 핵산 서열을 포함한다. "경쇄"는 임의의 유기체의 면역글로블린 경쇄 서열을 포함하며, 그리고 본 명세서의 도처에서 설명된다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 인간 면역글로블린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 인코드된 게놈 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 게놈 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Vκ 또는 Vλ 유전자 세그먼트 및 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 Jκ 또는 Jλ 유전자 세그먼트를 포함하며, 이들은 설치류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 한 구체예에서, 상기 게놈 핵산 서열은 설치류 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 재배열된 인간 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 면역글로블린 λ 또는 κ 경쇄 불변 영역 핵산은 렛 불변 영역 핵산 서열, 인간 불변 영역 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함한다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 세포외 단백질 또는 수용체용 리간드를 인코드할 수 있다. 특정 구체예들에서, 인코드된 리간드는 사이토킨이다. 관심대상의 사이토킨은 CCL, CXCL, CX3CL, 및/또는 XCL로부터 선별된 또는 이를 포함하는 케모킨을 포함한다. 상기 사이토킨은 종양 괴사 인자 (TNF)를 또한 포함할 수 있다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 사이토킨은 인터루킨 (IL)이다. 한 구체예에서, 인터루킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, 및/또는 IL-36로부터 선별되거나 또는 이를 포함한다. 한 구체예에서, 인터루킨은 IL-2이다. 특정 구체예들에서, 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 이러한 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 인간으로부터 유래되며, 그리고 더욱 특이적인 구체예들에서, 인간 게놈 서열을 포함할 수 있다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 아포리포단백질 E (ApoE)를 인코드할 수 있다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 세포질 단백질 또는 막 단백질을 인코드할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 막 단백질은 수용체, 이를 테면, 사이토킨 수용체, 인터루킨 수용체, 인터루킨 2 수용체-알파, 인터루킨-2 수용체 베타, 인터루킨-2 수용체 감마 또는 수용체 티로신 키나제다. 다른 경우들에 있어서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 상기 표적 좌의 이종상동성 또는 상동성 영역을 포함할 수 있다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 T 세포 수용체 알파가 포함된 T 세포 수용체의 최소한 영역이 인코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 방법들에서 각각의 상기 삽입 핵산은 T 세포 수용체 좌의 게놈 영역 (가령, T 세포 수용체 알파 좌)을 포함하고, 상기 게놈 T 세포 수용체 좌의 부분 또는 전체가 상기 표적 좌에 통합되었다. 이러한 삽입 핵산은 최소한 하나 또는 그 이상의 가변 세그먼트 또는 T 세포 수용체 좌(가령, T 세포 수용체 알파 좌)의 연결 세그먼트를 포함할 수 있다. 여전히 추가 구체예들에서, T 세포 수용체의 영역이 인코딩된 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 포유류, 비-인간 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스, 렛 인간, 원숭이, 헴스터, 농사용 포유류 또는 길들여진 포유류의 돌연변이 단백질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 유래될 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 핵 단백질을 인코드한다. 한 구체예에서, 상기 핵 단백질은 핵 수용체다. 특정 구체예들에서, 이러한 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 인간으로부터 유래되며, 그리고 더욱 특이적인 구체예들에서, 인간 게놈 서열을 포함할 수 있다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열 안에 유전적 변형을 포함할 수 있다. 이러한 유전적 변형은 코딩 서열의 결손 돌연변이 또는 2개의 코딩 서열의 융합이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 돌연변이 단백질, 예를 들면, 인간 돌연변이 단백질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 돌연변이 단백질은 변경된 결합 특징, 변경된 국소화, 변경된 발현, 및/또는 변경된 발현 패턴에 의해 특징화된다. 한 구체예에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 신경학적 질환의 대립유전자, 심혈관 질환의 대립유전자, 신장 질환의 대립유전자, 근육 질환의 대립유전자, 혈액 질환의 대립유전자, 암-유발 유전자의 대립유전자, 또는 면역계 질환의 대립유전자가 포함된, 최소한 하나의 질환 대립유전자를 포함한다. 이러한 경우들에서, 상기 질환 대립유전자는 우성 대립유전자 또는 상기 질환 대립유전자는 열성 대립유전자일 수 있다. 더욱이, 상기 질환 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP) 대립유전자를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이 단백질이 인코딩된 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 포유류, 비-인간 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스, 렛 인간, 헴스터, 원숭이, 농사용 포유류 또는 길들여진 포유류가 포함되나, 이에 국한되지 않는 임의의 유기체의 돌연변이 단백질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 유래될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 변경된 결합 특징, 변경된 국소화, 변경된 발현, 및/또는 변경된 발현 패턴을 가진 단백질의 돌연변이 형태를 만든다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 ApoE 좌, 예를 들면, 상기 렛 ApoE 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들고, 이때 ApoE 좌에서 상기 유전적 변형으로 ApoE 활성의 감소가 초래된다. 한 구체예에서, ApoE 녹아웃이 생성된다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 Rag1 좌, 예를 들면, 상기 렛 Rag1 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들고, 이때 Rag1 좌에서 상기 유전적 변형으로 Rag1 활성의 감소가 초래된다. 한 구체예에서, Rag1 녹아웃이 생성된다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 Rag2 좌, 예를 들면, 상기 렛 Rag2 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들고, 이때 Rag2 좌에서 상기 유전적 변형으로 Rag2 활성의 감소가 초래된다. 한 구체예에서, Rag2 녹아웃이 생성된다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 Rag1/Rag2 좌, 예를 들면, 상기 렛 Rag1/Rag2 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들고, 이때 Rag1/Rag2 좌에서 상기 유전적 변형으로 Rag1 활성의 감소와 Rag2 활성의 감소가 초래된다. 한 구체예에서, Rag1/Rag2 녹아웃이 생성된다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들고, 예를 들면, 상기 렛 인터루킨-2 수용체 감마 좌, 이때 인터루킨-2 수용체 감마 좌에서 상기 유전적 변형으로 인터루킨-2 수용체 감마의 감소가 초래된다. 한 구체예에서, 인터루킨-2 수용체 감마 녹아웃이 생성된다.
본 명세서의 도처에서 논의되는 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 추가 구체예들은 하나 이상의 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌, 예를 들면, 상기 렛 ApoE 좌, 상기 렛 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌를 포함하는데, 이들은 중 하나 이상은 상기 렛 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 일부분이 또다른 유기체의 ApoE 좌, 인터루킨-2 수용체 감마 좌, Rag2 좌, Rag1 좌 및/또는 Rag2/Rag1 좌의 대응하는 이종상동성 부분으로 대체된다.
한 구체예에서, 다중 유전적 변형이 생성된다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만들고, 예를 들면, 상기 렛 인터루킨-2 수용체 감마 좌, 이때 인터루킨-2 수용체 감마 좌에서 상기 유전적 변형으로 인터루킨-2 수용체 감마의 감소가 초래되며, 제 2 유전적 변형은 상기 렛 Rag2 좌의 영역의 결손, 추가, 대체 또는 이의 조합을 만드는데, 이때 Rag2 좌에서 상기 유전적 변형으로 Rag2 활성의 감소가 초래된다. 한 구체예에서, 인터루킨-2 수용체 감마/Rag2 녹아웃이 생성된다. 이러한 렛은 SCID 표현형을 갖는다.
한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨계, 생식계, 또는 이의 조합에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 포유류 핵산은 골수 또는 골수-유도된 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 비장 세포에서 발현되는 단백질이 인코드된 게놈 좌를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 마우스 게놈 DNA 서열, 렛 게놈 DNA 서열, 인간 게놈 DNA 서열, 또는 이의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 렛과 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 마우스 및 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 마우스 및 렛 게놈 DNA 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 게놈 좌는 임의의 순서로, 렛 마우스, 및 인간 게놈 DNA 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 삽입 핵산은 유전자의 코딩 서열에 유전적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 코딩 서열의 결손 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 2개의 내생성 코딩 서열의 융합을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 비-단백질-코딩 서열의 결손을 포함하지만, 그러나 단백질-코딩 서열의 결손은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 서열의 결손은 조절 요소의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터의 추가를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 프로모터 또는 조절 요소의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조절 요소는 인헨서다. 한 구체예에서, 상기 조절 요소는 전사 억제물질-결합 요소다.
한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 돌연변이 인간 단백질이 인코드된 인간 핵산 서열의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유전적 변형은 인간 유전자의 최소한 하나의 인간 질환 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 신경학적 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 심혈관 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 신장 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 근육 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 혈액 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 암이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환은 면역계 질환이다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환 대립유전자는 우성 대립유전자다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환 대립유전자는 열성 대립유전자다. 한 구체예에서, 상기 인간 질환 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP) 대립유전자를 포함한다.
상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 프로모터 서열, 인헨서 서열, 또는 전사 억제물질-결합 서열이 포함된 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 삽입 핵산 안에 및/또는 상기 표적 좌에 통합된 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 비-단백질-코딩 서열의 결손을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하지만, 그러나 단백질-코딩 서열의 결손은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 서열의 결손은 조절 서열의 결손을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 조절 요소의 결손은 프로모터 서열의 결손을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조절 요소의 결손은 인헨서 서열의 결손을 포함한다. 이러한 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 포유류, 비-인간 포유류, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 마우스, 렛 인간, 원숭이, 농사용 포유류 또는 길들여진 포유류가 포함되나, 이에 국한죄지 않는 임의의 유기체의 돌연변이 단백질이 인코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 유래될 수 있다.
5. 서열의 도입 방법 및 유전자삽입 동물을 만드는 방법.
이상기에서 서술된 바와 같이, 표적 좌 안으로 하나 또는 그 이상의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 표적화된 통합을 허용하기 위한 방법 및 조성물들이 제공된다. 이러한 시스템은 다양한 성분들을 이용하며, 참고의 용이성을 위하여, 본 명세서에서 용어 "표적화된 통합 시스템"은 통합 이벤트에 요구되는 모든 성분들을 일반적으로 포함한다 (가령, 비-제한적인 실시예들에서, 상기 다양한 뉴클레아제 물질들, 인지 부위들, 삽입 DNA 폴리뉴클레오티드, 표적화 벡터, 표적 게놈 좌, 및/또는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드).
본 명세서에서 제공된 방법들은 세포 안으로 상기 표적화된 게놈 통합 시스템의 다양한 성분들이 포함된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 구조체를 도입시키는 것을 포함한다. "도입하다(Introducing)"란 한 서열이 세포의 내부에 접근할 수 있는 방식으로 상기 세포에 이 서열(폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)을 제공한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 제공된 방법들은 상기 세포 안으로 상기 표적화된 게놈 통합 시스템의 임의의 성분을 도입시키기 위한 특정 방법에 의존적이지 않으며, 오직 해당 폴리뉴클레오티드가 최소한 하나의 세포의 내부에 접근하는데 달려있다. 폴리뉴클레오티드를 다양한 세포 유형 안으로 도입시키는 방법은 당분야에 공지되어 있는데, 안정적인 트랜스펙션 방법, 일시적인 트랜스펙션 방법, 및 바이러스-중개된 방법이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
임의의 유기체에서 유래된 임의의 세포가 상기 본 명세서에서 제공된 방법들에서 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서 상기 세포는 진핵생물, 렛이 아닌 진핵생물, 포유류, 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 렛이 아닌 설치류, 렛 마우스 또는 헴스터의 세포다. 특정 구체예들에서, 상기 세포는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 다능성 세포, 비-다능성 세포, 비-인간 다능성 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 인간 유도화된 다능성 세포 (iPS) 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 섬유아세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포 또는 CHO 세포다.
일부 구체예들에서, 상기 방법 및 조성물에서 이용된 세포는 이들의 게놈 안에 안정적으로 통합된 DNA 구조체를 갖는다. "안정적으로 통합된" 또는 "안정적으로 도입된"이란 상기 뉴클레오티드 서열이 상기 세포의 게놈 안으로 통합되고, 이의 자손으로 유전될 수 있도록 상기 세포 안으로 폴리뉴클레오티드가 통합된다는 것을 의미한다. DNA 구조체의 안정적인 통합 또는 상기 표적화된 게놈 통합 시스템의 상기 다양한 성분들의 안정적인 통합을 위하여 임의의 프로토콜이 이용될 수 있다.
트랜스펙션 프로토콜 뿐만 아니라 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 안으로 도입시키기 위한 프로토콜은 다양할 수 있다. 비-제한적 트랜스펙션 방법은 화학-기반의 트랜스펙션 방법을 포함하는데, 리포좀; 나노입자; 인산칼슘 (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 and, Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 양이온 폴리머 이를 테면 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민의 사용을 포함한다. 비 화학 방법은 전기천공; 음향-천공(Sono-poration); 그리고 광학적 트랜스펙션을 포함한다. 입자-기반의 트랜스펙션은 유전자 총, 자석 지원된 트랜스펙션 (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28)의 사용을 포함한다. 바이러스 방법 또한 트랜스펙션에 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 세포 안으로 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 도입은 전기천공, 세포질내 주사, 바이러스 감염, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 트랜스펙션, 지질-중개된 트랜스펙션에 의해 중개되거나 또는 Nucleofection™를 통하여 중개된다.
한 구체예에서, 세포 안으로 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 도입은 프로모터에 작동가능하도록 연계된 관심 핵산 서열이 포함된 발현 구조체를 도입시키는 것을 더 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 구성적으로-활성 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터다. 한 구체예에서, 상기 프로모터는 줄기 세포, 예를 들면, 배아 줄기 세포에서 활성이 있다.
한 구체예에서, 상기 발현 구조체는 LTVEC와 함께 도입된다. 한 구체예에서, 상기 발현 구조체는 일정 기간에 걸쳐 LTVEC와 별도로 도입된다.
한 구체예에서, 상기 세포 안으로 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 도입은 일정 기간에 걸쳐 여러차례 실행될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 세포 안으로 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 도입은 일정 기간에 걸쳐 최소한 2회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 3회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 4회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 5회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 6회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 7회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 8회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 9회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 10회, 일정 기간에 걸쳐 일정 기간에 걸쳐 최소한 11회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 12회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 13회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 14회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 15회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 16회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 17회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 18회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 19회, 또는 일정 기간에 걸쳐 최소한 20회 실행된다.
한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 상기 표적화 벡터 또는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)와 동시에 세포 안으로 도입된다. 대안으로, 상기 뉴클레아제 물질은 일정 기간에 걸쳐 상기 표적화 벡터 또는 LTVEC와 별도로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 뉴클레아제 물질은 상기 표적화 벡터 또는 LTVEC 도입 전에 도입되지만, 한편 다른 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 물질은 상기 표적화 벡터 또는 LTVEC의 도입 후 도입된다.
한 구체예에서, 스크리닝 단계는 부계 염색체의 대립유전자의 변형 (MOA)을 평가하기 위한 정량적 분석을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 정량적 PCR을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 PCR은 실시간 PCR (qPCR)이다. 한 구체예에서, 실시간 PCR은 상기 표적 좌를 인지하는 제 1 프라이머 세트와 비-표적화된 참고 좌를 인지하는 제 2 프라이머 세트를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인지하는 형광 프로브를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은형광물질-중개된 제자리(in situ) 혼성화 (FISH)를 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 상대적 게놈 혼성화를 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 등온선(isothermic) DNA 증폭을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 등온선 DNA 증폭을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화를 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 Invader Probes®를 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 MMP 분석®을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 TaqMan® Molecular Beacon을 통하여 실행된다. 한 구체예에서, 상기 정량적 분석은 Eclipse™ 프로브 기술을 통하여 실행된다. (예를 들면, US2005/0144655 참고하며, 이의 전문이 참고자료에 편입됨).
인간화된 비-인간 동물을 만드는 방법이 더 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 다능성 세포의 게놈을 인간 핵산 서열이 포함된 삽입 핵산을 포함하는 표적화 벡터로 변형시켜, 공유 세포를 만들고; (b) 상기 공여 세포를 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (c) 대리모에게 숙주 배아를 임신시키고; 이때 대리모는 상기 인간 핵산 서열이 포함된 자손을 생산한다. 한 구체예에서, 상기 공여 세포는 낭포 단계 또는 상실배-전 단계 (가령, 4 세포 단계 또는 8 세포 단계)에 있는 숙주 배아 안으로 도입된다. 더욱이, 단계 (a)는 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 및/또는 최소한 5 kb의 길이의 인간 핵산 서열과 함께 또한 실행될 수 있다. 여전히 추가 구체예들에서, 상기 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
유전적으로 변형된 비-인간 동물은 본 명세서에서 공개된 다양한 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 이러한 방법은 (1) 본 명세서에서 공개된 방법을 이용하여, 표적화된 게놈 좌 안에 삽입 핵산이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 세포를 만들기 위하여, 다능성 세포의 표적 좌에 하나 또는 그 이상의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 통합시키고; (2) 상기 표적 게놈 좌에 하나 또는 그 이상의 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 갖는 유전적으로 변형된 다능성 세포를 선별해내고; (3) 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포를 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (4) 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포가 포함된 숙주 배아를 대리모에게 이식하는 것을 포함한다. 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포로부터 자손이 생성된다. 한 구체예에서, 상기 공여 세포는 낭포 단계 또는 상실배-전 단계 (가령, 4 세포 단계 또는 8 세포 단계)에 있는 숙주 배아 안으로 도입된다. 생식계열을 통하여 유전자 변형을 유전시킬 수 있는 후손이 생성된다. 본 명세서의 도처에서 논의된 바와 같, 다능성 세포는 ES 세포일 수 있다.
상기 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 만드는데 핵 이전 기술이 또한 이용될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 핵 이전을 위한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (1) 난모세포의 핵을 빼내고; (2) 상기 핵이 적출된 난모세포와 복합되는 공여 세포 또는 핵을 단리시키고; (3) 상기 세포 또는 핵을 핵이 적출된 난모세포 인에 삽입시켜 재구성된 세포가 형성되고; (4) 상기 재구성된 세포는 동물의 자궁 안에 이식시켜 배아를 만들고; 그리고 (5) 배아가 발달되도록 한다. 이러한 방법에서 살아있는 동물의 난관 및/또는 난소로부터 난모 세포가 단리될 수 있지만, 일반적으로 난모세포는 죽은 동물로부터 회수된다. 난모세포는 핵 적출에 앞서, 당분에 공지된 다양한 배지에서 숙성될 수 있다. 난모세포의 핵 적출은 당분야의 숙련자들에게 공지된 방식으로 실행될 수 있다. 재구성된 세포를 만들기 위하여, 핵이 적출된 난모세포 안으로 공여 세포 또는 핵의 삽입은 보통 융합 전, 투명대(zona pellucida)에서 공여세포의 현미주사에 의해 이루어진다. 융합은 접촉/융합 면을 가로질러 DC 전기적 펄스를 제공함으로써 (전기융합), 융합-촉진 화학물질, 이를 테면 폴리에틸렌 글리콜에 세포를 노출시키거나, 또는 비활성화된 바이러스, 이를 테면, 센다이 바이러스를 통하여, 유도화될 수 있다. 재구성된 세포는 상기 핵 공여와 수용 난모세포의 융합전, 융합 동안 및/또는 융합 후, 전기적 및/또는 비-전기적 수단에 의해 전형적으로 활성화된다. 활성화 방법은 전기적 펄스, 화학적으로 유도화된 쇼크, 정자에 의한 침투, 난모세포에서 이가 양이온 수준 증가, 그리고 난모세포 안에서 세포 단백질의 인산화 감소 (키나제 억제제를 통하여)를 포함한다. 활성화된 재구성된 세포, 또는 배아는 당업자들에게 공지된 배지에서 전형적으로 배양되고, 그 다음 동물의 자궁으로 이전된다. 예를 들면, US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, 및 US 특허 번호 7,612,250 참고하며, 이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
한 측면에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 만드는 방법이 제공되는데, 이 방법은 변형된 다능성 세포를 만들기 위하여 관심 대상의 게놈 좌에 변형을 도입하기 위한 엔도뉴클레아제-중개된 유전자 표적화를 이용하여 다능성 세포 안에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키고, 전분화능이 유지되는데 충분한 조건하에서 상기 변형된 다능성 세포를 유지시키고, 상기 변형된 다능성 세포는 숙주 배아에서 공여 세포로 이용되고, 그리고 상기 변형된 다능성 세포가 포함된 숙주 배아를 대리모에 임신시키는 것을 포함하고, 이때 대리모가 상기 숙주 배아를 잉태하고, 유전적으로 변형된 자손이 태어난다.
한 구체예에서, 상기 표적 서열은 인트론에 위치한다. 한 구체예에서, 상기 표적 서열은 엑손에 위치한다. 한 구체예에서, 상기 표적 서열은 프로모터에 위치한다. 한 구체예에서, 상기 표적 서열은 프로모터 조절 영역에 위치한다. 한 구체예에서, 상기 표적 서열은 인헨서 영역에 위치한다.
한 구체예에서, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 일정 기간에 걸쳐 여러차례 도입 단계가 실행된다. 한 구체예에서, 단계는 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 2회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 3회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 4회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 5회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 6회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 7회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 8회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 9회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 10회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 11회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 12회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 13회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 14회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 15회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 16회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 17회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 18회, 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 19회, 또는 구별되는 별개의 표적 서열을 인지하는 다수의 엔도뉴클레아제를 이용하여 최소한 20회 실행된다.
한 구체예에서, 도입 단계는 전기천공, 세포질내 주사, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 트랜스펙션, 지질-중개된 트랜스펙션에 의해 중개되거나 또는 Nucleofection™를 통하여 중개된다.
한 구체예에서, 상기 방법은 외생성 핵산을 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포 안으로 도입시키는 것을 더 포함한다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 이식유전자다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 내생성 좌 안으로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 자궁외적으로 도입된다(가령, 이의 내생성 좌와 상이한 좌에서).
한 측면에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 만드는 방법이 제공되는데, 이 방법은 변형된 다능성 세포를 만들기 위하여 관심 대상의 게놈 좌에 변형을 도입하기 위한 RNA-안내된 게놈 공학을 이용하여 다능성 세포 안에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키고, 전분화능이 유지되도록 충분한 조건하에서 상기 변형된 다능성 세포를 유지시키고, 상기 변형된 다능성 세포는 숙주 배아에서 공여 세포로 이용되고, 그리고 상기 변형된 다능성 세포가 포함된 숙주 배아를 대리모에 임신시키는 것을 포함하고, 이때 대리모가 상기 숙주 배아를 잉태하고, 유전적으로 변형된 자손이 태어난다.
한 구체예에서, 상기 방법은 약 2% 내지 약 80% 범위의 표적화율을 갖는다.
한 구체예에서, 상기 방법은 구별되는 별개의 게놈 좌의 다중 편집을 위하여 구별되는 별개의 게놈 표적 서열이 포함된 다수의 제 2 발현 구조체를 공동-도입시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 일정 기간에 걸쳐 구별되는 별개의 게놈 좌의 다중 편집을 위하여 구별되는 별개의 게놈 표적 서열이 포함된 다수의 제 2 발현 구조체를 도입시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 일정 기간에 걸쳐 여러차례 도입 단계가 실행된다. 한 구체예에서, 도입 단계 (b)는 일정 기간에 걸쳐 최소한 2회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 3회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 4회, 일정 기간에 걸쳐 5회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 6회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 7회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 8회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 9회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 10회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 11회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 12회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 13회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 14회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 15회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 16회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 17회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 18회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 19회, 일정 기간에 걸쳐 최소한 20회 실행된다.
한 구체예에서, 제 1 발현 구조체와 제 2 발현 구조체는 동일한 플라스미드로부터 발현된다.
한 구체예에서, 도입 단계는 전기천공, 세포질내 주사, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 트랜스펙션, 지질-중개된 트랜스펙션에 의해 중개되거나 또는 Nucleofection™를 통하여 중개된다.
한 구체예에서, 상기 방법은 외생성 핵산을 상기 돌연변이 대립유전자가 포함된 상기 다능성 세포 안으로 도입시키는 것을 더 포함한다.
한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 이식유전자다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 내생성 좌 안으로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 자궁외에 위치한다 (가령, 이의 내생성 좌와 상이한 좌에서).
한 구체예에서, 상기 방법은 외생성 핵산을 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포 안으로 도입시키는 것을 더 포함한다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 이식유전자다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 내생성 좌 안으로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 외생성 핵산은 자궁외적으로 도입된다(가령, 이의 내생성 좌와 상이한 좌에서).
한 측면에서, 인간화된 비-인간 동물을 만드는 방법이 더 제공되는데, 이 방법은 최소한 5 kb의 인간 서열이 포함된 삽입을 포함하는 LTVEC로 다능성 세포의 게놈을 변형시키고, 그리고 상기 다능성 세포를 공여 세포로 이용하여, 상기 공여 세포를 숙주 배아 안으로 도입시키고, 그리고 대리모에게 숙주 배아를 임신시키는 것을 포함하고, 이때 대리모는 인간화가 포함된 자손을 낳는다.
본 명세서에서 공개된 바와 같이, 동물의 생식계열의 하나 또는 그 이상의 유전적 변형이 이의 생식계열에 포함된 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 만드는 다른 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 원핵 세포 안에 포함된 표적화된 좌를 본 명세서에서 기술된 다양한 방법을 이용하여 변형시키고; (b) 상기 표적화된 좌에서 상기 유전적 변형이 포함된 변형된 원핵 세포를 선별하고; (c) 상기 변형된 원핵 세포의 게놈으로부터 상기 유전적으로 변형된 표적화 벡터를 단리하고; (d) 상기 표적화된 게놈 좌에 상기 삽입 핵산이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 세포를 만들기 위하여 다능성 세포 안으로 상기 유전적으로 변형된 표적화 벡터를 도입시키고; (e) 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포를 선별하고; (f) 상실배-전 단계에서 숙주 배아 안으로 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포를 도입시키고; 그리고 (g) 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포가 포함된 숙주 배아를 대리모에게 이식하여 상기 유전적으로 변형된 다능성 세포로부터 유도된 F0 세포를 만든다. 이러한 방법에서 상기 표적화 벡터는 큰 표적화 벡터를 포함할 수 있다. 다능성 세포는 ES 세포일 수 있다. 추가 방법에서, 단리 단계 (c)는 상기 유전적으로 변형된 표적화 벡터 (가령, 상기 유전적으로 변형된 LTVEC)를 직선으로 만드는 것(c1)을 더 포함한다 여전히 추가 구체예들에서, 도입 단계 (d)는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 뉴클레아제 물질을 상기 다능성 세포 안으로 도입시키는 것(d1) 을 더 포함한다. 한 구체예에서, 선별 단계 (b) 및/또는 (e)는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 선별가능한 물질을 상기 원핵 세포 또는 상기 다능성 세포에 적용함으로써 실행된다. 한 구체예에서, 선별 단계 (b) 및/또는 (e)는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 대립유전자의 변형 (MOA) 분석을 통하여 실행된다.
원핵 세포에서 세균성 상동성 재조합 (BHR)을 통하여 포유류 세포의 표적 게놈 좌를 변형시키는 추가 방법들이 제공되는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 핵산이 포함된 표적 좌를 포함하는 원핵 세포를 제공하고, (b) 상기 원핵 세포 안으로 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 도입시키고, 이때 상기 삽입 핵산은 포유류 영역 (예를 들면, 인간으로부터 유래된 DNA 삽입을 포함)을 포함하며, 그리고 (c) 상기 표적 좌에서 상기 삽입 핵산을 포함하는 표적화된 원핵 세포를 선별하고, 이때 상기 원핵 세포는 BHR을 중개하는 재조합 효소를 발현시킬 수 있다. 단계 (a1)는 제 1 뉴클레아제 물질에 대한 제 1 인지 부위가 포함된 제 1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산이 포함된 표적 좌를 포함하는 원핵 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 단계 (b1)는 상기 원핵 세포에서 제 1 인지 부위에서 또는 이 부근에서 닉 또는 이중-가닥 파괴를 만드는 뉴클레아제 물질을 발현시키는 것을 더 포함할 수 있다. 단계 (a)-(c)는 원핵 세포 안에서 표적화된 좌에 다중 삽입 핵산이 도입되도록 본 명세서에서 공개된 바와 같이 연속적으로 반복될 수 있다. 상기 표적화된 게놈 좌가 원핵 세포 안에서 "구축(built)"되면, 상기 변형된 표적 좌가 포함된 표적화 벡터는 상기 원핵 세포로부터 단리될 수 있고, 그리고 다능성 세포 안의 표적 게놈 좌 안으로 도입될 수 있다. 상기 변형된 게놈 좌가 포함된 다분화능 세포 (가령, ES 세포)는 그 다음 유전적으로 변형된 비-인간 동물로 만들어질 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 표적 게놈 좌들의 다양한 유전적 변형은 VELOCIGENE® 유전 공학적 기술 (가령, US 특허 번호 6,586,251 및 Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659, 이들은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입됨)을 이용하여 세균성 인공 염색체(BAC) DNA로부터 유도된 LTVEC를 이용하여 세균성 세포 안에서 일련의 상동성 재조합 반응 (BHR)에 의해 실시될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 다양한 유전적 변형이 포함된 표적화된 ES 세포는 삽입 ES 세포로 이용되고, 그리고 대응하는 유기체의 상실배-전 단계 배아, 가령, 8-세포 단계 마우스 배아 안으로 VELOCIMOUSE® 방법을 이용하여 도입시킨다 (가령, US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, 및 US 2008-0078000 A1 참고하며, 이들 모두는 전문이 본 명세서의 참고자료에 통합된다). 상기 유전적으로 변형된 ES 세포가 포함된 배아는 낭포단계까지 배양되고, 그 다음 대리모에게 이식되어 F0을 생산한다. 상기 유전적으로 변형된 게놈 좌를 출산하는 동물은 본 명세서에서 설명된 대립유전자의 변형 (MOA) 분석을 통하여 식별될 수 있다. 상기 유전적으로 변형된 ES 세포로부터 유도된 생성된 F0 세대 비-인간 동물은 야생형 비-인간 동물과 교배되어, F1 세대 후손을 얻는다. 특이적 프라이머 및/또는 프로브를 이용한 유전자형분석 후, 유전적으로 변형된 게놈 좌에 대하여 이형접합성인 F1 비-인간 동물은 유전적으로 변형된 게놈 좌에 대하여 동형접합성인 동물을 생산하기 위하여 서로 교배된다. 대안으로, 유전자 변형을 갖는 각각의 F0 암컷 비-인간 동물과 F0 수컷 비-인간 동물이 교배되어 유전적 변형에 대하여 동형접합성인 F1 비-인간 동물을 얻을 수 있다.
한 측면에서, 예를 들면, 또다른 유기체의 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열과 함께, 내생성 핵산 서열의 표적화된 변형을 포함하는, 유전적으로 변형된 렛 게놈이 제공된다.
한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열의 길이는 약 5 kb 내지 약 200 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 5 kb 내지 약 10 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 10 kb 내지 약 20 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 20 kb 내지 약 30 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 30 kb 내지 약 40 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 40 kb 내지 약 50 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 50 kb 내지 약 60 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 60 kb 내지 약 70 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 70 kb 내지 약 80 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 80 kb 내지 약 90 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 90 kb 내지 약 100 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 100 kb 내지 약 110 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 110 kb 내지 약 120 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 120 kb 내지 약 130 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 140 kb 내지 약 150 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 150 kb 내지 약 160 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 160 kb 내지 약 170 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 170 kb 내지 약 180 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 180 kb 내지 약 190 kb이다. 한 구체예에서, 상기 상동성 또는 이종상동성 렛이 아닌 핵산 서열의 범위는 약 190 kb 내지 약 200 kb이다. 삽입 핵산에 이용되는 다양한 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 본 명세서의 도처에서 설명된다.
비-인간 동물의 표적화된 게놈 변형의 추가 방법들이 제공된다. 이러한 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 관심 대상의 게놈 좌의 변형을 위하여 본 명세서에서 제공된 다양한 임의의 방법들을 이용하여 비-인간 다능성 세포의 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키고, 이로 인하여 표적화된 게놈 변형이 포함된 유전적으로 변형된 비-인간 다능성 세포가 생산되고; (b) 단계 (a)의 상기 변형된 비-인간 다능성 세포를 비-인간 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (c) 상기 비-인간 상기 변형된 다능성 세포가 포함된 숙주 배아를 대리모에게 임신시키고, 이때 대리모는 상기 표적화된 게놈 변형을 포함하는 F0 자손을 낳고, 그리고 이때 상기 표적화된 게놈 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 표적화된 게놈 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손을, 그리고 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 외생성 핵산의 삽입을 동시에 포함한다 (가령, 한 단계에서 결손과 삽입). 일부 구체예들에서, 상기 표적화된 게놈 변형은 이중대립형질 유전적 변형을 포함한다. 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체(가령, 제 1 및 제 2 상동성 염색체의 쌍)의 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 외생성 핵산의 삽입을 포함할 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 표적화된 게놈 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성인, 변형된 다능성 세포를 창출한다. 다른 구체예들에서, 상기 표적화된 게놈 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성인, 변형된 다능성 세포를 창출한다. 일부 구체예들에서, 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 외생성 핵산의 삽입을 포함한다. 예를 들면, 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함할 수 있다: (1) 2개의 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 외생성 핵산의 삽입과 제 2 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴. 상기 제 1 염색체는 2개의 상동성 염색체의 첫번째일 수 있고, 제 2 염색체는 2개의 상동성 염색체의 두번째일 수 있다.
6. 세포
본 명세서에서 설명된 다양한 방법 및 조성물은 세포에서 게놈 좌 표적화 시스템 을 이용한다. 한 구체예에서, 상기 세포는 다능성 세포다. 한 구체예에서, 상기 세포는 비-다능성 세포다. 한 구체예에서, 상기 다능성 세포는 비-인간 다능성 세포다. 한 구체예에서, 상기 비-인간 다능성 세포는 포유류 다능성 세포다. 한 구체예에서, 상기 다능성 세포는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포다.
다른 구체예들에서, 상기 세포는 진핵 세포, 렛이 아닌 진핵 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 비-인간 포유류 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 섬유아세포, 설치류 세포, 렛이 아닌 설치류 세포, 렛 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포 또는 CHO 세포다.
한 구체예에서, 진핵 세포는 일차 세포다. 일차 세포는 유기체, 장기, 또는 조직으로부터 직접적으로 단리된 세포 또는 세포의 배양물을 포함한다. 일차 세포는 형질변환안된 또는 불사화(immortal)안된 세포를 포함한다. 조직 배양에서 기존에 계대되지 않았거나 또는 조직 배양에서 기존에 계대되었는지만, 조직 배양에서 무기한으로 계대될 수 없는, 유기체, 장기 또는 조직으로부터 획득된 임의의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 통상적인 기술에 의해 단리될 수 있으며, 그리고 예를 들면, 조혈 세포, 내종피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포, 각질세포, 멜라닌세포, 단핵구, 단핵 세포, 지방세포, 사전지방세포, 뉴런, 신경아교 세포, 간세포, 골근육모세포, 및 평활근 근육 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 일차 세포는 결합 조직, 근육 조직, 신경계 조직, 또는 상피 조직으로부터 유도된다.
또다른 구체예에서, 진핵 세포는 불사화된 세포다. 불사화된 세포는 다중세포 유기체로부터 정상적으로는 무한정으로 증식될 수 없지만, 그러나 돌연변이 또는 변경으로 인하여, 정상적인 세포 노화를 회피하고, 대신 분화를 지속할 수 있는 세포를 포함한다. 이러한 돌연변이 또는 변경은 자연적으로 발생되거나 또는 의도적으로 유도될 수 있다. 불사화된 세포의 예로는 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아의 신장 세포 (가령, HEK 293 세포), 그리고 마우스 배아의 섬유아세포 세포 (가령, 3T3 세포)를 포함한다. 다양한 유형의 불사화된 세포들이 당분야에 잘 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, 불사화된 세포는 암 세포로부터 유도된다. 또다른 구체예에서, 일차 또는 불사화된 세포는 재조합 유전자 또는 단백질의 배양 또는 발현에 전형적으로 이용되는 것이다.
다른 구체예들에서, 상기 다능성 세포는 이의 게놈의 최소한 하나의 표적화된 유전적 변형 후 전분화능을 지속할 수 있고, 상기 표적화된 변형을 F1 세대의 생식계열로 유전시킬 수 있다.
한 구체예에서, 상기 다능성 세포는 단일 세포 단계에서 비-인간 수정란이다. 한 구체예에서, 상기 비-인간 수정란은 포유류 수정란이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 수정란은 단일 세포 단계에서 설치류 수정란이다. 한 구체예에서, 상기 포유류 수정란은 단일 세포 단계에서 렛 또는 마우스 수정란이다.
본 명세서에서 설명된 방법 및 조성물에 이용되는 다양한 세포는 원핵 세포, 이를 테면 대장균(E. coli )을 포함하는, 세균성 세포를 또한 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 원핵 세포는 대장균(E. coli )의 재조합-수행능력(competent) 균주다. 한 구체예에서, 상기 원핵 세포는 상기 재조합효소가 인코드된 핵산을 포함하며, 한편 다른 경우들에서, 상기 원핵 세포는 재조합효소가 인코드된 핵산을 포함하지 않고, 재조합효소가 인코드된 핵산은 상기 원핵 세포 안으로 도입된다. 한 구체예에서, 재조합효소가 인코드된 핵산은 DNA 또는 mRNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 재조합효소가 인코드된 핵산은 pABG이다. 한 구체예에서, 상기 재조합효소는 유도성 프로모터의 조절 하에 발현된다. 한 구체예에서, 상기 재조합효소의 발현은 아라비노스에 의해 조절된다.
A. 인간 유도된 다분화능 줄기 세포를 만들고 유지하기 위한 저삼투질 배지
본 발명의 방법 및 조성물에 사용을 위한 세포 배양 배지가 제공된다. 한 구체예에서, 상기 배지는 인간 iPS 세포 집단을 만드는데 적합하다. 또다른 구체예에서, 상기 배지는 배양에서 인간 iPS 세포를 유지시키는데 적합하다. 일부 구체예들에서, 상기 인간 iPS 세포는 순수한
또는 순수-외양(
-looking)이다.
본 명세서에서 제공된 배지는 최소한 기본 배지, 보충물, 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드, 글리코겐 합성효소 키나제 3 (GSK3) 억제제, 및 MEK 억제제를 포함한다.
본 배지는 오스몰농도가 낮은 배지다. 한 실시예에서, 상기 오스몰농도는 약 175-280 mOsm/kg이다. 추가 실시예들에서, 상기 배지의 오스몰농도는 약 180-270 mOsm/kg, 약 200-250 mOsm/kg, 약 220-240 mOsm/kg, 또는 약 225-235 mOsm이다. 특정 구체예에서, 상기 배지의 오스몰농도는 약 233 mOsm/kg이다.
본 발명에서 제공되는 기본 배지는 오스몰농도가 낮은 기본 배지이며, 이 배지에 보충물이 추가된다. 본 기본 배지는 다양한 형태 (가령, Invitrogen DMEM, Cat. No. 1 1971 -025)의 Dulbecco 변형된 Eagle 배지(DMEM) 및 KO-DMEM™ (Invitrogen Cat. No. 10829-018)로 시판되는 이용가능한 저염 DMEM 배지가 포함된 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지하는데 전형적으로 이용되는 기본 배지와 상이하다.
본 발명에서 제공되는 기본 배지는 오스몰농도가 낮는 배지이지만, 낮은 오스몰 농도에 제한되지 않는 특징들을 나타낸다. 예를 들면, 표 A에 나타낸 DMEM 제제는 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 염화나트륨 및/또는 중탄산나트륨염 농도를 변경시키고, 이로 인하여 표 A에 나타낸 표준 DMEM 기본 배지 또는 저염 DMEM 기본 배지 (KO-DMEM)와 비교하였을 때 상이한 오스몰농도를 가지게 됨으로써 본 발명의 목적에 적합하도록 만들 수 있다.
본 기본 배지는 알칼리 금속 및 할로겐화물의 염, 이를 테면 염화나트륨 (NaCl)을 포함할 수 있다. 기본 배지에서 NaCl의 예시적인 농도는 50 ± 5 mM 또는 약 3 mg/mL을 포함한다.
또다른 구체예에서, 상기 기본 배지는 탄산염의 농도를 나타낸다. 탄산염은 나트륨 염일 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 나트륨염은 중탄산나트륨염일 수 있다. 특정 구체예에서, 중탄산나트륨염은 약 26 ± 5 mM 또는 약 2.2 mg/mL의 농도로 기본 배지 안에 존재한다.
여전히 또다른 구체예에서, 상기 기본 배지는 오스몰농도가 낮은 기본 배지다. 상기 기본 배지의 오스몰농도는 약 175-280 mOsm/kg, 약 180-250 mOsm/kg, 약 190-225 mOsm/kg, 또는 약 195-205 mOsm/kg 범위 내에 있을 수 있다. 상기 기본 배지의 예시적인 오스몰농도는 200, 214, 216, 또는 218 mOsm/kg일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 배지의 오스몰농도는 200 mOsm/kg이다. 상기 오스몰농도는 상이한 CO2 농도에서 세포가 배양될 때 측정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 세포는 3% CO2 또는 5% CO2에서 배양된다.
바람직한 구체예에서, 상기 기본 배지는 NaCl 3.0 mg/mL, 중탄산나트륨염 약 2.2 mg/mL를 포함하며, 그리고 오스몰농도 200 mOsm/kg를 갖는다.
인간 iPS 세포를 만들고, 유지시키고, 또는 이의 집단을 농축시키는데 적합하도록 본 발명의 기본 배지와 함께 제형화되는 보충물이 본 명세서에서 공개된다. 이러한 보충물은 본 명세서에서 "보충물" 또는 "+ 보충물"로 표시된다. 용어 "보충물" 또는 구절 "+ 보충물"은 표 A에서 설명된 기본 배지 성분들에 추가되는 하나 또는 그 이상의 추가적인 요소를 포함한다. 예를 들면, 보충물은 F-12® 배지 (Gibco), N2® 보충물 (Gibco; 100X 용액), NEUROBASAL® 배지 (Gibco), B-27® 보충물 (Gibco; 50X 용액), L-글루타민, 포도당, 2-멀캅토에탄올, 백혈병 저해 인자 (LIF) 폴리펩티드, 글리코겐 합성효소 키나제 3 억제제, MEK 억제제, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
특정 구체예에서, LIF 폴리펩티드는 인간 LIF (hLIF) 폴리펩티드다. 일부 실시예들에서, hLIF 폴리펩티드는 약 1-1000 유닛/mL, 약 20-800 유닛/mL, 약 50-500 유닛/mL, 약 75-250 유닛/mL, 또는 약 100 유닛/mL의 농도로 사용된다.
또다른 특정 구체예에서, GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함한다. 일부 실시예들에서, CHIR99021은 약 0.1 내지 10 μM, 약 1-5 μM, 약 2-4 μM, 또는 약 3 μM의 농도로 이용된다.
또다른 특정 구체예에서, MEK 억제제는 PD0325901을 포함한다. 일부 실시예들에서, PD0325901은 약 0.1-5 μM, 약 0.2-1 μM, 약 0.3-0.7 μM, 또는 약 0.5 μM의 농도로 이용된다.
예시적인 배지는 낮은 오스몰농도 기본 배지 약 24.75% (v/v), F-12 배지 약 24.75% (v/v), N2 보충물 약 0.5% (v/v), NEUROBASAL 배지 약 49% (v/v), B-27 보충물 약 1% (v/v), L-글루타민 약 2 mM, 2-멀캅토에탄올 약 0.1 mM, hLIF 약 100 유닛/mL, CHIR99021 약 3 μM, 그리고 PD0325901 약 0.5 μM을 포함한다.
또다른 특정 구체예에서, 상기 배지는 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, 또한 FGF2 또는 FGF-β로도 알려짐)를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는 본 배지는 bFGF를 포함하지 않는다.
B. 인간 유도화된 다분화능 줄기 세포
인간 iPS 세포 집단을 만들기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지시키기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 배양물에서 만들어진 또는 유지된 인간 iPS 세포가 또한 제공된다.
용어 "다능성 세포" 또는 "다능성 줄기 세포"는 하나 이상의 분화된 세포 유으로 발달될 수 있는 능력을 보유한 미분화된 세포를 포함한다. 이러한 다능성 세포는 예를 들면, 포유류 배아 줄기 (ES 세포) 세포 또는 포유류 유도화된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포)일 수 있다. 다능성 세포의 예로는 인간 iPS 세포를 포함한다.
용어 "배아 줄기 세포" 또는 "ES 세포"는 적합한 조건하에 시험관 배양물에서 유지될 수 있는 낭포의 내부 세포 덩어리로부터 유도된 배아-유도된 분화전능성 또는 다능성 줄기 세포를 말한다. ES 세포는 3개의 척추동물 배엽층, 가령, 내배엽, 외배엽, 또는 중배엽중 임의의 세포로 분화될 수 있다. ES 세포는 적합한 시험관 배양 조건하에서 무한정으로 분화되는 능력으로 특징화될 수 있다. 예를 들면, Thomson et al. (Science (1998) Vol. 282(5391), pp. 1145-1147) 참고.
용어 "유도화된 다능성 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 분화된 성숙 세포로부터 직접적으로 유도될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함한다. 인간 iPS 세포는 예를 들면, Oct3/4, Sox 패밀리 전사 인자 (가령, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15), Myc 패밀리 전사 인자 (가령, c-Myc, l-Myc, n-Myc), 
-유사 패밀리 (KLF) 전사 인자 (가령, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5), 및/또는 관련된 전사 인자, 이를 테면 NANOG, LIN28, 및/또는 Glis1들이 포함될 수 있는 특이적 재프로그래밍 인자들을 비-다능성 세포 안으로 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 miRNAs, 전사인자의 작용을 모방하는 소분자, 또는 계통 지정자(lineage specifiers)의 이용에 의해 또한 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 3개의 척추동물 배엽층, 가령, 내배엽, 외배엽, 또는 중배엽중 임의의 세포로 분화되는 능력에 의해 특징화된다. 인간 iPS 세포는 적합한 시험관 배양 조건하에서 무한정으로 분화되는 능력으로 특징화될 수 있다. 예를 들면, Takahashi and Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676) 참고.
용어 "순수
" 및 "프라임된(primed)"는 인간 iPS 세포의 상이한 전분화능 상태를 식별한다. 용어 "순수-외양(
-looking)"은 순수 다능성 세포의 하나 또는 그 이상의 특징을 나타내는 다능성 상태를 발현시키는 세포를 식별한다. 순수-외양 인간 iPS 세포는 "순수-유사(
-like)" 인간 iPS 세포로 또한 지칭될 수 있다. 일부 구체예들에서, 순수-외양 인간 iPS 세포는 순수 인간 iPS 세포의 하나 또는 그 이상의 형태학적 특징, 이를 테면 조밀한 돔(dome)-모양의 콜로니로 특징화되는 형태를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 순수-외양 인간 iPS 세포는 본 명세서에서 공개된 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지들을 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 순수 또는 순수-외양 인간 iPS 세포는 순수 인간 iPS 세포다. 다른 구체예들에서, 순수 또는 순수-외양 인간 iPS 세포는 순수-외양 인간 iPS 세포다.
순수 및 프라임된 iPS 세포의 특징은 당분야에서 설명된다. 예를 들면, Nichols and Smith (Cell Stem Cell (2009) Vol. 4(6), pp. 487-492) 참고. 순수 인간 iPS 세포는 사전-착상 배아의 세포내 물질의 ES 세포와 유사한 전분화능 상태를 나타낸다. 이러한 순수 세포는 계통 특이성 및 책무에 대하여 프라임되지 않는다. 암컷 순수 iPS 세포는 2개의 활성 X 염색체를 특징으로 한다. 배양에서, 순수 인간 iPS 세포의 자체-재생은 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 다른 억제제들에 의존적이다. 배양된 순수 인간 iPS 세포는 둥근 돔-모양의 콜로니를 특징으로 하는 클론 형태를 나타내며, 정점-기반 극성(apico-base polarity)의 결여된다. 배양된 순수 세포는 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 전분화능 표식들을 더 나타낼 수 있다. 적절한 조건하에서 배양물에서 순수 인간 iPS 세포의 배가 시간(doubling time)은 16 내지 24 시간이다.
프라임된 인간 iPS 세포는 착상 후 낭배의 외피(epiblast) 세포의 것과 유사한 전분화능 상태를 나타낸다. 이러한 세포는 계통 특이성 및 책무에 대하여 프라임된다. 암컷 프라임된 iPS 세포는 하나의 활성 X 염색체와 하나의 비활성 X 염색체를 특징으로 한다. 배양에서 프라임된 인간 iPS 세포의 자체-재생은 섬유하세포 성장 인자 (FGF)와 액티빈에 의존적이다. 배양된 프라임된 인간 iPS 세포는 상피 단층에 의해 특징화된 클론 형태를 나타내고, 정점-기반 극성을 나타낸다. 적절한 조건하에서 배양물에서 프라임된 인간 iPS 세포의 배가 시간은 24 시간 또는 그 이상이 될 수 있다.
한 구체예에서, 인간 iPS 세포는 다능성 상태를 발현시키도록 형질변환되 비-다능성 세포로부터 유도될 수 있다. 이러한 형질변환된 세포는 예를 들면, 전분화능을 유도하는 재프로그래밍 유전자를 발현시키도록 형질변환된 세포를 포함한다. 다능성 상태는 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지의 발현을 포함할 수 있다. 이러한 세포 (이를 테면 인간 포피 섬유아세포)는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 재프로그래밍 유전자, 또는 관심 대상의 임의의 추가적인 유전자를 발현시키도록 형질변환될 수 있다. 예를 들면, Takahashi and Yamanaka (Cell (2006) Vol. 126(4), pp. 663-676) 참고. 예를 들면, 이들은 하나 또는 그 이상의 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 게놈 안에 통합되며, 그리고 재프로그래밍이 완료된 후 제거될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 비-다능성 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, Myc, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 재프로그래밍 유전자로 형질변환된다. 일부 실시예들에서, 상기 형질변환된 세포는 프라임된 인간 iPS 세포를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양된 상기 인간 iPS 세포는 하나 또는 그 이상의 표현형, 유전자 발현 프로파일, 또는 순수 상태의 표지들 특징을 발현한다. 한 실시예에서, 상기 인간 iPS 세포는 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지들을 발현시키고, 이의 발현은 순수 상태를 나타낸다. 이러한 전분화능 표지들은 알칼리 포스파타제, NANOG, 5T4, ABCG2, 액티빈 RIB/ALK-4, 액티빈 RIIB, E-캐드헤린, Cbx2, CD9, CD30/TNFRSF8, CD117/c-kit, CDX2, CHD1, 크립토, DNMT3B, DPPA2, DPPA4, DPPA5/ESG1, EpCAM/TROP1, ERR 베타/NR3B2, ESGP, F-박스 단백질 15/FBXO15, FGF-4, FGF-5, FoxD3, GBX2, GCNF/NR6A1, GDF-3, Gi24/VISTA/B7-H5, 인테그린 알파 6/CD49f, 인테그린 알파 6 베타 1, 인테그린 알파 6 베타 4, 인테그린 베타 1/CD29, KLF4, KLF5, L1TD1, Lefty, Lefty-1, Lefty-A, LIN-28A, LIN-28B, LIN-41, cMaf, cMyc, Oct-3/4, Oct-4A, 포도칼리신, Rex-1/ZFP42, Smad2, Smad2/3, SOX2, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, Stella/Dppa3, SUZ12, TBX2, TBX3, TBX5, TERT, TEX19, TEX19.1, THAP11, TRA-1-60(R), TROP-2, UTF1, 및/또는 ZIC3을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 발현된 전분화능 표지는 알칼리 포스파타제, NANOG, 또는 이 둘 모두가 된다.
또다른 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양된 상기 인간 iPS 세포는 순수 상태를 암시하는 형태학적 특징들을 나타낸다. 예시적인 형태는 배양물에서 조밀한 돔-모양의 콜로니를 가지는 세포에 의해 특징화된다.
또다른 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양된 상기 인간 iPS 세포는 단일-세포 현탁액으로 기계적으로 또는 효소적으로 분리되고, 계대되며, 및/또는 계대배양될 수 있다. 한 실시예에서, 효소적 분리는 트립신을 이용하여 실행될 수 있다. 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지에 배양될 때, 인간 iPS 세포는 단일-세포 현탁액으로의 강화된 분리로 인하여 더 큰 형질변환 효과를 제공할 수 있다. 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지시키는데 전형적으로 이용되는 다른 유형의 배지 (가령, mTeSR™ 배지 또는 2i 배지)의 경우, 인간 iPS 세포의 분리는 기계적으로 또는 효소, 이를 테면 콜라게나제를 이용하여 실시되어야 한다. 결과적으로, 상기 세포는 효과적으로 또는 완벽하게 분리되지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지의 경우, 트립신을 이용하여 상기 세포를 분리시킬 수 있고, 이러한 강화된 분리에 의해 형질변환 효과는 증가된다. 더욱이, 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지시키는데 전형적으로 이용되는 다른 유형의 배지(가령, mTeSR™ 배지 또는 2i 배지)와 달리, 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지(바람직하게는 bFGF가 포함되지 않은 오스몰농도가 낮은 배지)에서 배양된 인간 iPS 세포의 효소적 분리는 이러한 세포의 계대에 일반적으로 필수적인 하나 또는 그 이상의 억제제 없이 실행될 수 있다. 생략될 수 있는 예시적인 억제제는 Rho-연합된 단백질 키나제 (ROCK) 억제제다. 사전-자가사멸성 경로 활성을 저해하기 위하여 인간 iPS 세포를 계대할 때, ROCK 억제제는 일반적으로 필수적이다.
추가 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양된 계대배양된 인간 iPS 세포는 효소적 분리 및 계대배양 후, 순수 또는 순수-외양 상태를 유지할 수 있다. 일부 실시예들에서, 계대배양된 인간 iPS 세포는 조밀한 돔-모양 콜로니를 특징으로 하는 형태를 지속적으로 나타낼 수 있다. 계대배양된 인간 iPS 세포는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 하나 또는 전분화능 표지들을 지속적으로 또한 발현시킬 수 있다.
C. 인간 유도된 다분화능 줄기 세포를 만들고 유지하기 위한 방법들
시험관 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 시험관 배양물에서 인간 iPS 세포를 유지시키기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다.
용어 "만들고(making)"란 세포 표현형, 유전자 발현, 또는 이 둘 모두에서 변화를 유도하는데 적합한 조건하에서 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 재프로그래밍 인자를 발현시키기 위하여 형질변화된 비-다능성 세포를 배양시키는 것을 포함하며, 상기 세포는 순수 또는 순수-외양 상태를 나타내는데, 가령, 순수 인간 iPS 세포의 하나 또는 그 이상의 특징들을 발현시킨다. 순수 또는 순수-외양 상태는 특정 배양 상태에 반응하여 발현될 수 있는데, 가령, 본 명세서에서 설명된 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양되어 발현될 수 있다. 일부 실시예들에서, 순수 또는 순수-외양 상태를 발현시키는 세포의 비율은 배양물에서 세포의 최소한 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 그리고 최대 100%가 된다.
한 구체예에서, 상기 방법은 순수 또는 순수-외양 인간 iPS 세포의 집단에 대하여 시험관 배양물을 풍부하게 한다(enriches). 이러한 구체예에서, 순수 또는 순수-외양 인간 iPS 세포는 순수 또는 순수-외양 상태를 발현시키지 않는 세포보다 선호적으로 배양물에서 증식될 수 있다. 또다른 구체예에서, 순수 또는 순수-외양 인간 iPS 세포는 배양물로부터 선별되고, 효소적으로 분리되고, 그리고 계대배양되어 순수 또는 순수-외양 인간 iPS 세포의 농축된 집단이 생산될 수 있다.
한 구체예에서, 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포는 최소한 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21, 또는 28 일, 또는 배양물에서 순수 또는 순수-외양 상태의 발현을 유도하는데 충분한 임의의 기간 동안 순수 또는 순수-외양 상태의 발현을 유도하는데 적합한 본 명세서에서 제공되는 배지에서 시험관내 배양된다. 형질변환된 세포는 최소한 1, 2, 3, 또는 4 주 동안 본 배지에서 배양될 수 있다. 때로 형질변환된 세포는 1-4 주 동안 배양된다. 순수 또는 순수-외양 상태의 발현은 본 명세서의 도처에서 설명된 형태학적 특징 또는 전분화능 표지들의 발현, 순수 또는 순수-외양 상태의 특징을 관찰함으로써 결정될 수 있다.
한 구체예에서, 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포는 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지에서 순수 또는 순수-외양 상태의 특징들이 발현될 때까지 배양된다. 그 다음 세포들은 순수 또는 순수-외양 상태가 유지되도록 하기 위하여 본 배지에 배양될 수 있다. 또다른 구체예에서, 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포는 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양되기 전, 오스몰농도가 높은 배지에서 일차 배양된다. 이러한 오스몰농도가 높은 배지는 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지보다 오스몰농도 더 높고, 그리고 bFGF를 포함할 수 있다. 일부 오스몰농도가 높은 배지는 소 혈청 알부민, bFGF, 형질변환 성장 인자 β (TGFβ), 염화리튬, 피페콜산, 및 감마-아미노부틸산 (GABA)중 하나 또는 그 이상을 포함한다. 오스몰농도가 높은 배지의 예로는 mTeSR™ 배지 (Stemcell Technologies)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포는 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지에서 상기 세포가 배양되어 순수 또는 순수-외양 상태의 특징들을 발현하기 시작할 때까지 bFGF가 포함된 오스몰농도가 높은 배지에서 일차 배양된다. 한 실시예에서, 세포는 최소한 1, 2, 5, 10, 30, 60, 또는 90 일의 기간, 1, 2, 4, 8, 또는 12 주의 기간, 또는 1 일 내지 3 개월의 기간 동안 bFGF가 포함된 오스몰농도가 높은 배지에서 일차 배양될 수 있다. bFGF가 포함된 오스몰농도가 높은 배지에서 배양을 위한 예시적인 기간은 2 개월이다.
다른 구체예들에서, 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포는 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지에서 상기 세포가 배양되어 3차원적 세포 덩어리(clumps)에 의해 특징화되는 형태를 나타내기 시작할 때까지 bFGF가 포함된 오스몰농도가 높은 배지에서 일차 배양된다. 이러한 구체예들에서, 3차원적 덩어리를 나타내는 세포가 선별되고, 분리되고 (가령, 트립신에 의해), 그리고 본 명세서에서 설명된 오스몰농도가 낮은 배지에서 새로운 배양물로 이전될 수 있다.
용어 "유지하다(maintain)", "유지하는(maintaining)", 및 "유지(maintenance)"는 본 명세서에서 설명된 상기 인간 iPS 세포의 최소한 하나 또는 그 이상의 특징 및 표현형의 보전을 포함한다. 이러한 특징들은 순수 세포의 전분화능, 세포 형태, 유전자 발현 프로파일, 및/또는 다른 기능적 특징들의 유지를 포함할 수 있다. 용어 "유지하다(maintain)", "유지하는(maintaining)", 및 "유지(maintenance)"는 세포의 증식 및/또는 배양된 순수 세포 수의 증가를 또한 포괄할 수 있다. 상기 용어는 세포가 프라임된 또는 비-다능성 상태로의 전환을 막는 배양 조건을 포함한다. 상기 용어는 상기 세포가 다능성 및/또는 순수를 유지하도록 하는 배양 조건을 더 포함하고, 한편 상기 세포는 분할 또는 수의 증가를 지속하거나 또는 지속하지 않을 수 있다.
한 구체예에서, 인간 iPS 세포는 순수 또는 순수-외양 상태로 세포를 유지시키는데 적합한 본 명세서에서 제공된 배지에서 시험관 배양된다. 특정 실시예에서, 인간 iPS 세포는 상기 배양된 세포가 순수 또는 순수-외양 상태를 유지하는 한, 1, 2, 5, 7, 10, 14, 21, 또는 28 일의 기간 동안, 또는 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 또는 그 이상의 기간 동안 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 세포는 최소한 1, 2, 3 또는 4 주 동안 배양될 수 있다. 때로 세포는 1-4 주 동안 배양된다. 인간 iPS 세포는 예를 들면, 배양물에서 세포의 증식, 상기 세포의 유전적 변형, 및/또는 세포의 계대배양을 위한 임의의 충분한 기간 동안 유지될 수 있다.
또다른 구체예에서, 인간 iPS 세포 또는 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포는 시험관 배양에 적합한 기질 또는 먹이공급 세포 층 상에서 배양될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포는 MATRIGEL™ (BD Biosciences)에서 배양된다. 또다른 실시예에서, 세포는 신생 인간 포피 섬유아세포 (NuFF) 먹이공급 세포 상에서 배양된다. 또다른 실시예에서, 세포는 GELTREX™ (Life Technologies)에서 배양된다.
추가 구체예에서, 본 발명의 오스몰농도가 낮은 배지에서 배양된 인간 iPS 세포의 배가 시간은 프라임된 인간 iPS 세포 또는 다능성 상태를 발현시키기 위하여 형질변환된 비-다능성 세포와 비교하였을 때 감소된다. 특정 실시예에서, 인간 iPS 세포의 배가 시간은 약 16-24 시간이다.
7. 서열 동일성
본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 상기 표적화된 게놈 통합 시스템 (가령, 뉴클레아제 물질들, 인지 부위들, 삽입 핵산, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 표적화 벡터, 선별 표지들 및 다른 성분들)의 다양한 상이한 성분들을 이용한다. 설명을 통하여 상기 표적화된 게놈 통합 시스템의 일부 성분들은 활성 변이체와 단편들을 보유할 수 있음이 인지된다. 이러한 성분들은 예를 들면, 뉴클레아제 물질들 (가령, 공작된 뉴클레아제 물질들), 뉴클레아제 물질 인지 부위들, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 상기 표적화 벡터의 표적 부위들 및 대응하는 상동성 아암을 포함한다. 각각의 이들 성분들의 생물학적 활성은 본 명세서의 도처에서 설명된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내용에서 "서열 동일성(sequence identity)" 또는 "동일성(identity)"은 특정 비교 창을 통하여 최대 상응이 허용되도록 배열될 때, 두 서열에서 동일한 잔기를 지칭한다. 단백질에 관하여 서열 동일성 비율이 이용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 흔히 상이하게 되며, 이때 아미노산 잔기들은 유사한 화학 성질 (가령, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기로 대체되며, 따라서, 이 분자의 기능적 성질은 변화되지 않음이 인지된다. 보존적 치환으로 서열이 상이할 때, 서열 동일성 백분율은 치환의 보존적 성질에 대하여 정확하게 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성(sequence similarity)" 또는 "유사성(similarity)"을 갖는다고 말한다. 이러한 조정을 만드는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 보존적 치환을 완전한 불일치로 기록하기 보다는 부분적인 불일치로 기록하고, 이로 인하여 서열 동일성 백분율은 증가된다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산은 점수 1로 기록되고, 비-보존적 치환은 점수 0으로 기록될 때, 보존적 치환은 0과 1 사이의 점수로 기록된다. 보존적 치환의 점수는 가령, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 이행된 것과 같이, 산출될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "서열 동일성의 백분율"은 비교 창을 통하여 최적으로 배열된 2개 서열을 비교함으로써 측정된 값을 말하는데, 이때 비교 창에 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 배열 위한 기준 서열(추가 또는 결손을 포함하지 않은)과 비교하였을 때 추가 또는 결손 (가령, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 양쪽 서열에서 동일한 핵산 기본 또는 아미노산 잔기에 의해 정합되는 위치의 수를 얻고, 정합되는 위치의 수를 비교 창에서 총 위치 수로 나누고, 그리고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 얻음으로써, 산출된다.
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 제공되는 동일성/유사성 값은 다음의 매개변수를 이용하여, GAP 버젼 10에 의해 획득된 값을 지칭한다: GAP Weight 50 및 Length Weight 3 그리고 nwsgapdna.cmp 득점 매트릭스를 이용하여 뉴클레오티드 서열의 동일성 %와 유사성 %; GAP Weight 8 및 Length Weight 2, 및 BLOSUM62 득점 매트릭스를 이용한 아미노산 서열의 동일성 %와 유사성 %; 또는 임의의 등가 프로그램. "등가 프로그램"이란 GAP Version 10에 의해 생성된 대응하는 배열 유전자와 비교하였을 때, 임의의 문제의 2개 서열의 경우, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 일치 및 동일한 서열 동일성 백분율을 갖는 배열을 만드는 임의의 서열 비교 프로그램을 의미한다.
명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 발명의 실시 또는 테스트에 있어서 본 명세서에서 설명된 것들과 유사한 또는 대등한 임의의 방법 및 재료들이 이용될 수 있지만, 바람직한 방법들과 재료들이 지금 설명된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개는 이들의 언급과 연계된 방법 및/또는 재료의 공개 및 설명을 하기 위하여 이 참고자료에 편입된다.
본 명세서에서 및 첨부된 청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수("a", "그리고" 및 "the")는 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서 논의된 공개는 본 출원 출원일 이전에 이들의 공개만을 위하여 제공된다. 본 명세서에서 설명된 발명자들은 선행 발명에의해 이러한 공개를 선행자격이 없는 것을 인정하는 것으로 간주되는 것은 없다. 더욱이, 제공되는 공개 일은 실제 공개일자와 상이할 수 있으며, 이는 개별적으로 확인해볼 필요가 있을 수 있다.
설명된 발명은 이의 사상 또는 필수적인 기여와 벗어나지 않고, 다른 특이적 형태로 구체화될 수 있으며, 따라서, 본 발명의 범위는 전술한 명세서보다는 첨부된 청구범위를 참고해야 한다.
비-제한적인 구체예들은 다음을 포함한다:
1. 다능성 렛 세포에서 관심 대상의 게놈 좌의 표적화된 변형을 위한 방법에 있어서, 이 방법은 (a) 상기 다능성 렛 세포 안으로 5' 렛 상동성 아암과 3' 렛 상동성 아암의 측면에 있는 삽입 핵산이 포함된 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도입시키고, 이때 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 10 kb이지만 그러나 150 kb보다는 적고; 그리고 (b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 렛 세포를 식별해내는 것을 포함하고, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 생식계열을 통하여 유전될 수 있는, 방법.
2. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질인, 방법.
3. 구체예 1 또는 2의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 렛 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
4. 구체예 1, 2 또는 3의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 DA 균주 또는 ACI 균주로부터 유도된, 방법.
5. 구체예 1-4중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, 또는 이의 조합이 포함된 최소한 하나의 전분화능 표지의 발현에 의해 특징화되는, 방법.
6. 구체예 1-4중 임의의 하나의 방법에 있어서 이때 상기 다능성 렛 세포는 다음중 하나 또는 그이상에 의해 특징화되는 방법:
(a) c-Myc, Ecat1, 및/또는 Rexo1을 포함하는 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지들의 발현 결핍; (b) Brachyury 및/또는 Bmpr2를 포함하는 중배엽 표지들의 발현 결핍; (c) Gata6, Sox17 및/또는 Sox7을 포함하는 하나 또는 그 이상의 내배엽 표지들의 발현 결핍; 또는 (d) Nestin 및/또는 Pax6을 포함하는 하나 또는 그 이상의 신경 표지들의 발현 결핍.
7. 구체예 1-6중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb인, 방법.
8. 구체예 1-6중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 16 kb 내지 약 150 kb인, 방법.
9. 구체예 1-8중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 방법: (a) 내생성 렛 핵산 서열은 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열로 대체; (b) 내생성 렛 핵산 서열의 결손; (c) 내생성 렛 핵산 서열의 결손, 이때 상기 결손 범위은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb이며; (d) 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb의 외생성 핵산 서열; (e) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열; (f) 인간 및 렛 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열; (g) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자; 또는 (h) 렛 세포 안에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포터 유전자.
10. 구체예 1-9중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 (i) 5' 렛 상동성 아암에 상보적인 제 1 핵산 서열; 그리고 (ii) 3' 렛 상동성 아암에 상보적인 제 2 핵산 서열을 포함하는, 방법.
11. 구체예 10의 방법에 있어서, 이때 제 1과 제 2 핵산 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만으로 떨어져 있는, 방법.
12. 구체예 10의 방법에 있어서, 이때 제 1 및 제 2 핵산 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1 Mb 미만, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb 미만, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb 미만으로 떨어져 있는, 방법.
13. 구체예 1-12중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 도입 단계는 (a) 상기 다능성 렛 세포에서 상기 표적화 구조체와 상기 관심 대상의 게놈 좌 사이에 상동성 재조합을 촉진시키는 뉴클레아제 물질이 인코딩된 제 2 핵산을 도입시키는 것을 더 포함하는, 방법.
14. 구체예 13의 방법에 있어서, 이때 상기 뉴클레아제 물질은 (a) FokI 엔도뉴클레아제에 융합된 아연 핑거-기반의 DNA 결합 도메인이 포함된 키메라 단백질; 또는 (b) FokI 엔도뉴클레아제에 융합된 전사 활성화물질-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN)가 포함된 키메라 단백질을 포함하는, 방법.
15. 구체예 1-12중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 도입 단계는 (a) 상기 다능성 렛 세포 안으로 다음을 도입시키는 것을 더 포함하는 방법: (i) 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)-연합된 (Cas) 단백질을 인코드하는 제 1 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 제 1 프로모터가 포함된 제1 발현 구조체, (ii) 가이드 RNA (gRNA)에 연계된 게놈 표적 서열에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체, 이때 상기 게놈 표적 서열은 3' 단부 상에 프로토스페이스 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif) 서열의 측면에 바로 있다.
16. 구체예 15의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 서열 번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
17. 구체예 15 또는 16의 방법에 있어서, 이때 gRNA는 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR) RNA (crRNA) 및 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인코드하는 제 3 핵산 서열을 포함하는, 방법.
18. 구체예 15, 16 또는 17의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
19. 구체예 15, 16, 17, 또는 18의 방법에 있어서, 이때 gRNA는 다음을 포함하는, 방법: (a) 서열 번호: 2의 핵산 서열의 키메라 RNA; 또는 (b) 서열 번호: 3의 핵산 서열의 키메라 RNA.
20. 구체예 17의 방법에 있어서, 이때 crRNA는 서열 번호: 4; 서열 번호: 5; 또는 서열 번호: 6을 포함하는, 방법.
21. 구체예 17의 방법에 있어서, 이때 tracrRNA는 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 8을 포함하는, 방법.
22. 다음을 포함하는 변형된 렛 게놈 좌: (i) 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열의 삽입; (ii) 내생성 렛 핵산 서열은 상기 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 대체; 또는 (iii) 이의 조합, 이때 상기 변형된 렛 게놈 좌 생식계열을 통하여 유전될 수있다.
23. 구체예 22의 변형된 렛 게놈 좌에 있어서, 이때 상기 삽입 또는 대체 크기는 약 5 kb 내지 약 400 kb인, 변형된 렛 게놈 좌.
24. 구체예 22의 변형된 렛 게놈 좌에 있어서, 이때 상기 삽입 또는 대체의 크기는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb인, 변형된 렛 게놈 좌.
25. 인간화된 렛을 만드는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법: (a) 유전적으로 변형된 다능성 렛 세포가 형성되도록 하기 위하여, 다능성 렛 세포 안에 관심 대상의 게놈 좌에 인간 핵산이 포함된 표적화 구조체를 표적화시키고; (b) 상기 유전적으로 변형된 다능성 렛 세포를 숙주 렛 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (c) 상기 숙주 렛 배아를 대리모에 임신시키고; 이때 대리모는 (i) 인간 핵산 서열의 삽입; (ii) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 렛 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 대체; (iii) 인간과 렛 핵산 서열을 포함하는 키메라 핵산 서열; 또는 (iv) 이의 조합이 포함된 변형된 게놈 좌를 렛 자손을 낳고, 이때 상기 변형된 게놈 좌 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
26. 구체예 25의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화 구조체는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이며, LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 최소한 10 kb 그러나 150 kb 미만인, 방법.
27. 구체예 26의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화 구조체의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 30 kb, 약 20 kb 내지 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 또는 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb인, 방법.
28. 구체예 25, 26 또는 27의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 핵산 서열은 최소한 5 kb 그러나 400 kb 미만인, 방법.
29. 구체예 25, 26, 또는 27의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 핵산 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 200 kb 그러나 250 kb 미만, 최소한 250 kb 그러나 300 kb 미만, 최소한 300 kb 그러나 350 kb 미만, 또는 최소한 350 kb 그러나 400 kb 미만인, 방법.
30. 구체예 25-29중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 렛 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
31. 구체예 25-30중 어느 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 DA 균주 또는 ACI 균주로부터 유도된, 방법.
32. 구체예 25-31중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, 또는 이의 조합이 포함된 최소한 하나의 전분화능 표지의 발현에 의해 특징화되는, 방법.
33. 구체예 25-31중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 다음의 특징중 하나 또는 그 이상에 의해 특징화되는, 방법: (a) c-Myc, Ecat1, 및/또는 Rexo1을 포함하는 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지들의 발현 결핍; (b) Brachyury 및/또는 Bmpr2를 포함하는 하나 또는 그 이상의 중배엽 표지들의 발현 결핍; (c) Gata6, Sox17 및/또는 Sox7을 포함하는 하나 또는 그 이상의 내배엽 표지들의 발현 결핍; 또는 (d) Nestin 및/또는 Pax6을 포함하는 하나 또는 그 이상의 신경 표지들의 발현 결핍.
34. 인간화된 게놈 좌를 포함하는 변형된 렛에 있어서, 다음을 포함하는 상기 인간화된 게놈 좌: (i) 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열의 삽입; (ii) 내생성 게놈 좌에서 렛 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산 서열로 대체; (iii) 인간과 렛 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열 또는 (iv) 이의 조합을 포함하고, 이때 상기 인간화된 게놈 좌 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
35. 게놈 좌에서 이의 표적화된 유전적 변형이 포함된 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 또는 Rag2/Rag1 좌이며, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 렛 또는 렛 세포: (a) 상기 게놈 좌에서 내생성 렛 핵산 서열의 결손; (b) 상동성 핵산, 이종상동성 핵산, 또는 인간과 렛 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산의 삽입, 또는 (c) 이의 조합, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 렛의 생식계열 또는 상기 렛 세포로부터 증식된 렛의 생식계열을 통화여 유전될 수 있다.
36. 구체예 35의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 (a) 상기 게놈 좌에서 내생성 렛 핵산의 결손은 최소한 약 10 kb이며; 또는 (b) 상기 게놈 좌에서 내생성 렛 핵산의 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb이며; (c) 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산 핵산의 삽입은 최소한 약 5 kb이며; 또는 (d) 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산 핵산의 삽입은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb인, 방법.
37. 구체예 35 또는 36의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 (a) 인터루킨-2 수용체 감마 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형에 의해 인터루킨-2 수용체 감마 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; (b) ApoE 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 ApoE 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; (c) Rag1 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 Rag1 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; (d) Rag2 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 Rag2 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; 또는 (e) Rag2/Rag1 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 Rag2 단백질 활성 및 Rag1 활성의 감소 또는 부재가 초래되는, 방법.
38. 구체예 35, 36, 또는 37의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 렛 또는 렛 세포: (a) 전체 렛 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; (b) 전체 렛 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역 또는 이의 부분이 인간 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역 또는 이의 부분으로 대체; (c) 상기 렛 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역의 엑토-도메인이 인간 인터루킨-2 수용체 감마의 엑토-도메인으로 대체; 또는 (d) 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 최소한 3kb 결손.
39. 구체예 35-37중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 ApoE 좌의 표적화된 유전적 변형은 (a) 전체 ApoE 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; 또는 (b) ApoE 코딩 영역이 포함된 ApoE 좌의 최소한 1.8 kb 결손을 포함하는 렛 또는 렛 세포.
40. 구체예 35-37중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 Rag2 좌의 표적화된 유전적 변형은 (a) 전체 Rag2 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; 또는 (b) Rag2 코딩 영역이 포함된 Rag2 좌의 최소한 5.7 kb 결손을 포함하는 렛 또는 렛 세포.
41. 구체예 35-37중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 Rag2/Rag1 좌의 표적화된 유전적 변형은 (a) 전체 Rag2 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손과 전체 Rag1 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; 또는 (b) Rag2 코딩 영역이 포함된 Rag2/Rag1 좌의 최소한 16kb의 결손을 포함하는 렛 또는 렛 세포.
42. 구체예 35-41중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 또는 Rag2/Rag1 좌에서 선별 표지가 포함된 발현 카세트의 삽입을 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
43. 구체예 42중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 발현 카세트는 상기 게놈 좌에서 내생성 프로모터에 작동가능하도록 연계된 lacZ 유전자와 선별 표지에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
44. 구체예 35-43중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌 또는 Rag2/Rag1 좌에서 표적화된 유전적 변형은 자가-결손 선별 카세트의 삽입을 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
45. 구체예 44의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 자가-결손 선별 카세트는 상기 렛 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선별 표지 유전자 와 수컷 생식 세포-특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된 재조합효소 유전자를 포함하고, 이때 상기 자가-결손 카세트는 상기 재조합효소에 의해 인지되는 재조합 인지 부위들의 측면에 있는, 렛 또는 렛 세포.
46. 구체예 45의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 (a) 상기 수컷 생식 세포-특이적 프로모터는 Protamine-1 프로모터이며; 또는 (b) 상기 재조합효소 유전자는 Cre를 인코드하고, 그리고 상기 재조합 인지 부위들은 loxP 부위들인, 렛 또는 렛 세포.
47. 구체예 35-46중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산 서열의 삽입은 내생성 인터루킨-2 수용체 감마 프로모터, 내생성 ApoE 프로모터, 내생성 Rag1 프로모터, 또는 내생성 Rag2 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포트 핵산을 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
48. 구체예 47의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 리포터 핵산은 β-갈락토시다제, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 강화된 황색 형광 단백질 (EYFP), Emerald, 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), CyPet, 시안 형광 단백질 (CFP), Cerulean, T-Sapphire, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 또는 이의 조합이 포함된 리포터를 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
49. 구체예 35-48중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 렛 세포는 다능성 렛 세포 또는 렛 배아 줄기 (ES) 세포인, 렛 또는 렛 세포.
50. 구체예 49의 렛 세포에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포 또는 상기 렛 배아 줄기 (ES) 세포는 (a) DA 균주 또는 ACI 균주로부터 유도되고; (b) Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, 또는 이의 조합이 포함된 최소한 하나의 전분화능 표지의 발현에 의해 특징화되며; 또는 (c) 다음 특징중 하나 또는 그 이상에 의해 특징화되는, 렛 세포: (i) c-Myc, Ecat1, 및/또는 Rexo1을 포함하는 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지들의 발현 결핍; (ii) Brachyury 및/또는 Bmpr2를 포함하는 중배엽 표지들의 발현 결핍; (iii) Gata6, Sox17 및/또는 Sox7을 포함하는 하나 또는 그 이상의 내배엽 표지들의 발현 결핍; 또는 (iv) Nestin 및/또는 Pax6을 포함하는 하나 또는 그 이상의 신경 표지들의 발현 결핍.
51. 다능성 렛 세포에서 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌 또는 Rag2/Rag1 좌에서 표적 게놈 좌를 변형시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법: (a) 상기 표적 게놈 좌에 상동성인 5' 상동성 아암과 3' 렛 상동성 아암의 측면에 삽입 핵산이 포함된 표적화 벡터를 다능성 렛 세포 안으로 도입시키고, (b) 상기 표적 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 유전적으로 변형된 다능성 렛 세포를 식별해내고, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 다능성 렛 세포로부터 증식된 렛의 생식계열을 통하여 유전될 수 있다.
52. 구체예 51의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화 벡터는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이며, 이때 5' 상동성 아암과 3' 렛 상동성 아암의 총 합은 최소한 약 10 kb 그러나 약 150 kb미만인, 방법.
53. 구체예 51 또는 52의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화 벡터를 상기 다능성 렛 세포로 도입에 의해 (i) 상기 표적 게놈 좌에서 내생성 렛 핵산 서열의 결손; (ii) 상기 표적 게놈 좌에서 외생성 핵산 서열의 삽입; 또는 (iii) 이의 조합이 유도되는, 방법.
54. 구체예 53의 방법에 있어서, 이때 (a) 상기 게놈 좌에서 내생성 렛 핵산의 결손은 최소한 약 10 kb이며; 또는 (b) 상기 게놈 좌에서 내생성 렛 핵산의 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb이며; (c) 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산 핵산의 삽입은 최소한 약 5 kb이거나; 또는 (d) 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산 핵산의 삽입은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb인, 방법.
55. 구체예 51-54중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 (a) 인터루킨-2 수용체 감마 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형에 의해 인터루킨-2 수용체 감마 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; (b) ApoE 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 ApoE 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; (c) Rag1 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 Rag1 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; (d) Rag2 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 Rag2 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되며; 또는 (e) Rag2/Rag1 좌에서 표적화된 유전적 변형에 의해 Rag2 단백질 활성 및 i Rag1 단백질 활성의 감소 또는 부재가 초래되는, 방법.
56. 구체예 51-54중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 렛 또는 렛 세포: (a) 전체 렛 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; (b) 전체 렛 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역 또는 이의 부분이 인간 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역 또는 이의 부분으로 대체; (c) 상기 렛 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역의 엑토-도메인이 인간 인터루킨-2 수용체 감마의 엑토-도메인으로 대체; 또는 (d) 인터루킨-2 수용체 감마 코딩 영역이 코딩된 인터루킨-2 수용체 감마 좌의 최소한 3kb 결손.
57. 구체예 51-55중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 ApoE 좌의 표적화된 유전적 변형은 (a) 전체 ApoE 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; 또는 (b) ApoE 코딩 영역이 포함된 ApoE 좌의 최소한 1.8 kb 결손을 포함하는 방법.
58. 구체예 51-55중 임의의 방법에 있어서, 이때 Rag2 좌의 표적화된 유전적 변형은 (a) 전체 Rag2 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; 또는 (b) Rag2 코딩 영역이 포함된 Rag2 좌의 최소한 5.7 kb 결손을 포함하는 방법.
59. 구체예 51-55중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 Rag1/Rag2 좌의 표적화된 유전적 변형은 (a) 전체 Rag2 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손과 전체 Rag1 코딩 영역 또는 이의 부분의 결손; 또는 (b) Rag2 및 Rag1 코딩 영역이 포함된 Rag2/Rag1 좌의 최소한 16kb의 결손을 포함하는 방법.
60. 구체예 51-59중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 삽입 핵산은 선별 표지가 인코드된 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 카세트를 포함하는, 방법.
61. 구체예 60 방법에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 게놈 좌에서 내생성 프로모터에 작동가능하도록 연계된 lacZ 유전자와 선별 표지 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는, 방법.
62. 구체예 51-60중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 삽입 핵산은 자가-결손 선별 카세트를 포함하는, 방법.
63. 구체예 62의 방법에 있어서, 이때 자가-결손 선별 카세트는 상기 렛 다능성 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선별 표지와 수컷 생식 세포-특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된 재조합효소를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이때 상기 자가-결손 카세트는 상기 재조합효소에 의해 인지되는 재조합 인지 부위들의 측면에 있는, 방법.
64. 구체예 63의 방법에 있어서, 이때 (a) 상기 수컷 생식 세포-특이적 프로모터는 Protamine-1 프로모터이며; 또는 (b) 상기 재조합효소 유전자는 Cre를 인코드하고, 그리고 상기 재조합 인지 부위들은 loxP 부위들인, 방법.
65. 구체예 53의 방법에 있어서, 이때 상기 게놈 좌에서 외생성 핵산 서열의 삽입은 내생성 인터루킨-2 수용체 감마 프로모터, 내생성 ApoE 프로모터, 내생성 Rag1 프로모터, 또는 내생성 Rag2 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포트 핵산 서열을 포함하는, 방법.
66. 구체예 65의 방법에 있어서, 이때 상기 리포터 핵산은 β-갈락토시다제, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 강화된 황색 형광 단백질 (EYFP), Emerald, 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), CyPet, 시안 형광 단백질 (CFP), Cerulean, T-Sapphire, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 또는 이의 조합이 포함된 리포터를 포함하는, 방법.
67. 구체예 51-66중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 렛 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
68. 구체예 51-67중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 렛 세포는 (a) DA 균주 또는 ACI 균주로부터 유도되며; 또는 (b) Oct-4, Sox-2, 알칼리 포스파타제, 또는 이의 조합이 포함된 전분화능 표지의 발현에 의해 특징화되거나; 또는 (c) 다음 특징중 하나 또는 그 이상에 의해 특징화되는, 방법. (i) c-Myc, Ecat1, 및/또는 Rexo1이 포함된 하나 또는 그 이상의 전분화능 표지들 발현 결핍(ii) Brachyury 및/또는 Bmpr2가 포함된 중배엽 표지들의 발현 결핍, iii) Gata6, Sox17 및/또는 Sox7이 포함된 하나 또는 그 이상의 내배엽 표지들의 발현 결핍; 또는 (iv) Nestin 및/또는 Pax6이 포함된 하나 또는 그 이상의 신경 표지들의 발현 결핍.
69. 구체예 51-68중 임의의 하나의 방법에 있어서, 상기 표적 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형을 식별해내는 것을 더 포함하며, 이때 상기 식별 단계는 상기 표적 게놈 좌에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 평가하기 위한 정량적 분석을 이용하는, 방법.
70. 구체예 51-69중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 도입 단계는 (a) 상기 다능성 렛 세포에서 상기 표적화 벡터와 표적 게놈 좌 사이에 상동성 재조합을 촉진시키는 뉴클레아제 물질이 인코딩된 제 2 핵산을 도입시키는 것을 더 포함하는, 방법.
71. 구체예 70의 방법에 있어서, 이때 상기 뉴클레아제 물질은 FokI 엔도뉴클레아제에 융합된 아연 핑거-기반의 DNA 결합 도메인이 포함된 키메라 단백질을 포함하는, 방법.
72. 구체예 71의 방법에 있어서, 이때 상기 방법은 상기 표적 게놈 좌의 이중-대립형질 변형을 야기하는, 방법.
73. 구체예 51-70중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 도입 단계는 (a) 상기 다능성 렛 세포 안으로 다음을 도입시키는 것을 더 포함하는 방법: (i) 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)-연합된 (Cas) 단백질을 인코드하는 제 1 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된 제 1 프로모터가 포함된 제1 발현 구조체, (ii) 가이드 RNA (gRNA)에 연계된 게놈 표적 서열에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체, 이때 상기 게놈 표적 서열은 3' 단부 상에 프로토스페이스 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif)의 측면에 바로 있다.
74. 구체예 73의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 서열 번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
75. 구체예 73 또는 74의 방법에 있어서, 이때 gRNA는 클러스트화된 규칙적으로 사이공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR) RNA (crRNA) 및 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 인코드하는 제 3 핵산 서열을 포함하는, 방법.
76. 구체예 73의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
77. 구체예 73, 74, 또는 75의 방법에 있어서, 이때 gRNA는 다음을 포함하는, 방법: (a) 서열 번호: 2의 핵산 서열의 키메라 RNA; 또는 (b) 서열 번호: 3의 핵산 서열의 키메라 RNA.
78. 구체예 75의 방법에 있어서, 이때 crRNA는 서열 번호: 4; 서열 번호: 5; 또는 서열 번호: 6을 포함하는, 방법.
79. 구체예 75의 방법에 있어서, 이때 tracrRNA는 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 8을 포함하는, 방법.
80. 구체예 35-50중 임의의 하나의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 렛 또는 렛 세포는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 및/또는 Rag2/Rag1 좌에서 표적화된 유전적 변형을 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
81. 구체예 80의 렛 또는 렛 세포에 있어서, 이때 상기 렛 또는 렛 세포는 인터루킨-2 수용체 감마 좌와 Rag2/Rag1 좌에서 유전적 변형을 포함하는, 렛 또는 렛 세포.
추가적인 비-제한적인 구체예들은 다음을 포함한다::
1. 진핵 세포에서 관심 대상의 게놈 좌를 변형시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:(a) 상기 진핵 세포 안으로 다음의 것들을 도입시키고: (i) 5' 상동성 아암(arm) 및 3' 상동성 아암이 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC), 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며; (ii) 제 2 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연결된 제 1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체(expression construct), (iii) 표적 서열과 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열이 포함된 가이드 RNA (gRNA)이 인코드된 제 3 핵산에 작동가능하도록 연결된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체, 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 진핵 세포 안에서 활성이며; 그리고 (b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 변형된 진핵 세포를 식별해낸다.
2. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형인, 방법.
3. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb인, 방법.
4. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb인, 방법.
5. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 진핵 세포는 포유류 세포인, 방법.
6. 구체예 5의 방법에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 섬유아 세포인, 방법.
7. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 진핵 세포는 다능성 세포인, 방법.
8. 구체예 7의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 세포는 인간 다능성 세포인, 방법.
9. 구체예 8의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 인간 성인 줄기 세포인, 방법.
10. 구체예 8의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포인, 방법.
11. 구체예 8의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포인, 방법.
12. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
13. 구체예 1의 방법에 있어서, 상기 표적 서열은 3' 단부 상에 프로토스페이스 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif (PAM)) 서열의 바로 측면에 있는, 방법.
14. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 150 kb인, 방법.
15. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb인, 방법.
16. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 방법:(a) 내생성 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열로 대체; (b) 내생성 핵산 서열의 결손; (c) 내생성 핵산 서열의 결손, 이때 상기 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb이며; (d) 외생성 핵산 서열의 삽입; (e) 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열의 삽입; (f) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열의 삽입; (g) 인간 및 비-인간 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열의 삽입; (h) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자의 삽입; (i) 상기 다능성 세포 안에서 활성인 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선택성 표지 또는 리포터 유전자의 삽입; 또는 (j) 이의 조합.
17. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 (i) 5' 상동성 아암에 상동성인 5' 표적 서열; 그리고 (ii) 3' 상동성 아암에 상동성인 3' 표적 서열을 포함하는, 방법.
18. 구체예 17의 방법에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리되는, 방법.
19. 구체예 17의 방법에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1 Mb 미만, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb 미만, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb 미만에 의해 떨어져 있는, 방법.
20. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 또는 Rag1과 Rag2 좌 모두를 포함하는, 방법.
21. 구체예 1의 방법에 있어서, 이때 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
22. 게놈을 변형시키는 방법에 있어서, 이 방법은 최소한 10 kb의 핵산 서열이 포함된 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에 Cas 단백질 및 CRISPR RNA에 노출시키는 것을 포함하며, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, 그리고 LTVEC에 노출된 후, 상기 게놈은 최소한 10 kb 핵산 서열이 포함되도록 변형되는 것을 포함하는, 방법.
23. 구체예 22의 방법에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
24. 구체예 22의 방법에 있어서, 이때 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
25. 게놈을 변형시키는 방법에 있어서, 이 방법은 상기 게놈을 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에 Cas 단백질, 표적 서열에 혼성화되는 CRISPR RNA, 그리고 tracrRNA에 접촉시키는 것을 포함하고, 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고, 이때 LTVEC 존재하에서 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA에 접촉된 후, 상기 게놈은 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산을 포함하도록 변형되는 것을 포함하는, 방법.
26. 구체예 25의 방법에 있어서, 이때 상기 게놈은 진핵 세포 안에 있으며, 그리고 Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 LTVEC가 상기 진핵 세포 안으로 도입되는, 방법.
27. 구체예 26의 방법에 있어서, 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 변형된 진핵 세포를 식별해내는 것을 더 포함하는, 방법.
28. 구체예 26 또는 27의 방법에 있어서, 이때 CRISPR RNA와 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA) 형태로 함께 도입되는, 방법.
29. 구체예 26 또는 27의 방법에 있어서, 이때 CRISPR RNA 및 tracrRNA는 별도로 도입되는, 방법.
30. 구체예 26-29중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때: (a) Cas 단백질은 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 상기 진핵 세포 안으로 도입되며; (b) CRISPR RNA는 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 진핵 세포 안으로 도입되며; 그리고 (c)tracrRNA는 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 진핵 세포 안으로 도입되는, 방법.
31. 구체예 30의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 상기 진핵 세포 안에 단백질-RNA 복합체로 도입되는, 방법.
32. 구체예 30의 방법에 있어서, 이때: (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고 (c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 상기 진핵 세포안에서 활성인, 방법.
33. 구체예 32의 방법에 있어서, 이때 제 1, 제 2, 및/또는 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
34. 구체예 30의 방법에 있어서, 이때: (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고 (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고; 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 진핵 세포 안에서 활성인, 방법.
35. 구체예 34의 방법에 있어서, 이때 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
36. 구체예 27-35중 임의의 하나의 방법에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함하는, 방법.
37. 구체예 27-36중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형인, 방법.
38. 구체예 37의 방법에 있어서, 이때 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
39. 구체예 27-36중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 변형된 진핵 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성인, 방법.
40. 구체예 39의 방법에 있어서, 이때 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
41. 구체예 39의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 방법: (1) 2개의 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴.
42. 구체예 25-41중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb인, 방법.
43. 구체예 25-42중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb인, 방법.
44. 구체예 25-43중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 제 1 핵산은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 최소한 200 kb, 최소한 250 kb, 또는 최소한 300 kb인, 방법.
45. 구체예 26-44중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 진핵 세포는 포유류 세포인, 방법.
46. 구체예 45의 방법에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 섬유아세포인, 방법.
47. 구체예 26-43중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 진핵 세포는 다능성 세포인, 방법.
48. 구체예 47의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 세포는 비-인간 다능성 세포인, 방법.
49. 구체예 48의 방법에 있어서, 이때 상기 비-인간 다능성 세포는 설치류 다능성 세포.
50. 구체예 49의 방법에 있어서, 이때 상기 설치류 다능성 세포는 마우스 또는 렛 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
51. 구체예 47의 방법에 있어서, 이때 상기 다능성 세포는 인간 다능성 세포인, 방법.
52. 구체예 51의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 인간 성인 줄기 세포인, 방법.
53. 구체예 51의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포인, 방법.
54. 구체예 51의 방법에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포인, 방법.
55. 구체예 25-54중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
56. 구체예 25-55중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 측면에 있는, 방법.
57. 구체예 25-56중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 150 kb인, 방법.
58. 구체예 25-57중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb인, 방법.
59. 구체예 27-58중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는 방법: (a)내생성 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열로 대체; (b) 내생성 핵산 서열의 결손; (c) 내생성 핵산 서열의 결손, 이때 상기 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb 범위이며; (d) 외생성 핵산 서열의 삽입; (e) 약 5kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열의 삽입; (f) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열의 삽입; (g) 인간 및 비-인간 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열의 삽입; (h) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자의 삽입; (i) 상기 다능성 세포 안에서 활성인 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선택성 표지 또는 리포터 유전자의 삽입; 또는 (j) 이의 조합.
60. 구체예 25-59중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 (i) 5' 상동성 아암에 상동성인 5' 표적 서열; 그리고 (ii) 3' 상동성 아암에 상동성인 3' 표적 서열을 포함하는, 방법.
61. 구체예 60의 방법에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리되는, 방법.
62. 구체예 60의 방법에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만, 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1Mb 미만, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb 미만, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb 미만으로 떨어져 있는, 방법.
63. 구체예 60의 방법에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 110 kb, 최소한 120 kb, 최소한 130 kb, 최소한 140 kb, 최소한 150 kb, 최소한 160 kb, 최소한 170 kb, 최소한 180 kb, 최소한 190 kb, 또는 최소한 200 kb에 의해 분리되는, 방법.
64. 구체예 25-63중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, 또는 Rag1과 Rag2 좌 모두를 포함하는, 방법.
65. 구체예 25-63중 임의의 하나의 방법에 있어서, 상기 관심 대상의 게놈 좌는 Adamts5 좌, Trpa1 좌, Folh1 좌, 또는 Erbb4 좌를 포함하는, 방법.
66. 구체예 25-63중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 Lrp5 좌를 포함하는, 방법.
67. 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된, F0 세대 비-인간 동물을 만드는 방법에 있어서, 이 방법은 (a) 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재 하에서 비-인간 ES 세포 안의 게놈에 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA를 접촉시켜, 변형된 비-인간 ES 세포를 만들고, 이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며이며, 그리고 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고; (b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 상기 변형된 비-인간 ES 세포를 식별해내고; (c) 상기 변형된 비-인간 ES 세포를 비-인간 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고 (d) 상기 대리모에게 비-인간 숙주 배아를 임신시키고, 이때 상기 대리모는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 F0 세대 비-인간 동물을 출산하는 것을 포함하는, 방법.
68. 구체예 67의 방법에 있어서, 이때 CRISPR RNA와 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (gRNA) 형태로 함께 도입되는, 방법.
69. 구체예 67의 방법에 있어서, 이때 CRISPR RNA 및 tracrRNA는 별도로 도입되는, 방법.
70. 구체예 67-69중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때: (a) Cas 단백질은 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입되며; (b) CRISPR RNA는 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입되며; 그리고 (c)tracrRNA는 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입되는, 방법.
71. 구체예 70의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 상기 비-인간 ES 세포 안에 단백질-RNA 복합체로 도입되는, 방법.
72. 구체예 70의 방법에 있어서, 이때: (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고 (c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 상기 진핵 세포안에서 활성인, 방법.
73. 구체예 72의 방법에 있어서, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
74. 구체예 70의 방법에 있어서, 이때: (a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고 (b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고; 이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 상기 진핵 세포 안에서 활성인, 방법.
75. 구체예 74의 방법에 있어서, 이때 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
76. 구체예 67-75중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함하는, 방법.
77. 구체예 67-76중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형인, 방법.
78. 구체예 77의 방법에 있어서, 이때 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
79. 구체예 67-76중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 변형된 비-인간 ES 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성인, 방법.
80. 구체예 79의 방법에 있어서, 이때 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
81. 구체예 79의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 방법: (1) 2개의 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴.
82. 구체예 67-81중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
실시예들
다음의 실시예들은 본 발명이 어떻게 만들어지고, 이용되는지에 대한 완벽한 공개 및 설명을 당업계 숙련자들에게 제시하기 위하여 제공되는 것이며, 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니며, 하기 실험등이 실행할 수 있는 모든 또는 유일한 실험으로 제시하려는 의도도 아니다. 이용된 수치(가령, 양, 온도, 등)에 있어서 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만, 일부 실험적 오류 및 편차들은 고려되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부분은 중량부이며, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 또는 실온이며, 압력은 대기압 또는 그 주변값이다.
실시예 1. 렛 ES 세포 유도 및 특징화
1.1.
렛
ES
세포
특징화
도 1에 나타낸 것과 같이, 렛 ESCs는 치밀한 나선형 콜로니로 성장하며, 접시 안에서 통상적으로 분리되고, 부유한다 (근접 촬영, 도 8). 렛 ESCs는 Oct-4 (도 2a) 및 Sox2 (도 2b)가 포함된 전분화능 표지들을 발현시키고, 그리고 높은 수준의 알칼리 포스파타제 (도 3)를 발현시킨다. 계통 DA.2B의 핵형은 42X,Y (도 4)이다. 렛 ESCs는 흔히 사배수체(tetraploid)가 되고; 따라서 계통들은 중기 염색체 스프레드(spreads)를 카운팅하여 사전-선별되었고, 주로 정상적인 카운트를 가진 계통들이 정식으로 핵형화되었다.
ACI 낭포들은 시중에 판매되는 과-배란 암컷으로부터 수거되었다. DA 낭포들은 시판되는 냉동된 8-세포 배아로부터 배양되었다. 투명대는 산 Tyrodes에 의해 제거되었고; 그리고 낭포들은 유사분열적으로 비활성화된 MEFs 상에 도말되었다. 증식물을 찍어내고, 표준 방법에 의해 확장시켰다. 모든 낭포가 2i 배지를 이용하여 도말되었고, 배양되었고, 확장되었다 (Li et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135:1299-1310; 이의 전문이 본 명세서에 참고자료에 통합됨).
1.2. :
렛 생산(Rat Production)
낭포 주사 및 렛 ESC 게놈의 전달에 의한 키메라 렛이 생산된다. 부계 ACI.G1 렛 ESCs을 이용하여 낭포 현미주사에의해 생산된 키메라는 도 9에 나타낸다. 도 9에서 별표(*)로 표시된 라벨된 ACI/SD 키메라에 의해 아비가 된 F1 아구티 새끼와 백색증 한배새끼는 도 10에 나타낸다.
부계 렛
ESC
의 생식계열 유전.
3가지 정배수체 (euploid) 렛 ESC 계통들은 백색증 SD 낭포 안으로 현미주사에 의해 전분화능에 대하여 평가되었다. 키메라는 아구티 털 색깔로 식별되었으며, 이는 렛 ESC 때문인임을 나타낸다 (도 10 참고). 각 계통의 경우, 대부분의 키메라는 rESC 게놈이 F1 후손으로 전달되었다 (표 2).
1.3. :
렛 배아 줄기세포의 유도
과배란
프로토콜, 렛
0 일차: 임신한 암말 혈청이 주사됨: IP, 20 U (0.4 ml).
1 일차: 활동 없음
2 일차: (46 hr. 후): hCG, IP, 50 U (1 ml) 주사됨.
-한마리 암컷 짝짓기 준비.
3 일차: 플러그 점검. 암컷에 플러그를 끼웠다(plugged). 이때가 0.5일차다.
6 일차 (e3.5): 암컷을 안락사시키고, 배아를 빼내었다.
ES
세포 유도 프로토콜 (
과배란
)
0 일차:
1) 암컷 렛은 CO2를 이용하여 안락사시켰다.
2) 70% 에탄올을 이용하여 배 복부를 닦고; 가위를 이용하여 신체 배벽을 개복하여 내장이 노출되도록 한다.
3) 난관과 자궁각을 해부하고, 이것들을 따뜻한 N2B27 배지가 담겨있는 조직 배양 접시에 두었다. 가능한 한 많은 혈액을 씻어내고, N2B27가 있는 새로운 접시로 옮겼다.
4) 1 ml 주사기와 뭉툭한 27g 바늘을 이용하여, 자궁각과 난관을 통하여 배지를 쏟아부어 낭포들이 배지안으로 방출되도록 하였다.
5) 마우스 피펫을 이용하여 낭포들을 수집하고, KSOM + 2i (1μMPD0325901, 3 μM CHIR99021)이 포함된 배아 배양 접시로 옮겼다. KSOM는 Millipore에서 생산되는 배양 배지다. 카탈로그 번호는 MR-106-D이다.
6) 37°; 7.5% CO2에서 하룻밤 동안 배양되었다.
ES 세포 유도 프로토콜 (냉동된 배아)
0 일차:
1) 냉동된 8-세포 배아 (시판되는 것을 구입)를 M2 배지에 해동시켰다. 실온에서 10분간 배양되었다.
2) KSOM + 2i로 옮기고, 하룻밤 동안 배양한다.
ES
세포 유도 프로토콜 (양쪽 동일)
1 일차:
1) 공동이 형성된(cavitated) 배아를 2i 배지로 옮기고, 하룻밤 동안 배양한다.
2) 공동이 형성안된 배아는 KSOM +2i에서 배양을 지속하였다.
2 일차:
1) 모든 남아있는 배아는 2i 배지로 옮겼다 (공동이 형성되었는지 여부와는 무관하게).
2) 하룻밤 동안 배양되었고; 2i 배지에서 초기 배아의 배양을 지속하였다.
3 일차:
1) 배아는 30 -60 초동안 산 티로이드에 옮겨 투명대(zona pellucida)를 제거하였다.
2) 산 티로이드를 제어하기 위하여 2i 배지에서 배아를 세척하였다.
3) 96-웰 먹이공급 플레이트의 별도 웰에 예치되었다 (상기 웰은 단층의 유사분열적으로 비활성화된 마우스 배아의 섬유아세포 (MEFs)를 포함한다.
4) 2i 배지에서 하룻밤 동안 배양되었다.
4 -5 일차:
1) 증식(세포의 무정형 미분화된 덩어리)이 있었는지에 대하여 도말된 배아를 관찰하였다. 증식물이 도말된 배아 크기의 대략 두 배가 될 때 이들은 이전 준비가 된 것이다.
2) 매일: 마이크로 피펫으로 사용된 배지를 제거하고, 새로운 2i 배지를 대체시킨다.
3) 증식물은 새로운 먹이공급 웰로 이전시켰다:
a. 사용된 배지를 제거하였고, PBS로 웰을 가볍게 세척한다.
b.PBS를 제거하였고, 30 μl 0.05% 트립신을 추가하고; 10 분 동안 항온처리한다.
c. 30μl 2i + 10% FBS를 추가함으로써 트립신 반응이 중단되었다.
d. 상기 세포는 미량피펫터로 가볍게 분리시키고, 웰의 전체 내용물은 24-웰 먹이공급 플레이트의 새로운 웰로 옮겼다. 이것이 계대 1 (P1)이다.
e. 2i 배지에서 하룻밤 동안 배양되었다
5 -8 일차: (시기는 얼마나 빨리 각 계통이 확장되는지에 따라 달라진다)
1) 매일 배지 (2i 배지)가 교환되었고, ESC 형태를 가진 콜로니가 존재하는지에 대하여 관찰되었다.
2) 콜로니가 나타날 때, 콜로니가 ~ 50% 합류로 확장될 때까지 배양을 지속하였다.
3) 콜로니는 트립신처리되었고, 이전과 같이 계대되며; 먹이공급 상에서 도말되고, 6-웰 접시에서 계통당 1개 웰. 이것이 계대 2 (P2)이다.
진행중:
1) 대략적으로 50% 합류가 될 때까지 각 계통에 영양 공급 및 관찰을 지속하였다.
2) 종전과 같이 세포를 트립신처리하였다.
3) 트립신은 2i + 10% FBS로 중단되었고; 상기 세포는 원심분리 (Beckman-Coulter 테이블탑 원심분리기에서 5', 1200 rpm)에 의해 펠렛화되었다.
4) 상층액은 흡출해내고, 그리고 400 μl 냉동 배지(Freezing Medium) (70% 2i, 20% FBS, 10% DMSO)에서 세포를 가볍게 재현탁시켰다.
5) 상기 세포를 2개 바이알에 분배하였고, -80°에서 냉동시켰다. 이것이 계대 3 (P3)이다.
6) 장기 보관을 위하여, 이 바이알은 액체 N2 창고로 이전된다.
2i 배지는 표 3과 같이 준비되었다
재료: 임신한 암말의 혈청 고나도트로핀 (PMSG)
인간 임신 소변 융모생식선자극호르몬 (HCG)
암컷 렛 (5-12 주령)
수컷 렛 (12 주령 내지 8 개월령), 우리당 한 마리
주사기/바늘
동물의 방에는 6:00-18:00 동안 채광
절차:
1 일차: 8:00-10:00 AM
암컷에게 20 IU PMSG (0.4 ml), IP로 주사한다.
사용안된 PMSG를 폐기한다.
3 일차: 8:00-10:00 AM (PMSG 주사 후 48시간)
암컷에게 50 IU HCG (1 ml), IP로 주사한다.
교배 우리 안에 수컷 한 마리당 암컷 한마리를 넣는다.
사용안된 HCG는 폐기한다.
4 일차: 8:00-10:00 AM (HCG 주사 후 24시간)
플러그에 대해 암컷을 점검한다.
호르몬 공급처
PMSG: Sigma #G-4877 (1000 IU). PBS에서 최종 [ ] 50 IU/ml이 되도록 재현탁시킨다. -20°에서 1 ml 분액으로 보관된다.
HCG: Sigma #CG-5 (5000 IU). PBS에서 최종 [ ] 50 IU/ml이 되도록 재현탁시킨다. -20°에서 1 ml 분액으로 보관된다.
1.4.:
렛 배아 줄기 세포계통의 핵형결정
생성된 렛 ES 세포 계통의 핵형이 결정되었고, 그 결과는 표 4-7에서 요약된다.
1.5.:
벡터를 렛 배아 줄기 세포로 전기천공
1. 전기천공 이전에 렛 ES 세포를 24-48 시간 동안 계대하였다.
2. 전기천공 24시간 전에 배지는 RVG2i + ROCKi (10μM Y-27632)로 교체되었다.
3. 트립신처리되기 30' 전, 배지를 교체하였다.
4. 전기영동되는 DNA를 분획하였다.
5. DNA는 >10 분 동안 실온에서 따뜻해지도록 하였다.
6. DNA는 5' 동안 62℃에서 가열되었다. 얼음 위에 DNA를 둔다.
7. 세포를 트립신처리하였다:
a. 부유 콜로니를 수거하였다. 가능한 많은 부유물을 수거하기 위하여 플레이트를 세척하였다.
b. 3' 동안 750 rpm에서 콜로니를 펠렛화하였다.
c. 펠렛은 1x 5-10ml PBS로 세척되었고, 그리고 재-회전/펠렛화 되었다.
d. 상층액은 흡출되었고; 500λ 트립신, 0.05% + 1% 닭 혈청이 추가되었따.
i. 튜브당 10 cm 콜로니 플레이트에서 1개 이상으로 모으지(pool) 않았다. 트립신처리 동안 튜브 바막으로 너무 많은 콜로니가 쌓여 있는 경우, 응괴(clump)될 것이고, 세포의 대부분이 상실될 것이다.
e.
37°에서 4'. 응괴를 최소화시키기 위하여 콜리니를 몇 차례 피페팅하였다.
f.
37°에서 4' 동안 X 단계 1-2를 반복하였다.
g.
트립신은 500λ RVG2i + 10% FBS로 중단시켰다.
8. 1200 rpm에서 5' 동안 세포를 펠렛화시켰다.
9. 세포는 10 ml PBS에서 재현탁된다. 총 세포 수를 결정하기 위하여 2개의 20λ 분취액을 카운트한다.
10. 세포를 펠렛화시키고 (5'/1200rpm); 정확한 세포 농도 (표적 #/75 μl EP 완충액)를 얻기 위하여 총 세포 수와 총 재현탁 용적을 산출한다.
11. 최소 용적의 EP 완충액에 재현탁시키고; 총 용적을 측정하고, 그리고 EP 완충액을 이용하여 표적 용적으로 조정한다. 전기천공 완충액은 Millipore에서 시판한다. 카탈로그 번호 #는 ES-003-D이다. Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21:652-659을 참고하며, 이는 본 명세서에서 참고자료에 편입된다.
12. 75λ 세포를 50λ DNA에 추가하고; 125λ 세포/DNA 용액은 BTX 48-웰 큐벳중 하나의 웰로 옮긴다.
a.
동일한 컬럼에 비어있는 웰은 125λ EP 완충액으로 채워넣었다.
13. BTX 전기천공기에서 한번 큐벳에 펄스를 제공하였다:
a.
세팅: 400V; Ω; 100 μF (세팅은 변화될 수 있다)
14. 회복을 위하여 15' 동안 큐벳은 얼음위에 둔다.
15. 세포는 5 ml RVG2i + 10 μM ROCKi로 보냈다.
16. 15 cm 플레이트에 20 ml RVG2i + 10μM ROCKi를 추가하였다. 플레이트는 2x neoR MEFs (또는 프로젝트에 따라 다른 MEFs)를 갖는다. neoR 선택성 표지는 Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36 또는 US 특허 번호 7,205,148 또는 6,596,541(이들 각각은 본 명세서의 참고자료에 편입된다)의 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (neo) 유전자다.
17. 37°에서 항온처리되었다. 48시간 후에 선별을 시작한다.
이용된 ROCK 억제제는 Y-27632이었다.
1.6:
렛 배아 줄기 세포에서
표적화된
유전적 변형의 선별
1. 전기천공 전, 세포를 24-48 시간 동안 계대하였다.
2. 전기천공 24시간 전에 배지는 RVG2i + ROCKi (10μM Y-27632)로 교체되었다.
3. 트립신처리되기 30' 전, 배지를 교체하였다.
4. 전기영동되는 DNA를 분획하였다.
5. DNA는 >10 분 동안 실온에서 따뜻해지도록 하였다.
6. DNA는 5' 동안 62℃에서 가열되었다. 얼음 위에 DNA를 둔다.
7. 세포를 트립신처리하였다:
a. 부유 콜로니를 수거하였다. 가능한 많은 부유물을 수거하기 위하여 플레이트를 세척하였다.
b.
3' 동안 750 rpm에서 콜로니를 펠렛화하였다.
c.
펠렛은 1x 5-10ml PBS로 세척되었고, 그리고 재-회전/펠렛화 되었다.
d.
상층액은 흡출되었고; 500λ 트립신, 0.05% + 1% 닭 혈청이 추가되었다.
i.
튜브당 10 cm 콜로니 플레이트에서 1개 이상으로 모으지(pool) 않았다. 트립신처리 동안 튜브 바막으로 너무 많은 콜로니가 쌓여 있는 경우, 응괴(clump)될 것이고, 세포의 대부분이 상실될 것이다.
e.
37°에서 4'. 응괴를 최소화시키기 위하여 콜리니를 몇 차례 피페팅하였다.
f.
37°에서 4' 동안 X 단계 1-2를 반복하였다.
g.
트립신은 500λ RVG2i + 10% FBS로 중단시켰다.
8. 1200 rpm에서 5' 동안 세포를 펠렛화시켰다.
9. 세포는 10 ml PBS에서 재현탁된다. 총 세포 수를 결정하기 위하여 2개의 20λ분취액을 카운트한다.
10. 세포를 펠렛화시키고 (5'/1200rpm); 정확한 세포 농도 (표적 #/75 μl EP 완충액)를 얻기 위하여 총 세포 수와 총 재현탁 용적을 산출한다.
11. 최소 용적의 EP 완충액에 재현탁시키고; 총 용적을 측정하고, 그리고 EP 완충액을 이용하여 표적 용적으로 조정한다.
12. 75λ 세포를 50λ DNA에 추가하고; 125λ 세포/DNA 용액은 BTX 48-웰 큐벳중 하나의 웰로 옮긴다.
a.
동일한 컬럼에 비어있는 웰은 125λ EP 완충액으로 채워넣었다.
13. BTX 전기천공기에서 한번 큐벳에 펄스를 제공하였다:
a.
세팅: 400V; 100 μF (세팅은 변화될 수 있다).
14. 회복을 위하여 15' 동안 큐벳은 얼음위에 둔다.
15. 세포는 5 ml RVG2i + 10μM ROCKi로 보냈다.
16. 15 cm 플레이트에 20 ml RVG2i + 10μM ROCKi를 추가하였다. 플레이트는 2x neoR MEFs (또는 프로젝트에 따라 다른 MEFs)를 갖는다.
17. 37°에서 항온처리되었다. 48시간 후에 선별을 시작하였다.
18. G418 선별 프로토콜은 다음과 같았다:
a.
2일차 (EP후 둘째 날): 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 세포는 항온처리되었다.
b.
3일차: G418 없이, 2i 배지에서 세포는 항온처리되었다.
c.
4일차: 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 세포는 항온처리되었다.
d.
5일차: G418 없이, 2i 배지에서 세포는 항온처리되었다.
e.
6일차: 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 세포는 항온처리되었다.
f.
7일차: G418 없이, 2i 배지에서 세포는 항온처리되었다.
g.
8일차: 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 세포는 항온처리되었다.
h.
9일차: G418 없이, 2i 배지에서 세포는 항온처리되었다.
i.
10일차: 2i 배지 + G418, 75 μg/ml세포는 항온처리되었다.
j.
11일차: G418 없이, 2i 배지에서 세포는 항온처리되었다.
k.
12일차: 콜로니를 찍어내어, 스크리닝을 위해 확장시켰다. 각 콜로니는 10분 동안 0.05% 트립신 + 1% 닭 혈청에서 분리되었고, 그 다음 96-웰 먹이공급 플레이트의 1개 웰 안에 도달되었다.
19. 3 일 동안 2i 배지에서 콜로니는 확장되었다.
20. 새로운 96-웰 먹이공급 플레이트에 클론은 1:1로 계대되었다.
21. 3 일 동안 2i 배지에서 클론은 확장되었다.
22. 각 클론의 경우, 콜로니는 트립신에서 분리되었다. 각 클론의 2/3은 냉동시키고, -80°에 보관하고; 남아있는 1/3은 라미닌 플레이트 상에 도말된다 (10 μg/ml 라미닌이 피복된 96-웰 플레이트).
23. 상기 라미닌 플레이트가 합류될 때, 클론의 유전자형분석을 위하여 스크리닝 랩으로 넘겼다.
1.7.
렛 배아 줄기 세포의 분자 특징
표 8에 열거된 유전자는 마우스 ES 세포에서 대응하는 유전자들보다 렛 ES 세포에서 20-배 더 낮게 발현되었다. 표 9에 열거된 유전자는 마우스 ES 세포에서 대응하는 유전자들보다 렛 ES 세포에서 20-배 더 높은 수준에서 발현되었다.
표 8 및 9의 마이크로어래이 데이터는 다음과 같이 생성되었다. 렛 ES 세포 (ACI.G2 및 DA.2B)와 마우스 ES 세포 (F1H4)는 합류까지 3계대 동안 2i 배지에서 배양되었다. F1H4 세포는 먹이공급자 없이 젤라틴-피복된 플레이트 상에서 배양되었다. F1H4 마우스 ES 세포는 129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합성 배아로부터 유도되었다 (가령, US Pat. No. 7,294,754 and Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela,D.M. (2007), 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 통합됨).
시료 준비에 다음의 프로토콜이 이용되었다: 1.5mL Eppendorf 튜브에 시료 ID를 표시하였다. 플레이트 상에서 성장된 세포들은 37℃ 인산염 완충된 염수 (PBS)로 세척되었다. PBS를 제거하였고, 300 ul의 Trizol®가 추가되었다. Trizol® (Life Technology)에서 상기 세포를 파괴하는데 스크레이퍼가 이용되었다. 해리된 세포는 1.5mL Eppendorf 튜브안에 Trizol® 에 수집되었다. 현탁액 상에서 성장된 세포의 경우, 상기 세포는 37℃ PBS에서 헹구고, 1.5mL 튜브에 수집되었다. 상기 세포를 회전시켰고, PBS를 제거하였고; 그리고 300 ul의 Trizol®가 상기 세포에 추가되었다. 세포 막은 피펫팅에 의해 파괴되었다. 시료는 FACS를 위하여 10 내지 105개 세포로 분류되었고, 용적은 100uL 미만으로 농축되었다. 4 용적의 RNA 용해 완충액이 추가되었고, 피펫팅에 의해 혼합되었다. 시료의 경우, 320uL RNA 용해 완충액이 80uL 시료에 추가되었다. 시료는 -20℃에서 보관되었다.
RNA-Seq를 이용하여 마우스 및 렛 유전자의 발현 수준이 측정되었다. 서열화 판독(Sequencing reads)은 Tophat 및 RPKM에 의해 마우스와 렛 기준 게놈에 메핑되었고 (메핑된 백만개 단편당 엑손 킬로베이스당 단편들) 마우스 및 렛 유전자에 대해 산출되었다. 유전자 기호에 근거하여 상동성 유전자들이 선별되었고, 그 다음 t-테스트를 이용하여 마우스와 렛 사이에서 각 유전자의 발현 수준이 비교되었다. 렛 ESCs에서 miR-32는 상위 최대 발현된 10개 유전자 안에 있었지만, 마우스 ES 세포에서는 발현되지 않았다. miR-632에 대한 상대적인 자료는 없지만, 렛 ESCs에서 발현된 다른 유전자와 비교하여 이의 발현 수준과 배아의 발달에서 이들의 공지된 기능에 근거하여, miR-632는 렛 ES 세포의 표지로 선별되었다.
상기 렛 ES 세포를 위한 전분화능 표지들/유전자를 이용하는 추가 분자 특징 또한 개발되었다. 표 11은 RNA 프로파일링 데이타로부터 유전자 목록 및 이들의 발현 등급을 제공한다. mRNA는 렛 ES 세포로부터 단리되었으며, 다양한 표지들의 발현 수준이 서로 비교되었다. 용어 "등급(rank)"이란 개별 유전자의 상대적 발현을 의미하는 것으로, 등급이 높을 수록(최고 등급은 1임), 발현이 더 높다. 예를 들면, Oct4이 등급 13이란, 분석된 모든 유전자중에서 12개 유전자를 제외하고 다른 모든 것보다 발현이 더 높다는 것을 의미한다. 이 실험에서 배경은 30이하의 임의의 발현 값이며; 6107개 유전자는 30 또는 더 높는 발현 값을 가지고 있었다.
실시예
2:
렛에서
게놈 좌의 비활성화
2.1:
엔도클레아제
물질을 이용하여
내생성
게놈 좌의 비활성화
내생성 렛 게놈 좌에 돌연변이 대립유전자를 도입시키기 위하여, 본 명세서에서 설명된 렛 ES 세포에 ZFNs 1 및 2 (또는 TALENs 1 및 2)를 발현시키는 발현 벡터 (또는 mRNA)를 전기천공하였다. 이들 단백질은 반대 가닥상의 약 6 bp 내지 약 40 bp 떨어져 있는 표적 서열에 결합된다. 이중-가닥으로 된 파괴가 상기 표적 좌 안에 형성되며, 상기 세포는 비-상동성 말단-연결(NHEJ)을 통하여 복구를 시도한다. 많은 경우에 있어서, NHEJ는 결손을 만들게 되며, 대개 유전자의 기능이 파괴된다(가장 흔하게는 틀이동 돌연변이를 만듦으로써). 돌연변이 대립유전자가 포함된 양성 클론을 식별해내기 위하여, the 전기천공된 세포는 저밀도로 도말되는데, 그 이유는 약물 선별이 실행되지 않기 때문이다. 돌연변이가 만들어졌는지를 보기 위하여 표적 부위에서 콜로니를 찍어내어 분석한다 (가령, 상기에서 설명된 대립유전자의 변형 (MOA) 분석 이용). 그 다음 상기 돌연변이 대립유전자가 포함된 선별된 ES 세포는 숙주 렛 배아, 예를 들면, 상실배-전 단계 또는 낭포 단계 렛 배아 안으로 도입되고,시조 렛(F0 동물)을 만들기 위하여 대리모의 자궁 안에 이식된다. 차후, 상기 시조 렛은 예를 들면, 돌연변이 대립유전자에 대한 이형접합성 F1 자손을 만들기 위하여 야생형 렛으로 사육된다. 이형접합성 F1 동물의 짝짓기는 상기 돌연변이 대립유전자에 동형접합성 자손을 생산할 수 있다.
2.2.:
아연
핑거
뉴클레아제를 이용한 렛
아포리포단백질
E (
ApoE
)
유전자 의
비활성화를 위한 렛
ESC
표적화
아연 핑거 뉴클레아제는 상기 게놈에서 독특한 표적 서열에 대해 엔도뉴클레아제 활성을 겨냥하기 위하여 서열 특이적 모듈러 DNA 결합 도메인을 이용한다. ZFNs는 한 쌍의 모노머로 공작된다. 각 모노머는 3개 또는 그 이상 아연 핑거 DNA-결합 도메인에 융합된 FokI 엔도뉴클레아제의 비특이적 절단 도메인을 포함한다. 각 아연 핑거는 3 bp 하위부위에 결합하고, 양쪽 모노머의 복합된 표적 부위에 의해 특이성이 획득된다. ZFNs는 DNA에서 이중-가닥으로 된 파괴 (DSBs)를 만들고, 비-상동성 단부 연결 (NHEJ) 동안 돌연변이 (삽입 또는 결손)가 빈번히 발생된다. 도 15는 게놈-편집 엔도뉴클레아제 (가령, ZFNs 및 TALENs)가 표적 게놈 서열 안으로 이중 가닥 틈을 도입시키고, 세포 안에서 NHEJ을 활성화시키는 기전을 설명한다. ZFN과 함께 공여 서열이 제공된다면, 상동성 재조합에 의해 DSBs는 또한 상동성-지향된 복구 (HDR)
이러한 ZFNs는 표적화된 효과를 개선시키기 위하여 본 명세서에서 설명된 다양한 방법 및 조성물과 복합되어 이용되었다. ZFNs 1 및 2를 발현시키는 발현 벡터가 또한 상기 렛 ES 세포 안으로 도입된 것을 제외하고, 실시예 3.2(a)(i)에서 설명된 바와 같이, 렛 아포리포단백질 E (ApoE) 좌가 표적화되었다. rTZFN1P 및 rTZFN2P와 복합되어, ApoE 표적화 이벤트의 도식을 제공하는, 도 11 참고. 상기 표적화 효과는 하기 실시예 5에서 설명되는 것과 같이 측정되었고, 그 결과는 표 12에 나타낸다. 이형접합성 표적화, 동형접합성 표적화, 그리고 "혼합된" 이중 (가령, 컴파운드 이형접합성 표적화)을 스크리닝하기 위하여, 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 유전자유형을 결정하였다. 놀랍게도, 표적화 효과가 8-10 배 상승되었다.
플라스미드 표적화 벡터는 자가-결손 약물 선별 카세트와 리포터 유전자로 lacZ 유전자와 함께 구축되었다 (선별 카세트가 포함된 표적화 벡터의 전기천공시 발생될 수 있는 상동성 및 비-상동성 재조합 이벤트를 설명하는 도 14 참고). 양호한 표적화 효과가 획득되었고, 높은 %의 키메라가 생산되었다. 표적화 효과 개선에 있어서 효과를 검사하기 위하여 표적화 벡터와 복합되어 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)가 또한 테스트되었다 (표적화 벡터의 상동성 재조합 효과를 개선시키기 위하여 ZFNs 또는 TALENs를 이용하는 유전자 표적화 기술 설명은 도 16 참고). 상기 표적화 벡터는 ApoE 좌를 절단하는 2개의 ZFN 쌍에 대한 발현 벡터와 함께 공동-발현된다. 상기 두 표적화 벡터와 ZFNs 세트와 함께 전기 천공된 렛 ESC 클론들은 표적화 벡터 단독으로 전기천공된 렛 ESC 클론보다 8-10배 더 높은 표적화 효과를 나타내었다. 더욱이, 우리 클론중 약 2%에서 이중-대립유전자 동형접합성 표적화가 탐지되었다. 이들 표적화된 클론중 2개로부터 높은 %의 키메라가 획득되었다.
ApoE-표적화된 (ZFN 지원된) 렛 ESC 클론은 SD 낭포로 현미주사되었고, 그 다음 표준 기술을 이용하여 가상임신된 SD 수용 암컷으로 이송되었다. 털 색으로 키메라가 식별되었고 (도 17 참고하며, ApoE-ZFN-AB5 키메라 (가령, ApoE-/-키메라); 수컷 F0 키메라는 SD 암컷으로 사육되었다. 상기 표적화된 ApoE 대립유전자의 존재에 대하여 생식계통 F1 새끼들의 유전자유형을 확인하였다 (표 13). 이들 표적화된 클론중 2개로부터 높은 %의 키메라가 획득되었다.
ApoE 녹아웃 렛은 다양한 유형의 장애 및 질환을 연구하는 수단을 제공한다. 인간에서 아포리포단백질은 킬로미크론(chylomicron), HDL, LDL 및 VLDL에서 발현된다. ApoE는 트리글리세리드-풍부 지질단백질 성분들의 정상 분해대사에 필수적이다. APOE에서 결함은 수많은 질환 상태, 예를 들면, 가족성 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증, 베타지방단백혈증, 가족성 이상베타지방단백혈증, 유형 III 고지방단백혈증 (HLP III), 관상 동맥 질환 위험의 원인이 된다. 하나의 이소폼 (ApoE4)은 후기-개시 가족성 및 특발성 알츠하이머 질환, 그리고 뿐만 아니라 MS와도 연합된다.
마우스에서 ApoE는 HDL에서 주로 발현되며; 인간과 마찬가지로 콜레스테롤을 운반한다. ApoE-결핍 마우스 (2개 독립적인 KOs)는 정상 혈장 콜레스테롤의 5배를 가지며; 3월령쯤 전단 대동맥에서 거품-세포가 풍부한 침착물로 발달된다(인간 증후군과 필적됨).
렛에서 ApoE 녹아웃은 플락 형성, 전사 변화 (RNA-Seq), 생체외 기능을 포함하나, 이에 국한되지 않는 내피 기능을 연구하는 동물 모델을 제공한다. 더욱이, 더 큰 크기의 렛은 이들 모든 분석을 용이하게 할 것이며, 잠재적으로 RNA-Seq 데이타의 질을 개선시킬 것이다.
2.3. 아연 핑거 뉴클레아제를 이용하여 렛 인터루킨-2 수용체 감마 ( IL2r - γ ) 좌의 비활성화
ZFN U (ZFN 상류) 및 ZFN D (ZFN 하류)를 발현시키는 발현 벡터를 상기 렛 ES 세포 안으로 도입시키는 것을 제외하고, 실시예 3.2(a)(i)에서 설명된 바와 같이, 렛 인터루킨-2 수용체 감마 (IL2r-γ 또는 Il2rg) 좌가 표적화되었다. 도 18은 ZFN U 및 ZFN D와 복합되어 IL2r-γ 표적화 이벤트를 도식화한 것이다. 도 18에서 아연 핑거가 결합하는 IL2r-γ 좌의 서열은 서열 번호: 93로 표시된다. 상기 표적화 효과는 하기 실시예 3.3(a)에서 설명되는 것과 같이 측정되었고, 그 결과는 표 14에 나타낸다. 간략하게 설명하자면, 동형접합성 표적화된 클론은 PCR에 의해 확인되었다. ZFN1 쌍의 경우: 스크리닝된 192개중 173개 돌연변이 클론(90%), 그리고 스크리닝된 192개중 162개 클론(84%).
IL2r-γ -표적화된(ZFN 지원된) 렛 ESC 클론은 SD 낭포로 현미주사되었고, 그 다음 표준 기술을 이용하여 가상임신된 SD 수용 암컷으로 이송되었다. 털 색으로 키메라가 식별되었고; 수컷 F0 키메라는 SD 암컷으로 사육되었다. 상기 표적화된 IL2r-γ 대립유전자의 존재에 대하여 생식계통 F1 새끼들의 유전자유형을 확인하였다.
2.4.:
CRISPR
/
Cas9
를 이용하여 렛 인터루킨-2 수용체 감마 (
IL2r
-γ) 좌의 비활성화
표적화 효과를 지원하기 위하여, CRISPR/Cas9 시스템이 또한 상기 렛 ES 세포 안으로 도입시키는 것을 제외하고, 실시예 3.2(a)(i)에서 설명된 바와 같이, 렛 IL2r-γ 좌가 표적화되었다. SBI: System Biosciences Cas9 "SmartNuclease" 올-인-원 벡터를 이용하였고, Cas9 발현은 CAG, EF1a, PGK, 또는 CMV 프로모터에 의해 구동되었다. 커스텀 gRNA가 벡터에 결찰되었고, H1 프로모터에 의해 발현되었다. Il2rg 에 대항하는 4개 RNAs가 기획되었다. gRNAs1-4에 의해 표적화된 렛 IL2r-γ 좌의 영역은 도 19에 나타낸다. 표적화 (가령, 이형접합성 표적화, 동형접합성 표적화, 및 컴파운드 이형접합성 표적화)을 스크리닝하기 위하여, 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 유전자유형을 결정하였다. 상기 다양한 가이드 RNAs를 이용할 때 표적화 결과는 표 15에 나타낸다. "강함" 및 "약함"은 상기 콜로니가 표적화된 변형을 보유하지의 스크리닝에 근거하여 증거의 강도를 지칭한다.
2.5.:
CRISPR
/
Cas9
를 이용하여 마우스
하이포산틴
구아닌
포스포리보실
전달효소(
Hprt)의
비활성화
LTVECs 단독 또는 CRISPR/Cas9와 복합하여 마우스 ES 세포에서 마우스 Hprt 좌가 표적화되었다. 32.9 kb의 완전한 Hprt 코딩 서열은 결손 및 pCAGG-Puro 퓨로마이신 저항성 선별 카세트로의 대체에 대하여 표적화되는데, 이 카세트는 또한 eGFP를 발현시켰다. 결손 단부 점들은 시작 및 종료 코돈이었다. 이용된 가이드 RNA 서열은 5'-GACCCGCAGUCCCAGCGUCG-3´ (서열 번호: 84)이었고, 이는 마우스 Hprt 유전자의 엑손 1을 표적으로 하였다. 예상되는 표적 부위 절단 위치는 상기 결손의 5' 단부로부터 22bp이다. ES 세포에서 관찰된 Cas9/gRNA 적중(on-target) 절단 효과는 ≥ 93%이었다. 표 16에 요약을 나타낸다. 완전한 32.9 kb Hprt 좌의 표적화를 지원하기 위하여 CRISPR/Cas9를 이용하면LTVEC 단독을 이용한 것보다 표적화가 5배 강화되었다.
실시예
3:
렛 게놈 좌의
표적화된
변형
3.1:
렛
ESC
표적화
:
렛
Rosa26
좌.
렛 Rosa26 좌는 마우스에서와 같인 동일한 공간을 가지고, Setd5와 Thumpd3 유전자 사이에 있다. 렛 Rosa26 좌 (도 12, 패널 b)는 마우스 Rosa26 좌 (도 12, 패널 a)와 상이하다. 마우스 Rosa26 전사체는 2 또는 3개의 엑손으로 구성된다. 렛 좌는 마우스 엑손1 (Ex1a)에 대하여 상동성 엑손에 추가하여 두번째 엑손 1(Ex1b)를 함유한다. 렛에서 3번째 엑손은 확인되지 않았다. 렛 Rosa26 대립유전자의 표적화는 도 12c에서 도시되는데, 이때 D렛 ESC의 게놈 DNA를 이용하여 PCR에 의해 각 5kb의 상동성 아암이 클론되었다. 상기 표적화된 대립유전자는 상기 렛 Rosa26 인트론에서 117bp 결손을 대체하는 SA (접합 수용자)-lacZ-hUb-neo 카세트를 함유한다.
상기 렛 Rosa26 좌에서 표적화 효과가 측정되었다 (표 17). 선형화된 벡터는 DA 또는 ACI 렛 ESCs 안으로 전기천공되었고, 표준 기술을 이용하여 2i 배지 + G418에서 형질감염된 콜로니가 배양되었다. 개별 콜로니를 찍어내어, 대립유전자 상실 분석(LOA)을 이용하여 스크리닝되었다 (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660, 본명세서 참고자료에 통합됨).
Rosa26 - 표적화된 렛 ESC 클론을 이용하여 키메라 생산 및 생식계열 유전. 재확인된 Rosa26-표적화된 렛 ESC 클론은 SD 낭포로 현미주사되었고, 그 다음 표준 기술을 이용하여 가상임신된 SD 수용 암컷으로 이송되었다. 털 색으로 키메라가 식별되었고; 수컷 F0 키메라는 SD 암컷으로 사육되었다. 상기 표적화된 Rosa26 대립유전자의 존재에 대하여 생식계통 (아구티) F1 새끼들의 유전자유형이 확인되었고; 22마리 아구티 새끼중 9마리가 Rosa26 좌에서 이형접합성으로 유전자형이 확인되었다 (표 18).
Rosa26 좌에서 유전적으로 변형된 대립유전자가 생식계열을 통하여 전달되었음을 확인하기 위하여, 이형접합성 Rosa26-표적화된 렛에서 X-gal 착색에 의해 lacZ 발현이 확인되었다. 14주령의 이형접합성 Rosa26-표적화된 렛의 뇌, 심장 및 흉선 그리고 폐의 X-gal 착색에서 lacZ의 발현이 나타났고 (차례로 도 13b, d, 그리고 f), 반면 연령대가 일치되는 야생형 대조는 낮은 수준의 배경 X-gal 착색 (차례로 도 13a, c, 및 e)을 나타내었다. E12.5 및 E 14.5 이형접합성 Rosa26-표적화된 렛 배아의 X-gal 착색에서 lacZ의 편재적 발현이 나타났고 (차례로 도 13g 및 i), 반면 대조 렛 배아는 낮은 수준의 배경 X-gal 착색 (차례로 도 13h 및 j)을 나타내었다.
3.2.(
a)(i) :
렛
아포리포단백질
E (
ApoE
) 좌의
표적화
.
렛 아포리포단백질 E (ApoE) 좌는 ApoE 기능을 파괴하기 위하여 표적화되었다. ApoE 좌에 상동성인 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 측면에 있는 lacZ-hUb-neo 카세트가 포함된 표적화된 벡터를 이용하여, ApoE 좌 표적화가 실행되었다. 도 20은 1.8 kb 결손 및 lacZ-hUb-neo 카세트의 삽입에 의해 파괴된 유전적으로 변형된 렛 ApoE 좌를 나타내는데, 이 카세트는 Protamine 프로모터에 의해 구동된 Crei 유전자가 포함된 자가-결손 Cre 카세트를 더 포함한다. 전기천공 조건은 다음과 같다: 6 ug DNA; 2.05 x 106 개의 세포; 400V; 200 uF: 342 V, 593 usec; 2i + 10 uM ROCKi에서 2x 밀도 neoR MEFs상에 도말.
ApoE 좌에서 표적화 효과가 측정되었고, 표 19에 나타낸다. 선형화된 벡터는 DA 균주로부터 유도된 DA.2B 렛 ESCs 안으로 전기천공되었고, 표준 기술을 이용하여 형질감염된 콜로니가 배양되었다. 개별 콜로니를 찍어내어, 대립유전자 상실 분석(LOA)을 이용하여 스크리닝되었다.
ApoE-표적화된 렛 ESC 클론을 이용하여 키메라 생산 및 생식계열 전달이 실행되었다. ApoE-표적화된 렛 ESC 클론은 SD 낭포로 현미주사되었고, 그 다음 표준 기술을 이용하여 가상임신된 SD 수용 암컷으로 이송되었다. 털 색으로 키메라가 식별되었고; 수컷 F0 키메라는 SD 암컷으로 사육되었다. 생식계통 전달이 이루어졌다. 상기 표적화된 ApoE 대립유전자의 존재에 대하여 F1 새끼들의 유전자유형을 확인하였다 (표 20).
내생성 ApoE 프로모터에 의해 구동된 LacZ 발현은 12-주령의 ApoE +/-암컷 렛의 뇌, 혈액 혈관, 및 간에서 X-gal 착색에 의해 확인되었다 (차례로 도 43-45). 도 43-45에서는 내생성 ApoE의 발현 패턴이 반영된 lacZ의 발현 패턴을 보여준다. 연령-일치되는 야생형 대조는 낮은 수준의 배경 X-gal 착색을 보여준다.
ApoE -결손된 렛의 표현형이 추가 연구되었다. 종단 혈청 화학 연구를 실행하여 3주 간격으로 콜레스테롤, LDL, HDL, 및 트리글리세리드 수준을 측정하였다. 도 46a-d는 표적화된 동형접합성, 표적화된 이형접합성, 및 야생형 렛의 6 주, 9 주, 12 주, 및 15 주령에서 혈청 콜레스테롤, LDL, HDL, 그리고 트리글리세리드 수준을 보여준다. 2마리 야생형 렛, 7마리 이형접합성 렛, 그리고 8마리 동형접합성 렛으로 구성된 연령-일치된 코호트에서 눈 출혈을 실시하였다. 수컷과 암컷 간의 유의적인 차이는 없었다. 동형접합성 ApoE-결손된 렛은 상승된 콜레스테롤 및 LDL 수준과 감소된 HDL 수준을 보여주었다. ApoE -/-마우스와는 달리, ApoE-결손된 렛에서 트리글리세리드의 유의적인 증가는 관찰되지 않았다.
실시된 추가 표현형 분석은 대동맥 활 플락 형성에 관한 조직학/생체외 영상촬영, 대동맥 활 플락 형성에 대한 생체내 영상촬영, 그리고 대동맥 활 내피에 대한 전사 변화 (전체 전사체 쇼트건 서열화 (RNA-Seq))를 포함한다. 이들 분석 시기는 플락 형성 시기에 따라 달라진다. ApoE -/-마우스의 경우 24 주 시점에 플락이 탐지가능하다.
ApoE의 경우 추가 표적화 데이터는 표 22에서 제공된다.
3.2.(a)(ii).
표적화
벡터와 함께
렛에서
ApoE
표적화
도 20은 렛 ApoE 좌 및 표적화 플라스미드를 도식화한다. 도 20의 상위 그림은 렛 ApoE 좌의 게놈 구조와 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역을 나타낸다. ApoE의 엑손은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다.
도 20의 하부 도식은 상기 표적화 벡터다. 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 벡터는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들의 측면에 있는 자가-결손 카세트 (개방 화살표)를 포함한다. 자가-결손 카세트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자와 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동가능하도록 네오마이신 저항성 유전자가 포함된 선별 카세트를 포함한다.
Crei 유전자는 2개의 엑손을 포함하는데, 이들은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론(Crei)에 의해 분리되어 있다. 예를 들면, 자가-결손 카세트를 상세하게 설명하는 U.S. 특허 8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다. Prm1 프로모터를 이용하여, F0 렛의 수컷 생식 세포에서 상기 자가-결손 카세트는 특이적으로 결손될 수 있다. 상기 표적화 벡터는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 네오마이신-저항성 MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
표 44에 나타난 바와 같이, 384개 콜로니가 스크리닝되었고, 23개의 표적화된 클론이 획득되었다. 상기 표적화 효과는 5.99%이었다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이 3개 클론이 낭포 안으로 주사되었다. 키메라를 생산하는 3개 클론이 획득되었고, 이들 클론중 1개가 생식계열을 통하여 상기 표적화된 변형을 전달하였다.
3.2.(a)(iii).
아연
핑커
뉴클레아제와 복합하여
표적화
벡터를 이용한
렛에서의
ApoE
표적화
렛 ApoE 좌를 표적화하기 위하여 실시예 3.2(a)(ii)에서 이용된 표적화 벡터는 아연 핑거 뉴클레아제와 복합 이용되었다. 표 21은 상기 렛 ApoE 좌의 게놈 조직의 요약을 제공한다. 표 21에 나타낸 위치는 상기 렛 게놈 (ENSMBL)의 참고 서열 빌드(build) 5.0에서 취한 것이다. ApoE는 염색체 1의 (-) 가닥에 있다.
도 11은 렛 ApoE 좌를 도식한 것으로, ZFN1 및 ZFN2의 절단 부위를 나타내는 회색 막대를 나타낸다. ZFN1의 컷팅 부위는 엑손 3에 있고, ZNF2의 컷팅 부위는 인트론 3에 있다. ZFN 양쪽 부위들의 정확한 위치는 표 21에서 제시된다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 5 kb 및 5.4 kb)에 대응하는 게놈 영역은 짙은 회색 상자로 표시된다. ApoE의 엑손은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다.
이용된 표적화 벡터는 실시예 3.2(a)(ii)의 것과 동일하고, 도 20에 나타내며, 도 21a는 아연-핑거 뉴클레아제와 도 20에 나타낸 상기 표적화 벡터를 이용하여 렛 ES 세포에서 ApoE 좌의 표적화를 도식으로 제공한다. ZFNs는 2개의 발현 플라스미드로 도입되었는데, 한 개의 플라스미드는 ZFN 쌍의 각 절반이 된다. ZFN1용 플라스미드 20 ug과 ZFN2용 플라스미드 20 ug이 이용되었다. ZFNs는 Sigma로부터 구입하였다. 각 ZFN의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동되었다.
상기 표적화 벡터는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 neoR MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
표 22와 표 44에 나타난 바와 같이, 384개 콜로니가 스크리닝되었고, 290개의 표적화된 클론이 획득되었다. 상기 표적화 효과는 75.52%이었다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이 2개 클론이 낭포 안으로 주사되었다 키메라를 생산하는 2개 클론이 획득되었고, 이들 클론중 1개가 생식계열을 통하여 상기 표적화된 변형을 전달하였다.
더욱이, ZFN1 및 ZFN2를 이용하여 8개 이중대립형질 표적화된 클론을 만들었으며, 효과는 2.08%이었다.
3.2.(b)(i):
큰
표적화
벡터(
LTC
)를 이용하여 렛
아포리포단백질
E (
ApoE
) 좌의
표적화된
변형
ApoE 좌에 약 45 kb의 5' 상동성 아암과 약 23 Kb의 ApoE 좌에 약 23 Kb의 3' 상동성 아암의 측면에 있는 lacZ-마우스 Prm1-Crei 카세트가 포함된 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 이용하여 ApoE 좌의 표적화가 실행된다. 도 22는 1.83 kb 결손과 lacZ 유전자 및 mPrm1-Crei 카세트와 hUb-neo 선별 카세트가 포함된 자가-결손 카세트의 삽입에 의해 ApoE 좌가 파괴된 렛 ApoE 좌를 나타낸다. 실시예 3.2(a)(i)에 이용된 방법을 이용하여 이 벡터를 렛 ES 세포 안으로 도입시킬 수 있다.
실시예
3.2.(b)(ii).
큰
표적화
벡터 (
LTVEC
)를 이용한 렛
ApoE
좌의
표적화
도 22는 렛 ApoE 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 도 22의 상위 도식은 렛 ApoE 좌와 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. ApoE의 엑손은 넌-코딩이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE의 3개 인트론은 선으로 표시되며, 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다.
도 22의 하부 도식은 LTVEC이다. 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 표적화 벡터는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들 (개방 화살표)의 측면에 있는 자가-결손 카세트를 포함하는데, 이 카세트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자, 그리고 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동가능하도록 연계된 네오마이신 저항성 유전자가 포함된 약물 선별 카세트를 포함한다. Crei는 2개의 엑손을 포함하는데, 이들은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론(Crei)에 의해 분리되어 있다. 예를 들면, 자가-결손 카세트를 상세하게 설명하는 U.S. 특허 8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다. 마우스 Prm1 프로모터를 이용하여, F0 렛의 수컷 생식 세포에서 상기 자가-결손 카세트는 특이적으로 결손될 수 있다.
상기 LTVEC는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 neoR MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
표 44에 나타난 바와 같이, 288개 콜로니가 스크리닝되었고, 8개의 표적화된 클론이 획득되었다. 상기 표적화 효과는 2.78%이었다. 키메라 렛 (F0)을 생산하기 위하여, 실시예 2에서 설명된 바와 같이 낭포 단계에서 숙주 배아로 3개 클론이 주사되었다. 더욱이, 한 개의 이중대립형질 표적화된 클론이 생산되었고, 이중대립형질 효과는 0.35%이었다.
3.2.(b)(iii).
아연
핑커
뉴클레아제와 복합하여
큰표적화
벡터(
LTVEC
)를 이용한 렛에서의
ApoE
표적화
렛 ApoE 좌를 표적화하기 위하여 실시예 3.2.(b)(ii)에서 이용된 LTVEC는 아연 핑거 뉴클레아제와 복합 이용되었다. 표 21은 렛 ApoE 좌의 게놈 조직을 요약한 것이고, 나타낸 위치는 상기 렛 게놈 (ENSMBL)의 참고 서열 빌드(build) 5.0에서 취한 것이다.
도 23은 렛 ApoE 좌를 도식한 것으로, ZFN1 및 ZFN2의 절단 부위를 나타내는 회색 막대를 나타낸다. ZFN1의 컷팅 부위는 t 엑손 3에 있고, ZNF2의 컷팅 부위는 인트론 3에 있다. ZFN 양쪽 부위들의 정확한 위치는 표 21에서 제시된다. 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 (각각 차례로 45 kb 및 23 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. ApoE 유전자의 엑손은 넌-코딩(non-coding)이며, 5' 상동성 아암에 가장 가까운 개방 상자로 나타낸다. ApoE 유전자의 3개 인트론은 선으로 표시된다. 엑손 2와 3은 코딩 영역을 포함하고, 반점 회색 상자로 나타낸다. 엑손 4는 코딩 서열과 넌-코딩 서열을 모두 포함하며, 반점 회색 음영 및 개방 상자로 나타낸다.
이용된 LTVEC는 실시예 3.2(b)(ii)의 것과 같고, 도 22에 나타낸다. ZFNs는 2개의 발현 플라스미드로 도입되었는데, 한 개의 플라스미드는 ZFN 쌍의 각 절반이 된다. ZFN1용 플라스미드 20 ug과 ZFN2용 플라스미드 20 ug이 이용되었다. ZFNs는 Sigma로부터 구입하였다. 각 ZFN의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동되었다.
상기 표적화 벡터는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 neoR MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
표 44에 나타난 바와 같이, 288개 콜로니가 스크리닝되었고, 16개의 표적화된 클론이 획득되었다. 상기 표적화 효과는 5.56%이었다. 실시예 2에서 설명된 바와 같이 1개 클론이 낭포 안으로 주사되었다.
더욱이, ZFN1 및 ZFN2를 이용하여 1개 이중대립형질 표적화된 클론을 만들었으며, 효과는 0.35%이었다.
3.2.(b)(iv).
CRISPR
/
Cas9와
복합하여
큰표적화
벡터(
LTVEC
)를 이용한
렛에서의
ApoE
표적화
렛 ApoE 좌를 표적화하기 위하여 실시예 3.2.(b)(ii)에서 이용된 LTVEC는 CRISPR/Cas9와 복합 이용되었다. 표 23은 실험 결과 비교를 나타내는데, 이때 ApoE LTVEC는 단독으로 상기 렛 ApoE 좌를 표적화시키데 이용되거나, 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제와 복합되어 상기 렛 ApoE 좌를 표적화시키는데 이용되었다. 각 실험에서, 전기천공된 세포는 고밀도로 도말되었고, 약물-저항성인 콜로니를 찾기 위하여 약물 선별을 받게 되었다. 약물-저항성 콜로니를 찍어내었고, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 상기 대립유전자의 변형 (MOA) 분석을 이용하여 상기 표적화된 변형에 대해 스크리닝되었다. 특이적으로, 4 x 106개의 세포는 400V 전압, 100 uF 전기용량, 저항성 0에서 2 ug의 ApoE LTVEC로 전기천공되었다. 나중 실험에서, 6 ug의 Cas9 발현 플라스미드와 3 ug의 ApoE gRNA2 또는 3 ug의 ApoE gRNA3가 또한 전기천공되었다. 75 ug/mL의 G418를 이용하여 선별이 실행되었다. ApoE gRNA2는 서열 GCAGGCCCTGAACCGCTTCTTGG (서열 번호: 87) 을 보유하며, 렛 ApoE 엑손 3의 시작의 3' 67bp 영역을 표적으로 한다. ApoE gRNA3은 서열 CCTGCGCTGGGTGCAGACGCTTT (서열 번호: 88)을 보유하며, 렛 ApoE 엑손 3의 시작의 3' 97bp 영역을 표적으로 한다(도 47 참고). 표 23에서 나타낸 바와 같이, Cas9와 어느 쪽이던 gRNAs가 ApoE LTVEC와 함께 상기 세포 안으로 도입되었을 때, 표적화 효과는 증가되었다(43%에서 53% 또는 47%로). 이중대립형질 표적화는 ApoE gRNA2 또는 3과 복합된 ApoE LTVEC로 표적화된 5개 콜로니에서 관찰되었는지만, ApoE LTVEC 단독에서는 이중대립형질 표적화가 관찰되지 않았다.
3.3(a):
렛 인터루킨-2 수용체 감마 (
IL2r
-γ) 좌의
표적화
IL2r-γ 기능을 파괴시키기 위하여, 렛 인터루킨-2 수용체 감마 (IL2r-γ 또는 Il2rg) 좌가 표적화되었다. IL2r-γ는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21에 의한 신호생성에 중요한 역할을 하며, IL2r-γ에서 돌연변이는 T, B 및 NK 세포 개발에서 몇 가지 결함과 연합된다.
도 24에서 나타낸 것과 같이, IL2r-γ 좌에 대한 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암 상동성의 측면에 있는 eGFP-hUb-neo 카세트가 포함된 표적화 벡터를 이용하여 IL2r-γ 좌의 표적화가 실행되었다. 도 25는 상기 렛 IL2r-γ 좌의 게놈 구조를 나타내는데, 이때 IL2r-γ 좌는 3.2 kb 결손에 의해 파괴되었다. 상기 표적화된 IL2r-γ 좌는 또한 eGFP 유전자, 마우스 Protamine1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei를 내포하는 자가-결손 카세트, 그리고 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 hUb 프로모터가 포함된 약물 선별 카세트를 포함하였다.
IL2r-γ 좌에서 표적화 효과를 측정하였고, 표 24에 나타낸다. 선형화된 벡터는 DA.2B 렛 ESCs 안으로 전기천공되며, 표준 기술을 이용하여 형질감염된 콜로니가 배양되었다. 개별 콜로니를 찍어내어, 대립유전자 상실 분석(LOA)을 이용하여 스크리닝되었다.
IL2r-γ-표적화된 렛 ESC 클론을 이용하여 키메라 생산 및 생식계열 전달이 실행되었다. IL2r-γ-표적화된 렛 ESC 클론은 SD 낭포로 현미주사되었고, 그 다음 표준 기술을 이용하여 가상임신된 SD 수용 암컷으로 이송되었다. 털 색으로 키메라가 식별되었고; 수컷 F0 키메라는 SD 암컷으로 사육되었다. 상기 표적화된 IL2r-γ 대립유전자의 존재에 대하여 생식계통 F1 새끼들의 유전자유형을 확인하였다(표 25). 클론 Il2rg-CG12의 또다른 현미 주사 실험에서, 생식계열 전달은 털 색깔 및 유전자형분석에 의해 또한 확인되었다.
Il2rg -/Y 키메라 #3이 더 연구되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)는 몇 가지 림프구 계통에서 항원을 인지하는 항체로 착색되었다. 도 30에서 나타낸 것과 같이, 상기 키메라중 2개에서 GFP-양성 PBMCs가 탐지되었다. 더욱이, GFP+ 세포는 T-세포 표지 CD3에 대하여 음성이었으며 (도 29a), 그리고 B-세포 표지 B220 및 NK 세포 표지 CD161a에 대하여 대부분 음성이었다 (차례로 도 29b 및 c). 야생형 렛의 PBMCs는 GFP 발현에 대하여 음성 대조군으로 이용되었다. 도 29d-f 참고. 작은 이중-양성 집단은 마우스에서 공개된 Il2rg 녹아웃 표현형과 일치한다. IL2 수용체 감마-양성 세포를 포함하는 키메라 렛으로부터 데이터를 얻었으며, 이는 표현형 분석을 복합하게 할 수 있다. 림프구 수의 대응하는 감소를 밝히기 위하여 골수 및 비장의 세포 집단에 유동세포 분석이 또한 실행될 수 있다. Mashimo et al. (2010) PLoS One 5(1):e8870 참고.
3.3(b):
렛 인터루킨-2 수용체 감마(
IL2r
-γ) 좌의
표적화된
변형
IL2r-γ 기능을 파괴시키기 위하여 렛 인터루킨-2 수용체 감마 (IL2r-γ) 좌가 표적화되었다. 도 25는 렛 Il2rg 좌 (도 25의 상부 패널)의 게놈 구조와 좌 안으로 도입된 표적화 벡터 (도 25의 하부 패널)를 나타낸다. eGFP가 리포터로 선택되어, FACS를 이용하여 상기 유전적으로 변형된 렛의 면역표현형이 검사될 것이다. 자가-결손 카세트 (hUb-Neo; Prm1-Cre)를 이용하여 상기 F0 렛의 수컷 생식 세포에서 특이적으로 약물 선별 카세트와 Cre 유전자를 결손시켰다. 추가적으로, 렛 Il2rg 유전자의 전체 코딩 영역 (약 3.2 kb)을 제거하기 위하여 표적화된 벡터가 기획되었다.
렛 ESCs에서 결손 크기는 상기 렛 Il2rg 좌에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해 확인되었다. 낭포 단계에서 숙주 배아 안으로 표적화된 클론의 현미주사시에, 높은 비율읜 키메라가 획득되었다. 출혈용으로 이들 키메라가 준비되었다. 상기 표적화가 예상과 같이 작용했는지를 판단하기 위하여, 출혈 전에 키메라의 말초 혈액을 수거하였고, 말초 혈액에서 면역 세포의 표현형은 FACS를 통하여 분석되었다. 도 30에 나타낸 것과 같이, 검사된 3개 키메라중 2개의 말초 혈액에서 GFP-양성 세포가 탐지되었고, 상기 키메라 렛은 GFP (가령, Il2rg KO 세포) 에 대하여 양성인 1% 미만의 T 세포, 1% 미만의 B 세포, 그리고 1% 미만의 NK-세포를 내포하였다. (도 29a-c).
3.4(a)(i).
큰
표적화벡터(LTVEC)를
이용한
렛에서의
Rag2
좌의
표적화
표 26은 렛 Rag2 좌의 게놈 조직을 요약한 것이고, 나타낸 위치는 상기 렛 게놈 (ENSMBL)의 참고 서열 빌드(build) 5.0에서 취한 것이다. Rag2는 염색체 3의 (+) 가닥에 있다.
도 26은 렛 Rag2 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 상기 LTVEC는 140 kb이며, 결손에 대하여 상기 렛 Rag2 좌의 대략적으로 5.7 kb 부분을 표적으로 한다. 도 26의 상위 도식은 렛 ApoE 좌와 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2는 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다.
도 26의 하부 도식은 LTVEC이다. 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 84 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들의 측면에 있는 자가-결손 카세트 (개방 화살표)를 포함한다. 상기 자가-결손 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 마우스 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다. 또다른 형태의 LTVEC가 생성되었는데, 이때 네오마이신 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자로 대체되어, Il2rg-표적화된 렛 ES 세포의 재표적화를 가능하게 하였다. Crei는 2개의 엑손을 포함하는데, 이들은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론(Crei)에 의해 분리되어 있다. 예를 들면, 자가-결손 카세트를 상세하게 설명하는 U.S. 특허 8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다. 마우스 Prm1 프로모터를 이용하여, F0 렛의 수컷 생식 세포에서 상기 자가-결손 카세트는 특이적으로 결손될 수 있다.
상기 LTVEC는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 neoR MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 그리고 유지되었다.
콜로니는 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 스크리닝되고, 표적화된 클론이 획득된다. 그 다음 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 상기 표적화된 클론은 숙주 배아로 주사되어 F0 렛이 생산된다.
3.4(a)(ii).
큰
표적화벡터
(
LTVEC
) 및
CRISPR
/
Cas9
를 이용한
렛에서의
Rag2
좌의
표적화
표 27은 실험 결과 비교를 나타내는데, 이때 히그로마이신 저항성 유전자를 갖는 Rag2 LTVEC 형태 (도 48)를 단독으로 이용하여 렛 Rag2 좌를 표적화시키거나, 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제와 복합되어 이용되어 상기 렛 Rag2 좌를 표적화시켰다. 각 실험에서, 전기천공된 세포는 고밀도로 도말되었고, 약물-저항성인 콜로니를 찾기 위하여 약물 선별을 받게 되었다. 약물-저항성 콜로니를 찍어내었고, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 상기 대립유전자의 변형 (MOA) 분석을 이용하여 상기 표적화된 변형에 대해 스크리닝되었다. 특이적으로, 4 x 106개의 세포는 400V 전압, 100 uF 전기용량, 저항성 0에서 2 ug의 Rag2 LTVEC로 전기천공되었다. 나중 실험에서, 6 ug의 Cas9 발현 플라스미드와 Rag2 gRNA1 또는 3 ug의 Rag2 gRNA4가 또한 전기천공되었다. 75 ug/mL의 G418를 이용하여 선별이 실행되었다. Rag2 gRNA1은 서열 CCAGCTACTTGCTCGTACAA (서열 번호: 89)을 보유하며, 상기 렛 Rag2 시작 코돈 (ATG)의 3' 219bp 영역을 표적으로 한다. Rag2 gRNA4는 서열 CCCCTCAGATTCACGTGCGT (서열 번호: 90)을 갖고, 상기 렛 Rag2 정지 코돈 (TAG)의 3' 12bp 영역을 표적으로 한다(도 48 참고). 표 27에서 나타낸 바와 같이, Cas9와 어느쪽이던 gRNAs가 Rag2 LTVEC와 함께 상기 세포 안으로 도입되었을 때, 표적화 효과는 증가되었다(0%에서 10% 또는 38%로). 한개 콜로니에서 이중대립형질 표적화가 관찰되었다.
3.4.(b)(i):
렛에서
Rag1
및 Rag 2 좌의
표적화
도 27은 상기 렛 Rag1/Rag2 좌의 게놈 구조를 제공한다. CDS는 코딩 서열을 나타내고, 회색 상자는 엑손을 나타낸다. Rag2는 우측으로 전사되는 "플러스" 가닥 상에 있다. Rag1는 좌측으로 전사되는 "마이너스" 가닥 상에 있다. Mbp = 백만 염기 쌍.
표 28은 렛 Rag2 좌 및 Rag1 좌의 놈 조직을 요약한 것이고, 나타낸 위치는 상기 렛 게놈 (ENSMBL)의 참고 서열 빌드(build) 5.0에서 취한 것이다. Rag1은 염색체 3의 (-) 가닥에 있다.
도 28은 렛 Rag2 좌 및 Rag1 좌와 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도식화한 것을 제공한다. 상기 LTVEC는 약 70 kb이며, 결손에 대하여 Rag1 및 Rag2 좌를 포함하는 대략적으로 16.6 kb 렛 게놈 좌를 표적으로 한다. 도 28의 상위도식은 렛 Rag1 및 Rag2 좌와 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb; 짙은 회색 상자)에 대응하는 게놈 영역의 게놈 조직을 나타낸다. Rag2 및 Rag 1은 각각 반점 회색 음영으로 표시된 단일 엑손을 포함한다. 도 28의 하부 도식은 LTVEC이다. 5' 및 3' 상동성 아암 (각각 차례로 48 kb 및 15 kb)은 짙은 회색 상자로 표시된다. 상기 LTVEC는 리포터 유전자 (lacZ)와 loxP 부위들의 측면에 있는 자가-결손 카세트 (개방 화살표)를 포함한다. 상기 자가-결손 카세트는 Crei 유전자에 작동가능하도록 연계된 렛 Prm1 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자에 작동가능하도록 연계된 인간 유비퀴틴 프로모터를 포함하는 약물 선별 카세트를 포함한다. 또다른 형태의 LTVEC가 생성되었는데, 이때 네오마이신 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자로 대체되어, Il2rg-표적화된 렛 ES 세포의 재표적화를 가능하게 하였다. Crei는 2개의 엑손을 포함하는데, 이들은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론(Crei)에 의해 분리되어 있다. 예를 들면, 자가-결손 카세트를 상세하게 설명하는 U.S. 특허 8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다. 수컷 생식 세포에서 특이적으로 Crei의 발현을 구동시키는 렛 Prm1 프로모터를 이용함으로써, F0 렛의 수컷 생식 세포에서 상기 자가-결손 카세트는 특이적으로 결손될 수 있다.
상기 LTVEC는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 neoR MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 그리고 유지되었다.
콜로니는 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 스크리닝되고, 표적화된 클론이 획득된다. 그 다음 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 상기 표적화된 클론은 숙주 배아로 주사되어 F0 렛이 생산된다.
3.4.(b)(ii):
Il2rg
좌가 이미
표적화된
렛
ES
세포에서
Rag1
과
Rag2
좌의
재표적화
결손용으로 Rag1 및 Rag2 좌를 표적으로 하기 위하여, 도 50에서와 같은 LTVEC를 준비하였다. LTVEC의 전체 길이는 72 kb이었다. 실시예 3.3에서와 같이, Il2rg 좌 결손에 대해 이미 표적화된 렛 ES 세포로 LTVEC는 전기천공되었다. 구체적으로, 클론 Il2rg-CG12으로부터 렛 ES 세포를 얻었고, 이의 생식계열 전달은 실시예 3.3(a)에서 확인되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 그리고 유지되었다. 이중 표적화된 클론은 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 스크리닝되고, 표적화된 클론이 획득되었다. Il2rg-CG12 세포는 85%의 효과에서 재표적화되었고, Il2rg 돌연변이는 상기 표적화된 클론에 여전히 존재하였다. 전기천공은 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 실시되었고, 항생제 선별은 1.5 ug/ml의 퓨로마이신을 이용하여 실시하였다. 그 다음 본 명세서의 도처에서 설명된 바와 같이 상기 표적화된 클론은 숙주 배아로 주사되어 F0 렛이 생산될 것이다. 재표적화는 Rag1 / Rag2-표적화된 렛과 Il2rg-표적화된 렛의 상호교배보다 더 신속하기 때문에 유익하다.
실시예
4.
인간화(Humanization)
4.1.
렛 게놈
좌의인간화
렛 게놈 좌들의 인간화는 본 명세서에서 설명된 렛 ES 세포를 이용하여 실시되는데, 이 세포들은 시험관에서 하나 또는 그 이상의 전기천공 후 이들의 전분화능을 지속할 수 있고, 후세대로 상기 표적화된 유전적 변형을 유전시킬 수 있다. 추가적으로, 큰 게놈 DNA 단편을 수용하는데 있어서 플라스미드의 한계를 회피하고, 그리고 렛 ES 세포의 내생성 좌 안으로 표적화된 유전적 변형을 도입시키는데 있어서 낮은 효과를 극복하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전적 변형은 세균, 가령, 대장균(E. coli )에서 세균성 상동성 재조합 (BHR)을 이용하고, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 사용함으로써 실행된다 본 명세서에서 설명된 LTVEC는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 변형을 가진 내생성 렛 게놈 서열의 큰 단편을 포함하거나, 또는 특이적 게놈 영역에 상보적인 렛 상동성 아암 측면에 있는 외생성 핵산 (가령, 상동성 또는 이종상동성 인간 핵산)을 포함한다.
4.2.
렛
면역글로블린
좌의 인간화
내생성 렛 면역글로블린 중쇄 좌의 인간화는 하나 또는 그 이상의 내생성 렛 면역글로블린 중쇄 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 내생성 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 인간 D 유전자 세그먼트, 및 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 세그먼트)을 제거하고; 그리고 상기 변형된 면역글로블린 좌 안으로 표적화 벡터, 가령, 다음을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 도입시킴으로써 실행된다: (i) 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 인간 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 세그먼트), 또는 하나 또는 그 이상의 재배열된 인간 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 인간 재배열된 V-D-J 유전자 세그먼트); (ii) 선별 카세트 (가령, loxP 부위들을 측면에 가진 네오마이신 저항성 유전자); 그리고 (iii) 5' 상동성 아암과 3' 렛 상동성 아암.
간략하게 설명하자면, 렛 BAC 클론에서 하나 또는 그 이상의 내생성 렛 면역글로블린 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 (가령, 하나 또는 그 이상의 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 인간 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 세그먼트)는 렛 상동성 아암의 측면에 있는 선별 카세트를 가진 내생성 렛 면역글로블린 중쇄 좌를 표적화시킴으로써, 제거되거나 또는 비활성화된다. 더욱 구체적으로, 표적 렛 게놈 서열에 상보적인 5' 상동성 아암과 3' 렛 상동성 아암의 측면에 있는 선별 카세트 (가령, loxP 부위들의 측면에 있는 네오마이신 저항성 유전자)를 포함하도록 표적화 벡터가 구축된다 (가령, 상류 및 하류 렛 게놈 DNA 서열은 하나 또는 그 이상의 렛 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 인간 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 세그먼트를 포괄한다).
그 다음, 렛 면역글로블린 중쇄 좌를 포괄하는 렛 게놈 큰 DNA 단편을 가진 세균성 세포가 선별되고, 일시적 유도성 프로모터에 작동가능하도록 연계된 재조합효소를 인코드하는 플라스미드 (가령, pABG)에 의해 도입된다. 그 다음 상기와 같이 구축된 표적화 벡터는 상기 재조합-수행능력 세균성 세포 안으로 도입된다. 전기천공 후, 상기 세균성 세포는 유도인자 (가령, 아라비노시드)로 처리되어, BAC 클론 하에서 상기 표적화 벡터와 상기 표적 렛 게놈 서열간에 상동성 재조합이 시작된다. 형질변환된 세포는 고밀도로 도말되었고, 약물-저항성인 콜로니를 찾기 위하여 약물 선별을 받게 되었다. 약물-저항성 콜로니를 찍어내었고, 상기 표적화된 변형에 대해 스크리닝되었다.
상기 표적화된 유전적 변형의 식별을 촉진시키기 위하여, a 고처리량 정량적 분석, 이름하여, 대립유전자의 변형 (MOA) 분석이 이용되는데, 이는 부계 염색체에서 변형된 대립유전자(들)의 대규모 스크리닝을 허용한다. MOA 분석은 정량적 PCR, 가령, 실시간 PCR (qPCR)을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 분석 기술을 통하여 실행될 수 있다. 예를 들면, 실시간 PCR은 상기 표적 좌를 인지하는 제 1 프라이머 세트와 비-표적화된 참고 좌를 인지하는 제 2 프라이머 세트를 포함한다. 추가적으로, 상기 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인지하는 형광 프로브를 포함한다. 대안으로, 상기 정량적 분석은 형광물질-중개된 제자리(in situ) 혼성화 (FISH), 상대적 게놈 혼성화, 등온선 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, Invader Probes®, MMP 분석®, TaqMan® Molecular Beacon, 그리고 Eclipse™ 프로브 기술이 포함되나, 이에 국한되지 않은 다양한 분석 기술을 통하여 실시될 수 있다. (예를 들면, US2005/0144655 참고하며, 이의 전문이 참고자료에 편입됨).
상기 변형된 렛 BAC 클론, 가령, BAC 클론 내포 렛 게놈 DNA 서열을 포함하는 세균성 세포, 이때 하나 또는 그 이상의 내생성 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 (VH, D, 및/또는 JH 유전자 세그먼트)는 결손되거나 또는 비활성화되는데, 이 세포는 그 다음 다음을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)로 전기천공된다: (i) 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 VH 유전자 세그먼트, 하나 또는 그 이상의 인간 D 유전자 세그먼트, 그리고 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 세그먼트), 또는 하나 또는 그 이상의 재배열된 인간 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 재배열된 인간 V-D-J 유전자 세그먼트).
세균성 세포에서 상동성 재조합의 시작 및 양성 클론의 선별은 상기에서 설명된 바와 같이 실행되었다. 내생성 면역글로블린 중쇄 좌 안으로 표적화될 때, 재배열안된 또는 재배열된 인간 면역글로블린 중쇄 가변 영역 핵산 서열은 내생성 렛 면역글로블린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 대안으로, 내생성 렛 중쇄 불변 영역 좌는 내생성 중쇄 불변 영역 좌로부터 하나 또는 그 이상의 렛 중쇄 불변 영역 유전자 세그먼트 (CH)를 결손시킴으로써 비활성화될 수 있고, 인간 중쇄 불변 영역 핵산 서열로 대체될 수 있다.
유사하게, 내생성 렛 면역글로블린 κ 또는 λ 경쇄 좌의 인간화는 하나 또는 그 이상의 내생성 렛 면역글로블린 κ 및/또는 λ 경쇄 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 내생성 렛 Vκ 유전자 세그먼트 및 하나 또는 그 이상의 내생성 렛 Jκ 유전자 세그먼트)을 제거하고; 그리고 표적화 벡터, 가령, 다음을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)로 상기 변형된 면역글로블린 경쇄 좌를 표적화시킴으로써 실행될 수 있다: (i) 하나 또는 그 이상의 재배열안된 인간 면역글로블린 경쇄 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 인간 Vκ 유전자 세그먼트 및 하나 또는 그 이상의 인간 Jκ 유전자 세그먼트), 또는 하나 또는 그 이상의 재배열된 인간 가변 영역 핵산 서열 (가령, 하나 또는 그 이상의 인간 재배열된 Vκ-Jκ 유전자 세그먼트); (ii) 선별 카세트 (가령, loxP 부위들을 측면에 가진 네오마이신 저항성 유전자); 그리고 (iii) 5' 상동성 아암과 3' 렛 상동성 아암.
내생성 면역글로블린 경쇄 좌 안으로 표적화될 때, 재배열안된 또는 재배열된 인간 면역글로블린 경쇄 가변 영역 핵산 서열은 내생성 렛 면역글로블린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다.
세균성 세포 안에서 이렇게 생성된 LTVEC는 예를 들면, 인간화된 렛 면역글로블린 중쇄 또는 경쇄 좌가 포함된 삽입 핵산과 특이적 게놈 표적 서열에 상보적인 렛 상동성 아암 (가령, 5 kb 내지 150 kb 범위)을 포함하는데, 이때 하나 또는 그 이상의 내생성 렛 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트는 하나 또는 그 이상의 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트로 대체된다. 상기에서 설명된 유전적 변형이 포함된 LTVEC는 그 다음 선형화되고, 상기 렛 ES 세포 안으로 전기천공된다. 전기천공된 렛 ES 세포는 상기 표적화 벡터가 포함된 약물-저항성 세포의 선별을 위하여 고밀도로 도말된다. 상기 약물 선별 공정은 상기 도말된 세포의 대부분(~99%)을 제거하며, 개별 콜로니를 남겨두며, 이때 콜로니 각각은 단일 세포로부터 유도된 클론이다. 남아있는 세포 중에서, 대부분 세포 (~ 80-100%)는 상기 게놈에서 무작위 위치에 통합된 상기 표적화 벡터를 보유한다. 따라서, 상기 콜로니은 개별적으로 떼어내고, 정확한 게놈 위치에서 상기 표적화 벡터를 품고 있는 렛 ES 세포를 식별해내기 위하여 유전자유형분석된다 (가령, 상기에서 설명된 대립유전자의 변형(MOA) 분석).
상기 표적화된 유전적 변형의 효과를 증가시키기 위하여, 상기 렛 ES 세포는 LTVEC와 함께 ZFNs 1 및 2 (또는 TALENs 1 및 2)를 발현시키는 발현 벡터 (또는 mRNA)로 전기천공되었다. 상기 표적화 벡터의 상동성 아암은 ZFN 표적 부위의 외부에 위치하며, 따라서 상기 표적화 벡터는 ZFNs에 의해 쪼개지지 않는다. ZFNs에 의해 생성된 이중 가닥 틈은 상동성-지향된 복구 (HDR)를 촉진시키는데, 이것은 포유류 세포에서 정상적으로 발생되는 매우 작은 비율의 복구에 해당된다 (비-상동성 단부-연결; NHEJ과 비교하여).
대안으로, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 발현 벡터 내포 유형 II CRISPR-연합된 뉴클레아제 (가령, Cas9), 가이드 RNA (CRISPR-RNA (cr-RNA) 및 트란스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 포함)는 LTVEC와 함께 세균성 세포 안으로 도입되어, 상기 표적 게놈 좌에서 상동성 재조합 효과를 증가시킬 수 있다. 전기천공된 세포는 고밀도로 도말되었고, 약물-저항성인 콜로니를 찾기 위하여 약물 선별을 받게 되었다. 약물-저항성 콜로니를 찍어내고, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 상기 대립유전자의 변형 (MOA) 분석을 이용하여 상기 표적화된 변형에 대해 스크리닝된다. 이 과정에 따라, 표적화 효과의 개선이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 개선 정도는 작거나 (가령, 10% 내지 15%) 또는 클 것이다 (가령, 10% 내지 80%의 개선).
상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 선별된 렛 ES 세포는 숙주 렛 배아, 예를 들면, 상실배-전 단계 또는 낭포 단계 렛 배아 안으로 도입되고, 시조 렛(F0 동물)을 만들기 위하여 대리모의 자궁 안에 이식된다. 차후, 상기 시조 렛은 예를 들면, 유전적 변형에 대한 이형접합성 F1 자손을 만들기 위하여 야생형 렛으로 사육된다. 이형접합성 F1 렛의 짝짓기는 상기 유전적 변형에 동형접합성 자손을 생산할 수 있다.
4.3(a).
렛
IL2rg
를
HumIL2
수용체 감마로 대체
표 29는 렛 렛 인터루킨 2 수용체 감마 좌의 게놈 조직을 요약한 것이고, 나타낸 위치는 상기 렛 게놈 (ENSMBL)의 참고 서열 빌드(build) 5.0에서 취한 것이다. Il2rg는 염색체 X의 (-) 가닥에 있다.
도 25의 하부 도식은 Il2rg 3.2 kb 결손에 대한 상기 표적화 벡터다. 상기 표적화 벡터는 내생성 프로모터에 작동가능하도록 연계된 리포터 유전자 (eGFP)와 loxP 부위들의 측면에 있는 자가-결손 카세트 (개방 화살표)를 포함한다. 자가-결손 카세트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 Crei 유전자와 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동가능하도록 네오마이신 저항성 유전자가 포함된 선별 카세트를 포함한다.
Crei 유전자는 2개의 엑손을 포함하는데, 이들은 원핵 세포 안에서 이의 발현을 방지하기 위하여 인트론(Crei)에 의해 분리되어 있다. 예를 들면, 자가-결손 카세트를 상세하게 설명하는 U.S. 특허 8,697,851 및 U.S. 출원 공개 2013-0312129 참고하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고자료에 편입된다. 마우스 Prm1 프로모터를 이용하여, Cre 발현 카세트 및 약물 선별 카세트는 F0 렛의 수컷 생식 세포에서 특이적으로 결손될 수 있다. 상기 표적화 벡터는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 네오마이신-저항성 MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
도 31에 나타낸 것과 같이, 전장 렛 인터루킨 2 수용체 감마 코딩 영역이 전장 인간 인터루킨 2 수용체 감마 코딩 영역으로 대체되도록, 플라스미드 표적화 벡터가 구축되었다. 상기 표적화 벡터는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 네오마이신-저항성 MEFs에 도말되었다. 구체적으로, 4 x 106 세포는 400V 전압, 100 uF 전기용량, 저항성 0에서 2 ug의 Il2rg 전장 인간화 벡터로 전기천공되었다. 75 ug/mL의 G418를 이용하여 선별이 실행되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
표 44에 나타난 바와 같이, 168개 콜로니가 스크리닝되었고, 6개의 표적화된 클론이 획득되었다. 상기 표적화 효과는 3.57%이었다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이 1개 클론이 낭포 안으로 주사되었고, 키메라를 생산하는 한 개의 클론이 획득되었다.
실시예 1에서 설명된 바와 같이 2개 클론이 낭포 안으로 주사되었다. F0 키메라 렛을 생산하는 클론이 획득되었다. 표준 기술을 이용하여 낭포는 가상임신 수용 암컷으로 이전되었고, 키메라 F0 렛이 획득되었다. 생식계열을 통하여 상기 표적화된 변형을 전달하는 F0 렛이 획득된다.
4.3(b)(i).
렛
IL2rg
엑토
-도메인을
HumIL2rg
엑토
-도메인으로 대체
IL 2 수용체 감마의 전장 인간화는 이런 변형된 좌를 가진 렛이 인간 Il2rg를 생산하기 때문에 유용하며; 그리고 인간 Il2rg에 특이적인 항체로 렛에서 인간 Il2rg의 탐지를 허용할 것이다.
엑토-인간화 (가령, 상기 Il2rg의 렛 엑토-도메인이 Il2rg의 인간 엑토-도메인으로 대체)에 의해 Il2rg 폴리펩티드는 Il2rg에 대한 인간 리간드에 결합하게 될 것이지만, 세포질 도메인은 여전히 렛이기 때문에 Il2rg의 엑토-인간화된 형태는 여전히 상기 렛 신호생성 기전과 상호작용 또한 할 것이다. 도 33은 상기 인간 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 20; NP_000197.1); 상기 렛 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 21; NP_543165.1); 그리고 상기 렛 IL-2rg 단백질의 나머지에 융합된 IL-2rg의 상기 인간 엑토-도메인이 포함된 키메라 IL-2rg 단백질 (서열 번호: 22)의 서열 배열을 제공한다. 상기 인간과 렛 IL-2rg 사이의 교점(junction)은 수직 선으로 표시된다.
표 30은 렛 렛 인터루킨 2 수용체 감마 좌의 게놈 조직을 요약한 것이고, 나타낸 위치는 상기 렛 게놈 (ENSMBL)의 참고 서열 빌드(build) 5.0에서 취한 것이다. Il2rg는 염색체 X의 (-) 가닥에 있다. Il2rg의 엑토-도메인의 위치가 더 표시된다.
도 32에 나타낸 것과 같이, 인터루킨 2 수용체 감마 코딩 영역의 렛 엑토-도메인이 인간 엑토 도메인으로 대체되도록, 플라스미드 표적화 벡터가 구축되었다. 상기 표적화 벡터는 실시예 1에서 획득된 렛 ES 세포 안으로 전기천공되었고, 상기 세포는 2i + 10 uM ROCKi에서 15 cm 2x 밀도 네오마이신-저항성 MEFs에 도말되었다. 상기 형질변환된 렛 ES 세포는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 배양되고, 선별되고, 그리고 유지되었다.
표 44에 나타난 바와 같이, 192개 콜로니가 스크리닝되었고, 13개의 표적화된 클론이 획득되었다. 상기 표적화 효과는 6.77%이었다.
실시예 1에서 설명된 바와 같이, 2개 클론이 낭포 안으로 주사되었고, 키메라를 생산하는 2개 클론을 얻었다. F0 렛을 생산하는 클론이 획득되었다. 생식계열을 통하여 상기 표적화된 변형을 전달하는 F0 렛이 획득된다.
4.3(b)(ii).
CRISPR
/
Cas9
과 복합된 플라스미드를 이용하여 렛
IL2rg
엑토
-도메인을
HumIL2rg
엑토
-도메인으로 대체
표 31은 실험 결과 비교를 나타내는데, 이때 도 32에 나타낸 Il2rg 엑토-도메인 인간화 벡터 형태 단독으로 이용하여 상기 렛 Il2rg 좌를 표적화시키거나 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제와 복합되어 이용되어 렛 Il2rg 좌를 표적화시켰다. 각 실험에서, 전기천공된 세포는 고밀도로 도말되었고, 약물-저항성인 콜로니를 찾기 위하여 약물 선별을 받게 되었다. 약물-저항성 콜로니를 찍어내었고, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 상기 대립유전자의 변형 (MOA) 분석을 이용하여 상기 표적화된 변형에 대해 스크리닝되었다. 구체적으로, 4 x 106 세포는 400V 전압, 100 uF 전기용량, 저항성 0에서 2 ug의 Il2rg 엑토-도메인 인간화 벡터로 전기천공되었다. 나중 실험에서, 6 ug의 Cas9 발현 플라스미드와 3 ug의 Il2rg gRNA2 또는 3 ug의 Il2rg gRNA4가 또한 전기천공되었다. 75 ug/mL의 G418를 이용하여 선별이 실행되었다. Il2rg gRNA2는 서열 GAAGCTCTTTCTATACAATCTGG (서열 번호: 91)을 갖고, 상기 렛 Il2rg 엑손 1의 3' 190bp 영역을 표적으로 한다. Il2rg gRNA4는 서열 CCCCCGAAAGGAGGAGCCCTAGG (서열 번호: 92)을 갖고, 렛 Il2rg 정지 코돈 (TGA)의 5' 80bp 영역을 표적으로 한다 (도 49 참고).
4.4(a).
CRISPR
/
Cas9
엔도뉴클레아제에
의한 비-인간 동물 큰 유전자의 결손과 함께 동시에 인간 유전자의 대체에 의한 강화된
표적화
인간 질환 상태를 위하여 새로 개발된 약물, 이를 테면 완전한 인간 항체는 인간 세포 및 조직에서 이들의 표적에 대하여 매우 특이적이지만, 설치류에 있는 상동성 표적은 인지하지 못한다. 이러한 높은 수준의 선택성은 인간에서 이를 사용하기에 앞서 설치류에서 약물의 작용 효과 및 기전을 테스트하는 것을 불가능하게 만든다.
이 문제에 대한 매우 효과적인 해결책은 약물 표적을 인코드하는 인간 유전자를 설치류 동족체로 대체시킨, 유전적으로 변형된 마우스 또는 렛을 만드는 것이다. 설치류에서 이러한 인간화된 대립유전자를 만드는 한 가지 방법은 배아 줄기 (ES) 세포에서 설치류 유전자를 우선 제거하고, 그 다음 제 2 유전자 변형 이벤트에서 상기 결손된 좌에 정확하게 인간 유전자를 삽입시키는 것이다. 그 다음 이 ES 세포를 설치류 배아 안으로 주사하고, 대리모 설치류의 자궁에 이식시켜, 후속적으로 상기 인간화된 대립유전자를 가지는 유전적으로 변형된 새끼를 낳는 것이다.
상기 인간화된 유전자 변형을 만드는 더 효과적인 방법은 상기 설치류 유전자의 결손과 동시에 이의 인간 대응부로의 치환을 지휘하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 이용하는 것이다. VELOCIGENE® 유전 공학적 방법을 이용함으로써, 상기 설치류 유전자 결손과 인간 유전자 삽입이 약 20 킬로베이스 쌍(kb) 보다 더 작을 때 상대적으로 높은 효과를 가지면서 단일-단계 인간화가 이루어질 수 있다. 100 kb 이상의 결손과 대체를 수반하는 더 큰 단일-단계 인간화는 LTVECs 및 유전 공학적 방법 이를 테면 VELOCIGENE® 유전 공학적 방법을 이용하면 가능하지만, 때로 매우 큰 변형에서 부닥치는 감소된 표적화 효과로 인하여, 원하는 유전자 변형을 가진 것을 성공적으로 찾아내기 위하여 수십만개의 ES 세포 클론 또는 스크리닝이 대개 요구된다.
큰 인간화의 효과를 개선시키기 위하여, 우리는 LTVEC 유전자 표적화와 클러스트화된 규칙적 간극을 가진 짧은 팔린드롬성 반복부 RNA-안내된 Cas9 엔도뉴클레아제 (CRISPR/Cas9)와 복합시키는 방법을 개발하였다. CRISPR/Cas9 뉴클레아제는 가이드 RNA와 상기 표적 DNA중 하나 사이에 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 특정 DNA 서열에 Cas9 절단을 유도하는, CRISPR RNA에 결합된 세균성 Cas9 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하는 리보핵산단백질 효소들이다. 상기 표적화 기전의 단순성으로 인하여, 거의 임의의 게놈 좌에서 이중 가닥 틈을 지시하는 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 기획하는 것은 용이하다. 이중 가닥 파괴는 상기 비-상동성 단부 연결 (NHEJ) 경로에 의한 세포 게놈 복구를 유도하는데, 이것은 오류발생이 쉬워서, 흔히 이중 가닥 틈 부위에 결손 또는 삽입을 초래한다. 이중 가닥 틈을 복구하는 대체 기전은 상동성-지향된 복구 (HDR)이며, 이때 절단된 부위와 서열 동일성 유사성을 공유하는 DNA의 내생성 또는 외생성 조각은 상기 세포 상동성 재조합 기전 작용에 의해 절단된 단부를 이음매없이 복구시킨다. HDR은 절단된 부위에서 원래 서열로 복구되는 완벽한 복구를 초래할 수 있고, 또는 기획된 변형, 이를 테면 이중 가닥 틈의 부위에서 서열의 결손, 삽입 또는 대체를 지시하는데 이용될 수 있다. CRISPR/Cas9 뉴클레아제는 상기 부위들에서 의도된 유전자 변형의 정확한 이중 가닥 절단을 지시함으로써, 공작된 HDR 이벤트 비율을 상당히 개선시킬 수 있다.
설치류 유전자의 전부 또는 일부분의 정확한 단일-단계 결손과 함께 이의 인간 동족체의 전부 또는 일부로의 동시 대체의 효과를 평가하기 위하여, 설치류 ES 세포 3개의 핵산 분자를 전기천공에 의해 도입시켰다. (1) LTVEC; (2) Cas9 엔도뉴클레아제를 인코드하는 플라스미드 또는 mRNA; 그리고 (3) CRISPR 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 sgRNA 자체를 인코드하는 플라스미드. 상기 LTVEC는 상기 설치류 유전자를 결손시키고, 상기 인간 유전자를 삽입시키는 HR 이벤트를 지시하도록 기획된, 설치류 DNA의 상동성 아암의 측면에 있는 유전자 산물(단백질 또는 RNA)를 인코드하는 인간 유전자의 모두 또는 일부분을 포함한다. 상기 인간화 LTVEC는 또한 항생제 약물 (예를 들면, G418)에 대한 저항성을 부여하는 효소 (가령, 네오마이신 포스포트란스퍼라제)의 발현을 지시하는 약물 선별 카세트를 운반하였다. LTVEC를 취입하고, 이를 이들의 게놈 안으로 통합시킨 ES 세포는 배양 접시내 항생제 약물이 내포된 성장 배지 상에서 성장하고 콜로니를 형성할 수 있었다. LTVEC 분자보다 500 내지 1,000 배 더 많은 CRISPR/Cas9-인코딩 핵산 분자를 도입하였기 때문에, 대부분의 LTVEC-내포 약물 저항성 콜로니는 최소한 일시적으로, CRISPR/Cas9 성분들을 포함하였다. 우리는 약물 저항성 콜로니를 선택하였고, 정확하게 표적화된 인간화된 대립유전자를 보유하는 클론을 식별해내기 위하여 대립유전자-상실 방법(loss-of-allele method)에 의해 이를 스크리닝하였다 (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660; Frendewey, D. et al. (2010) The loss-of-allele assay for ES cell screening and mouse genotyping, Methods Enzymol. 476:295-307; 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 통합됨).
한 특정 구체예에서, 마우스 Lrp5 (저-밀도 지질단백질 수용체-관련된 단백질 5) 유전자의 68 kb 결손과 상기 상동성 인간 LRP5 유전자의 91kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 34). 상기 LTVEC는 결손될 마우스 Lrp5 유전자 68kb의 측면에 있는 마우스 Lrp5 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA의 7 kb 및 33 kb를 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 LRP5 유전자의 91-kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, Lrp5 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 8개 sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE2, gE, gF)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Lrp5 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 LRP5 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Lrp5 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 32에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 스크린된 약물 저항성 클론의 1.0%는 정확하게 표적화된 단일-대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 8개 sgRNAs (sgRNA-5´A, sgRNA-5´B, sgRNA-5´B2, sgRNA-C, sgRNA-D, sgRNA-3´E2, 및 sgRNA-3´F; 표 33에 서열 제공)중 7개에 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이가 2.1 내지 7.3% 범위의 효과를 가지고 생성되었는데, 이는 도움을 받지 않은 LTVEC와 비교하였을 때 2-내지 9-배 강화된 단일-단계 인간화된 유전자 표적화를 나타낸다. 단일대립형질 표적화에 추가하여, sgRNA-5´B2에 의한 Cas9-안내된 절단의 경우, 1% 빈도의 이중대립형질 동형접합성 인간화가 탐지되었다. VELOCIMOUSE® 유전 공학적 방법 (Poueymirou, W. T. et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25:91-99, 이의 전문이 참고자료에 편입됨)에 의해 동형접합성 Lrp5 인간화된 ES 세포는 표현형 및 약물 효과 연구를 위한 완전한 ES 세포-유도된 마우스로 직접적으로 전환될 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)로 실행된 등가의 실험과 비교하였을 때, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제에 의한 큰 Lrp5 인간화의 강화된 표적화가 두드러진다. 결손에 대해 표적화된 마우스 Lrp5 유전자의 영역내 부위들에서 이중 가닥 틈을 만들기 위하여 기획된 4개의 ZFNs을 구하였다(도 34). 한 가지 ZFN은 상기 결손의 5' 단부 부근 서열을 표적으로 하고(a), 하나는 상기 결손 중앙 서열을 표적으로 하고 (b), 그리고 나머지 2개는 상기 결손의 3' 단부 부근 서열을 표적으로 하였다 (c, d). 별도의 실험에서, 별도의 실험에서, Lrp5 인간화 LTVEC와 4개의 ZFNs (a-d)중 하나는 인코드하는 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Lrp5 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 모든 ZFNs는 활성이 있었고, Lrp5 유전자에서 NHEJ 돌연변이를 유도할 수 있었지만 (데이타는 제시되지 않음), LTVEC와 복합되었을 때, LTVEC 단독과 비교하여, HDR-중개된 유전자 표적화가 강화되지는 않았던 것으로 판단하였다.
ZFN-지원된 일련의 인간화 실험과 비교하였을 때, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제에 의한 큰 Lrp5 인간화의 강화된 표적화 효과 또한 현저하다. 이들 실험에서, 일련의 ZFN-지원된 인간화가 실행되었는데, 이때 마우스 표적 유전자 결손과 상기 인간 유전자 삽입은 일반적으로 크기가 증가되었다 (표 34; 도 35). 도 35a는 결손에 대한 크기가 증가되는 LTVECs 표적화 유전자의 표적화 효과 백분율을 나타낸다. 상기 LTVECs가 단독으로 이용되거나 (회색 사각형), 또는 ZFNs와 복합되어 이용되었다 (검정 사각형). 도 35b는 크기가 증가되는 인간 유전자 삽입을 갖는 LTVECs 표적화 효과 백분율을 나타낸다. 다시, LTVECs가 단독으로 이용되거나 (회색 삼각형), 또는 ZFNs와 복합되어 이용되었다 (검정 삼각형). 표 34 및 도 35에 나타낸 것과 같이, LTVEC 표적화 효과를 강화시키는 ZFN-중개된 DNA 절단 능력은 마우스 표적 유전자 결손의 크기가 24.7 kb 이상일 때 그리고 상기 인간 유전자 삽입의 크기가 22.2 kb 이상일 때 사라졌다 (표 34; 도 35a). 대조적으로, CRISPR/Cas9는 Lrp5 유전자의 LTVEC 표적화 효과를 강화시킬 수 있었는데, 이는 68.3 kb의 마우스 유전자 결손과 91.0 kb의 인간 유전자 삽입이 관련되었다 (표 32; 도 34). 이는 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제는 다른 뉴클레아제 (가령, 아연 핑거 뉴클레아제)가 작용하지 않는 상황에서 LTVEC 표적화 효과를 강화시킬 수 있음을 나타낸다.
다른 마우스 유전자의 인간화에 대한 비교 실험이 실행되었다. 한 실험에서, 마우스 Trpa1 (일시적인 수용체 전위 양이온 채널 하위패밀리 A 멤버 1) 유전자의 45 kb 결손과 함께 상동성 인간 TRPA1 유전자의 55 kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다(도 36). 상기 LTVEC는 결손된 마우스 Trpa1 유전자 45 kb 서열의 측면에 있는 마우스 Trpa1 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 41 kb 및 58 kb을 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 TRPA1 유전자의 55kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, Trpa1 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 8개 sgRNAs (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, 및 gF)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Trpa1 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 TRPA1 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Trpa1 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 35에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 스크린된 약물 저항성 클론의 1.0%는 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 8개의 sgRNAs (A, A2, B, C, D, 및 F; 표 43에 서열 제공됨)중 6개에 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이 또는 이중대립형질 컴파운드 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이가 1.0 내지 3.1% 범위의 효과를 가지고 생성되었다. gRNA A 및 gRNA F에 의한 Cas9-안내된 절단의 경우, 우리는 1.0%의 빈도로 컴파운드 이형접합성 돌연변이가 탐지되었다.
또다른 실험에서, 마우스 Folh1 (글루탐산염 카르복시펩티다제 2) 유전자의 55 kb 결손과 함께 상동성 인간 FOLH1 유전자의 61 kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 37). 상기 LTVEC는 결손된 마우스 Folh1 유전자 55 kb 서열의 측면에 있는 마우스 Folh1 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 22 kb 및 46 kb을 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 FOLH1유전자의 61kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, Folh1 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 6개 sgRNAs (gA, gA2, gC, gD, gE, 및 gE2)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Folh1 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 FOLH1 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Folh1 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 36에 나타낸다.. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 96가지 스크린된 약물 저항성 클론중 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것은 하나도 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 6개의 sgRNAs중 3개(A, D, 및 E2; 표 43에 서열 제공됨) 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이가 1.0 내지 3.1% 범위의 효과를 가지고 생성되었다.
또다른 실험에서, 보체 성분 5에 대한 마우스 유전자(C5 또는 Hc)의 76 kb 결손과 함께, 상동성 인간 C5 유전자의 97 kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 38). 상기 LTVEC는 결손된 마우스 C5 (Hc) 유전자 76 kb 서열의 측면에 있는 마우스 C5 (Hc) 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 34.1 kb 및 31.2 kb을 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 C5 유전자의 97kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, C5 (Hc) 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 6개 sgRNAs (gA, gB, gC, gD, gE, 및 gE2)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 C5 (Hc) 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 C5 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
C5 (Hc) 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 37에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 스크린된 약물 저항성 클론의 1.0%는 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 6개의 sgRNAs (A, B, C, D, E, 및 E2; 표 43에 서열 제공됨) 모두에 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이 또는 이중대립형질 컴파운드 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이가 4.2 내지 16.7% 범위의 효과를 가지고 생성되었다. gRNAs A 및 E에 의한 Cas9-안내된 절단의 경우, 우리는 차례로 5.2% 및 4.2%의 빈도로 컴파운드 이형접합성 돌연변이가 탐지되었다.
또다른 실험에서, 마우스 Adamts5 (트롬보스폰딘 모티프 5와 함께 디스인테그린과 메탈로프로타나제) 유전자의 38 kb 결손과 함께 상동성 인간 ADAMTS5 유전자의 43 k 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 39). 상기 LTVEC는 결손된 마우스 Adamts5 유전자 38 kb 서열의 측면에 있는 마우스 Adamts5 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 22 kb 및 46 kb을 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 ADAMTS5 유전자의 43kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, Adamts5 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 8개 sgRNAs (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, 및 gF)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Adamts5 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 ADAMTS5 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Adamts5 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 38에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 96가지 스크린된 약물 저항성 클론중 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것은 하나도 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 8개의 sgRNAs 중 2개(B, 및 F; 표 43에 서열 제공됨)에 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이 또는 이중대립형질 컴파운드 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이가 1.0 % 의 효과를 가지고 생성되었다. gRNA E2에 의한 Cas9-안내된 절단의 경우, 우리는 1.0%의 빈도로 컴파운드 이형접합성 돌연변이가 탐지되었다.
또다른 실험에서, 마우스 Erbb4 (수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-4) 유전자 유전자의 102 kb 결손과 함께 상동성 인간 ERBB4 유전자의 127 kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 40). 상기 LTVEC는 결손된 마우스 Erbb4 유전자 102 kb 서열의 측면에 있는 마우스 Erbb4 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 48 kb 및 26 kb을 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 ERBB4 유전자의 127 kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, Erbb4 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 8개 sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE, gE2, 및 gF)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Erbb4 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 ERBB4 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Erbb4 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 39에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 96가지 스크린된 약물 저항성 클론중 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것은 하나도 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 8개의 sgRNAs 중 1개(D; 표 43에 서열 제공됨)에 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이 또는 이중대립형질 컴파운드 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이가 1.0 % 의 효과를 가지고 생성되었다. gRNA D에 의한 Cas9-안내된 절단의 경우, 우리는 1%의 빈도로 컴파운드 이형접합성 돌연변이가 탐지되었다.
또다른 실험에서, 마우스 Ror1 (티로신-단백질 키나제 막통과 수용체 ROR1) 유전자 유전자의 110 kb 결손과 함께 상동성 인간 ROR1 유전자의 1347 kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 41). 상기 LTVEC는 결손된 마우스 Ror1 유전자 110 kb 서열의 측면에 있는 마우스 Ror1 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 41.8 kb 및 96.4 kb을 포함하는 상동성 아암의 측면에 위치한 인간 ROR1 유전자의 134 kb 단편을 포함하였다. 별도의 실험에서, Ror1 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 6개 sgRNAs (gA, gB, gC, gD, gE, 및 gF)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Ror1 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 ROR1 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Ror1 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 40에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 96가지 스크린된 약물 저항성 클론중 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것은 하나도 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 6개의 sgRNAs중 2개(D 및 F; 표 43에 서열 제공됨) 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 또는 이중대립형질 돌연변이가 1.0%의 효과를 가지고 생성되었다. gRNA F에 의한 Cas9-안내된 절단의 경우, 1%의 빈도로 컴파운드 이형접합성 돌연변이가 또한 탐지되었다.
또다른 실험에서, 마우스 Dpp4 (디펩티딜 펩티다제 4) 유전자의 79 kb 결손과 함께 상동성 인간 DPP4 유전자의 82 kb 단편이 동시에 대체되도록 LTVEC가 기획되었다 (도 42). 상기 LTVEC는 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 측면에 있는 인간 DPP4 유전자의 82 kb 단편을 포함하며, 이들 각 아암은 결손된 마우스 Dpp4 유전자의 79kb 서열의 측면에 있는 마우스 Dpp4 좌의 일부분으로부터 유도된 게놈 DNA 46kb을 포함한다. 별도의 실험에서, Dpp4 인간화 LTVEC와 Cas9를 인코드하는 플라스미드와 8개 sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE, gE2, 및 gF)중 하나를 인코드하는 제 2 플라스미드를 복합시켜, 결손에 대하여 표적화된 마우스 Dpp4 유전자의 영역 안에 이중 가닥 틈을 만들었다. 상기 sgRNAs는 상기 인간 DPP4 유전자의 삽입된 부분내 임의의 서열 인지를 회피하도록 기획되었다.
Dpp4 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화의 결과는 표 41에 나타낸다. LTVEC만을 단독으로 ES 세포 안으로 도입시켰을 때, 스크린된 약물 저항성 클론의 2.1%는 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 인간화된 대립유전자를 가지는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 테스트된 8개의 sgRNAs (A, B, B2, C, D, E, E2, 및 F; 표 43에 서열 제공됨)중 임의의 하나에 의해 안내된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC의 조합으로 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이가 2.1 내지 7.3% 범위의 효과를 가지고 생성되었다.
상기 다양한 마우스 유전자의 CRISPR/Cas9-지원된 인간화에 대한 결과를 요약한 표가 표 42에 제공된다. 제 1 열은 표적화된 유전자 좌를 나타낸다. 제 2 열은 내생성 마우스 좌의 결손 크기(Del)과 대응하는 인간 좌의 삽입 크기 (Ins)를 나타낸다. 나머지 열은 정확하게 표적화된 단일대립형질 이형접합성 돌연변이, 이중대립형질 컴파운드 이형접합성 돌연변이, 또는 이중대립형질 동형접합성 돌연변이를 갖는 각 조건에 대한 콜로니의 수(96개 중에서)를 나타낸다. "gRNA 없음"은 LTVEC 단독을 나타내며, 다른 줄은 LTVEC + 대응하는 gRNAs 를 나타낸다(상기 결손 좌 안에 상대적 위치를 나타냄).
실시예
5.
렛 게놈 좌의
표적화된
변형 요약
표 45는 플라스미드 또는 CRISPR/Cas9와 복합된 LTVECs으로 렛 ES 세포의 표적화의 요약을 나타낸다. 2개의 gRNAs는 각 표적화된 좌: Rag2, ApoE, 및 Il2rg에 대해 별도로 테스트되었다 3개 좌 모두에서 CRISPR/Cas9의 절단 효과는 > 20% 이었다. CRISPR/Cas9가 표적화 플라스미드 및 LTVECs와 복합되어 이용될 때, 효적화 효과가 증가되고, 이중대립형질 표적화도 증가된 것으로 관찰되었다.
표 46은 렛 게놈 좌의 표적화된 변형을 위한 생식계열 전달 데이터의 요약을 나타낸다. ApoE-표적화된 렛 및 Il2rg-표적화된 렛에 대한 생식계통 전달이 확인되었다. 렛 ES 세포는 XY (수컷)이었고, 표적화된 이형접합성이었다. 따라서, 상기 표적화된 ES 세포가 생식계열이 기여할 때, ES 세포로부터 유도된 정자의 대략 50%는 상기 돌연변이 대립유전자를 품고 있을 것이며 이형접합성 F1 새끼를 낳을 것이다.
실시예
6.
인간 유도된
다분화능
줄기 세포의 생성, 유지 및
표적화
6.1.
인간
iPS
세포의 생성
이 실시예는 비-다능성 인간 세포로부터 인간 iPS 세포 생성을 설명한다. CM7 프로모터에 작동가능하도록 연계된 4개의 재프로그래밍 인자 (hOct4, hSox2, hKLF-4, hMYC)를 인코드하는 유전자를 포함하는 PiggyBac (System Biosciences) 벡터 (PB-600A_CAGGS Bst XI (0.64 μg/μL) 및 PB-200 (0.99μg/μL)은 RED 및 BLUE GeneIn™ 트랜스펙션 시약 (GlobalStem)을 이용하여 신생 인간 포피 섬유아세포 안으로 도입되었다. 형질감염된 세포는상기 벡터의 통합 및 재프로그래밍 인자의 발현을 허용하기 위하여, E7 배지내 NuFF1 먹이공급 세포상에서 항온처리되었다. E7 배지는 DMEM/F-12, NaHCO3, L-아스코르빈산, 인슐린, 트랜스페린, 셀레니움, 및 FGF-2를 포함한다.
E7 배지에서 2 μg/mL 퓨로마이신을 이용하여 트랜스펙션 후 10일에 퓨로마이신 선별이 시작되었다. 21일 차에, 콜로니가 선별되었고, DMEM/F-12, NaHCO3, L-아스코르빈산, 인슐린, 트랜스페린, 셀레니움, FGF-2, TGF-β1, 글루타티온, L-글루타민, 확정된(defined) 지질, 티아민, 미량 원소 B 및 C, β-멀캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 피페콜산, 염화리튬, 및 GABA이 포함된 mTeSR™ 배지에서 배양되었다. 29일에서 57일 시점까지, 세포는 6 웰 플레이트에서 ~50% 합류될 때까지 mTeSR™ 배지에서 증식되고, 계대되었다. 65일 내지 73일 시점까지, mTeSR™ 배지 및 Gentle Cell Dissociation Reagent (Stem Cell Technologies)을 이용하여 증식 및 계대가 지속되었다. 76일 시점에서, 배지는 순수 또는 순수-외양 hiPSCs가 포함된 세포의 추가 증식, 계대 및 유지를 위하여 오스몰농도가 낮은 VG2i 배지로 교체되었다.
6.2.
인간
iPS
세포에서
LTVEC
표적화
이 실시예는 인간 iPS 세포에서 LTVEC 표적화의 용도를 설명한다. 도 51에서 나타난 바와 같이, VG2i 배지에서 증식된 인간 iPS 세포 안으로 다음의 핵산 분자가 전기 천공에 의해 도입되었다: (1) LTVEC (0.67 μg); (2) Cas9 엔도뉴클레아제 (5 μg)를 인코딩하는 플라스미드; 그리고 (3) CRISPR 단일 가이드 RNA (gRNA) (10 μg)를 인코딩하는 플라스미드. 시료 한 세트에서, Cas9와 gRNA는 배제되었다. 특이적으로, 3 x 106개 세포는 700V 전압, 25 uF 전기용량 그리고 400 ohms 저항에서 전기천공되었다. 상기 LTVEC는 결손될 인간 ADAM6 좌 4.1 kb 서열 측면에 있는 게놈 영역으로부터 유도된 게놈 DNA 34 kb 및 105 kb를 포함하는 상동성 아암 측면에 있는 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자가 포함된 16.7 kb 핵산을 포함하였다. 상기 LTVEC는 또한 항생제 약물 (히그로마이신)에 대한 저항성을 부여하는 효소의 발현을 지시하는 약물 선별 카세트를 운반하였다. 이용된 인간 ADAM6 gRNA는 다음의 서열을 갖는다: GTATAGCCCTGTTACACATT (서열 번호: 94).
LTVEC를 취입하고, 이를 이들의 게놈 안으로 통합시킨 세포는 GELTREX™-피복된 조직 배양 접시내 항생제 약물이 내포된 성장 배지 상에서 성장하고 콜로니를 형성할 수 있었다. LTVEC 분자보다 500 내지 1,000 배 더 많은 CRISPR/Cas9-인코딩 핵산 분자를 도입하였기 때문에, 대부분의 LTVEC-내포 약물 저항성 콜로니는 최소한 일시적으로, CRISPR/Cas9 성분들을 포함하였다. 우리는 약물 저항성 콜로니를 선택하였고, 정확하게 표적화된 인간화된 대립유전자를 보유하는 클론을 식별해내기 위하여 대립유전자-상실 방법(loss-of-allele method)에 의해 이를 스크리닝하였다 (Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotech. 21:652-660; Frendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307; 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 통합됨)
ADAM6 좌의 CRISPR/Cas9-지원된 LTVEC 표적화 결과는 표 47에 나타낸다.
LTVEC 단독으로 인간 iPS 세포 안으로 도입된 경우, 3.1%의 표적화 효과가 관찰되었다. 대조적으로, ADAM6 gRNA에 의해 안내된 Cas9와 LTVEC가 복합되면 표적화 효과는 7.3%가 되었다.
6.3.
인간
iPS
세포 형태에서
오스놀농도가
낮은 배지의 효과
본 실시예는 배양에서 인간 iPS 세포의 전분화능 상태에 있어서, 염 농도, 이온 강도 및/또는 오스몰농도의 효과를 설명한다. 인간 iPS 세포는 표 48에서 설명된 배지 또는 mTeSR™ -hLIF 배지에서 MATRIGEL™ 또는 GELTREX™ 기질 상에서 배양되었다.
이용된 기본 배지가 DMEM일 때, 이 배지는 2i 배지로 지칭되었다. 이용된 기본 배지가 VG-DMEM일 때, 이 오스몰농도가 낮은 배지는 VG2i 배지로 지칭되었다. VG2i 배지 (233 mOsm/kg)의 오스몰농도는 전통적인 2i 배지 (261 mOsm/kg)의 오스몰농도보다 낮다.
도 52에 나타낸 바와 같이, 8 일 (도 52a) 또는 12 일 (도 52b)의 기간 동안 2i 배지에서 MATRIGEL™ 상에서 배양된 인간 iPS 세포는 프라임된 상태의 iPS 세포의 형태 특징을 나타내었고, 구체적으로 상피 단층에서 성장 및 정점-기반 극성의 출현을 나타낸다.
인간 iPS 세포의 형태 및 전분화능 상태에 있어서 mTeSR-hLIF 배지 및 VG2i 배지의 효과를 더 평가하였다. 본 연구에서, 인간 iPS 세포는 6일의 기간 동안 mTeSR™ -hLIF 배지 (도 53a 및 53c) 또는 VG2i 배지 (도 53b 및 53d) MATRIGEL™ 또는 NuFF 먹이공급 세포 상에서 배양되었다. mTeSR™ -hLIF 배지에서 MATRIGEL™ 또는 NuFF 먹이공급 세포 상에서 배양되었을 때, 인간 iPS 세포는 프라임된 전분해능 상태의 iPS 세포의 형태 특징을 나타내었고, 구체적으로 상피 단층에서 성장 및 정점-기반 극성의 출현을 나타낸다. mTeSR™ -hLIF 배지에서 배양된 일부 세포는 3차원적 응괴형성을 특징으로 하는 형태를 나타내기 시작하였다. 대조적으로, VG2i 배지에서 MATRIGEL™ 또는 NuFF 먹이공급 세포 상에서 배양되었을 때, 상기 인간 iPS 세포는 순수 전분화능 상태의 형태 특징, 구체적으로 둥근 돔-모양 콜로니를 나타내었고, 정점-기반 극성은 부족하였다.
6.4.
인간
iPS
세포에서
전분화능
표지의 발현에 있어서
오스몰
농도가 낮은 배지의 효과
본 실시예는 프라임된 상태에서 순수 상태로 재프로그됨된 인간 iPS 세포에서 전분화능 표지들의 발현에 있어서, 염 농도, 이온 강도 및/또는 오스몰농도의 효과를 설명한다. VG2i 배지에서 MATRIGEL™ 기질상에서 24일 배양 후, 재프로그램된 순수 인간 iPS 세포는 알칼리 포스파타제 또는 NANOG의 발현에 대하여 착색되었다. 재프로그램된 세포는 알칼리 포스파타제 (도 54a) 및 NANOG (도 54b 및 54c) 모두를 강력하게 발현시킨 것으로 관찰되었고, 이는 순수 전분화능 상태를 나타낸다.
6.5. 인간 iPS 세포의 효소적 해리 및 준배양에서 낮은 오스몰농도 배지의 효과
본 실시예에서, 오스몰농도가 낮은 VG2i 배지를 이용하여 순수 상태로 재프로그램된 인간 iPS 세포는 트립신을 이용하여 해리시켜 단일 세포 현탁액을 만들었다 (도 55a). 상기 세포 현탁액은 VG2i 배지에서 계대배양을 위하여 GELTREX™-피복된 새 플레이트 상에 계대되었다. 1 일 (도 55b)과 4 일 (도 55c) 후, 상기 계대배양된 세포는 순수 전분화능 상태의 세포 형태 특징을 지속적으로 나타낸 것으로 관찰되었다. 구체적으로, 상기 세포는 둥근 돔-모양 콜로니로 성장되며, 정점-기반 극성은 나타내지 않았다. 사전-자가사멸 경로의 활성화를 방지하는데 전형적으로 요구되는 ROCK 억제제 없이 효소적 분리가 실행될 수 있음이 자명하다. 이는 사전-자가사멸 경로는 본 명세서에서 확인된 조건하에 배양된 순수 인간 iPS 세포의 효소적 분리 및 계대 배양 동안 강력하게 활성화되지 않음을 암시한다.
본 명세서에서 언급된 공개 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 공개물, 특허 출원들은 각 개별 공개, 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고문헌에 통합된 것과 동일한 수준으로 참고자료에 통합된다. 임의의 구체예의 내용으로부터 자명하지 않는 한, 본 발명의 측면, 단계 또는 특징은 임의의 다른 것과 복합될 수 있다. 범위와 관련하여, 이 범위내의 임의의 수, 그리고 이 범위의 임의의 하위 범위의 정수를 포함한다. 다중 범위의 언급에는 이러한 범위의 복합이 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Frendewey, David
Auerbach, Wojtek
Lai, Ka-Man Venus
Mujica, Alexander O.
Lee, Jeffrey D.
Droguett, Gustavo
Trzaska, Sean
Hunt, Charleen
Gagliardi, Anthony
Kuno, Junko
Valenzuela, David M.
Yancopoulos, George D.
<120> Methods and Compositions for the
Targeted Modification of a Genome
<130> 057766/453460
<150> US 61/914,768
<151> 2013-12-11
<150> US 62/017,416
<151> 2014-06-26
<150> US 62/029,261
<151> 2014-07-25
<150> US 62/052,906
<151> 2014-09-19
<150> US 62/059,527
<151> 2014-10-03
<150> US 62/064,384
<151> 2014-10-15
<160> 94
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a genomic target sequence that is linked to a
guide RNA (gRNA)
<220>
<221> misc_feature
<222> 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21
<223> n = A,T,C or G
<400> 1
gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23
<210> 2
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide RNA (gRNA)
<400> 2
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 3
<211> 42
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide RNA (gRNA)
<400> 3
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cg 42
<210> 4
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a crRNA
<400> 4
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau 30
<210> 5
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a crRNA
<400> 5
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aag 33
<210> 6
<211> 26
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a crRNA
<400> 6
gaguccgagc agaagaagaa guuuua 26
<210> 7
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a tracrRNA
<400> 7
aaggcuaguc cg 12
<210> 8
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a tracrRNA
<400> 8
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 50
<210> 9
<211> 203
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 9
Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
His Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn
20 25 30
Ala Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Gly Asn Leu Met Asn Gln
35 40 45
Ile Lys Asn Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe
50 55 60
Ile Ser Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu
65 70 75 80
Lys Leu Cys Ala Pro Asn Met Thr Asp Phe Pro Ser Phe His Gly Asn
85 90 95
Gly Thr Glu Lys Thr Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Met Val Ala Tyr
100 105 110
Leu Ser Ala Ser Leu Thr Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Val Leu Asn
115 120 125
Pro Thr Ala Val Ser Leu Gln Val Lys Leu Asn Ala Thr Ile Asp Val
130 135 140
Met Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Arg Val Gly His Val Asp Val Pro Pro Val Pro Asp His Ser Asp Lys
165 170 175
Glu Ala Phe Gln Arg Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Thr Tyr
180 185 190
Lys Gln Val Ile Ser Val Val Val Gln Ala Phe
195 200
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN1a binding site
<400> 10
caggccctga accgc 15
<210> 11
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN1 cutting site
<400> 11
ttctgg 6
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN1b binding site
<400> 12
gattacctgc gctggg 16
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZF21a binding site
<400> 13
ttcaccctcc gcacc 15
<210> 14
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN2 cutting site
<400> 14
tgctgag 7
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZF21b binding site
<400> 15
tatccagatc caggggtt 18
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> conserved domain of a family of homing nucleases
<400> 16
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN1a binding site
<400> 17
caggccctga accgc 15
<210> 18
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN1 cutting site
<400> 18
ttctgg 6
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZFN1b binding site
<400> 19
gattacctgc gctggg 16
<210> 20
<211> 369
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu
260 265 270
Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro
275 280 285
Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His
290 295 300
Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro
325 330 335
Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn
340 345 350
Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu
355 360 365
Thr
<210> 21
<211> 368
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 21
Met Leu Lys Pro Leu Leu Pro Ser Arg Ser Phe Leu Leu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Arg Val Gly Trp Ser Ser Lys Val Leu Met Ser Ser Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Lys Ser Asp Leu Leu Leu Thr Ser Met Asp Leu Lys
35 40 45
His Leu Ser Val Pro Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Met His Tyr Arg Tyr Lys Gly Ser Asp Asn
85 90 95
Asn Thr Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Lys Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Ile Gln Lys Glu Asp Ile Gln Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Gln Lys Pro Gln Arg Arg Ala Glu Gln
130 135 140
Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu Tyr Asn Leu Ser Glu Ser Gln Val Glu Leu Arg Trp Lys Ser
165 170 175
Arg Tyr Ile Glu Arg Cys Leu Gln Tyr Leu Val Gln Tyr Arg Ser Asn
180 185 190
Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Gln Ile Val Asp His Glu Pro Arg Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Glu Gln Lys Leu Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Ile Cys Gly Ser Thr Gln Gln Trp Ser Lys Trp
225 230 235 240
Ser Gln Pro Ile His Trp Gly Ser His Thr Ala Glu Glu Asn Pro Ser
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Leu Ile Pro Val Gly Thr Met Gly Leu
260 265 270
Ile Ile Thr Leu Ile Phe Val Tyr Cys Trp Leu Glu Arg Met Pro Arg
275 280 285
Ile Pro Ala Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly
290 295 300
Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Thr Glu Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Phe Cys His Val Ser Glu Ile Pro Pro
325 330 335
Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser Leu
340 345 350
His Ser Pro Tyr Trp Pro Pro Pro Cys Tyr Ser Leu Lys Pro Glu Ala
355 360 365
<210> 22
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric IL-2 receptor gamma comprising the rat
IL-2 receptor gamma protein having the ecto domain
of IL-2 gamma receptor from human
<400> 22
Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp
35 40 45
Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln
130 135 140
Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn
165 170 175
Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp
180 185 190
Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe
245 250 255
Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Leu Ile Pro Val Gly Thr Met Gly Leu
260 265 270
Ile Ile Thr Leu Ile Phe Val Tyr Cys Trp Leu Glu Arg Met Pro Arg
275 280 285
Ile Pro Ala Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly
290 295 300
Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Thr Glu Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Phe Cys His Val Ser Glu Ile Pro Pro
325 330 335
Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser Leu
340 345 350
His Ser Pro Tyr Trp Pro Pro Pro Cys Tyr Ser Leu Lys Pro Glu Ala
355 360 365
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a genomic target sequence that is linked to a
guide RNA (gRNA)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)...(21)
<223> n= A, T, C or G
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> n can be from 1-20 nucleotides
<400> 23
gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 24
gggaacccac agcatactcc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 25
gaatcatgca cggctacccc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 26
tgctcctatg gggaggcgcg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 27
cttggataac attgataccc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 28
ggggcagagc ccttatatca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 29
tcgctcacat taatccctag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 30
gtactgggga atcggtggtc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 31
cacgcactcc aaatttatcc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 32
ctaagtgtgt atcagtacat 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 33
tgccctgcac aataagcgca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 34
actcattgaa acgttatggc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 35
agtaagggtg gattaaattc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 36
gccatctaga ttcatgtaac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 37
gactagaaat gttctgcacc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 38
tgaaccaatt gtgtagcctt 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 39
aatagtggta aagcaccatg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 40
gtgtgctaag gatcgaagtc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 41
caccgagatg cttgggtatt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 42
tgtaaccgcc ctgaatgacc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 43
aaaagggcat cataaatccc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 44
tcaaaaatag tcatacacct 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 45
ggtctctagt acattgtaga 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 46
atcacaaacc agttaaccgg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 47
tttcagacga gccgacccgg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 48
ctgtcaacag tgccgcgttt 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 49
tgtgtgtcat agcgatgtcg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 50
aacaggtacc ctatcctcac 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 51
tcgtggttgc atgcgcactg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 52
ggcccggacc tagtctctct 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 53
agtctgtaaa gttagcagtc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 54
ggtggtggtg ctgacggaca 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 55
tatgagatca acactcgcta 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 56
ccaaggactt ccccacgtta 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 57
tgcttccctt atgcaagatt 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 58
ttaggtaccc tatttgaata 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 59
tgcagtgggt gacaggtcca 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 60
agggttatac tgacgttgtg 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 61
tgtctttcaa ggagggctac 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 62
tgatgtgcag tcagacaaag 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 63
tgcactatgg ttgactatga 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 64
ggaatattct aataggaagt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 65
aagtgctgta ccattctagc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 66
taatcaatag acaacctcgt 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 67
tcattcctaa tggtattata 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 68
agggtacata gatggcatcg 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 69
ctctttaaca attaccactt 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 70
tgtgggcctt tgctgatcac 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 71
aatctatgat cctatggcct 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 72
tgccaatagc agtgacttga 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 73
gggaagaatg ggctattgtc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 74
ggttgtttgt gctgatgacg 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 75
ccgtcctagg ccttctacgt 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 76
actagtagac ctgaggggtt 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 77
gctccagtgt ttaggccttg 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 78
ggcaagctga aaacgcatgc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 79
gtagatcgct ttccactacc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 80
gaactccact gctcgtgagc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 81
ataggtgggc actattgaag 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 82
atgggaaggt ttataccagc 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 83
cggtgtaaaa acaacgggaa 20
<210> 84
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 84
gacccgcagu cccagcgucg 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 85
actgagatca atgaccccga 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 86
gggtcgcccg gaacctctac 20
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 87
gcaggccctg aaccgcttct tgg 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 88
cctgcgctgg gtgcagacgc ttt 23
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 89
ccagctactt gctcgtacaa 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 90
cccctcagat tcacgtgcgt 20
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 91
gaagctcttt ctatacaatc tgg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 92
cccccgaaag gaggagccct agg 23
<210> 93
<211> 56
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 93
ttctgagcct cagccgacca acctcactat gcactatagg tatgagaagg gggagg 56
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> aArtificial Sequence
<220>
<223> a guide sequence
<400> 94
gtatagccct gttacacatt 20
Claims (59)
- 마우스 세포 또는 인간 세포내 관심 대상의 게놈 좌에서 게놈을 변형시키는 방법에 있어서, 이 방법은 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에서 상기 게놈을 Cas 단백질, 상기 관심 대상의 게놈 좌의 표적 서열에 혼성화되는 CRISPR RNA, 그리고 tracrRNA에 접촉시키는 것을 포함하고,
이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 상기 관심 대상의 게놈에서 5'표적 서열에 상동성인 5' 상동성 아암과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고, 이때 제 1 핵산은 최소한 30 kb이며 및/또는 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 30 kb에 의해 분리되며, 이때 LTVEC 존재하에서 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA에 접촉된 후, 상기 게놈은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입이 포함된 표적화된 유전적 변형이 포함되도록 변형되는 것을 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 LTVEC는 마우스 세포 또는 상기 인간 세포 안으로 도입되는, 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 변형된 마우스 세포 또는 상기 변형된 인간 세포를 식별해내는 것을 더 포함하는, 방법.
- 청구항 2 또는 3에 있어서, 이때 CRISPR RNA 및 tracrRNA는 단일 전사체 형태로 함께 도입되는, 방법.
- 청구항 2 또는 3에 있어서, 이때 CRISPR RNA 및 tracrRNA는 별도로 도입되는, 방법.
- 청구항 2-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때:
(a) Cas 단백질은 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 도입되며;
(b) CRISPR RNA는 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 도입되며; 그리고
(c) tracrRNA는 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안으로 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 도입되는, 방법. - 청구항 6에 있어서, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 단백질-RNA 복합체로써 마우스 세포 또는 상기 인간 세포 안으로 도입되는, 방법.
- 청구항 6에 있어서, 이때:
(a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고;
(b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고
(c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고;
이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안에서 활성인, 방법. - 청구항 8에 있어서, 이때 제 1, 제 2, 및/또는 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
- 청구항 6에 있어서, 이때:
(a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고
(b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 단일 전사체 안에 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고;
이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 마우스 세포, 또는 상기 인간 세포 안에서 활성인, 방법. - 청구항 10에 있어서, 이때 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 단일 단계에서 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함하는, 방법.
- 청구항 12에 있어서, 이때 상기 결손된 내생성 핵산 서열은 약 30 kb 내지 약 110 kb이며, 상기 삽입된 제 1 핵산은 약 40 kb 내지 약 140 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형인, 방법.
- 청구항 14에 있어서, 이때 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
- 청구항 14에 있어서, 이때 상기 변형된 마우스 세포 또는 상기 변형된 인간 세포는 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성인, 방법.
- 청구항 14에 있어서, 이때 상기 변형된 마우스 세포 또는 상기 변형된 인간 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성인, 방법.
- 청구항 16에 있어서, 이때 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
- 청구항 16에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 방법: (1) 제 1 및 제 2 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 15 kb, 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 또는 최소한 90 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 LTVEC는 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 또는 최소한 200 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 제 1 핵산은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 150 kb, 최소한 200 kb, 최소한 250 kb, 또는 최소한 300 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 제 1 핵산은 약 40 kb 내지 약 140 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 마우스 세포 또는 상기 인간 세포는 일차 세포 또는 불사화된 세포인, 방법.
- 청구항 1-23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 마우스 세포 또는 상기 인간 세포는 다능성 세포인, 방법.
- 청구항 25에 있어서, 이때 마우스 다능성 세포는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
- 청구항 25에 있어서, 이때 상기 인간 다능성 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포, 인간 성인 줄기 세포, 발생학적으로 제한된 인간 선조 세포, 또는 인간 유도화된 다능성 줄기 (iPS) 세포인, 방법.
- 청구항 27에 있어서, 이때 상기 인간 iPS 세포는 기본 배지와 보충물이 포함된 배지 안에서 유지되며, 이때 상기 배지는 다음을 포함하는 방법:
(a) 백혈병 억제 인자 (LIF) 폴리펩티드;
(b) 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK3) 억제제; 그리고
(c) MEK 억제제;
이때 상기 배지는 약 175 mOsm/kg 내지 약 280 mOsm/kg의 오스몰농도를 갖는다. - 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 상기 표적 서열은 프로토스페이스 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 측면에 있는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 150 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 LTVEC의 5' 상동성 아암과 3' 상동성 아암의 총 합은 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 120 kb, 또는 약 120 kb 내지 150 kb인, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 내생성 핵산 서열이 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열로 대체;
(b) 내생성 핵산 서열의 결손;
(c) 내생성 핵산 서열의 결손,
이때 상기 결손은 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb 범위이며;
(d) 외생성 핵산 서열의 삽입;
(e) 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb 범위의 외생성 핵산 서열의 삽입;
(f) 상동성 또는 이종상동성 핵산 서열이 포함된 외생성 핵산 서열의 삽입;
(g) 인간 및 비-인간 핵산 서열이 포함된 키메라 핵산 서열의 삽입;
(h) 부위-특이적 재조합효소 표적 서열의 측면에 있는 조건부 대립인자의 삽입;
(i) 상기 다능성 세포 안에서 활성인 프로모터에 작동가능하도록 연계된 선택성 표지 또는 리포터 유전자의 삽입; 또는
(j) 이의 조합. - 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 3 Mb 미만에 의해 분리되는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 5 kb 그러나 10 kb 미만, 최소한 10 kb 그러나 20 kb 미만 최소한 20 kb 그러나 40 kb 미만, 최소한 40 kb 그러나 60 kb 미만, 최소한 60 kb 그러나 80 kb 미만, 최소한 약 80 kb 그러나 100 kb 미만, 최소한 100 kb 그러나 150 kb 미만, 또는 최소한 150 kb 그러나 200 kb 미만, 최소한 약 200 kb 그러나 약 300 kb 미만, 최소한 약 300 kb 그러나 약 400 kb 미만, 최소한 약 400 kb 그러나 약 500 kb 미만, 최소한 약 500 kb 그러나 약 1Mb 미만, 최소한 약 1 Mb 그러나 약 1.5 Mb 미만, 최소한 약 1.5 Mb 그러나 약 2 Mb 미만, 최소한 약 2 Mb 그러나 약 2.5 Mb 미만, 또는 최소한 약 2.5 Mb 그러나 약 3 Mb 미만에 의해 분리되는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 20 kb, 최소한 30 kb, 최소한 40 kb, 최소한 50 kb, 최소한 60 kb, 최소한 70 kb, 최소한 80 kb, 최소한 90 kb, 최소한 100 kb, 최소한 110 kb, 최소한 120 kb, 최소한 130 kb, 최소한 140 kb, 최소한 150 kb, 최소한 160 kb, 최소한 170 kb, 최소한 180 kb, 최소한 190 kb, 또는 최소한 200 kb에 의해 분리되는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 약 30 kb 내지 약 110 kb에 의해 분리되는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 인터루킨-2 수용체 감마 좌, ApoE 좌, Rag1 좌, Rag2 좌, Rag1 및 Rag2 좌 둘 모두, Adamts5 좌, Trpa1 좌, Folh1 좌, Erbb4 좌, Lrp5 좌, C5 (Hc) 좌, Ror1 좌, 또는 Dpp4 좌를 하는, 방법.
- 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 상기 관심 대상의 게놈 좌는 염색체외 DNA를 포함하는, 방법.
- 관심 대상의 게놈 좌에서 표적화된 유전적 변형이 포함된 F0 세대 마우스를 생산하는 방법에 있어서, 이때 이 방법은 다음을 포함하는 방법:
(a) 변형된 마우스 ES 세포를 만들기 위하여, 마우스 ES 세포내 게놈은 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에서 상기 게놈을 Cas 단백질, 상기 관심 대상의 게놈 좌의 표적 서열에 혼성화되는 CRISPR RNA, 그리고 tracrRNA에 접촉시키는 것을 포함하고,
이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 상기 관심 대상의 게놈에서 5'표적 서열에 상동성인 5' 상동성 아암과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고, 이때 제 1 핵산은 최소한 30 kb이며 및/또는 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 30 kb에 의해 분리되며,
(b) 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 상기 변형된 마우스 ES 세포를 식별해내고;
(c) 상기 변형된 마우스 ES 세포를 마우스 숙주 배아 안으로 도입시키고; 그리고
(d) 마우스 숙주 배아를 대리모에 착상시키고,
이때 대리모는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형이 포함된 F0 세대 마우스를 낳는다. - 청구항 40에 있어서, 이때 CRISPR RNA 및 tracrRNA는 단일 전사체 형태로 함께 도입되는, 방법.
- 청구항 40에 있어서, 이때 CRISPR RNA 및 tracrRNA는 별도로 도입되는, 방법.
- 청구항 40-42중 임의의 한 항에 있어서, 이때:
(a) Cas 단백질은 단백질 형태, Cas 단백질을 인코드하는 메신져 RNA (mRNA), 또는 Cas 단백질을 인코드하는 DNA 형태로 상기 마우스 ES 세포 안으로 도입되며;
(b) CRISPR RNA는 RNA 또는 CRISPR RNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 마우스 ES 세포 안으로 도입되며; 그리고
(c) tracrRNA는 RNA 또는 tracrRNA를 인코드하는 DNA 형태로 상기 비-인간 ES 세포 안으로 도입되는, 방법. - 청구항 43에 있어서, 이때 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA는 상기 마우스 ES 세포 안에 단백질-RNA 복합체로 도입되는, 방법.
- 청구항 43에 있어서, 이때:
(a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고;
(b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA는 CRISPR RNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있으며; 그리고
(c) tracrRNA를 인코드하는 DNA는 tracrRNA를 인코드하는 제 4 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 3 프로모터가 포함된 제 3 발현 구조체 형태 안에 있고;
이때 제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터들은 마우스 ES 세포 안에서 활성인, 방법. - 청구항 45에 있어서, 이때 제 1, 제 2, 및 제 3 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
- 청구항 43에 있어서, 이때:
(a) Cas 단백질을 인코드하는 DNA는 Cas 단백질을 인코드하는 제 2 핵산에 작동가능하도록 연계된 제1 프로모터가 포함된 제 1 발현 구조체 형태 안에 있고; 그리고
(b) CRISPR RNA를 인코드하는 DNA와 tracrRNA를 인코드하는 DNA는 단일 전사체 안에 CRISPR RNA 및 tracrRNA가 포함된 gRNA를 인코드하는 제 3 핵산에 작동가능하도록 연계된 제 2 프로모터가 포함된 제 2 발현 구조체 형태 안에 있고;
이때 제 1 및 제 2 프로모터들은 마우스 ES 세포 안에서 활성인, 방법. - 청구항 47에 있어서, 이때 제 1 및 제 2 발현 구조체들은 단일 핵산 분자 상에 있는, 방법.
- 청구항 40-48중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입을 동시에 포함하는, 방법.
- 청구항 40-49중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 이중대립형질 유전적 변형인, 방법.
- 청구항 50에 있어서, 이때 상기 이중대립형질 유전적 변형은 2개의 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
- 청구항 50에 있어서, 이때 상기 변형된 마우스 ES 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 컴파운드 이형접합성인, 방법.
- 청구항 50에 있어서, 이때 상기 변형된 마우스 ES 세포는 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 반접합성인, 방법.
- 청구항 52에 있어서, 이때 하나의 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 상기 표적화된 유전적 변형은 내생성 핵산 서열의 결손과 제 1 핵산의 삽입을 포함하는, 방법.
- 청구항 52에 있어서, 이때 상기 표적화된 유전적 변형은 다음을 포함한다: (1) 제 1 및 제 2 상동성 염색체 안에 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 내생성 핵산 서열의 결손; 그리고 (2) 제 1 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌에 제 1 핵산의 삽입과 제 2 상동성 염색체 안에 관심 대상의 게놈 좌의 붕괴.
- 청구항 40-55중 임의의 하나의 방법에 있어서, 이때 Cas 단백질은 Cas9인, 방법.
- 진핵 세포내 관심 대상의 게놈 좌에서 게놈을 변형시키는 방법에 있어서, 이 방법은 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 존재하에서 상기 게놈을 Cas 단백질, 상기 관심 대상의 게놈 좌의 표적 서열에 혼성화되는 CRISPR RNA, 그리고 tracrRNA에 접촉시크는 것을 포함하고,
이때 LTVEC는 최소한 10 kb이며, 상기 관심 대상의 게놈에서 5'표적 서열에 상동성인 5' 상동성 아암과 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암에서 3' 표적 서열에 상동성인 3' 상동성 아암의 측면에 있는 제 1 핵산을 포함하고, 이때 제 1 핵산은 최소한 30 kb이며 및/또는 5' 표적 서열과 3' 표적 서열은 최소한 30 kb에 의해 분리되며,
이때 상기 진핵 세포는 렛 세포는 아니며, 그리고
이때 LTVEC 존재하에서 Cas 단백질, CRISPR RNA, 및 tracrRNA에 접촉된 후, 상기 게놈은 상기 관심 대상의 게놈 좌에서 제 1 핵산의 삽입이 포함된 표적화된 유전적 변형이 포함되도록 변형되는, 방법. - 청구항 57에 있어서, 이때 상기 렛이 아닌 진핵 세포는 다능성 세포, 비-다능성 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 헴스터 세포, 또는 섬유아세포인, 방법.
- 청구항 57에 있어서, 이때 상기 렛이 아닌 진핵 세포는 일차 세포 또는 불사화된 세포인, 방법.
Applications Claiming Priority (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361914768P | 2013-12-11 | 2013-12-11 | |
| US61/914,768 | 2013-12-11 | ||
| US201462017416P | 2014-06-26 | 2014-06-26 | |
| US62/017,416 | 2014-06-26 | ||
| US201462029261P | 2014-07-25 | 2014-07-25 | |
| US62/029,261 | 2014-07-25 | ||
| US201462052906P | 2014-09-19 | 2014-09-19 | |
| US62/052,906 | 2014-09-19 | ||
| US201462059527P | 2014-10-03 | 2014-10-03 | |
| US62/059,527 | 2014-10-03 | ||
| US201462064384P | 2014-10-15 | 2014-10-15 | |
| PCT/US2014/060788 WO2015088643A1 (en) | 2013-12-11 | 2014-10-15 | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
| US62/064,384 | 2014-10-15 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177023915A Division KR102170502B1 (ko) | 2013-12-11 | 2014-10-15 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160095150A true KR20160095150A (ko) | 2016-08-10 |
| KR101773782B1 KR101773782B1 (ko) | 2017-09-01 |
Family
ID=51830654
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020167018610A KR101773782B1 (ko) | 2013-12-11 | 2014-10-15 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| KR1020177023915A KR102170502B1 (ko) | 2013-12-11 | 2014-10-15 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177023915A KR102170502B1 (ko) | 2013-12-11 | 2014-10-15 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US9546384B2 (ko) |
| JP (3) | JP6174811B2 (ko) |
| KR (2) | KR101773782B1 (ko) |
| CN (2) | CN105980568B (ko) |
| AU (3) | AU2014360811B2 (ko) |
| BR (1) | BR112016013400B1 (ko) |
| CA (1) | CA2933433C (ko) |
| IL (1) | IL245674B (ko) |
| MX (2) | MX2016007654A (ko) |
| RU (2) | RU2685914C1 (ko) |
| SG (1) | SG10201700961TA (ko) |
| WO (1) | WO2015088643A1 (ko) |
Families Citing this family (181)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| WO2011159847A2 (en) | 2010-06-15 | 2011-12-22 | The Regents Of The University Of California | Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof |
| DK3252076T3 (da) | 2011-01-14 | 2019-12-02 | Univ California | Diagnostisk anvendelse af antistoffer mod ror-1-protein |
| EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| EP2847335B1 (en) | 2012-04-25 | 2018-06-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors |
| PE20150336A1 (es) | 2012-05-25 | 2015-03-25 | Univ California | Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn |
| CN109369808B (zh) | 2012-08-24 | 2023-11-07 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗 |
| KR101844123B1 (ko) | 2012-12-06 | 2018-04-02 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 |
| ES2904803T3 (es) | 2013-02-20 | 2022-04-06 | Regeneron Pharma | Modificación genética de ratas |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| CN113563476A (zh) | 2013-03-15 | 2021-10-29 | 通用医疗公司 | 遗传和表观遗传调节蛋白至特定基因组基因座的rna引导的靶向 |
| PT3456831T (pt) | 2013-04-16 | 2021-09-10 | Regeneron Pharma | Modificação alvejada do genoma de rato |
| US10011850B2 (en) | 2013-06-21 | 2018-07-03 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
| US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| CN105637087A (zh) * | 2013-09-18 | 2016-06-01 | 科马布有限公司 | 方法、细胞与生物体 |
| CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| US10787684B2 (en) | 2013-11-19 | 2020-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Large gene excision and insertion |
| CN105980568B (zh) * | 2013-12-11 | 2019-12-03 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向修饰基因组的方法和组合物 |
| US20150166984A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations |
| CN106133141B (zh) | 2014-01-08 | 2021-08-20 | 哈佛学院董事及会员团体 | Rna引导的基因驱动 |
| EP3102722B1 (en) | 2014-02-04 | 2020-08-26 | Jumpcode Genomics, Inc. | Genome fractioning |
| CN111705365A (zh) | 2014-02-11 | 2020-09-25 | 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） | Crispr支持的多路基因组工程化 |
| RU2648166C1 (ru) * | 2014-05-30 | 2018-03-22 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Животные, содержащие гуманизированную дипептидилпептидазу iv (dpp4) |
| LT3152312T (lt) | 2014-06-06 | 2020-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tikslinio lokuso modifikavimo būdai ir kompozicijos |
| RU2771532C2 (ru) | 2014-06-26 | 2022-05-05 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленных генетических модификаций и способы их применения |
| WO2016022363A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| SG11201702309RA (en) | 2014-10-15 | 2017-04-27 | Regeneron Pharma | Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells |
| JP6779217B2 (ja) | 2014-10-24 | 2020-11-04 | アヴェクタス リミテッド | 細胞原形質膜を越える送達方法 |
| CA2963820A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Editas Medicine, Inc. | Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
| US11319555B2 (en) * | 2014-11-20 | 2022-05-03 | Duke University | Compositions, systems and methods for cell therapy |
| KR20230070319A (ko) | 2014-11-21 | 2023-05-22 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| BR112017013104A2 (pt) | 2014-12-19 | 2018-05-15 | Regeneron Pharma | métodos para modificar um locus genômico alvo em uma célula, para intensificar a recombinação homóloga em um locus genômico alvo em uma célula e para produzir uma geração f0 de um animal não humano. |
| EP3262175A4 (en) | 2015-02-25 | 2018-10-31 | Jumpcode Genomics, Inc. | Methods and compositions for in silico long read sequencing |
| CA2978096C (en) | 2015-03-16 | 2022-06-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception |
| EP3461337A1 (en) | 2015-05-06 | 2019-04-03 | Snipr Technologies Limited | Altering microbial populations & modifying microbiota |
| US10701911B2 (en) * | 2015-06-16 | 2020-07-07 | The Jackson Laboratory | Genetically modified non-human animals and methods relating to complement dependent cytotoxicity |
| AU2016285724A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-11-16 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified CRISPR RNA and modified single CRISPR RNA and uses thereof |
| CA2995036A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Tunable endogenous protein degradation |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| EP3341477B1 (en) | 2015-08-28 | 2022-03-23 | The General Hospital Corporation | Engineered crispr-cas9 nucleases |
| EP3350315A4 (en) * | 2015-09-18 | 2019-07-17 | The Regents of The University of California | METHODS FOR GENOME AUTOCATALYTIC EDITING AND NEUTRALIZATION OF GENOME AUTOCATALYTIC EDITION AND COMPOSITIONS THEREOF |
| US11591382B2 (en) * | 2015-09-22 | 2023-02-28 | Genentech, Inc. | Expression of Fc-containing proteins |
| EP3786294A1 (en) | 2015-09-24 | 2021-03-03 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing |
| IL258821B (en) | 2015-10-23 | 2022-07-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
| EP3370513A1 (en) * | 2015-11-06 | 2018-09-12 | The Jackson Laboratory | Large genomic dna knock-in and uses thereof |
| WO2017096041A1 (en) * | 2015-12-02 | 2017-06-08 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for modifying a target nucleic acid |
| JP7449646B2 (ja) * | 2015-12-30 | 2024-03-14 | アヴェクタス リミテッド | 細胞および組織への遺伝子編集タンパク質および組成物の、ベクターなしでの送達 |
| JP7212224B2 (ja) * | 2016-02-12 | 2023-01-25 | ジャンプコード ゲノミクス，インク． | Ｄｎａ配列の標的特異的ｒｎａ転写のための方法 |
| US11339427B2 (en) | 2016-02-12 | 2022-05-24 | Jumpcode Genomics, Inc. | Method for target specific RNA transcription of DNA sequences |
| EP3219799A1 (en) | 2016-03-17 | 2017-09-20 | IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH | Conditional crispr sgrna expression |
| US11597924B2 (en) | 2016-03-25 | 2023-03-07 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
| EP3440194A1 (en) * | 2016-04-04 | 2019-02-13 | ETH Zurich | Mammalian cell line for protein production and library generation |
| EP3443086B1 (en) | 2016-04-13 | 2021-11-24 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
| WO2017189336A1 (en) * | 2016-04-25 | 2017-11-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for genomic editing |
| WO2017201476A1 (en) * | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas |
| CN116458475A (zh) | 2016-06-03 | 2023-07-21 | 瑞泽恩制药公司 | 表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物 |
| GB201609811D0 (en) | 2016-06-05 | 2016-07-20 | Snipr Technologies Ltd | Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits |
| US11293021B1 (en) | 2016-06-23 | 2022-04-05 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems |
| EP3474669B1 (en) | 2016-06-24 | 2022-04-06 | The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate | Methods for generating barcoded combinatorial libraries |
| IL299099A (en) | 2016-06-27 | 2023-02-01 | Univ California | Combinations of cancer treatments |
| WO2018023014A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice comprising mutations resulting in expression of c-truncated fibrillin-1 |
| US20190153430A1 (en) * | 2016-08-02 | 2019-05-23 | Kyoto University | Method for genome editing |
| SG11201900907YA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| GB2573062A (en) | 2016-10-14 | 2019-10-23 | Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
| CN106544360B (zh) * | 2016-10-17 | 2019-11-05 | 扬州大学 | 一种终止lncRNA双等位基因转录的方法 |
| US20190390221A1 (en) * | 2016-11-02 | 2019-12-26 | David Kiewlich | Plasmid vectors for expression of large nucleic acid transgenes |
| LT3407709T (lt) | 2016-11-04 | 2020-10-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Gyvūnai, išskyrus žmogų, turintys sukonstruotą imunoglobulino lambda lengvosios grandinės lokusą |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| CA3053006C (en) | 2017-02-08 | 2023-09-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Regulating chimeric antigen receptors |
| US11530388B2 (en) | 2017-02-14 | 2022-12-20 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| CA3057192A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-09-27 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
| CN106987604B (zh) * | 2017-03-29 | 2021-05-28 | 北京希诺谷生物科技有限公司 | 一种制备动脉粥样硬化疾病模型犬的方法 |
| BR112019021719A2 (pt) | 2017-04-21 | 2020-06-16 | The General Hospital Corporation | Variantes de cpf1 (cas12a) com especificidade para pam alterada |
| BR112019022201A2 (pt) * | 2017-04-24 | 2020-05-12 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Métodos para modular a atividade de uma endonuclease cas, para aumentar a especificidade de uma endonuclease cas e complexo polinucleotídico guia, para aumentar a frequência de recombinação homóloga e para ativação ou repressão gênica, célula e célula vegetal |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| EP3630198A4 (en) | 2017-05-25 | 2021-04-21 | The General Hospital Corporation | USE OF CLIVED DESAMINASES TO LIMIT UNWANTED OUT-OF-TARGET DESAMINATION FROM BASE EDITING |
| WO2018228534A1 (zh) * | 2017-06-16 | 2018-12-20 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用 |
| CA3064807A1 (en) * | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Method for knocking out target gene in t cell in vitro and crrna used in the method |
| US9982279B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-05-29 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| US10011849B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-07-03 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| US11696572B2 (en) | 2017-06-27 | 2023-07-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus |
| HRP20220615T1 (hr) | 2017-06-30 | 2022-06-24 | Inscripta, Inc. | Postupci, moduli, instrumenti i sustavi za automatiziranu obradu stanica |
| EP3652312A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| WO2019018534A1 (en) | 2017-07-18 | 2019-01-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | GENOME EDITION WITHOUT SCARCE THROUGH TWO-STEP APPROVED REPAIR BY HOMOLOGY |
| JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
| CA3065579A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Assessment of crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo |
| WO2019028032A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | EMBRYONIC STEM CELLS OF TRANSGENIC MOUSE CASES AND MICE AND USES THEREOF |
| AU2018309708A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | CRISPR reporter non-human animals and uses thereof |
| WO2019033053A1 (en) * | 2017-08-11 | 2019-02-14 | Recombinetics, Inc. | INDUCIBLE DISEASE MODELS, METHODS OF MAKING AND USING THEM IN TISSUE COMPLEMENTATION |
| US10738327B2 (en) | 2017-08-28 | 2020-08-11 | Inscripta, Inc. | Electroporation cuvettes for automation |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| EP3679143A1 (en) * | 2017-09-08 | 2020-07-15 | Life Technologies Corporation | Methods for improved homologous recombination and compositions thereof |
| CN111163633B (zh) | 2017-09-29 | 2022-09-09 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法 |
| CA3074927A1 (en) | 2017-09-30 | 2019-04-04 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation instrumentation |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| ES2911249T3 (es) * | 2017-11-10 | 2022-05-18 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que comprenden una mutación de slc30a8 y métodos de uso |
| JP7361031B2 (ja) * | 2017-11-30 | 2023-10-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物 |
| US11643670B2 (en) | 2018-01-29 | 2023-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of enhancing chromosomal homologous recombination |
| WO2019183123A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
| US10760075B2 (en) | 2018-04-30 | 2020-09-01 | Snipr Biome Aps | Treating and preventing microbial infections |
| KR20210004994A (ko) | 2018-03-26 | 2021-01-13 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 치료제를 시험하기 위한 인간화된 설치류 |
| AU2019241967A1 (en) | 2018-03-29 | 2020-11-19 | Inscripta, Inc. | Automated control of cell growth rates for induction and transformation |
| US10376889B1 (en) | 2018-04-13 | 2019-08-13 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges |
| US10858761B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-12-08 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells |
| US10557216B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-02-11 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries |
| WO2019209926A1 (en) | 2018-04-24 | 2019-10-31 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of peptide libraries |
| JP2021523745A (ja) | 2018-05-16 | 2021-09-09 | シンテゴ コーポレイション | ガイドｒｎａ設計および使用のための方法およびシステム |
| WO2020005383A1 (en) | 2018-06-30 | 2020-01-02 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| US10532324B1 (en) | 2018-08-14 | 2020-01-14 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| US11142740B2 (en) | 2018-08-14 | 2021-10-12 | Inscripta, Inc. | Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
| US10752874B2 (en) | 2018-08-14 | 2020-08-25 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| AU2019363487A1 (en) | 2018-08-30 | 2021-04-15 | Inscripta, Inc. | Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
| JP7222075B2 (ja) | 2018-09-13 | 2023-02-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｃ３糸球体症のモデルとしての補体因子ｈ遺伝子ノックアウトラット |
| US11851663B2 (en) | 2018-10-14 | 2023-12-26 | Snipr Biome Aps | Single-vector type I vectors |
| CN113227368B (zh) | 2018-10-22 | 2023-07-07 | 因思科瑞普特公司 | 工程化酶 |
| US11214781B2 (en) | 2018-10-22 | 2022-01-04 | Inscripta, Inc. | Engineered enzyme |
| US11965172B2 (en) | 2018-11-05 | 2024-04-23 | California Institute Of Technology | DNA sequence modification-based gene drive |
| CN111321171A (zh) * | 2018-12-14 | 2020-06-23 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法 |
| JP7449291B2 (ja) | 2018-12-20 | 2024-03-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヌクレアーゼ媒介リピート伸長 |
| CN113646434B (zh) * | 2018-12-20 | 2023-05-30 | 北京大学 | 使用加标签的向导rna构建体进行高效基因筛选的组合物和方法 |
| WO2020163396A1 (en) | 2019-02-04 | 2020-08-13 | The General Hospital Corporation | Adenine dna base editor variants with reduced off-target rna editing |
| WO2020168315A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Automated biomanufacturing systems, facilities, and processes |
| WO2020191153A2 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| US11001831B2 (en) | 2019-03-25 | 2021-05-11 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
| CN113631713A (zh) | 2019-03-25 | 2021-11-09 | 因思科瑞普特公司 | 酵母中的同时多重基因组编辑 |
| WO2020206139A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
| JP2022526429A (ja) * | 2019-04-10 | 2022-05-24 | ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション | Ａｍｄの処置のためのｈｔｒａ１調節 |
| CN113853433A (zh) * | 2019-05-27 | 2021-12-28 | 转基因股份有限公司 | 外显子人源化小鼠 |
| JP2022534867A (ja) | 2019-06-04 | 2022-08-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ベータスリップ変異を有するヒト化ｔｔｒ遺伝子座を含む非ヒト動物と使用方法 |
| CA3139122C (en) | 2019-06-06 | 2023-04-25 | Inscripta, Inc. | Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing |
| BR112021022722A2 (pt) | 2019-06-07 | 2022-01-04 | Regeneron Pharma | Animal não humano, célula de animal não humana, genoma de animal não humano, gene de albumina animal não humana humanizada, vetor de alvejamento, método de avaliação da atividade de um reagente, e, método de otimização da atividade de um reagente |
| US10907125B2 (en) | 2019-06-20 | 2021-02-02 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation modules and instrumentation |
| US10920189B2 (en) | 2019-06-21 | 2021-02-16 | Inscripta, Inc. | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli |
| US10927385B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-02-23 | Inscripta, Inc. | Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast |
| US11203762B2 (en) | 2019-11-19 | 2021-12-21 | Inscripta, Inc. | Methods for increasing observed editing in bacteria |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| US10883095B1 (en) | 2019-12-10 | 2021-01-05 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| US10704033B1 (en) | 2019-12-13 | 2020-07-07 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| JP2023507566A (ja) | 2019-12-18 | 2023-02-24 | インスクリプタ， インコーポレイテッド | 核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のためのカスケード／ｄＣａｓ３相補性アッセイ |
| US10689669B1 (en) | 2020-01-11 | 2020-06-23 | Inscripta, Inc. | Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems |
| WO2021154706A1 (en) | 2020-01-27 | 2021-08-05 | Inscripta, Inc. | Electroporation modules and instrumentation |
| AU2021212668A1 (en) | 2020-01-28 | 2022-08-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized PNPLA3 locus and methods of use |
| US20230081547A1 (en) | 2020-02-07 | 2023-03-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use |
| EP4125348A1 (en) | 2020-03-23 | 2023-02-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| CA3179410A1 (en) * | 2020-04-06 | 2021-10-14 | LogoMix, Inc. | Genome alteration method and genome alteration kit |
| US20210332388A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Inscripta, Inc. | Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells |
| KR20230019843A (ko) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물 |
| US11787841B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-10-17 | Inscripta, Inc. | Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli |
| MY197253A (en) * | 2020-06-06 | 2023-06-08 | Lanzatech Inc | Microorganism with knock-in at acetolactate decarboxylase gene locus |
| CN111647663B (zh) * | 2020-06-18 | 2022-07-01 | 安徽农业大学 | 一种鸡步行数性状的分子遗传标记及应用 |
| WO2021263146A2 (en) | 2020-06-26 | 2021-12-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ace2 locus |
| US11299731B1 (en) | 2020-09-15 | 2022-04-12 | Inscripta, Inc. | CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells |
| US11512297B2 (en) | 2020-11-09 | 2022-11-29 | Inscripta, Inc. | Affinity tag for recombination protein recruitment |
| AU2021415461A1 (en) | 2021-01-04 | 2023-08-17 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| US11332742B1 (en) | 2021-01-07 | 2022-05-17 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| WO2022154343A1 (ko) * | 2021-01-13 | 2022-07-21 | 재단법인대구경북과학기술원 | Apoe christchurch 돌연변이를 포함하는 알츠하이머 저항성 세포 모델 및 이의 제조방법 |
| US20220251205A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions of programmed death receptor 1 (pd-1) antibodies and methods of obtaining the compositions thereof |
| US11884924B2 (en) | 2021-02-16 | 2024-01-30 | Inscripta, Inc. | Dual strand nucleic acid-guided nickase editing |
| DE112022001365T5 (de) | 2021-03-05 | 2024-02-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | In vivo dna zusammenbau und analyse |
| EP4370647A1 (en) | 2021-07-15 | 2024-05-22 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Bidirectional tangential flow filtration (tff) perfusion system |
| WO2023077053A2 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5 |
| AU2022381205A1 (en) | 2021-11-04 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a modified cacng1 locus |
| CA3238939A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Gaurang Patel | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
| US20230279442A1 (en) | 2021-12-15 | 2023-09-07 | Versitech Limited | Engineered cas9-nucleases and method of use thereof |
| WO2023122506A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
| WO2023150798A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
| WO2023154861A1 (en) | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents |
| WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
| WO2024026488A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus |
| WO2024031053A1 (en) | 2022-08-05 | 2024-02-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Aggregation-resistant variants of tdp-43 |
| US20240130341A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
Family Cites Families (224)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5981175A (en) | 1993-01-07 | 1999-11-09 | Genpharm Internation, Inc. | Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome |
| DE19525285C2 (de) | 1995-06-28 | 1999-04-15 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte |
| AU1802797A (en) | 1996-02-16 | 1997-09-02 | University Of Edinburgh, The | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| US5830729A (en) | 1996-04-18 | 1998-11-03 | Institut Pasteur | I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells |
| US6136566A (en) | 1996-10-04 | 2000-10-24 | Lexicon Graphics Incorporated | Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same |
| WO1999005266A2 (en) | 1997-07-26 | 1999-02-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Trans-species nuclear transfer |
| JP2002533130A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-08 | ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ | Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株 |
| US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
| WO2000046386A2 (en) | 1999-02-03 | 2000-08-10 | The Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site |
| US20030104526A1 (en) | 1999-03-24 | 2003-06-05 | Qiang Liu | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
| DE60023936T2 (de) | 1999-12-06 | 2006-05-24 | Sangamo Biosciences Inc., Richmond | Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| CA2431308C (en) | 2000-12-07 | 2010-04-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| AU2002241946B2 (en) | 2001-01-22 | 2007-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modified zinc finger binding proteins |
| US7947469B2 (en) | 2001-01-22 | 2011-05-24 | Gendaq, Ltd. | Modulation of HIV infection |
| AUPR451401A0 (en) | 2001-04-20 | 2001-05-24 | Monash University | A method of nuclear transfer |
| CN100575485C (zh) | 2002-01-23 | 2009-12-30 | 犹他大学研究基金会 | 使用锌指核酸酶的定向染色体诱变 |
| DK1485475T3 (da) | 2002-03-15 | 2008-01-21 | Cellectis | Hybrid meganuklease og enkeltkædet maganuklease og brug deraf |
| EP2368982A3 (en) | 2002-03-21 | 2011-10-12 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| US7612250B2 (en) | 2002-07-29 | 2009-11-03 | Trustees Of Tufts College | Nuclear transfer embryo formation method |
| US9447434B2 (en) | 2002-09-05 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
| WO2004031346A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-04-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins |
| US20030175968A1 (en) | 2002-10-30 | 2003-09-18 | Golic Kent G. | Gene targeting method |
| US7344886B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-03-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product |
| KR20060002745A (ko) | 2003-01-13 | 2006-01-09 | 마헨드라 에스 라오 | 치료적 생성물의 전달을 위한 증식성 줄기세포 및전구세포에서의 후보 분자의 지속적 발현 |
| US7205148B2 (en) | 2003-06-11 | 2007-04-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genome mutation by intron insertion into an embryonic stem cell genome |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| KR20120091471A (ko) | 2004-03-04 | 2012-08-17 | 도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠간켄큐센터 | 래트 배아 줄기 세포 |
| EP1591521A1 (en) | 2004-04-30 | 2005-11-02 | Cellectis | I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof |
| US20090104158A1 (en) | 2004-09-03 | 2009-04-23 | Moraga Biotechnology Corporation | Non-Embryonic Totipotent Blastomere-Like Stem Cells And Methods Therefor |
| KR20070060115A (ko) | 2004-09-16 | 2007-06-12 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법 |
| PT1802193E (pt) | 2004-10-19 | 2014-06-23 | Regeneron Pharma | Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética |
| FR2879622B1 (fr) | 2004-12-17 | 2008-02-01 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs presentant une modification genomique ciblee |
| WO2006097784A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
| EP1863909B2 (en) | 2005-03-15 | 2014-09-10 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
| US10022457B2 (en) | 2005-08-05 | 2018-07-17 | Gholam A. Peyman | Methods to regulate polarization and enhance function of cells |
| CA2645170A1 (en) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors, and uses thereof |
| GB0615327D0 (en) | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
| US7910798B2 (en) * | 2006-03-31 | 2011-03-22 | Medarex, Inc. | Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies |
| CN101117633B (zh) | 2006-08-03 | 2011-07-20 | 上海交通大学附属儿童医院 | 一种细胞核移植方法 |
| WO2008076290A2 (en) | 2006-12-14 | 2008-06-26 | Dow Agrosciences Llc | Optimized non-canonical zinc finger proteins |
| US7771967B2 (en) | 2006-12-22 | 2010-08-10 | The J. David Gladstone Institutes | Nucleic acid encoding apolipoprotein E-I3 |
| US10155038B2 (en) | 2007-02-02 | 2018-12-18 | Yale University | Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof |
| US8110379B2 (en) | 2007-04-26 | 2012-02-07 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted integration into the PPP1R12C locus |
| WO2008151081A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Omt, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
| CA2708776A1 (en) | 2007-12-10 | 2009-06-18 | Aliva Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for sequential replacement of targeted region by homologous recombination |
| EP2313515B1 (en) | 2008-08-22 | 2015-03-04 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
| US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| EP2180058A1 (en) | 2008-10-23 | 2010-04-28 | Cellectis | Meganuclease recombination system |
| WO2010065123A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
| EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
| AU2010226313B2 (en) | 2009-03-20 | 2014-10-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins |
| US8772008B2 (en) | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
| US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US20120178647A1 (en) | 2009-08-03 | 2012-07-12 | The General Hospital Corporation | Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly |
| WO2011020014A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette |
| US10913929B2 (en) | 2009-10-13 | 2021-02-09 | Stemcell Technologies Inc. | Method of differentiating stem cells |
| EP2493288B1 (en) | 2009-10-28 | 2015-02-18 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Homologous recombination in the oocyte |
| DK3147362T3 (en) | 2009-10-29 | 2019-04-08 | Regeneron Pharma | Multifunctional alleles |
| WO2011053957A2 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for the regulation of multiple genes of interest in a cell |
| CA2782596A1 (en) | 2009-12-01 | 2011-06-09 | National Cancer Center | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
| EP2510096B2 (en) | 2009-12-10 | 2018-02-07 | Regents of the University of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
| AU2010339863B2 (en) | 2009-12-21 | 2014-07-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized FcyR mice |
| EP2516652B1 (en) | 2009-12-21 | 2014-11-05 | Keygene N.V. | Improved techniques for transfecting protoplasts |
| KR101951489B1 (ko) | 2010-01-22 | 2019-04-22 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 유전적으로 변형된 유기체에서 도입유전자의 절제 |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| WO2011100058A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
| CA2798988C (en) | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
| GB201009732D0 (en) | 2010-06-10 | 2010-07-21 | Gene Bridges Gmbh | Direct cloning |
| MY172702A (en) | 2010-06-11 | 2019-12-10 | Regeneron Pharma | Production of fertile xy female animals from xy es cells |
| JP6050230B2 (ja) | 2010-07-21 | 2016-12-21 | サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | Ｈｌａ遺伝子座の修飾のための方法及び組成物 |
| WO2012018726A1 (en) | 2010-08-02 | 2012-02-09 | Cellectis Sa | Method for increasing double-strand break-induced gene targeting |
| US9528124B2 (en) | 2013-08-27 | 2016-12-27 | Recombinetics, Inc. | Efficient non-meiotic allele introgression |
| WO2012129198A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| WO2012162561A2 (en) | 2011-05-24 | 2012-11-29 | Zyngenia, Inc. | Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses |
| WO2012168307A2 (en) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Improved recombination efficiency by inhibition of nhej dna repair |
| DK3424947T3 (da) | 2011-10-28 | 2021-02-22 | Regeneron Pharma | Genmodificerede t-celle-receptor-mus |
| GB2496375A (en) | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
| WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| EP2847335B1 (en) | 2012-04-25 | 2018-06-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors |
| WO2013169802A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes |
| PE20150336A1 (es) | 2012-05-25 | 2015-03-25 | Univ California | Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn |
| KR20150023670A (ko) | 2012-06-12 | 2015-03-05 | 제넨테크, 인크. | 조건적 녹아웃 대립유전자의 생성 방법 및 이를 위한 조성물 |
| EP3808844A1 (en) | 2012-07-25 | 2021-04-21 | The Broad Institute, Inc. | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| CN116064533A (zh) | 2012-10-23 | 2023-05-05 | 基因工具股份有限公司 | 用于切割靶dna的组合物及其用途 |
| KR101844123B1 (ko) | 2012-12-06 | 2018-04-02 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 |
| WO2014093479A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Montana State University | Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation |
| WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| ES2786193T3 (es) | 2012-12-12 | 2020-10-09 | Broad Inst Inc | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
| ES2553782T3 (es) | 2012-12-12 | 2015-12-11 | The Broad Institute, Inc. | Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias |
| EP3252160B1 (en) | 2012-12-12 | 2020-10-28 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| EP2848690B1 (en) | 2012-12-12 | 2020-08-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| EP3434776A1 (en) | 2012-12-12 | 2019-01-30 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| DK2931898T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-20 | Massachusetts Inst Technology | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS |
| RU2699523C2 (ru) | 2012-12-17 | 2019-09-05 | Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж | Рнк-направляемая инженерия генома человека |
| ES2705033T3 (es) | 2012-12-27 | 2019-03-21 | Keygene Nv | Método para eliminar un ligamiento genético en una planta |
| WO2014127287A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for in vivo tergated mutagenesis |
| ES2904803T3 (es) | 2013-02-20 | 2022-04-06 | Regeneron Pharma | Modificación genética de ratas |
| WO2014130955A1 (en) | 2013-02-25 | 2014-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption |
| EP2922393B2 (en) | 2013-02-27 | 2022-12-28 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases |
| US10612043B2 (en) | 2013-03-09 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events |
| ES2901396T3 (es) | 2013-03-14 | 2022-03-22 | Caribou Biosciences Inc | Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico |
| US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| US20140349400A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Programmable Modification of DNA |
| US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
| JP6346266B2 (ja) | 2013-03-21 | 2018-06-20 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊 |
| WO2014165825A2 (en) | 2013-04-04 | 2014-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems |
| US20160186208A1 (en) | 2013-04-16 | 2016-06-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal |
| PT3456831T (pt) | 2013-04-16 | 2021-09-10 | Regeneron Pharma | Modificação alvejada do genoma de rato |
| US20160040155A1 (en) | 2013-04-16 | 2016-02-11 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering |
| JP2016521971A (ja) | 2013-04-23 | 2016-07-28 | イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド | 単離ナイーブ型多能性幹細胞およびそれを発生させる方法関連出願本出願は、米国特許法１１９条第（ｅ）項に基づき、２０１４年１月２９日出願の米国特許仮出願第６１／９３２，９３５号、２０１３年９月１７日出願の米国特許仮出願第６１／８７８，７６９号、および２０１３年４月２３日出願の米国特許仮出願第６１／８１４，９２０号の優先権を主張する。また、本出願は、同時に提出された同出願人による同時係属出願である、ＹａｑｕｂＨＡＮＮＡ、ＮｏａＮＯＶＥＲＳＨＴＥＲＮ、およびＹｏａｃｈＲＡＩＳによる米国特許出願（発明の名称「単離ナイーブ型多能性幹細胞およびそれを発生させる方法（ＩＳＯＬＡＴＥＤＮＡＩＶＥＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧＳＡＭＥ）」）（代理人事件記録簿第５８８７０号）にも関する。上記出願の内容はその全体を参考として本明細書に組み込む。 |
| EP2796558A1 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-29 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Improved gene targeting and nucleic acid carrier molecule, in particular for use in plants |
| EP2994531B1 (en) | 2013-05-10 | 2018-03-28 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| CN116083487A (zh) | 2013-05-15 | 2023-05-09 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
| ES2883131T3 (es) | 2013-05-29 | 2021-12-07 | Cellectis | Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN |
| EP3004337B1 (en) | 2013-05-29 | 2017-08-02 | Cellectis | Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system |
| EP3004349B1 (en) | 2013-05-29 | 2018-03-28 | Cellectis S.A. | A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity |
| US20140359795A1 (en) | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Recombinetics, Inc. | Genetic techniques for making animals with sortable sperm |
| US9982277B2 (en) | 2013-06-11 | 2018-05-29 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for target DNA modification |
| EP3011035B1 (en) | 2013-06-17 | 2020-05-13 | The Broad Institute, Inc. | Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences |
| KR20160034901A (ko) | 2013-06-17 | 2016-03-30 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 서열 조작에 최적화된 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 이중 닉카아제 시스템, 방법 및 조성물 |
| ES2777217T3 (es) | 2013-06-17 | 2020-08-04 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias |
| DK3011032T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-01-20 | Broad Inst Inc | Fremføring, modificering og optimering af systemer, fremgangsmåder og sammensætninger til målretning mod og modellering af sygdomme og forstyrrelser i postmitotiske celler |
| DK3011031T3 (da) | 2013-06-17 | 2020-12-21 | Broad Inst Inc | Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi |
| SG11201510286QA (en) | 2013-06-17 | 2016-01-28 | Broad Inst Inc | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components |
| SG11201510297QA (en) | 2013-06-19 | 2016-01-28 | Sigma Aldrich Co Llc | Targeted integration |
| US10011850B2 (en) | 2013-06-21 | 2018-07-03 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing |
| WO2015006498A2 (en) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | President And Fellows Of Harvard College | Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems |
| KR20160029112A (ko) | 2013-07-09 | 2016-03-14 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 멀티플렉스 rna-가이드된 게놈 조작 |
| BR112016000571B1 (pt) | 2013-07-10 | 2023-12-26 | President And Fellows Of Harvard College | Métodos in vitro para modular a expressão e para alterar um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula simultaneamente com a regulação da expressão de um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula, bem como célula de levedura ou bactéria compreendendo ácidos nucleicos |
| US9663782B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-05-30 | Larix Bioscience Llc | Methods and compositions for producing double allele knock outs |
| US11306328B2 (en) | 2013-07-26 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
| LT3036327T (lt) | 2013-08-22 | 2019-06-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genomo modifikacijos, panaudojant nukreipiančias polinukleotido/cas endonukleazės sistemas, ir panaudojimo būdai |
| KR20160060659A (ko) | 2013-08-29 | 2016-05-30 | 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 | Hiv 감염증의 rna-유도 치료를 위한 방법 및 조성물 |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
| CN105637087A (zh) | 2013-09-18 | 2016-06-01 | 科马布有限公司 | 方法、细胞与生物体 |
| US10822606B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-11-03 | The Regents Of The University Of California | Optimized small guide RNAs and methods of use |
| WO2015052231A2 (en) | 2013-10-08 | 2015-04-16 | Technical University Of Denmark | Multiplex editing system |
| AU2014337248B2 (en) | 2013-10-17 | 2020-09-24 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| JP5900942B2 (ja) | 2013-11-06 | 2016-04-06 | 国立大学法人広島大学 | 核酸挿入用ベクター |
| CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| US10787684B2 (en) | 2013-11-19 | 2020-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Large gene excision and insertion |
| US10450586B2 (en) | 2013-11-28 | 2019-10-22 | Horizon Discovery Limited | Somatic haploid human cell line |
| CN105980568B (zh) | 2013-12-11 | 2019-12-03 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向修饰基因组的方法和组合物 |
| JP6625055B2 (ja) | 2013-12-12 | 2020-01-08 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法 |
| EP4219699A1 (en) | 2013-12-12 | 2023-08-02 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation |
| CN111269902A (zh) | 2013-12-12 | 2020-06-12 | 布罗德研究所有限公司 | Crispr-cas系统和组合物的递送及用途 |
| KR20160089526A (ko) | 2013-12-12 | 2016-07-27 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 입자 전달 성분을 이용한 표적 장애 및 질병에 대한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 이용 및 치료 적용 |
| DK3079725T3 (da) | 2013-12-12 | 2020-01-20 | Broad Inst Inc | Administration, brug og terapeutiske anvendelser af crispr-cas-systemerne og sammensætninger til genomredigering |
| AU2014361834B2 (en) | 2013-12-12 | 2020-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular Cas enzymes |
| US20160312233A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-27 | Cellectis | New method of selection of algal-transformed cells using nuclease |
| MX2016007797A (es) | 2013-12-19 | 2016-09-07 | Amyris Inc | Metodos para integracion genomica. |
| CN106133141B (zh) | 2014-01-08 | 2021-08-20 | 哈佛学院董事及会员团体 | Rna引导的基因驱动 |
| US10034463B2 (en) | 2014-01-24 | 2018-07-31 | Children's Medical Center Corporation | High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities |
| US20150291969A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-10-15 | Chromatin, Inc. | Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same |
| US10233456B2 (en) | 2014-01-30 | 2019-03-19 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site |
| CN111705365A (zh) | 2014-02-11 | 2020-09-25 | 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） | Crispr支持的多路基因组工程化 |
| US10370680B2 (en) | 2014-02-24 | 2019-08-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration |
| EP3957735A1 (en) | 2014-03-05 | 2022-02-23 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa |
| DK3116997T3 (da) | 2014-03-10 | 2019-08-19 | Editas Medicine Inc | Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10) |
| EP3116533B1 (en) | 2014-03-12 | 2020-08-12 | Precision Biosciences, Inc. | Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases |
| UA124375C2 (uk) | 2014-03-14 | 2021-09-08 | Кібус Юс Ллс | Спосіб здійснення спрямованої генетичної зміни днк в клітині рослини з використанням нуклеази crispr і модифікованого gron |
| CN106459894B (zh) | 2014-03-18 | 2020-02-18 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物 |
| JP6815986B2 (ja) | 2014-03-26 | 2021-01-20 | ユニバーシティ オブ メリーランド， カレッジ パーク | 大型家畜の接合体における標的化ゲノム編集 |
| GB201406968D0 (en) | 2014-04-17 | 2014-06-04 | Green Biologics Ltd | Deletion mutants |
| KR101823661B1 (ko) | 2014-04-24 | 2018-01-30 | 기초과학연구원 | 마이크로 상동 기반의 유전자 녹아웃을 위한 뉴클레아제 표적 서열을 확인하는 방법 |
| GB201407852D0 (en) | 2014-05-02 | 2014-06-18 | Iontas Ltd | Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
| EP3142706A1 (en) | 2014-05-16 | 2017-03-22 | Vrije Universiteit Brussel | Genetic correction of myotonic dystrophy type 1 |
| WO2015184262A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections |
| LT3152312T (lt) | 2014-06-06 | 2020-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tikslinio lokuso modifikavimo būdai ir kompozicijos |
| ES2788426T3 (es) | 2014-06-16 | 2020-10-21 | Univ Johns Hopkins | Composiciones y métodos para la expresión de ARNs de guía de CRISPR utilizando el promotor de H1 |
| RU2771532C2 (ru) | 2014-06-26 | 2022-05-05 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленных генетических модификаций и способы их применения |
| JP7113618B2 (ja) | 2014-07-15 | 2022-08-05 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 養子細胞療法用の操作された細胞 |
| US9944933B2 (en) | 2014-07-17 | 2018-04-17 | Georgia Tech Research Corporation | Aptamer-guided gene targeting |
| EP3193944B1 (en) | 2014-07-17 | 2021-04-07 | University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education | Methods of treating cells containing fusion genes |
| EP3778891A1 (en) | 2014-08-27 | 2021-02-17 | New England Biolabs, Inc. | Synthon formation |
| SG11201701245QA (en) | 2014-08-27 | 2017-03-30 | Caribou Biosciences Inc | Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency |
| WO2016036754A1 (en) | 2014-09-02 | 2016-03-10 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification |
| CN107073091A (zh) | 2014-09-07 | 2017-08-18 | 西莱克塔生物科技公司 | 用于减弱外显子跳读抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物 |
| WO2016049163A2 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder |
| WO2016049024A2 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo |
| WO2016049258A2 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Functional screening with optimized functional crispr-cas systems |
| JP2017534295A (ja) | 2014-09-29 | 2017-11-24 | ザ ジャクソン ラボラトリー | エレクトロポレーションによる遺伝子改変哺乳動物の高効率ハイスループット生成 |
| KR102630014B1 (ko) | 2014-10-01 | 2024-01-25 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 뉴클레아제-유도 상동성-지정 복구의 효율 증가 방법 |
| US20180250424A1 (en) | 2014-10-10 | 2018-09-06 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for promoting homology directed repair |
| WO2016061073A1 (en) | 2014-10-14 | 2016-04-21 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Composition and method for in vivo engineering of chromosomal rearrangements |
| SG11201702309RA (en) | 2014-10-15 | 2017-04-27 | Regeneron Pharma | Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells |
| BR112017007923B1 (pt) | 2014-10-17 | 2023-12-12 | The Penn State Research Foundation | Método para produzir manipulação genética mediada por reações multiplex com rna em uma célula receptora, construção de ácido nucleico,cassete de expressão, vetor, célula receptora e célula geneticamente modificada |
| WO2016061523A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Howard Hughes Medical Institute | Genomic probes |
| WO2016065364A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for enhancing homologous recombination |
| WO2016073955A2 (en) | 2014-11-06 | 2016-05-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells |
| CA2963820A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Editas Medicine, Inc. | Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
| KR20230070319A (ko) | 2014-11-21 | 2023-05-22 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| CA2968808A1 (en) | 2014-11-27 | 2016-06-02 | Danziger Innovations Ltd. | Nucleic acid constructs for genome editing |
| WO2016089866A1 (en) | 2014-12-01 | 2016-06-09 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided systems for in vivo gene editing |
| EP3230452A1 (en) | 2014-12-12 | 2017-10-18 | The Broad Institute Inc. | Dead guides for crispr transcription factors |
| WO2016094880A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs) |
| WO2016094874A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems |
| WO2016097751A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | The University Of Bath | Method of cas9 mediated genome engineering |
| BR112017013104A2 (pt) | 2014-12-19 | 2018-05-15 | Regeneron Pharma | métodos para modificar um locus genômico alvo em uma célula, para intensificar a recombinação homóloga em um locus genômico alvo em uma célula e para produzir uma geração f0 de um animal não humano. |
| US10190106B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-01-29 | Univesity Of Massachusetts | Cas9-DNA targeting unit chimeras |
| WO2016108926A1 (en) | 2014-12-30 | 2016-07-07 | The Broad Institute Inc. | Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis |
| WO2016112242A1 (en) | 2015-01-08 | 2016-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Split cas9 proteins |
| CN113388670B (zh) | 2015-01-09 | 2024-02-02 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 检测基因组编辑 |
| WO2016114972A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | The Regents Of The University Of California | Heterodimeric cas9 and methods of use thereof |
| CN107429263A (zh) | 2015-01-15 | 2017-12-01 | 斯坦福大学托管董事会 | 调控基因组编辑的方法 |
| BR112017016080B1 (pt) | 2015-01-28 | 2024-02-20 | Caribou Biosciences, Inc | Polinucleotídeo crispr da classe 2 único, sistema crispr da classe 2 e método in vitro de modificação de uma molécula de ácido nucleico alvo em um organismo não-humano, ou em uma célula |
| WO2016130697A1 (en) | 2015-02-11 | 2016-08-18 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules |
| EP3262173A2 (en) | 2015-02-23 | 2018-01-03 | Crispr Therapeutics AG | Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies |
| BR112017017812A2 (pt) | 2015-02-23 | 2018-04-10 | Crispr Therapeutics Ag | materiais e métodos para tratamento de hemoglobinopatias |
| WO2016138574A1 (en) | 2015-03-02 | 2016-09-09 | Sinai Health System | Homologous recombination factors |
| GB201504223D0 (en) | 2015-03-12 | 2015-04-29 | Genome Res Ltd | Biallelic genetic modification |
| WO2016154579A2 (en) | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-mediated gene conversion |
| US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
-
2014
- 2014-10-15 CN CN201480074803.XA patent/CN105980568B/zh active Active
- 2014-10-15 US US14/515,503 patent/US9546384B2/en active Active
- 2014-10-15 JP JP2016538790A patent/JP6174811B2/ja active Active
- 2014-10-15 KR KR1020167018610A patent/KR101773782B1/ko active IP Right Grant
- 2014-10-15 SG SG10201700961TA patent/SG10201700961TA/en unknown
- 2014-10-15 WO PCT/US2014/060788 patent/WO2015088643A1/en active Application Filing
- 2014-10-15 RU RU2016126989A patent/RU2685914C1/ru active
- 2014-10-15 CA CA2933433A patent/CA2933433C/en active Active
- 2014-10-15 RU RU2019111616A patent/RU2725520C2/ru active
- 2014-10-15 MX MX2016007654A patent/MX2016007654A/es unknown
- 2014-10-15 BR BR112016013400-1A patent/BR112016013400B1/pt active IP Right Grant
- 2014-10-15 KR KR1020177023915A patent/KR102170502B1/ko active IP Right Grant
- 2014-10-15 CN CN201911060314.XA patent/CN110951779B/zh active Active
- 2014-10-15 AU AU2014360811A patent/AU2014360811B2/en active Active
- 2014-12-19 US US14/578,291 patent/US9228208B2/en active Active
-
2015
- 2015-10-30 US US14/928,180 patent/US20160060657A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-05-17 IL IL245674A patent/IL245674B/en active IP Right Grant
- 2016-06-10 MX MX2021014368A patent/MX2021014368A/es unknown
- 2016-07-27 JP JP2016147146A patent/JP6517755B2/ja active Active
- 2016-11-17 US US15/354,270 patent/US10208317B2/en active Active
-
2017
- 2017-08-07 AU AU2017210669A patent/AU2017210669B2/en active Active
-
2018
- 2018-12-18 US US16/224,413 patent/US10711280B2/en active Active
-
2019
- 2019-03-28 AU AU2019202160A patent/AU2019202160B2/en active Active
- 2019-04-18 JP JP2019079554A patent/JP6670412B2/ja active Active
-
2020
- 2020-06-03 US US16/891,978 patent/US11820997B2/en active Active
-
2023
- 2023-10-11 US US18/484,777 patent/US20240052365A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101773782B1 (ko) | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 | |
| KR102186281B1 (ko) | 랫트 게놈의 표적화된 변형 | |
| DK3080279T3 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED MODIFICATION OF A GENOM | |
| RU2751237C1 (ru) | Способы и композиции для направленной модификации генома | |
| NZ721985B2 (en) | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| GRNT | Written decision to grant |